WO2022207322A1 - Light sheet fluorescence microscope - Google Patents

Light sheet fluorescence microscope Download PDF

Info

Publication number
WO2022207322A1
WO2022207322A1 PCT/EP2022/056817 EP2022056817W WO2022207322A1 WO 2022207322 A1 WO2022207322 A1 WO 2022207322A1 EP 2022056817 W EP2022056817 W EP 2022056817W WO 2022207322 A1 WO2022207322 A1 WO 2022207322A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
light
imaging
light sheet
fluorescence microscope
Prior art date
Application number
PCT/EP2022/056817
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Mostafa Aakhte
Hans-Arno Müller
Original Assignee
Universität Kassel
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universität Kassel filed Critical Universität Kassel
Publication of WO2022207322A1 publication Critical patent/WO2022207322A1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0036—Scanning details, e.g. scanning stages
    • G02B21/0048—Scanning details, e.g. scanning stages scanning mirrors, e.g. rotating or galvanomirrors, MEMS mirrors
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B26/00—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
    • G02B26/08—Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the direction of light
    • G02B26/10—Scanning systems
    • G02B26/105—Scanning systems with one or more pivoting mirrors or galvano-mirrors

Definitions

  • the light sheet fluorescence microscopy also known as light sheet fluorescence microscopy or English light sheet fluorescence microscopy or single plane illumination microscopy, is a fluorescence microscopic method for the tomographic display of biological samples and is mainly used in cell biology and for the examination of living organisms.
  • the method is based on a layer-by-layer, sequential fluorescence excitation of the sample, typically by means of laser radiation, and the detection of the emitted fluorescence radiation by means of an imaging system whose observation direction is directed perpendicularly to the sample layer to be imaged.
  • Illumination system irradiated excitation radiation has at the site Sample the shape of a light sheet with a minimum width of the beam waist of a few micrometers and a lateral extent in the plane of the excited sample layer, which, for example, encompasses the entire sample cross-section.
  • the radiated light sheet and thus the excited sample layer are located in the focal plane of an imaging lens of the imaging system, ie the sample is illuminated perpendicularly to the optical axis of the imaging lens.
  • Light sheet fluorescence microscopy is thus based on wide-field microscopy and enables imaging of the sample based on optical sections through individual sample layers.
  • either the sample in the sample chamber is appropriately shifted or rotated, or the light sheet is shifted layer by layer along the optical axis of the imaging lens, with a corresponding shift of the imaging lens itself taking place in order to always position its focal plane in the incident light sheet.
  • an expanded, collimated laser beam can be focused in just one direction using a cylindrical lens.
  • a "static" light sheet is the rapid back and forth movement of a thin, rotationally symmetrical laser beam, for example a Gaussian beam or a Bessel beam, in the focal plane of the imaging lens.
  • a scanned laser beam effectively results in the form of a light sheet, and within the scope of the present application, both the "static" and this "dynamic" form of the excitation radiation are referred to as light sheets.
  • the advantages of light sheet fluorescence microscopy are in particular a shorter process time for creating the tomograms and a lower radiation dose of the excitation radiation, which reduces the risk of bleaching of the examined biological sample.
  • Another advantage of light sheet fluorescence microscopy compared to scanning microscopy is a significantly larger field of view, which means that intact tissue or entire organisms can be displayed simultaneously.
  • the lower lateral and axial spatial resolution of the image is disadvantageous.
  • the spatial resolution is determined in particular by the detailed shape of the light sheet in the sample layer.
  • the ideal case of a homogeneous light sheet encompassing the entire sample cross-section cannot be realized in practice.
  • the interaction of the light sheet with the sample in particular in the form of scattering, leads to widening and inhomogeneities, the extent of which increases with the distance traversed by the excitation radiation in the sample.
  • beam shaping which is why an incident light sheet does not have an ideally planar shape, but is widened at the edge starting from a central profile waist.
  • Various approaches are known in the prior art for improving the spatial resolution of light sheet fluorescence microscopes.
  • US Pat. No. 9,404,869 B2 discloses a light sheet fluorescence microscope with two illumination systems which are arranged on opposite sides of the sample chamber, so that light sheets can be radiated into the sample from opposite sides.
  • the individual light sheets can thus laterally be dimensioned smaller and thus also have a smaller waist size than with the conventional excitation of the entire sample layer or the entire field of view of the imaging system by means of a single light sheet.
  • each lighting system has its own
  • US Pat. No. 10,222,600 B2 discloses a method of light sheet fluorescence microscopy in which the light sheet is spatially modulated in the sample layer.
  • This spatial modulation consists of a lateral reduction of the light sheets to partial areas of the field of view of the imaging system and a rapid lateral displacement of these light sheets to successively cover the entire field of view. Due to the lateral reduction of the light blades, they can have an extremely small waist size. As a result, particularly thin sample layers can be excited and due to the small interaction volume of light sheets modulated in this way with the sample, there is less widening due to scattering.
  • the illumination system of the light sheet fluorescence microscope according to the invention has two illumination arms, via which pairs of light sheets can be radiated into the respective sample layer from opposite sides of the sample chamber, and the illumination system has a light modulator for spatial modulation of the light sheets in the respective sample layer.
  • the invention is based on the idea of generating a particularly small-scale segmentation of the sample layer to be imaged in that pairs of spatially modulated light sheets with rapidly changing modulation patterns are irradiated from opposite sides of the sample to cover the entire field of view of the imaging system.
  • This enables beam shaping that generates light sheets with an extremely small waist width and thus significantly improves both the axial and the lateral spatial resolution in the image of the sample.
  • it is thus possible to image with high resolution not only optically clarified samples, but also opaque, living biological samples in which the excitation radiation is subject to strong scattering.
  • the imaging system has two imaging arms into which fluorescence radiation emerging from opposite sides of the sample chamber can be irradiated, the imaging arms being offset at right angles to the illumination arms, and each imaging arm having an imaging objective.
  • the imaging lenses are positioned in such a way that their focal planes correspond to the plane of incidence of the light sheet. In this embodiment, therefore, the exiting in both half-spaces above and below the sample Fluorescence radiation used to image the sample layer in question. This results in a higher signal intensity and the illumination time per sample layer can be chosen to be correspondingly shorter than in a conventional setup with only one imaging arm.
  • the lighting arms are preferably integrated into the lighting system by means of a first prismatic mirror in such a way that a light sheet generated in a generation section of the lighting system can be divided into a pair of preferably identical light sheets by means of the first prismatic mirror and as such can be radiated into the lighting arms. It is thus possible to generate a pair of spatially modulated light sheets simultaneously irradiated into the sample using only a single laser light source, a single light modulator and a single system for shaping and displacing the light sheet.
  • the imaging arms are integrated into the imaging system by means of a second prismatic mirror in such a way that the fluorescence radiation can be reflected onto the image sensor by means of the second prismatic mirror after passing through the respective imaging arm.
  • a single image sensor is therefore sufficient to to record images of the sample layer produced by the two opposing imaging lenses.
  • the light modulator is preferably designed as a phase-modulating liquid crystal display, in particular based on ferroelectric liquid crystals.
  • the matrix-type control of such a liquid crystal display allows spatially high resolution Phase modulation of the reflected laser radiation and thus a spatially high-resolution modulation of the light sheets radiated into the sample with extremely short switching times of the order of 41 ps.
  • the light sheets in the focal plane of the imaging lens have an FWHM waist width of 1 mpi to 5 mhi and/or a Rayleigh length of 7 mpi to 170 mpi.
  • This information corresponds to irradiation of the light sheets into the empty sample chamber, i.e. without any interaction with a sample.
