WO2022145144A1

WO2022145144A1 - Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療剤

Info

Publication number: WO2022145144A1
Application number: PCT/JP2021/042347
Authority: WO
Inventors: 善紀吉田; 有紀森本; 和久蝶名林; 晃史高折; 浩川端
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2021-11-11
Publication date: 2022-07-07
Anticipated expiration: 2023-06-28
Also published as: JPWO2022145144A1

Abstract

本発明は、脱メチル化剤、特に５−アザシチジンまたはその誘導体を含む、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血を治療するための医薬組成物、ならびにＸ連鎖性鉄芽球性貧血患者由来のｉＰＳ細胞から脱メチル化剤の存在下で分化誘導された正常な赤血球を提供する。

Description

Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療剤

　本発明は、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療剤に関する。
　本願は、２０２０年１２月２８日に出願された日本国特許出願第２０２０−２１８５５７号に対して優先権を主張するものであり、当該日本国特許出願の内容を本願に一体化させる。

　Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血は、ヘム合成の最初の段階を触媒する酵素ＡＬＡＳ２（赤血球型５−アミノレブリン酸合成酵素）の遺伝子が変異することにより高度の赤血球分化障害を来す遺伝性疾患である。Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血患者の約半数にはビタミンＢ６投与が有効であるが、ビタミンＢ６投与が無効である約半数の患者には輸血や造血幹細胞移植以外に有効な治療法はなく（非特許文献１、２）、代替となる治療法の開発が期待されている。

Ｇｏｎｚａｌｅｚ　ＭＩ，Ｃａｂａｌｌｅｒｏ　Ｄ，Ｖａｚｑｕｅｚ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ　ｃａｓｅ　ｏｆ　ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ　ｓｉｄｅｒｏｂｌａｓｔｉｃ　ａｎｅｍｉａ．Ｂｒ　Ｊ　Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０００；１０９：６５８−６６０．Ｍｅｄｅｉｒｏｓ　ＢＣ，Ｋｏｌｈｏｕｓｅ　ＪＦ，Ｃａｇｎｏｎｉ　ＰＪ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｏｎｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ　ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｓｉｄｅｒｏｂｌａｓｔｉｃ　ａｎｅｍｉａ．Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００３；３１：１０５３−１０５５．

　Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血、とりわけビタミンＢ６投与が無効である患者に対する有効な治療を提供することが必要である。

　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねてきた。本発明者らは、δ−アミノレブリン酸を用いることにより、変異型ＡＬＡＳ２が活性化されているｉＰＳ細胞由来の赤芽球の赤血球分化能を改善できることを見いだしたが、必要とされるδ−アミノレブリン酸の量が多いという問題があった。そこで本発明者らは、より少量で効果的な薬剤について検索し、脱メチル化剤、とりわけ５−アザシチジンおよびその誘導体が少量で上記の赤血球分化を改善できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。本明細書の以下の部分において、５−アザシチジンをＡＺＡと略称する。

　すなわち本発明は以下のものを提供する：
　（１）脱メチル化剤を含む、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血を治療するための医薬組成物。
　（２）脱メチル化剤が式（Ｉ）：

［式中、Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣ_１−６アルキル、ＯＣ_１−６アルケニル、ＯＣ_１−６アルキニル、ＯＣＯＣ_１−６アルキル、ＯＣＯＣ_１−６アルケニル、またはＣＯＣ_１−６アルキニルであり、Ｒ^３は水素、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、ＣＯＣ_１−６アルキル、ＣＯＣ_１−６アルケニル、ＣＯＣ_１−６アルキニル、またはリン酸基であり、ＡはＣＲ^４またはＣＲ^５Ｒ^６であり、Ｒ^４は水素、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、ＯＨ、またはハロゲンであり、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、ＯＨ、またはハロゲンであり、ＺはＮ、ＮＲ^７、ＣＲ^８、またはＣＲ^９Ｒ^１０であり、Ｒ^７は水素、ＯＨ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、またはハロゲンであり、Ｒ^８は水素、ＯＨ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、またはハロゲンであり、Ｒ^９およびＲ^１０はそれぞれ独立して水素、ＯＨ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、またはハロゲンであり、Ｘは水素またはＮＲ^１１Ｒ^１２であり、Ｒ^１１およびＲ^１２はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、またはＣ_１−６アルキニルであり、上記アルキル、アルケニルおよびアルキニルは１個以上の水酸基またはハロゲンで置換されていてもよく、−−は一重結合または二重結合を表す。］で示される化合物である、（１）記載の医薬組成物。
　（３）脱メチル化剤がＡＺＡまたは５−アザ−２’−デオキシシチジンである、（２）記載の医薬組成物。
　（４）脱メチル化剤がＡＺＡである、（３）記載の医薬組成物。
　（５）ビタミンＢ６投与が無効であるＸ連鎖性鉄芽球性貧血患者に使用される（１）~（４）のいずれか記載の医薬組成物。
　（６）Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血患者由来のｉＰＳ細胞から正常な赤血球を製造する方法であって、該ｉＰＳ細胞を赤血球に分化誘導することを含み、分化誘導の際に脱メチル化剤を細胞に添加するものである方法。
　（７）脱メチル化剤が式（Ｉ）：

［式中、Ｒ^１−Ｒ^１２、Ａ、Ｚ、Ｘ、および−−は（２）における定義と同じ。］で示される化合物である、（６）記載の方法。
　（８）脱メチル化剤がＡＺＡまたは５−アザ−２’−デオキシシチジンである、（７）記載の方法。
　（９）脱メチル化剤がＡＺＡである、（８）記載の方法。
　（１０）患者が、ビタミンＢ６投与が無効であるＸ連鎖性鉄芽球性貧血患者である、（６）~（９）のいずれか記載の方法。
　（１１）Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血を治療するための脱メチル化剤の使用。
　（１２）脱メチル化剤が式（Ｉ）：

［式中、Ｒ^１−Ｒ^１２、Ａ、Ｚ、Ｘ、および−−は（２）における定義と同じ。］で示される化合物である、（１１）記載の使用。
　（１３）脱メチル化剤がＡＺＡまたは５−アザ−２’−デオキシシチジンである、（１２）記載の使用。
　（１４）脱メチル化剤がＡＺＡである、（１３）記載の使用。
　（１５）治療すべき患者が、ビタミンＢ６投与が無効であるＸ連鎖性鉄芽球性貧血患者である、（１１）~（１４）のいずれか記載の使用。
　（１６）Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療において使用するための脱メチル化剤。
　（１７）式（Ｉ）：

［式中、Ｒ^１−Ｒ^１２、Ａ、Ｚ、Ｘ、および−−は（２）における定義と同じ。］で示される化合物である、（１６）記載の脱メチル化剤。
　（１８）ＡＺＡまたは５−アザ−２’−デオキシシチジンである、（１７）記載の脱メチル化剤。
　（１９）ＡＺＡである、（１８）記載の脱メチル化剤。
　（２０）治療すべき患者が、ビタミンＢ６投与が無効であるＸ連鎖性鉄芽球性貧血患者である、（１６）~（１９）のいずれか記載の脱メチル化剤。
　（２１）Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血を治療するための医薬の製造における脱メチル化剤の使用。
　（２２）脱メチル化剤が式（Ｉ）：

