WO2022270522A1 - 細胞内におけるｃｙｐ酵素群の酵素活性の検出方法 - Google Patents

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靖矩 名和
梦露 李
誠一 石田
泰成 諫田
聡史 藤田
克昌 藤田
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
国立大学法人大阪大学
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting the activity of CYP enzymes using Stokes Raman scattering signals (hereinafter also referred to as Raman scattering signals or Raman signals) that indicate the activity of CYP metabolizing enzymes.
  • Stokes Raman scattering signals hereinafter also referred to as Raman scattering signals or Raman signals
  • Cytochrome p450 known as a group of enzymes responsible for drug and toxic metabolism, is a heme protein that is expressed in hepatocytes and small intestinal epithelial cells and localized in the endoplasmic reticulum (ER).
  • CYP Cytochrome p450
  • ER endoplasmic reticulum
  • CYPs form a gene superfamily consisting of multiple molecular species (enzymes) with different properties such as substrate specificity.
  • the object of the present invention is to provide a method for detecting the enzymatic activity of CYP enzymes in cells with high resolution without relying on invasiveness and labeling.
  • the present inventors have found that (1) that the enzymatic activity of the CYP enzyme group correlates with the number of molecules of the oxidized CYP enzyme group; (2) By measuring the number of molecules of oxidized CYP enzymes in living cells using Raman signals, it is possible to noninvasively evaluate the enzymatic activity of CYP enzymes in the cells, and (3) By simultaneously detecting Raman signals of multiple biomolecules in living cells, the state of cells (e.g., degree of drug response, degree of differentiation/undifferentiation, etc.) can be determined noninvasively and multilaterally.
  • the present invention has been completed by discovering that it can be analyzed, etc., and further research based on such knowledge.
  • the present invention is as follows.
  • a method for evaluating enzymatic activity of intracellular or extracellular CYP enzymes including a step of measuring the number of molecules of oxidized CYP enzymes.
  • the step of measuring the number of molecules of the oxidized CYP enzymes comprises: The method according to ⁇ 1>, comprising the steps of irradiating cells with excitation light and obtaining a Raman spectrum using a photodetector, and extracting Raman scattering signals derived from CYP enzymes from the Raman spectrum.
  • ⁇ 3> The method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the wavenumber of the Raman scattering signal derived from the CYP enzyme group is within the wavenumber range of 300-600, 620-880, 920-1320 or 1320-1660 cm -1 . .
  • ⁇ 4> The method according to ⁇ 3>, wherein the wave number is 1370 cm -1 or 1636 cm -1 .
  • ⁇ 5> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the cells are derived from liver, small intestine, kidney, or brain.
  • ⁇ 6> The method according to ⁇ 5>, wherein the cells are liver-derived cells.
  • ⁇ 7> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the cells are derived from pluripotent stem cells.
  • ⁇ 8> Observing at least one selected from the group consisting of cell shape, cell size, and intracellular distribution of intracellular components in the region where the number of molecules of the CYP enzyme group is measured.
  • ⁇ 9> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, including the step of further extracting Raman scattering signals derived from substances other than the CYP enzyme group.
  • the substance other than the CYP enzyme group is at least one selected from the group consisting of reduced heme b, reduced/oxidized heme c, glycogen, reduced/oxidized cytochrome c, phenylalanine, and lipids. , the method described in ⁇ 9>.
  • a method for evaluating the metabolic capacity of liver parenchymal cells comprising the following steps: A step of irradiating hepatocytes with excitation light and obtaining a Raman spectrum using a photodetector, and a step of detecting Raman signals of biomolecules related to the metabolic ability of hepatocytes from the Raman spectrum.
  • biomolecule related to hepatocyte metabolism is at least one selected from the group consisting of CYP enzymes, glycogen, cytochrome b5 , cytochrome c, lipids, and phenylalanine. the method of.
  • the present invention is as follows.
  • ⁇ 1'> A detection method for detecting the enzymatic activity of the CYP enzyme group by detecting the oxidized CYP enzyme group.
  • ⁇ 3'> The detection method according to ⁇ 1'> or ⁇ 2'>, wherein the wavenumber of the Raman spectrum is derived from type b oxidized heme bound to the CYP enzyme group.
  • ⁇ 4'> The detection according to any one of ⁇ 1'> to ⁇ 3'>, wherein the specific wavenumber is within the range of 300-600, 620-880, 920-1320 or 1320-1660 cm -1 wavenumbers. Method.
  • ⁇ 5′> The detection method according to ⁇ 4′>, wherein the specific wave number is 1370 cm ⁇ 1 or 1636 cm ⁇ 1 .
  • ⁇ 6'> The detection method according to any one of ⁇ 1'> to ⁇ 5'>, wherein the cells are cells having CYP activity.
  • ⁇ 7'> The detection method according to ⁇ 6'>, wherein the cells having CYP activity are cells derived from any of liver, small intestine, kidney, and brain.
  • ⁇ 8'> The detection method according to any one of ⁇ 1'> to ⁇ 7'>, wherein the cells are derived from pluripotent stem cells, such as iPS cells and ES cells.
  • ⁇ 9'> The detection method according to any one of ⁇ 1'> to ⁇ 8'>, wherein the cells are hepatocytes.
  • ⁇ 10'> The detection method according to any one of ⁇ 1'> to ⁇ 7'>, wherein the cells are human liver tumor-derived cell lines or cells differentiated therefrom.
  • ⁇ 11'> At least one of cell shape, cell size, and intracellular distribution of intracellular components in the region where the enzyme activity of the CYP enzyme group is detected, as well as the detection of the enzyme activity of the CYP enzyme group.
  • ⁇ 13′> The other Raman scattering signals having specific wavenumbers indicating the other molecules are reduced heme b, reduced/oxidized heme c, glycogen, reduced/oxidized cytochrome c, The detection method according to ⁇ 12′>, which is derived from either phenylalanine or lipid.
  • the wave number of the Raman scattering signal derived from the reduced heme b is in the range of 650-680 cm ⁇ 1 , 900-1000 cm ⁇ 1 , 1300-1373 cm ⁇ 1 , 1490-1500 cm ⁇ 1 or 1570-1590 cm ⁇ 1
  • the detection method according to ⁇ 13′> which is within.
  • the wave number of the Raman scattering signal derived from the reduced/oxidized heme c is 590-640 cm ⁇ 1 , 730-755 cm ⁇ 1 , 1120-1130 cm ⁇ 1 , 1310-1370 cm ⁇ 1 , or 1580-1640 cm
  • the wavenumber of the Raman scattering signal derived from glycogen is within the range of 440-580 cm ⁇ 1 , 840-945 cm ⁇ 1 , 1020-1660 cm ⁇ 1 , or 2900-2940 cm ⁇ 1 , ⁇ 13′> ⁇
  • ⁇ 17′> A step of irradiating the cells with excitation light and acquiring a Raman spectrum using a photodetector; extracting a Raman scattering signal derived from the CYP enzyme group from the Raman spectrum,
  • a peak and a waveform of a specific wavenumber of the Raman spectrum are identified, and the intersection of a line connecting both ends of the base of the peak and a straight line drawn perpendicular to the wavenumber axis from the peak apex is set as the origin, and from the origin to the above Calculate the height to the peak apex as the Raman scattering intensity,
  • the detection method according to any one of ⁇ 2'> to ⁇ 16'>.
  • ⁇ 18'> A step of irradiating the cells with excitation light and obtaining a Raman spectrum using a photodetector; extracting a Raman scattering signal derived from the CYP enzyme group from the Raman spectrum, In the step of extracting the Raman scattering signal, Identify the peak and waveform of a specific wavenumber of the Raman spectrum, and calculate the area of the region surrounded by the line connecting both ends of the base of the peak and the waveform of the Raman spectrum after noise removal as the Raman scattering intensity. , The detection method according to any one of ⁇ 2'> to ⁇ 16'>.
  • ⁇ 19'> Furthermore, using the Raman scattering signals of glycogen and cytochrome c extracted from the Raman spectrum, at least one of cell or tissue type, degree of differentiation, and degree of maturity is evaluated, ⁇ 17'> or ⁇ 18′> detection method.
  • ⁇ 20'> A method for detecting enzymatic activity of purified CYP proteins in an environment that mimics the intracellular environment, using Raman spectra with specific wavenumbers that indicate the enzymatic activity of the CYP enzyme group.
  • Raman spectrum detection It is a figure explaining Raman spectrum detection. 4 is a flowchart for explaining a method of extracting Raman scattering signals; An example of Raman spectrum measurement results is shown. 1 shows a method 1 for extracting a Raman scattering signal. Fig. 2 shows method 2 for extracting Raman scattering signals.
  • Raman spectra of CYP3A4-induced liver parenchymal cells The graph which shows the measurement result of CYP3A4 by the luminescence method. Western blotting measurement results.
  • Wavenumber 600 cm -1 reduced heme c, mainly reduced cytochrome c, wavenumber 675 cm -1 : reduced heme b, mainly reduced cytochrome b5, wavenumber 940 cm -1 : glycogen, wavenumber 1636 cm -1 : Oxidized heme b, mainly oxidized CYP enzymes.
  • Wavenumber 600 cm -1 reduced heme c, mainly reduced cytochrome c, wavenumber 675 cm -1 : reduced heme b, mainly reduced cytochrome b5, wavenumber 940 cm -1 : glycogen, wavenumber 1000 cm -1 : Phenylalanine, wave number 1370 cm -1 : oxidized heme b, mainly oxidized CYP enzymes, wave number 1636 cm -1 : oxidized heme b, mainly oxidized CYP enzymes.
  • Graph showing CYP enzyme activity in HepaRG cells in which Azamulin was used to down-regulate CYP enzyme activity A boxplot plotting the Raman signal at a wavenumber of 1636 cm ⁇ 1 by averaging the detected Raman spectra for each cell. Comparative photograph of Raman image and immunostaining result. Wavenumber 1636 cm -1 : oxidized heme b, mainly oxidized CYP enzymes. Raman peaks derived from various biomolecules observed in human hepatocytes. Raman images of various biomolecules.
  • Wave number 675 cm -1 reduced heme b, mainly reduced cytochrome b5, wave number 940 cm -1 : glycogen, wave number 1636 cm -1 : oxidized heme b, mainly oxidized CYP enzyme group, wave number 600 cm -1 : reduced heme c, mainly reduced cytochrome c, wave number 1000 cm -1 : phenylalanine, wave number 2850 cm -1 : lipid.
  • Graph showing Raman signals of frozen primary human hepatocytes (PHH) and HepaRG cells Images showing the distribution of each molecule in PHH and HepaRG cells obtained by visualizing Raman signals corresponding to each spectrum.
  • Wavenumber 600 cm -1 reduced heme c, mainly reduced cytochrome c, wavenumber 675 cm -1 : reduced heme b, mainly reduced cytochrome b 5 , wavenumber 750 cm -1 : all cytochrome, wavenumber 1636 cm -1 : oxidized heme b, mainly oxidized CYP enzyme group, wave number 1000 cm -1 : phenylalanine, mainly protein, wave number 1157 cm -1 : carotenoids, wave number 1512 cm -1 : carotenoids.
  • the present invention provides a method for evaluating the enzymatic activity of intracellular or extracellular CYP enzymes, comprising a step of measuring the number of molecules of oxidized CYP enzymes (hereinafter, may be referred to as the "evaluation method of the present invention", etc.). provided).
  • the present inventors discovered for the first time in the world "the fact that the enzymatic activity of the CYP enzyme group correlates with the number of molecules of the oxidized enzyme of the CYP enzyme group.” (Specifically demonstrated by the data presented in Example 6 herein). In other words, when the CYP enzyme group exists in the intracellular or extracellular environment, the enzymatic activity of the CYP enzyme group is determined by determining the "number of molecules" of the oxidized CYP enzyme group among the CYP enzyme group using an appropriate method. The inventors have found that it can be evaluated by measuring
  • the method used to measure the number of molecules of the oxidized CYP enzyme group in the CYP enzyme group is not particularly limited, and a method known per se may be used. Examples include, but are not limited to, infrared spectroscopy, labeling with fluorescent or luminescent materials, mass spectroscopy, and the like. Raman spectroscopy, which allows non-destructive analysis, is preferably used in embodiments for evaluating the enzymatic activity of intracellular CYP enzymes. As one spectroscopic technique, there is identification of the redox state of cytochrome P450 using an absorption spectrum (Non-Patent Document 1).
  • the enzymatic activity of intracellular CYP enzymes can be evaluated.
  • Raman spectroscopy can be used in the step of measuring the number of molecules of oxidized CYP enzymes. More specifically, as a method for measuring the number of molecules of the oxidized CYP enzyme group, a step of irradiating cells with excitation light and obtaining a Raman spectrum using a photodetector; By performing the step of extracting group-derived Raman scattering signals, the number of molecules of the oxidized CYP enzyme group can be measured.
  • a Raman spectrum containing a Raman scattering signal having a specific wavenumber is used to evaluate the enzymatic activity of CYP enzymes in the intracellular environment.
  • CYPs to be evaluated in one embodiment of the present invention are CYPs derived from all kinds of organisms.
  • CYP enzyme group refers to CYPs derived from any and all organisms.
  • CYPs are heme proteins that contain heme as a prosthetic genus.
  • the evaluation method detects the "redox state" derived from the molecular structure specific to the CYP molecule.
  • a molecular structure specific to a CYP molecule is as follows. There are subtypes (type a, type b, etc.) depending on the porphyrin structure of heme, and CYP has a type b heme structure.
  • CYPs form a gene superfamily consisting of multiple molecular species (enzymes) with different properties such as substrate specificity.
  • CYP genes There are 57 known CYP genes in humans. Among the 57 CYP genes, CYP3A4, CYP1A2, CYP2B6, etc. are the main CYP enzyme groups involved in the metabolism of drugs and poisons.
  • CYP enzymes are mainly expressed in liver parenchymal cells and small intestinal epithelial cells, and are localized in the endoplasmic reticulum (ER).
  • ER endoplasmic reticulum
  • CYP3A4 is known to have the highest expression, accounting for 35% of the entire CYP family (Non-Patent Document 2).
  • the total intensity of Raman scattered light at a specific Raman shift is detected for all CYP molecules contained in the CYP enzyme group without distinguishing between the types of these molecules. .
  • the "CYP enzyme group” whose activity is evaluated by the evaluation method of the present invention is a group of 57 human CYP enzymes.
  • the "CYP enzyme group” is a CYP enzyme whose expression is induced by an inducer known to induce the expression of the CYP enzyme group among the 57 types of human CYP enzyme group.
  • an inducer known to induce the expression of the CYP enzyme group among the 57 types of human CYP enzyme group.
  • inducers include, but are not limited to, rifampicin, phenytoin, carbamazepine, and dexamethasone.
  • the four exemplified inducers are the group consisting of CYP3A4, CYP1A2, CYP2B6, and CYP2C9.
  • the present inventors have confirmed that it induces gene expression of at least one of four CYP enzymes selected from: CYP3A4, CYP1A2, CYP2B6, and CYP2C9 as CYP enzymes whose expression is induced by the inducer It may be at least one selected from the group consisting of
  • the "CYP enzyme group” can be any of the following (1) to (15): (1) Human CYP3A4 (2) Human CYP1A2 (3) Human CYP2B6 (4) Human CYP2C9 (5) human CYP3A4 and human CYP1A2 (6) human CYP3A4 and human CYP2B6 (7) human CYP3A4 and human CYP2C9 (8) human CYP1A2 and human CYP2B6 (9) human CYP1A2 and human CYP2C9 (10) human CYP2B6 and human CYP2C9 (11) human CYP3A4, human CYP1A2 and human CYP2B6 (12) human CYP3A4, human CYP1A2 and human CYP2C9 (13) human CYP3A4, human CYP2B6 and human CYP2C9 (14) human CYP1A2, human CYP2B6 and human CYP2C9 (14) human CY
  • the evaluation method of the present invention can evaluate not only human CYP3A4 but also metabolic enzymatic activities of CYPs derived from all kinds of organisms.
  • Heme b is an iron porphyrin complex with an iron atom as the central metal.
  • One highly reactive oxygen atom is bound to the iron atom of heme b.
  • CYP introduces one oxygen atom into target compounds such as drugs and poisons and oxidizes the compound, thereby increasing the water solubility of the compound and promoting excretion from the body. Therefore, the iron atom of heme b reversibly changes between a trivalent oxidized form (Fe 3+ ) and a divalent reduced form (Fe 2+ ) through redox reactions.
  • the metabolic enzymatic activity of the CYP enzymes is evaluated based on the measurement results of the redox state of the CYP enzymes.
  • Raman spectroscopy is a non-destructive, non-staining, non-invasive measurement of CYP enzyme activity.
  • Raman spectroscopy when an object to be measured is irradiated with excitation light, Raman scattered light is generated.
  • a spectrum obtained from Raman scattered light has peaks at a plurality of specific wavenumbers. These are derived from chemical bonds within and between molecules.
  • the “Raman scattering signal having a specific wavenumber” in the present embodiment is derived from type b oxidized heme (hereinafter also referred to as oxidized heme b), which is a prosthetic group bound to the CYP enzyme.
  • the specific wavenumber is preferably within the range of 300-600, 620-880, 920-1320, or 1320-1660 cm -1 . More preferably, the wave number is 1360-1380 or 1630-1640 cm -1 . A wavenumber of 1370 or 1636 cm ⁇ 1 is particularly preferred.
  • Raman scattered light generated by irradiating a cell with excitation light is spectroscopically separated by a diffraction grating.
  • a Raman scattering signal (Raman scattering intensity) is obtained at a wavenumber of 1630 to 1640 cm ⁇ 1 , for example, from the Raman spectrum detected by the detection device.
  • Obtaining a Raman scattering signal at the wavenumber indicates that the CYP enzyme group has enzymatic activity.
  • the binding between the CYP enzyme and heme b is covalent or non-covalent.
  • the cell shape, size, and intracellular distribution of intracellular components may be observed in the region where the enzymatic activity of the CYP enzyme group is evaluated.
  • the "region for evaluating the enzymatic activity of the CYP enzyme group" is, in one example, a predetermined area containing cells developed on a substrate as shown in FIG. Y ⁇ m plane. Although one cell is arranged in the region in FIG. 1, a plurality of cells may be arranged. Observation of the shape and size of cells and the intracellular distribution of intracellular components can be carried out using, for example, an optical measurement method.
  • Optical measurement methods refer to methods for generating images, for example in the bright field (FIG. 26) or fluorescence (FIGS. 12, 24).
  • FOG. 26 the bright field
  • FGS. 12, 24 fluorescence
  • Optical measurement methods By using an optical measurement method together, it is possible to identify the localization of the observed cell group and identify the analyzed cell group (specification of the parenchymal cell part of the liver), so efficient measurement and highly sensitive signal extraction can be realized.
  • individual cells can be identified (extraction of cell contours), analysis such as quantification of activity for each cell is possible.
  • fluorescently staining the organelles and analyzing the acquired fluorescence images and Raman images it is possible to analyze the intracellular organelles and CYP enzyme activity distribution.
  • Raman scattering signal included in the Raman spectrum may be used to detect other molecules or their redox states.
  • Raman scattering signals with specific wavenumbers indicative of molecules may originate from any of reduced/oxidized heme b, reduced/oxidized heme c, glycogen, cytochrome c, phenylalanine and lipids.
  • cytochrome c and glycogen can be used as indicators of the metabolic capacity of the liver. Metabolism is a reaction that produces the energy necessary for life support and synthesizes the necessary macromolecular compounds, and it is necessary to fully understand it in the development of medical technology and drug discovery. Methods using luminescence or fluorescence have been widely used as methods for measuring cytochrome c and glycogen. Furthermore, in recent years, unstained measurement using Raman spectroscopy is attracting attention. Raman spectroscopy utilizes the fact that substances exhibit specific spontaneous Raman scattered light.
  • Non-Patent Document 3 discloses Raman observation of cytochrome c in apoptotic cells.
  • Cytochrome c is a heme c protein present in cells or tissues. It is localized in mitochondria, one of the intracellular organelles, and is involved in apoptosis and energy production. Toxic effects on mitochondria are a cause of drug liver injury, and quantification and localization of cytochrome c are important factors. Cytochrome c contains a type c heme as a prosthetic genus. It emits a characteristic Raman signal different from type b heme contained in CYP and other proteins. That is, Raman scattering signals derived from the oxidation/reduction state of cytochrome c can be used as one of biomolecules other than CYP enzymes.
  • type b heme proteins such as cytochrome b 5 can also be detected.
  • Cytochrome b 5 plays an important role in the catalytic cycle of CYP enzymes, supplying electrons.
  • detection of phenylalanine, which indicates cytoplasm is included. The intensity of the phenylalanine Raman scattering signal reflects the density of the cytoplasm in the Raman observed area.
  • the specific activity of CYP can be obtained.
  • the Raman scattering signal of cytochrome c is used for normalization, the specific activity of CYP to mitochondrial activity can be obtained.
  • the Raman scattering signal of cytochrome b the specific activity of CYP to catalytic activity can be obtained.
  • the specific activity of CYP on sugar metabolism can be obtained.
  • cytochrome c, b, glycogen, and phenylalanine show specific distribution inside the cell derived from organelles (cytochrome c: distributed in mitochondria, cytochrome b: distributed in endoplasmic reticulum, phenylalanine: distributed throughout cytoplasm). It is expected to quantify the cell state and drug response by utilizing the relationship between each cell function and the shape and localization of organelles that can be measured from these Raman scattering signals.
  • the reduced heme c has a wavenumber of 604 cm -1
  • the reduced heme b has a wavenumber of 675 cm -1
  • the reduced heme structure (common to b and c) has a wavenumber of 750 cm -1
  • the oxidized heme structure (b and c) has a plurality of characteristic Raman scattering signals represented by a wavenumber of 1638 cm ⁇ 1 (Non-Patent Document 4).
  • Non-Patent Documents 5 to 12 When CYP enzymes having a heme structure or CYP3A4 take an oxidized structure, the wave numbers are 1368 cm -1 , 1371-1373 cm -1 , 1490 cm -1 , 1500 cm -1 , 1570 cm -1 , It is reported to have characteristic Raman scattering signals near 1590 cm -1 , 1630 cm -1 and 1640 cm -1 (Non-Patent Documents 5 to 12).
  • the wavenumbers of Raman scattering signals derived from reduced/oxidized heme b are 650-680 cm -1 , 900-1000 cm -1 , 1300-1373 cm -1 , 1490-1500 cm -1 or 1570-1590 cm -1 . It may be within the range of 1 (Non-Patent Document 13).
  • the wavenumbers of Raman scattering signals derived from reduced/oxidized heme c are 590-640 cm -1 , 730-755 cm -1 , 1120-1130 cm -1 , 1310-1370 cm -1 , or 1580-1640 cm May be in the range of -1 .
  • Glycogen is a polymer synthesized for temporary storage of excess glucose and is known to be synthesized mainly in the liver and skeletal muscle. It is an effective index of liver function and glucose metabolism.
  • the wavenumber of the Raman scattering signal derived from glycogen is 440-580 cm -1 , 840-945 cm -1 , 1020-1660 cm -1 (more preferably 1020-1120 cm -1 ), or 2900-2940 cm -1 . may be within the range of 1 .
  • the wavenumber of Raman scattering signals originating from lipids may be 1450 cm ⁇ 1 or 2850 cm ⁇ 1 .
  • FIG. 1 is a diagram for explaining the principle of Raman scattering.
  • a sample is irradiated with excitation light having a wavelength of ⁇ 0 such as a laser
  • scattering occurs in addition to reflection, refraction, and absorption.
  • Rayleigh scattering refers to scattering of light having the same wavelength as the incident light among the scattered light having the wavelength ⁇ .
  • the light whose frequency has decreased compared to the incident light that is, the light whose wavelength has shifted to the long wavelength side is called Stokes Raman scattering (hereinafter, Raman scattered light).
  • a Raman spectrum is obtained by spectroscopy the Raman scattered light generated from the sample with a diffraction grating and detecting it with a detector such as a CCD image sensor. Subsequently, a Raman scattering signal is extracted from the acquired Raman spectrum.
  • biological tissue in vivo
  • cultured cells in vitro
  • fixed biological tissue for example, biological tissue (in vitro), cultured cells (in vitro), and fixed biological tissue
  • Biological tissues are, for example, human- or animal-derived liver tissue, intestinal tissue (preferably small intestine tissue), renal tissue, brain tissue, and cells contained therein.
  • Cultured cells are, for example, hepatocytes, small intestinal epithelial cells, bile duct epithelial cells, renal cells, nerve cells, glial cells and the like.
