WO2022118973A1

WO2022118973A1 - 遺伝子スイッチを選抜する方法

Info

Publication number: WO2022118973A1
Application number: PCT/JP2021/044574
Authority: WO
Inventors: 将大冨永; 純石井; 健太能崎; 昭彦近藤
Original assignee: Kobe University NUC
Current assignee: Kobe University NUC
Priority date: 2020-12-04
Filing date: 2021-12-03
Publication date: 2022-06-09
Anticipated expiration: 2023-06-04
Also published as: JPWO2022118973A1

Abstract

初期型の遺伝子スイッチ・センサの性能を劇的に高めることができる効率的な方法を提供すること。生物における遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜する方法であって、（Ａ）遺伝子スイッチ発現配列および／または該遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子が結合するプロモータにランダムな変異を導入した複数の核酸分子を含むＤＮＡライブラリーを提供する工程と、（Ｂ）該ライブラリーを宿主細胞に導入する工程と、（Ｃ）該プロモータによって発現調節される遺伝子を発現する細胞を死滅させるＯＦＦ条件に該宿主細胞を曝露し、生存する細胞を選択する工程と、（Ｄ）該生存する細胞を、前記プロモータによって発現調節される遺伝子を発現しない、及び／または目的の発現レベルに達していない細胞を死滅させるＯＮ条件に曝露し、生存する細胞を選択する工程と、（Ｅ）該生存する細胞に含まれる該ライブラリーに含まれていたものと同じ核酸配列を有する核酸分子を遺伝子スイッチ（転写調節因子）として選択する工程とを含む、方法。

Description

遺伝子スイッチを選抜する方法

　本開示は、遺伝子スイッチを選抜または作出する方法に関する。より詳しくは、本開示は、従来の初期型の遺伝子スイッチ・センサの性能を劇的に高めることができる効率的な選択手法に関する。

　近年、代謝物などの化合物に応答する遺伝子スイッチ・センサ（メタボライトセンサ）が注目を集めており、特に大腸菌などのバクテリアを中心にその開発が進められている。しかし、真核生物である酵母では、バクテリアに比べて転写制御領域が長く、その機能領域が曖昧なため、高性能な遺伝子スイッチ・センサを開発することが困難である。

　ところで、遺伝子スイッチ・センサの開発においては、変異体において、遺伝子発現がＯＮであるべき条件下で起動状態にあるもの、および／またはＯＦＦであるべき条件下で抑制状態にあるものをその遺伝子発現量に対して選抜（ＯＮ選抜／ＯＦＦ選抜）することが必須であるが、この２つの状態ともに適切な条件で選抜を実施することが重要となる。従来のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ－ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇでは、選抜条件を変えることはできるものの、一度に一つの条件しか検討することができない。また、薬剤を用いた選抜技術では、選抜条件を変えること自体が困難である。

　本開示は、真核生物、特に酵母において構築した初期型の遺伝子スイッチ・センサ、およびそれを利用した遺伝子スイッチ系の性能を劇的に高めることができる効率的な方法を提供する。

　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目Ｘ１）
　生物における転写調節因子を選抜する方法であって、（Ａ）遺伝子スイッチ発現配列および／または該遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子が結合するプロモータにランダムな変異を導入した複数の核酸分子を含むＤＮＡライブラリーを提供する工程と、（Ｂ）該ライブラリーを宿主細胞に導入する工程と、（Ｃ）該プロモータによって発現調節される遺伝子を発現する細胞を死滅させるＯＦＦ条件に該宿主細胞を曝露し、生存する細胞を選択する工程と、（Ｄ）（Ｃ）において該生存する細胞（ＯＦＦ条件で生存する細胞）を、前記プロモータによって発現調節される遺伝子を発現しない、及び／または目的の発現レベルに達していない細胞を死滅させるＯＮ条件に曝露し、生存する細胞を選択する工程と、（Ｅ）（Ｄ）において該生存する細胞（ＯＮ条件で生存する細胞）に含まれる該ライブラリーに含まれていたものと同じ核酸配列を有する核酸分子を転写調節因子として選択する工程とを含む、方法。
（項目Ｘ２）
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子は、前記細胞に対して毒性を示す毒性物質に結合することで前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、上記項目に記載の方法。（項目Ｘ３）
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子は、前記毒性物質に対して触媒活性を有さない、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ４）
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子は、遺伝子産物の量に対して化学量論的に前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ５）
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子は、前記毒性物質との結合性を弱める変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ６）
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子はブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）をコードする遺伝子配列を含み、前記変異はＤ２５Ａ変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ６Ａ）
　前記ブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）がStreptoalloteichus　hindustanus由来である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ７）
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子は、複数の遺伝子が融合された融合遺伝子である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ８）
　前記宿主細胞が、前記遺伝子スイッチ発現配列と、前記プロモータによって発現調節される遺伝子配列とを有する発現ベクターを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。（項目Ｘ９）
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子は、前記転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が、前記プロモータのオペレータ配列に結合することによって発現が調節される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１０）
　前記転写調節因子が転写活性化因子である場合に、前記ＯＦＦ条件が、前記転写活性化因子と結合する誘導因子の非存在下で、かつデオキシチミジン三リン酸(ｄＴＴＰ)のデノボ合成経路の阻害剤の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１１）
　前記転写調節因子が転写活性化因子である場合に、前記ＯＮ条件が、前記転写活性化因子と結合する誘導因子の存在下で、かつ前記毒性物質の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１２）
　前記転写調節因子が転写抑制因子である場合に、前記ＯＮ条件が、前記転写抑制因子と結合する誘導因子の非存在下で、かつ前記毒性物質の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１３）
　前記転写調節因子が転写抑制因子である場合に、前記ＯＦＦ条件が、前記転写抑制因子と結合する誘導因子の存在下で、かつデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１４）
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子が、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１４Ａ）
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子が、ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１５）
　前記デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤が、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（５ＦｄＵ）またはその誘導体である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１６）
　前記毒性物質が抗生物質を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１７）
　前記生物が真核生物である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１８）
　前記生物がピキア酵母である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１８Ａ）
　前記生物が原核生物である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ１９）
　さらに、工程Ｄの後に、該生存する細胞を、マーカー遺伝子の発現量に応じてスクリーニングする工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２０）
　前記生物がピキア酵母であり、前記プロモータがピキア酵母由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２１）
　前記プロモータが、その上流に任意の配列長の任意の配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２１Ａ）
　前記任意の配列が、ＡＲＧ４配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２２）
　前記プロモータが、複数コピー数のオペレータ配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｘ２２Ａ）
　上記項目のいずれか一項に記載の方法によって選抜された遺伝子スイッチを含む遺伝子スイッチライブラリー。
（項目Ｙ１）
　転写調節因子をコードする遺伝子配列の中から転写調節因子をスクリーニングするための組み合わせ物であって、細胞と、毒性前駆物質と、毒性物質と、発現されることにより前記毒性前駆物質を、前記細胞に対する毒性を付与または強化するよう変換させる毒性付与強化遺伝子と、発現されることにより前記細胞に前記毒性物質に対する耐性を付与または強化する耐性付与強化遺伝子と、マーカー遺伝子とを含む組み合わせ物。
（項目Ｙ２）
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質に結合することで前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、上記項目に記載の組み合わせ物。
（項目Ｙ３）
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質に対して触媒活性を有さない、上記項目のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
（項目Ｙ４）
　前記耐性付与強化遺伝子は、遺伝子産物の量に対して化学量論的に前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、上記項目のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
（項目Ｙ５）
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質との結合性を弱める変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
（項目Ｙ６）
　前記耐性付与強化遺伝子はブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）をコードする遺伝子配列を含み、前記変異はＤ２５Ａ変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
（項目Ｙ６Ａ）
　前記ブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）がStreptoalloteichus　hindustanus由来である、上記項目のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
（項目Ｙ７）
　さらに、デオキシチミジン三リン酸(ｄＴＴＰ)のデノボ合成経路の阻害剤を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
（項目Ｙ８）
　さらに、前記転写調節因子と結合する誘導因子を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
（項目Ｙ９）
　前記毒性付与強化遺伝子が、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
（項目Ｙ９Ａ）
　前記毒性付与強化遺伝子が、ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
（項目Ｙ１０）
　前記デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤が、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（５ＦｄＵ）またはその誘導体である、上記項目のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
（項目Ｙ１１）
　前記毒性物質が抗生物質を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
（項目Ｚ１）
　生物における転写調節因子を選抜する方法であって、（Ａ）候補転写調節因子をコードする遺伝子配列を含む発現ベクターを細胞に導入する工程と、（Ｂ）毒性付与強化遺伝子と、耐性付与強化遺伝子と、マーカー遺伝子とを含む融合遺伝子を、該候補転写調節因子と結合するプロモータと作動可能に連結して前記細胞に導入する工程と、（Ｃ）該毒性付与強化遺伝子の遺伝子産物によって毒性が付与または強化される毒性前駆物質の少なくとも１種の濃度の存在下に該細胞を配置し、生存する細胞を選択する工程と、（Ｄ）該細胞に対して毒性を示す毒性物質であって、該耐性付与強化遺伝子の遺伝子産物によって耐性が付与または強化される毒性物質の少なくとも１種の濃度の存在下に該細胞を配置し、生存する細胞を選択する工程と、（Ｅ）（Ｃ）および（Ｄ）で生存した細胞を選択し、含まれる候補転写調節因子をコードする遺伝子配列を転写調節因子として選択する工程とを含む、方法。
（項目Ｚ２）
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質に結合することで前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、上記項目に記載の方法。
（項目Ｚ３）
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質に対して触媒活性を有さない、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ４）
　前記耐性付与強化遺伝子は、遺伝子産物の量に対して化学量論的に前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ５）
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質との結合性を弱める変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ６）
　前記耐性付与遺伝子はブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）をコードする遺伝子配列を含み、前記変異はＤ２５Ａ変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ６Ａ）
　前記ブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）がStreptoalloteichus hindustanus由来である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ７）
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子は、複数の遺伝子が融合された融合遺伝子である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ８）
　前記転写調節因子が転写活性化因子である場合に、前記（Ｃ）における配置が、前記転写活性化因子と結合する誘導因子の非存在下で、かつデオキシチミジン三リン酸(ｄＴＴ
Ｐ)のデノボ合成経路の阻害剤の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいず
れか一項に記載の方法。
（項目Ｚ９）
　前記転写調節因子が転写活性化因子である場合に、前記（Ｄ）における配置が、前記転写活性化因子と結合する誘導因子の存在下で、かつ前記毒性物質の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ１０）
　前記転写調節因子が転写抑制因子である場合に、前記（Ｄ）における配置が、前記転写抑制因子と結合する誘導因子の非存在下で、かつ前記毒性物質の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ１１）
　前記転写調節因子が転写抑制因子である場合に、前記（Ｃ）における配置が、前記転写抑制因子と結合する誘導因子の存在下で、かつデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ１２）
　前記毒性付与強化遺伝子が、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ１２Ａ）
　前記毒性付与強化遺伝子が、ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ１３）
　前記デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤が、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（５ＦｄＵ）またはその誘導体である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ１４）
　前記毒性物質が抗生物質を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ１５）
　前記生物が真核生物である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ１６）
　前記生物がピキア酵母である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ１６Ａ）
　前記生物が原核生物である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ１７）
　前記生物がピキア酵母であり、前記プロモータがピキア酵母由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ１８）
　前記プロモータが、その上流に任意の配列長の任意の配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ１８Ａ）
　前記任意の配列が、ＡＲＧ４配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ１９）
　前記プロモータが、複数コピー数のオペレータ配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｚ１９Ａ）
　上記項目のいずれか一項に記載の方法によって選抜された転写調節因子を含む遺伝子スイッチライブラリー。
（項目Ａ１）
　生物における転写調節因子を選抜するシステムであって、（Ａ）遺伝子スイッチ発現配列および／または該遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子が結合するプロモータにランダムな変異を導入した複数の核酸分子を含むＤＮＡライブラリーと、（Ｂ）該ライブラリーを宿主細胞に導入する手段と、（Ｃ）該プロモータによって発現調節される遺伝子を発現する細胞を死滅させるＯＦＦ条件に該宿主細胞を曝露し、生存する細胞を選択する手段と、（Ｄ）（Ｃ）において該生存する細胞（ＯＦＦ条件で生存する細胞）を、該プロモータによって発現調節される遺伝子を発現しない、及び／または目的の発現レベルに達していない細胞を死滅させるＯＮ条件に曝露し、生存する細胞を選択する手段と、（Ｅ）（Ｄ）において該生存する細胞（ＯＮ条件で生存する細胞）に含まれる該ライブラリーに含まれていたものと同じ核酸配列を有する核酸分子を転写調節因子として選択する手段とを含む、システム。
（項目Ａ１Ａ）
　生物における転写調節因子を選抜するシステムであって、該システムは、遺伝子スイッチ発現配列および／または該遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子が結合するプロモータにランダムな変異を導入した複数の核酸分子を含むＤＮＡライブラリーから該遺伝子スイッチを選抜するものであり、該システムは、（Ｂ）該ライブラリーを宿主細胞に導入する手段と、（Ｃ）該プロモータによって発現調節される遺伝子を発現する細胞を死滅させるＯＦＦ条件に該宿主細胞を曝露し、生存する細胞を選択する手段と、（Ｄ）（Ｃ）において該生存する細胞（ＯＦＦ条件で生存する細胞）を、該プロモータによって発現調節される遺伝子を発現しない、及び／または目的の発現レベルに達していない細胞を死滅させるＯＮ条件に曝露する手段と、（Ｅ）（Ｄ）において該生存する細胞（ＯＮ条件で生存する細胞）に含まれる該ライブラリーに含まれていたものと同じ核酸配列を有する核酸分子を転写調節因子として選択する手段とを含む、システム。
（項目Ａ２）
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子は、前記細胞に対して毒性を示す毒性物質に結合することで前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、上記項目に記載のシステム。
（項目Ａ３）
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子は、前記毒性物質に対して触媒活性を有さない、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ４）
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子は、遺伝子産物の量に対して化学量論的に前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ５）
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子は、前記毒性物質との結合性を弱める変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ６）
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子はブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）をコードする遺伝子配列を含み、前記変異はＤ２５Ａ変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ６Ａ）
　前記ブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）がStreptoalloteichus　hindustanus由来である、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ７）
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子は、複数の遺伝子が融合された融合遺伝子である、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ８）
　前記宿主細胞が、前記遺伝子スイッチ発現配列と、前記プロモータによって発現調節される遺伝子配列とを有する発現ベクターを含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ９）
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子は、前記転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が、前記プロモータのオペレータ配列に結合することによって発現が調節される、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ１０）
　前記転写調節因子が転写活性化因子である場合に、前記ＯＦＦ条件が、前記転写活性化因子と結合する誘導因子の非存在下で、かつデオキシチミジン三リン酸(ｄＴＴＰ)のデノボ合成経路の阻害剤の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ１１）
　前記転写調節因子が転写活性化因子である場合に、前記ＯＮ条件が、前記転写活性化因子と結合する誘導因子の存在下で、かつ前記毒性物質の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ１２）
　前記転写調節因子が転写抑制因子である場合に、前記ＯＮ条件が、前記転写抑制因子と結合する誘導因子の非存在下で、かつ前記毒性物質の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ１３）
　前記転写調節因子が転写抑制因子である場合に、前記ＯＦＦ条件が、前記転写抑制因子と結合する誘導因子の存在下で、かつデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ１４）
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子が、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ１４Ａ）
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子が、ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ１５）
　前記デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤が、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（５ＦｄＵ）またはその誘導体である、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ１６）
　前記毒性物質が抗生物質を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ１７）
　前記生物が真核生物である、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ１８）
　前記生物がピキア酵母である、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ１９）
　さらに、工程Ｄの後に、該生存する細胞を、マーカー遺伝子の発現量に応じてスクリーニングする工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ２０）
　前記生物がピキア酵母であり、前記プロモータがピキア酵母由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ２１）
　前記プロモータが、その上流に任意の配列長の任意の配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ａ２１Ａ）
　前記任意の配列が、ＡＲＧ４配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。（項目Ａ２２）
　前記プロモータが、複数コピー数のオペレータ配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ１）
　生物における転写調節因子を選抜するシステムであって、（Ａ）候補転写調節因子をコードする遺伝子配列を含む発現ベクターを細胞に導入する手段と、（Ｂ）毒性付与強化遺伝子と、耐性付与強化遺伝子と、マーカー遺伝子とを含む融合遺伝子を、該候補転写調節因子と結合するプロモータと作動可能に連結して前記細胞に導入する手段と、（Ｃ）該毒性付与強化遺伝子の遺伝子産物によって毒性が付与または強化される毒性前駆物質の少なくとも１種の濃度の存在下に該細胞を配置し、生存する細胞を選択する手段と、（Ｄ）該細胞に対して毒性を示す毒性物質であって、該耐性付与強化遺伝子の遺伝子産物によって耐性が付与または強化される毒性物質の少なくとも１種の濃度の存在下に該細胞を配置し、生存する細胞を選択する手段と、（Ｅ）（Ｃ）および（Ｄ）で生存した細胞を選択し、含まれる候補転写調節因子をコードする遺伝子配列を転写調節因子として選択する手段とを含む、システム。
（項目Ｂ２）
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質に結合することで前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、上記項目に記載のシステム。
（項目Ｂ３）
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質に対して触媒活性を有さない、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ４）
　前記耐性付与強化遺伝子は、遺伝子産物の量に対して化学量論的に前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ５）
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質との結合性を弱める変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ６）
　前記耐性付与遺伝子はブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）をコードする遺伝子配列を含み、前記変異はＤ２５Ａ変異を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。（項目Ｂ６Ａ）
　前記ブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）がStreptoalloteichus　hindustanus由来である、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ７）
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子は、複数の遺伝子が融合された融合遺伝子である、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ８）
　前記転写調節因子が転写活性化因子である場合に、前記（Ｃ）における配置が、前記転写活性化因子と結合する誘導因子の非存在下で、かつデオキシチミジン三リン酸(ｄＴＴ
Ｐ)のデノボ合成経路の阻害剤の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいず
れか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ９）
　前記転写調節因子が転写活性化因子である場合に、前記（Ｄ）における配置が、前記転写活性化因子と結合する誘導因子の存在下で、かつ前記毒性物質の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ１０）
　前記転写調節因子が転写抑制因子である場合に、前記（Ｄ）における配置が、前記転写抑制因子と結合する誘導因子の非存在下で、かつ前記毒性物質の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ１１）
　前記転写調節因子が転写抑制因子である場合に、前記（Ｃ）における配置が、前記転写抑制因子と結合する誘導因子の存在下で、かつデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤の存在下でのインキュベーションを含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ１２）
　前記毒性付与強化遺伝子が、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ１２Ａ）
　前記毒性付与強化遺伝子が、ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ１３）
　前記デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤が、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（５ＦｄＵ）またはその誘導体である、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ１４）
　前記毒性物質が抗生物質を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ１５）
　前記生物が真核生物である、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ１６）
　前記生物がピキア酵母である、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ１７）
　前記生物がピキア酵母であり、前記プロモータがピキア酵母由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ１８）
　前記プロモータが、その上流に任意の配列長の任意の配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｂ１８Ａ）
　前記任意の配列が、ＡＲＧ４配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。（項目Ｂ１９）
　前記プロモータが、複数コピー数のオペレータ配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目Ｃ１）
　所望の特性を有する生物または細胞を育種する方法であって、前記方法は
Ａ）上記項目のいずれか一項に記載の転写調節因子を選抜する方法を用いて、所望の活性を有する転写調節因子を提供する工程と、
Ｂ）前記転写調節因子を用いて、前記所望の特性を付与することに関与する１または複数の遺伝子を、所望の転写特性を持つように改変する工程と、
Ｃ）工程Ｂで改変された所望の転写特性を有する遺伝子を、目的の細胞に導入する工程と、
Ｄ）工程Ｃで得られた細胞の中から、所望の特性を有する細胞を選択する工程と
を包含する、方法。
（項目Ｃ２）
　所望の特性を有する生物または細胞を育種する方法であって、前記方法は
Ａ）上記項目のいずれか一項に記載の遺伝子スイッチライブラリーを提供する工程であって、前記ライブラリーは、所望の活性を有する転写調節因子を有するように構成される、工程と、
Ｂ）前記転写調節因子を用いて、前記所望の特性を付与することに関与する１または複数の遺伝子を、所望の転写特性を持つように改変する工程と、
Ｃ）工程Ｂで改変された所望の転写特性を有する遺伝子を、目的の細胞に導入する工程と、
Ｄ）工程Ｃで得られた細胞の中から、所望の特性を有する細胞を選択する工程と
を包含する、方法。
（項目Ｃ３）
　所望の物質を生産する生物または細胞を育種する方法であって、前記方法は
Ａ）上記項目のいずれか一項に記載の転写調節因子を選抜する方法を用いて、所望の活性を有する転写調節因子を提供する工程と、
Ｂ）前記転写調節因子を用いて、前記物質の生合成に関与する１または複数の遺伝子を、所望の転写特性を持つように改変する工程と、
Ｃ）工程Ｂで改変された所望の転写特性を有する遺伝子を、目的となる細胞に導入する工程と、
Ｄ）工程Ｃで得られた細胞の中から、所望の特性を有する細胞を選択する工程と
を包含する、方法。
（項目Ｃ４）
　上記項目のいずれか一項に記載の転写調節因子を選抜する方法を行う工程を含む、所望のプロモーターを生産する方法であって、該遺伝子スイッチの選抜において、所望の活性を有するものを選抜することを包含する、方法。
（項目Ｃ５）
　上記項目のいずれか一項に記載の転写調節因子を選抜する方法を行う工程を含む、所望のプロモーターを生産する方法であって、該転写調節因子の選抜において、所望の細胞において活性を有するものを選抜することを包含する、方法。
（項目Ｃ６）
　所望の特性を有する生物または細胞を選抜する方法であって、
Ａ）上記項目のいずれか一項に記載の遺伝子スイッチライブラリーを提供する工程であって、前記ライブラリーは、目的の代謝化合物に応答する転写調節因子を有するように構成される、工程と、
Ｂ）前記転写調節因子を用いて、前記目的の代謝化合物への応答性を付与することに関与する１または複数の遺伝子を、所望の転写特性を持つように改変する工程と、
Ｃ）工程Ｂで改変された所望の転写特性を有する遺伝子を、目的の細胞に導入する工程と、
Ｄ）工程Ｃで得られた細胞の中から、所望の特性を有する細胞を選択する工程と
を包含する、方法。
（項目Ｃ７）
　前記細胞は、真核生物由来の細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ８）
　前記細胞は、酵母を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ９）
　前記細胞は、原核生物由来の細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ１０）
　前記細胞は、細菌を含み、必要に応じて前記細菌は放線菌、大腸菌、枯草菌、糸状菌、および微細藻類を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。