［式中、Ｒ^１−Ｒ^１２、Ａ、Ｚ、Ｘ、および−−は（２）における定義と同じ。］で示される化合物である、（２１）記載の使用。
　（２３）脱メチル化剤がＡＺＡまたは５−アザ−２’−デオキシシチジンである、（２２）記載の使用。
　（２４）脱メチル化剤がＡＺＡである、（２３）記載の使用。
　（２５）治療すべき患者が、ビタミンＢ６投与が無効であるＸ連鎖性鉄芽球性貧血患者である、（２１）~（２４）のいずれか記載の使用。
　（２６）Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療を要する患者に脱メチル化剤を投与することを含む、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療方法。
　（２７）脱メチル化剤が式（Ｉ）：

［式中、Ｒ^１−Ｒ^１２、Ａ、Ｚ、Ｘ、および−−は（２）における定義と同じ。］で示される化合物である、（２６）記載の方法。
　（２８）脱メチル化剤がＡＺＡまたは５−アザ−２’−デオキシシチジンである、（２７）記載の方法。
　（２９）脱メチル化剤がＡＺＡである、（２８）記載の方法。
　（３０）患者が、ビタミンＢ６投与が無効であるＸ連鎖性鉄芽球性貧血患者である、（２６）~（２９）のいずれか記載の方法。
　（３１）（６）~（１０）のいずれか記載の方法によって得られた正常な赤血球を含む、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血を治療するための医薬組成物。
　（３２）（６）~（１０）のいずれか記載の方法によって得られた正常な赤血球の、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血を治療するための使用。
　（３３）Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療において使用するための、（６）~（１０）のいずれか記載の方法によって得られた正常な赤血球。
　（３４）（６）~（１０）のいずれか記載の方法によって得られた正常な赤血球の、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血を治療するための医薬の製造における使用。
　（３５）（６）~（１０）のいずれか記載の方法によって得られた正常な赤血球を、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療を要する患者に投与することを含む、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療方法。

　本発明によれば、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血、とりわけビタミンＢ６投与が無効である患者、より好ましくは女性患者に対する有効な治療が提供される。特に、本発明の治療剤の有効成分の１つであるＡＺＡは現在骨髄異形成症候群の治療薬として用いられており、ヒトでの安全性や薬物動態の試験が済んでいるため、使用上の不安が少ない。

図１Ａは、ＷＴ１−ｉＰＳＣ２（図中、「ＷＴ　ｉＰＳＣ」と示される）およびＭＴ１−ｉＰＳＣ３（図中、「ＭＴ　ｉＰＳＣ」と示される）由来の赤芽球（３４日目）のペレットおよび鉄染色像を示す。矢印は環状鉄芽球を示す。スケールバーは１０μｍである。図１Ｂは、ＷＴ１−ｉＰＳＣ２（図中、「ＷＴ　ｉＰＳＣ」と示される）由来の赤芽球（３４日目）（上）およびＭＴ１−ｉＰＳＣ４（図中、「ＭＴ　ｉＰＳＣ」と示される）由来の赤芽球（３４日目）（下）のＭａｙ　Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色像を示す。スケールバーは２５μｍである。図１Ｃは、３種類のＷＴ−ｉＰＳＣ株および４種類のＭＴ−ｉＰＳＣ株に由来する多染性巨核球（Ｐｏｌｙ−Ｍ）、多染性赤芽球（Ｐｏｌｙ−Ｅ）および正染性赤芽球（Ｏｒｔｈｏ−Ｅ）の割合を示すグラフである。図１Ｄは、ＷＴ１−ｉＰＳＣ３（図中、「ＷＴ　ｉＰＳＣ」と示される）由来の赤芽球（３４日目）およびＭＴ１−ｉＰＳＣ３（図中、「ＭＴ　ｉＰＳＣ」と示される）由来の赤芽球（３４日目）のｏ−ジアニシジン染色ペレット（上）およびｏ−ジアニシジン染色像（下）である。スケールバーは２００μｍである。図２Ａは、異なる患者由来のＷＴ−ｉＰＳＣおよびＭＴ−ｉＰＳＣから得られたＣＤ４３＋細胞の割合を示すグラフである。図２Ｂは、異なる患者由来のＷＴ−ｉＰＳＣおよびＭＴ−ｉＰＳＣから得られたＣＤ２３５ａ＋細胞の割合を示すグラフである。上記データは、平均±標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。Ｐ値は、対応のない両側スチューデントのｔ検定を使用して計算した。＊＊＊＊　Ｐ＜０．０００１；Ｎ．Ｓ．　有意差なし。図２Ｃは、ＳＡ３由来の２種類のＷＴ−ｉＰＳＣ株（ＷＴ３−ｉＰＳＣ１、ＷＴ３−ｉＰＳＣ２）および２種類のＭＴ−ｉＰＳＣ株（ＭＴ３−ｉＰＳＣ１およびＭＴ３−ｉＰＳＣ２）に由来するＣＤ２３５ａ＋細胞の割合を示すグラフである。図２Ｄは、フィーダー細胞を用いない方法で分化した赤芽球中のＣＤ２３５およびＣＤ７１の同時発現を示すフローサイトメトリーである。図３Ａは、ｉＰＳＣから赤血球分化のプロトコールおよび各サンプル収集時点を示すスキームである。図３Ｂは、試料間距離を示すヒートマップおよびｉＰＳＣのヒエラルキークラスタリングである。図３Ｃは、３種類のＷＴ−ｉＰＳＣ株および４種類のＭＴ−ｉＰＳＣ株に由来する赤芽球、健康なドナーおよびＳＡ３由来の骨髄赤芽球のＰＣＡの結果である。図３Ｄは、ＷＴ赤芽球（左）およびＭＴ赤芽球（右）に関して濃縮された分子機能タームを示すＧＯ分析の結果である。図３Ｅは、ＷＴ赤芽球で濃縮されたヘム代謝データセットのＧＳＥＡの結果を示す。図３Ｆは、図３Ｃに関して説明した赤芽球の正染性段階で特徴的に発現される１３個の遺伝子のヒートマップである。図４Ａは、赤血球分化におけるＡＺＡ投与のスキームである。図４Ｂは、ＤＭＳＯまたはＡＺＡで処理されたＣＤ２３５ａ＋赤芽球の割合を示す。データは平均±ＳＥＭとして表される。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキーの検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）、および対応のない両側スチューデントのｔ検定を使用して計算した。＊＊　Ｐ＜０．０１；Ｎ．Ｓ．　有意差なし。図４Ｃは、ＤＭＳＯまたはＡＺＡを投与して、フィーダー細胞を用いずに分化させたＭＴ１−ｉＰＳＣ２由来の赤芽球のフローサイトメトリーの代表的なデータである。図４Ｄの上パネルは、ＤＭＳＯまたはＡＺＡで処理した場合のＭＴ１−ｉＰＳＣ２に由来する赤芽球のｏ−ジアニシジン染色されなかったペレット（左）および染色されたペレット（右）を示す。図４Ｄの中および下パネルは、ＤＭＳＯまたはＡＺＡで処理されたＷＴ１−ｉＰＳＣ１（左）およびＭＴ１−ｉＰＳＣ２（右）に由来する赤芽球のｏ−ジアニシジン染色像である。図５は、サンガーシークエンスによるＡＬＡＳ２変異部位の解析結果を示す図である。ＤＭＳＯはＤＭＳＯ投与群、ＡＺＡはＡＺＡ　５００ｎＭ投与群を示す。図６の右パネルは、変異型ＡＬＡＳ２が活性化されているｉＰＳ細胞由来の赤芽球の赤血球分化能を改善するＡＺＡの効果を示すグラフである。図６の左パネルは、変異型ＡＬＡＳ２が活性化されているｉＰＳ細胞由来の赤芽球について同様の実験を行った結果を示す。グラフ縦軸はＣＤ２３５ａ陽性細胞の割合（％）である。図７は、変異型ＡＬＡＳ２が活性化されているｉＰＳ細胞由来の赤芽球から赤血球コロニー数を増加させるＡＺＡの効果を示すグラフである。上パネルは、総コロニーに対する各細胞周期にある細胞および赤血球のコロニーの割合を示す。赤血球コロニーの割合は、各バーの最上層の濃色部分で示される。下パネルは、各実験系における赤血球コロニー数を示す。図８Ａは、ＤＭＳＯまたはＡＺＡで処理されたＷＴ１−ｉＰＳＣ１およびＭＴ１−ｉＰＳＣ２に由来する造血前駆細胞の分化１５日目のコロニー形成アッセイの結果を示す。図８Ｂは、図８Ａにおける赤血球および混合コロニーの数を示す。上記データは平均±ＳＥＭとして表される。Ｐ値は、一元配置分散分析とテューキーの検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）、および対応のない両側スチューデントのｔ検定を使用して計算した。＊　Ｐ＜０．０５；Ｎ．Ｓ．　有意差なし。図８Ｃは、ＡＺＡ処理されたＭＴ１−ｉＰＳＣ２に由来する混合コロニーの代表的な像である。スケールバーは２００μｍである。図９は、ＤＭＳＯまたはＡＺＡで処理されたＷＴ１−ｉＰＳＣ１およびＷＴ１−ｉＰＳＣ３に由来する造血前駆細胞の分化１５日目のコロニー形成アッセイの結果（左）ならびにＤＭＳＯまたはＡＺＡで処理されたＭＴ１−ｉＰＳＣ１およびＭＴ１−ｉＰＳＣ２に由来する造血前駆細胞の分化１５日目のコロニー形成アッセイの結果（右）を示す。