  • the hepatocytes are parenchymal hepatocytes.
  • the cultured cells are primary cultured cells or immortalized cells.
  • the primary cultured cells can be human-derived primary hepatocytes (PHH).
  • the immortalized cell is a human liver tumor-derived cell line.
  • the cultured cells are cells differentiated therefrom.
  • a human liver tumor-derived cell line may be used, for example, HepaRG (trademark, HPR116, BIOPREDIC International) cells.
  • parenchymal hepatocytes differentiated or dedifferentiated from HepaRG cells may be used.
  • the cultured cells may also be cells differentiated from stem cells.
  • Stem cells include, but are not limited to, ES cells, iPS cells, somatic stem cells (eg, neural stem cells, hepatic stem cells, epithelial stem cells, etc.).
  • stem cells can be pluripotent stem cells (ie, ES cells or iPS cells).
  • the cultured cells may be liver cells (hepatocyte-like cells (HLC)) obtained by inducing differentiation of human iPS cells.
  • HSC hepatocyte-like cells
  • a "purified protein” is a CYP extracted from cells or synthesized from which contaminants have been completely or partially removed.
  • Synthetic CYP is a microbiologically prepared recombinant protein.
  • An "environment mimicking the intracellular environment” is an in vitro reaction system containing intracellular substances other than CYP enzymes.
  • the cultured cells are diluted in a medium and seeded on a quartz substrate dish for Raman observation.
  • the quartz substrate dish for Raman observation is a plastic dish having a quartz substrate adhered to the inner bottom surface of the dish.
  • cloning cylinders may be used to seed cells only on quartz substrates.
  • HepaRG trademark
  • cells cultured at 37° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 3 days may be used as samples.
  • a solution sample extracted from a tissue and containing contaminants, such as microsomes can be used as the target sample for Raman scattering.
  • extracting is not limited to The term "extracellular” as used herein is used to mean “in vitro” unless otherwise specified, but may be used to mean “extra-cellular” depending on the context.
  • the CYP enzyme group whose enzymatic activity is evaluated in this embodiment may be induced intracellularly using an inducer.
  • Rifampicin which is a kind of CYP enzyme inducer, mainly induces the expression of CYP3A4 among the CYP enzymes. As described above, this inducer can also induce the expression of CYP2B6, CYP2C9, and the like.
  • a Raman microscope (Non-Patent Document 3) may be used to identify a Raman scattering signal from a Raman spectrum having a specific wavenumber.
  • a laser beam is condensed into a straight line (X ⁇ m, hereinafter also referred to as a line) of a predetermined length to excite a Raman signal in the sample.
  • the laser light may be condensed into a point to excite the Raman signal.
  • a water immersion objective lens may be used for the excitation and detection of Raman scattering.
  • the Raman scattered light collected by the objective lens passes through a dichroic mirror and an edge filter that transmits long wavelengths, and then forms an image on the entrance slit of the spectrometer.
  • the Raman scattering signal imaged on the slit is then dispersed by the diffraction grating inside the spectrometer and detected by the CCD image sensor.
  • a cooled CCD image sensor for example, may be used as the CCD image sensor.
  • Raman scattering signals scattered from everywhere on the focused line are detected by different pixels on the CCD image sensor. It is preferable to determine the laser irradiation time so that these Raman scattering signals can be measured simultaneously and independently.
  • the laser irradiation time is, for example, 0.001 seconds to 3 minutes. It is preferably 0.01 seconds to 30 seconds. More preferably, it is 0.1 seconds to 15 seconds. Particularly preferably, it is 1 second to 10 seconds.
  • each Raman scattering signal is simultaneously detected in a linear region (line region) of a predetermined length in which the light is collected.
  • the laser irradiation and the detection of the Raman scattering signal are repeated while shifting the focusing position in the direction perpendicular to the direction of the focused line. For example, as shown in FIG. 1, a Raman image is acquired in a rectangular region of X ⁇ m ⁇ Y ⁇ m on the substrate.
  • the Raman image of an arbitrary area is acquired by repeatedly detecting the Raman scattering signal while shifting it to an arbitrary distance in the X-Y direction. As a result, a Raman image is finally obtained from an area of X ⁇ m in width and Y ⁇ m in height. You can switch the X and Y directions.
  • the laser light used as excitation light for example, it is preferable to use laser light with a wavelength of 406 nm to 561 nm, especially laser light with a wavelength of 532 nm as excitation light.
  • the inventors focused on resonant Raman scattering. In resonant Raman scattering, by exciting a molecule in its absorption band, vibrations originating in the absorption band can be selectively measured due to the resonance effect. Heme b and heme c have absorption bands called ⁇ / ⁇ bands near 520 to 560 nm. Therefore, when laser light with a wavelength of 532 nm is used as excitation light, Raman scattered light can be significantly increased due to the resonance effect.
  • laser light with wavelengths of 488, 561, 556, 543, 526, 523, 520, 515, 501, 450, 406 nm, etc. may be used to excite Raman scattering.
  • the Raman scattered light detected by the Raman scattering method of this embodiment is due to resonance Raman scattering.
  • Raman scattered light by non-resonant Raman scattering may also be detected.
  • FIG. 2 is a flowchart explaining a method of extracting Raman scattering signals.
  • the cosmic rays and the offset signal of the CCD image sensor which are noise contained in the measured Raman scattering signal, are removed.
  • the offset signal is a signal for offset adjustment of the CCD image sensor.
  • processing is performed to reduce the influence of noise that could not be removed as described above.
  • a noise removal method either a method using a singular value decomposition (SVD) method or a method of averaging Raman spectra for arbitrary analysis target regions can be used.
  • the singular value decomposition method can be used.
  • a method of averaging Raman spectra for arbitrary analysis target regions can be used.
  • the Raman scattering signal to be analyzed After removing the noise contained in the Raman scattering signal, the Raman scattering signal to be analyzed is extracted.
  • the Raman scattering signal to be analyzed refers to the Raman scattering signal (Raman scattering intensity) at a wavenumber of 1636 cm ⁇ 1 when detecting the enzymatic activity of the CYP enzyme group.
  • “extracting” the Raman scattering signal to be analyzed means defining an arbitrary Raman scattering intensity as the Raman scattering signal to be analyzed using a predetermined method.
  • a method of extracting the Raman scattering signal to be analyzed a first method or a second method described below can be used. The first method will be described with reference to FIGS. 3 and 4, and the second method will be described with reference to FIGS.
  • FIG. 3 shows the Raman spectrum after noise removal.
  • the Raman spectrum (Raman scattering signal) is represented by the Raman scattering intensity (Raman scattering signal intensity) on the vertical axis and the Raman shift (wave number) on the horizontal axis.
  • the Raman shift (wavenumber) on the horizontal axis represents the difference in wavenumber between incident light from excitation light such as a laser and Raman scattered light.
  • FIG. 4 is an enlarged view of the area indicated by the dashed line in FIG. This figure shows a method of extracting a Raman scattering signal to be analyzed using the first method.
  • the first method is suitable when there is a Raman scattering intensity peak of another biologically derived Raman scattering signal in the vicinity of the Raman scattering signal to be analyzed.
  • the intensity difference between the intensity of the linearly or nonlinearly approximated background signal and the peak of the Raman scattering intensity is defined as the Raman scattering signal to be analyzed. More specifically, first, the peak of the Raman scattering intensity of a specific wavenumber and the waveform containing the peak are specified. With respect to the peak of the Raman scattering intensity, the height to the peak apex is the intersection of a line connecting both ends of the base of the peak, that is, a straight line or a curved line, and a straight line drawn vertically from the peak apex to the wavenumber axis. is calculated as the Raman scattering signal to be analyzed.
  • the "line connecting both ends of the peak base” is not particularly limited as long as it can define the peak area.
  • FIG. 5 is an enlarged view of the area indicated by the dashed line in FIG. This figure shows a method of extracting a Raman scattering signal to be analyzed using the second method.
  • the Raman scattering signal to be analyzed has a sufficient signal-to-noise ratio (SN ratio) with respect to the background signal, and there is a Raman scattering signal intensity peak derived from another living body in the vicinity. This is a good method if you don't.
  • SN ratio signal-to-noise ratio
  • the peak of the Raman scattering intensity of a specific wavenumber and the waveform containing the peak are specified.
  • the "line connecting both ends of the peak base" is not particularly limited as long as it can define the peak area.
  • the Raman signal to be analyzed is defined as the difference between the peak intensity of the Raman scattering intensity to be analyzed and the intensity of the base of the peak.
  • the base of the peak refers to a convex point in the minus direction of the y-axis in the vicinity of the peak of the Raman scattering intensity to be analyzed.
  • the method described above defines the Raman scattering signal to be analyzed at wavenumbers 1320-1660 cm ⁇ 1 , preferably 1636 cm ⁇ 1 . If the Raman scattering signal (Raman scattering intensity) is increased in the cell, it indicates that the enzymatic activity of the CYP enzyme group is increased in the cell.
  • Raman spectroscopy Raman signals of biomolecules related to metabolic capacity can be detected from living cells under a microscope.
  • Raman signals of biomolecules that represent the state and structure of cells can also be detected at the same time.
  • the intracellular distribution of each detected biomolecule can be grasped with a spatial resolution at the organelle level, for example, with a spatial resolution of 200 nm.
  • the present invention also provides a method for evaluating the metabolic capacity of hepatocytes, comprising the following steps (hereinafter referred to as the "method for evaluating the metabolic capacity of hepatocytes of the present invention”: ): A step of irradiating hepatocytes with excitation light and obtaining a Raman spectrum using a photodetector, and a step of detecting Raman signals of biomolecules related to the metabolic ability of hepatocytes from the Raman spectrum.
  • the "biomolecule related to the metabolic capacity of hepatocytes” is not particularly limited as long as it is a biomolecule related to the metabolic capacity of hepatocytes.
  • it may be at least one selected from the group consisting of CYP enzymes, glycogen, cytochrome b5 , cytochrome c, lipids, and phenylalanine.
  • the wavenumber of the Raman scattering signal capable of detecting these biomolecules a known wavenumber may be used.
  • the wavenumbers used in the following examples can be used, but are not limited thereto.
  • the detection method according to the present invention is a method that utilizes the redox state derived from the molecular structure characteristic of CYP enzymes. Moreover, as described above, the redox state of the CYP enzymes is related to the metabolic mechanism of the CYP enzymes. Therefore, the data in the following examples obtained for CYP3A4 demonstrate that not only human CYP3A4 but also enzymatic activity of metabolism by CYPs derived from all kinds of organisms can be detected by the detection method of the present invention.
  • Hepatocytes Cultured cells were used in Examples. More specifically, frozen HepaRG cells (HPR116, BIOPREDIC International) differentiated into hepatocytes and bile duct epithelial cells were used. Frozen HepaRG cells were thawed using a 37°C water bath. Thawed HepaRG cells were subsequently diluted with medium (MIL600, ADD670, BIOPREDIC International). Subsequently, the diluted HepaRG cells were seeded on a quartz substrate dish for Raman observation (SF-S-D12, Fine Plus International, Japan).
  • medium MIL600, ADD670, BIOPREDIC International
  • the “quartz substrate dish for Raman observation” used for seeding is a plastic dish having a quartz substrate with a thickness of 0.15 mm and a diameter of 12 mm adhered to the bottom of the dish.
  • a cylindrical cloning cylinder (outer diameter: 10 mm, inner diameter: 8 mm, 1980005, Hilgenberg GmbH) was placed on the quartz substrate. 1.2 ⁇ 10 5 cells were seeded inside the cloning cylinder.
  • the cloning cylinder is placed on a quartz substrate. In other words, the cloning cylinder is not glued or fixed on the quartz substrate.
  • HepaRG cells adhere to the quartz substrate.
  • the cloning cylinder was removed from the quartz substrate.
  • the medium was replaced with fresh medium (MIL600, ADD670, BIOPREDIC International) when the cloning cylinder was removed.
  • HepaRG cells were cultured in the medium. Cultivation was carried out for 3 days at 37° C. in an atmosphere of 5% CO 2 .
  • the induction of the CYP enzyme group is explained. First, the medium for the HepaRG cell group in (1) above was replaced with a medium containing an inducer for the CYP enzyme group. The CYP enzyme group was induced by culturing the HepaRG cell group replaced with the medium containing the inducer described below for 48 hours at 37°C in an atmosphere of 5% CO 2 .
  • the medium used to induce the CYP enzyme group is MIL600, ADD650, BIOPREDIC International.
  • the inducer of the CYP enzyme group added to the medium one of the following four types was used: Rifampicin (189-01001), Fujifilm Wako, Japan; Phenytoin (16612082) Fujifilm Wako, Japan; Dexamethasone (04718863), Fujifilm Wako, Japan; Carbamazepine (034-23701) Fujifilm Wako, Japan.
  • the concentration of each inducer contained in the medium used in each example is as described in each example. These inducers promote transcription of the CYP gene.
  • Uninduced cell group Cells not induced with the control CYP enzyme group (hereinafter also referred to as uninduced cell group) were also cultured.
  • the medium of the HepaRG cell group in (1) was replaced with the above-mentioned inducer-free medium (MIL600, ADD650, BIOPREDIC International). Cultivation was performed at 37° C. under an atmosphere of 5% CO 2 for 48 hours.
  • the HepaRG cell group used for the inhibition of CYP3A which is one of the CYP enzymes, is the cell group in which the above-mentioned CYP enzymes were induced.
  • the medium of the HepaRG cell group in (1) was replaced with a medium containing rifampicin, which is a kind of inducer described above, and cultured at 37°C in an atmosphere of 5% CO 2 for 48 hours to obtain CYP enzymes. Groups were induced to obtain cell groups.
  • the cell population was used for inhibition of CYP3A.
  • Media used for inhibition of CYP enzymes are MIL600, ADD650, BIOPREDIC International.
  • Azamulin (18748, Cay chemical) was used as an inhibitor added to the medium.
  • the concentration of Azamulin contained in the medium used in each example is as described in each example.
  • the medium in which the CYP enzymes were induced was replaced with a medium containing the inhibitor Azamulin.
  • CYP3A one of the CYP enzymes, was inhibited by culturing the HepaRG cell group replaced with the medium containing Azamulin for 5 minutes at 37°C in an atmosphere of 5% CO 2 .
  • CYP3A4 activity in a cell group using a luminescence method In order to confirm the enzymatic activity of CYP3A4, which is expressed in hepatocytes among the CYP enzymes in the cell group subjected to Raman observation, in parallel with Raman observation, A test using a luminescence method (hereinafter referred to as a luminescence test) was performed.
  • the cell group used for the luminescence test was the cell group separated from the cultured cells used in the Raman observation described later in (5). That is, a group of cells cultured simultaneously under the same conditions as the cultured cells used in Raman observation was used.
  • CYP luminescence test was performed using a commercially available luminescence assay kit (P450-Glo-CYP3A4-Assay-and-Screening-System) according to the provided protocol.
  • the luciferin-IPA substrate is converted to luciferin by CYP3A4 and becomes a substrate for luciferase, producing luminescence proportional to the activity of CYP3A4.
  • the cell population medium was replaced with substrate-containing medium containing Luciferin-IPA substrate (V9002, Promega, Germany) at a concentration of 3 ⁇ M and incubated at 37° C. in an atmosphere of 5% CO 2 for 1 hour.
  • the Luciferin-IPA substrate is a CYP3A4-specific substrate.
  • the Luciferin-IPA substrate, a luciferin precursor, is converted to luciferin by the catalytic action of the CYP3A4 enzyme.
  • FIGS. 7, 14, 16, 18, 20 and 22 After incubation, the substrate-containing medium was collected and 50 ⁇ l was dispensed into a 96-well white flat bottom plate (Corning). 50 ⁇ l of luciferase was added dropwise to the dispensed substrate-containing medium, and luminescence was caused using the luciferin-luciferase reaction. Luminescence was detected using a micro-plate reader (Synergy HTX, BioTek). CYP3A4 activity detected by the present luminescence method is shown in FIGS. 7, 14, 16, 18, 20 and 22. FIG.
  • Western Blotting was used to detect CYP3A4 protein from a cell group in which CYP enzymes were induced.
  • a cell group cultured by inducing the CYP enzyme group using rifampicin as an inducer was used according to the method described in (2) above.
  • the CYP-induced cell group was washed twice with cold PBS and dissolved in a cell lysate.
  • Cells were lysed in RIPA Buffer containing protease inhibitor cocktail (1-100 dilution, Cat. No. P8340, Sigma Aldrich) for 30 minutes while cooling on ice.
  • a cell lysate containing lysed cells was collected using a cell scraper.
  • the recovered cell lysate was centrifuged (12000 g, 20 min) at 4°C, and the supernatant was collected to remove unnecessary precipitated cell debris.
  • the protein concentration contained in the supernatant of the cell lysate was measured using the BCA protein assay kit (Cat. No. 23227, ThermoFisher Scientific). Cell lysates were added to wells of 12% SDS-PAGE gels (Cat. No. 4568043, BioRad) and subjected to electrophoresis. A low fluorescence polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane was adhered to the gel after SDS-PAGE and transferred. Block the membrane after transfer using TBST (0.1% Tween-20 in TBS) solution containing 5% ECL blocking agent (Cat. No. RPN2125, GE Healthcare) for 1 hour at room temperature while stirring with a stirrer. was carried out. After that, the membrane was washed twice with a TBST solution.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the blocked membrane was treated with the primary antibodies mouse anti-CYP3A4 (1:2000), rabbit anti-cytochrome b 5 (1:1000), and rabbit anti- ⁇ -actin (1:1000 dilution, Cat. No. 4970). , Cell signaling Technology) and allowed to react overnight. Next, they were immersed in a blocking buffer containing secondary antibodies, horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse or anti-rabbit secondary antibodies (1:10000), and allowed to react at room temperature for 1 hour. Subsequently, the membrane was immersed in TBST buffer and washed three times.
  • CYP3A4 protein was detected using the ECL detection system (RPN2232, GE Healthcare) and the ChemiDOC MP imaging system (Bio-Rad).
  • the culture medium of the cultured cell group was removed, and the cell group was washed twice with PBS.
  • Observation solution Live Cell Imaging Solution (A14291DJ, Thermo Fisher Scientific) was added to the washed cell group.
  • the group of cells treated in this way was subjected to Raman observation using the Raman microscope (Non-Patent Document 3) described with reference to FIG. 1 (FIGS. 6, 9-11, 13-21, and Figure 26).
  • a 40x water immersion objective lens (CFI Apochromat Lambda S 40XC WI) equipped with the Raman microscope was used to excite the Raman scattered light of the cell group and detect the Raman scattering signal.
  • a laser beam with a wavelength of 532 nm was condensed into a straight line (hereinafter referred to as a line) of a predetermined length and irradiated using the water immersion objective lens.
  • the Raman scattered light collected by the water-immersion objective lens passes through a dichroic mirror and an edge filter that transmits long wavelengths, and is imaged on the entrance slit of the spectrometer.
  • the Raman scattering signal imaged on the slit is then separated by a diffraction grating inside the spectrometer and detected by a cooled CCD image sensor (PIXIS 400B, Princeton Instruments) used as a photodetector.
  • PIXIS 400B cooled CCD image sensor
  • Each Raman signal was detected simultaneously in an area of approximately 133.3 ⁇ m in the focused line direction.
  • This laser irradiation and detection of the Raman signal were repeatedly scanned while shifting the condensing position in a direction perpendicular to the direction of the condensed line by a scanning pitch of Z nm. That is, a rectangular area of 133.3 ⁇ m ⁇ Y ⁇ m was scanned with the laser to detect the Raman scattering signal of the cell population.
  • the laser energy density on the surface of the cell cluster when scanning the laser was 3 mW/ ⁇ m 2 .
  • the value of Y corresponding to the observation area width and the value of the scanning pitch Z in the direction parallel to Y differ depending on each embodiment.
  • Raman scattering signals Two types were used to detect the Raman signal.
  • detection of Raman scattering signals includes both quantitative measurement of Raman scattering signals and construction of Raman images.
  • a 1200-ruled diffraction grating (1200 L/mm, BLZ 500 nm) was used for quantitative measurement of the Raman scattering signal.
  • a 600-ruled diffraction grating 600 L/mm, BLZ 500 nm was used to construct the Raman image. This time, the diffraction gratings were used according to the purpose of each experiment, but it is not always necessary to use them properly as described above.
  • 600 and 1200 ruled gratings can be used for quantitative measurement of Raman scattering signals and construction of Raman images, respectively.
  • Raman scattering signals measured as Raman spectra were analyzed according to the method described in Non-Patent Document 14 using calculation software Matlab (Math works). After removing the cosmic rays and the photodetector offset signal contained in the measured Raman spectrum, the noise was removed using singular value decomposition (SVD). After that, a signal intensity distribution of an arbitrary Raman shift (wave number) was constructed to obtain a Raman image. In the quantitative measurement of Raman signals, we used data from which cosmic rays and camera offset were removed without noise removal by SVD. If necessary, the average of clear spectra, hereinafter referred to as the average spectrum, was calculated from multiple Raman spectra. The plurality of Raman spectra may be Raman spectra from areas where cells of interest are clustered, or from adjacent areas.
  • the Raman scattering signal intensity was defined as the area of the region surrounded by the straight line or curve connecting both ends of the peak base and the waveform of the Raman scattering signal, and the Raman scattering signal intensity was calculated.
  • the height to the peak apex is the Raman scattering signal intensity and the Raman scattering signal intensity was calculated.
  • the signal intensities of the Raman scattering signals extracted by the method described with reference to FIG. 4 were used to create each boxplot in this example. Using the above two methods, we investigated the correlation between the Raman scattering signal to be analyzed and CYP activity.
  • the cell group was fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature for 20 minutes.
  • Cell membrane permeabilization was performed using a solution obtained by diluting Triton-X-100 to 0.1% with PBS (phosphate-buffered saline). After washing, blocking treatment was performed at room temperature for 1 hour using 4% bovine serum albumin (A2153, Sigma Aldrich) in order to suppress non-specific staining.
  • Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody (10 g/ml, A11001, Invitrogen) and Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody (10 g/ml) were used as secondary antibodies.
  • A11012, Invitrogen was added dropwise and allowed to react at room temperature for 1 hour. Staining was performed after washing three times with a PBS solution. For staining, DAPI (D1306, Invitrogen) was added at a concentration of 1M, reacted at room temperature, and cell nuclei were stained. Finally, the cell cluster was washed twice with PBS and stored at 4°C in the dark until fluorescence observation.
  • FIGS. 12 and 24 Fluorescent images obtained by the above method are shown in FIGS. 12 and 24.
  • FIG. Examples 1 to 7 will be described in detail below with reference to FIGS. 6 to 26.
  • rifampicin a CYP enzyme inducer
  • Rifampicin mainly induces the expression of CYP3A4 among CYP enzymes.
  • This inducer also induces the expression of CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, and CYP2C19 (Non-Patent Document 15).
  • Non-Patent Document 2 rifampicin mainly induces the expression of CYP3A4 among the CYP enzymes, and that CYP3A4 accounts for one-third of all CYP enzymes expressed in the liver.
  • Raman observation, luminescence test, and Western blotting were performed on cultured cells in parallel.
  • the luminescence test was performed to confirm the enzymatic activity of CYP3A4 in particular among the CYP enzymes in the cell group subjected to Raman observation.
  • Western blotting was performed to detect CYP3A4 protein from the cell population.
  • HepaRG cells human hepatocytes
  • CYP enzymes were induced according to the procedures described in (1) and (2) above.
  • An inducer of the CYP enzyme group (Rifampicin) was added at a concentration of 4 ⁇ M.
  • an uninduced cell group was also cultured using a medium containing no CYP enzyme inducer (MIL600, ADD650, BIOPREDIC International).
  • liver parenchymal cells When cultured for 6 days after seeding, HepaRG cells aggregate with liver parenchymal cells and bile duct epithelial cells to form separate cell groups. On the cell-seeded quartz substrate, areas where liver parenchymal cells and bile duct epithelial cells form cell clusters can be identified by bright-field microscopic observation.
  • CYP enzymes are known to be expressed only in liver parenchymal cells. Therefore, the object of Raman observation in this example is liver parenchymal cells.
  • a cell group for Raman observation and luminescence test was separated from the cell group of liver parenchymal cells in which the CYP enzyme group was induced.
  • CYP enzyme group uninduced liver parenchymal cell groups were also isolated for Raman observation and luminescence test, respectively.
  • FIG. 6 shows Raman spectra of liver parenchymal cells in which CYP enzymes were induced.