　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

　なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。

　本開示の方法により、高効率に性能の高い遺伝子スイッチ・センサを取得することができる。特に酵母において改良型の遺伝子スイッチ・センサ、およびそれを利用した遺伝子スイッチ系を構築することができる点が有利である。

図１は、本開示の一実施形態における遺伝子スイッチ・センサを作出する方法のワークフローを説明する模式図である。図１Ａでは、コアプロモーターとオペレーター配列を融合させた合成プロモーター（ｓｙｎＰ）を示す。図１Ｂでは、遺伝子スイッチライブラリーからの所望の性質をもつ遺伝子スイッチの選抜手法を示した。図２は、本開示の一実施形態において用いたＴＢ_Ｄ２５ＡＧの性能を評価した結果を示す模式図である。（Ａ）Ｔｅｔ－ＯＮ制御されたＴＢ_Ｄ２５ＡＧ遺伝子発現の模式図を示す。ヌクレオシド（５ＦｄＵまたはｄＰ）はｈＥＮＴ１を介して組み込まれ、ＴＢ_Ｄ２５ＡＧのキナーゼ活性によって毒素化される。ゼオシンは細胞に対して抗生物質活性を示すが、これはＴＢ_Ｄ２５ＡＧの発現によって緩和される。ＴＢ_Ｄ２５ＡＧの発現レベルは、ＧＦＰ蛍光により定量することができる。（Ｂ～Ｄ）ＴＢ_Ｄ２５ＡＧの機能を示す。Ｔｅｔ－ＯＮシステムの制御下でのＴＢ_Ｄ２５ＡＧの染色体発現を、（Ｂ）細胞ＧＦＰ蛍光、（Ｃ）ゼオシン含有培地中での細胞生存率、または（Ｄ）５ＦｄＵ含有培地中での細胞生存率によって測定した。エラーバーは、３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。図３は、本開示の一実施形態における改良したＴｅｔ－ＯＮ型遺伝子スイッチのＳ／Ｎ比を示す。図４は、本開示の一実施形態において開発した種々の遺伝子スイッチの変異箇所とそのＳ／Ｎ比を示す。図５は、本開示の一実施形態において開発した遺伝子スイッチを用いたＦＰＰからβ－カロテンへのフラックス制御を示す模式図である。図６は、本開示の一実施形態において進化させたＤＡＰＧ－ＯＮスイッチのｒＰｈｌＴＡ発現カセットに見出されたヌクレオチドおよびアミノ酸（ＡＡ、括弧内に示す）変異を示す。図７は、本開示の一実施形態において進化させたＨＳＬ－ＯＮスイッチのＬｕｘＴＡ発現カセットに見出されたヌクレオチドおよびアミノ酸（ＡＡ、括弧内に示す）の変異を示す。図８は、本開示の一実施形態において開発したピキア酵母における遺伝子スイッチの模式図である。図９は、本開示の一実施形態におけるピキア酵母の遺伝子スイッチにおいて、ｐｈｌＯのコピー数の変化と発現量の変化との関係を示すグラフである。

　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。

　本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。

　本明細書において、「遺伝子スイッチ」または「遺伝子スイッチ・センサ」とは、交換可能に使用され、転写調節ドメインを含有する因子（例えば、分子、その複合体、またはそれらの融合物等）であって、対象となる遺伝子を構成する核酸に相互作用（例えば、結合）することにより当該因子を活性化し得る物質(例えば、活性化物質、または誘導因子)が相互作用（例えば、結合）する部位を有するものをいう。本明細書において、「遺伝子スイッチ」は「転写調節因子」と呼ぶ場合があり、相互互換的に使用することができる。このような因子は、誘導物質（活性化物質、または誘導因子）の相互作用（例えば、結合や解離）により活性が調節され、その機能を変化させることができる。遺伝子スイッチに誘導物質（活性化物質、または誘導因子）が相互作用（例えば、結合）することにより、遺伝子スイッチの標的配列へのその相互作用（例えば、結合）の程度または状態が変化し、その結果、目的の遺伝子の発現が抑制または誘導される。例えば、本明細書における「遺伝子スイッチ」は、転写活性化ドメインを含有する分子であって、結合することにより当該分子を活性化し得る物質（例えば、活性化物質、または誘導因子）が結合する部位を有し、該物質の結合により標的配列への結合もしくは解離が生じる分子が例示される。

　また本明細書において、「遺伝子スイッチ系」とは、上記のような遺伝子スイッチを用いた系の全体、すなわち転写調節因子とその結合配列（発現制御配列や調節ＤＮＡエレメントなど）、さらにはその下流のプロモータまでを含む全体を指す。

　本明細書において、「遺伝子スイッチ発現配列」は、遺伝子スイッチ（転写調節因子）がタンパク質またはポリペプチドの場合、その遺伝子スイッチをコードする核酸配列を意味する。

　本明細書において、「遺伝子スイッチの活性化物質」は、遺伝子スイッチ（転写調節因子）に相互作用（例えば、結合）することにより遺伝子スイッチを活性化させ、またはその機能を変化させ、その結果、直接的または間接的に、１または複数の遺伝子の発現の調節を誘導する物質をいい、例えばそのような化合物を意味する。本明細書において、「活性化物質」は「誘導因子」または「誘導物質」と呼ぶ場合があり、相互互換的に使用することができる。活性化物質は、遺伝子スイッチ（転写調節因子）ごとに異なるものとすることもできる。遺伝子スイッチと活性化物質との組み合わせとしては、例えば、ｒｔｅｔＴＡとＤｏｘ、ＣａｍＴＡとＤ－Ｃａｍｐｈｏｒ、ＰｈｌＴＡとＤＡＰＧ、ＬｕｘＴＡとＨＳＬなどを挙げることができる。

　本明細書において、「遺伝子スイッチの標的配列」は、目的のタンパク質をコードする遺伝子の５’上流に位置する核酸配列であって、標的遺伝子の転写を制御する核酸配列または調節ＤＮＡエレメントをいい、好ましくはプロモータ活性を有し、プロモータ配列や、オペレーター配列とコアプロモータとが融合された人工プロモータであってもよい。好ましくは、エンハンサが、遺伝子スイッチ（転写調節因子）の標的配列に間接的にまたは直接的に作用されることもできる。標的配列への遺伝子スイッチ（転写調節因子）の作用は誘導物質の添加により調節されることができ、それにより標的遺伝子の発現が制御され、標的配列に遺伝子スイッチ（転写調節因子）が作用しないと標的遺伝子は発現しない。例えば、遺伝子スイッチｒｔｅｔＴＡは、その活性化物質Ｄｏｘの添加により、その標的配列ｔｅｔＯプロモータ（ｔｅｔＯを含む人工プロモータ）に作用し、該プロモータの下流に位置する標的遺伝子の転写を促進する。

　本明細書において、「プロモータ」とは、遺伝子の転写開始を制御し、またその転写の程度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼの結合により転写を開始する核酸配列をいう。プロモータは、使用する宿主細胞の種によって適宜選択して使用されることができる。酵母を宿主として使用する場合、プロモータとして、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを使用してもよい。例えば、プロモータとして、ＧＡＬ１プロモータ、ＧＡＬ１０プロモータ、ヒートショックタンパク質プロモータ、ＭＦα１プロモータ、ＰＨＯ５プロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＧＡＰプロモータ、ＡＤＨプロモータ、ＴＤＨプロモータ、ＤＡＳ１、およびＡＯＸ１プロモータなどを挙げることができる。

　遺伝子スイッチ（転写調節因子）の選抜において、遺伝子発現がＯＮであるべき条件下で起動状態にあるものを選抜し（ＯＮ選抜）、および／またはＯＦＦであるべき条件下で抑制状態にあるものを選抜すること（ＯＦＦ選抜）により、任意の出力特性をもつ遺伝子スイッチ（転写調節因子）を取得することができる。このＯＮ／ＯＦＦ選抜を連続して行うことで、さまざまな遺伝子スイッチ（転写調節因子）を迅速に開発することができる。

　本明細書において、「ＯＮ選抜」または「ＯＮ条件」とは、遺伝子発現がＯＮであるべき条件下で起動状態にあるものを選抜すること、またはその条件をいい、例えば遺伝子スイッチ（転写調節因子）がＯＮ（起動状態）である条件下で、遺伝子発現がＯＦＦ（抑制状態）にある遺伝子スイッチ（転写調節因子）、及び／または目標とする起動レベルには達していない起動状態にある遺伝子スイッチ（転写調節因子）を除去することによる選抜をいうことができる。ＯＮ条件には、プロモータによって発現調節される遺伝子を発現しない、及び／または目標とする量の発現をしない細胞を死滅させる条件が含まれる。ＯＮ選抜を行うには、例えば、選抜対象となる遺伝子スイッチ（転写調節因子）の制御下に、「発現しないと宿主細胞が生存できない」、及び／または「目標とする量だけ発現しないと宿主細胞が生存できない」遺伝子を配置する手法を挙げることができる。遺伝子スイッチがＯＮ（起動状態）である条件下で起動せずに下流の遺伝子を発現できない遺伝子スイッチ（転写調節因子）、及び／または目標とする起動レベルには達していない起動状態にある遺伝子スイッチ（転写調節因子）は、それを導入した細胞が死滅などすることにより除去することができる。ＯＮ選抜では、遺伝子スイッチ（転写調節因子）の作用により発現調節される遺伝子が発現することにより、及び／または目標とする量だけ発現することより、細胞死を回避することができる。

　本明細書において、「ＯＦＦ選抜」または「ＯＦＦ条件」とは、遺伝子発現がＯＦＦであるべき条件下で抑制状態にあるものを選抜すること、またはその条件をいい、例えば遺伝子スイッチ（転写調節因子）がＯＦＦ（抑制状態）である条件下で、下流の遺伝子が発現してしまう遺伝子スイッチ（転写調節因子）、つまり漏出発現（リーク発現）のある遺伝子スイッチ（転写調節因子）を除去することによる選抜をいうことができる。ＯＦＦ条件には、プロモータによって発現調節される遺伝子を発現する細胞を死滅させる条件が含まれる。ＯＦＦ選抜を行うには、例えば、選抜対象である遺伝子スイッチ（転写調節因子）の制御下に、「発現すると、宿主細胞の細胞死を起こす」遺伝子を配置する手法を挙げることができる。遺伝子スイッチ（転写調節因子）がＯＦＦ（抑制状態）である条件下で、下流の遺伝子を発現させてしまう（リーク発現をさせてしまう）遺伝子スイッチ（転写調節因子）は、それを導入した細胞が死滅などすることにより除去することができる。ＯＦＦ選抜では、遺伝子スイッチ（転写調節因子）の作用により発現調節される遺伝子の発現がＯＦＦ（減弱または消失）であるときに細胞死を回避することができる。

