WO2022118894A1 - 核可溶性タンパク質の新規分画方法 - Google Patents

核可溶性タンパク質の新規分画方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2022118894A1
WO2022118894A1 PCT/JP2021/044140 JP2021044140W WO2022118894A1 WO 2022118894 A1 WO2022118894 A1 WO 2022118894A1 JP 2021044140 W JP2021044140 W JP 2021044140W WO 2022118894 A1 WO2022118894 A1 WO 2022118894A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nuclear
cells
digitonin
cell
cell membrane
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/044140
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
泰 小川
Original Assignee
国立研究開発法人理化学研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人理化学研究所 filed Critical 国立研究開発法人理化学研究所
Priority to JP2022566962A priority Critical patent/JPWO2022118894A1/ja
Publication of WO2022118894A1 publication Critical patent/WO2022118894A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for fractionating intracellular proteins and a kit used for the method, and specifically for a method for fractionating nuclear-soluble proteins and a kit used for the method.
  • Non-Patent Document 1 The genome of eukaryotic cells is sequestered in the nucleus, and only necessary proteins such as transcription factors are selectively transferred into the nucleus, controlling homeostasis maintenance functions such as gene expression depending on the situation.
  • the transfer of substances between the nucleus and cytoplasm is carried out through the nuclear pore complex existing in the hundreds to thousands on the surface of the nuclear envelope.
  • the passage paths of the nuclear pore complex can be broadly divided into two types. One is an active transport pathway recognized and selectively transported by a nuclear-cytoplasmic transport factor (Non-Patent Document 1). The other is a passive transport route by free diffusion (Non-Patent Document 2). For the latter, only proteins of 60 kDa or less, which are sufficiently small to pass through the nuclear pore complex, are available (Non-Patent Document 3).
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a method for fractionating a nuclear-soluble protein according to the prior art (upper and middle) and the present invention (lower) in comparison with each other.
  • One is a method in which a cell membrane (PM) and a nuclear envelope (NE) are perforated with a surfactant or a homogenizer to elute the soluble protein, and the protein in the nucleus is eluted at a high salt concentration (Non-Patent Document). 4, Fig. 1, middle row).
  • Non-Patent Documents 5, 6 and 7, FIG. 1, upper row are examples of the nuclear protein that are more tightly bound to the structure in the nucleus.
  • Another method is to use a hypotonic solution or digitonin, a surfactant that specifically binds to cholesterol abundant in the cell membrane (PM), to break the cell membrane so that the nuclear envelope does not break, and remove the cytoplasmic fraction.
  • PM cholesterol abundant in the cell membrane
  • the processing efficiency for obtaining cells having membrane-penetrating cell membrane specificity that only the cell membrane is broken and the nuclear envelope is not broken is not very good, and the processing efficiency is about 1 ⁇ 10 7 cells / mL of cultured cells.
  • the processing efficiency is about 1 ⁇ 10 7 cells / mL of cultured cells.
  • An object of the present invention is to provide a method for fractionating a nuclear-soluble protein having a high processing yield to obtain a cell having a membrane-penetrating cell membrane specificity that only the cell membrane is broken and the nuclear membrane is not broken.
  • a further object of the present invention is to provide a method for fractionating a nuclear soluble protein that can prevent the soluble protein in the nucleus from leaking out of the nucleus through the nuclear pores by diffusion.
  • a further object of the present invention is to provide a kit used for the fractionation method.
  • Non-Patent Document 5 since Non-Patent Document 5 first reported in 1990, and the explanation of the experimental method in 2016 by the first author of Non-Patent Document 5 (Non-Patent Document 6). However, it is supposed to perform cell membrane permeation treatment with digitonin on ice. Also in Non-Patent Document 7 by the group to which the inventor of the present invention belongs, cell membrane permeation treatment with digitonin was performed under a temperature condition of 4 ° C.
  • the inventor of the present invention surprisingly found that the yield of cell membrane-specific permeable cells was higher when the temperature condition of the step of exposing the cells to digitonin was 10 ° C. or higher than on ice. The present invention was completed.
  • the present invention provides a method for fractionating a nuclear soluble protein.
  • the method for fractionating a nuclear soluble protein of the present invention comprises exposing cells to digitonin at a temperature condition of 10 ° C to 42 ° C.
  • the temperature condition can be 25 ° C to 37 ° C.
  • the step of exposing cells to the jigitonin comprises exposing cells at a concentration of at least 1 ⁇ 10 7 cells / mL to the jigitonin to obtain cell membrane-specific permeability.
  • a step of separating the cytoplasmic fraction and the nuclear and insoluble fractions from cells exposed to jigitonin in which the indicated cells are 85% or more can be included.
  • the present invention provides a kit for carrying out the method for fractionating a nuclear-soluble protein of the present invention.
  • the kit of the present invention contains digitonin.
  • the method for fractionating a nuclear-soluble protein of the present invention can include a step of exposing cells to wheat germ agglutinin (hereinafter referred to as "WGA").
  • WGA wheat germ agglutinin
  • the present invention provides a kit for carrying out the method for fractionating a nuclear-soluble protein of the present invention, which comprises the step of exposing cells to the WGA.
  • the kit of the present invention contains digitonin and WGA.
  • On the left is a fluorescence micrograph (GFP-Importin ⁇ ) in which fluorescence by GFP was observed.
  • the center is a fluorescence micrograph (GST-NP NLS-mCherry) in which fluorescence by mCherry is observed.
  • the right is a differential interference contrast micrograph (DIC).