  • the waist width corresponds to the smallest width in the beam profile, the FWHM width of the underlying individual beam, in particular a Gaussian beam, being specified.
  • the Rayleigh length relates to the lateral extent of the light sheets in the direction of light propagation and designates that distance from the beam waist at which the beam width has increased to 1.4 times the waist width.
  • the generation section preferably has a first laser scanner for generating a light sheet from a laser beam emitted by the laser light source and/or a second laser scanner for shifting the light sheet in layers, the laser scanners preferably being designed as galvanometer mirrors.
  • a light sheet is thus generated dynamically, that is to say by means of rapid lateral displacement of a rotationally symmetrical laser beam in the sample layer using the first laser scanner.
  • the second laser scanner enables the light sheet in the sample to be shifted sequentially along the optical axis of the imaging system.
  • the light sheet fluorescence microscope according to the invention has a control unit based on a Field Programmable Gate Array Synchronization of the light modulator, the laser scanner, the image sensor and the imaging lenses is formed.
  • the invention also relates to a method for the tomographic display of a sample, in particular a living biological sample, wherein at least the following steps are carried out to display each sample layer:
  • the fluorescence radiation emitted in both hemispheres above and below the sample layer is preferably used for imaging.
  • two to ten pairs of spatially modulated light sheets are irradiated for each lateral extension of 100 ⁇ 100 ⁇ m 2 of the sample layer.
  • Each pair of spatially modulated light sheets is irradiated into the sample layer for an illumination duration of 1 ms to 50 ms, for example.
  • one of the aforementioned embodiments of the light sheet fluorescence microscope according to the invention is used to carry out the method according to the invention.
  • Fig. 1 an isometric view of a light sheet
  • Fig. 2 a cross-sectional view of a sample to illustrate the method according to the invention
  • 3a is an isometric view of a light sheet fluorescence microscope according to the invention.
  • Fig. 3b is a plan view of Fig. 3a
  • Fig. 3c is a detail of Fig. 3b.
  • FIG. 1 shows an isometric view of a single light sheet LB whose direction of propagation corresponds to the x-direction. Transferred to the geometric conditions in a light sheet fluorescence microscope according to the invention, the sample layers to be excited with the light sheet LB lie parallel to the x-y plane, and the light sheet LB is displaced along the z-direction for the sequential excitation of individual sample layers.
  • the profile of the light sheet LB in the x-z plane corresponds to the profile of a rotationally symmetrical laser beam, in particular a Gaussian beam, and the light sheet LB is formed effectively, i.e. on average over an imaging period, by fast scanning of such a single laser beam along the y -Direction.
  • the boundary lines of the light sheet LB shown in FIG. 1 correspond to the full-width-at-half-maximum (FWHM) width of the underlying laser beam.
  • the narrowest point of the profile in the xz plane is called the beam waist with the waist width w_z.
  • the Waist width w_z is an essential index for the spatial resolution of the associated microscope and is, for example, 1 ⁇ m to 5 ⁇ m in a light sheet fluorescence microscope according to the invention.
  • the Rayleigh length r_x designates that distance in the direction of light propagation, ie in the x-direction, from the waist of the beam at which the width of the beam profile has increased to 1.4 times the value of the waist width w_z.
  • a large Rayleigh length r_x ie a high level of homogeneity in the lateral extent of the light sheet LB in the xy plane, can only be achieved at the expense of a large waist width w_z and vice versa.
  • a suitable compromise must always be made between the large-area excitation, ie a fast imaging process with a large field of view, and the spatial resolution that can be achieved in the process.
  • the present invention comes in and proposes segmenting the sample layer to be excited in such a way that pairs of spatially small-scale modulated light sheets LB are irradiated from opposite sides Changing modulation patterns effectively cover a large field of view.
  • FIG. 2 shows a cross-sectional view of a sample P in the xz plane, the outer diameter of the sample P being 200 ⁇ m, for example, and being completely encompassed by the field of view of a microscope according to the invention.
  • three pairs of light sheets LB which are each radiated into different sample layers.
  • Each light sheet LB is spatially modulated, ie its lateral extension in the x-direction is restricted in such a way that it does not encompass the entire diameter of the sample P, but only has a Rayleigh length of approximately 15 ⁇ m.
  • the modulation consists in the fact that the position of the light sheets LB varies in the x-direction.
  • Each rehearsal shift is completed during a Observation period fully excited by spatial modulation of the light sheets LB, so that a large field of view with high spatial resolution can be imaged.
  • a high temporal resolution can also be achieved, for example when imaging living samples.
  • the fluorescence radiation emitted in the upper half-space HR1 and in the lower half-space HR2 is used to image the respective sample layer, with the optical axes of the associated imaging lenses running collinear to the z-direction, and the focal planes are arranged parallel to the x-y plane. Due to this high light yield, comparatively short irradiation times are already sufficient for high-quality imaging.
  • the light sheet fluorescence microscope 100 has the illumination system 110 for irradiating the light sheets LB into the sample P in the sample chamber 1, and the imaging system 120 for sequential imaging of the excited sample layers onto the image sensor 3 by means of fluorescence radiation FS emitted from the sample P.
  • the illumination system 110 comprises the generation section 113 for generating a spatially modulated light sheet LB and the two illumination arms 111, 112, via which pairs of light sheets LB can be radiated into the sample chamber 1 from opposite sides.
  • the imaging system 120 includes the two imaging arms 121, 122 which project from opposite sides of the sample chamber 1 exiting fluorescence radiation FS can be irradiated and which are offset at right angles to the illumination arms 111, 112.
  • the light sheets LB irradiate the sample P in the x-direction and the optical axes of the imaging lenses 41, 42 provided for detecting the fluorescence radiation FS run in the z-direction.
  • a single laser beam LS for example with a wavelength of 488 nm, is expanded via two lenses in a telescope configuration to a beam diameter of, for example, 12 mm, which corresponds to the diameter of the liquid crystal display 51 of the light modulator 5.
  • the polarizing beam splitter 52 is arranged in front of the light modulator 5, which reflects part of the laser radiation LS for spatial phase modulation onto the liquid crystal display 51 and then superimposes it with a non-modulated beam component, the division ratio on the polarizing beam splitter 52 being set by means of the 1/2 plate 53 can be.
  • the pinhole diaphragm 55 is arranged in the rear focal plane of the converging lens 54 in order to filter out disturbing diffraction patterns based on the inherent pixel-shaped structure of the light modulation.
  • the converging lens 56 that follows serves to conjugate the pattern generated by the light modulator 52 .
  • the second laser scanner 72 is used to shift the light sheets LB layer by layer in the z-direction, and the first laser scanner 71 is used to generate the light sheets LB by rapidly scanning the laser beam LS along the y-direction.
  • the laser scanners 71, 72 are designed as galvanometer mirrors.
  • the transition from the generation section 113 to the illumination arms 111, 112 is marked by the first prismatic mirror 61, which separates an incident light sheet LB into a pair of identical light sheets LB and each radiates into an illumination arm 111 , 112 .
  • the light sheets LB are radiated into the sample chamber 1 via the illumination lenses 91 , 92 via a subsequent mirror and lens system.
  • the fluorescence radiation FS excited in the respective irradiated sample layer is recorded by the two imaging lenses 41, 42, with the imaging lenses 41, 42 being displaceable along the z-direction by means of fast piezoelectric actuators in order to shift their focal plane into the active sample layer.
  • the fluorescence radiation FS from the two illumination arms 121 , 122 is thrown onto the second prismatic mirror 62 via an expedient arrangement of mirrors and lenses and is reflected by it onto the image sensor 3 .
  • each half of the active surface of the image sensor 3 is assigned to an imaging arm 121 , 122 .
  • the image sensor 3 is designed as a CMOS sensor.
  • the control unit 8 is connected to the various optical components of the light sheet fluorescence microscope 100 in a manner not shown and acts as a master clock for synchronizing the active components, i.e. in particular the light modulator 5, the laser scanners 71, 72, the imaging lenses 41, 42 and of the image sensor 3.
  • the control unit 8 is based on a Field Programmable Gate Array, which enables particularly rapid synchronization.