　本発明は、１の態様において、脱メチル化剤を含む、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血を治療するための医薬組成物を提供する。

　本発明において、脱メチル化剤は、ＤＮＡのメチル化を阻害する薬剤をいう。

　本発明において、好ましい脱メチル化剤はＡＺＡ誘導体である。具体的には、ＡＺＡ誘導体は式（Ｉ）で示される化合物である。なお、式（Ｉ）の化合物は、その構造異性体および立体異性体を包含しうる。

　式（Ｉ）で示される化合物のうち、Ｒ^１、Ｒ^２の両方がＯＨである化合物、あるいはＲ^１、Ｒ^２の一方が水素であり他方がＯＨである化合物が好ましい。式（Ｉ）で示される化合物のうち、Ｒ^３が水素である化合物が好ましい。式（Ｉ）で示される化合物のうち、ＡがＣＨまたはＣＨ_２であり、ＺがＮ、ＮＨ、ＣＨ、またはＣ−ハロゲンであり、Ｘが水素またはＮＨ_２である化合物が好ましい。

　式（Ｉ）におけるＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニルおよびＣ_１−６アルキニルは、それぞれ炭素数１~６個のアルキル、アルケニルおよびアルキニルを意味する。Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニルおよびＣ_１−６アルキニルは構造異性体を包含する。式（Ｉ）におけるＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニルおよびＣ_１−６アルキニルは未置換であってもよく、あるいは１個以上の水酸基またはハロゲンで置換されていてもよい。ハロゲンはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり、好ましくはＦまたはＣｌである。

　式（Ｉ）で示される化合物の例としては、ＡＺＡ、５−アザ−２’−デオキシシチジン、ファザラビン、デシタビン、５−フルオロ−２’−デオキシシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン（ＤＨＡＣ）、ゼブラリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

　本発明において好ましい化合物の例としては、ＡＺＡおよび５−アザ−２’−デオキシシチジンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、より好ましい化合物はＡＺＡである。

　本明細書において、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療とは、患者における当該疾病に起因する動悸、めまい、疲れやすいなどの貧血関連症状を緩和、軽減、改善または消失させること、および貧血によって生じる心不全、肝障害などを予防することをいう。本明細書において、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療には、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の予防が包含される。

　本発明の医薬組成物の治療効果は、脱メチル化剤によりＡＬＡＳ２遺伝子の変異に対応している部位のメチル化が外れ、変異型配列に加えて野生型配列が発現することにより発揮される。例えば、ＡＬＡＳ２のｃＤＮＡにおいて、Ｒ２２７Ｃ変異（ＡＬＡＳ２タンパク質のＮ末端から２２７番目のアルギニンがシステインに置換されている）に対応する部位のメチル化が外れ、６７９番目の塩基の一部でＣ（変異型）に加えてＴ（野生型）が発現することにより、本発明の医薬組成物の治療効果が発揮される。特に、ビタミンＢ６が無効であるＸ連鎖性鉄芽球性貧血患者のＡＬＡＳ２遺伝子変異の一つであるＲ２２７Ｃ変異で有効性が示されたため、本発明の医薬組成物はＲ２２７Ｃ変異を含め全てのビタミンＢ６投与が無効であるＸ連鎖性鉄芽球性貧血患者、好ましくは女性患者の治療に有効であると考えられる。

　ビタミンＢ６投与が無効であるとは、ビタミンＢ６が全く奏功しない場合、ならびに部分的に奏功するが治療には不十分である場合を包含する。

　本発明の医薬組成物の奏功を確認するために公知の方法を用いることができる。例えば、患者の問診、および／または赤血球数、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣの値、赤血球の形態観察（顕微鏡観察）、赤血球の色調観察、骨髄の形態観察、Ｘ染色体不活性化の偏りの確認、赤血球のｃＤＮＡによる変異型・野生型ＡＬＡＳ２の発現割合などにより、奏功を確認してもよい。

　本発明の医薬組成物は、通常、医薬上許容される担体または賦形剤を含む。

　本発明の医薬組成物の投与経路はいずれの経路であってもよい。好ましくは、本発明の医薬組成物は皮下注射、静脈注射、静脈点滴、または経口投与される。

　本発明の医薬組成物は、投与経路に応じて公知の方法にて製造することができる。注射剤または点滴剤である本発明の医薬組成物を、注射用水、生理食塩水、ブドウ糖溶液、リンゲル液などの公知の担体に有効成分（例えばＡＺＡ）を混合、溶解することにより製造してもよい。経口投与剤である本発明の医薬組成物を、公知の固体、半固体または液体担体と混合することにより製造してもよい。経口投与剤である本発明の医薬組成物の剤形の例としては、錠剤、カプセル剤、粉末、顆粒、錠剤、ゲル、シロップ、ドリンク等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物は、例えばｐＨ調節用の緩衝成分、香料、甘味料等を適宜含んでいてもよい。

　本発明の医薬組成物によるＡＺＡ等の化合物の投与量は、投与化合物の種類、患者の症状の重さ、年齢、体重、健康状態、既往症、現在受けている治療等を考慮して、医師が決定しうる。例えば、約５０~約１００ｍｇ／ｍ^２（体表面積）のＡＺＡを１日１回皮下注射または点滴静注してもよい。