  • A is a cell in which neither the cell membrane nor the nuclear envelope is broken
  • B is a cell in which the cell membrane is broken but the nuclear envelope is not broken
  • C is a cell in which both the cell membrane and the nuclear envelope are broken.
  • the pair in the left photo shows the fluorescent fusion proteins GFP-Iportin ⁇ and GST on the suspension-cultured HeLaS3 cells that have been subjected to cell membrane permeation treatment in the presence of 0 to 200 ⁇ g / mL jigitonin on ice (On ice ( ⁇ 0 ° C.)).
  • -Fluorescence micrographs in which the same field of view was observed with fluorescence by GFP (left of the pair of photographs) and fluorescence by mCherry (right of the pair of photographs) with the addition of mCherry.
  • the graph on the right shows cells whose cell membrane was ruptured but not ruptured as a result of cell membrane permeation treatment (successful (black)), cells whose cell membrane was not ruptured (insufficient (white)), and cell membrane and nuclear envelope.
  • the horizontal axis of the bar graph represents the composition ratio (percentage) of each cell.
  • the pair in the left photo is the same by adding the fluorescent fusion proteins GFP-Iportin ⁇ and GST-mCherry to the suspension culture system HeLaS3 cells that had been subjected to cell membrane permeation treatment in the presence of jigitonin at 25 ° C.
  • the pair in the left photo is a suspension-cultured HeLaS3 subjected to cell membrane permeation treatment in the presence of 100 ⁇ g / mL jigitonin under different temperature conditions (on ice, 10 ° C, 15 ° C, 25 ° C and 37 ° C). Fluorescence micrographs obtained by adding the fluorescence fusion proteins GFP-Iportin ⁇ and GST-mCherly to cells and observing them by fluorescence by GFP (left of the pair of photographs) and fluorescence by mCherry (right of the pair of photographs).
  • the graph on the right shows cells in which the cell membrane was torn but the nuclear envelope was not torn (successful (black)), and cells in which the cell membrane was not torn (insufficient (white)), as a result of the cell membrane permeation treatment under each temperature condition.
  • a bar graph showing the composition ratio (percentage) of cells (over (gray)) in which both the cell membrane and the nuclear envelope are torn.
  • the horizontal axis of the bar graph represents the composition ratio (percentage) of each cell.
  • RPE1 retinal pigment epithelial cell line
  • A549 human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cell line
  • MCF7 human mammary adenocarcinoma cell line
  • U2OS human osteosarcoma cell line
  • a bar graph showing the composition ratio of cells in which the nuclear membrane was not ruptured (successful (black)), cells in which the cell membrane was not ruptured (inclusive (white)), and cells in which both the cell membrane and the nuclear membrane were ruptured (over (gray)).
  • the vertical axis of the bar graph represents the composition ratio (percentage) of each cell.
  • the numbers above each bar graph represent the mean value for three counts, and the error bars represent the standard deviation.
  • Proteins that increased 1.2 times or more and proteins decreased 0.8 times or less at p> 0.05 are represented by white triangles ( ⁇ ) and squares ( ⁇ ), respectively. Proteins with a detected amount ratio of 0.8 or more and 1.2 or less are represented by white circles ( ⁇ ). The representative protein detected showed the gene name.
  • the upper row shows proteins known to be localized only in the cytoplasm (Cytoplasm) (GAPDH, ⁇ -Tubulin and RanBP1), or proteins known to be localized in both the cytoplasm and nucleus (Both) ( ⁇ -actin and). Fluorescence micrograph of HeLaS3 cells adherently cultured using an antibody against Protein ⁇ 1) and an Alexa488-labeled secondary antibody.
  • the middle row shows two types of commercially available cell fractionation kits (Lysople (Fuji Wako) and NE-PER (Thermo)), the method of fractionation using only digitonin of the present invention (Digitonin), and the fractionation by the present invention of digitonin and WGA.
  • Western blot detected by protein antibody The lower row is a band graph showing the results of quantifying the bands of the Western blot in the middle row by densitometry.
  • the gray, black and white parts of the band graph represent the percentages of the cytoplasmic fraction (Cyto), the nuclear fraction (Nuc) and the insoluble fraction (Ptt), respectively.
  • the upper row is known to be localized to proteins (Lamine A / C and Nup62) known to be localized to the nuclear envelope and nuclear foramen complex (Nuclear envelope and NPCs), or to the nucleus (Nucleus).
  • Fluorescent micrographs of HeLaS3 cells adherently cultured with antibodies against proteins (Histon H3, HMGA1, RCC1, RanBP3 and PCNA) and Alexa488-labeled secondary antibodies.
  • the middle row shows two types of commercially available cell fractionation kits (Lysople (Fuji Wako) and NE-PER (Thermo)), the method of fractionation using only digitonin of the present invention (Digitonin), and the fractionation by the present invention of digitonin and WGA.
  • Western blot detected by protein antibody The lower row is a band graph showing the results of quantifying the bands of the Western blot in the middle row by densitometry.
  • the gray, black and white parts of the band graph represent the percentages of the cytoplasmic fraction (Cyto), the nuclear fraction (Nuc) and the insoluble fraction (Ptt), respectively.
  • the upper right end is a fluorescence micrograph of the results of observing the fluorescence emitted by EGFP after fixing the adherently cultured HeLaS3 cells that transiently express EGFP with paraformaldehyde (Para).
  • the right end of the middle row is based on two types of commercially available cell fractionation kits (Lysopur (Fuji Wako) and NE-PER (Thermo)), the method of fractionation using only digitonin of the present invention (Digitonin), and the digitonin and WGA of the present invention.