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

The invention relates to a light sheet fluorescence microscope (100) for tomographic imaging of a sample (P), in particular a living biological sample, said microscope at least comprising a sample chamber (1), an illumination system (110) having a laser light source (2) for sequentially inducing individual sample layers to fluoresce by means of at least one light sheet (LB) which can be displaced in layers, and an imaging system (120) for sequentially imaging the sample layers onto an image sensor (3) by means of fluorescence radiation (FS) emitted from the sample (P), it being possible to irradiate each light sheet (LB) into the focal plane of at least one imaging lens (41, 42) of the imaging system (120). According to the invention, the illumination system (110) has two illumination arms (111, 112) via which pairs of light sheets (LB) can be irradiated into the relevant sample layer from opposite sides of the sample chamber (1), and the illumination system (110) has a light modulator (5) for spatially modulating the light sheets (LB) in the relevant sample layer.

Description

LICHTBLATT-FLUORESZENZMIKROSKOP Die vorliegende Erfindung betrifft ein Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop zur tomografischen Darstellung einer Probe, insbesondere einer lebenden biologischen Probe, wenigstens umfassend eine Probenkammer, ein Beleuchtungssystem mit einer Laserlichtquelle zur sequentiellen Fluoreszenzanregung einzelner Probenschichten mittels wenigstens eines schichtweise verschiebbaren Lichtblatts, und ein Abbildungssystem zur sequentiellen Abbildung der Probenschichten auf einen Bildsensor mittels aus der Probe emittierter Fluoreszenzstrahlung, wobei das Lichtblatt jeweils in die Brennebene wenigstens eines Abbildungsobjektivs des Abbildungssystems einstrahlbar ist. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur tomografischen Darstellung einer Probe. LIGHT SHEET FLUORESCENCE MICROSCOPE Imaging of the sample layers on an image sensor by means of fluorescence radiation emitted from the sample, with the light sheet being able to be irradiated into the focal plane of at least one imaging objective of the imaging system. Furthermore, the invention relates to a method for the tomographic representation of a sample.
STAND DER TECHNIK STATE OF THE ART
Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie, auch als Lichtscheiben- Fluoreszenzmikroskopie oder englisch light sheet fluorescence microscopy oder single plane Illumination microscopy bezeichnet, ist ein fluoreszenzmikroskopisches Verfahren zur tomografischen Darstellung von biologischen Proben und findet vorwiegend in der Zellbiologie und zur Untersuchung lebender Organismen Verwendung. The light sheet fluorescence microscopy, also known as light sheet fluorescence microscopy or English light sheet fluorescence microscopy or single plane illumination microscopy, is a fluorescence microscopic method for the tomographic display of biological samples and is mainly used in cell biology and for the examination of living organisms.
Das Verfahren beruht auf einer schichtweisen, sequentiellen Fluoreszenzanregung der Probe, typischerweise mittels Laserstrahlung, und der Detektion der emittierten Fluoreszenzstrahlung mittels eines Abbildungssystems, dessen Beobachtungsrichtung senkrecht auf die abzubildende Probenschicht gerichtet ist. Die über dasThe method is based on a layer-by-layer, sequential fluorescence excitation of the sample, typically by means of laser radiation, and the detection of the emitted fluorescence radiation by means of an imaging system whose observation direction is directed perpendicularly to the sample layer to be imaged. The one about that
Beleuchtungssystem eingestrahlte Anregungsstrahlung hat am Ort der Probe die Gestalt eines Lichtblatts mit einer minimalen Weite der Strahltaille von wenigen Mikrometern und einer lateralen Erstreckung in der Ebene der angeregten Probenschicht, die beispielsweise den gesamten Probenquerschnitt umfasst. Das eingestrahlte Lichtblatt und somit die angeregte Probenschicht befinden sich dabei in der Brennebene eines Abbildungsobjektivs des Abbildungssystems, d.h., die Beleuchtung der Probe erfolgt senkrecht zur optischen Achse des Abbildungsobjektivs. Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie beruht somit auf der Weitfeld- Mikroskopie und ermöglicht die bildliche Darstellung der Probe auf der Grundlage von optischen Schnitten durch einzelne Probenschichten. Illumination system irradiated excitation radiation has at the site Sample the shape of a light sheet with a minimum width of the beam waist of a few micrometers and a lateral extent in the plane of the excited sample layer, which, for example, encompasses the entire sample cross-section. The radiated light sheet and thus the excited sample layer are located in the focal plane of an imaging lens of the imaging system, ie the sample is illuminated perpendicularly to the optical axis of the imaging lens. Light sheet fluorescence microscopy is thus based on wide-field microscopy and enables imaging of the sample based on optical sections through individual sample layers.
Zur dreidimensionalen Abbildung wird entweder die Probe in der Probenkammer zweckmäßig verschoben oder rotiert, oder das Lichtblatt wird schichtweise entlang der optischen Achse des Abbildungsobjektivs verschoben, wobei auch eine entsprechende Verschiebung des Abbildungsobjektivs selbst erfolgt, um dessen Brennebene stets in das eingestrahlte Lichtblatt zu positionieren. For three-dimensional imaging, either the sample in the sample chamber is appropriately shifted or rotated, or the light sheet is shifted layer by layer along the optical axis of the imaging lens, with a corresponding shift of the imaging lens itself taking place in order to always position its focal plane in the incident light sheet.
Zur Formung des Lichtblatts sind im Stand der Technik unterschiedliche Ansätze bekannt. Beispielsweise kann ein aufgeweiteter, kollimierter Laserstrahl mit Hilfe einer Zylinderlinse in nur einer Richtung fokussiert werden. Im Wesentlichen äquivalent zu einer solchen Anregung mit einem „statischen“ Lichtblatt ist die schnelle Hin- und Her-Bewegung eines dünnen, rotationssymmetrischen Laserstrahls, beispielsweise eines Gauß- Strahls oder eines Bessel-Strahls, in der Brennebene des Abbildungsobjektivs. Im zeitlichen Mittel über einen Beobachtungszeitraum ergibt sich auch aus einem derartigen gescannten Laserstrahl effektiv die Form eines Lichtblatts, und im Rahmen der vorliegenden Anmeldung sollen sowohl die „statische“ als auch diese „dynamische“ Form der Anregungsstrahlung als Lichtblatt bezeichnet werden. Im Vergleich zu Verfahren der konfokalen Rastermikroskopie bestehen die Vorteile der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie insbesondere in einer kürzeren Prozessdauer zur Erstellung der Tomogramme, sowie in einer geringeren Strahlendosis der Anregungsstrahlung, was die Gefahr des Ausbleichens der untersuchten biologischen Probe verringert. Ein weiterer Vorteil der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie gegenüber der Rastermikroskopie ist ein erheblich größeres Sichtfeld, wodurch die simultane Darstellung intakter Gewebe oder ganzer Organismen erreicht werden kann. Various approaches are known in the prior art for shaping the light sheet. For example, an expanded, collimated laser beam can be focused in just one direction using a cylindrical lens. Essentially equivalent to such an excitation with a "static" light sheet is the rapid back and forth movement of a thin, rotationally symmetrical laser beam, for example a Gaussian beam or a Bessel beam, in the focal plane of the imaging lens. When averaged over time over an observation period, such a scanned laser beam effectively results in the form of a light sheet, and within the scope of the present application, both the "static" and this "dynamic" form of the excitation radiation are referred to as light sheets. Compared to methods of confocal scanning microscopy, the advantages of light sheet fluorescence microscopy are in particular a shorter process time for creating the tomograms and a lower radiation dose of the excitation radiation, which reduces the risk of bleaching of the examined biological sample. Another advantage of light sheet fluorescence microscopy compared to scanning microscopy is a significantly larger field of view, which means that intact tissue or entire organisms can be displayed simultaneously.