　本発明の医薬組成物は、脱メチル化剤以外の貧血治療成分、例えば鉄剤を含んでいてもよい。また、本発明の医薬組成物を、他の貧血治療、例えば鉄剤投与療法と併用してもよい。

　本発明は、もう１つの態様において、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血患者由来のｉＰＳ細胞から正常な赤血球を製造する方法であって、該ｉＰＳ細胞を赤血球に分化誘導することを含み、分化誘導の際に脱メチル化剤を細胞に添加するものである方法を提供する。

　ｉＰＳ細胞は、体細胞に核初期化因子を導入することにより得ることができる。ｉＰＳ細胞の作製方法は公知であり、いずれの方法を用いてもよい。核初期化因子は、基本的にはＯｃｔファミリー遺伝子または当該遺伝子産物、Ｋｌｆファミリー遺伝子または当該遺伝子産物、Ｓｏｘファミリー遺伝子または当該遺伝子産物、およびＭｙｃファミリー遺伝子または当該遺伝子産物を含む。これらの因子に加えて、Ｌｉｎ２８遺伝子または当該遺伝子産物、ｎａｎｏｇ遺伝子または当該遺伝子産物など体細胞に導入して、ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めてもよい。核初期化因子の体細胞への導入方法も公知である。また、核初期化因子導入後にヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤で細胞を処理することで、ｉＰＳ細胞の樹立効率を高めてもよい。核初期化因子を導入した体細胞の培養方法、ｉＰＳ細胞の検出・選択方法についても公知である。

　体細胞は、身体のいずれの部位に由来するものであってもよい。体細胞は末梢血単核細胞などの血液細胞が好ましい。

　幹細胞を赤血球へと分化させる方法も公知である。一般的には、適切な因子の存在下での胚様体（ＥＢ）形成法が用いられるが、これに限定されない。例えば、ＢＭＰ４、Ｒｏｃｋインヒビター、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＩＬ３、ＩＬ１１、ＳＣＦ、ＦＬＴ３、さらにはＴＰＯ、ＥＰＯなどの存在下においてｉＰＳ細胞を培養し、胚様体（ＥＢ）を形成させることにより赤血球へと分化させてもよい。得られたＥＢをステムセルファクター（ＳＣＦ）およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む培地にて培養して、さらに赤血球へと分化させてもよい。

　例えば、ＥＢ形成開始から一定期間後（例えば１０~２０日目）に、造血幹細胞および／または造血前駆細胞に特異的な細胞表面マーカーが陽性である細胞を選択し、選択された細胞をＳＣＦやＥＰＯを含む培地にて培養して、赤血球が豊富な細胞集団を得てもよい。造血幹細胞および／または造血前駆細胞に特異的な細胞表面マーカーとしては、ＣＤ３４やＣＤ４３が挙げられるが、これらに限定されない。細胞の選択方法は公知であり、例えばセルソーターを用いてもよい。

　ＳＣＦやＥＰＯを含む培地にて培養する際に、ストロマ細胞と共培養して赤血球分化を促進してもよい。ストロマ細胞と共培養する際に、分化途中の細胞を再度ストロマ細胞に載せ替えて赤血球分化誘導をさらに促進してもよい。ストロマ細胞はいずれのものであってもよいが、好ましくは骨髄由来のストロマ細胞である。骨髄由来のストロマ細胞の例としてはＯＰ９細胞が挙げられるが、これに限定されない。

　赤血球分化効率は、赤血球前駆細胞および／または赤血球に特異的な細胞表面マーカーを検出することにより調べることができる。かかるマーカーとしてはＣＤ２３５ａ、ＣＤ７１、ＣＤ３６、ＣＤ２３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいマーカーとしてはＣＤ２３５ａ、ＣＤ７１、ＣＤ３６が挙げられる。マーカーの検出方法も公知であり、例えば、可視化標識を付したマーカーを用いてもよく、特異的抗体を用いてもよい。分化した赤血球の選択方法も公知であり、例えばセルソーターを用いてもよい。

　脱メチル化剤の細胞への添加は、細胞と脱メチル化剤が接触する条件下で行われる。通常は、脱メチル化剤を培地に添加する。脱メチル化剤の細胞への添加は、ｉＰＳ細胞から赤血球分化のいずれの段階で行ってもよい。好ましくは、ＥＢ法にてある程度分化が進んだ段階（例えば、ＥＢ形成開始から１０~２０日目）で、脱メチル化剤を添加する。培地交換ごとに脱メチル化剤を添加してもよい。

　培地中に添加する脱メチル化剤の濃度は、適宜選択、変更することができる。例えばＡＺＡを添加する場合、培地中のＡＺＡ濃度は通常約１００~約１０００ｎＭ、好ましくは約３００~約７００ｎＭ、例えば約５００ｎＭであってもよい。

　正常な赤血球であるかどうかの確認は、ＡＬＡＳ２遺伝子の変異が正常化しているかどうかを調べることにより行ってもよい。分化によって得られた赤血球または赤芽球のＡＬＡＳ２遺伝子の塩基配列と、変異のないＡＬＡＳ２遺伝子の塩基配列（公知である）とを比較することにより、かかる確認を行ってもよい。遺伝子の塩基配列の解析方法は公知であり、例えば自動シークエンサーを用いてもよい。

　また、正常な赤血球であるかどうかの確認は公知の方法にて行うことができる。例えば、顕微鏡観察、Ｈｍｏｘ−１，ｇｌｏｂｉｎなどの遺伝子発現の確認、ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ染色、ＡＬＡＳ２変異部位の塩基配列の確認やＸ染色体不活性化の確認などの方法にて確認してもよい。あるいは、患者のｉＰＳ細胞から得られた赤血球の色調を、健常人（赤血球分化における障害を有しない人）の赤血球の色調と比較（例えば肉眼で）することにより、確認を行ってもよい。患者のｉＰＳ細胞から得られた赤血球の色調が、健常人の赤血球の色調と同じいかまたはそれに近い濃さであれば、得られた赤血球が正常と判断してもよい。

　本発明はさらなる態様において、以下のものを提供する。
　・Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血を治療するための脱メチル化剤の使用；
　・Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療において使用するための脱メチル化剤；
　・Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血を治療するための医薬の製造における脱メチル化剤の使用；ならびに
　・Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療を要する患者に脱メチル化剤を投与することを含む、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療方法。
　これらの態様における脱メチル化剤、患者については上で説明したとおりである。

　本発明はさらなる態様において、以下のものを提供する：
　・Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血患者由来のｉＰＳ細胞から正常な赤血球を製造する方法であって、該ｉＰＳ細胞を赤血球に分化誘導することを含み、分化誘導の際に脱メチル化剤を細胞に添加するものである方法によって得られた正常な赤血球を含む、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血を治療するための医薬組成物；
　・Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血を治療するための前記正常な赤血球の使用；
　・Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療において使用するための、前記正常な赤血球；
　・Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血を治療するための医薬の製造における前記正常な赤血球の使用；ならびに
　・Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療を要する患者に前記正常な赤血球を投与することを含む、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血の治療方法。
　これらの態様における脱メチル化剤、患者については上で説明したとおりである。