  • the average spectrum of the area where liver parenchymal cells are concentrated was calculated and plotted.
  • the light gray line (Induced) indicates the spectrum of the liver parenchymal cell group in which the CYP enzyme group was induced by rifampicin.
  • the dark gray line (Control) indicates the spectrum of the CYP enzyme group-uninduced liver parenchymal cell group.
  • the bar graph in Figure 7 shows that the CYP3A4-induced cell group using rifampicin has increased CYP activity compared to the CYP3A4-uninduced cell group.
  • Non-Patent Document 4 Raman signals near wavenumbers of 1370 cm ⁇ 1 and 1636 cm ⁇ 1 originate from type b and type c oxidized heme.
  • a group of CYP enzymes induced by rifampicin are type b heme proteins (Non-Patent Document 12). Therefore, the above Raman observation results are in good agreement with the prediction that the Raman signal at wavenumber 1370 and 1636 cm ⁇ 1 is caused by CYP enzymes having type b heme as a prosthetic genus.
  • the molecules of these CYP enzymes are mainly CYP3A4.
  • the Raman signal at wave number 1370 and 1636 cm ⁇ 1 is a Raman signal detected only in liver parenchymal cells. This result is consistent with the fact that CYP enzymes are expressed only in liver parenchymal cells and not in bile duct epithelial cells. A specific description will be given below with reference to FIGS. 9 and 10.
  • FIG. 9 A specific description will be given below with reference to FIGS. 9 and 10.
  • FIG. 9 is a graph showing Raman spectra of liver parenchymal cells and bile duct epithelial cells.
  • the black line indicates the average Raman spectrum within a given region of liver parenchymal cells.
  • the gray line indicates the average Raman spectrum within a given region of the biliary epithelial cell population.
  • the vertical axis of the graph is the Raman scattering intensity (Raman scattering signal intensity), and the horizontal axis is the Raman shift (wave number).
  • the Raman signal with a wavenumber of 1636 cm ⁇ 1 can be confirmed only in hepatocytes (black line) and not in bile duct epithelial cells (gray line).
  • the Raman signal with a wavenumber of 1370 cm ⁇ 1 also shows the same tendency as the Raman signal with a wavenumber of 1636 cm ⁇ 1 .
  • FIG. 10 is a Raman image constructed based on specific Raman peaks.
  • the far left of FIG. 10 is a bright field photograph.
  • the upper side of the white line drawn in the bright-field photograph indicates liver parenchymal cells, and the lower side (inner side) of the white line indicates bile duct epithelial cells.
  • the predetermined region of the liver parenchymal cell group indicated by the black line in FIG. 9 is indicated by the upper white square, and the predetermined region of the bile duct epithelial cell group indicated by the gray line in FIG.
  • FIG. 9 is a graph showing the average Raman spectrum within the given region.
  • FIG. 10 shows Raman images at wavenumbers of 600, 675, 940 and 1636 cm ⁇ 1 , respectively. Although not explicitly shown in FIG. 10, the Raman image with a wavenumber of 1370 cm ⁇ 1 also shows the same tendency as the Raman image with a wavenumber of 1636 cm ⁇ 1 .
  • Glycogen (940 cm ⁇ 1 ) and CYP enzyme group (1370, 1636 cm ⁇ 1 ) represent biomolecules resulting from liver metabolic functions.
  • Other Raman peaks (600, 675 cm -1 ) represent heme proteins distinct from the CYP enzyme family.
  • the Raman signal at 600 cm -1 indicates reduced cytochrome c
  • the Raman signal at 675 cm -1 indicates reduced cytochrome b.
  • a Raman image constructed using the Raman signals of each wavenumber shows the concentration distribution of molecules resulting from each Raman signal.
  • the Raman signal at 750 cm -1 is derived from reduced forms of cytochrome c and cytochrome b, and shows a distribution such that images at 600 cm -1 and 675 cm -1 are superimposed (not shown).
  • CYP3A4-induced cells the concentration of glycogen molecules decreases and the concentration of CYP enzyme group molecules increases. Concentration distributions of other heme proteins do not correlate with CYP3A4 induction. Since cytochrome c is mainly distributed in mitochondria, Raman images of reduced cytochrome c show mitochondria, and cytochrome b is mainly distributed in the ER (endoplasmic reticulum). Show distribution.
  • the intracellular intensity distribution of the Raman signal with a wavenumber of 600 cm ⁇ 1 was confined to fine structures such as mitochondria.
  • the intracellular intensity distribution of the Raman signal with a wavenumber of 1636 cm -1 spread throughout the cytoplasm.
  • the endoplasmic reticulum, in which CYP enzymes, which are type b heme proteins, are distributed originally has a finer network structure than mitochondria (Non-Patent Document 18). Therefore, with the spatial resolution of the microscope used in this experiment (about 260 nm), it is considered impossible to observe a clear image in which the distribution of the Raman signal matches the structure. Therefore, the intensity distribution of Raman signals at 1370 and 1636 cm ⁇ 1 in FIG. 11 is consistent with the observation that the endoplasmic reticulum is distributed throughout the cytoplasm.
  • Cytochrome b is a type b heme protein similar to CYP enzymes, and its signal distribution shows the cytoplasmic distribution similar to that of the Raman signal at wavenumber 1370, 1636 cm -1 . Therefore, it can be said that the Raman signal at wave number 1370 and 1636 cm ⁇ 1 is a type b heme protein distributed in the endoplasmic reticulum.
  • 1636 cm -1 is derived from CYP enzymes but not from cytochrome b 5 .
  • Raman of human hepatocytes in which CYP enzymes were induced using rifampicin Observation results and immunostaining results were compared.
  • CYP3A4 and cytochrome b 5 were immunostained and fluorescence observation was performed.
  • CYP3A4 has the highest expression level among the CYP enzymes induced by rifampicin.
  • cytochrome b 5 is a type b heme protein other than CYP enzymes known to exist in the endoplasmic reticulum.
  • FIG. 12 is a fluorescence image acquired by the method (8) above.
  • cytochrome b 5 and CYP show the entire cytoplasm.
  • Cytochrome b 5 is also reported to be distributed in the endoplasmic reticulum like CYP enzymes.
  • Our Raman observations are also consistent with findings previously reported for cytochrome b5 . Therefore, it is confirmed as follows that the Raman signal at wave number 1370 and 1636 cm ⁇ 1 is not derived from cytochrome b 5 . Specifically, comparing the Raman signal intensities as shown in FIG.
  • the Raman signal at a wave number of 1370 and 1636 cm ⁇ 1 is increased in the cells induced with rifampicin.
  • the change in Raman signal intensity at a wavenumber of 675 cm ⁇ 1 did not differ significantly between the induced and uninduced cell groups.
  • the results of immunostaining also showed a similar tendency.
  • the fluorescence intensity of the label for CYP3A4 was increased only in cells in which the CYP enzyme group was induced.
  • the fluorescence intensity of the label for cytochrome b 5 did not differ significantly between the induced group and the control group. Therefore, it can be said that the Raman signals at wave numbers of 1370 and 1636 cm -1 derived from type b oxidized heme proteins are mainly derived from CYP enzymes rather than cytochrome b 5 .
  • the Raman signal intensity distribution and the fluorescence intensity distribution do not match in some cells. This difference in distribution is thought to be derived from CYP molecules other than CYP3A4. This is because only CYP3A4 can be specifically detected in the fluorescence image, whereas all CYP molecules are detected in the Raman image.
  • Non-Patent Document 15 Non-Patent Document 15
  • the inducer induces the expression of CYP3A4 in human hepatocytes (HepaRG cells). Therefore, we induced CYP3A4 in human hepatocytes (HepaRG cells) using an inducer (Rifampicin) with different concentrations. Hepatocytes were seeded, cultured and induced according to the procedures (1) and (2) above. The inducer (Rifampicin) was added at concentrations of 0, 0.04, 0.4, and 4 ⁇ M.
  • CYP3A4 activity expressed in cells was detected using a luminescence method in some of the induced cells according to the procedure shown in (3) above.
  • Raman observation was performed on the other cells according to the procedure shown in (5) above.
  • Raman spectra were acquired by irradiating a rectangular region of 133.3 ⁇ m x 84 ⁇ m with a laser at a scanning pitch of 1 ⁇ m at each of three locations in the culture dish. Noise was removed from the acquired Raman spectrum according to the methods described in (6) and (7) above.
  • the Raman signal at a wave number of 1370 and 1636 cm ⁇ 1 was derived from the CYP enzyme group and was presumed to correlate with the CYP enzyme group activity. Therefore, as shown in FIG. 13, a Raman image of a rectangular region was reconstructed using the distribution of Raman signals at a wavenumber of 1636 cm ⁇ 1 (oxidized type b heme protein). The Raman signal with a wavenumber of 1636 cm -1 is uniformly distributed throughout the cytoplasm. Note that FIG. 13 shows an area of 84 ⁇ 84 ⁇ m cut out from the acquired Raman image.
  • the signal intensity is the height to the peak apex, with the point of intersection of the straight line connecting both ends of the peak base at the peak including wavenumber 1636 cm -1 and the straight line drawn perpendicular to the wavenumber axis from the apex of the peak waveform as the origin. extracted as
  • light gray bars show CYP3A4 activity detected using the luminescence method.
  • the dark gray bar graph shows the Raman signal at wave number 1636 cm ⁇ 1 extracted from the Raman spectrum averaged over the liver parenchymal cell region.
  • the Raman signal intensity at a wavenumber of 1636 cm -1 for each concentration of rifampicin added was compared with the results of CYP3A4 activity using the luminescence method. It was confirmed that as the concentration of the administered rifampicin increased, the Raman signal intensity at a wave number of 1636 cm ⁇ 1 indicating the CYP enzyme group and the activity of CYP3A4 increased. Therefore, it can be said that the Raman signal with a wavenumber of 1636 cm ⁇ 1 has a positive correlation with the activity of CYP3A4.
  • FIG. 15 is a boxplot showing variations in CYP enzyme group activity among cells.
  • Each plot is a Raman signal with a wave number of 1636 cm ⁇ 1 extracted from the average spectrum for each cell according to the method described above. It can be confirmed that the induced CYP enzyme group activity differs from cell to cell even under the condition that the dose concentration of rifampicin is constant. What was shown by the detection of CYP enzyme group activity using Raman signals indicates that the cells in the culture dish do not uniformly increase CYP activity. In addition, it was confirmed that the median value of the plot under each dosage concentration condition of rifampicin increased with the dosage concentration of rifampicin. This median increase was statistically significant. It also correlates well with increased CYP3A4 activity.
  • Activated PXR translocates from the cytoplasm into the nucleus, forms a heterodimer with the retinoid X receptor (RETINOID X RECEPTOR: RXR), binds to the promoter sequence, and promotes transcription of the target gene (non-patented References 20-22), as a result of which the expression of CYP enzymes is promoted.
  • CYP3A4 is primarily transcriptionally enhanced through PXR.
  • HepaRG cells Human hepatocytes (HepaRG cells) were seeded, cultured and induced according to the procedures (1) and (2) above.
  • Four inducers (Rifampicin, Phenytoin, Dexamethasone and Carbamazepine) were added at concentrations of 4, 100, 100 and 100 ⁇ M, respectively.
  • uninduced hepatocytes cultured in a medium containing no inducer (MIL600, ADD650, BIOPREDIC International) were also prepared. In order to carry out the luminescence method and Raman observation, cells were separated from these cell groups for each observation.
  • HepaRG cells A part of the induced human hepatocytes (HepaRG cells) was used for the luminescence method as a control experiment for the Raman observation, and the remaining human hepatocytes (HepaRG cells) were used for the Raman observation.
  • the luminescence method and Raman observation were performed according to the procedures described in (3) and (5) above, respectively.
  • the activity of CYP3A4 in human hepatocytes (HepaRG cells) was measured.
  • the Raman signal at 1636 cm -1 is expected to correlate well with CYP activity.
  • the Raman signal at 1636 cm ⁇ 1 was extracted and compared with the detection results of CYP3A4 using the luminescence method.
  • Figures 16 and 17 show the measurement results of CYP enzyme group activity when induced using rifampicin, phenytoin, carbamazepine, and dexamethasone as inducers.
  • CYP3A4 activity induced by various drugs could be measured using Raman signals with a wave number of 1636 cm -1 .
  • FIG. 16 shows CYP3A4 activity (light gray) and Raman signal (dark gray) detected using the luminescence method.
  • the black bar graph in FIG. 16 plots the Raman signal intensity at a wave number of 1636 cm ⁇ 1 , which is the Raman peak of the CYP enzyme group, after averaging the Raman spectra detected from the liver parenchymal cell region.
  • FIG. 17 is a boxplot showing the variation in CYP enzyme group activity for each cell.
  • Each plot is a Raman signal with a wavenumber of 1636 cm ⁇ 1 extracted from the average spectrum for each cell in the same manner as described above. Similar to the results in FIG. 15, the induced CYP enzyme group activity differs from cell to cell even under certain culture conditions. Moreover, not all cells in a culture dish uniformly increase CYP activity. Also, the increase and decrease in the median value of the plot under each culture condition agrees well with the variation in CYP3A4 activity detected by the luminescence method. The increase in the mean value of the plot was statistically significant.
  • IL-6 Interleukin-6
  • HepaRG cells human hepatocytes
  • IL6 Interleukin-6
  • IL6 is a primary mediator of the acute phase response and one of the cytokines that plays a central role in multiple chronic inflammatory diseases. IL6 release occurs when cells are exposed to inflammatory or infectious stress.
  • IL6 is known to suppress the expression of CYP3A4 mRNA in HepaRG cells, a liver cancer cell line (Non-Patent Document 23). Suppression of mRNA expression results in suppression of CYP3A4 protein expression.
  • hepatocytes For the downregulation of CYP enzyme group activity using IL-6, hepatocytes that had been seeded and cultured according to the procedure in (1) above were used. Prior to administration of IL-6, induction of all CYP enzyme group types, ie non-specific induction of CYP enzyme group types, was performed. Non-specific induction of CYP enzymes was performed by culturing HepaRG cells for 2 days in a medium containing 2% DMSO (MIL600, ADD620, BIOPREDIC International). After that, the cells were cultured for 48 hours in a medium (MIL600, ADD650, BIOPREDIC International) containing IL-6 (206-IL-010/CF, R&D systems) at a concentration of 2 ng/ml.
  • MIL600, ADD650, BIOPREDIC International containing IL-6 (206-IL-010/CF, R&D systems) at a concentration of 2 ng/ml.
  • hepatocytes cultured for 48 hours in a medium containing no IL-6 (MIL600, ADD650, BIOPREDIC International) were also prepared.
  • MIL600, ADD650, BIOPREDIC International a medium containing no IL-6
  • Raman observation cells were taken from these cell groups for each observation.
  • HepaRG cells A portion of induced and IL-6 administered human hepatocytes (HepaRG cells) were used for the luminescence method as a control experiment for Raman observation, and the remaining human hepatocytes (HepaRG cells) were used for Raman observation.
  • the luminescence method and Raman observation were performed according to the procedures described in (3) and (5) above, respectively, to measure the activity of CYP3A4 in human hepatocytes (HepaRG cells).
  • the Raman signal at 1636 cm -1 expected to correlate well with CYP activity was extracted and compared with the results of CYP3A4 using the luminescence method.
  • Figures 18 and 19 show the results of detection of downregulation of CYP activity by administration of IL-6 using Raman signals. As a result, it was detected by a luminescence test that the activity of CYP3A4 was also reduced, which agreed well with the results of Raman measurement.
  • the bar graph in FIG. 18 shows CYP3A4 activity (light gray) and Raman signal (dark gray) detected using the luminescence method.
  • the dark gray bar graph in FIG. 18 shows the Raman signal intensity obtained by averaging the Raman spectrum from the liver parenchymal region and plotting the Raman signal at the wave number of 1636 cm ⁇ 1 , which is the Raman peak of the CYP enzyme group.
  • Gray bar graphs show CYP activity detected by the luminescence method.
  • the signal was extracted from the peak including the wavenumber of 1636 cm -1 with the intersection of a straight line connecting both ends of the base of the peak and a straight line drawn vertically from the apex of the peak waveform to the peak apex. Height was taken as signal strength.
  • FIG. 19 is a boxplot showing variations in CYP enzyme group activity among cells.
  • Each plot is a Raman signal with a wave number of 1636 cm ⁇ 1 extracted from the average spectrum of each cell in the same manner as above. Similar to the results in FIG. 15, the CYP enzyme group activity differs from cell to cell even under certain culture conditions. In addition, the CYP activity of all the cells in the culture dish does not decrease uniformly. In addition, the decrease in the median value of the plot under each culture condition (with or without administration of CYP enzyme group expression inhibitors) agrees well with the variation in CYP3A4 activity detected by the luminescence method. The observed reduction in the median of the plots was statistically significant.
  • HepaRG cells human hepatocytes
  • HepaRG cells Human hepatocytes (HepaRG cells) were seeded and cultured according to the procedure in (1) above. In order to carry out the luminescence method and Raman observation, cells were separated from these cell groups for each observation. CYP enzyme group activity was detected by luminescence and Raman observation 6 hours, 24 hours and 48 hours after inoculation of HepaRG cells.
  • HepaRG cells prepared human hepatocytes
  • HepaRG cells the remaining human hepatocytes
  • the luminescence method and Raman observation were performed according to the procedures described in (3) and (5) above, respectively, to measure the activity of CYP3A4 in human hepatocytes (HepaRG cells).
  • different cell groups seeded and cultured at the same timing were observed at each time point.
  • the Raman signal at 1636 cm -1 expected to correlate well with CYP activity was extracted and compared with the results of CYP3A4 using the luminescence method.
  • Figures 20 and 21 show the results of detection of changes in CYP activity of HepaRG cells over time by a luminescence method and Raman observation, respectively.
  • the time course of CYP enzyme group activity was measured using Raman signals with a wave number of 1636 cm -1 .
  • the dark gray bar graph in FIG. 20 plots the Raman signal intensity at a wave number of 1636 cm ⁇ 1 , which is the Raman peak of the CYP enzyme group, after averaging the Raman spectrum from the region of the liver parenchymal cells.
  • CYP activity detected by a luminescence method is shown.
  • the signal was extracted from the peak including the wavenumber of 1636 cm -1 with the intersection of a straight line connecting both ends of the base of the peak and a straight line drawn vertically from the apex of the peak waveform to the peak apex. Height was taken as signal strength.
  • FIG. 21 is a boxplot showing variations in CYP enzyme group activity among cells.
  • Each plot is a Raman signal with a wavenumber of 1636 cm ⁇ 1 extracted from the average spectrum for each cell in the same manner as described above. Similar to the results in FIG. 15, the CYP enzyme group activity differs from cell to cell even under certain culture conditions. Also, the cells in the culture dish do not uniformly lose CYP activity. Also, the decrease in the median value of the plot under each culture condition (differences in time points) agrees well with the variation in CYP3A4 activity detected by the luminescence method. The reduction in the mean value of the plot was statistically significant.
  • a Raman signal with a wavenumber of 1370 cm -1 can also be used to measure CYP enzyme activity.
  • Azamulin is known as a mechanism-based inhibitor (MBI) that specifically acts on CYP3A (including CYP3A4) (Non-Patent Document 24). Azamulin therefore inhibits CYP3As activity in human hepatocytes (HepaRG cells).
  • MBI mechanism-based inhibitor
  • Azamulin metabolized by the catalytic action of CYP3As produces highly reactive metabolites. Irreversible covalent bonding of its metabolites with CYP3As, including CYP3A4, inhibits the catalytic action (metabolic capacity) of CYP3As.
  • CYP3As are inhibited, the drug in the body is not metabolized and the blood concentration of the drug increases. As a result, the risk of changes in therapeutic effects and the occurrence of serious side effects increases. Therefore, detection of a decrease in CYP3As activity (drug-metabolizing ability) due to inhibitors is important in techniques for evaluating CYP3As activity.
  • Hepatocytes were seeded, cultured, induced, and inhibited according to the procedures (1) and (2) above.
  • the inducer (Rifampicin) and inhibitor (Azamulin) were added to the medium at concentrations of 4 ⁇ M and 10 ⁇ M, respectively.
  • As a control human hepatocytes (HepaRG cells) cultured in a medium (MIL600, ADD650, BIOPREDIC International) containing no inhibitor (Azamulin) after induction were also prepared. In order to perform the luminescence method and the Raman observation, cells were sorted for each observation from these cell groups.
  • HepaRG cells prepared human hepatocytes
  • HepaRG cells the remaining human hepatocytes
  • the luminescence method and Raman observation were performed according to the procedures described in (3) and (5) above, respectively, to measure the activity of CYP3A4 in human hepatocytes (HepaRG cells).
  • the Raman signal at 1636 cm -1 expected to correlate well with CYP activity was extracted and compared with the results of CYP3A4 using the luminescence method.
  • Figures 22 and 23 show the activity of the CYP enzymes detected by the luminescence method and Raman observation, respectively.
  • CYP3A4 activity is measured by a luminescence method depending on the presence or absence of CYP3A4 inhibition by Azamulin.
  • CYP was induced with rifampicin before administration of Azamulin as described above. From the results of detection by the luminescence method in FIG. 22, it was confirmed that 82% of all CYP3A4 lost their activity due to CYP enzyme group inhibition by Azamulin for 5 minutes.
  • FIG. 23 shows the relationship between the presence or absence of CYP3A4 inhibition by Azamulin and Raman signals at a wavenumber of 1636 cm ⁇ 1 .
  • Extraction of the Raman scattering signal was performed using the intersection of a straight line connecting both ends of the base of the peak containing a wavenumber of 1636 cm -1 and a straight line drawn perpendicular to the wavenumber axis from the top of the peak waveform as the origin. The height up to was measured as the signal intensity.
  • CYP was induced with rifampicin before administration of azamulin.
  • FIG. 23 shows that administration of Azamulin reduces the Raman signal at a wavenumber of 1636 cm ⁇ 1 .
  • Each plot is a Raman signal with a wave number of 1636 cm -1 extracted from the Raman spectrum averaged for each cell.
  • the Raman signal with a wavenumber of 1636 cm -1 varies among individual cells. This indicates a difference in CYP enzyme group activity between cells.
  • the median value of the plot is decreased in human hepatocytes treated with Azamulin (HepaRG cells) compared to cells induced with rifampicin but not treated with Azamulin. From this, it can be said that the inhibition of the CYP enzyme group activity could be detected by observing the Raman signal with a wavenumber of 1636 cm ⁇ 1 .
  • the signal of oxidized heme b correlates with the CYP enzyme activity of intracellular CYP enzymes. More specifically, by considering the following (1) to (7), it is understood that the enzymatic activity of the CYP enzyme group has a clear correlation with the number of molecules of the oxidized CYP enzyme group: (1) As a major premise, CYP3A4 accounts for the majority (about 30%) of CYPs present in the liver in humans. (Pharmacology & Therapeutics 138 (2013) 103-141.
  • Cytochrome P450 enzymes in drug metabolism Regulation of gene expression, enzyme activities, and impact of genetic variation
  • the possibility of cause 1) is considered to be low. This is because it is considered that inhibition of CYP enzyme group activity for 5 minutes using Azamulin does not change the number of hemoproteins. Therefore, it is considered that causes 2) and 3) affect the results of Raman observation shown in FIG. In order to confirm the effect of cause 2), the intensity distribution of the Raman signal at a wavenumber of 675 cm -1 indicating type b reduced hemeprotein and the Raman signal at a wavenumber of 1636 cm -1 indicating type b oxidized hemeprotein.
  • FIG. 24 includes a Raman image acquired by the method (5) above and a fluorescence image acquired by the method (8) above. If the administration of azamulin changes the oxidized CYP enzyme group to the reduced state as shown in cause 2), the intracellular Raman signal at a wave number of 675 cm -1 should increase. However, as can be confirmed from the Raman observation results in FIG. 24, the Raman signal with a wavenumber of 675 cm ⁇ 1 did not increase.
  • a Raman scattering signal group was used in which other Raman signals were added to the Raman signals with wavenumbers of 1370 to 1636 cm ⁇ 1 indicating CYP metabolic activity.
  • the Raman signal at wavenumber 940 cm -1 originates from glycogen associated with sugar metabolism.
  • Wavenumber 600 cm -1 originates from cytochrome c involved in energy production.
  • the Raman signal with a wave number of 2850 cm -1 is involved in lipid metabolism in the liver.
  • Hepatocytes were seeded, cultured, and induced according to the methods described in (1) and (2) above. However, the timing of medium exchange, CYP induction, and CYP measurement differs from (1) and (2) above.