Nachteilig hingegen ist die geringere laterale und axiale Ortsauflösung der Abbildung. Neben Drifteffekten in Aufbauten mit verschiebbaren oder rotierbaren Proben wird die Ortsauflösung insbesondere durch die detaillierte Form des Lichtblatts in der Probenschicht bestimmt. Der Idealfall eines den gesamten Probenquerschnitt umfassenden, homogenen Lichtblatts lässt sich in der Praxis nicht realisieren. Einerseits führt die Wechselwirkung des Lichtblatts mit der Probe, insbesondere in Form von Streuung, zu Aufweitungen und Inhomogenitäten, deren Ausmaß mit der von der Anregungsstrahlung durchlaufenden Strecke in der Probe zunimmt. Weiterhin sind auch hinsichtlich der Strahlformung technische Grenzen gesetzt, weshalb ein eingestrahltes Lichtblatt keine idealplanare Gestalt aufweist, sondern ausgehend von einer zentralen Profiltaille randseitig aufgeweitet ist. Zur Verbesserung der Ortsauflösung von Lichtblatt- Fluoreszenzmikroskopen sind im Stand der Technik unterschiedliche Ansätze bekannt. On the other hand, the lower lateral and axial spatial resolution of the image is disadvantageous. In addition to drift effects in structures with movable or rotatable samples, the spatial resolution is determined in particular by the detailed shape of the light sheet in the sample layer. The ideal case of a homogeneous light sheet encompassing the entire sample cross-section cannot be realized in practice. On the one hand, the interaction of the light sheet with the sample, in particular in the form of scattering, leads to widening and inhomogeneities, the extent of which increases with the distance traversed by the excitation radiation in the sample. Furthermore, there are also technical limits with regard to beam shaping, which is why an incident light sheet does not have an ideally planar shape, but is widened at the edge starting from a central profile waist. Various approaches are known in the prior art for improving the spatial resolution of light sheet fluorescence microscopes.
Beispielsweise offenbart die US 9,404,869 B2 ein Lichtblatt- Fluoreszenzmikroskop mit zwei Beleuchtungssystemen, welche auf einander gegenüberliegenden Seiten der Probenkammer angeordnet sind, sodass Lichtblätter aus gegenüberliegenden Seiten in die Probe eingestrahlt werden können. Die einzelnen Lichtblätter können somit lateral kleiner dimensioniert werden und dadurch auch eine geringere Taillenweite aufweisen als bei der konventionellen Anregung der gesamten Probenschicht bzw. des gesamten Sichtfelds des Abbildungssystems mittels eines einzigen Lichtblatts. In der technischen Lehre der US 9,404,869 B2 weist jedes Beleuchtungssystem eine eigeneFor example, US Pat. No. 9,404,869 B2 discloses a light sheet fluorescence microscope with two illumination systems which are arranged on opposite sides of the sample chamber, so that light sheets can be radiated into the sample from opposite sides. The individual light sheets can thus laterally be dimensioned smaller and thus also have a smaller waist size than with the conventional excitation of the entire sample layer or the entire field of view of the imaging system by means of a single light sheet. In the technical teaching of US Pat. No. 9,404,869 B2, each lighting system has its own
Laserlichtquelle und separate optische Elemente zur Strahlformung auf, woraus ein nachteilig hoher Synchronisationsaufwand resultiert. Laser light source and separate optical elements for beam shaping, which results in a disadvantageously high synchronization effort.
Weiterhin offenbart die US 10,222,600 B2 ein Verfahren der Lichtblatt- Fluoreszenzmikroskopie, bei welchem das Lichtblatt in der Probenschicht räumlich moduliert wird. Diese räumliche Modulation besteht in einer lateralen Verkleinerung der Lichtblätter auf Teilbereiche des Sichtfelds des Abbildungssystems und einer schnellen lateralen Verschiebung dieser Lichtblätter zur sukzessiven Überdeckung des gesamten Sichtfelds. Aufgrund der lateralen Verkleinerung der Lichtblätter können diese eine überaus geringe Taillenweite aufweisen. Dadurch können besonders dünne Probenschichten angeregt werden und aufgrund des geringen Wechselwirkungsvolumens derart modulierter Lichtblätter mit der Probe kommt es zu einer geringeren Aufweitung durch Streuung. Furthermore, US Pat. No. 10,222,600 B2 discloses a method of light sheet fluorescence microscopy in which the light sheet is spatially modulated in the sample layer. This spatial modulation consists of a lateral reduction of the light sheets to partial areas of the field of view of the imaging system and a rapid lateral displacement of these light sheets to successively cover the entire field of view. Due to the lateral reduction of the light blades, they can have an extremely small waist size. As a result, particularly thin sample layers can be excited and due to the small interaction volume of light sheets modulated in this way with the sample, there is less widening due to scattering.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Lichtblatt- Fluoreszenzmikroskop und ein zugehöriges Verfahren zurtomografischen Darstellung einer Probe vorzuschlagen, welches eine räumlich und zeitlich hochaufgelöste Abbildung ermöglicht. DISCLOSURE OF THE INVENTION It is the object of the present invention to propose a light sheet fluorescence microscope and an associated method for the tomographic representation of a sample, which enables spatially and temporally high-resolution imaging.
Diese Aufgabe wird ausgehend von einem Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop gemäß Anspruch 1 sowie einem Verfahren gemäß Anspruch 9 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben. Die technische Lehre der Erfindung offenbart, dass das Beleuchtungssystems des erfindungsgemäßen Lichtblatt- Fluoreszenzmikroskops zwei Beleuchtungsarme aufweist, über welche Paare von Lichtblättern von einander gegenüberliegenden Seiten der Probenkammer in die jeweilige Probenschicht einstrahlbar sind, und wobei das Beleuchtungssystem einen Lichtmodulator zur räumlichen Modulation der Lichtblätter in der jeweiligen Probenschicht aufweist. This object is achieved on the basis of a light sheet fluorescence microscope according to claim 1 and a method according to claim 9. Advantageous developments of the invention are specified in the dependent claims. The technical teaching of the invention reveals that the illumination system of the light sheet fluorescence microscope according to the invention has two illumination arms, via which pairs of light sheets can be radiated into the respective sample layer from opposite sides of the sample chamber, and the illumination system has a light modulator for spatial modulation of the light sheets in the respective sample layer.
Die Erfindung geht dabei von dem Gedanken aus, eine besonders kleinteilige Segmentierung der jeweils abzubildenden Probenschicht dadurch zu erzeugen, dass von gegenüberliegenden Seiten der Probe Paare räumlich modulierter Lichtblätter mit schnell wechselndem Modulationsmuster zur Überdeckung des gesamten Sichtfelds des Abbildungssystems eingestrahlt werden. Dies ermöglicht eine Strahlformung, welche Lichtblätter mit überaus geringer Taillenweite generiert und somit sowohl die axiale, als auch die laterale Ortsauflösung in der Abbildung der Probe signifikant verbessert. Insbesondere ist es damit möglich, nicht nur optisch geklärte Proben, sondern auch opake, lebende biologische Proben, bei welchen die Anregungsstrahlung einer starken Streuung unterliegt, hochauflösend abzubilden. The invention is based on the idea of generating a particularly small-scale segmentation of the sample layer to be imaged in that pairs of spatially modulated light sheets with rapidly changing modulation patterns are irradiated from opposite sides of the sample to cover the entire field of view of the imaging system. This enables beam shaping that generates light sheets with an extremely small waist width and thus significantly improves both the axial and the lateral spatial resolution in the image of the sample. In particular, it is thus possible to image with high resolution not only optically clarified samples, but also opaque, living biological samples in which the excitation radiation is subject to strong scattering.
In vorteilhafter Ausführungsform des erfindungsgemäßen Lichtblatt- Fluoreszenzmikroskops weist das Abbildungssystem zwei Abbildungsarme auf, in welche aus einander gegenüberliegenden Seiten der Probenkammer austretende Fluoreszenzstrahlung einstrahlbar ist, wobei die Abbildungsarme gegenüber den Beleuchtungsarmen rechtwinklig versetzt angeordnet sind, und wobei jeder Abbildungsarm ein Abbildungsobjektiv aufweist. Die Abbildungsobjektive sind dabei so positioniert, dass ihre Brennebenen mit der Einstrahlebene des Lichtblatts jeweils übereinstimmen. In dieser Ausführungsform wird folglich die in beide Halbräume oberhalb und unterhalb der Probe austretende Fluoreszenzstrahlung zur Abbildung der betreffenden Probenschicht verwendet. Daraus resultiert eine höhere Signalintensität und die Beleuchtungszeit je Probenschicht kann dementsprechend kürzer gewählt werden als bei einem konventionellen Aufbau mit nur einem Abbildungsarm. In an advantageous embodiment of the light sheet fluorescence microscope according to the invention, the imaging system has two imaging arms into which fluorescence radiation emerging from opposite sides of the sample chamber can be irradiated, the imaging arms being offset at right angles to the illumination arms, and each imaging arm having an imaging objective. The imaging lenses are positioned in such a way that their focal planes correspond to the plane of incidence of the light sheet. In this embodiment, therefore, the exiting in both half-spaces above and below the sample Fluorescence radiation used to image the sample layer in question. This results in a higher signal intensity and the illumination time per sample layer can be chosen to be correspondingly shorter than in a conventional setup with only one imaging arm.