　本明細書において、「転写調節因子」は、プロモータなどの調節ＤＮＡエレメントに作用して働くタンパク質をいう。転写調節因子は転写抑制因子（リプレッサ）および転写活性化因子（アクチベータ）に大別される。転写抑制因子は調節ＤＮＡエレメントに作用して遺伝子の転写を抑制し、遺伝子の発現量を低減させることができる。転写活性化因子は調節ＤＮＡエレメントに作用して遺伝子の転写を促進し、遺伝子の発現量を増加させることができる。本開示の一実施形態において、転写抑制因子および転写活性化因子は公知の各因子を使用することができる。転写調節因子が作用する調節ＤＮＡエレメントの下流に配置された遺伝子配列は、転写調節因子の作用によりその発現が抑制または促進される。遺伝子の発現とは、遺伝子の情報がｍＲＮＡに転写され、さらに該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列として翻訳される一連の過程を意味する。発現が促進されれば遺伝子によりコードされるタンパク質が産生されてその量が増大し、発現が抑制されれば遺伝子によりコードされるタンパク質は産生されずその量は減少する。

　本明細書において、「候補転写調節因子」とは、転写調節因子の候補となり得る因子である。

　本明細書において、「誘導因子」、「誘導物質」または「誘導剤」とは、転写調節因子と結合することにより、転写調節因子を活性化させ、または不活性化させ、またはその機能を変化させ、その結果、１または複数の遺伝子の直接的または間接的な発現を調節することができる因子をいう。

　本明細書において、「ＤＮＡライブラリー」とは、天然から単離された核酸配列または合成の核酸配列を含む、核酸ライブラリーである。天然から単離された核酸配列の供給源としては、真核生物細胞、原核生物細胞、またはウイルス由来のゲノム配列やｃＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。天然から単離された配列に、任意の配列（例えば、シグナル、タグなど）を付加したライブラリーもまた、本開示のＤＮＡライブラリーに含まれる。

　本明細書において、「宿主細胞」とは、異種（例えば、外因性）核酸またはタンパク質が導入された細胞を指す。宿主細胞には、特定の対象細胞だけでなく、当該細胞の子孫も含むことができる。宿主細胞は原核生物細胞または真核生物細胞を含み、異種の核酸またはタンパク質を受容して産生するために適切な形質を有する任意の細胞である。例えば、原核生物および真核生物の細胞、細菌細胞、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合物が含まれる。

　本明細書において、「発現ベクター」とは、宿主細胞に外部遺伝子を運搬するベクターＤＮＡであって、宿主細胞中で目的遺伝子を発現させ得るＤＮＡをいう。ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択することができる。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡを抽出して得られたベクターＤＮＡの他、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているベクターＤＮＡでもよい。代表的なベクターＤＮＡとして、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、およびウイルス由来のベクターＤＮＡを挙げることができる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどを使用することができる。バクテリオファージＤＮＡとしては、λファージなどを挙げることができる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとしては、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスなどの動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルス由来のベクターを挙げることができる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡなどを挙げることができる。あるいは、これらを組み合わせて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組み合わせて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミドなど）を挙げることができる。ベクターＤＮＡには、目的遺伝子が発現されるように目的遺伝子を組み込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子と調節ＤＮＡエレメント、例えばプロモータとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組み合わせて公知の手法によりベクターＤＮＡに組み込むことができる。このような遺伝子配列として、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）を挙げることができる。これらから選択した１種類または複数種類の遺伝子配列をベクターＤＮＡに組み込むことができる。

　本明細書において、「融合遺伝子」とは、人工的にまたは自然に複数の遺伝子が連結されて生じる新たな遺伝子のことをいい、染色体の転座、挿入、逆位などの組換えの結果生じるものも含まれる。また、融合遺伝子は、融合タンパク質をコードしていることもある。融合遺伝子として機能的なタンパク質を生じさせることができるものであれば、融合遺伝子において連結される遺伝子の数は特に限られるものではない。融合遺伝子における各遺伝子の向きも特に限定されず、すべてがフォワード（本来の転写の向き）、すべてがリバース（本来の転写の向きと逆向き）、及びフォワードとリバースとの組み合わせのいずれであってもよい。また融合遺伝子において、各遺伝子はいずれの位置で連結されていてもよい。本明細書における「融合遺伝子」は、異なる遺伝子が連結しているものだけではなく、同一の遺伝子同士が連結しているものも含まれる。

　本明細書において、「作動可能に連結」とは、核酸にコードされたポリペプチドが、プロモーターなどのエレメントによる制御下に当該ポリペプチドの生物学的活性を示す状態で発現するようにエレメントに連結されていることを意味する。本明細書において、「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子に隣接する発現制御配列または調節ＤＮＡエレメント、および目的の遺伝子を制御するためにトランスで、または距離をおいて作用する発現制御配列または調節ＤＮＡエレメントのいずれも含む。

　本明細書において、「ランダムな変異」とは、核酸配列において変異がランダムに入っていること、およびそのような変異を指し、変異の数は１個であってもよいし、２個以上であってもよい。ランダムな変異における変異は、人工的に導入されたものであってもよく、または自然に発生した突然変異でもよい。

　本明細書において、「毒性物質」とは、細胞などの標的に対して、当該標的の生存や増殖に害を与える（死滅させることを含む）か、またはその生存や増殖を抑制させる性質を有する物質をいい、抗生物質であってもよい。

　本明細書において、「毒性前駆物質」とは、それ自体では毒性を備えていないか、または備えていたとしても細胞などの標的に対して当該標的の生存や増殖に害を与えるものではないが、他の物質との結合やリン酸化などの内部または外部の要因により、毒性物質に変化するものをいう。

　本明細書において、「毒性付与強化遺伝子」とは、発現されることにより前記毒性前駆物質を、前記細胞に対する毒性を付与または強化するよう変換させる核酸配列または核酸分子をいう。

　本明細書において、「耐性付与強化遺伝子」とは、発現されることにより前記細胞に前記毒性物質に対する耐性を付与または強化する核酸配列または核酸分子をいう。例えば、毒性物質に結合することで前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生するものであってもよい。好ましくは、耐性付与強化遺伝子は、毒性物質に対して触媒活性を有さないか、毒性物質に対して触媒活性を有するものを発現しないものが有利である。あるいは、例えば、遺伝子産物の量に対して化学量論的に前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生するものであってもよい。あるいは、例えば毒性物質との結合性を弱める変異を含むものであってもよい。

　本明細書において、「マーカー遺伝子」とは、細胞内で翻訳されて、マーカーとして機能し、特定の条件を満たした細胞種の判別を可能にする任意のタンパク質をコードする遺伝子をいう。細胞内で翻訳されてマーカーとして機能しうるタンパク質であれば特に限られるものではなく、例えば、蛍光、発光、または呈色を示すもの、あるいは蛍光、発光、または呈色を補助することなどにより、視覚化し、定量化することができるタンパク質が含まれる。蛍光タンパク質としては、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰなどの青色蛍光蛋白質；ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰなどのシアン蛍光タンパク質；ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ（例えば、ｈｍＡＧ１）、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ｍＵｋＧ（Ｕｍｉｋｉｎｏｋｏ　Ｇｒｅｅｎ）などの緑色蛍光タンパク質；ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ－ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａなどの黄色蛍光タンパク質；ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ　（例えば、ｈｍＫＯ２）、ｍＯｒａｎｇｅなどの橙色蛍光タンパク質；ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、などの赤色蛍光タンパク質；ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ、ＫｅｉｍａＲｅｄ（例えば、ｈｄＫｅｉｍａＲｅｄ）、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍなどの近赤外蛍光タンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。

　本明細書において、「組み合わせ物」とは、細胞、化合物、または遺伝子などの因子を組み合わせたものをいい、組み合わせ物には任意の因子を含むことができる。組み合わせ物は必ずしも組成物などの形態である必要はなく、その組み合わせ物を構成する各因子が別個のものとして存在していてもよく、例えばキットなども含むことができる。

　本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいい、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」を指すことがある。

　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。

　（遺伝子スイッチの作出）
　本開示の一局面において、生物における遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜する方法であって、（Ａ）遺伝子スイッチ発現配列および／または該遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子が結合するプロモータにランダムな変異を導入した複数の核酸分子を含むＤＮＡライブラリーを提供する工程と、（Ｂ）該ライブラリーを宿主細胞に導入する工程と、（Ｃ）該プロモータによって発現調節される遺伝子を発現する細胞を死滅させるＯＦＦ条件に該宿主細胞を曝露し、生存する細胞を選択する工程と、（Ｄ）該生存する細胞を、前記プロモータによって発現調節される遺伝子を発現しない細胞を死滅させるＯＮ条件に曝露し、生存する細胞を選択する工程と、（Ｅ）該生存する細胞に含まれる遺伝子（ライブラリーに含まれていたものと同じ核酸配列を有する核酸分子）を遺伝子スイッチ（転写調節因子）として選択する工程とを含む、方法が提供される。ここで使用されるＤＮＡライブラリーは、多様な性能を持つ。

　本開示の一実施形態において、遺伝子スイッチ（転写調節因子）、およびそれを利用した遺伝子スイッチ系は、有用タンパク質の大量生産に応用でき、タンパク質の生産においては、例えば、大腸菌などの宿主細胞に異種生物から得た標的タンパク質を強制発現させる手法が用いられる。宿主細胞にとって毒性を示すタンパク質を生産させる場合、宿主細胞を充分な数まで増殖させて、適切なタイミングで発現を誘導して強制発現させる。したがって、本開示の一実施形態に係る遺伝子スイッチ（転写調節因子）は、非誘導時の基底発現レベルが充分低く（すなわち、漏出発現が小さいこと）、および発現が誘導（ＯＮ）されたときに充分な遺伝子発現を行う（すなわち、ＯＮ／ＯＦＦ時の発現レベル比が大きいこと）ものである。

　また他の実施形態において、本開示の遺伝子スイッチ（転写調節因子）は、誘導因子の濃度が低い場合にも高感度に下流の遺伝子の発現を調節することができるものである。

　他の実施形態において、遺伝子スイッチ、およびそれを利用した遺伝子スイッチ系は、代謝工学の手段として使用することができる。代謝工学では、複数の酵素遺伝子を１つの宿主細胞の中で同時に発現させ、ある目的物質の生合成経路を構築する。構築した人工の生合成経路において最高の成果、例えば、バイオマスあたりの最終生成物の収量最大化、副産物の最少化などを目指す場合には、個々の遺伝子の発現レベルを詳細に、かつ独立して調節することが必要となる。そのため、本開示の一実施形態において、望みどおりのＯＮ／ＯＦＦ切り替え特性をもち、複数の遺伝子の発現調節をひとつの細胞で同時に行う場合に、１つの遺伝子スイッチ（転写調節因子）の誘導物質が別の遺伝子スイッチ、およびそれを利用した遺伝子スイッチ系を誤作動させることなく、それぞれの遺伝子スイッチ（転写調節因子）による発現量を連続的に調節することができる遺伝子スイッチ（転写調節因子）を提供することができる。

　他の実施形態において、本開示の遺伝子スイッチ・センサ、およびそれを利用した遺伝子スイッチ系は、目的の代謝産物をＨＰＬＣやＧＣＭＳなどの分析手法を用いずに、ＧＦＰ等で簡便かつ高速な生産量（濃度）測定を行うことができる。本開示の遺伝子スイッチ・センサ、およびそれを利用した遺伝子スイッチ系をメタボライトセンサとして用いる場合には、高感度化させた遺伝子スイッチ・センサ、およびそれを利用した遺伝子スイッチ系を用いて生産量が低い化合物を測定するだけではなく、低感度化させた遺伝子スイッチ・センサ、およびそれを利用した遺伝子スイッチ系を用いて生産量が高くなってきた株の生産量を測定することもでき、本開示の方法によれば、その感度調整を容易に行うことができる。

　本開示の一実施形態において、ＤＮＡライブラリーは公知の種々の方法を用いて作製することができ、遺伝子スイッチ発現配列および／または該遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子が結合するプロモータにランダムな変異が導入されているものであれば特に限られるものではない。本開示の一実施形態において、このようなＤＮＡライブラリーを宿主細胞に導入する場合には、宿主細胞に発現ベクターを導入することによって行うことができる。また他の実施形態において、発現カセット（フラグメント）をゲノムに組み込むこともできる。「発現ベクター」は、宿主細胞に外部遺伝子を運搬するベクターＤＮＡであって、宿主細胞中で目的遺伝子を発現させ得るＤＮＡをいう。ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択することができる。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡを抽出して得られたベクターＤＮＡの他、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているベクターＤＮＡでもよい。代表的なベクターＤＮＡとして、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、およびウイルス由来のベクターＤＮＡを挙げることができる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどを使用することができる。バクテリオファージＤＮＡとしては、λファージなどを挙げることができる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとしては、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルスなどの動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルス由来のベクターを挙げることができる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡなどを挙げることができる。あるいは、これらを組み合わせて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組み合わせて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミドなど）を挙げることができる。ベクターＤＮＡには、目的遺伝子が発現されるように目的遺伝子を組み込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子と調節ＤＮＡエレメント、例えばプロモータとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組み合わせて公知の手法によりベクターＤＮＡに組み込むことができる。このような遺伝子配列として、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）を挙げることができる。これらから選択した１種類または複数種類の遺伝子配列をベクターＤＮＡに組み込むことができる。

　ベクターＤＮＡに目的遺伝子を組み込む方法は、公知の遺伝子工学的技術を適用することができる。例えば、目的遺伝子を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼにより再結合する手法を用いることもできる。あるいは、目的遺伝子に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても所望のベクターＤＮＡを得ることができる。

　宿主細胞への発現ベクターの導入方法は、宿主細胞にベクターＤＮＡを導入して宿主細胞中で目的遺伝子を発現させ得る導入方法であれば特に限定されず、宿主細胞の種により適宜選択した公知の方法のいずれを使用してもよい。例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法などを挙げることができる。

　本開示の一実施形態において、プロモータによって発現調節される遺伝子を発現する細胞を死滅させるＯＦＦ条件、および／またはプロモータによって発現調節される遺伝子を発現しない細胞を死滅させるＯＮ条件は、例えば、人工または天然のプロモータの下流に、チミジンキナーゼ（例えば、ｈｓｖＴＫ）、毒性物質に結合することで該毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物産生遺伝子（例えば、ｂｌｅ（ブレオマイシン耐性タンパク質））、及び蛍光タンパク質産生遺伝子（例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質））を融合したレポーター遺伝子を作動可能に連結した発現カセットを細胞に導入して行うことができる。例えば、ｈｓｖＴＫは５ＦｄＵやｄＰなどの人工核酸をリン酸化して細胞毒性を付与するため、当該遺伝子カセットを含む発現ベクターを形質転換した細胞は、５ＦｄＵやｄＰなどの人工核酸の存在時にｈｓｖＴＫを発現すると死滅する（ＯＦＦ選抜）。

　一方、上記発現ベクターを形質転換した細胞は、例えば、毒性物質として抗生物質であるゼオシンの存在化であっても、ｂｌｅを発現することでゼオシンへの耐性を獲得し、生存することができる（ＯＮ選抜）。

　本開示の一実施形態において、発現配列と遺伝子スイッチ（転写調節因子）とを同一の発現ベクターに含む必要はなく、上記融合レポーター遺伝子の発現配列を含む発現ベクターと、遺伝子スイッチ（転写調節因子）を含む発現ベクターとを同一の細胞に共形質転換することにより実施することもできる。

　本開示の一実施形態において、チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列は、特に限定されず、哺乳動物細胞やウイルス由来のチミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を挙げることができ、ヒトヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ、大腸菌由来のチミジンキナーゼ、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｐｏｐｈｉｌａ）由来のヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子配列を用いることもできる。より好ましくは、ヒトヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ（ｈｓｖＴＫ）をコードする遺伝子配列を用いることができる。また、野生型チミジンキナーゼの遺伝子配列の他、該遺伝子配列において１個以上、例えば１～約１００個、好ましくは１～約３０個、より好ましくは１～約２０個、さらに好ましくは１～約１０個、さらにより好ましくは１個～数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入などの変異が存在する遺伝子配列であって、野生型チミジンキナーゼと同質のキナーゼ活性を示すタンパク質をコードする遺伝子配列を使用することもできる。変異体のキナーゼ活性は、野生型キナーゼと比較して、同等または高いことが好ましい。変異体をコードする遺伝子配列における変異の程度およびそれらの位置などは、該変異を有する遺伝子配列が野生型チミジンキナーゼの遺伝子配列と同質のキナーゼ活性を示すタンパク質をコードする遺伝子配列である限り特に制限されない。変異を導入する手段は公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、またはポリメラーゼ連鎖反応などを単独でまたは適宜組合せて使用することができる。

　チミジンキナーゼ（ＴＫ）は、デオキシチミジンのリン酸化反応を触媒する酵素であり、ＤＮＡ合成の調節因子として重要な役割を果たす。人工核酸である５ＦｄＵやｄＰは、他のヌクレオシドと同様に、チミジンのサルベージ経路を経由してゲノムに取り込まれる。５ＦｄＵやｄＰはゲノムに取り込まれて遺伝子変異を頻発する変異原性ヌクレオシドである。したがって、チミジンキナーゼを発現する細胞は、５ＦｄＵやｄＰの添加により細胞死が誘導されるが、チミジンキナーゼを発現しない細胞では、５ＦｄＵやｄＰを添加しても細胞死は誘導されない。