　以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例の記載は本発明の範囲を限定するものではない。

　Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血患者からのｉＰＳ細胞の取得
　Ｘ染色体上のＡＬＡＳ２遺伝子ヘテロにＲ２２７Ｃ変異が入ったＸ連鎖性鉄芽球性貧血患者（４２歳（ｉＰＳ細胞樹立当時）、女性、以下「ＳＡ１」ともいう）、その妹（４０歳（ｉＰＳ細胞樹立当時）、女性、以下「ＳＡ２」ともいう）、およびその母（７０歳（ｉＰＳ細胞樹立当時）、女性、以下「ＳＡ３」ともいう）の血液細胞（末梢血単核細胞）からｉＰＳ細胞を作製した。ＳＡ１と同様に、ＳＡ２およびＳＡ３もＸ染色体上のＡＬＡＳ２遺伝子ヘテロにＲ２２７Ｃ変異が入ったＸ連鎖性鉄芽球性貧血患者である。ＳＡ１はビタミンＢ６投与が無効であった。ｉＰＳ細胞の作製手順は以下のとおりであった。

　患者から末梢血を採血し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ　Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア）を用いて末梢血単核細胞を分離した。ＭＡＣＳ　ＣＤ３　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｌｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０５０−１０１）を用いて、ＣＤ３陽性のＴ細胞とＣＤ３陰性の非Ｔ細胞に分離した。Ａｍａｘａ　ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を用い、ｐＣＸＬＥ−ｈＯＣＴ３／４−ｓｈｐ５３−Ｆ、ｐＣＸＬＥ−ｈＳＫ、ｐＣＸＬＥ−ｈＵＬ、ｐＣＸＷＢ−ＥＢＮＡ１を用いて遺伝子導入を行った（これらのベクターは米国Ａｄｄｇｅｎｅから得た）（Ｔ細胞についてはＡｍａｘａ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を用い、非Ｔ細胞についてはＡｍａｘａ　Ｈｕｍａｎ　Ｍｏｎｏｃｙｔｅ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を用いた）。Ｔ細胞については、血球培地Ｘ　ＶＩＶＯ−１０（Ｌｏｎｚａ）１ｃｃに５０μＬＭのＤｙｎａｂｅａｄｓ　ＣＤ３／ＣＤ２８を１．５ｍｌのチューブに加えて溶解し、チューブをＤｙｎａＭａｇ−２に静置し、上清を取り除いた。その後、Ｘ　ＶＩＶＯ−１０に３ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２を加えた培地中、ＭＥＦ　ｆｅｅｄｅｒ上で細胞を培養した。非Ｔ細胞は、αＭＥＭに１０％ＦＢＳ、各１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ加えた培地を用いて培養を行った。

　ＡＬＡＳ２遺伝子はＸ染色体上にあるため、２つのＡＬＡＳ２遺伝子のうち１つは、女性患者においてＸ染色体不活性化によってランダムに不活性化される。そのため、各患者から得られたｉＰＳ細胞は以下の２種類であった：
　・ＡＬＡＳ２変異のあるＸ染色体が不活性化し、野生型ＡＬＡＳ２のみを発現しているｉＰＳ細胞（「野生型ＡＬＡＳ２がａｃｔｉｖｅなｉＰＳ細胞」または「ａｃｔｉｖｅ　ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ　ｉＰＳＣｓ」または「ＷＴ−ｉＰＳＣ」という）
　・ＡＬＡＳ２変異のないＸ染色体が不活性化し、変異型ＡＬＡＳ２のみを発現しているｉＰＳ細胞（「変異型ＡＬＡＳ２がａｃｔｉｖｅなｉＰＳ細胞」または「ａｃｔｉｖｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｉＰＳＣｓ」または「ＭＴ−ｉＰＳＣ」という）。
　本明細書においてｉＰＳ細胞を「ｉＰＳＣ」ということがある。
　ＳＡ１から５８のｉＰＳＣ株を得た。ＳＡ２から９４のｉＰＳＣ株を得た。ＳＡ３から４７のｉＰＳＣ株を得た。
　本明細書において、ＳＡ１から得たＷＴ−ｉＰＳＣ株を、「ＷＴ１−ｉＰＳＣ１」、「ＷＴ１−ｉＰＳＣ２」、「ＷＴ１−ｉＰＳＣ３」といい、ＳＡ１から得たＭＴ−ｉＰＳＣ株を、「ＭＴ１−ｉＰＳＣ１」、「ＭＴ１−ｉＰＳＣ２」、「ＭＴ１−ｉＰＳＣ３」、「ＭＴ１−ｉＰＳＣ４」という。同様に、ＳＡ３から得たＷＴ−ｉＰＳＣ株を、「ＷＴ３−ｉＰＳＣ１」、「ＷＴ３−ｉＰＳＣ２」といい、ＳＡ３から得たＭＴ−ｉＰＳＣ株を、「ＭＴ３−ｉＰＳＣ１」、「ＭＴ３−ｉＰＳＣ２」という。
　健康なドナーから得た１のｉＰＳＣ株（６９２Ｄ２）を対照として使用した。
　本明細書において、細胞があるマーカーに関して陽性であることを「陽性」または「＋」で、陰性であることを「陰性」または「−」で表す。例えばＣＤ２３５ａ陽性細胞を「ＣＤ２３５ａ陽性細胞」または「ＣＤ２３５ａ＋細胞」と表記する。

　ｉＰＳＣの維持
　４ｎｇ／ｍＬの組換えｂＦＧＦを補足した霊長類用ＥＳ細胞培地（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ）中、ＳＴＯフィーダー細胞上ですべてのｉＰＳＣ株を維持した。フィーダー細胞を除去するためにＭａｔｒｉｇｅｌで被覆したプレート上で１継代培養後、ｉＰＳＣ株を分化させた。

　ｉＰＳ細胞の赤血球分化誘導
　Ｉ．実験方法
　ＥＢ法（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ　ＡＥ　ｅｔ．ａｌ　Ｂｌｏｏｄ．Ａｐｒ．８；１１５（１４）：２７６９−７６（２０１０））を用いてｉＰＳ細胞をＳｔｅｍ　Ｐｒｏ−３４培地（ｇｉｂｃｏ）で分化させた。０日目はＢＭＰ４、Ｒｏｃｋインヒビターを含む培地にて、１日目~４日目はＢＭＰ４、ｂＦＧＦを含む培地にて、４日目~８日目はＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＩＬ３、ＩＬ１１、ＳＣＦ、ｂＦＧＦおよび所望によりＦｌｔ３ａを含む培地にて、８日目~１５日目はＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＩＬ３、ＩＬ１１、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＥＰＯおよび所望によりＦｌｔ３ａを含む培地にて培養した。

　フローサイトメトリー分析および細胞ソーティング
　ｉＰＳＣ由来の造血細胞をフローサイトメトリー分析およびソーティングに供するために、０．２５％　トリプシンを用いて胚葉体を解離させ、次いで１０~２０回ピペッティングした。細胞を、ＦＡＣＳ　ＡＲＩＡ　ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いるフローサイトメトリー分析およびソーティングに供した。７−ＡＡＤ（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて死細胞を除去した。
　造血前駆細胞（ＨＰＣ）のソーティングに用いた抗体は、ＣＤ３４−ＰＥ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，　３４８０５７）およびＣＤ４３−ＦＩＴＣ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，　５５５４７５）であった。