  • Dysopur Fluji Wako
  • NE-PER Thermo
  • the lower right end is a band graph showing the results of quantifying the Western blot band at the middle right end by densitometry.
  • the rest of the upper row contains antibodies against known proteins (NTF2 (14 kDa), PPIA (18 kDa), PFN1 (15 kDa), TXN (12 kDa) and Ran (24 kDa)) after fixation with paraformaldehyde (Para) or methanol (Meth). Fluorescence micrograph of the adherently cultured HeLaS3 cells used. It was confirmed in FIG. 7 that the leakage of all of the known proteins from the nucleus was suppressed by the addition of WGA.
  • the rest of the middle row consists of two commercially available cell fractionation kits (Lysople (Fuji Wako) and NE-PER (Thermo)), the digitonin-only fractionation method of the present invention (Digitonin), and the digitonin and WGA of the present invention.
  • the cytoplasmic fraction (Cyto), nuclear fraction (Nuc) and insoluble fraction (Ptt) of the suspension-cultured HeLaS3 cells that constantly express the above obtained by the fractionation method (Digitonin + WGA) are described above.
  • the rest of the bottom row is a band graph showing the results of densitometry quantification of the remaining bands of the Western blot in the middle row.
  • the gray, black and white parts of the band graph represent the percentages of the cytoplasmic fraction (Cyto), the nuclear fraction (Nuc) and the insoluble fraction (Ptt), respectively.
  • the numbers in parentheses represent the mass of each protein.
  • NTF2 is another name for NUTF2 (alias symbol).
  • One embodiment of the present invention is a method for fractionating a nuclear soluble protein, which comprises a step of exposing cells to digitonin at a temperature condition of about 10 ° C to about 42 ° C.
  • the percentage of the composition ratio of the cells selectively permeated only by the cell membrane is on ice, that is, the cells subjected to the cell membrane permeation treatment at 0 ° C.
  • the ratio was only 27%, but it was 94%, 85%, 92% and 91%, respectively.
  • the percentage of the composition ratio of the cells exposed to digitonin in a plurality of cultured cells to which only the cell membrane was selectively permeated was 86% to 93%.
  • the temperature condition of the step of exposing cells to digitonin is any temperature within the temperature range of about 10 ° C to about 42 ° C.
  • the temperature conditions are 10 ° C, 11 ° C, 12 ° C, 13 ° C, 14 ° C, 15 ° C, 16 ° C, 17 ° C, 18 ° C, 19 ° C, 20 ° C, 21 ° C, 22 ° C, 23 ° C, 24 ° C, 25 ° C, 26 ° C, 27 ° C, 28 ° C, 29 ° C, 30 ° C, 31 ° C, 32 ° C, 33 ° C, 34 ° C, 35 ° C, 36 ° C, 37 ° C, 38 ° C, 39 ° C, 40 ° C. , 41 ° C. and 42 ° C., any two temperatures selected from the group consisting of 41 ° C.
  • This temperature condition includes about 42 ° C, which is the body temperature of birds such as chickens, and about 39 ° C, which is used for the analysis of mammalian cells and temperature-sensitive mutants of pathogens hosted on mammalian cells.
  • the method for fractionating a nuclear-soluble protein refers to a protein localized in a specific intracellular small organ or subcellular structure among intracellular small organs or subcellular structures that are constituents of a cell in another cell.
  • the intracellular small organs or subcellular structures include nuclei, cytoplasm, endoplasmic reticulum, mitochondria, lysosomes, peroxisomes, Golgi apparatus, other membrane structures, and chromosomes, spindles, centroids, etc. Not limited to.
  • a fraction containing at least one of the cytoplasm and the nucleus but not the other is separated and recovered.
  • the nuclear envelope may also be broken.
  • the nuclear envelope is not torn, that is, even if the nuclear envelope is intact or remains complete, there is a structure in which a large number of proteins called nuclear pores are aggregated.
  • active and passive transport pathways for transport between the nucleus and the cytoplasm through the nuclear pores of which the passive transport pathway also functions in isolated nuclei and is therefore intranuclear.
  • Nuclei especially those that are soluble and have a relatively small molecular weight that can pass through the nuclear pores, leak out of the nucleus. Therefore, the specific separation between the cytoplasmic fraction and the nuclear fraction is to selectively break only the cell membrane among the cell membrane and the nuclear envelope, that is, to obtain a cell in which only the cell membrane is permeable, and to obtain a cell having permeability. It is both important to prevent the leakage of the nucleus to the outside of the nucleus.
  • Non-Patent Document 5 first reported in 1990, and the explanation of the experimental method in 2016 by the first author of Non-Patent Document 5 (Non-Patent Document). Even in 6), cell membrane permeation treatment with digitonin is performed on ice or at a temperature of 4 ° C.
  • the inventor of the present invention surprisingly found that the yield of soluble protein in the nuclear fraction was higher at 10 ° C. than on ice at the temperature condition of the step of exposing cells to digitonin.
  • the concentration of jigitonin in the cell permeation treatment solution used in the step of exposing cells to jigitonin is determined by the presence and concentration of other components in the solution and when the cells are exposed to jigitonin. Can be easily determined by those skilled in the art depending on the temperature conditions of.
  • the concentration of digitonin in the solution is, for example, 100 ⁇ g / mL to 200 ⁇ g / mL when the temperature condition for carrying out the step of exposing the cells to digitonin is any temperature within the temperature range of about 10 ° C to about 42 ° C. It can be any concentration between.