　本開示の一実施形態において、変異原性ヌクレオシドは、遺伝子に取り込まれたときに遺伝子に変異を生じて細胞死を誘導するものであれば特に限定されず、天然に存在する変異原性ヌクレオシドであってもよく、人工的に作成されたものであってもよい。変異原性ヌクレオシドの濃度は、遺伝子に取り込まれたときに遺伝子に変異を生じて細胞死を誘導する濃度であれば特に限定されず、簡単な繰り返し実験により決定できる。例えば、ｄＰは、５０ｎＭ～１μＭ、より好ましくは１００ｎＭの濃度で使用する。変異原性ヌクレオシドと細胞とのインキュベーション時間は、細胞死が生じるような時間であれば特に限定されるものではなく、簡単な繰り返し実験により決定できる。ｄＰを用いる場合、ｄＰと細胞とのインキュベーションは、変異原性ヌクレオシドによる変異に起因する細胞死が惹起される時間であればよく、例えば約５分間～約２４時間、好ましくは約１５時間～約２４時間とすることができる。

　本開示の一実施形態において、さらに、デオキシチミジン三リン酸(ｄＴＴＰ)のデノボ合成経路の阻害剤を含むことができる。デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤は、デノボ合成経路を阻害してｄＴＴＰの産生を阻害し得る化合物であれば特に限定されず、例えば、５－フルオロウラシルおよびその誘導体を挙げることができる。より具体的には、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（５ＦｄＵ）を挙げることができる。５－フルオロウラシルおよびその誘導体の濃度は、ｄＴＴＰのデノボ合成経路を阻害し得る濃度であればよく、簡単な繰り返し実験により決定できる。例えば、５ＦｄＵは、５０ｎＭ～１μＭ、好ましくは１００ｎＭの濃度で使用することができる。ｄＴＴＰのデノボ合成経路の阻害剤と細胞とのインキュベーション時間は、細胞死が生じるような時間であれば特に限定されるものではなく、簡単な繰り返し実験により決定できる。

　本開示の一実施形態において、ｄＰおよび５ＦｄＵなどの人工核酸を細胞に取り込ませるために、細胞に広基質ヌクレオシドトランスポーター（平衡ヌクレオシドトランスポーター１（ＥＮＴ１））（例えば、ヒト平衡ヌクレオシドトランスポーター１（ｈＥＮＴ１））をコードする遺伝子をクローニングし、染色体に組み込むこともできる。例えば天然の酵母細胞はこれらの人工核酸を取り込むことができないため、このようなトランスポーターを組み込むことで、ヌクレオチドの取り込みを促進させることができる。本開示の一実施形態において、このようなトランスポーターは、１コピーだけクローニングしてもよく、または２コピー、３コピー、５コピー、７コピー、１０コピーなど複数のトランスポーターをクローニングすることもでき、複数コピーをクローニングした場合には、スクリーニング効率が高まる（エスケープする細胞を排除できる）という利点も期待できる。

　本開示の一実施形態において、毒性物質に結合することで該毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物は、抗生物質などの毒性物質による細胞への毒性を減弱させることができるものであればよく、例えば、ｂｌｅ（ブレオマイシン耐性タンパク質）などを用いることができる。望ましくは、液体培養でのＯＮ選抜が可能であり、薬剤濃度の違いにより選抜するレポーター発現強度の域値を変えることができるものであり、結合性を弱める変異を含むことができ、例えばｂｌｅの場合、Ｄ２５Ａなどの変異を加えて選抜感度を調節することもできる。

　一実施形態において、ＯＦＦ選抜にはｈｓｖＴＫ、ＯＮ選抜にはｂｌｅが好ましいが、他のレポーター遺伝子であても、本開示で示される所望の効果を発揮する限り、いずれのレポーター遺伝子をも用いることができる。

　本開示の一実施形態において、融合レポーターとして、融合タンパク質（ｈｓｖＴＫ－Ｂｌｅ－ＧＦＰ（ＴＢＧ）を用いることができる。ＴＢＧをコードする遺伝子には、ＯＮ状態のセレクターとしてＳｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ　ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ由来のゼオシン耐性遺伝子（ｂｌｅ）が含まれている。このタンパク質は、酵母におけるプラスミド維持および組換えのための陽性選択マーカーとして広く用いられている。Ｂｌｅ二量体は抗生物質を１：１のモル比で結合・隔離することでゼオシンを不活性化することができる。したがって、細胞のゼオシン耐性はＢｌｅの発現レベルを直接反映しているといえる。この選択機構があることにより、ゼオシンの量を変えるだけで、スイッチ出力（ＴＢＧ発現）の選択閾値を自由に設定できることとなる。

　本開示の一実施形態において、上記のようなチミジンキナーゼなどを含むＯＮ選抜またはＯＦＦ選抜用のレポーター遺伝子配列の上流に該遺伝子配列に作動可能に連結されるプロモータ配列は、これらのレポーター遺伝子を発現させる機能を有し、かつ試験される遺伝子スイッチ（転写調節因子）の遺伝子産物が作用するプロモータ配列であれば特に限定されず、公知のプロモータ配列を使用することができる。

　本開示の一実施形態において、上記のようなレポーター遺伝子配列と前記プロモータ配列とを、公知の遺伝子工学的技術を用いて、公知の発現ベクターにクローニングすることにより、遺伝子スイッチ（転写調節因子）のスクリーニングに使用される発現ベクターを作成することができる。

　このような発現ベクターは、これら配列に加えて、蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列をさらに含むことが好ましい。蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現ベクター内に配置することにより、レポーター遺伝子の発現の有無によるＯＮ選抜およびＯＦＦ選抜を実施する場合に、該発現ベクター内のプロモータの起動状態を蛍光タンパク質の発現の有無により視認することができる。蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列は、細胞内で蛍光を発することができるタンパク質をコードするものであれば特に限定されないが、緑色蛍光タンパク質(Green　Fluorescence　Protein、GFP)、黄色蛍光タンパク質(Yellow　FluorescenceProtein、YFP)、シアン蛍光タンパク質(Cyan　FluorescenceProtein、CFP)、および青色蛍光タンパク質(BlueFluorescence　Protein、CFP)、並びにこれら蛍光タンパク質の変異体、例えば、UV最適化緑色蛍光タンパク質(UV-optimized　Green　Fluorescence　rotein、GFPuv)、強化緑色蛍光タンパク質(Enhanced　Green　Fluorescence　Protein、EGFP)、強化黄色蛍光タンパク質(Enhanced　Yellow　Fluorescence　Protein、EYFP)、強化シアン蛍光タンパク質(Enhanced　Cyan　Fluorescence　Protein、ECFP)、および青色蛍光タンパク質(Enhanced　Blue　Fluorescence　Protein、ECFP)を挙げることができる。

　本開示の一実施形態において、上記のようなチミジンキナーゼをコードする遺伝子配列、毒性物質に結合することで前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物をコードする遺伝子配列、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列を含む発現ベクターとして、これらの遺伝子配列を含むプラスミドを用いることもできる。他の実施系多において、これらの遺伝子配列を融合レポーター遺伝子として、発現ベクターに導入することもできる。

　本開示において使用される細胞は、特に限定されるものではなく、酵母や大腸菌などの種々の細胞を用いることができる。本開示の一実施形態において、細胞死や細胞の死滅とは、増殖能などの細胞としての機能を消失している状態を意味する。例えば、酵母などの細胞を固形培地上で培養したとき、一個の細胞から増殖して可視的に計数できる一定以上の大きさの細胞集落(コロニー)を形成できる能力を消失している状態をさす。また他の実施形態において、細胞死や細胞の死滅には、生理的または病理的な要因により生じた不要な細胞や障害細胞などを積極的に除去する能動的細胞死(アポトーシス)および外的要因への反応による受動的細胞死(ネクローシス)も含まれ得る。

　本開示の一実施形態において、酵母としては、出芽酵母、分裂酵母などを用いることができる。出芽酵母としては、例えば、Saccharomyces属（Saccharomyces　cerevisiaeなど）、Zygosaccharomyces属（Zygosaccharomyces　rouxiiなど）や、ピキア酵母（Komagataella　phaffii、Komagataella　pastoris、Komagataella　pseudopastoris）、メタノール資化性酵母（Ogataea　polymorpha、Hansenula　polymorpha、Candidaboidinii、Ogataea　minuta、Ogataea　angusta、Pichia　methanolica、Ogataea　parapolymorphaなど）などを用いることができる。分裂酵母としては、例えば、Zygosaccharomyces属（Zygosaccharomyces　rouxiiなど）を用いることができる。これらのうちでも特に好ましい酵母は、Saccharomyces　cerevisiaeまたはピキア酵母（Komagataella　phaffii、Komagataella　pastoris、Komagataella　pseudopastoris）である。一実施形態において、メタノール資化性酵母とは、唯一の炭素源としてメタノールを利用して培養可能な酵母細胞と定義されるが、本来メタノール資化性酵母細胞であったが、人為的な改変あるいは変異によりメタノール資化性能を喪失した酵母細胞もメタノール資化性酵母細胞に包含される。

　ピキア酵母はメタノール資化性の性質をもち、主にタンパク質生産で産業的に広く使われている。このピキア酵母では、メタノール誘導システムとしてＡＯＸ１プロモータが広く用いられている。このＡＯＸ１プロモータは発現量が非常に強く、メタノール下で増殖した細胞では全ｍＲＮＡ量の５％がＡＯＸ１ｐ由来といわれており、その発現はメタノールで厳密に制御することができる。

　本開示の一実施形態においては、人工転写活性化因子であるｒＰｈｌＴＡと誘導剤としてＤＡＰＧを用いることで、ＡＯＸ１プロモータに匹敵する新規誘導性プロモータを提供することができる。

　本開示の一局面において、転写調節因子をコードする遺伝子配列を中から遺伝子スイッチ（転写調節因子）をスクリーニングするための組み合わせ物であって、細胞と、毒性前駆物質と、毒性物質と、発現されることにより前記毒性前駆物質を、前記細胞に対する毒性を付与または強化するよう変換させる毒性付与強化遺伝子と、発現されることにより前記細胞に前記毒性物質に対する耐性を付与または強化する耐性付与強化遺伝子と、マーカー遺伝子とを含む組み合わせ物が提供される。

　本開示の一実施形態において、耐性付与強化遺伝子は、毒性物質に結合することで毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生するものであり、好ましくは毒性物質に対して触媒活性を有さないものである。例えば、ｂｌｅ（ブレオマイシン耐性タンパク質）などを用いることができる。望ましくは、液体培養でのＯＮ選抜が可能であり、薬剤濃度の違いにより選抜するレポーター発現強度の域値を変えることができるものであり、結合性を弱める変異を含むことができ、例えばｂｌｅの場合、Ｄ２５Ａなどの変異を加えて選抜感度を調節することもできる。

　本開示の一実施形態において、耐性付与強化遺伝子は、遺伝子産物の量に対して化学量論的に毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生するものであり、例えば、Ｂｌｅ二量体は抗生物質を１：１のモル比で結合・隔離することでゼオシンを不活性化することができる。したがって、細胞のゼオシン耐性はＢｌｅの発現レベルを直接反映しているといえる。

　一実施形態においては、さらに、転写調節因子と結合する誘導因子を含むこともできる。誘導因子は活性化物質とも呼ばれ、遺伝子スイッチ（転写調節因子）に結合することにより遺伝子スイッチ（転写調節因子）を活性化させ、またはその機能を変化させ、その結果、１または複数の遺伝子の直接的または間接的な発現の調節を誘導することができる。遺伝子スイッチ（転写調節因子）ごとに異なるものとすることもでき、遺伝子スイッチ（転写調節因子）と誘導因子との組み合わせとしては、例えば、ｒｔｅｔＴＡとＤｏｘ、ＣａｍＴＡとＤ－Ｃａｍｐｈｏｒ、ＰｈｌＴＡとＤＡＰＧ、ＬｕｘＴＡとＨＳＬなどを挙げることができる。

　本開示の他の局面において、生物における遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜する方法であって、（Ａ）候補転写調節因子をコードする遺伝子配列を含む発現ベクターを細胞に導入する工程と、（Ｂ）毒性付与強化遺伝子と、耐性付与強化遺伝子と、マーカー遺伝子とを含む融合遺伝子を、該候補転写調節因子と結合するプロモータと作動可能に連結して前記細胞に導入する工程と、（Ｃ）該毒性付与強化遺伝子の遺伝子産物によって毒性が付与または強化される毒性前駆物質の少なくとも１種の濃度の存在下に該細胞を配置し、生存する細胞を選択する工程と（Ｄ）該細胞に対して毒性を示す毒性物質であって、該耐性付与強化遺伝子の遺伝子産物によって耐性が付与または強化される毒性物質の少なくとも１種の濃度の存在下に該細胞を配置し、生存する細胞を選択する工程と（Ｅ）（Ｃ）および（Ｄ）で生存した細胞を選択し、含まれる候補転写調節因子をコードする遺伝子配列を遺伝子スイッチ（転写調節因子）として選択する工程とを含む、方法が提供される。

　本開示の一実施形態において、転写調節因子が転写活性化因子である場合に、転写活性化因子と結合する誘導因子の非存在下で、かつデオキシチミジン三リン酸(ｄＴＴＰ)のデノボ合成経路の阻害剤の存在下でのインキュベーションをすることで、ＯＦＦ選抜を行うことができる。この場合、転写調節因子が転写活性化因子である場合に、転写活性化因子と結合する誘導因子の存在下で、かつ毒性物質の存在下でのインキュベーションをすることで、ＯＮ選抜をすることができる。

　本開示の他の実施形態において、転写調節因子が転写抑制因子である場合に、転写抑制因子と結合する誘導因子の非存在下で、かつ前記毒性物質の存在下でのインキュベーションをすることで、ＯＦＦ選抜をすることができる。この場合、転写調節因子が転写抑制因子である場合に、転写抑制因子と結合する誘導因子の存在下で、かつデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤の存在下でのインキュベーションをすることで、ＯＮ選抜をすることができる。

　本開示の一実施形態において、オペーレーター配列とコアプロモーター領域を融合したＤＮＡ配列と対応する転写因子を初期型のスイッチ・センサの構成要素として、それらの化合物に対する応答性能を簡便かつ劇的に高める手法を提供することができる。具体的には、本開示の一実施形態において、転写因子を発現するカセットと、オペーレーター配列とコアプロモーター領域を融合したＤＮＡ配列の下流にＨＳＶ－ＴＫ（チミジンキナーゼ）、Ｂｌｅ（ブレオマイシン耐性タンパク質）及びＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を融合した遺伝子を挿入した発現カセットを準備し、そのいずれかもしくは両方に変異を導入した後に酵母へ導入し、ＯＮ／ＯＦＦ選抜およびＧＦＰスクリーニングを行う手法を提供することができる。

　一実施形態において、選抜薬剤（ＯＦＦ選抜：５ＦｄＵやｄＰなど、ＯＮ選抜：Ｚｅｏｃｉｎなど）の濃度や誘導剤の濃度などを変化させた様々なＯＦＦおよびＯＮ選抜の条件で培養したのち、フローサイトメーター等でＧＦＰの蛍光分布から変異体の濃縮状況を確認し、より望ましい条件で選抜した変異集団についてコロニー単離を行い、それぞれのコロニーのＯＮ／ＯＦＦ両状態のＧＦＰ蛍光強度および変異配列を決定することができる。このような手法によって遺伝子スイッチ（転写調節因子）の選抜を行うことにより、様々な遺伝子スイッチ・センサ（転写調節因子）（テトラサイクリン応答型、ホモセリンラクトン（ＨＳＬ）応答型、２，４－ジアセチルフロログルシノール（ＤＡＰＧ）応答型、など）の改良型を簡便に作出することができる。また初期型センサではほとんど応答の見られなかった遺伝子センサについても、有意な応答が見られるレベルにまで簡便に改良できる。また、逆転型のスイッチも簡単に構築することができる。さらに、オペレーター配列をタンデム化することで、さらなる劇的な応答性能の向上を達成している。

　遺伝子スイッチ系は、誘導プロモーターとして利用することができ、使用しにくい特性を持つ天然型の誘導プロモーターの欠点を克服した性能の良い人工の遺伝子スイッチ系はニーズが高い。また、遺伝子スイッチ系は生産物の簡便な間接定量評価や遺伝子発現の調節を行うことができるため、近年その利用ニーズが高まってきている。産業微生物としても有用な酵母において、本手法により、簡便に高性能遺伝子スイッチ・センサ、および／またはそれを利用した遺伝子スイッチ系を作ることができれば、菌株構築の時間を圧倒的に短縮したり、高度な代謝や遺伝子ネットワーク制御を行うことができる。そのため、特に代謝工学や合成生物学分野において産業応用が期待される。また本開示の遺伝子スイッチは、有用タンパク質の大量生産や毒性を示すタンパク質などの発現制御、代謝化合物の簡易的な濃度測定などに利用できる。