Vorzugsweise sind die Beleuchtungsarme mittels eines ersten prismatischen Spiegels in das Beleuchtungssystem integriert, derart, dass ein in einem Generationsabschnitt des Beleuchtungssystems erzeugtes Lichtblatt mittels des ersten prismatischen Spiegels in ein Paar vorzugsweise identischer Lichtblätter teilbar und als solches in die Beleuchtungsarme einstrahlbar ist. Damit ist es möglich, ein simultan in die Probe eingestrahltes Paar von räumlich modulierten Lichtblättern zu erzeugen mittels lediglich einer einzigen Laserlichtquelle, eines einzigen Lichtmodulators und eines einzigen Systems zur Formung und Verschiebung des Lichtblatts. Mit weiterem Vorteil sind die Abbildungsarme mittels eines zweiten prismatischen Spiegels in das Abbildungssystem integriert, derart, dass die Fluoreszenzstrahlung nach dem Durchlaufen des jeweiligen Abbildungsarms mittels des zweiten prismatischen Spiegels auf den Bildsensor reflektierbar ist Es ist erfindungsgemäß also ein einziger Bildsensor ausreichend, um die von den beiden gegenüberliegenden Abbildungsobjektiven erzeugten Bilder der Probenschicht aufzuzeichnen. Durch die derartige Integration von Beleuchtungs- und/oder Abbildungsarmen kann das erfindungsgemäße Mikroskop mit einer vergleichsweise geringen Anzahl an Komponenten aufgebaut sein, welche dementsprechend einfach untereinander synchronisierbar sind. The lighting arms are preferably integrated into the lighting system by means of a first prismatic mirror in such a way that a light sheet generated in a generation section of the lighting system can be divided into a pair of preferably identical light sheets by means of the first prismatic mirror and as such can be radiated into the lighting arms. It is thus possible to generate a pair of spatially modulated light sheets simultaneously irradiated into the sample using only a single laser light source, a single light modulator and a single system for shaping and displacing the light sheet. With a further advantage, the imaging arms are integrated into the imaging system by means of a second prismatic mirror in such a way that the fluorescence radiation can be reflected onto the image sensor by means of the second prismatic mirror after passing through the respective imaging arm. According to the invention, a single image sensor is therefore sufficient to to record images of the sample layer produced by the two opposing imaging lenses. By integrating illumination and/or imaging arms in this way, the microscope according to the invention can be constructed with a comparatively small number of components, which can accordingly be easily synchronized with one another.
Vorzugsweise ist der Lichtmodulator als eine phasenmodulierende Flüssigkristallanzeige ausgebildet, insbesondere basierend auf ferroelektrischen Flüssigkristallen. Die matrixartige Ansteuerung einer solchen Flüssigkristallanzeige erlaubt eine räumlich hochaufgelöste Phasenmodulation der reflektierten Laserstrahlung und somit eine räumlich hochaufgelöste Modulation der in die Probe eingestrahlten Lichtblätter bei überaus kurzen Schaltzeiten in der Größenordnung von 41 ps. The light modulator is preferably designed as a phase-modulating liquid crystal display, in particular based on ferroelectric liquid crystals. The matrix-type control of such a liquid crystal display allows spatially high resolution Phase modulation of the reflected laser radiation and thus a spatially high-resolution modulation of the light sheets radiated into the sample with extremely short switching times of the order of 41 ps.
Beispielsweise weisen die Lichtblätter in der Brennebene des Abbildungsobjektivs eine FWHM-Taillenweite von 1 miti bis 5 mhi und/oder eine Rayleighlänge von 7 mpi bis 170 miti auf. Diese Angaben entsprechen einer Einstrahlung der Lichtblätter in die leere Probenkammer, d.h. ohne eine Wechselwirkung mit einer Probe. Die Taillenweite entspricht der geringsten Weite im Strahlprofil, wobei die FWHM-Breite des zugrundeliegenden Einzelstrahls, insbesondere eines Gauß-Strahls, angegeben ist. Die Rayleighlänge betrifft die laterale Ausdehnung der Lichtblätter in Lichtausbreitungsrichtung und bezeichnet denjenigen Abstand von der Strahltaille, in welchem die Strahlweite auf das 1 ,4-fache der Taillenweite angestiegen ist. For example, the light sheets in the focal plane of the imaging lens have an FWHM waist width of 1 mpi to 5 mhi and/or a Rayleigh length of 7 mpi to 170 mpi. This information corresponds to irradiation of the light sheets into the empty sample chamber, i.e. without any interaction with a sample. The waist width corresponds to the smallest width in the beam profile, the FWHM width of the underlying individual beam, in particular a Gaussian beam, being specified. The Rayleigh length relates to the lateral extent of the light sheets in the direction of light propagation and designates that distance from the beam waist at which the beam width has increased to 1.4 times the waist width.
Vorzugsweise weist der Generationsabschnitt einen ersten Laserscanner zur Erzeugung eines Lichtblatts aus einem von der Laserlichtquelle emittierten Laserstrahl und/oder einen zweiten Laserscanner zum schichtweisen Verschieben des Lichtblatts auf, wobei die Laserscanner vorzugsweise als Galvanometerspiegel ausgebildet sind. Vorliegend wird ein Lichtblatt somit dynamisch erzeugt, das heißt mittels schnellen lateralen Verschiebens eines rotationssymmetrischen Laserstrahls in der Probenschicht mittels des ersten Laserscanners. Der zweite Laserscanner ermöglicht das sequentielle Verschieben des Lichtblatts in der Probe entlang der optischen Achse des Abbildungssystems. The generation section preferably has a first laser scanner for generating a light sheet from a laser beam emitted by the laser light source and/or a second laser scanner for shifting the light sheet in layers, the laser scanners preferably being designed as galvanometer mirrors. In the present case, a light sheet is thus generated dynamically, that is to say by means of rapid lateral displacement of a rotationally symmetrical laser beam in the sample layer using the first laser scanner. The second laser scanner enables the light sheet in the sample to be shifted sequentially along the optical axis of the imaging system.
Mit weiterem Vorteil weist das erfindungsgemäße Lichtblatt- Fluoreszenzmikroskop ein Steuergerät basierend auf einem Field Programmable Gate Array auf, wobei das Steuergerät insbesondere zur Synchronisation des Lichtmodulators, der Laserscanner, des Bildsensors und der Abbildungsobjektive ausgebildet ist. With a further advantage, the light sheet fluorescence microscope according to the invention has a control unit based on a Field Programmable Gate Array Synchronization of the light modulator, the laser scanner, the image sensor and the imaging lenses is formed.
Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur tomografischen Darstellung einer Probe, insbesondere einer lebenden biologischen Probe, wobei zur Darstellung jeder Probenschicht wenigstens die folgenden Schritte durchgeführt werden: The invention also relates to a method for the tomographic display of a sample, in particular a living biological sample, wherein at least the following steps are carried out to display each sample layer:
- komplanares Einstrahlen von Paaren räumlich modulierter Lichtblätter in die Probenschicht, wobei die Lichtblätter von zwei einander gegenüberliegenden Seiten eingestrahlt werden, und wobei die Lichtblätter die Probenschicht zur Fluoreszenz anregen, und - injecting pairs of spatially modulated light sheets into the sample layer coplanarly, the light sheets being irradiated from two opposite sides, and the light sheets exciting the sample layer to fluoresce, and
- Abbilden der Probenschicht auf einen Bildsensor mittels der von der Probe emittierten Fluoreszenzstrahlung. - Imaging of the sample layer on an image sensor by means of the fluorescence radiation emitted by the sample.
Zum Abbilden wird dabei vorzugsweise die in beide Halbräume oberhalb und unterhalb der Probenschicht emittierte Fluoreszenzstrahlung verwendet. The fluorescence radiation emitted in both hemispheres above and below the sample layer is preferably used for imaging.
Beispielsweise werden je lateraler Erstreckung von 100 x 100 pm2 der Probenschicht zwei bis zehn Paare räumlich modulierter Lichtblätter eingestrahlt. Jedes Paar räumlich modulierter Lichtblätter wird beispielsweise für eine Beleuchtungsdauer von 1 ms bis 50 ms in die Probenschicht eingestrahlt. For example, two to ten pairs of spatially modulated light sheets are irradiated for each lateral extension of 100×100 μm 2 of the sample layer. Each pair of spatially modulated light sheets is irradiated into the sample layer for an illumination duration of 1 ms to 50 ms, for example.
Insbesondere wird eine der vorgenannten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet. Beispielsweise kann damit ein lebendiger Drosophila Embryo mit einem Volumen von ca. In particular, one of the aforementioned embodiments of the light sheet fluorescence microscope according to the invention is used to carry out the method according to the invention. For example, a living Drosophila embryo with a volume of approx.
190 x 190 x 500 pm3 in einer Zeit von lediglich 40 s mit einer korrigierten Ortsauflösung von 800 nm lateral und 1,6 pm axial abgebildet werden. BEVORZUGTES AUSFÜHRUNGSBEISPIEL DER ERFINDUNG Weitere, die Erfindung verbessernde Maßnahmen werden nachstehend gemeinsam mit der Beschreibung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung anhand der Figuren näher dargestellt. Es zeigt: 190 x 190 x 500 pm 3 can be imaged in just 40 s with a corrected spatial resolution of 800 nm laterally and 1.6 pm axially. PREFERRED EXEMPLARY EMBODIMENT OF THE INVENTION Further measures improving the invention are presented in more detail below together with the description of a preferred exemplary embodiment of the invention with reference to the figures. It shows:
Fig. 1 : eine isometrische Ansicht eines Lichtblatts, Fig. 1: an isometric view of a light sheet,
Fig. 2: eine Querschnittsansicht einer Probe zur Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens, Fig. 2: a cross-sectional view of a sample to illustrate the method according to the invention,
Fig. 3a eine isometrische Ansicht eines erfindungsgemäßen Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops, 3a is an isometric view of a light sheet fluorescence microscope according to the invention,
Fig. 3b eine Aufsicht zur Fig. 3a, und Fig. 3c ein Detail der Fig. 3b. Fig. 3b is a plan view of Fig. 3a, and Fig. 3c is a detail of Fig. 3b.
Fig. 1 zeigt eine isometrische Ansicht eines einzelnen Lichtblatts LB, dessen Ausbreitungsrichtung der x-Richtung entspricht. Übertragen auf die geometrischen Verhältnisse in einem erfindungsgemäßen Lichtblatt- Fluoreszenzmikroskop liegen die mit dem Lichtblatt LB anzuregenden Probenschichten parallel zur x-y-Ebene, und die Verschiebung des Lichtblatts LB zur sequentiellen Anregung von einzelnen Probenschichten erfolgt entlang der z-Richtung. 1 shows an isometric view of a single light sheet LB whose direction of propagation corresponds to the x-direction. Transferred to the geometric conditions in a light sheet fluorescence microscope according to the invention, the sample layers to be excited with the light sheet LB lie parallel to the x-y plane, and the light sheet LB is displaced along the z-direction for the sequential excitation of individual sample layers.
Dabei entspricht das Profil des Lichtblatts LB in der x-z-Ebene dem Profil eines rotationssymmetrischen Laserstrahls, insbesondere eines Gauß- Strahls, und das Lichtblatt LB wird effektiv, d.h. im Zeitmittel über einen Abbildungszeitraum, gebildet durch ein schnelles Scannen eines solchen einzelnen Laserstrahls entlang der y-Richtung. The profile of the light sheet LB in the x-z plane corresponds to the profile of a rotationally symmetrical laser beam, in particular a Gaussian beam, and the light sheet LB is formed effectively, i.e. on average over an imaging period, by fast scanning of such a single laser beam along the y -Direction.
Die in der Fig. 1 dargestellten Begrenzungslinien des Lichtblatts LB entsprechen der Full-Width-at-Half-Maximum (FWHM) Weite des zugrundeliegenden Laserstrahls. Die schmälste Stelle des Profils in der x-z- Ebene wird als die Strahltaille mit der Taillenweite w_z bezeichnet. Die Taillenweite w_z ist eine wesentliche Kennzahl für das räumliche Auflösungsvermögen des zugehörigen Mikroskops und beträgt in einem erfindungsgemäßen Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop beispielsweise 1 pm bis 5 pm. Die Rayleighlänge r_x bezeichnet denjenigen Abstand in Lichtausbreitungsrichtung, d.h. in x-Richtung, von der Strahltaille, in welchem die Weite des Strahlprofils auf den 1 ,4-fachen Wert der Taillenweite w_z angestiegen ist. Technisch ist eine große Rayleighlänge r_x, d.h. eine hohe Homogenität in der lateralen Erstreckung des Lichtblatts LB in der x-y-Ebene, nur auf Kosten einer großen Taillenweite w_z zu realisieren und umgekehrt. In der Praxis ist also stets ein geeigneter Kompromiss zu treffen zwischen der Großflächigkeit der Anregung, d.h. einem schnellen Abbildungsvorgang mit großem Sichtfeld, und der dabei erzielbaren Ortsauflösung. Daran setzt die vorliegende Erfindung an und schlägt vor, die anzu regende Probenschicht derart zu segmentieren, dass von gegenüberliegenden Seiten Paare räumlich kleinteilig modulierter Lichtblätter LB eingestrahlt werden, die jeweils eine geringe Taillenweite w_z und eine vergleichsweise geringe Rayleighlänge r_x aufweisen, die aber aufgrund eines schnellen Wechsels der Modulationsmuster effektiv ein großes Sichtfeld überdecken. The boundary lines of the light sheet LB shown in FIG. 1 correspond to the full-width-at-half-maximum (FWHM) width of the underlying laser beam. The narrowest point of the profile in the xz plane is called the beam waist with the waist width w_z. the Waist width w_z is an essential index for the spatial resolution of the associated microscope and is, for example, 1 μm to 5 μm in a light sheet fluorescence microscope according to the invention. The Rayleigh length r_x designates that distance in the direction of light propagation, ie in the x-direction, from the waist of the beam at which the width of the beam profile has increased to 1.4 times the value of the waist width w_z. Technically, a large Rayleigh length r_x, ie a high level of homogeneity in the lateral extent of the light sheet LB in the xy plane, can only be achieved at the expense of a large waist width w_z and vice versa. In practice, therefore, a suitable compromise must always be made between the large-area excitation, ie a fast imaging process with a large field of view, and the spatial resolution that can be achieved in the process. This is where the present invention comes in and proposes segmenting the sample layer to be excited in such a way that pairs of spatially small-scale modulated light sheets LB are irradiated from opposite sides Changing modulation patterns effectively cover a large field of view.
Dies wird demonstriert anhand der Fig. 2, welche eine Querschnittsansicht einer Probe P in der x-z-Ebene zeigt, wobei der Außendurchmesser der Probe P beispielsweise 200 pm beträgt und vom Sichtfeld eines erfindungsgemäßen Mikroskops gänzlich umfasst ist. Weiterhin dargestellt sind drei Paare von Lichtblättern LB, welche jeweils in unterschiedliche Probenschichten eingestrahlt sind. Jedes Lichtblatt LB ist räumlich moduliert, d.h. in seiner lateralen Erstreckung in x-Richtung derart eingeschränkt, dass es nicht den vollständigen Durchmesser der Probe P umfasst, sondern jeweils nur eine Rayleighlänge von ca. 15 pm aufweist. Weiterhin besteht die Modulation darin, dass die Position der Lichtblätter LB in der x-Richtung variiert. Jede Probenschicht wird während eines Beobachtungszeitraums durch räumliche Modulation der Lichtblätter LB vollständig angeregt, so dass ein großes Sichtfeld mit hoher Ortsauflösung abbildbar ist. In Kombination mit einem schnell schaltbaren Lichtmodulator kann dabei zudem auch eine hohe zeitliche Auflösung, beispielsweise bei der Abbildung lebender Proben, erzielt werden. This is demonstrated with reference to FIG. 2, which shows a cross-sectional view of a sample P in the xz plane, the outer diameter of the sample P being 200 μm, for example, and being completely encompassed by the field of view of a microscope according to the invention. Also shown are three pairs of light sheets LB, which are each radiated into different sample layers. Each light sheet LB is spatially modulated, ie its lateral extension in the x-direction is restricted in such a way that it does not encompass the entire diameter of the sample P, but only has a Rayleigh length of approximately 15 μm. Furthermore, the modulation consists in the fact that the position of the light sheets LB varies in the x-direction. Each rehearsal shift is completed during a Observation period fully excited by spatial modulation of the light sheets LB, so that a large field of view with high spatial resolution can be imaged. In combination with a quickly switchable light modulator, a high temporal resolution can also be achieved, for example when imaging living samples.
In einem erfindungsgemäßen Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop mit zwei Abbildungsarmen wird sowohl die in den oberen Halbraum HR1, als auch in den unteren Halbraum HR2 emittierte Fluoreszenzstrahlung zur Abbildung der jeweiligen Probenschicht genutzt, wobei die optischen Achsen der zugehörigen Abbildungsobjektive kollinear zur z-Richtung verlaufen, und die Brennebenen parallel der x-y-Ebene angeordnet sind. Aufgrund dieser hohen Lichtausbeute sind bereits vergleichsweise kurze Bestrahlungsdauern ausreichend für eine hochwertige Abbildung. In a light sheet fluorescence microscope according to the invention with two imaging arms, the fluorescence radiation emitted in the upper half-space HR1 and in the lower half-space HR2 is used to image the respective sample layer, with the optical axes of the associated imaging lenses running collinear to the z-direction, and the focal planes are arranged parallel to the x-y plane. Due to this high light yield, comparatively short irradiation times are already sufficient for high-quality imaging.
Die Fig. 3a bis 3c zeigen eine isometrische Ansicht bzw. zwei Aufsichten auf ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops 100, jeweils mit einer schematischen Darstellung des Strahlengangs sowie sämtlicher essenzieller optischer Komponenten. Das Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop 100 weist das Beleuchtungssystem 110 zur Einstrahlung der Lichtblätter LB in die Probe P in der Probenkammer 1 auf, sowie das Abbildungssystem 120 zur sequentiellen Abbildung der angeregten Probenschichten auf den Bildsensor 3 mittels aus der Probe P emittierter Fluoreszenzstrahlung FS. 3a to 3c show an isometric view and two top views of a preferred embodiment of the light sheet fluorescence microscope 100 according to the invention, each with a schematic representation of the beam path and all essential optical components. The light sheet fluorescence microscope 100 has the illumination system 110 for irradiating the light sheets LB into the sample P in the sample chamber 1, and the imaging system 120 for sequential imaging of the excited sample layers onto the image sensor 3 by means of fluorescence radiation FS emitted from the sample P.