  • ⁇ g / mL 160 ⁇ g / mL, 165 ⁇ g / mL, 170 ⁇ g / mL, 175 ⁇ g / mL, 180 ⁇ g / mL, 185 ⁇ g / mL, 190 ⁇ g / mL, 195 ⁇ g / mL and 200 ⁇ g / mL.
  • Is the lower limit and the upper limit and is the concentration of any digitonin contained in the concentration range of digitonin including the lower limit and the upper limit.
  • the digitonin concentration can also be varied depending on the temperature conditions under which the steps of exposing the cells to digitonin are performed.
  • Non-Patent Document 5 which first reported the cell membrane permeation treatment with jigitonin as a cell permeation treatment solution containing jigitonin. It is isotonic to cells and pH like a buffer (20 mM HEEPS buffer (pH 7.3), 110 mM CH 3 COOK, 2 mM (CH 3 COO) 2 Mg, 5 mM CH 3 COONa and 0.5 mM EGTA). Any solution containing a controllable buffer may be used.
  • the cell permeation treatment solution containing the digitonin includes PBS (3 mM Na 2 HPO 4 , 1.06 mM KH 2 PO 4 and 155 mM NaCl), Linder, M. et al., Which is described in Non-Patent Document 6.
  • PBS 3 mM Na 2 HPO 4 , 1.06 mM KH 2 PO 4 and 155 mM NaCl
  • Linder, M. et al. which is described in Non-Patent Document 6.
  • a modified digitonin-containing cell membrane permeation buffer 25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 25 mM CH 3 COOK, 7.5 mM MgCl 2 , 250 mM sucrose.
  • 0.5 mM DTT and 0.5 mM EGTA Digiton , J. Mol. D. (Nucl.
  • a cell reprogramming buffer 50 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 20 mM HEPES pH 8.2 and 1 mM DTT
  • streptolysin O Solutions including, but not limited to, may be used.
  • BSA, polyvinylpyrrolidone, etc. may be added to the cell permeation treatment solution containing digitonin, for example, 10 mg / mL.
  • an energy supply reaction system using ATP for example, 2 mM
  • glycolysis or other enzymes may be added.
  • potassium, magnesium and sodium ions may be replaced with chloride (MgCl 2 , etc.) instead of acetate.
  • the method for fractionating the nuclear-soluble protein of the present invention is NP-40, Nonidet P-40, IGEPAL CA-630, Tween-20, Tween-80, Brij-35, Brij-58, Triton X-100, Triton X-. It may not contain at least one or all of the surfactants selected from the group consisting of 114, octyl glucoside, octyl thio glucoside, SDS, CHAPS and CHASPO.
  • Non-Patent Document 5 a transport buffer (20 mM HEPES buffer (pH 7.3), 110 mM CH 3 COOK, 2 mM (CH 3 COO) 2 Mg, 5 mM CH 3 ). COONa and 0.5 mM EGTA), PBS (3 mM Na 2 HPO 4 , 1.06 mM KH 2 PO 4 and 155 mM NaCl), Linder, M. et al. I. (Dev.
  • the lower limit of the treatment time that can be adopted in the nuclear-soluble protein fractionation method of the present invention may be, for example, usually 30 seconds or longer, preferably 1 minute or longer, 3 minutes or longer, or 5 minutes or longer. Not limited to.
  • the upper limit of the processing time may be, for example, usually 2 hours or less, preferably 1 hour or less, 45 minutes or less, 30 minutes or less, or 15 minutes or less, but is not limited thereto.
  • the treatment time is, for example, about 5 minutes under a temperature condition of 10 ° C. to 42 ° C. and a concentration condition of digitonin of 100 ⁇ g / mL to 200 ⁇ g / mL, for example. , 4.5 minutes, 4.6 minutes, 4.7 minutes, 4.8 minutes, 4.9 minutes, 5.0 minutes, 5.1 minutes, 5.2 minutes, 5.3 minutes, 5.4 minutes
  • Any two processing times selected from the group consisting of 5.5 minutes can be set as the lower limit and the upper limit, and any processing included in the range of the processing time including the lower limit and the upper limit can be adopted. Not limited to.
  • the target to which the nuclear-soluble protein fractionation method of the present invention is applied is eukaryotic cells having both a cell membrane and a nuclear envelope.
  • the target to which the method for fractionating the nuclear-soluble protein of the present invention is applied is preferably cells belonging to the animal kingdom, plant kingdom and fungal kingdom, more preferably cells belonging to the animal kingdom, preferably vertebrates and invertebrates, and from 10 ° C. More preferably, cells of an animal having a body temperature of 42 ° C. or an animal capable of surviving under temperature conditions of 10 ° C. to 42 ° C.
  • the target to which the method for fractionating the nuclear-soluble protein of the present invention is applied may be cells of animals belonging to fish, amphibians, reptiles, birds and mammals.
  • the target to which the method for fractionating the nuclear-soluble protein of the present invention is applied may be cells freshly isolated from an individual organism, or cultured cells obtained by culturing and proliferating the freshly isolated cells in vitro.
  • the target to which the method for fractionating the nuclear-soluble protein of the present invention is applied is a cultured cell
  • the cultured cell may be a suspension-cultured cell or a cell adhered to a substrate.
  • the target to which the method for fractionating the nuclear-soluble protein of the present invention is applied is transformed, whether it is a normal cell, a primary cultured cell, a non-immortalized cell, or a cell having a limited number of passages. It can be a cell, a lined cell, or any other immortalized cell.