　本開示の一実施形態において、誘導プロモーターはタンパク質の誘導発現（分泌または細胞内での生産）に利用することができる。

　本開示の一実施形態において、Ｓ／Ｎ比に優れたＴｅｔ－ＯＮ、ＤＡＰＧ－ＯＮ、ＨＳＬ－ＯＮは、代謝酵素の発現制御への利用を想定することができる。例えば代謝経路を分岐させる酵素への使用が考えられる。例えばテルペノイドの一種のスクアレンの生産において、スクアレン消費する下流のエルゴステロール経路の酵素を、スクアレンを高生産するタイミングでのみＯＦＦにすることで、スクアレンの生産量を高めることができる。または他の実施形態において、細胞に強い毒性を示す有用タンパク質、例えば抗体タンパク質などを候補として挙げることができる。抗体タンパク質の生産では、化学反応の変換プロセスを構築する代謝工学とはことなり、抗体タンパク質の発現量がそのまま生産量に比例する。そのため、発現量を限界まで高める必要があるが、発現誘導系のＳ／Ｎ比が低いと、発現の漏出が起き、タンパク質の過剰発現による細胞毒性のために酵母株を得ること自体不可能である。ＤＡＰＧ－ＯＮやＴｅｔ－ＯＮ、ＨＳＬ－ＯＮスイッチでは、その高いＳ／Ｎ比ゆえに、毒性タンパク質の高生産が見込まれる。

　一実施形態において、遺伝子スイッチ系は、特に細胞に対して毒性を示す遺伝子の発現のＯＮ／ＯＦＦ切り替えに利用されることができる。医薬品としての利用が期待される抗体タンパク質、あるいは植物代謝物の合成を担う異種酵素遺伝子の酵母内発現は、過剰に発現させ過ぎると往々にして細胞毒性を示す。しかし、細胞増殖期には毒性を示す遺伝子であっても、増殖完了後の発現誘導であればその毒性が緩和されることがある。そこで、遺伝子スイッチ系を用いて、増殖期には毒性遺伝子の発現をＯＦＦ、増殖完了後にＯＮにすることで、異種遺伝子の過剰発現による細胞毒性を回避できる。

　本開示の一実施形態において、遺伝子スイッチ系は、バイオコンピューティングの分野でも注目を集めている。複数の遺伝子スイッチ系の組み合わせで構成される「遺伝子回路」は、細胞に与えられた外部情報を処理する「電子回路」のアナロジーとして解釈することができる。実際に、合成生物学分野では、遺伝子回路を構築し、細胞に新規機能を付与すること目的として、実際のコンピュータに実装されている論理回路と同じトポロジーを持つ多数の遺伝子回路を設計・構築してきた。しかし、電子回路とは異なり、遺伝子スイッチのＯＮ／ＯＦＦ切り替えはアナログであるため、遺伝子回路の組み合わせは数個に止まり、その拡張性を制限していた。ＯＦＦとＯＮの比に優れた遺伝子スイッチによって遺伝子回路の抱えるこのような弱点を解決できる可能性がある。

　本開示の一実施形態において、酵母をメインとして、その他の真核生物や大腸菌を含む原核細胞など様々な生物種において、高性能な新たな遺伝子スイッチ系またはメタボライトセンサを作出するために本開示の方法を使用することができる。作出するスイッチ・センサをライセンス若しくはキットの一部としての販売する、あるいはスイッチ・センサの受託開発をすることもできる。また、作出した遺伝子スイッチ系は、安全かつ安価で使いやすい（たとえば防爆設備が不要、炭素源を限定しない、など）新たなタンパク質生産の誘導プロモーターとして利用したり、代謝経路中の遺伝子発現を厳密にコントロールしたり、遺伝子回路を組むことによって、実用プロセスまたは研究用途の高性能（高生産）な物質生産株を開発（自社開発・受託開発を含む）するために利用することもできる。また、開発したメタボライトセンサは、ＨＰＬＣやＧＣＭＳの代わりに目的産物や副産物の生産量を簡易的にハイスループット定量するために利用し、高性能（高生産）な物質生産株の開発スピードを加速させることもできる。

　本開示の一実施形態において、より安価かつ安全な化合物を誘導剤とする遺伝子スイッチ（転写調節因子）、および／またはそれを利用した遺伝子スイッチ系を開発し、そのライセンス化やキットの一部としての販売を行うことができる。さまざまな生物種が持つ転写因子について、誘導剤の物性を指標にスクリーニングを行い、これを用いた遺伝子スイッチ（転写調節因子）、および／またはそれを利用した遺伝子スイッチ系のプロトタイプを試作する。試作したプロトタイプについて、その構成要素にランダムな遺伝子変異を導入する。そうして作製した遺伝子スイッチライブラリに対して、ＯＦＦ／ＯＮ選抜を行う。すなわち、遺伝子スイッチライブラリを保持する酵母株を、１００ｎＭの５ＦｄＵ存在下で培養したのちに、誘導剤を加えた培地に移すことで、遺伝子発現を誘導する。培養液を１～３ｍＭのＺｅｏｃｉｎと誘導剤を含む培地へと移すことで、ＯＮ選抜を行う。用途に合わせて誘導剤の濃度を調整することで、より低濃度の誘導剤に応答する遺伝子スイッチ（転写調節因子）変異体の単離（高感度化）も行う。開発した遺伝子スイッチ（転写調節因子）、および／またはそれを利用した遺伝子スイッチ系は、物質生産の鍵となる代謝酵素の発現制御や、細胞にとって負荷の大きいタンパク質の生産を誘導することに用いる。スイッチ・センサの受託開発においては、指定の誘導剤と転写因子のペアについて同様の進化分子工学サイクルを実施する。誘導剤・転写因子ペアについては、代謝工学上重要な化合物、例えば目的の生産物やあるいはその中間体などに応答するものを選定することで，これらの濃度を簡易モニタリングできるメタボライトセンサを開発する。こうして得たメタボライトセンサは、菌株開発のスピードアップに用いる。

　本開示の一局面において、生物における遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜するシステムであって、（Ａ）遺伝子スイッチ発現配列および／または該遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子が結合するプロモータにランダムな変異を導入した複数の核酸分子を含むＤＮＡライブラリーと、（Ｂ）該ライブラリーを宿主細胞に導入する手段と、（Ｃ）該プロモータによって発現調節される遺伝子を発現する細胞を死滅させるＯＦＦ条件に該宿主細胞を曝露し、生存する細胞を選択する手段と、（Ｄ）（Ｃ）において該生存する細胞（ＯＦＦ条件で生存する細胞）を、該プロモータによって発現調節される遺伝子を発現しない、及び／または目的の発現レベルに達していない細胞を死滅させるＯＮ条件に曝露し、生存する細胞を選択する手段と、（Ｅ）（Ｄ）において該生存する細胞（ＯＮ条件で生存する細胞）に含まれる該ライブラリーに含まれていたものと同じ核酸配列を有する核酸分子を遺伝子スイッチ（転写調節因子）として選択する手段とを含む、システムが提供される。

　また他の局面において、生物における遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜するシステムであって、該システムは、遺伝子スイッチ発現配列および／または該遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子が結合するプロモータにランダムな変異を導入した複数の核酸分子を含むＤＮＡライブラリーから該遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜するものであり、該システムは、（Ｂ）該ライブラリーを宿主細胞に導入する手段と、（Ｃ）該プロモータによって発現調節される遺伝子を発現する細胞を死滅させるＯＦＦ条件に該宿主細胞を曝露し、生存する細胞を選択する手段と、（Ｄ）（Ｃ）において該生存する細胞（ＯＦＦ条件で生存する細胞）を、該プロモータによって発現調節される遺伝子を発現しない、及び／または目的の発現レベルに達していない細胞を死滅させるＯＮ条件に曝露する手段と、（Ｅ）（Ｄ）において該生存する細胞（ＯＮ条件で生存する細胞）に含まれる該ライブラリーに含まれていたものと同じ核酸配列を有する核酸分子を遺伝子スイッチ（転写調節因子）として選択する手段とを含む、システム。

　一実施形態において、ＤＮＡライブラリーは、ＤＮＡライブラリーは公知の種々の方法を用いて作製することができ、遺伝子スイッチ発現配列および／または該遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子が結合するプロモータにランダムな変異が導入されているものであれば特に限られるものではない。

　一実施形態において、該ライブラリーを宿主細胞に導入する手段は、宿主細胞に発現ベクターを導入したり、発現カセット（フラグメント）をゲノムに組み込むことができる種々の分子生物学的機器を挙げることができる。

　一実施形態において、（Ｃ）該プロモータによって発現調節される遺伝子を発現する細胞を死滅させるＯＦＦ条件に該宿主細胞を曝露し、生存する細胞を選択する手段、および（Ｄ）該プロモータによって発現調節される遺伝子を発現しない、及び／または目的の発現レベルに達していない細胞を死滅させるＯＮ条件に曝露し、生存する細胞を選択する手段は、例えば、種々の条件を設定して当該条件で細胞培養を行うことができる培養器などを挙げることができ、所定の条件下で細胞を培養し得るものであれば特に限られるものではない。

　一実施形態において、（Ｅ）（Ｄ）において該生存する細胞（ＯＮ条件で生存する細胞）に含まれる該ライブラリーに含まれていたものと同じ核酸配列を有する核酸分子を遺伝子スイッチ（転写調節因子）として選択する手段は、例えば、所定の条件下で生存する細胞から、当該細胞に含まれる核酸分子を抽出し、その核酸配列を決定することができるものであれば特に限られるものではなく、シーケンサーなどを含むことができる。他の実施形態において、生存する細胞に含まれる核酸分子がライブラリーに含まれていたものと同じ核酸配列を有することを確認するため、ＤＮＡライブラリーにおける各核酸分子の情報を、個々の培養細胞に紐づけて培養できる機器であってもよい。

　（遺伝子スイッチライブラリー、およびそれによる生物または細胞の育種）
　本開示の方法によれば、所望の性質の遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜することができるため、目的の化合物や代謝産物に応じて、その発現強度や転写特性にバリエーションのあるプロモータをライブラリとして提供することができる。したがって、本開示の一局面において、本開示の方法によって選抜された遺伝子スイッチ（転写調節因子）を含む遺伝子スイッチライブラリーを提供することができる。

　またこのような誘導性プロモーターライブラリーを用いて微生物などの生物やその細胞の育種を行うことができ、代謝経路中の遺伝子を所望の発現強度となるように調節することで、当該微生物や細胞に目的の化合物を効率よく生産させることが可能となる。したがって、本開示の一局面において、所望の特性を有する生物または細胞を育種する方法であって、Ａ）本開示の遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜する方法を用いて、所望の活性を有する遺伝子スイッチ（転写調節因子）を提供する工程と、Ｂ）前記遺伝子スイッチ（転写調節因子）を用いて、前記所望の特性を付与することに関与する１または複数の遺伝子を、所望の転写特性を持つように改変する工程と、Ｃ）工程Ｂで改変された所望の転写特性を有する遺伝子を、目的の細胞に導入する工程と、Ｄ）工程Ｃで得られた細胞の中から、所望の特性を有する細胞を選択する工程とを包含する、方法が提供される。

　また他の局面において、所望の特性を有する生物または細胞を育種する方法であって、Ａ）本開示の遺伝子スイッチライブラリーを提供する工程であって、前記ライブラリーは、所望の活性を有する遺伝子スイッチ（転写調節因子）を有するように構成される、工程と、Ｂ）前記遺伝子スイッチ（転写調節因子）を用いて、前記所望の特性を付与することに関与する１または複数の遺伝子を、所望の転写特性を持つように改変する工程と、Ｃ）工程Ｂで改変された所望の転写特性を有する遺伝子を、目的の細胞に導入する工程と、Ｄ）工程Ｃで得られた細胞の中から、所望の特性を有する細胞を選択する工程とを包含する、方法が提供される。

　さらに他の局面において、所望の物質を生産する生物または細胞を育種する方法であって、Ａ）本開示の遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜する方法を用いて、所望の活性を有する遺伝子スイッチ（転写調節因子）を提供する工程と、Ｂ）前記遺伝子スイッチ（転写調節因子）を用いて、前記物質の生合成に関与する１または複数の遺伝子を、所望の転写特性を持つように改変する工程と、Ｃ）工程Ｂで改変された所望の転写特性を有する遺伝子を、目的となる細胞に導入する工程と、Ｄ）工程Ｃで得られた細胞の中から、所望の特性を有する細胞を選択する工程とを包含する、方法が提供される。

　本開示の遺伝子スイッチ（転写調節因子）の選抜方法や、それを利用した遺伝子スイッチライブラリーを応用することで、目的の代謝化合物に応答して転写制御可能な遺伝子スイッチを発現する細胞を元にライブラリ（導入する遺伝子の種類や、由来する生物種の種類、各遺伝子の発現量など）を構築し、その中から所望の特性を有する細胞を選択することもできる。したがって、本開示の別の局面において、所望の特性を有する生物または細胞を選抜する方法であって、Ａ）本開示の遺伝子スイッチライブラリーを提供する工程であって、前記ライブラリーは、目的の代謝化合物に応答する転写調節因子を有するように構成される、工程と、Ｂ）前記転写調節因子を用いて、前記目的の代謝化合物への応答性を付与することに関与する１または複数の遺伝子を、所望の転写特性を持つように改変する工程と、Ｃ）工程Ｂで改変された所望の転写特性を有する遺伝子を、目的の細胞に導入する工程と、Ｄ）工程Ｃで得られた細胞の中から、所望の特性を有する細胞を選択する工程とを包含する、方法が提供される。

　一実施形態において、所望の物質としては、例えば、アミノ酸やポリ乳酸等の有用物質を合成するための酵素、目的の化合物（例えば、ＰＥＴなどの難分解性化合物）を分解するための酵素、抗生物質などの抗菌性の物質を合成するための酵素、標的タンパク質と特異的に相互作用する抗体タンパク質などを挙げることができる。

　また本開示の一実施形態において、育種の対象となる生物や細胞としては、真核生物および原核生物を含み、どのような細胞であってもよいが、例えば、酵母（ピキア酵母、出芽酵母）、大腸菌、枯草菌、乳酸菌、コリネ菌、糸状菌、および微細藻類などを挙げることができる。

　また本開示の一局面において、本開示の遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜する方法を用いることで、所望の活性を有するプロモータを選抜することができ、これにより、所望のプロモーターを生産する方法を提供することができる。またこの際に、上記のような所望の細胞において活性を有するものを選抜することも可能である。

　本開示の別の局面において、本開示の遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜する方法およびこれによって得られるスイッチなどの産物および加工物は、いわゆるＤＢＴＬ（デザイン、ビルド、テスト、ラーン）サイクルによる高機能な生体物質（例えば、抗体、代謝物、その他タンパク、脂質、糖などの各種物質、オルガネラなど）の高生産株を迅速に創出することができる。

　ここで、デザインの側面では、生体物質（例えば、抗体）の配列や構造・改変細胞のデザインが想定される。例えば、生体物質（例えば、抗体）の構造安定性や発現量最適化のシミュレーション、候補配列提案のためのアルゴリズムなどを設計することができ、本開示の遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜する方法およびこれによって得られるスイッチなどの産物および加工物を利用することができる。

　ビルドの側面では、設計した生体物質（例えば、抗体）の候補配列やゲノム改変細胞の並列・迅速作出を行うことができる。ここでは、自動ＤＮＡ合成や自動タンパク質精製システムが利用され得、更なるプロセス自動化と最適化・拡張を行うことができ、本開示の遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜する方法およびこれによって得られるスイッチなどの産物および加工物を利用することができる。

　テストの側面では、生体物質（例えば、抗体）の機能や生産性評価を行うことができる。ここでは、自動化や次世代シーケンサー（ＮＧＳ），マイクロ流体システム等による超ハイスループット（ＨＴＰ）評価系の開発を行うことができる。これによって得られた評価をもとに、本開示の遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜する方法およびこれによって得られるスイッチなどの産物および加工物を用いて更なる改良を行ってもよい。

　ラーンでは、機械学習やルール抽出を行い、学習をさせる。データ管理や、生体物質（例えば、抗体）設計に適した学習アルゴリズム，膨大なデータの管理システム開発を行うことができ、本開示の遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜する方法およびこれによって得られるスイッチなどの産物および加工物を組み合わせることで、高機能な生体物質（例えば、抗体）の高生産株を迅速に創出することができる。

　一例として、本開示の遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜する方法およびこれによって得られるスイッチなどの産物および加工物を組み合わせることで、微生物によるバイオ医薬品フェドバッチ生産技術の改良を行うことができ、多品種製造に適したフェドバッチ生産技術を改良することもできる。

　別の例として、微生物によるバイオ医薬品の生産が挙げられ、本開示の遺伝子スイッチ（転写調節因子）を選抜する方法およびこれによって得られるスイッチなどの産物および加工物を組み合わせることで、改良することができる。例えば、連続生産技術の開発により、あるいは大量製造に適した連続生産技術を開発することができる。

　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８９）．　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ，　ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；　Ｓｎｉｎｓｋｙ，　Ｊ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．
　ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