Das Beleuchtungssystem 110 umfasst den Generationsabschnitt 113 zur Erzeugung eines räumlich modulierten Lichtblatts LB sowie die beiden Beleuchtungsarme 111, 112, über welche Paare von Lichtblättern LB von einander gegenüberliegenden Seiten in die Probenkammer 1 einstrahlbar sind. Das Abbildungssystem 120 weist die zwei Abbildungsarme 121, 122 auf, in welche aus einander gegenüberliegenden Seiten der Probenkammer 1 austretende Fluoreszenzstrahlung FS einstrahlbar ist und die gegenüber den Beleuchtungsarmen 111 , 112 rechtwinklig versetzt angeordnet sind. Die Einstrahlung der Lichtblätter LB in die Probe P erfolgt in x-Richtung und die optischen Achsen der zur Detektion der Fluoreszenzstrahlung FS vorgesehenen Abbildungsobjektive 41, 42 verlaufen in z-Richtung. The illumination system 110 comprises the generation section 113 for generating a spatially modulated light sheet LB and the two illumination arms 111, 112, via which pairs of light sheets LB can be radiated into the sample chamber 1 from opposite sides. The imaging system 120 includes the two imaging arms 121, 122 which project from opposite sides of the sample chamber 1 exiting fluorescence radiation FS can be irradiated and which are offset at right angles to the illumination arms 111, 112. The light sheets LB irradiate the sample P in the x-direction and the optical axes of the imaging lenses 41, 42 provided for detecting the fluorescence radiation FS run in the z-direction.
Ausgehend von der Laserlichtquelle 2 wird ein einzelner Laserstrahl LS, beispielsweise mit einer Wellenlänge von 488 nm, über zwei Linsen in Teleskopkonfiguration aufgeweitet auf einen Strahldurchmesser von beispielsweise 12 mm, was dem Durchmesser der Flüssigkristallanzeige 51 des Lichtmodulators 5 entspricht. Vor dem Lichtmodulator 5 ist der polarisierende Strahlteiler 52 angeordnet, der einen Teil der Laserstrahlung LS zur räumlichen Phasenmodulation auf die Flüssigkristallanzeige 51 reflektiert und anschließend mit einem nicht modulierten Strahlanteil überlagert, wobei mittels des l/2-Plättchens 53 das Teilungsverhältnis am polarisierenden Strahlteiler 52 eingestellt werden kann. In der hinteren Brennebene der Sammellinse 54 ist die Lochblende 55 angeordnet, um störende Beugungsmuster basierend auf der inhärent pixelförmigen Struktur der Lichtmodulation herauszufiltern. Die anschließende Sammellinse 56 dient dem Konjugieren des von dem Lichtmodulator 52 erzeugten Musters. Starting from the laser light source 2, a single laser beam LS, for example with a wavelength of 488 nm, is expanded via two lenses in a telescope configuration to a beam diameter of, for example, 12 mm, which corresponds to the diameter of the liquid crystal display 51 of the light modulator 5. The polarizing beam splitter 52 is arranged in front of the light modulator 5, which reflects part of the laser radiation LS for spatial phase modulation onto the liquid crystal display 51 and then superimposes it with a non-modulated beam component, the division ratio on the polarizing beam splitter 52 being set by means of the 1/2 plate 53 can be. The pinhole diaphragm 55 is arranged in the rear focal plane of the converging lens 54 in order to filter out disturbing diffraction patterns based on the inherent pixel-shaped structure of the light modulation. The converging lens 56 that follows serves to conjugate the pattern generated by the light modulator 52 .
Mittels des zweiten Laserscanners 72 wird das schichtweise Verschieben der Lichtblätter LB in der z-Richtung realisiert, und der erste Laserscanner 71 dient der Erzeugung der Lichtblätter LB mittels schnellen Scannens des Laserstrahls LS entlang der y-Richtung. Die Laserscanner 71, 72 sind als Galvanometerspiegel ausgebildet. The second laser scanner 72 is used to shift the light sheets LB layer by layer in the z-direction, and the first laser scanner 71 is used to generate the light sheets LB by rapidly scanning the laser beam LS along the y-direction. The laser scanners 71, 72 are designed as galvanometer mirrors.
Den Übergang vom Generationsabschnitt 113 in die Beleuchtungsarme 111, 112 markiert der erste prismatische Spiegel 61 , welcher ein eingestrahltes Lichtblatt LB in ein Paar identischer Lichtblätter LB auftrennt und diese jeweils in einen Beleuchtungsarm 111 , 112 einstrahlt. Über ein anschließendes Spiegel- und Linsensystem werden die Lichtblätter LB über die Beleuchtungsobjektive 91 , 92 in die Probenkammer 1 eingestrahlt. The transition from the generation section 113 to the illumination arms 111, 112 is marked by the first prismatic mirror 61, which separates an incident light sheet LB into a pair of identical light sheets LB and each radiates into an illumination arm 111 , 112 . The light sheets LB are radiated into the sample chamber 1 via the illumination lenses 91 , 92 via a subsequent mirror and lens system.
Die in der jeweils bestrahlten Probenschicht angeregte Fluoreszenzstrahlung FS wird von den beiden Abbildungsobjektiven 41 , 42 aufgenommen, wobei die Abbildungsobjektive 41, 42 mittels schneller piezoelektrischer Aktoren entlang der z-Richtung verschiebbar sind, um ihre Brennebene jeweils in die aktive Probenschicht zu verlagern. Über eine zweckmäßige Anordnung von Spiegeln und Linsen wird die Fluoreszenzstrahlung FS aus den beiden Beleuchtungsarmen 121, 122 auf den zweiten prismatischen Spiegel 62 geworfen und von diesem auf den Bildsensor 3 reflektiert. Dabei ist beispielsweise je eine Hälfte der aktiven Fläche des Bildsensors 3 einem Abbildungsarm 121 , 122 zugeordnet. Der Bildsensor 3 ist vorliegend als ein CMOS-Sensor ausgebildet. The fluorescence radiation FS excited in the respective irradiated sample layer is recorded by the two imaging lenses 41, 42, with the imaging lenses 41, 42 being displaceable along the z-direction by means of fast piezoelectric actuators in order to shift their focal plane into the active sample layer. The fluorescence radiation FS from the two illumination arms 121 , 122 is thrown onto the second prismatic mirror 62 via an expedient arrangement of mirrors and lenses and is reflected by it onto the image sensor 3 . In this case, for example, each half of the active surface of the image sensor 3 is assigned to an imaging arm 121 , 122 . In the present case, the image sensor 3 is designed as a CMOS sensor.
Das Steuergerät 8 ist auf nicht dargestellte Art und Weise mit den diversen optischen Komponenten des Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops 100 verbunden und fungiert als Hauptuhr für die Synchronisation der aktiven Komponenten, d.h. insbesondere des Lichtmodulators 5, der Laserscanner 71 , 72, der Abbildungsobjektive 41 , 42 sowie des Bildsensors 3. Das Steuergerät 8 basiert auf einem Field Programmable Gate Array, welches eine besonders schnelle Synchronisation ermöglicht. The control unit 8 is connected to the various optical components of the light sheet fluorescence microscope 100 in a manner not shown and acts as a master clock for synchronizing the active components, i.e. in particular the light modulator 5, the laser scanners 71, 72, the imaging lenses 41, 42 and of the image sensor 3. The control unit 8 is based on a Field Programmable Gate Array, which enables particularly rapid synchronization.
Die Erfindung beschränkt sich in ihrer Ausführung nicht auf die vorstehend angegebenen bevorzugten Ausführungsbeispiele. Vielmehr ist eine Anzahl von Varianten denkbar, welche von der dargestellten Lösung auch bei grundsätzlich anders gearteten Ausführungen Gebrauch macht. Sämtliche aus den Ansprüchen, der Beschreibung oder den Zeichnungen hervorgehenden Merkmale und/oder Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten oder räumlicher Anordnungen oder Verfahrensschritte, können sowohl für sich als auch in den verschiedensten Kombinationen erfindungswesentlich sein. The implementation of the invention is not limited to the preferred exemplary embodiments specified above. Rather, a number of variants are conceivable which make use of the solution shown even in the case of fundamentally different designs. All features and/or advantages resulting from the claims, the description or the drawings, including structural details or spatial arrangements or process steps, can be essential to the invention both on their own and in a wide variety of combinations.
Bezugszeichenliste: Reference list:
100 Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop100 light sheet fluorescence microscope
110 Beleuchtungssystem 110 lighting system
111 , 112 Beleuchtungsarm 111, 112 lighting arm
113 Generationsabschnitt 113 generation section
120 Abbildungssystem 120 imaging system
121 , 122 Abbildungsarm 121, 122 imaging arm
1 Probenkammer 1 sample chamber
2 Laserlichtquelle 2 laser light source
3 Bildsensor 3 image sensor
41, 42 Abbildungsobjektiv 41, 42 imaging lens
5 Lichtmodulator 5 light modulator
51 Flüssigkristallanzeige 51 liquid crystal display
52 polarisierender Strahlteiler 52 polarizing beam splitter
53 l/2-Plättchen 53 l/2 plate
54, 56 Sammellinse 55 Lochblende 54, 56 converging lens 55 pinhole
61, 62 prismatischer Spiegel 71, 72 Laserscanner 8 Steuergerät 61, 62 prismatic mirror 71, 72 laser scanner 8 control unit
91, 92 Beleuchtungsobjektiv 91, 92 illumination lens
P Probe P sample
LB Lichtblatt LB light sheet
LS Laserstrahlung LS laser radiation
FS Fluoreszenzstrahlung FS fluorescence radiation
HR1, HR2 Halbraum w_z F WH M -Tai I lenwe ite r_x Rayleighlänge x, y, z Raumrichtung HR1, HR2 half-space w_z F WH M -Tai I lenw ite r_x Rayleigh length x, y, z spatial direction