  • the target to which the method for fractionating the nuclear-soluble protein of the present invention is applied is selected from the group consisting of undifferentiated pluripotent stem cells, trophic extracellular embryo cells, intracellular embryonic follicle cells / mesodermal cells, ectodermal cells and primordial germ cells. It may be an undifferentiated cell, a differentiated cell or a dedifferentiated cell derived from any of the cells. Undifferentiated cells include cells capable of differentiating into any differentiated cell type and cells that have lost the ability to differentiate into any differentiated cell type.
  • the target to which the method for fractionating the nuclear-soluble protein of the present invention is applied is preferably cells containing more cholesterol in the cell membrane than in the nuclear envelope.
  • the subjects to which the method for fractionating the nuclear-soluble protein of the present invention is applied are HeLaS3 suspension cultured cells and adherent cultured cells (human-derived, cervical epithelioma) and RPE1 (human-derived, human-derived) used in the examples of the present specification.
  • TIG cell lines such as TIG-1 (human-derived, fibroblasts), aging research cells such as WI-38 (human-derived, normal lung normal diploid fibroblasts), HCT116 (human-derived, colon cancer) , NIH3T3 (mouse-derived, fibroblast line), HEK293 (human fetal kidney cell), HEK293T (HEK293 expressing SV40 virus T antigen), HUVEC (human-derived, umbilical vein endothelial cell), C2C12 (mouse-derived, immortalized) Myoblasts), THP-1 (human-derived, acute monocytic leukemia), HL60
  • any temperature condition may be used in steps other than the step of exposing cells to digitonin. Temperature conditions on ice or at 4 ° C. can also be used. Protease inhibitors can be used in combination to prevent the protein of interest from being degraded by proteases, but the temperature conditions of steps other than the step of exposing cells to jigitonin are on ice at 4 ° C and other low temperatures. Doing so also leads to suppression of protease activity.
  • One embodiment of the present invention is a method for fractionating a nuclear soluble protein, which comprises a step of exposing cells to digitonin at a temperature condition of about 25 ° C to about 37 ° C.
  • the temperature conditions used in the step of exposing cells to digitonin in the nuclear soluble protein fractionation method of this embodiment are 25 ° C, 26 ° C, 27 ° C, 28 ° C, 29 ° C, 30 ° C, 31 ° C.
  • Any two temperatures selected from the group consisting of 32 ° C, 33 ° C, 34 ° C, 35 ° C, 36 ° C and 37 ° C are set as the lower limit and the upper limit, and any temperature included in the temperature range including the lower limit and the upper limit. Is.
  • One embodiment of the invention comprises exposing cells at a concentration of at least 1 ⁇ 10 7 cells / mL to the jigitonin, wherein the cells exhibiting cell membrane-specific permeability. It is a method for fractionating a nuclear soluble protein of the present invention, which comprises a step of separating a cytoplasmic fraction, a nuclear fraction and an insoluble fraction from cells containing 85% or more.
  • 1 ⁇ 10 7 cells / mL, 1.25 ⁇ 10 7 cells / mL or higher concentrations for example, 2 ⁇ 10 7 cells / mL, 3 ⁇ 10 7 Cells / mL, 4 ⁇ 10 7 cells / mL, 5 ⁇ 10 7 cells / mL, 7 ⁇ 10 7 cells / mL, 1 ⁇ 10 8 cells / mL can be used.
  • the step of exposing cells to digitonin according to the method of the present invention even if the high concentration cells are exposed to digitonin, at least 85%, 91% or more, 92% or more of the cells exhibit cell membrane-specific permeability.
  • the cell membrane-specific permeability means that the cell membrane is torn, but the nuclear envelope is not.
  • the proportion of cells exhibiting cell membrane-specific permeability is determined from their localization by adding, for example, the fluorescent fusion proteins GFP-Importin ⁇ and GST-mCherry, as described in Examples 2, 3 or 4. be able to. At least 85% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, or 97% or more, or 86% or more, 91% or more, 92% or more of cells exhibit cell membrane-specific permeability.
  • 93% or more of the cells exposed to digitonin are cells exposed to digitonin in which the cell membrane is broken but the nuclear membrane is not broken, at least 85% or more and 91% or more. , 92% or more, 93% or more, 94% or more, or 97% or more, or 86% or more, 91% or more, 92% or more, or 93% or more.
  • the cells having 85% or more of the cells exhibiting the cell membrane-specific permeability are obtained by exposing the cells at a concentration of at least 1 ⁇ 10 7 cells / mL to the digitonin.
  • the nuclear envelope is not broken, that is, the nuclear envelope is intact in the step of obtaining cells having a permeability in the cell membrane, which is specific to the cytoplasmic fraction and the nuclear fraction.
  • the method for fractionating a nuclear-soluble protein of the present invention is performed after the step of separating the cytoplasmic fraction, the nuclear fraction and the insoluble fraction from the cells having 85% or more of the cells exhibiting the cell membrane-specific permeability.
  • the step of breaking the nuclear envelope that is, obtaining a cell having a permeable nuclear envelope other than the nuclear pore
  • the method for fractionating a nuclear-soluble protein of the present invention may include a step of separating a nuclear fraction and an insoluble fraction after a step of obtaining cells having a nuclear membrane other than the nuclear pores having permeability.