　ＯＰ９間質フィーダー細胞上で赤血球分化を行った。ＦＡＣＳによりソーティングされた１５日目の造血前駆細胞を、ＯＰ９細胞上にプレーティングし、１０％　ウシ胎児血清、１００ｍＭ　グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００μＭ　モノチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）、５μｇ／ｍＬ　トランスフェリン（Ｒｏｃｈｅ）および５０μｇ／ｍＬ　アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）を補足したアルファー最小必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、維持した。分化に使用したサイトカインおよび化合物は以下のものであった：１５~２０日目、ｈＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＦｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ｈＦｌｔ−３；１００ｎｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ｈＥＰＯ（４Ｕ／ｍＬ）およびヒトスロンボポイエチン（ｈＴＰＯ；５０ｎｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）；２０~２７日目、ｈＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびｈＥＰＯ（４Ｕ／ｍＬ）；２７~３４日目、ｈＥＰＯ（４Ｕ／ｍＬ）およびクエン酸第一鉄（ＳＦＣ；２５０μＭ，Ｎｉｈｏｎ　Ｇｅｎｅｒｉｃ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ）。

　Ｍａｙ　Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色
　ギムザ染色液（Ｗａｋｏ）およびギムザ液（Ｗａｋｏ）を用い、製造者の説明書に従ってＭａｙ　Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色を行った。

　ベルリン青染色
　Ｆｅ　ｓｔａｉｎ　ｋｉｔ（Ｍｕｔｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．）を用い、製造者の説明書に従ってベルリン青染色を行った。

　ｏ−ジアニシジン染色
　０．０１Ｍ　酢酸ナトリウム、０．６５％　水、４０％　エタノール、および０．６ｍｇ／ｍＬ　ｏ−ジアニシジン（Ｓｉｇｍａ）中で、ｏ−ジアニシジン染色を１５分間行った。

　ＩＩ．実験結果
　ａｃｔｉｖｅ　ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ　ｉＰＳＣに由来する赤芽球（ＷＴ赤芽球）のペレットは赤色であったが、ａｃｔｉｖｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｉＰＳＣに由来する赤芽球（ＭＴ赤芽球）のペレットは白色であった（図１Ａ）。鉄染色により、環状鉄芽球はＭＴ赤芽球中に存在するがＷＴ赤芽球中には存在しないことが示された（図１Ａ）。Ｍａｙ　Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色により、大部分のＷＴ赤芽球は成熟しているが、大部分のＭＴ赤芽球は未成熟な形態学的表現型を示すことが示された。さらに、ＭＴ赤芽球において、患者の赤芽球と同様に、核辺縁不整や核崩壊などの異形成の変化が観察された（図１Ｂ）。大部分のＷＴ赤芽球は正染性赤芽球であったが、大部分のＭＴ赤芽球は多染性赤芽球および巨赤芽球であった（図１Ｃ）。さらに、ＷＴ赤芽球のｏ−ジアニシジン染色は正常であったが、ＭＴ赤芽球はわずかに染色されるだけであり（図４Ｄ）、ＭＴ赤芽球においてヘム合成が大きく妨げられていることが示唆された。

　また、フィーダー細胞のない赤血球培養条件下で、ＭＴ−ｉＰＳＣの赤血球分化能を調べた。
　フィーダー細胞のない条件下で赤血球分化を行うために、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によりソーティングされたｉＰＳＣ由来の１５日目の造血前駆細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で分化させた。分化に使用したサイトカインは以下のものであった：１５~２３日目、ヒト幹細胞因子（ｈＳＣＦ；１００ｎｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒトエリスロポイエチン（ｈＥＰＯ；４Ｕ／ｍＬ，Ｋｙｏｗａ　Ｋｉｒｉｎ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．）およびヒトＩＬ−３（ｈＩＬ−３；５ｎｇ／ｍＬ，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）；２３~２６日目、ｈＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびｈＥＰＯ（４Ｕ／ｍＬ）；２６~２９日目、ｈＥＰＯ（４Ｕ／ｍＬ）。

　造血分化能は２種類のｉＰＳＣ株間で同等であった（図２Ａ）。しかしながら、ＳＡ１およびＳＡ３の両方から得られたＷＴ−ｉＰＳＣ株と比較すると、ＭＴ−ｉＰＳＣ株では、ＣＤ２３５＋赤血球細胞へのさらなる分化が有意に妨げられていた（図２Ｂ、図２Ｃおよび図２Ｄ）。

　赤芽球における赤血球成熟関連遺伝子の発現
　Ｉ．実験方法
　ＲＮＡ−ｓｅｑ
　あらかじめＦＡＣＳを用いてソーティングされた３種類のＷＴ−ｉＰＳＣ株および４種類のＭＴ−ｉＰＳＣ株から得られたＴＲＡ１−６０＋ｉＰＳＣ、８日目のＣＤ３４＋細胞、１５日目のＣＤ４３＋ＣＤ３４＋ＣＤ３８−Ｌｉｎ−細胞および３４日目のＣＤ２３５ａ＋赤芽球からＲＮＡを抽出した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて単離された患者骨髄単核細胞中のＭＡＣＳによりソーティングされたＣＤ２３５ａ＋赤芽球、および健康なドナーの骨髄単核細胞（Ｌｏｎｚａ）からもＲＮＡを抽出した。ＴｒｕＳｅｑ　Ｓｔｒａｎｄｅｄ　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｗｉｔｈ　Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ　Ｇｏｌｄ　ＬＴ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ，Ｓｅｔｓ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、製造者の説明書に従って、ライブラリーを構築した。ＮｅｘｔＳｅｑ　５００／５５０　Ｈｉｇｈ　Ｏｕｔｐｕｔ　Ｋｉｔ　ｖ２（７５サイクル）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて配列決定を行った。ｃｕｔａｄａｐｔ−１．１５を用いてリードに含まれるアダプター配列をトリミングした。Ｂｏｗｔｉｅ２およびＳａｍｔｏｏｌｓを用いて、リボソームＲＮＡにマップされたリードの除去を行った。ＳＴＡＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ　２．５．４ａ）を用いてリードをヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ＵＣＳＣ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｂｒｏｗｓｅｒ）にマッピングし、ＲＳｅＱＣ（ｖｅｒｓｉｏｎ　２．６．４）をクオリティーチェックに使用した。ＨＴＳｅｑ（ｖｅｒｓｉｏｎ　０．９．１）を用いて、ＧＥＮＣＯＤＥアノテーションファイル（ｖｅｒｓｉｏｎ　２７）に従ってリードをカウントした。そしてＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ　３．６．１）中のパッケージであるＤＥＳｅｑ２（ｖｅｒｓｉｏｎ　１．２４．０）を用いてカウントを正規化した。ＤＥＳｅｑ２パッケージ、ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ（ｖｅｒｓｉｏｎ　３．１２．０）およびｅｎｒｉｃｈｐｌｏｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ　１．６．１）パッケージを用いて、ＧＯ分析、ＧＳＥＡ、ＰＣＡおよびＷａｌｄ検定を行った。