  • medium was replaced with medium (MIL600, ADD670, BIOPREDIC International) 1 day and 4 days after seeding, and CYP induction was performed on days 6 and 7 after seeding with 4 ⁇ M rifampicin. It was replaced with medium (MIL600, ADD650, BIOPREDIC International). Control cells were cultured using medium (MIL600, ADD650, BIOPREDIC International) without inhibitor (Azamulin).
  • HepaRG cells prepared human hepatocytes
  • HepaRG cells the remaining human hepatocytes
  • the luminescence method and Raman observation were performed on the 1st and 8th days after seeding according to the procedures described in (3) and (5), respectively, and the activity of CYP3A4 in human hepatocytes (HepaRG cells) was measured. .
  • FIG. 25 shows the relationship between liver parenchymal cells and various Raman scattering signals.
  • the light gray dashed line is the Raman spectrum of HepaRG cells measured on Day 1
  • the light gray solid line is the Raman spectrum measured on Day 8
  • the dark gray solid line is the induction of CYP enzyme group with 4 ⁇ M rifampicin from Day 6.
  • the Raman spectra measured on Day 8 of the cells subjected to the above are shown.
  • the Raman signal with a wave number of 1636 cm ⁇ 1 derived from the CYP enzyme group increases according to the number of days of liver parenchymal cell culture or due to the induction of the CYP enzyme group.
  • the 940 cm -1 wavenumber Raman signal derived from glycogen increases with the number of days of liver parenchymal cell culture.
  • Rifampicin dosing reduces the Raman signal.
  • Rifampicin has the effect of promoting the decomposition of glycogen, and this example demonstrated that this phenomenon can be observed without labeling by using a Raman microscope.
  • the Raman signal intensity per unit cell at wavenumbers 675 and 600 cm -1 indicating cytochrome b 5 and cytochrome c did not change.
  • the Raman signal at a wavenumber of 2850 cm -1 indicative of lipids, was slightly reduced by CYP induction.
  • FIG. 26 shows the intracellular distribution of each Raman signal.
  • FIG. 26 shows that using the Raman data measured according to the procedure described in (5) above, the Raman signal indicating each biomolecule is extracted according to the methods described in (6) and (7) above, and intracellularly obtained the signal intensity distribution of Extraction of the Raman scattering signal was performed using the intersection of a straight line connecting both ends of the base of the peak containing a wavenumber of 1636 cm -1 and a straight line drawn perpendicular to the wavenumber axis from the top of the peak waveform as the origin. The height up to was measured as the signal intensity.
  • Raman signals at wave numbers of 675, 940 and 1636 cm -1 derived from cytochrome b 5 , glycogen, and CYP enzymes are mainly expressed in liver parenchymal cells and rarely observed in bile duct epithelial cells.
  • Raman signals at wavenumbers of 600, 1000 and 2850 cm ⁇ 1 representing cytochrome c associated with energy production, the essential amino acid phenylalanine, and lipids are visible in all cells in the field of view. The distribution of each signal intensity corresponds to the mitochondria where cytochrome c exists, the entire cytoplasm where phenylalanine exists, and the lipid existence range where lipid exists.
  • PHH was thawed using the OptiThaw hepatocyte isolation kit and cultured on a quartz-bottomed 35 mm dish (SF-S-D12; Fine Plus International) for Raman observation.
  • the quartz on the bottom of a 35 mm dish was pre-coated with collagen, a silicon ring with an inner diameter of 15 mm was placed on the quartz, and 3.2 ⁇ 10 4 cells were seeded inside the ring.
  • PHH adhered to the culture surface (7 hours after seeding) Raman measurements were performed.
  • HepaRG (human hepatocyte-derived cell line) at the same density was used as a control.
  • FIG. 27 shows Raman spectra of PHH and HepaRG cells. A signal at 1636 cm ⁇ 1 indicating CYP activity was observed in all cells.
  • FIG. 28 shows cell images of PHH and HepaRG visualizing Raman signals corresponding to each spectrum. It was found that intracellular CYP activity was observed in both PHH and HepaRG cells at 1636 cm -1 indicating CYP activity. This result indicates that CYP activity can be detected not only in HepaRG but also in primary hepatocytes, and its intracellular distribution can be visualized.
  • HEC liver-like cells differentiated from human induced pluripotent stem cells
  • hiPSCs were seeded in a 35 mm dish with a quartz bottom pretreated with Matrigel (BD science). A 4 ⁇ 10 5 cell culture area was restricted by a silicon ring with an inner diameter of 15 mm. Stepwise differentiation induction of definitive endoderm cells, hepatoblast-like cells, and hepatocyte-like cells (HLC) was performed for 25 days without intermediate passage.
  • hiPS cells were incubated in RPMI1640 medium (Sigma-Aldrich) containing 100 ng/ml Activin A (R&D Systems), 1 ⁇ Gluta-MAX (Thermo Fisher Scientific), 1 ⁇ B27 Supplement Minus Vitamin A (Thermo Fisher Scientific) for 4 days. cultured and induced to differentiate into definitive endoderm cells.
  • the medium contains 20 ng/ml BMP4 (R&D Systems), 20 ng/ml FGF4 (R&D Systems), 1 ⁇ GlutaMAX, 1 ⁇ B27 Supplement Minus Vitamin A
  • the medium was changed to RPMI1640 medium and cultured for 5 days.
  • the cells differentiated into hepatoblast-like cells were cultured in RPMI1640 medium supplemented with 20 ng/ml HGF, 1 ⁇ GlutaMAX, 1 ⁇ B27 Supplement Minus Vitamin A for 5 days, and then 20 ng/ml oncostatin M (Osm) was added.
  • Induction to HLC was completed by culturing for 11 days with the added Hepatocyte Culture Medium Bullet Kit TM (HCM, Lonza). HLC cells were then measured with a Raman microscope.
  • FIG. 29 shows Raman spectra of HepaRG cells in which CYP was induced by rifampicin, HepaRG cells to which no inducer was added, and HLCs.
  • a signal at 1636 cm ⁇ 1 indicating CYP activity was observed in all cells.
  • FIG. 30 is each cell image visualizing the Raman signal corresponding to each spectrum. It was found that intracellular CYP activity was observed in all cases at 1636 cm -1 indicating CYP activity. This result indicates that intracellular distribution of not only HepaRG but also various CYPs and metabolites in hepatocytes can be visualized.
  • CYP activity is an indicator of metabolic capacity, which is one of the liver functions. It can improve the efficiency of drug response assessment with drugs.
  • regenerative medicine technology it can be applied to evaluate the metabolic capacity of iPS-derived hepatocytes and constructed three-dimensional tissues.
  • the activity of CYP-metabolizing enzymes is measured by detecting changes in spontaneous Raman scattered light caused by the state of the molecule.
  • Raman signals derived from oxidized heme b, including 1370 cm ⁇ 1 and 1636 cm ⁇ 1 correlated with CYP activity.
  • Raman signals are used to measure the CYP activity of hepatocytes.
  • purified CYP protein and activity of CYP expressed in other organ tissues are measured.
  • Raman signals of other factors related to the metabolic function of cells or tissues are simultaneously detected. to further assess cell or tissue type, differentiation and maturity.
  • CYP metabolic enzymes are heme proteins that are expressed in hepatocytes and small intestinal epithelial cells and localized in the endoplasmic reticulum (ER), and are known as a group of enzymes responsible for detoxification and drug metabolism.
  • the activity of CYP-metabolizing enzymes plays a major role in drug metabolism, so it is used as an indicator of hepatic metabolic activity measurement in drug development. Therefore, means for detecting the activity of CYP-metabolizing enzymes without destroying cell tissues are strongly desired in the fields of drug discovery, regenerative medicine, and drug discovery.
  • the inventors have succeeded in nondestructively detecting the activity of CYP-metabolizing enzymes by utilizing Raman scattering signals. The inventors have also found a Raman signal that correlates with enzyme activity, not just enzyme abundance.
  • Raman signals that correlated with the redox state and amount of CYP metabolic enzymes in vitro were known, but there were no reports of measurements in cells or tissues.
  • the activity of the CYP enzyme is detected in cells or tissues in a non-destructive and non-staining manner. Therefore, it is possible to increase the speed of CYP activity measurement, improve quantification, and measure changes in CYP activity over time within the same sample.
  • Raman signals derived from other indicators related to metabolism are simultaneously detected by utilizing Raman signals. Therefore, the distribution of biomolecules resulting from the metabolic state of cells or tissues can be obtained. Therefore, the above embodiment can also be applied to the evaluation of the degree of differentiation and maturity of cells or tissues.
  • hepatocyte tissue enables evaluation of metabolism related to drug efficacy and toxicity and evaluation of domain specificity of metabolic function.
  • quality control is performed by evaluating the metabolic capacity of the iPS-derived hepatocytes and the constructed three-dimensional tissue. In one aspect, the evaluation of metabolic capacity is performed by the method for detecting enzymatic activity of CYP enzymes in cells according to the above embodiment.
  • ADMET evaluations nondestructive and chronological drug efficacy and toxicity evaluations
  • the present invention can be extremely useful in the fields of regenerative medicine technology, drug discovery technology, and diagnostic technology.

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Abstract

本発明は、酸化型CYP酵素群の分子数を測定する工程を含む、細胞内又は細胞外のCYP酵素群の酵素活性を評価する方法を提供する。

Description

細胞内におけるＣＹＰ酵素群の酵素活性の検出方法
　本発明は、CYP代謝酵素群の活性を示すストークスラマン散乱信号（以下、ラマン散乱信号又はラマン信号とも呼ぶ）を活用したCYP酵素群の活性検出方法に関する。
　薬物や毒物の代謝を担う酵素群として知られるcytochrome p450(CYP)は、肝実質細胞や小腸上皮細胞で発現し、小胞体（ER）に局在するヘムタンパク質である。ヒトでは57種類のCYP遺伝子が知られている。CYPは、基質特異性をはじめとする性質の異なる複数の分子種（酵素群）からなる遺伝子スーパーファミリーを形成している。
　従来、CYPの検出及び解析には、吸光スペクトルや電磁常磁気共鳴を利用した分光法、免疫染色による蛍光法、CYPの代謝反応を利用した発光法、そしてX線分析法が用いられてきた。しかし、検出対象であるCYPの検出感度を高めるために、CYPタンパク質を抽出・精製、または標識する操作が必要であり、侵襲的であった。このような検査は細胞組織を破壊してしまうので１つの細胞に対して１回限りしか適用できない。
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　発明者らは、次の問題を見出した。すなわち、従来のラマン分光法を用いたCYPの発現測定では、検出対象であるCYPの検出精度を高めるために、CYPタンパク質を抽出して精製していた。すなわち、侵襲的、破壊的操作が必要であった。また、このような侵襲的、破壊的操作を用いた従来技術では、生きた細胞内でのCYP酵素群の酵素活性を測定することは困難であった。
　本発明は、侵襲及び標識に依ることなく高い分解能で細胞内におけるCYP酵素群の酵素活性を検出する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、
（１）CYP酵素群の酵素活性は酸化型CYP酵素群の分子数に相関すること、
（２）生細胞内の酸化型CYP酵素群の分子数をラマン信号により測定することで、当該細胞内のCYP酵素群の酵素活性を非侵襲的に評価することができること、及び、
（３）生細胞において、複数の生体分子のラマン信号を同時に検出することにより、細胞の状態（例えば、薬剤応答の程度や分化／未分化の程度等）を非侵襲的、且つ、多角的に解析できること等を見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
＜１＞　酸化型CYP酵素群の分子数を測定する工程を含む、細胞内又は細胞外のCYP酵素群の酵素活性を評価する方法。
＜２＞　細胞内のCYP酵素群の酵素活性を評価する場合であって、酸化型CYP酵素群の分子数を測定する工程が、
　細胞に対し励起光を照射し、光検出器を用いてラマンスペクトルを取得する工程、及び
　前記ラマンスペクトルからCYP酵素群由来のラマン散乱信号を抽出する工程を含む、＜１＞記載の方法。
＜３＞　前記CYP酵素群由来のラマン散乱信号の波数が、波数300-600、620-880、920-1320又は1320-1660cm-1の範囲内である、＜１＞又は＜２＞記載の方法。
＜４＞　前記波数が、1370 cm-1又は1636cm-1である、＜３＞記載の方法。
＜５＞　前記細胞が、肝臓、小腸、腎臓、及び脳のいずれかに由来する細胞である、＜１＞～＜４＞のいずれか記載の方法。
＜６＞　前記細胞が、肝臓に由来する細胞である、＜５＞記載の方法。
＜７＞　前記細胞が、多能性幹細胞に由来する細胞である、＜１＞～＜４＞のいずれか記載の方法。
＜８＞　前記CYP酵素群の分子数の測定を行う領域において、細胞の形状、細胞の大きさ、及び細胞内成分の細胞内での分布からなる群から選択される少なくとも１つを観察する工程をさらに含む、＜１＞～＜７＞のいずれか記載の方法。
＜９＞　CYP酵素群以外の物質由来のラマン散乱信号をさらに抽出する工程を含む、＜１＞～＜９＞のいずれか記載の方法。
＜１０＞　前記CYP酵素群以外の物質が、還元型ヘムｂ、還元型／酸化型ヘムｃ、glycogen、還元型／酸化型cytochrome c、フェニルアラニン及び脂質からなる群から選択される少なくとも１つである、＜９＞記載の方法。
＜１１＞　以下の工程を含む、肝実質細胞の代謝能を評価する方法：
　肝実質細胞に対し励起光を照射し、光検出器を用いてラマンスペクトルを取得する工程、及び
　前記ラマンスペクトルから肝実質細胞の代謝能に関連する生体分子のラマン信号を検出する工程。
＜１２＞　前記肝実質細胞の代謝に関連する生体分子が、CYP酵素群、glycogen、cytochrome b5、cytochrome c、脂質、及びフェニルアラニンからなる群から選択される少なくとも１つである、＜１１＞記載の方法。
また、別の一態様において、本発明は以下の通りである。
＜１’＞　酸化型CYP酵素群を検出することによりCYP酵素群の酵素活性を検出する検出方法。
＜２’＞　前記酸化型CYP酵素群の酵素活性を示す特定の波数を有するラマン散乱信号を含んだラマンスペクトルを用いた、細胞内及び細胞外におけるCYP酵素群の酵素活性を検出する、＜１’＞に記載の検出方法。
＜３’＞　前記ラマンスペクトルの前記波数は前記CYP酵素群に結合しているタイプbの酸化型ヘムに由来する、＜１’＞又は＜２’＞に記載の検出方法。
＜４’＞　前記特定の波数は、波数300-600, 620-880, 920-1320又は1320-1660cm-1の範囲内である、＜１’＞～＜３’＞のいずれかに記載の検出方法。
＜５’＞　前記特定の波数は1370cm-1又は1636cm-1である、＜４’＞に記載の検出方法。
＜６’＞　前記細胞は、CYP活性を有する細胞である、＜１’＞～＜５’＞のいずれかに記載の検出方法。