　人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの遺伝子合成やフラグメント合成サービスを用いることもでき、その他、例えば、Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９８５）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９９０）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ
　Ｐｒｅｓｓ；　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，　Ｆ．（１９９１）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｄａｍｓ，　Ｒ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ；　Ｓｈａｂａｒｏｖａ，　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，　Ｇ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，　Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。

　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。

　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

（実施例１：融合レポーター遺伝子の構築）
　ＯＦＦ選抜用のタンパク質として単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｓｖＴＫ）、ＯＮ選抜用のタンパク質としてゼオシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）、および蛍光レポーター（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ）の３つの機能の融合タンパク質を使用して、酵母の遺伝子スイッチの迅速な並列構築／進化のための進化プラットフォームを構築した（図１Ａ）。この融合タンパク質であるｈｓｖＴＫ－Ｂｌｅ－ＧＦＰ（以下、ＴＢＧ）は、３つの利点を提供する。第１に、ＴＢＧは、改良された遺伝子スイッチの連続的な選択を可能にする。第２に、すべての工程がリキッドハンドリングのみで完了できることを考えると、マルチウェルプレートを用いて複数の選択条件を並行して試験することができる。第３に、選択されたすべての変異体を蛍光分析によりシームレスに特徴づけることができ、異なる仕様の酵母遺伝子スイッチを系統的に生成することが可能である。

　図１Ａに示すように、コアプロモーターとオペレーター配列を融合させた合成プロモーター（ｓｙｎＰ）を構築した。これにより、合成転写アクチベーター（ｓＴＡ）が誘導因子に正または負の反応で結合し、遺伝子スイッチの出力である融合タンパク質（ｈｓｖＴＫ－Ｂｌｅ－ＧＦＰ（ＴＢＧ））をコードする下流遺伝子の転写を活性化させる。次いで、所望の遺伝子スイッチ変異体を、種々のＯＦＦ／ＯＮ選抜で濃縮した。ＯＦＦ選抜としては、不適切なスイッチ出力（リーク発現）、つまりｈｓｖＴＫ発現を持つ変異体は５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（５ＦｄＵ）または６－（β－Ｄ－２－デオキシリボフラノシル）－３，４－ジヒドロ－８Ｈ－ピリミド［４，５－ｃ］［１，２］オキサジン－７－オン（ｄＰ）をリン酸化し、その後ヌクレオシド一リン酸塩（５ＦｄＵＭＰおよびｄＰＭＰ）の毒性効果により死滅させた。ＯＮ選抜としては、スイッチ出力（Ｂｌｅ発現）が不十分な変異体はゼオシンで死滅させた。

　続いて、図１Ｂに示すように、酵母遺伝子スイッチの誘導進化を以下のようにして行った。まず酵母細胞を、ランダムに変異させた成分（例えば、ｓＴＡをコードする発現カセット）からなる遺伝子スイッチライブラリーで最初に形質転換し、次いで５ＦｄＵまたはｄＰによるＯＦＦ選抜をおこなった。次に、得られた細胞プールに、異なる濃度の誘導剤を添加し、様々な濃度のゼオシンを用いたＯＮ選抜をおこなった。得られた細胞集団を、フローサイトメトリーを用いて誘導因子依存性の蛍光シフトについて評価し、所望のスイッチ変異体について濃縮された集団をスクリーニングした。以上のように、ＯＦＦ状態とＯＮ状態の両方で個々の細胞のＧＦＰ蛍光を評価することによって、最良のパフォーマンスを持つ変異体を分離した。
（実施例２：遺伝子スイッチの選抜）
　実施例１のようにして構築したＴＧＢをコードする遺伝子を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＧＡＬ１コアプロモーター（ｐ_{ＧＡＬ１－ｃ}）に融合した大腸菌ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）を７コピーつなげたｓｙｎＰ（ｐ_{ｔｅｔＯ７}）の下流に配置した（図２Ａ）。ＴＧＢをコードするコンストラクトは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムのＶ番染色体に組み込んだ。逆バクテリア転写抑制因子ｒＴｅｔＲと３コピーのウイルス転写活性化モチーフ（３×ＶＰ１６、ＶＰ４８）との融合体であるｒＴｅｔＴＡ（ｓＴＡ、ｒｔＴＡ２^Ｓ－Ｍ２ともいう）がｐ_{ｔｅｔＯ７}に結合し、さらにＤｏｘが結合するとＴＢＧコード遺伝子の転写が始まる。得られた細胞株の細胞蛍光はＤｏｘに応答しており（図２Ｂ）、この結果から、ＴＢＧがプロモーターの強度を示すレポーターとして有用であることがわかった。

　ｐ_{ｔｅｔＯ７}はリーク発現を示し、ｒＴｅｔＴＡの非存在下でも、低いものの検出可能な活性を有していた。プラスミドを用いてｒＴｅｔＴＡを発現させた場合、Ｄｏｘの非存在下でも細胞蛍光は４倍に上昇した。このようにＯＦＦ状態の出力が高いため、Ｄｏｘを添加した場合には３倍程度の蛍光上昇しか得られなかった（図２Ｂ）。
（実施例３：Ｂｌｅ変異体の評価）
　ＴＢＧコンストラクトのＯＮセレクターとしての性能を評価した。野生型のｂｌｅ遺伝子を組み込んだＴＢＧ（すなわちＴＢ_ＷＴＧ）では、Ｄｏｘによって誘導されるプロモーター強度における３倍の差を識別することができなかった。プラスミドから発現させたｒＴｅｔＴＡを用いた場合、ＴＢ_ＷＴＧコンストラクトをもつ細胞は、試験したすべての濃度のゼオシンで増殖し、ＴＢ_ＷＴＧの細胞性Ｂｌｅ活性はすでにＯＦＦ状態で飽和していることを示していた。そのため、Ｂｌｅに１つのアミノ酸置換（Ｄ２５Ａ）を導入し、このタンパク質の機能がわずかに損なわれるようにした。その結果、ＴＢ_Ｄ２５ＡＧを持つ細胞は、優れたＯＮセレクターであることが判明した。すなわち、２ｍＭゼオシンを含む培地では、ＴＢ_Ｄ２５ＡＧを持つ細胞の生存率は、細胞の蛍光から推定されるＴＢＧ発現レベルに実質的に比例していた（図２Ｃ）。
（実施例４：ｄＰおよび５ＦｄＵの取り込み）
　ｈｓｖＴＫは、６－（β－Ｄ－２－デオキシリボフラノシル）－３，４－ジヒドロ－８Ｈ－ピリミド［４，５－ｃ］［１，２］オキサジン－７－オン（ｄＰ）や５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（５ＦｄＵ）に対して優れたキナーゼであることが示されており、大腸菌の負の選抜マーカーとして利用されている。ＴＢＧ遺伝子をＯＦＦセレクターとして評価する前に、効率的なＯＦＦ選択を行うためには、酵母細胞を改変する必要がある。具体的には、広基質ヌクレオシドトランスポーター（ヒト平衡ヌクレオシドトランスポーター１（ｈＥＮＴ１））をコードする遺伝子をクローニングし、酵母染色体に組み込むことで、細胞によるヌクレオシドの取り込みを促進させた。ＴＢＧ発現細胞ではｄＰの細胞毒性が非常に高いため、ｐ_{ｔｅｔＯ７}－ＴＢＧを発現させた酵母細胞は、ＤｏｘやｒＴｅｔＴＡを添加しなくても、低濃度（～５０ｎＭ）のｄＰだけでも生存率が低下した。ＴＢＧ／ｄＰは、ほぼゼロに近い漏出発現を示す非常に厳格な遺伝子スイッチを選択するのに適しているものの、既存の誘導系のほとんどは、ある程度の漏出発現を示す。このような場合には、５ＦｄＵを選択剤として用いて変異体を選択する必要がある。図２Ｄに示したとおり、５ＦｄＵを用いた結果、５ＦｄＵは用量依存的な効果を示し、１００ｎＭの５ＦｄＵを培地に添加した場合には、ｒＴｅｔＴＡをもつ酵母はＤｏｘの存在下では生存しなくなり（高モード）、一方、この細胞は、Ｄｏｘの非存在下では生存率が低下した（低モード）。これは図２Ｃで示したように、蛍光で観察された漏出（非誘導）によるＴＢＧ発現を反映している。
（実施例５：Ｔｅｔ－ＯＮ型遺伝子スイッチのＳ／Ｎ比の評価）
　Ｔｅｔ－ＯＮ型遺伝子スイッチは、以前の研究により、Ｄｏｘ添加時に３倍の誘導しか示さなかったことがわかっているが、これはｒｔＴｅｔＴＡがｔｅｔＯに非特異的に結合したこと、およびｐ_{ｔｅｔＯ７}の上流でのプロモーターの偶然の出現によるものと考えられている。ｔｅｔＯへの非特異的結合を減少させるために、ｒＴｅｔＴＡ発現カセットの全領域を、エラーを起こしやすいＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）によってランダムに変異させ、その結果得られたＰＣＲ産物を、ＧＡＰ修復クローニングによって、ｐ_{ｔｅｔＯ７}－ＴＢＧをもつ細胞内のプラスミドに直接クローニングした（図３Ａ）。得られた形質転換体（～１０^５個のユニークなクローン）を、Ｄｏｘを含まない５ＦｄＵ含有液体培地で培養することにより、漏出の（すなわち、Ｄｏｘに依存しない）ＴＢＧ発現を有する変異体を除去してＯＦＦ選抜を行った。次に、非機能性バリアントを除去し、これにより良好なスイッチを濃縮するために、様々な条件下でＯＮ選抜を行った。具体的には、ＯＦＦ選抜された細胞のプールを、Ｄｏｘ（０．０１～１０μｇ／ｍＬ）とゼオシン（１または２ｍＭ）の様々な組み合わせを含む１４本の試験管に分注し、サンプルを一晩振盪した。

　１４本のＯＮ選抜された細胞混合物のそれぞれをフローサイトメトリーを用いて分析した（図３Ａ）。機能的なスイッチを、様々な選抜条件下で異なる程度に濃縮した。すべての場合において、試験したゼロではない濃度のＤｏｘにおいて、望ましい（Ｄｏｘ誘導性）変異体の有意な濃縮が観察された（図３Ａ）。一般に、誘導条件（Ｄｏｘ＋）の下での出力シグナルは、低い選択圧（ラン１～７；１ｍＭゼオシン）の下でのそれぞれの対応するプールよりも、より高い選択圧（２ｍＭゼオシン）がＯＮ条件の下で適用されたラン８～１４からのプールの方が高かった。しかし、２ｍＭゼオシンでＯＮ選抜されたプールは、Ｄｏｘの非存在下でも高い蛍光シグナルを示した高割合の「常にＯＮ」のバリアントで汚染されていた。２ｍＭのゼオシンを用いたＯＮ選抜は、Ｄｏｘ誘導時に高い出力を持つ陽性（望ましい）クローンにも毒性効果を及ぼし、それによって「常にＯＮ」の表現型を持つ非スイッチング変異体（スーパーアクチベーター）と比較してスイッチング変異体の割合を減少させたことがわかった。いずれの場合にも、低濃度のＤｏｘ、特に０．１μｇ／ｍＬ以下の濃度では、プール内に漏出発現のあるバリアントが徐々に蓄積される結果となった。この特定のケースでは、機能的スイッチの最も効率的な濃縮は、ラン９および１１（プール＃９および＃１１）で達成された。最高の誘導出力と最高のストリンジェンシーの両方を持つバリアントを分離するため、その後のスクリーニングにはラン８と１１を用いた。

　選択された２つのプールから、９３個のクローンをランダムに選び、９６ウェルプレートで蛍光スクリーニングを行った（図３Ｂ）。試験したクローンの合計４８％（４５／９３）は、Ｄｏｘ（１０μｇ／ｍＬ）で５倍以上の誘導を示し、最高のｒＴｅｔＴＡ変異体（ｒＴｅｔＴＡ_{Ｋ８Ｎ、Ｌ１３１Ｌ}）は、０．３および１０μｇ／ｍＬのＤｏｘの存在下でそれぞれ８倍および１１倍の誘導を示した（図３Ｃ）。

　図３Ａに示すように、Ｔｅｔ－ＯＮスイッチのｒＴｅｔＴＡをコードする発現カセットにランダムな変異を導入し、得られたライブラリーを異なる選抜条件でＯＦＦ／ＯＮ選抜の並列操作を行った。スイッチバリアントが濃縮される条件をスクリーニングするために、得られた細胞集団をＤｏｘ依存性の蛍光シフトについて評価した。緑と青で示した領域は、望ましくない挙動、すなわち漏出発現のあるバリアント（Ｄｏｘが存在しない場合に１０^４以上のＧＦＰ蛍光を持つ細胞）と不活性バリアント（１０μｇ／ｍＬのＤｏｘの存在下で１０^４未満のＧＦＰ蛍光を持つ細胞）のそれぞれ相対的な量（％）を示す。スイッチングバリアントの相対的な量（％）は、これらの２つの数値の両方を１００％から差し引くことによって得られた。破線は、ｒＴｅｔＴＡを含まないプラスミドをもつ酵母株から得られたヒストグラムを示す。図３Ｂでは、Ｔｅｔ－ＯＮバリアントの９６ウェルプレートでの蛍光スクリーニングの結果を示した。また図３Ｃでは、選択された変異体のトランスファー機能を示した。エラーバーは、３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。５０％有効濃度（ＥＣ_５０）値は、最小二乗法によりヒル式に適合した用量反応曲線から計算した。上のパネルは、野生型および進化させたＴｅｔ－ＯＮスイッチ（ｒＴｅｔＴＡ_{Ｋ８Ｎ、Ｌ１３Ｌ}）をもつ酵母株の細胞ペレットを１０μｇ／ｍＬのＤｏｘの有無にかかわらずインキュベートした場合の蛍光画像を示す。
（実施例６：遺伝子スイッチの改良）
　Ｔｅｔ－ＯＮシステムを開発するためのプロトコルに従って、任意の転写因子を真核生物の転写スイッチの構成要素として使用することができる。しかし、異なる転写因子の場合、安定性、ＤＮＡ結合親和性、およびｓＴＡを生成するために他のタンパク質またはドメインと融合したときにそれらの機能がどのように変化するのかがそれぞれ異なるため、得られるスイッチの性能は予測不可能である。さらに、ｓＴＡのスイッチング挙動は、種々の要因（発現レベル、プロモーターの位置およびコピー数、および株の種類）に大きく依存する。実際には、それぞれの条件において適切な性能を確保するために、新しいシステムを再進化させる必要がある。

　負に制御された真核生物の遺伝子スイッチを改良するため、２つの酵母の転写スイッチを再構築した。２，４－ジアセチルフロログシノール（ＤＡＰＧ）－ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ（ＤＡＰＧ－ＯＦＦ）スイッチとＤ－Ｃａｍｐｈｏｒ－ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ（Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦ）スイッチ（図４Ａ）。具体的には、ＤＡＰＧおよびＤ－Ｃａｍｐｈｏｒ応答性細菌リプレッサー（ＰｈｌＦおよびＣａｍＲ）をＶＰ４８活性化ドメインおよび核局在化シグナル（ＮＬＳ）と融合させ、公表されている配列と同一のタンパク質配列を有するｓＴＡ（それぞれＰｈｌＴＡおよびＣａｍＴＡ）を生成した。また、７コピーのｔｅｔＯの代わりに、ＰｈｌＦとＣａｍＲのシングルオペレーター（それぞれｐｈｌＯとｃａｍＯ）をｐ_{ＧＡＬ１－ｃ}に融合させ、合成プロモーター（それぞれｐ_{ｐｈｌＯ１}とｐ_{ｃａｍＯ１}）を作製した。本発明者らの手法は可能な限り報告された方法と一致していたものの、初期のコンストラクトは、報告されているように機能しなかった。これはおそらくｓＴＡの発現を駆動するために使用されるシス制御エレメント（プロモーター／ターミネーター）のわずかな違いに起因するものと思われた。さらに、本発明者らはＰｈｌＴＡ発現プラスミドで高い毒性を観察した。プラスミドを酵母に形質転換したところ、ＤＡＰＧに感受性のない数個の生存可能なコロニーのみが得られた（図４Ｂ）。これらの単離株は、ＶＰ１６を過剰に発現させた場合の毒性効果を緩和すると思われるＰｈｌＴＡ発現プラスミドの自然発生的なダウンチューニング変異を持つ突然変異体と考えられた。ＣａｍＴＡ発現プラスミドは、酵母においてより低い毒性を示したが、再構成されたＣａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦスイッチは、Ｄ－ｃａｍｐｈｏｒの存在下で有意な漏出発現を示した（図４Ｃ）。