  • the method for fractionating nuclear soluble proteins of the invention further comprises exposing cells to WGA. It is known that the lectin WGA inhibits nuclear cytoplasmic transport (Finlay, DR et al., J. Cell Biol., 104: 189-200 (1987), and Mohr, D. et al., EMBO, 28: 2541-2553 (2009)). Therefore, exposure of cells to WGA can prevent nuclear proteins from leaking out of the nucleus, and the method for fractionating nuclear soluble proteins of the present invention more accurately separates soluble proteins localized in the nucleus. to enable. FIG.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a method for fractionating a nuclear-soluble protein according to the prior art (upper and middle) and the present invention (lower) in comparison with each other. Since WGA blocks NPCs (nuclear pore complexes), it can prevent nuclear proteins from leaking out of the nucleus.
  • WGA can be WGA conjugated with biotin or other ligand.
  • biotinylated WGA can be easily adsorbed and removed when mixed with streptavidin immobilized on a solid support such as beads.
  • streptavidin immobilized on a solid support such as beads.
  • streptavidin immobilized on a solid support such as beads.
  • the specific binding of avidin or streptavidin to biotin the specific binding of two complementary oligonucleotides, lectins other than WGA and their recognition sugars, effector and receptor molecules, cofactors and enzymes, enzymes And an enzyme inhibitor or the like.
  • the step of exposing the cells to WGA is performed at the same time as the step of exposing the cells to digitonin.
  • the step of exposing the cells to WGA may be started before the step of exposing the cells to digitonin, provided that the WGA coexists in the step of exposing the cells to digitonin.
  • WGA may remain after the process of exposing cells to digitonin is complete.
  • One embodiment of the present invention is a kit for carrying out the method for fractionating a nuclear soluble protein of the present invention.
  • the kit of the present invention contains digitonin.
  • the transport buffer (20 mM HEEPS buffer (pH 7.3), 110 mM CH 3 COOK) described in Non-Patent Document 5, which first reported the cell membrane permeation treatment with jigitonin.
  • Any solution containing a buffer that is isotonic to cells and can control pH, such as 2 mM (CH 3 COO) 2 Mg, 5 mM CH 3 COONa and 0.5 mM EGTA) may be used. ..
  • the cell permeation treatment solution containing digitonin in the kit of the present invention includes PBS (3 mM Na 2 HPO 4 , 1.06 mM KH 2 PO 4 and 155 mM NaCl) described in Non-Patent Document 6. Linder, M. et al. I. (Dev. Cell, 43: 141-156 (2017)), a modified digitonin-containing cell membrane permeation buffer (25 mM HEPES-KOH pH 7.6, 25 mM CH 3 COOK, 7.5 mM MgCl 2 , 250 mM sucrose). , 0.5 mM DTT and 0.5 mM EGTA), Digiton ,, J. Mol. D. (Nucl.
  • kits for carrying out the cell fractionation method of the present invention include NP-40, Nonidet P-40, IGEPAL CA-630, Tween-20, Tween-80, Brij-35, Brij-58, Triton X-100, It may not contain at least one surfactant selected from the group consisting of Triton X-114, octyl glucoside, octyl thio glucoside, SDS, CHASPS and CHASPO.
  • kits for carrying out the cell fractionation method of the present invention include NP-40, Nonidet P-40, IGEPAL CA-630, Tween-20, Tween-80, Brij-35, Brij-58, It may be free of all surfactants in the group consisting of Triton X-100, Triton X-114, octyl glucoside, octyl thio glucoside, SDS, CHASPS and CHASPO.
  • the kit for carrying out the cell fractionation method of the present invention includes a transport buffer (20 mM HEPES buffer (pH 7.3), 110 mM CH 3 COOK, 2 mM (CH 3 COO) 2 Mg) described in Non-Patent Document 5.
  • Cell reprogramming buffer using streptricin O (50 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 20 mM HEPES pH 8.2 and 1 mM DTT). May not contain salts with higher ionic strength than the ionic strength of any of the buffers selected from the group consisting of. For example, it does not contain 420 mM NaCl, 1M urea and the like.
  • the kit for carrying out the method for fractionating nuclear soluble proteins of the invention comprises WGA.
  • the WGA can be a WGA conjugated to biotin or other ligand.
  • the adnominal adjective "about” that modifies a numerical value means that the numerical value is in the numerical range of 90% or more and 110% or less of the numerical value.
  • “about 40%” refers to a percentage in the numerical range of 36% or more and 44% or less.
  • Example 1 Visualization of Permeation Status of Cell Membrane and Nuclear Envelope Using Model Protein
  • a method for visualizing cells in which the cell membrane is torn but the nuclear envelope is not torn was examined.
  • GFP-Importin ⁇ None of the fluorescent fusion proteins GFP-Importin ⁇ , GST-NP NLS-mCherry and GST-mCherry can permeate the cell membrane. However, GFP-Importin ⁇ can reach the inside of the nucleus by interacting with the nuclear pores by itself if the cell membrane is broken. On the other hand, GST-NP NLS-mCherry and GST-mCherry can enter the cytoplasm if the cell membrane is broken, but cannot enter the nucleus if the nuclear membrane is not broken.
  • GFP-Importin ⁇ and GST-NP NLS-mCherry or GST-mCherry are added extracellularly, the cells distributed in the cytoplasm and nucleus of both cells have both the cell membrane and the nuclear envelope broken. Only GFP-Importin ⁇ is distributed in the cytoplasm and nucleus, and in GST-NP NLS-mCherry or GST-mCherry, only the cell membrane is broken in the cells distributed only in the cytoplasm. And in the cells that are not distributed in the cytoplasm and nucleus, the cell membrane is not broken.
  • the jigitonin solution is a basic buffer (20 mM HEPES buffer (pH 7.3), 110 mM CH 3 COOK, 2 mM (CH 3 COO) 2 Mg, 5 mM CH 3 COONa, 0.5 mM EGTA) to which jigitonin at a concentration of 40 ⁇ g / mL is added.