＜７’＞　前記CYP活性を有する細胞は肝臓、小腸、腎臓、及び脳のいずれかに由来する細胞である、＜６’＞に記載の検出方法。
＜８’＞　前記細胞は多能性幹細胞、例えばiPS細胞及びES細胞、由来である、＜１’＞～＜７’＞のいずれかに記載の検出方法。
＜９’＞　前記細胞は肝実質細胞である、＜１’＞～＜８’＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１０’＞　前記細胞はヒト肝腫瘍由来細胞株又はこれから分化した細胞である、＜１’＞～＜７’＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１１’＞　前記CYP酵素群の酵素活性の検出とともに、前記CYP酵素群の酵素活性の検出を行う領域において、細胞の形状、細胞の大きさ及び細胞内成分の細胞内での分布の少なくともいずれかを観察する、＜１’＞～＜１０’＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１２’＞　前記CYP酵素群の酵素活性の検出と同時に、前記ラマンスペクトルに含まれる他のラマン散乱信号をさらに用いて、他の分子又はその酸化還元状態を検出する、＜１’＞～＜１１’＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１３’＞　前記他のラマン散乱信号であって前記他の分子を示す特定の波数を有するものが、還元型ヘムｂ、還元型／酸化型ヘムｃ、glycogen、還元型／酸化型cytochrome c、フェニルアラニン及び脂質のいずれかに由来する、＜１２’＞に記載の検出方法。
＜１４’＞　前記還元型ヘムｂに由来するラマン散乱信号の波数が、650-680cm-1、900-1000cm-1、1300-1373cm-1、1490-1500cm-1又は1570-1590cm-1の範囲内である、＜１３’＞に記載の検出方法。
＜１５’＞　前記還元型／酸化型ヘムｃに由来するラマン散乱信号の波数が、590-640cm-1,730-755cm-1、1120-1130cm-1、1310-1370cm-1、又は1580-1640cm-1の範囲内である、＜１３’＞又は＜１４’＞に記載の検出方法。
＜１６’＞　前記glycogenに由来するラマン散乱信号の波数が、440-580cm-1、840-945cm-1、1020-1660cm-1、又は2900-2940cm-1の範囲内である、＜１３’＞～＜１５’＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１７’＞　細胞に対し励起光を照射し、光検出器を用いてラマンスペクトルを取得する工程、と、
　前記ラマンスペクトルからCYP酵素群由来のラマン散乱信号を抽出する工程と、を備え、
　前記ラマン散乱信号を抽出する工程では、
　前記ラマンスペクトルの特定の波数のピーク及び波形を特定し、前記ピーク底辺の両端を結んだ線と、ピーク頂点から波数軸に対して垂直に引いた直線との交点を原点として、前記原点から前記ピーク頂点までの高さをラマン散乱強度として算出する、
　＜２’＞～＜１６’＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１８’＞　細胞に対し励起光を照射し、光検出器を用いてラマンスペクトルを取得する工程と、
　前記ラマンスペクトルからCYP酵素群由来のラマン散乱信号を抽出する工程と、を備え、
　前記ラマン散乱信号を抽出する工程では、
　前記ラマンスペクトルの特定の波数のピーク及び波形を特定し、前記ピーク底辺の両端を結んだ線と、前記ノイズ除去後のラマンスペクトルの波形とによって囲まれた領域の面積をラマン散乱強度として算出する、
　＜２’＞～＜１６’＞のいずれかに記載の検出方法。
＜１９’＞　さらに前記ラマンスペクトルから抽出されたglycogen及びcytochrome cのラマン散乱信号を用いて、細胞又は組織の種類、分化度、成熟度のうち少なくとも１つを評価する、＜１７’＞又は＜１８’＞に記載の検出方法。
＜２０’＞　CYP酵素群の酵素活性を示す特定の波数を有するラマンスペクトルを用いた、細胞内環境を模した環境における精製CYPタンパク質の酵素活性の検出方法。
　本発明により、侵襲及び標識に依ることなく高い分解能で細胞内におけるCYP酵素群の酵素活性を検出可能である。
ラマンスペクトル検出を説明する図である。 ラマン散乱信号の抽出方法を説明するフローチャートである。 ラマンスペクトルの測定結果の例を示す。 ラマン散乱信号の抽出方法１を示す。 ラマン散乱信号の抽出方法２を示す。 CYP3A4を誘導した肝臓実質細胞のラマンスペクトル。 発光法によるCYP3A4の計測結果を示すグラフ。 ウェスタンブロッティングの測定結果。 肝臓実質細胞と胆管上皮細胞のラマンスペクトル。 特異的なラマンピークを基に構築したラマン画像。波数600 cm-1: 還元型ヘムc、主に還元型cytochrome c、波数675 cm-1:還元型ヘムｂ、主に還元型cytochrome b5、波数940 cm-1:glycogen、波数1636 cm-1: 酸化型ヘムｂ、主に酸化型CYP酵素群。 特異的なラマンピークを基に構築したラマン画像。波数600 cm-1: 還元型ヘムc、主に還元型cytochrome c、波数675 cm-1:還元型ヘムｂ、主に還元型cytochrome b5、波数940 cm-1:glycogen、波数1000 cm-1:フェニルアラニン、波数1370 cm-1: 酸化型ヘムｂ、主に酸化型CYP酵素群、波数1636 cm-1: 酸化型ヘムｂ、主に酸化型CYP酵素群。 CYP3A4の免疫染色画像。 Rifampicin濃度0、0.04、0.4、4 μMでCYP酵素群を誘導したHepaRG細胞のラマン画像を示す。波数1636 cm-1: 酸化型ヘムｂ、主に酸化型CYP酵素群。 HepaRG細胞のCYP酵素群の活性とラマン信号を示すグラフ。 検出したラマンスペクトルを細胞毎に平均し、波数1636 cm-1のラマン信号をプロットした箱ひげ図。 異なる複数の誘導剤を用いて培養したHepaRG細胞のCYP酵素群の活性とラマン信号を示すグラフ。 検出したラマンスペクトルを細胞毎に平均し、波数1636 cm-1のラマン信号をプロットした箱ひげ図。 IL-6を用いてCYP酵素群の発現を下方制御したHepaRG細胞のCYP酵素群の活性結果とラマン信号を示すグラフ。 検出したラマンスペクトルを細胞毎に平均し、波数1636 cm-1のラマン信号をプロットした箱ひげ図。 HepaRG細胞のCYP酵素群の活性とラマン信号の経時変化を示すグラフ。 検出したラマンスペクトルを細胞毎に平均し、波数1636 cm-1のラマン信号をプロットした箱ひげ図。 Azamulinを用いてCYP酵素群の活性を下方制御したHepaRG細胞のCYP酵素群の活性を示すグラフ。 検出したラマンスペクトルを細胞毎に平均し、波数1636 cm-1のラマン信号をプロットした箱ひげ図。 ラマン画像と免疫染色結果の比較写真。波数1636 cm-1: 酸化型ヘムｂ、主に酸化型CYP酵素群。 ヒト肝細胞中で観察された各種生体分子に由来するラマンピーク。 各種生体分子のラマン画像。波数675 cm-1:還元型ヘムｂ、主に還元型cytochrome b5、波数940 cm-1:glycogen、波数1636 cm-1: 酸化型ヘムｂ、主に酸化型CYP酵素群、波数600 cm-1: 還元型ヘムc、主に還元型cytochrome c、波数1000 cm-1:フェニルアラニン、波数2850 cm-1:脂質。 凍結初代ヒト由来肝実質細胞（PHH）およびHepaRG細胞のラマン信号を示すグラフ。 各スペクトルに対応したラマン信号を可視化して得られた、PHHおよびHepaRG細胞内の各分子の分布を示すイメージ。波数600 cm-1: 還元型ヘムc、主に還元型cytochrome c、波数675 cm-1:還元型ヘムb、主に還元型cytochrome b5、波数750 cm-1:すべてのcytochrome、波数1636 cm-1: 酸化型ヘムb、主に酸化型CYP酵素群、波数1000 cm-1:フェニルアラニン、主にタンパク質、波数1157 cm-1: carotenoids、波数1512 cm-1: carotenoids。 肝臓様細胞（HLC）およびHepaRG細胞のラマン信号を示すグラフ。 各スペクトルに対応したラマン信号を可視化して得られた、HLCおよびHepaRG細胞内の各分子の分布を示すイメージ。波数600 cm-1: 還元型ヘムc、主に還元型cytochrome c、波数675 cm-1:還元型ヘムｂ、主に還元型cytochrome b5、波数750 cm-1:すべてのcytochrome、波数1636 cm-1: 酸化型ヘムｂ、主に酸化型CYP酵素群、波数1000 cm-1:フェニルアラニン。
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施できる。なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開広報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
　本発明は、酸化型CYP酵素群の分子数を測定する工程を含む、細胞内又は細胞外のCYP酵素群の酵素活性を評価する方法（以下、「本発明の評価方法」等と称することがある）を提供する。
　まず、本発明者らは、「CYP酵素群の酵素活性は、当該CYP酵素群の酸化型の酵素の分子数と相関する事実」を世界で初めて見出した。（具体的には、本願明細書における実施例６に示すデータにより実証される）。換言すれば、細胞内又は細胞外の環境においてCYP酵素群が存在するとき、CYP酵素群の酵素活性はCYP酵素群のうち、酸化型のCYP酵素群の「分子数」を適切な方法を用いて測定することによって評価できることを本発明者らは見出した。
　本発明の評価方法において、CYP酵素群中の酸化型CYP酵素群の分子数の測定に用いる方法は特に限定されず、自体公知の方法を用いればよい。一例としては、赤外分光法、蛍光物質または発光物質によるラベリング、質量分析等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞内のCYP酵素群の酵素活性を評価する実施の形態においては、非破壊的な分析が可能であるラマン分光法が好適に用いられる。尚、分光学的手法の一つとして、吸収スペクトル（非特許文献１）を利用したcytochrome P450の酸化還元状態の識別が挙げられる。
　本発明の評価方法の一態様として、細胞内のCYP酵素群の酵素活性を評価することができる。本実施の形態では、酸化型CYP酵素群の分子数を測定する工程においてラマン分光法を利用することができる。より具体的には、酸化型CYP酵素群の分子数を測定する方法として、細胞に対し励起光を照射し、光検出器を用いてラマンスペクトルを取得する工程、と、前記ラマンスペクトルからCYP酵素群由来のラマン散乱信号を抽出する工程を実施することにより、酸化型CYP酵素群の分子数を測定することができる。本実施の形態では、CYP酵素群の細胞内環境での酵素活性を評価するために、特定の波数を有するラマン散乱信号が含まれたラマンスペクトルを用いる。
　まず本実施の形態の評価方法で評価対象となるCYPを説明する。ここで本発明の一態様において評価対象となるCYPは、ありとあらゆる生物由来のCYPである。特に断らない限り本明細書において「CYP酵素群」の用語はありとあらゆる生物由来のCYPを指す。CYPは、ヘムを補欠分子属として含むヘムタンパク質である。
　本発明の一態様に係る評価方法ではCYP分子に特異的な分子構造に由来する「酸化還元状態」を検出する。CYP分子に特異的な分子構造とは以下の通りである。ヘムのポルフィリン構造の違いでサブタイプ（タイプa、タイプbなど）があり、CYPは、タイプbのヘム構造を持つ。CYPは、基質特異性をはじめとする性質の異なる複数の分子種（酵素群）からなる遺伝子スーパーファミリーを形成している。ヒトでは57種類のCYP遺伝子が知られている。57種類のCYP遺伝子のうち、薬物や毒物の代謝に関わる主なCYP酵素群は、CYP3A4、CYP1A2、CYP2B6などである。CYP酵素群は、ヒトでは主に肝臓の肝実質細胞や小腸上皮細胞で発現し、小胞体（ER）に局在する。特にヒトの肝臓では、CYP3A4の発現が最も高く、CYPファミリー全体の35%を占めることが知られている（非特許文献２）。本発明の一態様に係る評価方法ではCYP酵素群に含まれる全てのCYP分子を、それらの分子の種類の区別することなく、それらの特定のラマンシフトにおけるラマン散乱光の強度の総量を検出する。
　一態様において、本発明の評価方法で活性が評価される「CYP酵素群」は、ヒトの57種類のCYP酵素群である。また、別の一態様において、「CYP酵素群」は、ヒトの57種類のCYP酵素群のうち、CYP酵素群の発現を誘導することが知られている誘導剤により発現が誘導されるCYP酵素であり得る。（かかる誘導剤の具体例としては、例えば、Rifampicin、Phenytoin、Carbamazepine、及びDexamethasoneが挙げられるがこれらに限定されない。尚、例示した4つの誘導剤は、CYP3A4、CYP1A2、CYP2B6、及びCYP2C9からなる群から選択される4つのCYP酵素の少なくとも１つの遺伝子発現を誘導することを本発明者らは確認している。誘導剤により発現が誘導されるCYP酵素としては、CYP3A4、CYP1A2、CYP2B6、及びCYP2C9からなる群から選択される少なくとも一つであり得る。
　本発明の一態様において、「CYP酵素群」は以下の(1)～(15)のいずれかであり得る：
(1)ヒトCYP3A4
(2)ヒトCYP1A2
(3)ヒトCYP2B6
(4)ヒトCYP2C9
(5)ヒトCYP3A4とヒトCYP1A2
(6)ヒトCYP3A4とヒトCYP2B6
(7)ヒトCYP3A4とヒトCYP2C9
(8)ヒトCYP1A2とヒトCYP2B6
(9)ヒトCYP1A2とヒトCYP2C9
(10)ヒトCYP2B6とヒトCYP2C9
(11)ヒトCYP3A4とヒトCYP1A2とヒトCYP2B6
(12)ヒトCYP3A4とヒトCYP1A2とヒトCYP2C9
(13)ヒトCYP3A4とヒトCYP2B6とヒトCYP2C9
(14)ヒトCYP1A2とヒトCYP2B6とヒトCYP2C9
(15)ヒトCYP3A4とヒトCYP1A2とヒトCYP2B6とヒトCYP2C9。
　本発明の評価方法ではヒトCYP3A4のみならず、ありとあらゆる生物由来のCYPによる代謝の酵素活性を評価することができる。ヘムｂは中心金属として鉄原子を持つ鉄ポルフィリン錯体である。ヘムｂの鉄原子には反応性の高い酸素原子が1原子結合している。CYPは、ターゲットとなる薬物や毒物などの化合物に1つの酸素原子を導入し、当該化合物を酸化することによって、当該化合物の水溶性を高め、体外への排出を促す。したがって、ヘムｂの鉄原子は酸化還元反応により、三価の酸化型（Fe3+）と二価の還元型（Fe2+）との間で可逆的に変化する。本発明の評価方法では、CYP酵素群の代謝の酵素活性を、CYP酵素群の酸化還元状態の測定結果に基づき評価する。
　本実施の形態の評価方法で用いる検出原理は、ラマン分光法である。ラマン分光法は、非破壊的、無染色、非侵襲にCYP酵素活性の測定が可能である。ラマン分光法では、測定対象物に励起光を照射すると、ラマン散乱光が生じる。ラマン散乱光から得たスペクトルは複数の特定の波数におけるピークを有している。これらは分子内部及び分子間における化学結合に由来する。
　本実施の形態における「特定の波数を有するラマン散乱信号」は、CYP酵素に結合している補欠分子族であるタイプbの酸化型ヘム（以下、酸化型ヘムｂとも呼ぶ）に由来する。具体的には、特定の波数とは好ましくは300-600, 620-880, 920-1320,又は1320-1660 cm-1の範囲内である。さらに好ましくは、波数1360-1380,又は1630-1640 cm-1である。特に好ましくは波数1370又は1636 cm-1である。具体的な一実施形態としては、まず細胞に励起光を照射して生じたラマン散乱光を回折格子により分光する。次に検出機器が検出したラマンスペクトルのうち、例えば、波数1630-1640cm-1においてラマン散乱信号（ラマン散乱強度）が得られる。当該波数においてラマン散乱信号が得られることは、CYP酵素群が酵素活性を有していることを示す。なお、CYP酵素とヘムｂとの結合は共有結合又は非共有結合である。
　本実施の形態では、CYP酵素群の酵素活性の評価とともにCYP酵素群の酵素活性の評価を行う領域において、細胞の形状、大きさ、細胞内成分の細胞内の分布を観察してもよい。ここで「CYP酵素群の酵素活性の評価を行う領域」とは、一例において、図１に示すように基板上に展開された細胞を含む所定の広さの、図中では横X μm、縦Y μmの平面である。図１中には領域に１個の細胞が配置されているが、配置される細胞は複数個でもよい。細胞の形状、大きさ、細胞内成分の細胞内の分布の観察には、例えば光学的計測方法を利用して観察することができる。光学的計測方法とは、例えば明視野(図２６)又は蛍光（図１２、図２４）での画像生成する方法を指す。光学的計測方法を併用することにより、観察対象細胞群の局在の特定及び、解析対象細胞群の識別(肝臓実質細胞部分の特定)ができるため、効率的な計測と、高感度の信号抽出が実現できる。また、個別の細胞の識別(細胞の輪郭の抽出)も可能であるため、細胞毎の活性の定量などの解析が可能である。さらに、細胞小器官を蛍光染色し、取得した蛍光画像とラマン画像を解析することで、細胞内小器官とCYP酵素活性分布を利用した解析も可能である。
　本実施の形態では、CYP酵素群の酵素活性の評価と同時に、ラマンスペクトルに含まれる他のラマン散乱信号をさらに用いて、他の分子又はその酸化還元状態を検出してもよい。分子を示す特定の波数を有するラマン散乱信号は、還元型／酸化型ヘムｂ、還元型／酸化型ヘムｃ、glycogen、cytochrome c、フェニルアラニン及び脂質のいずれかに由来してもよい。
　本実施の形態の評価方法で評価対象となる他の物質を説明する。本実施形態ではCYPに加え、肝臓の代謝能の指標として、cytochrome c、glycogenを利用できる。代謝は生命維持に必要なエネルギーの産生及び必要な高分子化合物の合成を行う反応であり、医療技術の開発及び創薬において、十分に理解する必要がある。cytochrome cとglycogenの計測手法として、発光法又は蛍光法を用いた手法が広く用いられていた。さらに近年、ラマン分光法を利用した無染色計測が注目されつつある。ラマン分光法では、物質が特異的な自発ラマン散乱光を呈することを利用する。特に肝毒性や肝代謝の評価においては、CYPによる薬物代謝、cytochrome cを指標としたミトコンドリア活性又は毒性、glycogenを指標とした細胞内のエネルギー生産と貯蔵は、重要なパラメータであり、互いに相関している。非特許文献３には、アポトーシス中の細胞におけるcytochrome cのラマン観察が開示されている。
　cytochrome cは、細胞又は組織内に存在するヘムｃタンパク質である。細胞内小器官の一つであるミトコンドリアに局在し、アポトーシスやエネルギー生産に関わる。ミトコンドリアに対する毒物作用は、薬物肝障害の原因であり、cytochrome cの定量や局在は重要な因子である。cytochrome cは、補欠分子属としてタイプcのヘムを含む。CYPに含まれるタイプbのヘムや、他のタンパク質とは異なる特徴的なラマン信号を発する。すなわち、CYP酵素以外の生体分子の一つとして、cytochrome ｃの酸化／還元状態に由来するラマン散乱信号を用いることができる。
　さらに、cytochrome b5などのタイプbのヘムタンパク質も検出することができる。cytochrome b5は、CYP酵素群の触媒サイクルにおいて重要な役割である電子の供給を担う。また、細胞質を示すphenylalanine(フェニルアラニン)の検出が挙げられる。フェニルアラニンのラマン散乱信号の強度は、ラマン観察した領域における細胞質の密度を反映する。
　これらの分子に由来するラマン散乱信号で、CYP活性に由来するラマン散乱信号を規格化(除算)することで、CYPの比活性を取得できる。例えば、cytochrome cのラマン散乱信号を規格化に使用した場合は、ミトコンドリア活性に対するCYPの比活性を取得できる。cytochrome bのラマン散乱信号を使用した場合は、触媒活性に対するCYPの比活性を取得できる。glycogenのラマン散乱信号で規格化した場合は、糖代謝に対するCYPの比活性を取得できる。
　また、cytochrome c、b、glycogen、フェニルアラニンは、細胞内部にて、細胞小器官に由来した特異的な分布を示すため(cytochrome c: ミトコンドリアに分布、cytochrome b: 小胞体に分布、フェニルアラニン: 細胞質全体に分布)、これらのラマン散乱信号から計測できる各細胞機能と、細胞小器官の形状、局在の関係を活用した、細胞の状態及び薬剤応答の定量が期待できる。
　ここで、ヘムの構造の違いによるラマン散乱信号の違いについて説明する。還元型のヘムｃが波数604 cm-1、還元型のヘムｂが波数675 cm-1、還元型のヘム構造（bとcで共通）が波数750 cm-1、酸化型のヘム構造（bとcで共通）が波数1638 cm-1に代表される特徴的なラマン散乱信号を複数もつことが報告されている（非特許文献４）。また、ヘム構造を持つCYP酵素群又はCYP3A4が酸化型の構造をとる際には、波数1368 cm-1, 1371-1373 cm-1、1490 cm-1、1500 cm-1、1570 cm-1、1590 cm-1、1630 cm-1、1640 cm-1付近に特徴的なラマン散乱信号を持つことが報告されている（非特許文献５～１２）。
　還元型／酸化型ヘムｂに由来するラマン散乱信号の波数は、650-680 cm-1、900-1000 cm-1、1300-1373 cm-1、1490-1500 cm-1又は1570-1590 cm-1の範囲内であってもよい（非特許文献１３）。
　還元型／酸化型ヘムｃに由来するラマン散乱信号の波数は、590-640 cm-1,730-755 cm-1、1120-1130 cm-1、1310-1370 cm-1、又は1580-1640 cm-1の範囲内であってもよい。
　glycogenは、余剰なグルコースの一時貯蔵のために合成される高分子で主に肝臓や骨格筋で合成される事が知られている。肝機能や糖代謝の有効な指標である。glycogenに由来するラマン散乱信号の波数は、440-580 cm-1、840-945 cm-1、1020-1660 cm-1（より好ましくは、1020-1120 cm-1）、又は2900-2940 cm-1の範囲内であってもよい。
　脂質に由来するラマン散乱信号の波数は、1450 cm-1又は2850 cm-1であってもよい。
　以下、図１～図５を参照し、細胞内のCYP酵素群及びその他の物質のラマン散乱を検出する方法と、取得したラマンスペクトルから特定の波数を有するラマン散乱信号を特定する方法について説明する。
　図１は、ラマン散乱の原理を説明する図である。図１に示すように、試料にレーザーなどの波長λ０の励起光を照射すると、反射、屈折、吸収などの他に、散乱が生じる。波長λの散乱光のうち、入射光と同じ波長の光が散乱されるものをレイリー散乱と呼ぶ。一方、入射光に比べて振動数が減少した、すなわち波長が長波長側へシフトしたものを、ストークスラマン散乱（以下、ラマン散乱光）と呼ぶ。試料から生じたラマン散乱光を回折格子により分光し、ＣＣＤイメージセンサーなどの検出機器で検出することによって、ラマンスペクトルを取得する。続いて、取得したラマンスペクトルからラマン散乱信号を抽出する。
　励起光を照射する試料としては例えば、生体組織（in vivo）、培養細胞（in vitro）及び固定された生体組織などを用いてもよい。生体組織は例えば、ヒトもしくは動物由来の肝組織、腸管組織（好ましくは小腸組織）、腎組織、脳組織、及びそこに含まれる細胞などである。培養細胞は例えば、肝細胞、小腸上皮細胞、胆管上皮細胞、腎細胞、神経細胞、グリア細胞などである。一態様において肝細胞は肝実質細胞である。一態様において培養細胞は、初代培養細胞又は不死化細胞である。一態様において、初代培養細胞は、ヒト由来初代肝実質細胞（PHH）であり得る。また、一態様において不死化細胞はヒト肝腫瘍由来細胞株である。一態様において培養細胞はこれらから分化した細胞である。ヒト肝腫瘍由来細胞株は例えばHepaRG（商標、HPR116、BIOPREDIC International）細胞を用いてもよい。また、HepaRG細胞から分化又は脱分化した肝実質細胞を用いてもよい。また、一態様において、培養細胞は幹細胞から分化させた細胞であってもよい。幹細胞としては、ES細胞、iPS細胞、体性幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝幹細胞、上皮幹細胞等）等が挙げられるがこれらに限定されない。一態様において、幹細胞は、多能性幹細胞（即ち、ES細胞又はiPS細胞）であり得る。本発明の評価方法の一態様において、培養細胞は、ヒトiPS細胞を分化誘導して得られた肝臓細胞（肝臓様細胞（Hepatocyte-Like Cell, HLC））であってもよい。
　またCYP酵素の精製タンパク質のラマン散乱を観察してもよい。「精製タンパク質」は細胞から抽出されたCYP又は合成されたCYPから夾雑物を完全に又は部分的に除去したものである。合成されたCYPは微生物学的に調製された遺伝子組み換えタンパクである。「細胞内環境を模した環境」は、CYP酵素以外の細胞内の物質を含有するin vitro反応系である。
　培養細胞は、培地に希釈してラマン観察用石英基板ディッシュ上に播種する。ラマン観察用石英基板ディッシュは、ディッシュ内部の底面に石英基板が接着されたプラスティックディッシュである。培養細胞を播種する際には、石英基板上にのみ細胞を播種するために、クローニングシリンダーを用いてもよい。一例としてHepaRG（商標）細胞を用いる場合、37℃、5% CO2雰囲気下で3日間培養したものを試料として用いてもよい。
　上記以外の試料として、細胞外においてラマン散乱光を検出する場合、ラマン散乱の対象試料として、組織から抽出された溶液試料であって夾雑物を含むもの、例えばミクロソームを用いることができるが、これらに限定されない。なお、本明細書における「細胞外」とは、特段の明示がない限りは「in vitro」の意で用いられるが、文脈によっては「細胞の外側（extra-cellular）」の意で用いられる場合がある。
　本実施の形態で酵素活性を評価するCYP酵素群は、誘導剤を用いて細胞内で誘導してもよい。CYP酵素群の誘導剤の一種であるRifampicinは、CYP酵素群の中でも主にCYP3A4の発現を誘導する。上述した通り、この誘導剤は、それ以外にもCYP2B6、CYP2C9等の発現を誘導できる。
　本実施形態では、特定の波数を有するラマンスペクトルからラマン散乱信号を特定するために、ラマン顕微鏡（非特許文献３）を用いてもよい。本顕微鏡では、レーザー光を所定の長さの直線状（X μm、以下ラインとも言う）、に集光して試料のラマン信号を励起する。なお、レーザー光は、点状に集光して、ラマン信号を励起しても良い。
　ラマン散乱の励起及び検出には、例えば水浸対物レンズを用いてもよい。対物レンズにより集光されたラマン散乱光はダイクロイックミラー及び長波長を透過するエッジフィルターを経たのちに、分光器の入射スリットに結像される。スリットに結像されたラマン散乱信号は、その後分光器内部の回折格子で分光され、ＣＣＤイメージセンサーで検出される。ＣＣＤイメージセンサーは、例えば冷却型ＣＣＤイメージセンサーを用いてもよい。