　ｅｐＰＣＲを用いて、ＰｈｌＴＡおよびＣａｍＴＡ発現カセット全体を変異させ、得られたライブラリーをＯＮ／ＯＦＦ選抜をおこなった。この選抜により、ＤＡＰＧ添加時に４倍の発現低下を示した機能的なＤＡＰＧ－ＯＦＦ変異体（１－２Ｅおよび１－６Ｈ）（図４Ｂ）、ならびにＤ－Ｃａｍｐｈｏｒに対する応答性がＳ／Ｎ比で２倍に改善されたＣａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦスイッチ変異体（１－８Ｄ）（図４Ｃ）を迅速に単離することができた。特筆すべきことに、新たに単離された変異体については、酵母において明らかな毒性は観察されなかった。最良の性能を有するＣａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦスイッチのうちの５つは、完全なＮＬＳを無効にするフレームシフト変異（Ａ６９５ｄｅｌ）を共有していた。その一方で、最良の性能を有するＤＡＰＧ－ＯＦＦスイッチのうちの４つは、無傷のＮＬＳを保持していたが、ＰｈｌＴＡ発現カセットに同じ変異を有していた。これらの観察から、Ｄ－ｃａｍｐｈｏｒの存在下で漏出のＴＢＧ発現がないか、またはそれ以下であることを確実にするために、最適なＣａｍＴＡ活性のためには、ＮＬＳ機能（およびおそらく核内局在性）の部分的な障害が必要であることが示唆された。コントロール実験では、ＮＬＳを欠いたＣａｍＴＡによる転写活性化は検出されなかった。

　図４に酵母転写スイッチの作出と進化方法を示す模式図を示した（Ｓ／Ｎ比、感度、行動タイプで評価）。図４Ａに本開示で開発した酵母遺伝子スイッチを示す。特定されたｓＴＡ変異体のプラスミド発現によって、宿主細胞においてｐ_{ｐｈｌＯ１}、ｐ_{ｃａｍＯ１}、またはｐ_{ｌｕｘＯ１}の制御下に置かれた用量依存的な活性化遺伝子が発現した。図４Ｂ～図４Ｆに、ＤＡＰＧ－ＯＦＦスイッチ（図４Ｂ）、Ｃａｍｐｈｏｒ－ＯＦＦスイッチ（図４Ｃ）、ＤＡＰＧ－ＯＮスイッチ（図４Ｄ）、およびＨＳＬ－ＯＮスイッチ（図４Ｆ）の親および変異体のトランスファー機能を示した。ＴＢＧ由来のＧＦＰ蛍光は、各誘導剤濃度の関数としてプロットした。示されているエラーバーは、３つの独立した実験の平均±ＳＤを表している。ＯＦＦ／ＯＮ選抜中に添加された誘導剤の濃度は、矢印および破線で示した。ＥＣ_５０値は、最小二乗法によりヒル式に適合した用量反応曲線から計算され、マイクロモル濃度単位で表した。図４Ｅおよび図４Ｇには、それぞれＰｈｌＴＡを反転／増感させ、ＬｕｘＴＡを増感させる、ＰｈｌＦおよびＬｕｘＲにおける変異の構造マッピングを示した。ＰｈｌＦとＬｕｘＲの構造は、それぞれＴｅｔＲファミリーの転写調節因子ＳＣＯ０３３２（ＰＤＢ：２ＺＢ９）とクォーラムセンサータンパク質ＴｒａＲ（ＰＤＢ：１Ｌ３Ｌ）の結晶構造をもとに、Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌサーバーを用いてモデル化した。ＤＮＡ構造は対応する参照結晶構造から引用した。
（実施例７：ＤＡＰＧ－ＯＦＦシステムからＤＡＰＧ－ＯＮシステムへの変換）
　突然変異によって、新規なスイッチング動作を持つ転写因子を出現させることができる。様々な細菌のリプレッサーは、いくつかの突然変異が生じることによって、それらのリガンド応答を反転させることが知られている。したがって、前述のＤＡＰＧ－ＯＦＦスイッチをコードする遺伝子に変異を誘発させることにより、ＤＡＰＧ－ＯＮスイッチにコンストラクトを変換することができるかどうかを確認した。この目的のために、ＤＡＰＧ－ＯＦＦスイッチの単離に使用したのと同じＰｈｌＴＡライブラリーを、ＤＡＰＧの非存在下でＯＦＦ選抜にかけ、次いでこの化合物（５μＭ）の存在下でＯＮ選抜にかけた。生存プールから、３０のバリアントをランダムに選択し、ＯＦＦ／ＯＮスクリーニングを行った結果、ＤＡＰＧ－ＯＮバリアント（１－１１Ｅ、１－１１Ｇ）を単離し、８倍のＤＡＰＧ依存性の蛍光増加を示した（図４Ｄ、図６Ａ）。このバリアントの変異解析を行ったところ、３つの新規変異の存在を明らかにした。そのうちの１つ（Ｑ１１７Ｒ）は、ＰｈｌＴＡ（ｒＰｈｌＴＡ）の機能の反転に必須であり、他の２つの変異（Ｅ１４３Ｋおよび／またはＫ８６Ｔ）は、反転したスイッチの応答性（感度および倍数変化の両方）の改善に必須であった（図４Ｅ）。ＯＮ選抜のためのより低い濃度のＤＡＰＧ（０．５μＭ）を用いた別のサイクルの突然変異誘発、選抜、およびスクリーニングによって、最大１／８倍に減少したＥＣ_５０値を示す３つの第２世代バリアント（２－１Ｅ、２－４Ｅ、および２－７Ｅ）を得た（図４Ｄ）。これらの第２世代バリアントはすべて、ＤＡＰＧに対する感受性の増加の原因となった新規変異（Ｆ１０９Ｌ）を共有していた（図４Ｅ）。ＰｈｌＦはこれまでに、大腸菌においてＤＡＰＧに対する感度および選択性を改変されているが、本実施例において反転ＰｈｌＦ（ｒＰｈｌＦ）機能を示す変異は、これまでに報告されていない。同様に、ｒＰｈｌＦの感度をあげる変異はこれまで報告されていない。

　図６に進化させたＤＡＰＧ－ＯＮスイッチのｒＰｈｌＴＡ発現カセットに見出されたヌクレオチドおよびアミノ酸（ＡＡ、括弧内に示す）変異を示した。その変異が親である（１－１１Ｅ）変異体にも見出された第二世代の変異体を除いて、第一世代（図６Ａ）および第二世代（図６Ｂ）のｒＰｈｌＴＡ発現カセットに見出された変異を赤線で示した。フォールドチェンジは、１０μＭのＤＡＰＧの存在下および非存在下での蛍光強度の平均±ＳＤ比として、図４Ｄに示すデータから計算した。

（実施例８：その他の新規なスイッチ）
　これまでのところ、原核生物の転写活性化因子は酵母の転写活性化因子として利用されていない。そこで、３－オキソ－ヘキサノイルホモセリンラクトン（ＨＳＬ）誘導細菌転写活性化因子であるＶｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈｅｒｉ　ＬｕｘＲを誘導成分として用いて、ｓＴＡの生成を試みた。ＬｕｘＴＡ（ＬｕｘＲ、ＶＰ４８、およびＮＬＳの融合体、図４Ａ）の単純なプラスミド発現では、ｐ_{ｌｕｘＯ１}（ＬｕｘＲ結合ボックス（ｌｕｘＯ）と融合したＧＡＬ１コアプロモーター）の制御下では、ＴＢＧのＨＳＬ依存性発現はみられなかった（図４Ｆ）。この非機能的な親を出発材料として、誘導剤の濃度を段階的に減少させながら２ラウンドの突然変異誘発および選抜を行い（１ラウンド目、１０μＭのＨＳＬ；２ラウンド目、１μＭのＨＳＬ）、機能的なＨＳＬ－ＯＮのバリアントを同定することに成功した。このようにして、迅速に、酵母が細菌のシグナルを感知し、応答することを初めて可能にした。

　３μＭのＨＳＬを添加したときにＴＢＧ発現の６倍の増強を示した最高のパフォーマンスのバリアント（図４Ｆ）は、２つの非同義変異（Ｓ１１６Ｙ、Ｗ２０１Ｒ）を持っていた（図４Ｇ、図７）。酵母のＨＳＬ－ＯＮスイッチでは、いずれの変異も、程度は異なるものの、ＬｕｘＴＡを単独でＨＳＬに増感させるのに十分であった。しかし、それぞれの変異は大腸菌では全く異なる挙動を示した。酵母で見られるように、ＬｕｘＲ構造のリガンド結合領域に位置するＳ１１６Ｙ変異は、大腸菌ではＬｕｘＲ／ｐ_ｌｕｘ転写制御因子のＨＳＬ感度を増加させた。一方、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼと相互作用することが知られているＬｕｘＲの表面に位置するもう一つの変異（Ｗ２０１Ｒ）は、大腸菌におけるｌｕｘプロモーターからの発現を著しく低下させた。Ｗ２０１Ｒ置換がＲＮＡポリメラーゼのリクルーターとしてのＬｕｘＲの機能に負の影響を与えると考えられるが、これはこの変異がこれまでにＨＳＬによる活性化のためにタンパク質を増感させるＬｕｘＲ変異を見つけるためのスクリーニングで見落とされていた理由となり得ると考えられる。酵母のＨＳＬ－ＯＮスイッチでは、ＬｕｘＲの役割は、ＨＳＬによって誘導されたＤＮＡ結合を促進することとなる。したがって、この増感性変異は酵母の遺伝子スイッチでのみ同定できると考えられる。

　図７は進化させたＨＳＬ－ＯＮスイッチのＬｕｘＴＡ発現カセットに見出されたヌクレオチドおよびアミノ酸（ＡＡ、括弧内に示す）の変異を示す。その変異が親である（１－４Ａ）変異体にも見出された第２世代の変異体を除いて、第１世代（図７Ａ）および第２世代（図７Ｂ）のＬｕｘＴＡ発現カセットに見出された変異は赤線で示した。フォールドチェンジは、１００μＭのＨＳＬ（２－４Ｆについては３μＭ）の存在下および非存在下での蛍光強度の平均±ＳＤ比として、図４Ｆに示すデータから計算した。
（実施例９：酵母スイッチ変異体のＡＮＤゲートβ－カロテン生合成経路への統合）
　酵母では、Ｓ／Ｎ比を向上させた一連の遺伝子スイッチを開発してきたので、これらの構造をパスウェイ・フラックス制御に応用することを試みた。単離された３つのｓＴＡ（ＤＡＰＧ－ＯＮ_２－１Ｅ、ＨＳＬ－ＯＮ_２－４Ｆ、およびＴｅｔ－ＯＮ_{１－１１Ｆ}）を酵母の異なる染色体に統合した（図５Ａ）。得られた株を、それぞれのｓｙｎＰの下流にｇｆｐ遺伝子がクローニングされたプラスミド（ｐ_{ｔｅｔＯ７}、ｐ_{ｐｈｌＯ６}、およびｐ_{ｌｕｘＯ５}）で形質転換した。なお、ｓｙｎＰの５００以上上流のベクター配列に含まれる潜在的なプロモーター配列は削除し、ｐｈｌＯおよびｌｕｘＯの繰り返し数を増加させた。得られた細胞のＧＦＰ蛍光は、それらの同族の誘導剤の存在下でのみ誘導され、１０^２以上の因子によって誘導された（図５Ｂ）。これらの合成プロモーターはいずれもストリンジェントであり、すなわち、誘導剤が存在しない場合には低い基底ＴＢＧ発現を示した。

　これらのスイッチをβ－カロテン生合成経路の調節因子として利用することで、直交的な調節能を利用することを試みた。そのために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｂｔｓ１ｐを用い、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｎｄｒｏｒｏｕｓのＣｒｔＹＢおよびＣｒｔＩタンパク質と組み合わせた３つの酵素の作用による９段階のプロセスでβ－カロテンの合成を行った（図５Ｃ）。

　３つの遺伝子（ＢＴＳ１、ｃｒｔＹＢ、およびｃｒｔＩ）をすべて発現するプラスミドを構成プロモーターの制御下で酵母を形質転換すると、誘導剤の有無にかかわらず、酵母はβ－カロテンを産生した（図５Ｄ）。ＢＴＳ１とｃｒｔＹＢのプロモーターをそれぞれｐ_{ｐｈｌＯ６}とｐ_{ｔｅｔＯ７}で置換した。これらの３つの遺伝子のすべてが発現する必要があったので、β－カロテン産生は、ＤＡＰＧとＤｏｘの両方の存在下でのみ期待された（ＡＮＤ－ゲート制御）。しかし、ｐ_{ｔｅｔＯ７}プロモーターによる漏出発現は、おそらくＣｒｔＹＢの強力な触媒活性のために、無視できないことが判明し、Ｄｏｘの非存在下では有意な誤った色素沈着をもたらした。この漏出発現は、ｃｒｔＹＢを制御するために使用される遺伝子スイッチをｐ_{ｔｅｔＯ７}からｐ_{ｌｕｘＯ５}に変換することによって緩和され、β－カロテン生合成経路はＨＳＬとＤＡＰＧの組み合わせによってＡＮＤゲート制御下に置かれた。この株では、β－カロテンの生合成はＤＡＰＧとＨＳＬの両方の存在下でのみ見られるという、期待されたＡＮＤゲートの挙動が観察された。同様の戦略を、β－カロテン生合成経路をＡＮＤゲート下に配置した株の構築においても採用した。

　図５に新たに開発した遺伝子スイッチを用いたＦＰＰからβ－カロテンへのフラックス制御を示した。図５Ａでは、カロテノイド生合成のＡＮＤゲート制御に用いた酵母株を示す。ＤＡＰＧ－ＯＮ_２－１Ｅ、ＨＳＬ－ＯＮ_２－４Ｆ、およびＴｅｔ－ＯＮ_{Ｋ８Ｎ，Ｌ１３１Ｌ}スイッチで使用するためのｓＴＡを発現する３つのプラスミドを染色体統合した。各ｓｙｎＰの下流の遺伝子（ｐ_{ｐｈｌＯ６}、ｐ_{ｔｅｔＯ７}、およびｐ_{ｌｕｘＯ５}）は、対応する誘導剤（それぞれ、ＤＡＰＧ、Ｄｏｘ、およびＨＳＬ）の存在下でのみ発現した。図５Ｂに、Ｄｏｘ、ＤＡＰＧ、およびＨＳＬを用いた直交ＧＦＰ発現制御をフローサイトメトリーで測定した結果を示す。図５Ｃにβ－カロテンへの合成経路を示す。ＦＰＰはファルネシル二リン酸を、ＧＧＰＰはゲラニルゲラニル二リン酸を示す。図５Ｄに、定常的なβ－カロテン生合成とＡＮＤゲート制御によるβ－カロテン生合成の模式図を示した。図５Ｄ左パネルに示す組み合わせで構成的プロモーターまたはｓｙｎＰ（ｐ_{ｐｈｌＯ６}、ｐ_{ｔｅｔＯ７}、およびｐ_{ｌｕｘＯ５}）の制御下で（ＢＴＳ１、ｃｒｔＹＢ、およびｃｒｔＩ）を発現する酵母株（図５Ｄ右パネル）の細胞ペレットを示す。これらの菌株を、異なる組み合わせの誘導剤（Ｄｏｘ、ＤＡＰＧ、およびＨＳＬ）を含む液体培地に接種し、３０℃で２４時間培養した。誘導剤の濃度は、ＤＡＰＧ（３μＭ）、ＨＳＬ（３μＭ）、およびＤｏｘ（１０μｇ／ｍＬ）であった。
（実施例１０：ピキア酵母での遺伝子スイッチの開発）
　本実施例ではピキア酵母を用いて遺伝子スイッチを開発した。具体的には、図８Ａに示すとおり、ＤＡＰＧ応答性細菌リプレッサー（ＰｈｌＦ）をＶＰ４８活性化ドメインおよび核局在化シグナル（ＮＬＳ）と融合させて人工の転写活性化因子（ｒＰｈｌＴＡ）を生成し、ＧＡＰプロモータとＡＯＸ１ターミネータの間にクローニングした。またＰｈｌＦのオペレーター（ｐｈｌＯ）を１個あるいはタンデムに１８個つなげたものを、ＡＯＸ１
　ｃｏｒｅプロモータに融合させ、合成プロモーター（ｐ_{ｐｈｌＯ１および}ｐ_{ｐｈｌＯ１８}）を作製し、ＥＧＦＰ遺伝子の上流にクローニングした。ＥＧＦＰの下流にはＡＯＸ１ターミネータを配置した。以上のｒＰｈｌＴＡの発現カセットと人工プロモータカセットを、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ　ｐｈａｆｆｉｉ　ＣＢＳ　７４３５株の　Ｔ３８４７３とＡＲＧ４座位に組み込んだ（図８Ａ）。

　その結果、図８Ｂに示すとおり、ｒＰｈｌＴＡをＡＲＧ４座位，人工プロモータｐ_{ｐｈｌＯ１}またはｐ_{ｐｈｌＯ１８}を含むＥＧＦＰカセットをＴ３８４７３座位に組み込んだ場合において，それぞれおよそ６００および３０００倍のＳ／Ｎ比を示した。これは従来の天然のプロモータの性能と匹敵し、さらに培地成分（主に糖源）の制約がなく、また従来の低性能の人工プロモータと比較して極めて高いＳ／Ｎ比を示すことがわかった。