　ＩＩ．実験結果
　ＷＴ細胞およびＭＴ細胞において、赤血球分化過程における転写発現パターンを比較するために、３種類のＷＴ−ｉＰＳＣ株および４種類のＭＴ−ｉＰＳＣ株において、ｉＰＳＣ、８日目のＣＤ３４＋細胞、１５日目のＣＤ４３＋ＣＤ３４＋ＣＤ３８−Ｌｉｎ−細胞、および３４日目のＣＤ２３５ａ＋赤芽球のＲＮＡ−ｓｅｑを行った（図３Ａ）。ｉＰＳＣ、ＣＤ３４＋細胞、およびＣＤ４３＋ＣＤ３４＋ＣＤ３８−Ｌｉｎ−細胞の段階ではＷＴとＭＴとの間に相違は観察されなかった。しかしながら、ヒエラルキークラスタリングによると、赤芽球は２つのクラスターに分けられた（図３Ｂ）。５種類のｉＰＳＣ株から分化した赤芽球ならびに健康なドナーおよびＳＡ３から得た骨髄赤芽球の主成分分析（ＰＣＡ）により、ｉＰＳＣ由来の赤芽球は、対応する患者の骨髄赤芽球と類似のクラスターパターンを有することが示された。ＭＴ赤芽球およびＳＡ３由来の骨髄赤芽球はＰＣ２のポジティブ側に存在したが、ＷＴ赤芽球および健康なドナーの骨髄赤芽球はネガティブ側に存在した（図３Ｃ）。この観察結果を証明するために、ＲＮＡ−ｓｅｑデータのＧｅｎｅ　Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）分析を用いて細胞を評価した。ＷＴ細胞においてアップレギュレートされた遺伝子は、Ｒａｓ　ＧＴＰａｓｅ結合、Ｒｈｏ　ＧＴＰａｓｅ結合およびアクチン結合を含む成熟赤芽球に関連したＧＯターム、ならびに遷移金属イオン膜貫通トランスポーター活性のような鉄トランスポーターによりレギュレートされるＧＯタームの豊富化を示した（図３Ｄ）。この分析により、同じ分化方法であるにもかかわらず、ＭＴ赤芽球よりもＷＴ赤芽球のほうが、より成熟した段階へと分化することが示された。ｇｅｎｅ　ｓｅｔ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）を用いて、赤血球分化の間に異なって発現される遺伝子のセットに関して、ＷＴ赤芽球とＭＴ赤芽球における遺伝子発現の豊富化についても調べた。ＷＴ赤芽球においてヘム代謝データセットが有意に豊富化されていた（図３Ｅおよび表１）。初期の正染性赤芽球で特異的に発現された遺伝子についてｉＰＳＣ由来の赤芽球および骨髄由来の赤芽球のヒエラルキークラスター分析を行った（図３Ｆ）。これらの遺伝子の発現は、ＷＴ赤芽球および健康なドナーの骨髄赤芽球よりもＭＴ赤芽球およびＳＡ３骨髄赤芽球において低かった。これらの遺伝子発現データは表現型実験での知見を支持するものであり、ＭＴ−ｉＰＳＣ由来の赤芽球は未成熟な赤血球段階で分化を停止することが示された。

　ＡＺＡによるヘム合成および赤血球分化の変化について調べた。
　Ｉ．実験方法
　ＡＺＡでの処理
　赤血球分化の開始時から、１００ｎＭまたは５００ｎＭのＡＺＡ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）を培地に添加した。培地交換時にＡＺＡを培地に添加した（ＥＢ法でフィーダー細胞を用いない方法にて、１９、２３および２６日目）。

　ＩＩ．実験結果
　赤血球分化段階においてＡＺＡを添加したところ（図４Ａ）、ＭＴ造血前駆細胞においてＣＤ２３５＋赤芽球の生成が有意に改善された（図４Ｂおよび４Ｃ）。さらに、ｏ−ジアニシジン染色において、ＡＺＡ不存在下でＭＴ造血前駆細胞から分化したかなりの数の赤芽球は陽性でなかったが、ＡＺＡ存在下でＭＴ造血前駆細胞から分化したかなりの数の赤芽球は陽性であった（図４Ｄ）。

　ＡＺＡによるＡＬＡＳ２遺伝子のヌクレオチド配列の変化について調べた。
　Ｉ．実験方法
　ｉＰＳ細胞の赤血球分化誘導
　実施例１で得られたＳＡ１由来のＷＴ−ｉＰＳＣおよびＭＴ−ｉＰＳＣを用いた。ＥＢ法（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓ　ＡＥ　ｅｔ．ａｌ　Ｂｌｏｏｄ．Ａｐｒ．８；１１５（１４）：２７６９−７６（２０１０））を用いてｉＰＳ細胞をＳｔｅｍ　Ｐｒｏ−３４培地（ｇｉｂｃｏ）で分化させた。０日目はＢＭＰ４、Ｒｏｃｋインヒビターを含む培地にて、１日目~４日目はＢＭＰ４、ｂＦＧＦを含む培地にて、４日目~８日目はＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＩＬ３、ＩＬ１１、ＳＣＦ、ｂＦＧＦおよび所望によりＦｌｔ３ａを含む培地にて、８日目~１５日目はＶＥＧＦ、ＩＬ６、ＩＬ３、ＩＬ１１、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＥＰＯおよび所望によりＦｌｔ３ａを含む培地にて培養した。

　１５日間分化させた細胞をＦＩＴＣ　ＣＤ４３（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，　５５５４７５）／ＰＥ　ＣＤ３４（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，　３４８０５７）と反応させ、ＣＤ４３＋ＣＤ３４＋細胞をＦＡＣＳソーティングした。ソーティングした細胞を１４日間赤血球分化させた。ＥＢ形成開始から１５日目~２３日目は、Ｓｔｅｍ　Ｐｒｏ−３４培地（ｇｉｂｃｏ）にＳＣＦ、ＥＰＯ、ＩＬ３を含む培地にて、２３日目~２６日目は、ＳＣＦ、ＥＰＯを含む培地にて、２６日目~２９日目は、ＥＰＯを含む培地にて培養した。培養はフィーダーフリー条件下で行った。培地交換毎に、ＡＺＡ投与群では５００ｎＭのＡＺＡ（ナカライテスク株式会社）を含む培地を用い、コントロール群ではＡＺＡのかわりにＤＭＳＯを含む培地を用いた。

　サンガーシークエンスによるＡＬＡＳ２変異部位の解析
　２９日間分化誘導した細胞をＱＩＡＺＯＬに溶解し、ｍｉＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｃｒｏ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ　Ｎ．Ｖ．）を用いてＲＮＡ抽出した。ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ　ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡株式会社）を用いて逆転写し、ＡＬＡＳ２のエクソン６の変異部位を、Ｂｉｇ　Ｄｙｅ反応を用いるサンガーシークエンスにて配列解析した。

　ＩＩ．実験結果
　結果を図５に示す。野生型ＡＬＡＳ２がａｃｔｉｖｅなｉＰＳ細胞由来の赤芽球では、ＤＭＳＯ投与群でシークエンス配列が正常配列ＣＧＣのみであった。ＡＺＡ　５００ｎＭ投与群では、正常配列ＣＧＣに加えて、変異配列ＴＧＣが発現していた。一方で、変異型ＡＬＡＳ２がａｃｔｉｖｅなｉＰＳ細胞由来の赤芽球では、ＤＭＳＯ投与群でシークエンス配列が変異配列ＴＧＣのみであった。ＡＺＡ　５００ｎＭ投与群では、変異配列ＴＧＣに加えて、正常配列ＣＧＣ配列が発現していた。これらのことから、ＡＺＡの投与により、野生型ＡＬＡＳ２がａｃｔｉｖｅなｉＰＳ細胞由来の赤芽球と、変異型ＡＬＡＳ２がａｃｔｉｖｅなｉＰＳ細胞由来の赤芽球いずれにおいても、本来の野生型、変異型の発現に加えて、それぞれ変異型、野生型の発現が見られ、不活性化されていたＡＬＡＳ２のメチル化が外れていることが考えられる。