　集光したライン上の至る所から散乱するラマン散乱信号は、ＣＣＤイメージセンサー上の異なる画素で検出される。これらのラマン散乱信号を同時にかつ独立に計測できるようにレーザー照射時間を決定することが好ましい。レーザー照射時間は、例えば0.001秒～3分である。好ましくは0.01秒～30秒である。さらに好ましくは0.1秒～15秒である。特に好ましくは1秒～10秒である。直線状に集光した場合、各ラマン散乱信号は、集光した所定の長さの直線状の領域（ライン領域）で同時に検出される。レーザー照射及びラマン散乱信号の検出を、集光位置を集光したラインの方向に対して垂直な方向にずらしながら繰り返す。例えば図１に示すように、基板上のX μm × Y μmの矩形状の領域におけるラマン画像を取得する。
　点状に集光した場合、X-Y方向の任意の距離にずらしながら繰り返しラマン散乱信号を検出することで、任意の領域のラマン画像を取得する。これにより最終的に横X μm、縦Y μmの領域からラマン画像を得る。XとYの方向を入れ替えてもよい。
　励起光として用いるレーザー光は、一例として波長406 nm～561 nmの、中でも波長532nmのレーザー光を励起光として用いることが好ましい。発明者らは共鳴ラマン散乱に着目した。共鳴ラマン散乱では、分子をその分子が持つ吸収帯で励起することで、共鳴効果により吸収帯に由来する振動を選択的に測定できる。ヘムｂ及びヘムｃは、520～560 nm付近にβ/α帯と呼ばれる吸収帯が存在する。したがって、波長532 nmのレーザー光を励起光として用いると、共鳴効果によりラマン散乱光を著しく増大させることができる。上記ヘムタンパク質は、380-460 nm付近にもSoret帯と呼ばれる吸収帯が存在するため、波長488, 561, 556, 543, 526, 523, 520, 515, 501, 450, 406 nm等のレーザー光を用いてラマン散乱を励起しても良い。本実施形態のラマン散乱法で検出されるラマン散乱光は共鳴ラマン散乱によるものである。本実施形態ではさらに非共鳴ラマン散乱によるラマン散乱光を検出してもよい。
　図２は、ラマン散乱信号の抽出方法を説明するフローチャートである。まず、計測されたラマン散乱信号に含まれるノイズである、宇宙線及びＣＣＤイメージセンサーのオフセット信号を除去する。オフセット信号は、ＣＣＤイメージセンサーのオフセット調整のための信号である。続いて、上記で除去しきれなかったノイズによる影響を低減するための処理を行う。ノイズ除去の方法としては、特異値分解（singular value decomposition, SVD）法を用いる方法と、任意の解析対象領域毎のラマンスペクトルを平均する方法のいずれかを用いることができる。ラマン画像を構築する場合は、特異値分解法を用いることができる。また、ドットプロットを作製する場合は、任意の解析対象領域毎のラマンスペクトルを平均する方法を用いることができる。
　ラマン散乱信号に含まれるノイズの除去後、解析対象のラマン散乱信号を抽出する。ここで解析対象のラマン散乱信号とは、CYP酵素群の酵素活性を検出する場合は、波数1636 cm-1におけるラマン散乱信号（ラマン散乱強度）を指す。また、解析対象のラマン散乱信号の「抽出」とは、所定の方法を用いて任意のラマン散乱強度を、解析対象のラマン散乱信号として定義することを意味する。解析対象のラマン散乱信号の抽出方法として、以下に説明する第１の方法又は第２の方法を用いることができる。第１の方法を図３及び図４を用いて、第２の方法を図３及び図５を用いて説明する。
　図３は、ノイズ除去後のラマンスペクトルを示す。図３に示すように、ラマンスペクトル（ラマン散乱信号）は、縦軸がラマン散乱強度（ラマン散乱信号強度）、横軸がラマンシフト（波数）で表される。横軸のラマンシフト（波数）は、レーザーなどの励起光による入射光と、ラマン散乱光との波数の差を表している。
　図４は、図３の破線で示す領域の拡大図である。本図を用いて第１の方法を用いた、解析対象のラマン散乱信号の抽出方法を示す。第１の方法は、解析対象のラマン散乱信号の近傍において、他の生体由来のラマン散乱信号のラマン散乱強度のピークが存在している場合に適した方法である。
　第１の方法では、線形もしくは非線形近似した背景信号の強度と、ラマン散乱強度のピークとの強度差を、解析対象のラマン散乱信号と定義する。より具体的には、まず、特定の波数のラマン散乱強度のピークと、ピークを含む波形とを特定する。当該ラマン散乱強度のピークに対して、ピーク底辺の両端を結んだ線、すなわち直線もしくは曲線と、ピーク頂点から波数軸に対して垂直に下ろした直線との交点を原点として、ピーク頂点までの高さを、解析対象のラマン散乱信号として算出する。本明細書において「ピーク底辺の両端を結んだ線」はピークの領域を定義できるものであれば特に制限されない。線はｎ次曲線でもよい。ｎ＝１であれば線は直線であり、ｎ＞１であれば線はいわゆる曲線である。
　図５は、図３の破線で示す領域の拡大図である。本図を用いて第２の方法を用いた、解析対象のラマン散乱信号の抽出方法を示す。第２の方法は、解析対象のラマン散乱信号が背景信号に対して十分な信号対雑音比（ＳＮ比）を有しているとともに、近傍に他の生体由来のラマン散乱信強度のピークが存在しない場合に適した方法である。
　第２の方法では、まず、特定の波数のラマン散乱強度のピークと、ピークを含む波形とを特定する。解析対象のラマン散乱強度のピークに対して、ピーク底辺の両端を結んだ線、すなわち直線もしくは曲線とラマン散乱信号の波形で囲まれた領域の面積を算出し、解析対象のラマン散乱信号として定義する。本明細書において「ピーク底辺の両端を結んだ線」はピークの領域を定義できるものであれば特に制限されない。線はｎ次曲線でもよい。ｎ＝１であれば線は直線であり、ｎ＞１であれば線はいわゆる曲線である。
　なお、第１の方法及び第２の方法以外に、必要とする定量性の精度に応じて別の方法を用いて解析対象のラマン散乱信号を抽出することも可能である。例えば、解析対象のラマン散乱強度のピークの強度と、ピークの底辺の強度の差を解析対象のラマン信号として定義する。ピークの底辺とは、解析対象のラマン散乱強度のピーク近傍において、ｙ軸マイナス方向に凸状の点を指す。
　上述の方法により、波数1320-1660 cm-1、好ましくは1636 cm-1において解析対象のラマン散乱信号を定義する。当該ラマン散乱信号（ラマン散乱強度）が細胞内で増加していれば、それは細胞内でCYP酵素群の酵素活性が増加していることを示す。ラマン分光法を用いることによって、顕微鏡下で生きた細胞から代謝能に関連する生体分子のラマン信号を検出できる。また、細胞の状態や構造を表す生体分子のラマン信号も、同時に検出できる。さらに、それぞれ検出した生体分子の細胞内での分布を、細胞小器官レベルの空間分解能で、一例において200 nmの空間分解能で把握できる。このため、代謝やエネルギー産生における細胞の薬剤応答を検討する上で、他の細胞小器官に局在する生体分子の振る舞いと合わせて、総合的に検討できる。1636 cm-1のラマン信号の観察はCYP酵素群活性の計測のみではなく、それら細胞機能のメカニズム解明に貢献できる。さらに、ラマンスペクトルから抽出されたglycogen及びcytochrome cのラマン散乱信号を用いて糖代謝やミトコンドリア活性/毒性といった肝機能の指標を検出することで、細胞又は組織の種類、分化度、成熟度のうち少なくとも１つを評価することもできる。
　上述の事実に基づき、本発明は、以下の工程を含む、肝実質細胞の代
謝能を評価する方法も提供する（以下、「本発明の肝実質細胞の代謝能を評価する方法」と称することがある）：
　肝実質細胞に対し励起光を照射し、光検出器を用いてラマンスペクトルを取得する工程、及び
　前記ラマンスペクトルから肝実質細胞の代謝能に関連する生体分子のラマン信号を検出する工程。
　本発明の肝実質細胞の代謝能を評価する方法において、「肝実質細胞の代謝能に関連する生体分子」としては、肝実質細胞の代謝能に関連する生体分子であれば特に限定されないが、例えば、CYP酵素群、glycogen、cytochrome b5、cytochrome c、脂質、及びフェニルアラニンからなる群から選択される少なくとも１つであり得る。これらの生体分子を検出し得るラマン散乱信号の波数については自体公知の波数を用いればよい。具体例としては、以下の実施例において使用された波数を用いることができるが、これらに限定されない。
　実施例１～７を参照しながら上記実施形態をさらに詳しく説明する。これら実施例に共通する実験条件等について、以下の（１）～（８）に説明する。以下の実施例ではヒト肝腫瘍由来細胞中のCYP3A4及びその他のCYP酵素群を検出する。上述の通り本発明に係る検出方法はCYP酵素群に特徴的な分子構造に由来する酸化還元状態を利用した方法である。また上述の通りCYP酵素群の酸化還元状態はCYP酵素群の代謝のメカニズムに関係する。したがってCYP3A4において得られた以下の実施例のデータは、ヒトCYP3A4のみならず、ありとあらゆる生物由来のCYPによる代謝の酵素活性が、本発明の検出方法で検出可能であることを実証している。
（１）肝細胞の播種と培養について
　実施例では、培養細胞を用いた。より具体的には、肝細胞及び胆管上皮細胞に分化した凍結HepaRG細胞(HPR116、BIOPREDIC International)を用いた。凍結HepaRG細胞を、37℃のウォーターバスを用いて融解した。続いて、融解したHepaRG細胞を培地(MIL600, ADD670, BIOPREDIC International)によって希釈した。続いて、希釈したHepaRG細胞をラマン観察用石英基板ディッシュ(SF-S-D12, Fine Plus International, Japan)上に播種した。
　播種についてより具体的に説明する。播種に用いた「ラマン観察用石英基板ディッシュ」とは、ディッシュ内部の底面に厚さ0.15 mm、直径12 mmの石英基板が接着されたプラスティックディッシュである。ディッシュのうち、石英基板上にのみにHepaRG細胞を播種するために、まず、円筒状のクローニングシリンダー（外径10 mm、内径：8 mm、1980005、Hilgenberg GmbH）を石英基板上に配置した。当該クローニングシリンダーの内部に、細胞を1.2 x105 個播種した。なお、クローニングシリンダーは石英基板上に載置されている。換言すると、クローニングシリンダーは、石英基板上に接着又は固定されていない。
　播種した24時間後には、HepaRG細胞が石英基板に接着する。播種したHepaRG細胞が石英基板に接着した時点で、クローニングシリンダーを石英基板から取り除いた。クローニングシリンダーを取り除いた際に、培地を新しい培地(MIL600, ADD670, BIOPREDIC International)に交換した。続いて、当該培地中でHepaRG細胞の培養を行った。培養は、37℃、5% CO2の雰囲気下で、3日間行った。
（２）肝細胞で発現するCYP酵素群の誘導又はCYP3Aの阻害について
　続いて、上記（１）の記載に従って培養したHepaRG細胞群を用いて、CYP酵素群の誘導又は阻害を行った。
　CYP酵素群の誘導について説明する。まず、上述した（１）のHepaRG細胞群の培地を、CYP酵素群の誘導剤を含む培地に置換した。以下に説明する誘導剤を含む培地に置換したHepaRG細胞群を、37℃、5 % CO2の雰囲気下で48時間培養することによって、CYP酵素群の誘導を行った。
　CYP酵素群の誘導に用いた培地は、MIL600, ADD650, BIOPREDIC Internationalである。培地に添加したCYP酵素群の誘導剤としては、次の4種類のいずれかを用いた：Rifampicin (189-01001), Fujifilm Wako, Japan; Phenytoin (16612082) Fujifilm Wako, Japan; Dexamethasone (04718863), Fujifilm Wako, Japan; Carbamazepine (034-23701) Fujifilm Wako, Japan。各実施例において用いた培地が含む各誘導剤の濃度は、各実施例に記載の通りである。これらの誘導剤は、CYP遺伝子の転写を促進する。
　コントロールのCYP酵素群の誘導を行わない細胞（以下、未誘導の細胞群とも呼ぶ）の培養も行った。未誘導の細胞群では、（１）のHepaRG細胞群の培地を、上述した誘導剤を含まない培地(MIL600, ADD650, BIOPREDIC International)に置換した。培養は、37℃、5 % CO2の雰囲気下で48時間行った。
　続いて、CYP酵素群の阻害について説明する。CYP酵素群の一種であるCYP3Aの阻害に用いたHepaRG細胞群は、上述のCYP酵素群の誘導を行った細胞群である。具体的には、（１）のHepaRG細胞群の培地を、上述の誘導剤の一種であるRifampicinを含む培地に置換し、37℃、5 % CO2の雰囲気下で48時間培養し、CYP酵素群を誘導して細胞群を得た。当該細胞群を、CYP3Aの阻害に用いた。
　CYP酵素群の阻害に用いた培地は、MIL600, ADD650, BIOPREDIC Internationalである。培地に添加した阻害剤は、Azamulin (18748, Cay chemical)を用いた。各実施例において用いた培地が含むAzamulinの濃度は、各実施例に記載の通りである。CYP酵素群を誘導した培地を、阻害剤であるAzamulinを含む培地に置換した。Azamulinを含む培地に置換したHepaRG細胞群を、37℃、5 % CO2の雰囲気下で5分間培養することによって、CYP酵素群の一種であるCYP3Aを阻害した。
（３）発光法を用いた細胞群のCYP3A4活性の検出
　ラマン観察を行う細胞群においてCYP酵素群のうち特に肝細胞で発現するCYP3A4の酵素活性を確認するために、ラマン観察と並行して、発光法を用いた試験（以下、発光試験）を行った。発光試験に用いた細胞群は、（５）にて後述するラマン観察において使用する培養細胞から分取した細胞群を用いた。すなわち、ラマン観察において使用した培養細胞と同条件かつ同時に培養した細胞群を用いた。CYP発光試験は、市販の発光アッセイキット(P450-Glo-CYP3A4-Assay-and-Screening-System)を用いて、提供されているプロトコルに従って実施した。
　Luciferin-IPA 基質がCYP3A4によりルシフェリンに変換されることでルシフェラーゼの基質となり、CYP3A4の活性に比例した発光を生じる。細胞群の培地を、Luciferin-IPA 基質(V9002, Promega, Germany)を3 μMの濃度で含む基質含有培地で置換し、37℃、CO2 5%の雰囲気下で1時間インキュベートした。ここで、Luciferin-IPA 基質は、CYP3A4に特異的な基質である。ルシフェリン前駆体であるLuciferin-IPA基質は、CYP3A4酵素の触媒作用により、ルシフェリンに変換される。インキュベート後、基質含有培地を採取し、96-well white flat bottom plate (Corning)に50 μl分注した。分注した基質含有培地に、50 μlのルシフェラーゼを滴下し、ルシフェリン－ルシフェラーゼの反応を利用して、発光させた。発光は、micro-plate reader (Synergy HTX, BioTek)を用いて検出した。なお、本発光法の方法により検出したCYP3A4活性は、図7、図１４、図１６、図１８、図２０、図２２に示されている。
（４）ウェスタンブロッティングを用いた細胞群のCYPの検出
　ウェスタンブロッティングを用いて、CYP酵素群を誘導した細胞群からCYP3A4タンパク質を検出した。ウェスタンブロッティングでは、上述の（２）に記載の方法により、誘導剤はRifampicinを用いてCYP酵素群を誘導して培養した細胞群を用いた。CYPを誘導した細胞群は、冷却したPBSで2回洗浄し、細胞溶解液に溶解した。細胞群の溶解は、protease inhibitor cocktail (1-100 dilution, Cat. No. P8340, Sigma Aldrich)を含む細胞溶解液RIPA Bufferの中で、30分間氷で冷却しながら実施した。細胞群を溶解した細胞溶解液を、セルスクレーパーを用いて回収した。回収した細胞溶解液を4℃下で遠心分離(12000 g, 20 min)し、その上清を採取することで、沈殿した不要な細胞片を取り除いた。
　細胞溶解液の上清に含まれるタンパク質濃度はBCA protein assay kit (Cat. No. 23227, ThermoFisher Scientific)を用いて測定した。細胞溶解液を12% SDS-PAGE gels (Cat. No. 4568043, BioRad)のウェルに添加し電気泳動にかけた。SDS-PAGE後のゲルに低蛍光ポリフッ化ビニリデン（PVDF）メンブレンを密着させ、転写した。転写後のメンブレンのブロッキング処理は5% ECL blocking agent (Cat. No. RPN2125, GE Healthcare)を含むTBST (0.1% Tween-20 in TBS)溶液を用いて1時間、攪拌器で攪拌しながら室温下で実施した。その後、メンブレンをTBST溶液で2回洗浄した。
　続いて一次抗体反応と二次抗体反応を行った。ブロッキング処理したメンブレンを、一次抗体であるmouse anti-CYP3A4 (1:2000)、rabbit anti-cytochrome b5 (1:1000)、及びrabbit anti-β-actin (1:1000 dilution, Cat. No. 4970, Cell signaling Technology)を含むブロッキングバッファーに浸し、一晩反応させた。次に、二次抗体であるhorseradish peroxidase-conjugated anti-mouse又はanti-rabbit secondary antibodies (1:10000)を含むブロッキングバッファーに浸し、1時間、室温下で反応させた。続いてメンブレンをTBSTバッファーに浸し、3回洗浄した。
　CYP3A4タンパク質の検出は、ECL detection system (RPN2232, GE Healthcare) と ChemiDOC MP imaging system (Bio-Rad)を用いて実施した。
（５）ラマン分光法を用いた細胞群のラマン観察
　上記（１）又は（２）の方法で培養した細胞群を、ラマン分光法を用いてラマン信号の定量計測を行い、ラマン画像の構築を行った。ここで本明細書における「観察」とは、細胞群のラマン散乱信号の検出を行うことと、細胞群のラマン画像を取得し、観察を行うことの両者を含む。なお、実施例によっては（１）の方法で培養した後に別の工程を経て観察対象の細胞群を得る場合もある。詳細は各実施例で説明する。
　培養した細胞群の培養液を除去し、当該細胞群をPBSで2回洗浄した。洗浄した細胞群に、観察用溶液（Live Cell Imaging Solution(A14291DJ, Thermo Fisher Scientific))を添加した。このように処理した細胞群を、図１を用いて説明したラマン顕微鏡（非特許文献３）を用いてラマン観察を行った(図６、図９～１１、図１３～図２１、図２３～図２６)。
　細胞群のラマン散乱光の励起及びラマン散乱信号の検出には、ラマン顕微鏡が備える40倍の水浸対物レンズ(CFI アポクロマートLambda S 40XC WI)を用いた。細胞群のラマン散乱光の励起光は、当該水浸対物レンズを用いて、波長532nmのレーザー光を所定の長さの直線状（以下ラインという）に集光して照射した。
　続いて、励起光によって励起され生じた細胞群のラマン散乱光の検出の流れについて説明する。水浸対物レンズにより集光されたラマン散乱光はダイクロイックミラー及び長波長を透過するエッジフィルターを経たのちに、分光器の入射スリットに結像される。スリットに結像されたラマン散乱信号は、その後分光器内部の回折格子で分光され、光検出器として用いた冷却型ＣＣＤイメージセンサー(PIXIS 400B, Princeton Instruments)で検出される。集光したライン上の至る所から散乱するラマン信号は、CCD上の異なる画素で、同時にかつ独立に計測できる。一度のレーザー照射時間は5秒とした。集光したライン方向のおよそ133.3 μmの領域で各ラマン信号を同時に検出した。このレーザー照射及びラマン信号の検出を、集光したラインの方向に対して垂直な方向に集光位置を走査ピッチZ nmずつずらしながら繰り返し走査した。すなわち、133.3 μm ×Y μmの長方形の領域でレーザーを走査して、細胞群のラマン散乱信号を検出した。レーザーを走査する時の細胞群の面上でのレーザーエネルギーの密度は3 mW/μm2であった。観察領域幅に相当するYの値と、Yと平行な方向の走査ピッチZの値は、各実施例によって異なる。ラマン信号の検出では刻線数の異なる2種類の回折格子を使用した。ここでラマン散乱信号の「検出」とは、ラマン散乱信号の定量計測と、ラマン画像の構築との両者を含む。ラマン散乱信号の定量計測には、刻線数1200の回折格子(1200L/mm, BLZ500 nm)を用いた。一方、ラマン画像の構築には、刻線数600の回折格子(600L/mm, BLZ500 nm)を用いた。今回、回折格子をそれぞれの実験目的によって使い分けたが、必ずしも上記の通りに使い分ける必要はない。他の例において、ラマン散乱信号の定量計測とラマン画像の構築にそれぞれ刻線数600、1200の回折格子を使用できる。
（６）ラマン散乱信号のノイズ処理
　ラマンスペクトルとして計測されたラマン散乱信号は非特許文献１４に記載の方法に従い、計算ソフトMatlab(Math works)を用いて解析した。計測したラマンスペクトルに含まれる宇宙線と、光検出器のオフセット信号を除去したのちに、特異値分解(singular value decomposition, SVD)を用いてノイズを除去した。その後、任意のラマンシフト（波数）の信号強度分布を構築し、ラマン画像を取得した。ラマン信号の定量計測では、SVDによるノイズ除去は行わず、宇宙線とカメラオフセットを除去したデータを用いた。必要に応じて、複数のラマンスペクトルから、クリアなスペクトルの平均、以下平均スペクトルを算出した。複数のラマンスペクトルは目的の細胞の集まる領域、もしくは隣り合う領域からのラマンスペクトルであっても良い。
（７）ラマン散乱信号の抽出とラマン画像の構築
　取得したラマンスペクトルから、上記（６）に記載の方法にてノイズを除去することでクリアなスペクトルを取得した。得られたスペクトルから解析対象となるラマン散乱信号を抽出する。抽出方法は、対象とするラマン散乱信号の強度や、近傍に他の生体分子由来のラマン散乱信号が存在するかどうか等の状況によって異なる。本実施例では、以下記載の二つの方法を用いて、対象となるラマン散乱信号をスペクトルから抽出し、定量に利用した。
　まずノイズ処理したスペクトルの中からCYP代謝酵素群に由来すると考えられる解析対象であるラマン散乱信号のピークとピークを含む波形とを特定する。一つの方法として、ピーク底辺の両端を結んだ直線もしくは曲線とラマン散乱信号の波形で囲まれた領域の面積をラマン散乱信号強度と定義し、ラマン散乱信号強度を算出した。またもう一つの方法として、ピーク底辺の両端を結んだ直線もしくは曲線と、ピーク頂点から波数軸に対して垂直に下ろした直線との交点を原点として、ピーク頂点までの高さをラマン散乱信号強度と定義し、ラマン散乱信号強度を算出した。本実施例の各箱ひげ図の作成には、図４を用いて説明した方法で抽出したラマン散乱信号の信号強度を使用した。上記二つの方法を用いて、解析対象となるラマン散乱信号とCYP活性との相関を調査した。
（８）免疫染色を用いた細胞群のCYP3A4とcytochrome b5の局在観察
　免疫染色を用いて、波数1636 cm-1のラマン信号がCYP酵素群に由来することを確認した。具体的には、CYP3A4と、CYP酵素群と同様タイプbの酸化型ヘムタンパク質であるcytochrome b5タンパク質の免疫染色を行った。cytochrome b5は、CYP酵素群と同様、薬物代謝に関わる酵素である。免疫染色に用いた細胞群は、ラマン観察を行った後の細胞群を用いた。
　ラマン観察した直後の細胞群を、4％のパラホルムアルデヒドを用いて室温下で20分間固定した。Triton-X-100をPBS(リン酸緩衝生理食塩水)で0.1％に希釈した溶液を用いて細胞膜の膜透過処理を行った。洗浄後、非特異染色を抑制するために、4％のウシ血清アルブミン(bovine serum albumin, A2153, Sigma Aldrich)を用いて1時間、室温下でブロッキング処理を行った。一次抗体としてanti-CYP3A4 (1:1000 dilution, SAB5300118,Sigma Aldrich )とrabbit anti-human cytochrome b5 (1:500 dilution, ab69801, abcam)を含む1%BSAブロッキングバッファーを滴下し、4℃下で一晩静置した。翌日、細胞群をPBS溶液で3回洗浄した後に、二次抗体として Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody (10 g/ml, A11001, Invitrogen) とAlexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody (10 g/ml, A11012, Invitrogen)を含むブロッキングバッファーを滴下し、室温下で1時間反応させた。PBS溶液で3回洗浄した後に、染色を行った。染色では、1Mの濃度のDAPI (D1306, Invitrogen)を添加し、室温下で反応させ、細胞核の染色を行った。最後に細胞群をPBSで2回洗浄し、蛍光観察までの間、遮光を行い4℃下で保存した。蛍光観察は、レーザー走査型共焦点顕微鏡(CLSM, Nikon, Japan)を用いて、ラマン観察した領域と同じ場所を観察した。ラマン観察を行う領域は予め油性ペンを用いて標識している。その標識を元に、ラマン観察と蛍光観察の領域を決定した。上述の方法により取得した蛍光画像は、図１２、図２４に示されている。
　以下、実施例1～7について、図６～図２６を用いて詳細に説明する。
＜実施例１＞
＜ヒト肝細胞のCYP酵素群の誘導に起因するラマンスペクトルの検出（図6）＞
　本実施例では、CYP酵素群の誘導剤であるRifampicinを用いて、HepaRG細胞のCYP酵素群の発現を誘導し、CYP酵素群の誘導に起因したラマン散乱信号の検出を試みた。Rifampicinは、CYP酵素群の中でも主にCYP3A4の発現を誘導する。この誘導剤は、それ以外にもCYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19の発現を誘導する（非特許文献１５）。Rifampicin誘導時において上記CYPを含めたCYP酵素群全体の発現量の変化は、CYP3A4の発現量の増減に支配されている。その理由として、Rifampicinは、CYP酵素群の中でも主にCYP3A4の発現を誘導することと、CYP3A4が、肝臓に発現する全CYP酵素群種の内の3分の1を占めていることが挙げられる（非特許文献２）。
　本実施例では、培養細胞に対し、ラマン観察、発光試験及びウェスタンブロッティングを並行して行った。発光試験は、ラマン観察を行う細胞群においてCYP酵素群のうち特にCYP3A4の酵素活性を確認するために行った。ウェスタンブロッティングは、細胞群からCYP3A4タンパク質を検出するために行った。
　まず、上記（１）及び（２）に記載の手順に従いヒト肝細胞(HepaRG細胞)の播種、培養、CYP酵素群の誘導を行った。CYP酵素群の誘導剤(Rifampicin)は、4 μMの濃度で添加した。CYP酵素群の誘導を行った細胞群に対するコントロールとして、CYP酵素群の誘導剤を含まない培地(MIL600, ADD650, BIOPREDIC International)を用いて、未誘導の細胞群の培養も行った。