  • a protease inhibitor couplete TM, EDTA-free, protease inhibitor buffer (Sigma Aldrich Japan GK)).
  • FIG. 2 shows the localization of the two fluorescent fusion proteins after being treated with a 40 ⁇ g / mL jigitonin solution at 25 ° C for 5 minutes for cell membrane permeation and then mixed with the fluorescent fusion proteins GFP-Importin ⁇ and GST-NP NLS-mCherry.
  • This is a microscopic photograph taken by selecting a field in which different cells coexist.
  • the left side of FIG. 2 is a fluorescence microscope photograph (GFP-Importin ⁇ ) in which fluorescence by GFP is observed
  • the center of FIG. 2 is an optical microscope photograph (GST-NP NLS-mCherry) in which fluorescence by mCherry is observed.
  • To the right of is a differential interference contrast micrograph (DIC).
  • DIC differential interference contrast micrograph
  • A is a cell in which neither the cell membrane nor the nuclear envelope is broken
  • B is a cell in which the cell membrane is broken but the nuclear envelope is not broken
  • C is a cell in which neither the cell membrane nor the nuclear envelope is broken. Represents a cell.
  • A is a cell in which no fluorescence of both fused fluorescent proteins is observed, which means a cell in which neither the cell membrane nor the nuclear envelope is broken.
  • B the fluorescence of GFP-Importin ⁇ is observed in both the cytoplasm and the nucleus, but the fluorescence of GST-NP NLS-mCherry is observed only in the cytoplasm.
  • the membrane means unbroken cells.
  • C is a cell in which the fluorescence of both fused fluorescent proteins is observed in the cytoplasm and nucleus, which means a cell in which both the cell membrane and the nuclear envelope are broken.
  • Example 2 Examination of temperature and digitonin concentration in cell membrane permeation treatment
  • the temperature and digitonin concentration in cell membrane permeation treatment were examined.
  • HeLaS3 suspension cultured cells were reacted in 800 ⁇ L of digitonin solution under different temperature (On ice ( ⁇ 0 ° C.) or 25 ° C.) conditions for 5 minutes to perform cell membrane permeation treatment, and then cell membrane permeation treatment was performed.
  • Fluorescent fusion proteins GFP-Importin ⁇ and GST-mCherry were added and the cell status was determined from their localization.
  • the jigitonin solution is a basic buffer (20 mM HEPES buffer (pH 7.3), 110 mM CH 3 COOK, 2 mM (CH 3 COO) 2 Mg, 5 mM CH 3 COONa, to which jigitonin having a concentration of 0 ⁇ g / mL to 200 ⁇ g / mL is added.
  • 0.5 mM EGTA and protease inhibitor buffer 0.5 mM EGTA and protease inhibitor buffer).
  • the pair in the left photo of FIG. 3-1 shows the fluorescence fusion protein GFP- on HeLaS3 cells suspended-cultured on ice (On ice ( ⁇ 0 ° C.) in the presence of 0-200 ⁇ g / mL jigitonin and subjected to cell membrane permeation treatment. It is a fluorescence micrograph of the same field observed by fluorescence by GFP (left of the pair of photographs) and fluorescence by mCherry (right of the pair of photographs) with the addition of Importin ⁇ and GST-mCherry. Right of FIG. 3-1.
  • the graph shows cells in which the cell membrane was ruptured but the nucleus membrane was not ruptured as a result of the cell membrane permeation treatment (fluorescence (black)), cells in which the cell membrane was not ruptured (insufficient (white)), and both the cell membrane and the nucleus membrane. It is a bar graph showing the composition ratio (percentage) of torn cells (over (gray)).
  • the pair in the left photograph of FIG. 3-2 is a cell membrane permeation treatment at 25 ° C. in the presence of 0 to 200 ⁇ g / mL jigitonin.
  • Fluorescence fusion proteins GFP-Importin ⁇ and GST-mCherly were added to the treated HeLaS3 cells, and the same field was observed by fluorescence by GFP (left of the pair in the photo) and fluorescence by mCherry (right of the pair in the photo).
  • the graph on the right of FIG. 3-2 shows cells in which the cell membrane was torn but the nuclear membrane was not torn (successful (black)) and cells in which the cell membrane was not torn (successful (black)) as a result of the cell membrane permeation treatment.
  • the cell membrane was torn but the nuclear envelope was torn in almost all cells at a concentration of 150 ⁇ g / mL or more on ice and 100 ⁇ g / mL or more at 25 ° C. I didn't. That is, it can be said that only the cell membrane could be selectively permeated. From this, it was possible to carry out the permeation treatment with a lower concentration of digitonin at 25 ° C. than on ice ( ⁇ 0 ° C.), which is usually performed.
  • Example 3 Examination of temperature conditions in cell membrane permeation treatment
  • the digitonin concentration was fixed at 100 ⁇ g / mL, and the temperature conditions in cell membrane permeation treatment were examined in more detail.
  • Cell membrane permeation treatment was performed by reacting 1 ⁇ 10 7 HeLaS3 suspension cultured cells in 800 ⁇ L of digitonin solution under different temperature (On ice, 10 ° C, 15 ° C, 25 ° C or 37 ° C) conditions for 5 minutes. Then, the fluorescent fusion proteins GFP-Importin ⁇ and GST-mCherry were added, and the cell status was judged from their localization.