　図８Ｃに示すとおり、ｒＰｈｌＴＡをＴ３８４７３座位、人工プロモータｐ_{ｐｈｌＯ１}またはｐ_{ｐｈｌＯ１８}を含むＥＧＦＰカセットをＴ３８４７３座位に組み込んだ場合では、ＤＡＰＧ　０μＭのときのＧＦＰ発現が大きく増加し、Ｓ／Ｎ比がおよそ７および３００倍にまで低下した。

　ＡＲＧ４遺伝子の全部（約１．６ｋｂｐ）または部分（１ｋｂｐ）を、人工プロモータｐ_{ｐｈｌＯ１}またはｐ_{ｐｈｌＯ１８}の上流にクローニングすると、図８Ｄに示すとおり、ＤＡＰＧ　０μＭのときの発現量のＧＦＰ発現のみが低下し、ｐ_{ｐｈｌＯ１}を用いた場合において、Ｓ／Ｎ比が３００倍に回復した。このことから、人工プロモータの上流に１ｋｂｐ以上の配列を挿入しておくことが、導入されるゲノム上の座位に依らず高いＳ／Ｎ比を実現するために必要であることがわかった。図８Ｅに示すとおり、同様の効果はｐｈｌＯのコピー数を４８に増やし、ｐｈｌＯのタンデムリピート全体で約１．６ｋｂｐにまで伸ばしたときにも確認され、３０００倍を超えるＳ／Ｎ比を示すことがわかった。

　ピキア酵母を含む酵母用の遺伝子スイッチは、人工の転写活性化因子だけでなく、ＶＰ１６の代わりに転写抑制モチーフ、例えばＭｘｉ１（転写抑制因子）を融合することで、制御様式を反転することができる。

　ピキア酵母用の遺伝子スイッチでは、人工プロモータとして、Saccharomyces　cerevisiae由来のＧＡＬ１ｃｏｒｅを用いるよりも、ＡＯＸ１ｃｏｒｅやＤＡＳ１ｃｏｒｅを用いたほうが効率よく遺伝子の発現を制御することができる。ピキア酵母においては、ＧＡＬ１ｃｏｒｅを用いた人工プロモーターは活性が極めて低く、ピキア酵母由来のＡＯＸ１やＤＡＳ１（強力なメタノール誘導プロモーター）やＧＡＰなどのコアプロモーターに変えることでＯＮ（遺伝子発現誘導）の際の値が極めて大きくなる。

　また上記のとおり、ｐｈｌＯのコピー数を４８に増やした場合には高いＳ／Ｎ比を達成している一方で、１、６、１２、１８、２４コピーでも応答性は高い。ＯＮ（遺伝子発現誘導）の際の最大の発現量は大きく変わらないものの、ｐｈｌＯのコピー数が増えるにつれて、漏出発現が大きく低減することがわかった（図８Ｂ、図８Ｅ、図９）。これはプロモーター上流のＤＮＡの長さが漏出発現の低減に影響している可能性がある。上流からの何等かの転写が漏出発現の原因となっており、上流からの距離が遠くなるとその影響が低減され、漏出発現が減少していると考えられる。このような上流配列に起因する漏出発現については、上流配列を変更したり、または上流からの距離を遠くさせるなどによって、漏出発現のほぼない人工プロモーターを開発することができる。

　また、ｐｈｌＯタンデムコピー（４８コピー）の代わりに、ＡＲＧ４をオペレーター配列の上流に置いても同じように漏出発現が極めて小さくなる。これはＡＲＧ４がｉｎｓｕｌａｔｏｒとして機能していると考えられる。ＡＲＧ４を１０００ｂｐくらいまで削ってもｉｎｓｕｌａｔｏｒとして機能する。ｐｈｌＯ１でも６００倍程度のＳ／Ｎ比を達成することができる（図８Ｃ、図８Ｄ）。オペレーターのコピー数を増やして配列を長くしても同じように漏出発現が低減することから、上流からの距離の長さが影響していると考えられる。

　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２０年１２月４日に出願された特願２０２０－２０２２３３に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。

　本開示の方法によって、産業微生物としても有用な酵母において簡便に高性能遺伝子スイッチ・センサを作出することができ、有用タンパク質の大量生産や毒性を示すタンパク質などの発現制御、代謝化合物の簡易的な濃度測定などに利用できる。これにより、バイオ医薬品や産業酵素の生産性を大きく高めたり、菌株構築の時間を圧倒的に短縮させることができ、高度な代謝や遺伝子ネットワーク制御を行うことができる。そのため、特に代謝工学や合成生物学分野において産業応用が期待される。

Claims

　生物における転写調節因子を選抜する方法であって、
（Ａ）遺伝子スイッチ発現配列および／または該遺伝子スイッチ発現配列によってコードされる転写調節因子が結合するプロモータにランダムな変異を導入した複数の核酸分子を含むＤＮＡライブラリーを提供する工程と、
（Ｂ）該ライブラリーを宿主細胞に導入する工程と、
（Ｃ）該プロモータによって発現調節される遺伝子を発現する細胞を死滅させるＯＦＦ条件に該宿主細胞を曝露し、生存する細胞を選択する工程と、
（Ｄ）（Ｃ）において該生存する細胞を、前記プロモータによって発現調節される遺伝子を発現しない、及び／または目的の発現レベルに達していない細胞を死滅させるＯＮ条件に曝露し、生存する細胞を選択する工程と、
（Ｅ）（Ｄ）において該生存する細胞に含まれる該ライブラリーに含まれていたものと同じ核酸配列を有する核酸分子を転写調節因子として選択する工程と
を含む、方法。
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子は、前記細胞に対して毒性を示す毒性物質に結合することで前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、請求項１に記載の方法。
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子は、前記毒性物質に対して触媒活性を有さない、請求項１または２に記載の方法。
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子は、遺伝子産物の量に対して化学量論的に前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子は、前記毒性物質との結合性を弱める変異を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
　前記ＯＮ条件に用いられる遺伝子はブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）をコードする遺伝子配列を含み、前記変異はＤ２５Ａ変異を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
　前記ブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）がStreptoalloteichus　hindustanus由来である、請求項６に記載の方法。
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子は、複数の遺伝子が融合された融合遺伝子である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
　前記宿主細胞が、前記遺伝子スイッチ発現配列と、前記プロモータによって発現調節される遺伝子配列とを有する発現ベクターを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子は、前記転写調節因子と誘導因子が結合した複合体が、前記プロモータのオペレータ配列に結合することによって発現が調節される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
　前記転写調節因子が転写活性化因子である場合に、前記ＯＦＦ条件が、前記転写活性化因子と結合する誘導因子の非存在下で、かつデオキシチミジン三リン酸(ｄＴＴＰ)のデノボ合成経路の阻害剤の存在下でのインキュベーションを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
　前記転写調節因子が転写活性化因子である場合に、前記ＯＮ条件が、前記転写活性化因子と結合する誘導因子の存在下で、かつ前記毒性物質の存在下でのインキュベーションを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
　前記転写調節因子が転写抑制因子である場合に、前記ＯＮ条件が、前記転写抑制因子と結合する誘導因子の非存在下で、かつ前記毒性物質の存在下でのインキュベーションを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
　前記転写調節因子が転写抑制因子である場合に、前記ＯＦＦ条件が、前記転写抑制因子と結合する誘導因子の存在下で、かつデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤の存在下でのインキュベーションを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子が、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子が、ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
　前記デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤が、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（５ＦｄＵ）またはその誘導体である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
　前記毒性物質が抗生物質を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
　前記生物が真核生物である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
　前記生物がピキア酵母である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
　前記生物が原核生物である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
　さらに、工程Ｄの後に、該生存する細胞を、マーカー遺伝子の発現量に応じてスクリーニングする工程を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
　請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法によって選抜された遺伝子スイッチを含む遺伝子スイッチライブラリー。
　転写調節因子をコードする遺伝子配列の中から目的の転写調節因子をスクリーニングするための組み合わせ物であって、
　細胞と、
　毒性前駆物質と、
　毒性物質と、
　発現されることにより前記毒性前駆物質を、前記細胞に対する毒性を付与または強化するよう変換させる毒性付与強化遺伝子と、
　発現されることにより前記細胞に前記毒性物質に対する耐性を付与または強化する耐性付与強化遺伝子と、
　マーカー遺伝子と
を含む組み合わせ物。
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質に結合することで前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、請求項２４に記載の組み合わせ物。
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質に対して触媒活性を有さない、請求項２４または２５に記載の組み合わせ物。
　前記耐性付与強化遺伝子は、遺伝子産物の量に対して化学量論的に前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質との結合性を弱める変異を含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
　前記耐性付与強化遺伝子はブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）をコードする遺伝子配列を含み、前記変異はＤ２５Ａ変異を含む、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
　前記ブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）がStreptoalloteichus　hindustanus由来である、請求項２９に記載の組み合わせ物。
　さらに、デオキシチミジン三リン酸(ｄＴＴＰ)のデノボ合成経路の阻害剤を含む、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
　さらに、前記転写調節因子と結合する誘導因子を含む、請求項２４～３１のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
　前記毒性付与強化遺伝子が、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、請求項２４～３２のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
　前記毒性付与強化遺伝子が、ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、請求項２４～３３のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
　前記デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤が、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（５ＦｄＵ）またはその誘導体である、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
　前記毒性物質が抗生物質を含む、請求項２４～３５のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
　生物における転写調節因子を選抜する方法であって、
（Ａ）候補転写調節因子をコードする遺伝子配列を含む発現ベクターを細胞に導入する工程と、
（Ｂ）毒性付与強化遺伝子と、耐性付与強化遺伝子と、マーカー遺伝子とを含む融合遺伝子を、該候補転写調節因子と結合するプロモータと作動可能に連結して前記細胞に導入する工程と、
（Ｃ）該毒性付与強化遺伝子の遺伝子産物によって毒性が付与または強化される毒性前駆物質の少なくとも１種の濃度の存在下に該細胞を配置し、生存する細胞を選択する工程と（Ｄ）該細胞に対して毒性を示す毒性物質であって、該耐性付与強化遺伝子の遺伝子産物によって耐性が付与または強化される毒性物質の少なくとも１種の濃度の存在下に該細胞を配置し、生存する細胞を選択する工程と
（Ｅ）（Ｃ）および（Ｄ）で生存した細胞を選択し、含まれる候補転写調節因子をコードする遺伝子配列を転写調節因子として選択する工程と
を含む、方法。
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質に結合することで前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、請求項３７に記載の方法。
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質に対して触媒活性を有さない、請求項３７または３８に記載の方法。
　前記耐性付与強化遺伝子は、遺伝子産物の量に対して化学量論的に前記毒性物質の毒性を減弱させる遺伝子産物を産生する、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。
　前記耐性付与強化遺伝子は、前記毒性物質との結合性を弱める変異を含む、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。
　前記耐性付与遺伝子はブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）をコードする遺伝子配列を含み、前記変異はＤ２５Ａ変異を含む、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の方法。
　前記ブレオマイシン耐性タンパク質（Ｂｌｅ）がStreptoalloteichus　hindustanus由来である、請求項４２に記載の方法。
　前記プロモータによって発現調節される遺伝子は、複数の遺伝子が融合された融合遺伝子である、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の方法。
　前記転写調節因子が転写活性化因子である場合に、前記（Ｃ）における配置が、前記転写活性化因子と結合する誘導因子の非存在下で、かつデオキシチミジン三リン酸(ｄＴＴＰ)のデノボ合成経路の阻害剤の存在下でのインキュベーションを含む、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の方法。
　前記転写調節因子が転写活性化因子である場合に、前記（Ｄ）における配置が、前記転写活性化因子と結合する誘導因子の存在下で、かつ前記毒性物質の存在下でのインキュベーションを含む、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の方法。
　前記転写調節因子が転写抑制因子である場合に、前記（Ｄ）における配置が、前記転写抑制因子と結合する誘導因子の非存在下で、かつ前記毒性物質の存在下でのインキュベーションを含む、請求項３７～４４のいずれか一項に記載の方法。
　前記転写調節因子が転写抑制因子である場合に、前記（Ｃ）における配置が、前記転写抑制因子と結合する誘導因子の存在下で、かつデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤の存在下でのインキュベーションを含む、請求項３７～４５のいずれか一項に記載の方法。
　前記毒性付与強化遺伝子が、ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、請求項３７～４８のいずれか一項に記載の方法。
　前記毒性付与強化遺伝子が、ヒトヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼをコードする遺伝子配列を含む、請求項３７～４９のいずれか一項に記載の方法。
　前記デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）のデノボ合成経路の阻害剤が、５－フルオロ－２’－デオキシウリジン（５ＦｄＵ）またはその誘導体である、請求項４５～５０のいずれか一項に記載の方法。
　前記毒性物質が抗生物質を含む、請求項３７～５１のいずれか一項に記載の方法。
　前記生物が真核生物である、請求項３７～５２のいずれか一項に記載の方法。
　前記生物がピキア酵母である、請求項３７～５３のいずれか一項に記載の方法。
　前記生物が原核生物である、請求項３７～５２のいずれか一項に記載の方法。
　請求項３７～５５のいずれか一項に記載の方法によって選抜された転写調節因子を含む遺伝子スイッチライブラリー。
　所望の特性を有する生物または細胞を育種する方法であって、前記方法は
Ａ）請求項１～２２または３７～５５のいずれか一項に記載の転写調節因子を選抜する方法を用いて、所望の活性を有する転写調節因子を提供する工程と、
Ｂ）前記転写調節因子を用いて、前記所望の特性を付与することに関与する１または複数の遺伝子を、所望の転写特性を持つように改変する工程と、
Ｃ）工程Ｂで改変された所望の転写特性を有する遺伝子を、目的の細胞に導入する工程と、
Ｄ）工程Ｃで得られた細胞の中から、所望の特性を有する細胞を選択する工程と
を包含する、方法。
　所望の特性を有する生物または細胞を育種する方法であって、前記方法は
Ａ）請求項２３または５６に記載の遺伝子スイッチライブラリーを提供する工程であって、前記ライブラリーは、所望の活性を有する転写調節因子を有するように構成される、工程と、
Ｂ）前記転写調節因子を用いて、前記所望の特性を付与することに関与する１または複数の遺伝子を、所望の転写特性を持つように改変する工程と、
Ｃ）工程Ｂで改変された所望の転写特性を有する遺伝子を、目的の細胞に導入する工程と、
Ｄ）工程Ｃで得られた細胞の中から、所望の特性を有する細胞を選択する工程と
を包含する、方法。
　所望の物質を生産する生物または細胞を育種する方法であって、前記方法は
Ａ）請求項１～２２または３７～５５のいずれか一項に記載の転写調節因子を選抜する方法を用いて、所望の活性を有する転写調節因子を提供する工程と、
Ｂ）前記転写調節因子を用いて、前記物質の生合成に関与する１または複数の遺伝子を、所望の転写特性を持つように改変する工程と、
Ｃ）工程Ｂで改変された所望の転写特性を有する遺伝子を、目的となる細胞に導入する工程と、
Ｄ）工程Ｃで得られた細胞の中から、所望の特性を有する細胞を選択する工程と
を包含する、方法。
　請求項１～２２または３７～５５のいずれか一項に記載の転写調節因子を選抜する方法を行う工程を含む、所望のプロモーターを生産する方法であって、該遺伝子スイッチの選抜において、所望の活性を有するものを選抜することを包含する、方法。
　請求項１～２２または３７～５５のいずれか一項に記載の転写調節因子を選抜する方法を行う工程を含む、所望のプロモーターを生産する方法であって、該転写調節因子の選抜において、所望の細胞において活性を有するものを選抜することを包含する、方法。
　所望の特性を有する生物または細胞を選抜する方法であって、
Ａ）請求項２３または５６に記載の遺伝子スイッチライブラリーを提供する工程であって、前記ライブラリーは、目的の代謝化合物に応答する転写調節因子を有するように構成される、工程と、
Ｂ）前記転写調節因子を用いて、前記目的の代謝化合物への応答性を付与することに関与する１または複数の遺伝子を、所望の転写特性を持つように改変する工程と、
Ｃ）工程Ｂで改変された所望の転写特性を有する遺伝子を、目的の細胞に導入する工程と、
Ｄ）工程Ｃで得られた細胞の中から、所望の特性を有する細胞を選択する工程と
を包含する、方法。
　前記細胞は、真核生物由来の細胞である、請求項５７～６２のいずれか一項に記載の方法。
　前記細胞は、酵母を含む、請求項５７～６３のいずれか一項に記載の方法。
　前記細胞は、原核生物由来の細胞である、請求項５７～６２のいずれか一項に記載の方法。
　前記細胞は、細菌を含み、必要に応じて前記細菌は放線菌、大腸菌、枯草菌、糸状菌、および微細藻類を含む、請求項５７～６２、及び６５のいずれか一項に記載の方法。