　播種後6日間培養すると、HepaRG細胞は、肝臓実質細胞と胆管上皮細胞とがそれぞれ集まり、別の細胞群となる。細胞が播種された石英基板上において、肝臓実質細胞と胆管上皮細胞が細胞群となる領域は、それぞれ明視野顕微鏡観察により識別可能である。ここで、CYP酵素群は肝臓実質細胞でのみ発現することが知られている。したがって、本実施例におけるラマン観察の対象は、肝臓実質細胞である。
　ラマン観察と発光試験とを並行して行うために、CYP酵素群の誘導を行った肝臓実質細胞の細胞群から、ラマン観察と発光試験用に細胞群を分取した。また、CYP酵素群未誘導の肝臓実質細胞の細胞群も、ラマン観察と発光試験用にそれぞれ分取した。
　ラマン観察は、上記（５）に記載の手順に従って、133.3 x 84 μmの長方形の領域を走査ピッチ333 nmでレーザー走査を実施した。取得したラマンスペクトルは、上記（５）～（７）に記載の手順に従って解析した。
　また、ラマン観察と並行して、発光試験を上記（３）に記載の手順に従って実施した。発光試験により、CYP酵素群の誘導を行った細胞群内に発現したCYP3A4の活性を測定した。
　さらに、ウェスタンブロッティングを（４）に記載の手順に従って行い、CYP3A4タンパク質の検出を行った。
　まず、ラマン観察の結果について図６を参照して説明する。
　図６は、CYP酵素群を誘導した肝臓実質細胞のラマンスペクトルを示す。CYP酵素群を誘導した又は誘導していない細胞群の観察では、肝臓実質細胞が集まる領域の平均スペクトルを算出し、プロットで表示した。図６に示すように、薄い灰色の線（Induced）はRifampicinによってCYP酵素群が誘導された肝臓実質細胞の細胞群のスペクトルを示す。濃い灰色の線（Control）はCYP酵素群未誘導の肝臓実質細胞の細胞群のスペクトルを示す。
　図６の平均スペクトルから、波数1370、1636 cm-1のピーク及び波形を特定した。波数1370、1636 cm-1において、CYP酵素群を誘導した肝臓実質細胞の細胞群と、CYP酵素群未誘導の肝臓実質細胞の細胞群との信号強度を比較した。RifampicinによりCYP酵素群を誘導した肝臓実質細胞の細胞群では、CYP酵素群未誘導の細胞群に比べて、波数1370、1636 cm-1のラマン信号が増加していることが確認できた。
　続いて、ラマン観察と並行して行った発光法及びウェスタンブロッティングの結果について、図７及び図８を参照して説明する。培養した肝臓実質細胞の細胞群にCYP酵素群の一種であるCYP3A4が誘導されていることを、発光法及びウェスタンブロッティングを行い確認した。
　図７の棒グラフは、Rifampicinを用いてCYP3A4を誘導した細胞群では、CYP3A4未誘導の細胞群に比べて、CYP活性が増加していることを示す。
　図８のウェスタンブロッティングの写真中には、CYP3A4未誘導の細胞群ではバンドが観察されない。一方でRifampicinを用いてCYP3A4を誘導した細胞群ではCYP酵素の発現量が増加している。
　ラマン観察により、波数1370, 1636 cm-1のラマン信号が、Rifampicinを用いたCYP酵素群の誘導により増加したことを確認した。平均スペクトルから、波数1370、1636 cm-1の他にも、従来より知られている還元型のヘムのラマン信号(波数600, 675, 750 cm-1)(非特許文献４)、肝細胞の糖代謝に関連するglycogenを示すラマン信号(波数940 cm-1)（非特許文献１６）、細胞質に多く含まれる必須アミノ酸であるフェニルアラニンを示すラマン散乱信号(波数1000 cm-1)のピーク及び波形を特定した。
＜ヒト肝細胞のCYP酵素群の誘導に起因するラマン信号の細胞内分布の取得（図９）＞
　続いて、CYP酵素群の誘導に起因するラマン信号の細胞内での分布を調査することで、検出したラマン信号が示す生体分子の特定を試みた。上記（５）に記載の手順に従って計測したラマンデータを用いて、上記（６）及び（７）に記載の方法に従い、それぞれの生体分子を示すラマン信号を抽出し、細胞内での信号強度分布を取得した。
　ここで、波数1370 cm-1及び1636 cm-1付近のラマン信号は、タイプbとタイプcの酸化型ヘムに由来することが知られている（非特許文献４）。Rifampicinによって誘導されるCYP酵素群は、タイプbのヘムタンパク質である（非特許文献１２）。このため、上述のラマン観察結果は、波数1370、1636 cm-1のラマン信号が、タイプbのヘムを補欠分子属として有するCYP酵素群に起因するという予想とよく一致する。上述の通り、これらのCYP酵素群の分子は主にCYP3A4で占められている。また、波数1370、1636 cm-1のラマン信号は、肝臓実質細胞においてのみ検出されるラマン信号である。この結果は、CYP酵素群が肝臓実質細胞においてのみ発現し、胆管上皮細胞には発現しない事実とも一致する。以下、図９及び図１０を用いて具体的に説明する。
　図９は、肝臓実質細胞と胆管上皮細胞のラマンスペクトルを示すグラフである。黒線は肝臓実質細胞群の所定の領域内における平均ラマンスペクトルを示す。灰色の線は胆管上皮細胞群の所定の領域内における平均ラマンスペクトルを示す。グラフの縦軸がラマン散乱強度（ラマン散乱信号強度）、横軸がラマンシフト（波数）で表される。図９のグラフに示すように、波数1636 cm-1のラマン信号は肝実質細胞においてのみ確認することができ（黒線）、胆管上皮細胞では確認できない（灰色の線）。図９中では明示していないが、波数1370 cm-1のラマン信号も波数1636 cm-1のラマン信号と同様の傾向を示す。
　肝臓実質細胞群と胆管上皮細胞群の平均ラマンスペクトルを取得した所定の領域について図１０を用いて説明する。図１０は特異的なラマンピークを元に構築したラマン画像である。図１０の最も左は明視野（Bright field）の写真である。明視野の写真に引かれた白線の上側が肝臓実質細胞を示し、白線の下側（内側）が胆管上皮細胞を示す。左から２枚目の写真のうち、図９の黒線で示す肝臓実質細胞群の所定の領域を上側の白抜き四角で示し、図９の灰色の線で示す胆管上皮細胞群の所定の領域を下側の白抜き四角で示す。上述の通り、当該所定の領域内における平均ラマンスペクトルを示したグラフが図９である。また、図１０は、波数600、675、940、1636 cm-1のラマン画像をそれぞれ示している。図１０中では明示していないが、波数1370 cm-1のラマン画像も波数1636 cm-1のラマン画像と同様の傾向を示す。
　これらの事実及び実験結果から、波数1370、1636 cm-1はCYP酵素群に起因する可能性が示唆される。また、肝臓実質細胞と胆管上皮細胞の識別に活用できる。係る識別には上記波数のラマン信号に加えて、675 cm-1のラマン信号が活用できる。
　波数1370及び1636 cm-1のラマン信号が、タイプc又はタイプbどちらのヘムに由来するかを見分けるために、タイプcとタイプbそれぞれのヘムの細胞内での分布の違いに着目した。タイプbのヘムであるCYP酵素群は、主に小胞体(endoplasmic reticulum)内に存在することが報告されている（非特許文献１７）。一方で、タイプcのヘムは、主にミトコンドリアの膜上に分布し、エネルギー代謝に関わることが知られている。細胞内を観察した時、タイプcのヘムの分布はミトコンドリアの表面形状に一致することが報告されている（非特許文献３）。上記の還元型の各種ヘムを表すラマン信号を用いてラマン画像を作成し、CYP酵素群を誘導した肝細胞と、未誘導の細胞群内におけるラマン信号の強度分布を比較した(図１１)。
　図１１に示すように、Glycogen(グリコーゲン、940 cm-1)とCYP酵素群(1370、1636 cm-1)とは、肝臓の代謝機能に起因する生体分子を示す。その他のラマンピーク(600, 675 cm-1)は、CYP酵素群とは異なるヘムタンパク質を示す。600 cm-1のラマン信号は還元型cytochrome cを, 675 cm-1のラマン信号は還元型cytochrome bを示す。各波数のラマン信号を用いて構築したラマン画像は、各ラマン信号に起因する分子の濃度分布を示す。750 cm-1のラマン信号は還元型のcytochrome cとcytochrome bに由来し、600 cm-1と675 cm-１の画像を重ね合わせたような分布を示す（不図示）。CYP3A4を誘導した細胞ではGlycogen分子の濃度が低下し、CYP酵素群分子の濃度が増加する。その他のヘムタンパク質の濃度分布は、CYP3A4の誘導と相関がない。cytochrome cは主にミトコンドリアに分布するため、還元型cytochrome cのラマン画像はミトコンドリアの分布を示し、cytochrome bは主にER(小胞体)に分布するため、還元型cytochrome bのラマン画像はERの分布を示す。
　還元型ヘムタンパク質のラマン信号と、フェニルアラニン（1000 cm-1）を示すラマン信号では、Rifampicinを用いたCYP酵素群の誘導による信号強度の変化は確認できなかった。一方、glycogenを示すラマン信号では、Rifampicinを用いたCYP酵素群の誘導により、CYP酵素群未誘導の細胞群と比べ、信号強度が低下することが確認できた。
　図１１に示すように、波数600 cm-1のラマン信号の細胞内における強度分布は、ミトコンドリアのような微細構造に限局した。一方、波数1636 cm-1のラマン信号の細胞内における強度分布は、細胞質全体に広がっていた。タイプbのヘムタンパク質であるCYP酵素群が分布する小胞体は、本来ミトコンドリアよりもさらに微細な網状構造をしている（非特許文献１８）。そのため、本実験に用いた顕微鏡の空間分解能(260 nm程度)では、ラマン信号の分布がその構造と一致することが分かる鮮明な像を観察することができないと考えられる。したがって図１１の1370、1636 cm-1のラマン信号の強度分布は、細胞質全体に小胞体が分布するように観察されることと整合する。
　波数675 cm-1のラマン信号は、cytochrome bが還元型の状態をとる際にえられる（非特許文献１９）。cytochrome bは、CYP酵素群と同様にタイプbのヘムタンパク質であり、その信号分布は波数1370、1636 cm-1のラマン信号の分布と同様に細胞質を示している。よって、波数1370、1636 cm-1のラマン信号は小胞体に分布するタイプbのヘムタンパク質であると言える。
　ヘムタンパク質の他にも、肝細胞の糖代謝に関連するglycogenに由来する波数940 cm-1のラマン信号についても、その強度分布を併せて確認した。その結果を図１１に示す。glycogenに由来するラマン信号は、CYP酵素群と同様に、代謝能を有する肝臓実質細胞にのみ分布することが確認できた。
　各種ヘムタンパク質を示すラマン信号と波数940 cm-1のラマン信号の強度分布の変化を検出することで、肝臓実質細胞の成熟度や薬剤応答に関する分子情報を計測できる。
＜CYP酵素群誘導を行ったヒト肝細胞のラマン観察結果と免疫染色結果の比較（図１２）＞
　波数1370、1636 cm-1のラマン信号がCYP酵素群に由来するものの、cytochrome b5には由来していないことを確認するために、Rifampicinを用いてCYP酵素群を誘導したヒト肝細胞のラマン観察結果と免疫染色結果との比較を行った。CYP3A4とcytochrome b5とを免疫染色し蛍光観察を行った。上述の通りCYP3A4はRifampicinにより誘導されるCYP酵素群の中でも最も発現量が多い。一方、cytochrome b5は小胞体に存在することが知られているCYP酵素群以外のタイプbヘムタンパク質である。図１２は、上記（８）の方法により取得した蛍光画像である。
　図１２で示されるcytochrome b5とCYPの分布と、図１１で示されるタイプbの還元型ヘムタンパク質のラマン信号(波数675 cm-1)と、タイプbの酸化型ヘムタンパク質のラマン信号(1370、1636 cm-1)の分布を比較すると、どちらも細胞質全体を示している。cytochrome b5も、CYP酵素群と同様に小胞体に分布することが報告されている。発明者らのラマン観察結果は、これまでcytochrome b5に対して報告された調査結果とも一致する。したがって波数1370、1636 cm-1のラマン信号がcytochrome b5に由来しないことは以下のとおり確認される。すなわち図１１に示すようにラマン信号の強度を比較すると、まず波数1370、1636 cm-1のラマン信号が、Rifampicinを用いて誘導した細胞において増加している。これに対し、波数675 cm-1のラマン信号の強度の変化は、誘導した細胞と未誘導の細胞群とで大きな差がなかった。波数675 cm-1のラマン信号は還元型cytochrome bを示すことが上述の調査結果ですでに知られている。免疫染色結果においても同様の傾向を示していた。CYP3A4に対する標識の蛍光強度は、CYP酵素群を誘導した細胞においてのみ増加していた。cytochrome b5に対する標識の蛍光強度は、誘導群とコントロール群と大きな差がなかった。したがって、タイプbの酸化型ヘムタンパク質に由来する波数1370、1636 cm-1のラマン信号は、cytochrome b5ではなく主にCYP酵素群に由来していると言える。
　図１１に示す波数1370、1636 cm-1のラマン画像と図１２に示すCYP3A4の蛍光画像とで、一部の細胞ではラマン信号の強度分布と蛍光の強度分布が一致しない。この分布の違いはCYP3A4以外のCYP分子に由来すると考える。蛍光画像ではCYP3A4のみを特異的に検出できているのに対し、ラマン画像では、全CYP分子を検出しているためである。上述したように、本実験にて誘導剤として使用したRifampicinは、CYP3A4以外のCYP酵素群に含まれる分子として、CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19（非特許文献１５）を誘導することが報告されている。
＜実施例２＞
＜CYP活性の誘導剤濃度依存の検出＞
　本実施例では、ラマン観察によるCYP活性の誘導剤濃度依存性の検出を試みた。上述の通り誘導剤（Rifampicin）は、ヒト肝細胞(HepaRG細胞)のCYP3A4の発現を誘導する。そこで濃度の異なる誘導剤（Rifampicin）を用いて、ヒト肝細胞(HepaRG細胞)内のCYP3A4を誘導した。上記（１）及び（２）の手順に従い肝細胞の播種、培養、誘導を行った。誘導剤（Rifampicin）の濃度は、0, 0.04, 0.4, 4 μMで添加した。誘導後の細胞の一部において、ラマン観察に対する対照実験として上記（３）に示す手順に従って、発光法を用いて細胞内に発現したCYP3A4の活性検出を実施した。他の細胞において上記（５）に示す手順に従ってラマン観察を行った。培養ディッシュ内の3箇所において、それぞれ縦133.3 μm x 横84 μmの長方形の領域を走査ピッチ1μmでレーザーを照射しラマンスペクトルを取得した。取得したラマンスペクトルに対して、上記（６）及び（７）に記載の方法に従ってノイズ除去を行った。
　上記実施例において波数1370、1636 cm-1のラマン信号はCYP酵素群に由来し、CYP酵素群活性と相関することが推定された。そこで図１３に示すように波数1636 cm-1(酸化型タイプbヘムタンパク質)のラマン信号の分布を用いて長方形の領域のラマン画像を再構築した。波数1636 cm-1のラマン信号は細胞質全体に均一に分布している。なお、図１３は、取得したラマン画像から、84 x 84 μmの領域を切り出して表示している。
　特に図示していないが波数1370 cm-1のラマン信号の分布の変化及びラマン信号の強度の変化も波数1636 cm-1のそれらと同等の傾向を示した。
　図１４、図１５は、肝臓実質細胞の領域の平均スペクトルの算出結果を示す。波数1636 cm-1を含むピークにおいてピーク底辺の両端を結んだ直線と、ピーク波形の頂点から波数軸に対して垂直に下ろした直線との交点を原点として、ピーク頂点までの高さを信号強度として抽出した。
　図１４において、薄い灰色の棒グラフは発光法を用いて検出したCYP3A4の活性を示す。一方、濃い灰色の棒グラフは肝臓実質細胞の領域で平均したラマンスペクトルから抽出した、波数1636 cm-1のラマン信号を示す。Rifampicinの添加濃度毎の波数1636 cm-1のラマン信号強度と、発光法を用いたCYP3A4活性の結果と比較した。投与するRifampicin濃度が増えるにつれて、CYP酵素群を示す波数1636 cm-1のラマン信号強度とCYP3A4の活性とが増加していく様子を確認できた。したがって、波数1636 cm-1のラマン信号は、CYP3A4の活性と正の相関があるといえる。
　図１５は、細胞毎のCYP酵素群活性のばらつきを示す箱ひげ図である。個々のプロットは、上記記載の方法に従い、細胞毎の平均スペクトルから波数1636 cm-1のラマン信号を抽出したものである。Rifampicinの投与濃度が一定の条件下であっても、誘導されるCYP酵素群活性が細胞毎に異なることが確認できる。ラマン信号を用いたCYP酵素群活性検出によって示されたことは、培養ディッシュ内の細胞が皆一様にCYP活性を高めていくわけではないということを示している。また、Rifampicinの各投薬濃度条件におけるプロットの中間値が、Rifampicinの投薬濃度とともに増加する様子を確認した。この中間値の増加は、統計的にみて有意であった。またCYP3A4活性の上昇とよく対応している。
＜実施例３＞
＜各種誘導剤を添加した肝細胞のCYP活性の検出＞
　本実施例では、誘導剤の種類ごとにCYP酵素群の活性の応答の違いの観察を試みた。ヒト肝細胞(HepaRG細胞)のCYP発現を誘導する事が知られている4種類の誘導剤（Rifampicin, Phenytoin, Dexamethasone, Carbamazepine）を用いた。これらによってヒト肝細胞(HepaRG細胞)内のCYPを誘導し、ラマン観察によるCYP酵素群の活性検出を試みた。これらの誘導剤は、転写因子であ・BR>餘XR(PREGNANT X RECEPTOR:PXR)を活性化させる。活性化されたPXRは細胞質から核内に移行して、レチノイドX受容体(RETINOID X RECEPTOR: RXR)とヘテロ二量体を形成してプロモータ配列に結合し、標的遺伝子の転写が進み（非特許文献２０～２２）、その結果CYP酵素群の発現が促進される。PXRを通じて転写が促進されるのは主にCYP3A4である。
　上記（１）及び（２）の手順に従いヒト肝細胞(HepaRG細胞)の播種、培養、誘導を行った。4種類の誘導剤(Rifampicin, Phenytoin, Dexamethasone, Carbamazepine)は、それぞれ4 , 100, 100, 100 μMの濃度で添加した。また、コントロールとして、誘導剤を含まない培地(MIL600, ADD650, BIOPREDIC International)で培養した未誘導の肝細胞も用意した。発光法とラマン観察とを行うために、これらの細胞群よりそれぞれの観察用に細胞を分取した。誘導後のヒト肝細胞(HepaRG細胞)の一部をラマン観察に対する対照実験として発光法に利用し、残りのヒト肝細胞(HepaRG細胞)をラマン観察に用いた。発光法とラマン観察は、それぞれ上記（３）及び（５）に記載された手順に従って実施した。以上によりヒト肝細胞(HepaRG細胞)内のCYP3A4の活性を測定した。上述の通り1636 cm-1のラマン信号はCYP活性と良く相関すると期待される。ラマン観察結果の解析では、上記（６）及び（７）において、1636 cm-1のラマン信号を抽出し、発光法を用いたCYP3A4の検出結果と比較した。
　図１６及び図１７は、誘導剤としてRifampicin、Phenytoin、Carbamazepine、Dexamethasoneを用いて誘導した時の、CYP酵素群活性の計測結果を示す。各種薬剤によって誘導されるCYP3A4の活性を、波数1636 cm-1のラマン信号を用いて計測できた。図１６は、発光法を用いて検出したCYP3A4の活性(薄い灰色)と、ラマン信号(濃い灰色)を示す。図１６の黒棒グラフは、肝臓実質細胞の領域から検出されたラマンスペクトルを平均した後に、CYP酵素群のラマンピークである波数1636 cm-1のラマン信号強度をプロットしたもので、薄い灰色の棒グラフは発光法で検出したCYP活性を示す。この時、信号の抽出は、波数1636 cm-1を含むピークにおいてピーク底辺の両端を結んだ直線と、ピーク波形の頂点から波数軸に対して垂直に下ろした直線との交点を原点として、ピーク頂点までの高さを信号強度として実施した。また、図１７は、細胞毎のCYP酵素群活性のばらつきを示す箱ひげ図である。個々のプロットは、細胞毎の平均スペクトルから前記と同様に波数1636 cm-1のラマン信号を抽出したものである。図１５での結果と同様に、ある一定の培養条件下においても、誘導されるCYP酵素群活性は細胞毎に異なる。また、培養ディッシュ内の細胞が、皆一様にCYP活性を高めていくわけではない。また、各培養条件におけるプロットの中間値の増加及び減少は、発光法で検出したCYP3A4の活性の変動とよく一致する。プロットの中間値の増加は、統計的に有意であった。
　特に図示していないが波数1370 cm-1のラマン信号の分布の変化及びラマン信号の強度の変化も波数1636 cm-1のそれらと同等の傾向を示した。
＜実施例４＞
＜IL-6(interleukin-6)によるCYP活性の抑制の検出＞
　本実施例では、CYP活性の抑制の観察を試みた。CYP活性の抑制には、ヒト肝細胞(HepaRG細胞)のCYP酵素群の活性を抑制することが知られているInterleukin-6 (IL-6)を用いた。ヒト肝細胞(HepaRG細胞)内のCYP酵素群の活性を抑制すなわち下方制御した後、ラマン観察によるCYP酵素群の活性検出を試みた。IL6は急性期応答の一次仲介物質であり、かつ複数の慢性炎症性疾患の中心的な役割を果たすサイトカインの一つである。炎症性又は感染性のストレスに細胞が晒されると、IL6の放出が起こる。IL6は、肝癌細胞株であるHepaRG細胞において、CYP3A4のmRNAの発現を抑制する事が知られている（非特許文献２３）。mRNAの発現の抑制の結果としてCYP3A4タンパク質の発現が抑制される。
　IL-6を用いたCYP酵素群活性の下方制御には、上記（１）の手順に従い、肝細胞の播種、培養を行った肝細胞を用いた。IL-6を投与する前に、全CYP酵素群の種類の誘導すなわちCYP酵素群の種類に非特異的な誘導を行った。CYP酵素群の非特異的な誘導は、DMSOを2 %の濃度で含む培地(MIL600, ADD620, BIOPREDIC International)でHepaRG細胞を2日間培養することで行った。その後、IL-6(206-IL-010/CF, R&D systems)を2 ng/mlの濃度で含む培地(MIL600, ADD650, BIOPREDIC International)で48時間培養した。また、コントロールとして、IL-6を含まない培地(MIL600, ADD650, BIOPREDIC International)で48時間培養した肝細胞も用意した。発光法とラマン観察とで用いるために、これらの細胞群よりそれぞれの観察用に細胞を分取した。
　誘導及びIL-6を投与したヒト肝細胞(HepaRG細胞)の一部をラマン観察に対する対照実験として発光法に利用し、残りのヒト肝細胞(HepaRG細胞)をラマン観察に用いた。発光法とラマン観察は、それぞれ上記（３）及び（５）に記載された手順に従って実施し、ヒト肝細胞(HepaRG細胞)内のCYP3A4の活性を測定した。ラマン観察結果の解析では、上記（６）及び（７）において、CYP活性と良く相関すると期待された1636 cm-1のラマン信号を抽出し、発光法を用いたCYP3A4の結果と比較した。
　図１８及び図１９は、IL-6を投与することで生ずるCYP活性の下方制御を、ラマン信号で検出した結果を示す。その結果CYP3A4の活性も低減することが発光試験により検出され、ラマン計測結果とよく一致した。図１８の棒グラフは、発光法を用いて検出したCYP3A4の活性(薄い灰色)と、ラマン信号(濃い灰色)を示す。図１８の濃い灰色の棒グラフは、肝臓実質細胞の領域からラマンスペクトルを平均した後に、CYP酵素群のラマンピークである波数1636 cm-1のラマン信号をプロットしたラマン信号強度を示すもので、薄い灰色の棒グラフは発光法で検出したCYP活性を示す。信号の抽出は、波数1636 cm-1を含むピークにおいてピーク底辺の両端を結んだ直線と、ピーク波形の頂点から波数軸に対して垂直に下ろした直線との交点を原点として、ピーク頂点までの高さを信号強度として実施した。
　また、図１９は、細胞毎のCYP酵素群活性のばらつきを示す箱ひげ図である。個々のプロットは、細胞毎の平均スペクトルから上記と同様に波数1636 cm-1のラマン信号を抽出したものである。図１５での結果と同様に、ある一定の培養条件下においても、CYP酵素群活性は細胞毎に異なっている。また、培養ディッシュ内の細胞が、皆一様にCYP活性が低下していくわけではない。また、各培養条件(CYP酵素群発現抑制剤の投与の有無)におけるプロットの中間値の減少は、発光法で検出したCYP3A4の活性の変動とよく一致する。
観察されたプロットの中間値の減少は、統計的に有意であった。
　特に図示していないが波数1370 cm-1のラマン信号の分布の変化及びラマン信号の強度の変化も波数1636 cm-1のそれらと同等の傾向を示した。
＜実施例５＞
＜肝細胞の播種に伴うCYP活性の変化のタイムコースラマン観察＞
　本実施例では、ヒト肝細胞(HepaRG細胞)の培養日数に応じたCYP酵素群活性の経時変化を、ラマン観察により検出することを試みた。まず凍結ヒト肝細胞(HepaRG細胞) (HPR116、BIOPREDIC International)を融解した。HepaRG細胞は、播種後、高いCYP酵素群活性を示し、その後の48時間で活性が低下していくことが知られている。
　上記（１）の手順に従い、ヒト肝細胞(HepaRG細胞)の播種、培養を行った。発光法とラマン観察とを行うために、これらの細胞群よりそれぞれの観察用に細胞を分取した。CYP酵素群活性の検出は、HepaRG細胞を播種した6時間後、24時間後、48時間後に、発光法とラマン観察により行った。
　用意したヒト肝細胞(HepaRG細胞)の一部を対照実験として発光法に利用し、残りのヒト肝細胞(HepaRG細胞)をラマン観察に用いた。発光法とラマン観察は、それぞれ上記（３）及び（５）に記載された手順に従って実施し、ヒト肝細胞(HepaRG細胞)内のCYP3A4の活性を測定した。本実施例のラマン観察では、タイムポイント毎に、同じタイミングで播種及び培養した異なる細胞群を観察した。ラマン観察結果の解析では、上記（６）及び（７）において、CYP活性と良く相関すると期待された1636 cm-1のラマン信号を抽出し、発光法を用いたCYP3A4の結果と比較した。
　図２０及び図２１は、HepaRG細胞のCYP活性の経時変化を、それぞれ発光法とラマン観察により検出した結果を示す。HepaRG細胞の播種後のCYP酵素群活性の経時変化を、波数1636 cm-1のラマン信号を用いて計測できた。図２０の濃い灰色の棒グラフは、肝臓実質細胞の領域からラマンスペクトルを平均した後に、CYP酵素群のラマンピークである波数1636 cm-1のラマン信号強度をプロットしたもので、薄い灰色の棒グラフは発光法で検出したCYP活性を示す。信号の抽出は、波数1636 cm-1を含むピークにおいてピーク底辺の両端を結んだ直線と、ピーク波形の頂点から波数軸に対して垂直に下ろした直線との交点を原点として、ピーク頂点までの高さを信号強度として実施した。
　また、図２１は、細胞毎のCYP酵素群活性のばらつきを示す箱ひげ図である。個々のプロットは、細胞毎の平均スペクトルから前記と同様に波数1636 cm-1のラマン信号を抽出したものである。図１５での結果と同様に、ある一定の培養条件下においても、CYP酵素群活性は細胞毎に異なる。また培養ディッシュ内の細胞が、皆一様にCYP活性を失っていくわけではない。また、各培養条件(タイムポイントの違い)におけるプロットの中間値の減少は、発光法で検出したCYP3A4の活性の変動とよく一致する。プロットの中間値の減少は、統計的に有意であった。