Claims

Ansprüche: Expectations:
1. Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (100) zur tomographischen Darstellung einer Probe (P), insbesondere einer lebenden biologischen Probe, wenigstens umfassend eine Probenkammer (1), ein Beleuchtungssystem (110) mit einer Laserlichtquelle (2) zur sequenziellen Fluoreszenzanregung einzelner Probenschichten mittels wenigstens eines schichtweise verschiebbaren Lichtblatts (LB), und ein Abbildungssystem (120) zur sequenziellen Abbildung der1. Light sheet fluorescence microscope (100) for the tomographic representation of a sample (P), in particular a living biological sample, comprising at least one sample chamber (1), an illumination system (110) with a laser light source (2) for sequential fluorescence excitation of individual sample layers by means of at least one layer-wise displaceable light sheet (LB), and an imaging system (120) for the sequential imaging of
Probenschichten auf einen Bildsensor (3) mittels aus der Probe (P) emittierter Fluoreszenzstrahlung (FS), wobei das Lichtblatt (LB) jeweils in die Brennebene wenigstens eines Abbildungsobjektiv (41, 42) des Abbildungssystems (120) einstrahlbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungssystem (110) zwei Beleuchtungsarme (111, 112) aufweist, über welche Paare von Lichtblättern (LB) von einander gegenüberliegenden Seiten der Probenkammer (1) in die jeweilige Probenschicht einstrahlbar sind, und wobei das Beleuchtungssystem (110) einen Lichtmodulator (5) zur räumlichen Modulation derSample layers on an image sensor (3) by means of fluorescence radiation (FS) emitted from the sample (P), wherein the light sheet (LB) can be irradiated into the focal plane of at least one imaging objective (41, 42) of the imaging system (120), characterized in that the illumination system (110) has two illumination arms (111, 112), via which pairs of light sheets (LB) can be radiated into the respective sample layer from opposite sides of the sample chamber (1), and the illumination system (110) has a light modulator (5) for spatial modulation of the
Lichtblätter (LB) in der jeweiligen Probenschicht aufweist Light sheets (LB) has in the respective sample layer
2. Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (100) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Abbildungssystem (120) zwei Abbildungsarme (121, 122) aufweist, in welche aus einander gegenüberliegenden Seiten der Probenkammer (1) austretende Fluoreszenzstrahlung (FS) einstrahlbar ist, wobei die Abbildungsarme (121, 122) gegenüber den Beleuchtungsarmen (111, 112) rechtwinklig versetzt angeordnet sind, und wobei jeder Abbildungsarm (121, 122) ein Abbildungsobjektiv (41,2. Light sheet fluorescence microscope (100) according to claim 1, characterized in that the imaging system (120) has two imaging arms (121, 122) into which fluorescence radiation (FS) exiting from opposite sides of the sample chamber (1) can be irradiated, wherein the imaging arms (121, 122) are arranged offset at right angles to the lighting arms (111, 112), and each imaging arm (121, 122) has an imaging objective (41,
42) aufweist. 42).
3. Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (100) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsarme (111, 112) mittels eines ersten prismatischen Spiegels (61) in das Beleuchtungssystem (110) integriert sind, derart, dass ein in einem Generationsabschnitt (113) des Beleuchtungssystems (110) erzeugtes Lichtblatt (LB) mittels des ersten prismatischen Spiegels (61) in ein Paar vorzugsweise identischer Lichtblätter (LB) teilbar und als solches in die Beleuchtungsarme (111, 112) einstrahlbar ist. 3. Light sheet fluorescence microscope (100) according to claim 1 or 2, characterized in that the illumination arms (111, 112) are integrated into the illumination system (110) by means of a first prismatic mirror (61), such that a generation section ( 113) of the lighting system (110) can be divided into a pair of preferably identical light sheets (LB) by means of the first prismatic mirror (61) and as such can be radiated into the lighting arms (111, 112).
4. Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (100) nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abbildungsarme (121, 122) mittels eines zweiten prismatischen Spiegels (62) in das Abbildungssystem (120) integriert sind, derart, dass die Fluoreszenzstrahlung (FS) nach dem Durchlaufen des jeweiligen Abbildungsarms (121, 122) mittels des zweiten prismatischen Spiegels (62) auf den Bildsensor (3) reflektierbar ist. 4. Light sheet fluorescence microscope (100) according to one of the preceding claims, characterized in that the imaging arms (121, 122) are integrated into the imaging system (120) by means of a second prismatic mirror (62), such that the fluorescence radiation (FS) can be reflected onto the image sensor (3) by means of the second prismatic mirror (62) after passing through the respective imaging arm (121, 122).
5. Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (100) nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Lichtmodulator (5) als eine phasenmodulierende Flüssigkristallanzeige (51) ausgebildet ist, insbesondere basierend auf ferroelektrischen Flüssigkristallen. 5. Light sheet fluorescence microscope (100) according to one of the preceding claims, characterized in that the light modulator (5) is designed as a phase-modulating liquid crystal display (51), in particular based on ferroelectric liquid crystals.
6. Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (100) nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtblätter (LB) in der Brennebene des Abbildungsobjektivs (41, 42) eine FWHM-Taillenweite (w_z) von 1 Mikrometer bis 5 Mikrometer und/oder eine Rayleighlänge (r_x) von 7 Mikrometer bis 170 Mikrometer aufweisen. 6. light sheet fluorescence microscope (100) according to any one of the preceding claims, characterized in that that the light sheets (LB) in the focal plane of the imaging lens (41, 42) have a FWHM waist width (w_z) of 1 micron to 5 microns and/or a Rayleigh length (r_x) of 7 microns to 170 microns.
Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (100) nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Generationsabschnitt (113) einen ersten Laserscanner (71) zur Erzeugung eines Lichtblatts (LB) aus einem von der Laserlichtquelle (2) emittierten Laserstrahl und/odereinen zweiten Laserscanner (72) zum schichtweisen Verschieben des Lichtblatts (LB) aufweist, wobei die Laserscanner (71, 72) vorzugsweise als Galvanometerspiegel ausgebildet sind. Light sheet fluorescence microscope (100) according to one of the preceding claims, characterized in that the generation section (113) has a first laser scanner (71) for generating a light sheet (LB) from a laser beam emitted by the laser light source (2) and/or a second laser scanner ( 72) for shifting the light sheet (LB) in layers, the laser scanners (71, 72) preferably being designed as galvanometer mirrors.
Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (100) nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (100) ein Steuergerät (8) basierend auf einem Field Programmable Gate Array aufweist, wobei das Steuergerät (8) insbesondere zur Synchronisation des Lichtmodulators (5), der Laserscanner (71, 72), des Abbildungsobjektivs (41, 42) und/oder des Bildsensors (3) ausgebildet ist. Light sheet fluorescence microscope (100) according to one of the preceding claims, characterized in that the light sheet fluorescence microscope (100) has a control unit (8) based on a field programmable gate array, the control unit (8) being used in particular for synchronizing the light modulator (5 ), the laser scanner (71, 72), the imaging lens (41, 42) and/or the image sensor (3).
Verfahren zur tomographischen Darstellung einer Probe (P), insbesondere einer lebenden biologischen Probe, wobei zur Darstellung jeder Probenschicht wenigstens die folgenden Schritte durchgeführt werden: Method for the tomographic representation of a sample (P), in particular a living biological sample, wherein at least the following steps are carried out for the representation of each sample layer:
- komplanares Einstrahlen von Paaren räumlich modulierter Lichtblätter (LB) in die Probenschicht, wobei die Lichtblätter (LB) von zwei einander gegenüberliegenden Seiten eingestrahlt werden, und wobei die Lichtblätter (LB) die Probenschicht zur Fluoreszenz anregen, und - coplanar irradiation of pairs of spatially modulated light sheets (LB) into the sample layer, where the light sheets (LB) are irradiated from two opposite sides, and the light sheets (LB) excite the sample layer to fluoresce, and
- Abbilden der Probenschicht auf einen Bildsensor (3) mittels der von der Probe (P) emittierten Fluoreszenzstrahlung (FS). - Imaging of the sample layer on an image sensor (3) by means of the sample (P) emitted fluorescence radiation (FS).
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass zum Abbilden die in beide Halbräume (HR1, HR2) oberhalb und unterhalb der Probenschicht emittierte Fluoreszenzstrahlung (FS) verwendet wird. 10. The method as claimed in claim 9, characterized in that the fluorescence radiation (FS) emitted in the two half-spaces (HR1, HR2) above and below the sample layer is used for imaging.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass je lateraler Erstreckung von 100 x 100 Quadratmikrometer der11. The method according to claim 9 or 10, characterized in that each lateral extension of 100 x 100 square microns of
Probenschicht 2 bis 10 Paare räumlich modulierter Lichtblätter (LB) eingestrahlt werden. Sample layer 2 to 10 pairs of spatially modulated light sheets (LB) are irradiated.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass jedes Paar räumlich modulierter Lichtblätter (LB) für eine Beleuchtungsdauer von 1 Millisekunde bis 50 Millisekunden in die Probenschicht eingestrahlt wird. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Durchführung des Verfahrens verwendet wird. 12. The method according to any one of claims 9 to 11, characterized in that each pair of spatially modulated light sheets (LB) is radiated into the sample layer for an illumination duration of 1 millisecond to 50 milliseconds. 13. The method according to any one of claims 9 to 12, characterized in that a light sheet fluorescence microscope (100) according to any one of claims 1 to 8 is used to carry out the method.
PCT/EP2022/056817 2021-03-29 2022-03-16 Light sheet fluorescence microscope WO2022207322A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102021107821.0 2021-03-29
DE102021107821.0A DE102021107821B4 (en) 2021-03-29 2021-03-29 LIGHT SHEET FLUORESCENCE MICROSCOPE AND METHODS OF TOMOGRAPHIC IMAGE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022207322A1 true WO2022207322A1 (en) 2022-10-06

Family

ID=81306831

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2022/056817 WO2022207322A1 (en) 2021-03-29 2022-03-16 Light sheet fluorescence microscope

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102021107821B4 (en)
WO (1) WO2022207322A1 (en)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102009044984A1 (en) * 2009-09-24 2011-03-31 Carl Zeiss Microimaging Gmbh microscope
WO2011059826A2 (en) * 2009-10-29 2011-05-19 California Institute Of Technology Multiple-photon excitation light sheet illumination microscope
WO2014009080A1 (en) * 2012-07-09 2014-01-16 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Microscope
US20150098126A1 (en) * 2013-10-09 2015-04-09 Howard Hughes Medical Institute Multiview Light-Sheet Microscopy
US9404869B2 (en) 2012-10-09 2016-08-02 Howard Hughes Medical Institute Multiview light-sheet microscopy
US10222600B2 (en) 2015-02-23 2019-03-05 The Research Foundation For The State University Of New York Method and apparatus for tiling light sheet selective plane illumination microscopy with real-time optimized light sheet

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6555803B2 (en) 2015-06-09 2019-08-07 オリンパス株式会社 Sheet illumination microscope and illumination method of sheet illumination microscope
EP3538941A4 (en) 2016-11-10 2020-06-17 The Trustees of Columbia University in the City of New York Rapid high-resolution imaging methods for large samples

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102009044984A1 (en) * 2009-09-24 2011-03-31 Carl Zeiss Microimaging Gmbh microscope
WO2011059826A2 (en) * 2009-10-29 2011-05-19 California Institute Of Technology Multiple-photon excitation light sheet illumination microscope
WO2014009080A1 (en) * 2012-07-09 2014-01-16 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Microscope
US9404869B2 (en) 2012-10-09 2016-08-02 Howard Hughes Medical Institute Multiview light-sheet microscopy
US20150098126A1 (en) * 2013-10-09 2015-04-09 Howard Hughes Medical Institute Multiview Light-Sheet Microscopy
US10222600B2 (en) 2015-02-23 2019-03-05 The Research Foundation For The State University Of New York Method and apparatus for tiling light sheet selective plane illumination microscopy with real-time optimized light sheet

Also Published As

Publication number Publication date
DE102021107821B4 (en) 2023-05-11
DE102021107821A1 (en) 2022-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102011000835C5 (en) Scanning microscope and method for light microscopic imaging of an object
EP1248132B1 (en) Method and arrangement for depth resolving optical detection of a probe
EP2535754B1 (en) Sampling microscope and method for imaging an object using a light microscope
EP3489735B1 (en) Method and arrangement for light sheet microscopy
EP2350726B1 (en) Combination microscopy
EP2107408B1 (en) Microscope with the viewing direction perpendicular to the illumination direction
EP3899629B1 (en) Method and device for illuminating a sample in a microscope in points
DE10038622A1 (en) Scanning microscope, optical arrangement and method for image acquisition in scanning microscopy
EP2718762A1 (en) High-resolution luminescence microscopy
WO2020001938A1 (en) Method for generating an overview image using a large-aperture lensobjective
EP1862839A1 (en) Microscope with improved resolution
DE102004053730B4 (en) Method and arrangement for the suppression of false light
DE102020209889A1 (en) Microscope and method for microscopic imaging with variable illumination
WO2013020713A1 (en) Laser assembly
DE19954933A1 (en) Arrangement for coupling optical tweezers and / or a processing beam into a microscope
DE10155002A1 (en) Depth-resolved optical imaging method for use in biological scanning microscopy, uses phase or frequency modulation of the imaging light
EP3992687B1 (en) Microscope and method for light field microscopy with light sheet excitation and confocal microscopy
WO2016071033A1 (en) Method for generating an image of a sample
EP2366990A2 (en) Method and device for performing multipoint FCS
DE102021107821B4 (en) LIGHT SHEET FLUORESCENCE MICROSCOPE AND METHODS OF TOMOGRAPHIC IMAGE
DE102021123130A1 (en) DEVICE AND METHOD FOR LIGHT FIELD MICROSCOPY
DE102016120312B3 (en) Method for illuminating focus positions on the object side of a microscope objective and microscope
DE102023104335B3 (en) Illumination module, microscope and procedure
DE102022108448B3 (en) Super-resolution rotating disk microscope apparatus
DE102017203995A1 (en) Lens, imaging system for generating images of an eye and method of operation

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22715998

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22715998

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1