　ＡＺＡによる赤血球分化能の改善について調べた。

　Ｉ．実験方法
　実施例１で得られたＳＡ１由来のｉＰＳ細胞を用い、実施例５と同様にＥＢ法にて２９日間分化誘導した。ＣＤ４３＋ＣＤ３４＋細胞のソーティングも実施例１と同様に行った。ＡＺＡの投与も実施例５と同様に行った。得られた細胞をＡＰＣ　ＣＤ２３５ａを指標としてＦＡＣＳにより解析した。

　ＩＩ．実験結果
　野生型ＡＬＡＳ２がａｃｔｉｖｅなｉＰＳ細胞由来の赤芽球では、ＤＭＳＯ投与群（図６の一番左）、ＡＺＡ　５００ｎＭ投与群（図６の左から二番目）のいずれにおいても赤血球分化能が良好であった。一方で、変異型ＡＬＡＳ２がａｃｔｉｖｅなｉＰＳ細胞由来の赤芽球では、ＤＭＳＯ投与群（図６の右から二番目）では赤血球分化能が著しく低下していたが、ＡＺＡ　５００ｎＭ投与群（図６の一番右）では赤血球分化能の顕著な改善が認められた。

　ＡＺＡによる赤血球コロニー数の増加について調べた。
　Ｉ．実験方法
　実施例１で得られたＳＡ１由来のｉＰＳ細胞を用い、実施例５と同様にＥＢ法にて２９日間分化誘導した。ＣＤ４３＋ＣＤ３４＋細胞のソーティングも実施例５と同様に行った。ソーティング後の細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（Ｈ４４３５）に溶解して播き、１４日間培養した。ＡＺＡ投与群では１００ｎＭまたは５００ｎＭのＡＺＡを含む培地を用い、コントロール群ではＡＺＡのかわりにＤＭＳＯを含む培地を用いた。コロニー数は以下のＣＦＵアッセイにより計測した。

　ＣＦＵアッセイ
　Ｎｉｓｈｉｚａｗａ　ＭらによるＣｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２０１６；１９（３）：３４１−３５４．に記載された方法に基づいてＣＦＵアッセイを行った。形態学的分析により系統アサインメントを決定し、いくつかの典型的なコロニー（特に赤血球および混合コロニー）をピックアップし、Ｍａｙ　Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色を用いて評価した。

　ＩＩ．実験結果
　野生型ＡＬＡＳ２がａｃｔｉｖｅなｉＰＳ細胞では、ＤＭＳＯ投与群（図７上段および下段の一番左）、ＡＺＡ　５００ｎＭ投与群（図７上段および下段の左から二番目）のいずれにおいても赤血球コロニー数は正常範囲内であった。一方で、変異型ＡＬＡＳ２がａｃｔｉｖｅなｉＰＳ細胞由来の赤芽球では、ＤＭＳＯ投与群（図７上段および下段の右から二番目）では赤血球コロニーが認められなかったが、ＡＺＡ投与群（図７上段および下段の一番右）では赤血球コロニーの出現が認められ、コロニー数は野生型ＡＬＡＳ２がａｃｔｉｖｅなｉＰＳ細胞のＡＺＡ投与群の約半分にまで改善された。

　複数の株を用いて、ＡＺＡ投与によるＭＴ−ｉＰＳＣ由来のＨＰＣの赤血球系コロニー形成能の変化を調べた。ＣＦＵアッセイは、上述の手順に従って行った。ＡＺＡ投与群およびコントロール群で全コロニー数に違いはなかった（図８Ａ）。コントロール群のＭＴ造血前駆細胞において、赤血球コロニーは観察されず、わずかな混合コロニーが観察された。他方、ＡＺＡ投与群のＭＴ造血前駆細胞において、赤血球コロニーおよび混合コロニーの形成が有意に改善された（図８Ｂ、図８Ｃ）。ＷＴ−ｉＰＳＣ３およびＭＴ−ｉＰＳＣ１についても同じ手順で実験を行って、上と同様の結果を得た（図９）。これらの結果は、ＡＺＡ投与が、ＭＴ造血前駆細胞における欠陥のあるヘム合成および無効造血を改善することを示すものである。

　本発明は、遺伝性疾患、特に造血疾患の治療用医薬品およびこのような疾患の研究分野等において有用である。

Claims

　脱メチル化剤を含む、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血を治療するための医薬組成物。
　脱メチル化剤が式（Ｉ）：

［式中、Ｒ^１およびＲ^２はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、ハロゲン、ＯＨ、ＯＣ_１−６アルキル、ＯＣ_１−６アルケニル、ＯＣ_１−６アルキニル、ＯＣＯＣ_１−６アルキル、ＯＣＯＣ_１−６アルケニル、またはＣＯＣ_１−６アルキニルであり、Ｒ^３は水素、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、ＣＯＣ_１−６アルキル、ＣＯＣ_１−６アルケニル、ＣＯＣ_１−６アルキニル、またはリン酸基であり、ＡはＣＲ^４またはＣＲ^５Ｒ^６であり、Ｒ^４は水素、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、ＯＨ、またはハロゲンであり、Ｒ^５およびＲ^６はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、ＯＨ、またはハロゲンであり、ＺはＮ、ＮＲ^７、ＣＲ^８、またはＣＲ^９Ｒ^１０であり、Ｒ^７は水素、ＯＨ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、またはハロゲンであり、Ｒ^８は水素、ＯＨ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、またはハロゲンであり、Ｒ^９およびＲ^１０はそれぞれ独立して水素、ＯＨ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、Ｃ_１−６アルキニル、またはハロゲンであり、Ｘは水素またはＮＲ^１１Ｒ^１２であり、Ｒ^１１およびＲ^１２はそれぞれ独立して水素、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルケニル、またはＣ_１−６アルキニルであり、上記アルキル、アルケニルおよびアルキニルは１個以上の水酸基またはハロゲンで置換されていてもよく、−−は一重結合または二重結合を表す。］で示される化合物である、請求項１記載の医薬組成物。
　脱メチル化剤が５−アザシチジン（ＡＺＡ）または５−アザ−２’−デオキシシチジンである、請求項２記載の医薬組成物。
　脱メチル化剤がＡＺＡである、請求項３記載の医薬組成物。
　ビタミンＢ６投与が無効であるＸ連鎖性鉄芽球性貧血患者に使用される請求項１~４のいずれか１項記載の医薬組成物。
　Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血患者由来のｉＰＳ細胞から正常な赤血球を製造する方法であって、該ｉＰＳ細胞を赤血球に分化誘導することを含み、分化誘導の際に脱メチル化剤を細胞に添加するものである方法。
　脱メチル化剤が式（Ｉ）：

［式中、Ｒ^１−Ｒ^１２、Ａ、Ｚ、Ｘ、および−−は請求項２における定義と同じ。］で示される化合物である、請求項６記載の方法。
　脱メチル化剤がＡＺＡまたは５−アザ−２’−デオキシシチジンである、請求項７記載の方法。
　脱メチル化剤がＡＺＡである、請求項８記載の方法。
　患者が、ビタミンＢ６投与が無効であるＸ連鎖性鉄芽球性貧血患者である、請求項６~９のいずれか１項記載の方法。