　実施例２～５の結果から、酸化型CYP酵素群を示す波数1636 cm-1のラマン信号と、発光法で検出したCYP3A4の活性との間に正の相関があることを確認した。このことから、波数1636 cm-1のラマン信号を用いて、CYP酵素群の活性を測定できるといえる。
　特に図示していないが波数1370 cm-1のラマン信号の分布の変化及びラマン信号の強度の変化も波数1636 cm-1と同等の傾向を示す。そのため、波数1370 cm-1のラマン信号もCYP酵素活性の測定に活用できる。
＜実施例６＞
＜AzamulinによるCYP活性の阻害＞
　本実施例では、ヒト肝細胞(HepaRG細胞)のCYP酵素群活性の阻害をラマン観察により検出することを試みた。Azamulinはmechanism-based inhibitor (MBI)としてCYP3A(CYP3A4を含む)に特異的に働く阻害薬として知られている（非特許文献２４）。したがってAzamulinはヒト肝細胞(HepaRG細胞)のCYP3As活性を阻害する。
　CYP3Asの触媒作用によって代謝されたAzamulinは、反応生の高い代謝物を生じる。その代謝物がCYP3A4を含むCYP3Asと不可逆的に共有結合を形成することにより、CYP3Asの触媒作用(代謝能)が阻害される。CYP3Asが阻害されると、体内の薬物が代謝されず、薬物の血中濃度が上昇する。その結果、治療効果の変化や重篤な副作用発現のリスクが高まる。そのため、CYP3As活性の評価技術において、阻害薬によるCYP3As活性(薬物代謝能)の低下の検出は重要である。
　上記（１）及び（２）の手順に従い、肝細胞の播種、培養、誘導、そして阻害を行った。誘導剤(Rifampicin)と阻害剤(Azamulin)はそれぞれ、4 μMと10 μMの濃度で培地に添加した。コントロールとして、誘導後に阻害剤(Azamulin)を含まない培地(MIL600, ADD650, BIOPREDIC International)で培養したヒト肝細胞(HepaRG細胞)も用意した。発光法とラマン観察とを行うため、これらの細胞群よりそれぞれの観察用に細胞を分取した。用意したヒト肝細胞(HepaRG細胞)の一部をラマン観察に対する対照実験として発光法に利用し、残りのヒト肝細胞(HepaRG細胞)をラマン観察に用いた。発光法とラマン観察は、それぞれ上記（３）及び（５）に記載された手順に従って実施し、ヒト肝細胞(HepaRG細胞)内のCYP3A4の活性を測定した。ラマン観察結果の解析では、上記（６）及び（７）において、CYP活性と良く相関すると期待された1636 cm-1のラマン信号を抽出し、発光法を用いたCYP3A4の結果と比較した。
　図２２及び図２３はそれぞれ発光法とラマン観察により検出したCYP酵素群の活性を示す。図２２では、AzamulinによるCYP3A4阻害の有無ごとに発光法によるCYP3A4活性測定を行っている。上述の通りAzamulinを投与する前に、RifampicinでCYPを誘導している。図２２の発光法による検出結果から、Azamulinによる5分間のCYP酵素群阻害により、全CYP3A4の82 %が活性を失っていることを確認した。
　図２３は、AzamulinによるCYP3A4阻害の有無と波数1636 cm-1のラマン信号の関係を示している。ラマン散乱信号の抽出は、波数1636 cm-1を含むピークにおいてピーク底辺の両端を結んだ直線と、ピーク波形の頂点から波数軸に対して垂直に下ろした直線との交点を原点として、ピーク頂点までの高さを信号強度として実施した。Azamulinを投与する前に、RifampicinでCYPを誘導している。図２３では、Azamulinを投与することで、波数1636 cm-1のラマン信号が低下することを示している。個々のプロットは細胞毎に平均したラマンスペクトルから波数1636 cm-1のラマン信号を抽出したものである。波数1636 cm-1のラマン信号は、個々の細胞でばらついている。これは細胞毎のCYP酵素群活性の違いを示している。プロットの中間値は、Rifampicinで誘導したがAzamulinを投与していない細胞群に比べて、Azamulinを投与したヒト肝細胞(HepaRG細胞)において減少している。このことから、波数1636 cm-1のラマン信号を観察することで、CYP酵素群活性の阻害を検出できたといえる。プロットの中間値の減少量は、統計的に有意であることも確認している。
　先行技術およびこれまでの実験結果に基づけば、酸化型ヘムｂのシグナル（波数1636cm-1）が細胞内のCYP酵素群のCYP酵素活性と相関することが理解される。より具体的には以下の（１）～（７）を考慮することにより、CYP酵素群の酵素活性は、酸化型CYP酵素群の分子の数と明らかな相関があると理解される：
（１）大前提として、ヒトにおいてCYP3A4は肝臓に存在するCYPの大部分（約30%）を占める。（Pharmacology & Therapeutics 138 (2013) 103-141. Cytochrome P450 enzymes in drug metabolism: Regulation of gene expression, enzyme activities, and impact of genetic variation）
（２）RifampicinをCYP酵素誘導剤として用いた場合、Rifampicin添加量依存的な1636cm-1のシグナルの増加と、既存のCYP3A4酵素活性評価手法による評価結果は高い相関を示す（図１３、１４、１５）。
（３）Rifampicin以外のCYP誘導剤を用いた場合でも、1636cm-1のシグナルの増加と、既存のCYP3A4酵素活性評価手法による評価結果は高い相関を示す（図１６、１７）。
（４）IL-6によるCYP活性の抑制の傾向についても、既存のCYP酵素活性の評価手法による評価結果と1636cm-1のシグナルによる評価結果は高い相関を示す（図１８、１９）。
（５）CYP酵素群の誘導を行わない場合においても、CYP活性の低下の経時変化について、既存のCYP酵素活性の評価手法による評価結果と1636cm-1のシグナルによる評価結果は高い相関を示す（図２０、２１）。
（６）CYP3A4の競争阻害剤であるAzamulinを添加する実験系においても、CYP酵素活性の低下について、既存のCYP酵素活性の評価手法による評価結果と1636cm-1のシグナルによる評価結果は高い相関を示す（図２２、２３）。以上の（１）～（６）を考慮すれば、CYP酵素群の酵素活性は、酸化型CYP酵素群の分子の量と非常に強い相関があり、酸化型CYP酵素群の分子の量を測定する事でCYP酵素群の酵素活性の測定が可能である事を示している。

また、酸化型CYPの分子の量がCYP酵素群の酵素活性と相関することは、（７）に示す理論的解釈からも説明可能である。
（７）CYP酵素群の反応サイクルでは「酸化型CYP→還元型CYP→酸化型CYP→還元型CYP」の構造変化を繰り返す事で酵素反応サイクルが回転する。競争阻害剤を添加してもCYP酵素群の分子の量に変化はないが、反応サイクルが還元型CYPの段階で停止する事で、結果として酸化型CYPの分子の量が減少すると考えられる。
　Azamulinを用いてCYP酵素群を阻害したヒト肝細胞(HepaRG細胞)のラマン観察を行った。波数1636 cm-1のラマン信号が減少する様子を確認できた。波数1636 cm-1のラマン信号は主に、酸化型ヘムタンパク質中にあるIII価の鉄(Fe)を含むヘムに起因する。そのため、図２３で確認された波数1636 cm-1のラマン信号の減少は、以下の3つが原因と考えられる。1）ヘムを含むヘムタンパク質の分子数が減少すること。2) ヘムタンパク質が酸化状態から還元状態に変化すること。3) 分子構造が変わり、波数1636 cm-1のラマン信号を示す分子構造が減少もしくは無くなること。
　本実施例では、原因1)の可能性は低いと考える。Azamulinを用いた5分間のCYP酵素群活性の阻害では、ヘムタンパク質の数は変化しないと考えるためである。よって、原因2)と3)が、ラマン観察結果である図２３に影響していると考える。原因2)の影響を確認するために、タイプbの還元型ヘムタンパク質を示す波数675 cm-1のラマン信号の強度分布と、タイプbの酸化型ヘムタンパク質を示す波数1636 cm-1のラマン信号の強度分布(ラマン画像)とを比較した。さらに、ヘムタンパク質分子の細胞内分布を確認するために、HepaRG細胞中に含まれるタイプbヘムタンパク質であるCYP酵素群とcytochrome b5の免疫染色を行った。その結果を図２４に示す。図２４は、上記（５）の方法により取得したラマン画像と上記（８）の方法により取得した蛍光画像とを含む。Azamulinの投与により、原因2)で示したように酸化状態のCYP酵素群が還元状態に変化していれば、細胞内の波数675 cm-1のラマン信号が増加するはずである。しかしながら、図２４のラマン観察結果から確認できるように波数675 cm-1のラマン信号が増加していない。以上の結果から、残った原因3)が波数1636 cm-1のラマン信号の減少の真の原因であると考えられる。すなわちAzamulinの投与により、CYP3A4の分子構造が変わり、酵素活性を反映する波数1636 cm-1のラマン信号を示す分子構造が減少することがわかる。
　特に図示していないが波数1370 cm-1のラマン信号の分布の変化及びラマン信号の強度の変化も波数1636 cm-1のそれらと同等の傾向を示した。
＜実施例７＞
＜ラマン散乱信号群を用いた肝機能の多角的計測＞
　本実施例では、CYP代謝活性を示す波数1370-1636 cm-1のラマン信号に他のラマン信号を加えたラマン散乱信号群を用いた。波数940 cm-1のラマン信号は糖代謝に関連するglycogenに由来する。波数600 cm-1はエネルギー産生に関わるcytochrome cに由来する。波数2850 cm-1のラマン信号は肝臓の脂質の代謝に関わる。これらをひとまとめにラマン散乱信号群を検出することで、ヒト肝細胞(HepaRG細胞)の細胞機能を多角的に計測することを試みた。
　上記（１）及び（２）に記載の方法に従い、肝細胞の播種、培養、誘導を行った。ただし、培地交換、CYPの誘導、CYPの計測を行うタイミングは上記（１）及び（２）とは異なる。本実施例では、播種後1日後と4日後に培地(MIL600, ADD670, BIOPREDIC International)で培地交換を行い、CYPの誘導は、播種後6日目と7日目に、4 μMのRifampicinを含む培地(MIL600, ADD650, BIOPREDIC International)に置換した。コントロールの細胞は、阻害剤(Azamulin)を含まない培地(MIL600, ADD650, BIOPREDIC International)を用いて培養した。用意したヒト肝細胞(HepaRG細胞)の一部をラマン観察に対する対照実験として発光法に利用し、残りのヒト肝細胞(HepaRG細胞)をラマン観察に用いた。発光法とラマン観察は、播種後1日目と8日目に、それぞれ上記（３）及び（５）に記載された手順に従って行い、ヒト肝細胞(HepaRG細胞)内のCYP3A4の活性を測定した。
　図２５は、肝臓実質細胞と各種ラマン散乱信号との関係を示す。図２５において、薄い灰色の破線はDay1に計測したHepaRG細胞のラマンスペクトルを、薄い灰色の実線はDay8に計測したラマンスペクトルを、濃い灰色の実線はDay6から4 μMのRifampicinでCYP酵素群の誘導を行った細胞を、Day8に計測したラマンスペクトルをそれぞれ示す。図２５に示すように、CYP酵素群に由来する波数1636 cm-1のラマン信号が、肝臓実質細胞の培養日数に応じて、又はCYP酵素群の誘導により増加していることが確認できる。glycogenに由来する波数940 cm-1のラマン信号は、肝臓実質細胞の培養日数に応じて増加する。しかしながら、Rifampicinの投薬によりラマン信号は減少する。Rifampicinはglycogenの分解を促進する作用があり、本実施例により、ラマン顕微鏡を利用することで、その現象を無標識に観察できることが示された。cytochrome b5,及びcytochrome cを示す波数675, 600 cm-1の単位細胞当たりのラマン信号強度は変化しなかった。脂質を示す波数2850 cm-1のラマン信号は、CYPの誘導により若干減少した。
　上記各ラマン信号の細胞内の分布を図２６に示す。図２６は、上記（５）に記載の手順に従って計測したラマンデータを用いて、上記（６）及び（７）に記載の方法に従い、それぞれの生体分子を示すラマン信号を抽出し、細胞内での信号強度分布を取得した。ラマン散乱信号の抽出は、波数1636 cm-1を含むピークにおいてピーク底辺の両端を結んだ直線と、ピーク波形の頂点から波数軸に対して垂直に下ろした直線との交点を原点として、ピーク頂点までの高さを信号強度として実施した。Cytochrome b5とglycogen、CYP酵素群に由来する波数675、940及び1636 cm-1のラマン信号は、主に肝臓実質細胞に発現し、胆管上皮細胞ではほとんど観察されない。エネルギー産生に関連するcytochrome c、必須アミノ酸であるフェニルアラニン、そして脂質を示す波数600、1000及び2850 cm-1のラマン信号は、視野内の全細胞で確認できる。それぞれの信号強度の分布は、cytochrome cが存在するミトコンドリア、フェニルアラニンが存在する細胞質全体、及び脂質が存在する脂質の存在範囲と一致する。
　本手法により、顕微鏡下で生きた細胞から代謝能に関連する生体分子のラマン信号を検出できた。細胞の状態や構造を表す生体分子のラマン信号も、同時に検出することができた。それぞれ検出した生体分子の細胞内での分布を、細胞小器官レベルの空間分解能で把握できる。このため、代謝やエネルギー産生における細胞の薬剤応答を検討する上で、他の細胞小器官に局在する生体分子の振る舞いと合わせて、総合的に検討できる。1636 cm-1及び940 cm-1のラマン信号の観察はCYP酵素群活性や糖代謝の計測のみではなく、それら細胞機能のメカニズム解明に貢献すると考える。
　特に図示していないが波数1370 cm-1のラマン信号の分布の変化及びラマン信号の強度の変化も波数1636 cm-1のそれらと同等の傾向を示した。
＜実施例８＞
＜初代ヒト由来肝実質細胞におけるCYP活性の可視化＞
　凍結初代ヒト由来肝実質細胞（PHH, Lot No. HC2-50）、OptiThaw Hepatocyte isolation kit (K8000)、OptiCulture media kit (K8300M)、OptiPlate hepatocyte media (K8200)は、Sekisui XenoTech, LLCより購入した。PHHは、OptiThaw hepatocyte isolation kitを使用して解凍し、ラマン観察を行うため、底面が石英の35mmディッシュ（SF-S-D12; Fine Plus International）上で培養を行った。具体的には、35mmディッシュ底面の石英にコラーゲンをプレコーティングし、石英上に内径15mmのシリコンリングを配置し、リングの内側に3.2×104個の細胞を播種した。PHHが培養面に接着した後（播種7時間後）、ラマン測定を行った。同密度のHepaRG（ヒト肝細胞由来細胞株）をコントロールとした。
　図２７はPHHおよびHepaRG細胞のラマンスペクトルを示している。いずれの細胞についてもCYP活性を示す1636 cm-1のシグナルが認められた。図２８は、各スペクトルに対応したラマンシグナルを可視化したPHHおよびHepaRGの細胞像である。CYP活性を示す1636 cm-1において、PHHおよびHepaRG細胞いずれにおいても細胞内のCYP活性が見られることが判った。本結果は、HepaRGだけでなく、初代肝細胞においてもCYP活性を検出し、その細胞内分布を可視化することができる事を示している。
＜実施例９＞
＜ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）から分化した肝臓様細胞（HLC）におけるCYP活性の可視化＞
　hiPSCをMatrigel（BD science社製）で前処理した石英の底面を持つ35mmディッシュに播種した。4×105個の細胞培養領域は、内径15 mmのシリコンリングで制限した。胚体内胚葉細胞、肝芽細胞様細胞、肝実質細胞様細胞（HLC）の順に段階的な25日間の分化誘導を、途中継代を行う事なく実施した。hiPS細胞を、100 ng/ml Activin A (R&D Systems), 1×Gluta-MAX(Thermo Fisher Scientific), 1×B27 Supplement Minus Vitamin A (Thermo Fisher Scientific) を含むRPMI1640培地 (Sigma-Aldrich) で4日間培養し、胚体内胚葉細胞への分化を誘導した。次に肝芽細胞様細胞の分化を誘導するために、培地を20 ng/ml BMP4 (R&D Systems), 20 ng/ml FGF4 (R&D Systems), 1×GlutaMAX, 1×B27 Supplement Minus Vitamin Aを含むRPMI1640培地に交換し5日間培養をした。続いて肝芽細胞様細胞に分化した細胞を 20 ng/ml HGF, 1×GlutaMAX, 1×B27 Supplement Minus Vitamin A 添加の RPMI1640 培地で 5 日間培養し、その後 20 ng/ml oncostatin M（Osm）を添加したHepatocyte Culture Medium Bullet KitTM (HCM, Lonza) で11日間培養する事でHLCへの誘導を完了した。その後、HLC細胞をラマン顕微鏡で測定した。
　図２９はRifampicinでCYPを誘導したHepaRG細胞、誘導剤を添加しないHepaRG細胞とHLCsのラマンスペクトルを示している。いずれの細胞についてもCYP活性を示す1636 cm-1のシグナルが認められた。図３０は、各スペクトルに対応したラマンシグナルを可視化した各細胞像である。CYP活性を示す1636 cm-1において、いずれにおいても細胞内のCYP活性が見られることが判った。本結果は、HepaRGだけでなく、様々な肝細胞のCYPや代謝物質の細胞内分布を可視化することができる事を示している。
＜応用例＞
　上記実施形態に係る、細胞内におけるCYP酵素群の酵素活性の検出方法の利点を説明しつつ、その様々な応用を以下に示す。CYP活性は肝機能の一つである代謝能を表す指標であるため、本手法により、迅速・精密(細胞小器官レベル)な代謝能診断が可能となるため、医療現場での診断や、創薬での薬剤応答評価の効率を向上できる。また、再生医療技術の開発においては、iPS由来の肝細胞や、構築した3次元組織の代謝能評価に応用可能である。
　先行技術に係るCYP活性を検出する手法の多くが、質量分析法や発色系プローブを用いた１回限りで細胞組織を壊してしまう「破壊検査」「侵襲的検査」である。一方、本実施形態では、低侵襲・無標識に細胞小器官レベルの分解能でCYP活性を検出する事が可能である。本技術を使用することで、3次元肝組織のCYP活性及びその分布を、組織を破壊することなくそのままの状態で、高速に可視化できる。
　発明者らはCYP代謝酵素分子の酸化還元状態とCYP活性との間の相関があることを見出した。上記実施形態では、その分子の状態に起因する自発ラマン散乱光の変化を検出することで、CYP代謝酵素群の活性を測定する。発明者らは、1370cm-1、1636 cm-1を含む酸化型ヘムｂに由来するラマン信号がCYP活性と相関することを発見した。上記実施形態では、ラマン信号を用いて肝細胞のCYP活性の測定を実施する。さらに上記実施形態の応用では、その他、精製したCYPタンパク質や、他の臓器組織で発現するCYPの活性を測定する。更に上記実施形態では、CYP活性の測定と同時に、他の細胞又は組織の代謝機能に関連する因子、例えば還元型/酸化型ヘムｂ、還元型/酸化型ヘムｃ及びglycogenのラマン信号を同時に検出することで、細胞又は組織の種類、分化度及び成熟度をさらに評価する。
　CYP代謝酵素は、肝実質細胞や小腸上皮細胞で発現し、小胞体（ER）に局在するヘムタンパク質で、解毒や薬物代謝を担う酵素群として知られる。CYP代謝酵素の活性は、薬物代謝において主要な役割を果たすため、創薬開発における肝代謝活性測定の指標として使われる。よって、細胞組織を破壊することなくCYP代謝酵素の活性を検出する手段は、創薬・再生医療、創薬分野で強く求められている。発明者らはラマン散乱信号を活用して、CYP代謝酵素群の活性を、非破壊的に検出することに成功した。発明者らはさらに、酵素量だけではなく、酵素活性に相関するラマン信号を見出した。
　従来技術では、試験管内のCYP代謝酵素の酸化還元状態と量に相関するラマン信号は既知であったが、細胞や組織内の状態で計測した報告はない。これに対して、上記実施形態では、CYP酵素の量に加えて、CYP酵素の活性を細胞又は組織内で非破壊・無染色に検出する。そのため、CYP活性計測の高速化と定量性の向上、同一サンプル内でのCYP活性の経時的変化の計測が実現できる。また、上記実施形態ではラマン信号を活用することで、代謝に関わる他指標に由来するラマン信号を同時に検出する。このため、細胞又は組織の代謝状態に起因する生体分子の分布を取得できる。そのため、上記実施形態は細胞又は組織の分化度及び成熟度の評価にも応用できる。特に肝細胞組織では、薬効毒性に関わる代謝評価と代謝機能の領域特異性の評価が可能である。
　再生医療分野では、特にヒトES/iPS細胞において、継代回数や培養方法で品質に大きな違いが出ることが知られている。したがって細胞品質管理技術の標準化が求められている。ES/iPS細胞から肝細胞を作製する工程においても同様に、細胞の品質管理が必要である。一態様においてiPS由来の肝細胞や、構築した3次元組織の代謝能評価により品質管理を行う。一態様において代謝能評価は上記実施形態に係る、細胞内におけるCYP酵素群の酵素活性の検出方法で行う。
　創薬分野では、細胞組織を用いた非破壊的・経時的な薬効毒性評価(ADMET評価)が求められている。一態様において、このような薬効毒性評価を、上記実施形態に係る、細胞内におけるCYP酵素群の酵素活性の検出方法で行う。
　診断分野では、診断対象とする細胞又は組織における異常部位が識別できる効果的な指標と、その指標を迅速に検出・測定できる技術が求められている。例えば、癌切除における術中・術後の組織診断では、病理医による高度な判断が求められる。上記実施形態では、非破壊的・無染色にCYP活性を含む代謝に関わる生体分子のイメージングを行う。一態様においてこのイメージングで、細胞又は組織の薬効毒性評価・品質評価・迅速組織診断を行う。
　なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。
　上述した通り、本発明は、再生医療技術、創薬技術、及び診断技術の分野において極めて有用であり得る。
　本出願は、日本で出願された特願２０２１－１０４３０９（出願日：２０２１年６月２３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (12)

  1. 　酸化型CYP酵素群の分子数を測定する工程を含む、細胞内又は細胞外のCYP酵素群の酵素活性を評価する方法。
  2. 　細胞内のCYP酵素群の酵素活性を評価する場合であって、酸化型CYP酵素群の分子数を測定する工程が、
    　細胞に対し励起光を照射し、光検出器を用いてラマンスペクトルを取得する工程、及び
    　前記ラマンスペクトルからCYP酵素群由来のラマン散乱信号を抽出する工程を含む、請求項１記載の方法。
  3. 　前記CYP酵素群由来のラマン散乱信号の波数が、波数300-600、620-880、920-1320又は1320-1660cm-1の範囲内である、請求項２記載の方法。
  4. 　前記波数が、1370 cm-1又は1636cm-1である、請求項３記載の方法。
  5. 　前記細胞が、肝臓、小腸、腎臓、及び脳のいずれかに由来する細胞である、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  6. 　前記細胞が、肝臓に由来する細胞である、請求項５記載の方法。
  7. 　前記細胞が、多能性幹細胞に由来する細胞である、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  8. 　前記CYP酵素群の分子数の測定を行う領域において、細胞の形状、細胞の大きさ、及び細胞内成分の細胞内での分布からなる群から選択される少なくとも１つを観察する工程をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  9. 　CYP酵素群以外の物質由来のラマン散乱信号をさらに抽出する工程を含む、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  10. 　前記CYP酵素群以外の物質が、還元型ヘムｂ、還元型／酸化型ヘムｃ、glycogen、還元型／酸化型cytochrome c、フェニルアラニン及び脂質からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項９記載の方法。
  11. 　以下の工程を含む、肝実質細胞の代謝能を評価する方法：
    　肝実質細胞に対し励起光を照射し、光検出器を用いてラマンスペクトルを取得する工程、及び
    　前記ラマンスペクトルから肝実質細胞の代謝能に関連する生体分子のラマン信号を検出する工程。
  12. 　前記肝実質細胞の代謝に関連する生体分子が、CYP酵素群、glycogen、cytochrome b5、cytochrome c、脂質、及びフェニルアラニンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１１記載の方法。
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LI ZHONG, JIANG YUANYUAN, GUENGERICH F. PETER, MA LI, LI SHENGYING, ZHANG WEI: "Engineering cytochrome P450 enzyme systems for biomedical and biotechnological applications", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, US, vol. 295, no. 3, 17 January 2020 (2020-01-17), US , pages 833 - 849, XP093017482, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/jbc.REV119.008758 *
UNO, TADAYUKI: "Structure analysis of heme proteins by resonance Raman spectroscopy", SEISAN-TO-GIJUTSU = MANUFACTURING & TECHNOLOGY, SEISAN GIJUTSU SHINKō KYōKAI, JP, vol. 60, no. 2, 10 April 2008 (2008-04-10), JP , pages 27 - 33, XP009542079, ISSN: 0387-2211 *

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