  • the digitonin solution was prepared as a basic buffer (20 mM HEPES buffer (pH 7.3), 110 mM CH 3 COOK, 2 mM (CH 3 COO) 2 Mg, 5 mM CH 3 COONa, 0.5 mM EGTA," to which 100 ⁇ g / mL digitonin was added. And a protease inhibitor buffer).
  • the pair in the left photo of FIG. 4 is a suspension subjected to cell membrane permeation treatment in the presence of 100 ⁇ g / mL jigitonin under different temperature conditions (on ice, 10 ° C, 15 ° C, 25 ° C or 37 ° C). It is a fluorescence micrograph of the cultured HeLaS3 cells to which the fluorescence fusion proteins GFP-Importin ⁇ and GST-mCherry were added and observed by fluorescence by GFP (left of the pair in the photograph) and fluorescence by mCherry (right of the pair in the photograph). .. The graph on the right of FIG.
  • the cell membrane permeation treatment with digitonin is performed at a temperature of 10 ° C. or higher.
  • the cell membrane permeation treatment was performed at 10 ° C. or higher.
  • the results showed that 85% to 94% of the cells were selectively permeabilized only in the cell membrane, which was more than three times as many.
  • Example 4 Examination of cell membrane permeation treatment efficiency in different cell types
  • the jigitonin concentration was fixed at 100 ⁇ g / mL
  • the cell type was derived from HeLaS3 of the human suspension cultured cells used in Examples 1 to 3.
  • the temperature conditions in the cell membrane permeation treatment were examined in more detail using four types of cultured human cells.
  • RPE1 Human retinal pigment epithelial cell line
  • A549 human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cell line
  • MCF7 human mammary adenocarcinoma cell line
  • U2OS human osteosarcoma cell line
  • the fusion proteins GFP-Iportin ⁇ and GST-mCherry were added and the cell status was determined from their localization.
  • the cell condition was evaluated for 100 or more cells under each condition, and only the cell membrane was torn and the nuclear membrane was not torn, the cell with insufficient fluorescence fusion protein permeability of the cell membrane, or both the cell membrane and the nuclear membrane.
  • the operation of classifying and counting cells that permeate the fluorescent fusion protein of the cell membrane was repeated three times.
  • the digitonin solution was prepared as a basic buffer (20 mM HEPES buffer (pH 7.3), 110 mM CH 3 COOK, 2 mM (CH 3 COO) 2 Mg, 5 mM CH 3 COONa, 0.5 mM EGTA, and 0.5 mM EGTA) to which 100 ⁇ g / mL digitonin was added. , Protease inhibitor buffer).
  • FIG. 5 shows an evaluation of the cell status of 100 or more cells of cultured human cells RPE1, A549, MCF7 and U2OS after cell membrane permeation treatment under 25 ° C. and on ice temperature conditions.
  • Cells obtained by repeating classification and counting three times, in which only the cell membrane was ruptured and the nuclear membrane was not ruptured (successful (black)), cells in which the cell membrane was not ruptured (insufficient (white)), and the cell membrane and nuclear membrane
  • the vertical axis of the bar graph represents the composition ratio (percentage) of each cell.
  • the numbers above each bar graph represent the mean value for three counts, and the error bars represent the standard deviation.
  • the efficiency of tearing only the cell membrane may be significantly reduced depending on the cell type, but in the cell membrane permeation treatment at 25 ° C., 80 in all four types. It was shown that a treatment in which only the cell membrane was torn was achieved with% or more cells. In particular, the efficiency was 90% or more in the three types of cells, hTERT-RPE1, A549, and MCF7. On the other hand, it is considered that the efficiency of U2OS is a little low because the cells are easily damaged at the time of the operation after the Trypsin treatment due to the characteristics of the cells.
  • the nuclear-soluble protein fractionation method of the present invention can permeate only the cell membrane with high efficiency without being significantly affected by the cell type.
  • Example 5 Suppression of leakage of nuclear-soluble protein into cytoplasm by WGA
  • suppression of leakage of nuclear-soluble protein into cytoplasm in the method for fractionating nuclear-soluble protein of the present invention was examined.
  • the suspension-cultured HeLaS3 cells constantly expressing 1 ⁇ 10 7 EGFPs were reacted at 25 ° C. for 5 minutes in 800 ⁇ L of a cell permeation treatment solution to perform cell membrane permeation treatment.
  • the cell permeation treatment solution is based on a basic buffer consisting of 20 mM HEEPS buffer (pH 7.3), 110 mM CH 3 COOK, 2 mM (CH 3 COO) 2 Mg, 5 mM CH 3 COONa, 0.5 mM EGTA and a protease inhibitor cocktail.
  • Basic buffer without digitonin (w / o Digitonin)
  • basic buffer with NP-40 added (0.1% NP-40)
  • basic buffer with added digitonin 100 ⁇ g / ml Digitonin
  • digitonin 100 ⁇ g / ml Biotinylated WGA
  • a basal buffer to which GST-mCherry was added was added.
  • FIG. 6 shows HeLaS3 cells in suspension culture that constitutively express EGFP under different cell membrane permeation conditions (w / o Digitonin), NP-40 (0.1% NP-40), and digitonin (100 ⁇ g / ml). It is a fluorescence micrograph of the same field observed under different optical conditions after treatment with (Digitonin) or with digitonin and WGA (100 ⁇ g / ml Digitonin + 100 ⁇ g / ml Biotinylated WGA). The left is a fluorescence micrograph of observing fluorescence by EGFP, and the right is a fluorescence micrograph of observing fluorescence by GST-mCherry.
  • EGFP is not present in the cytoplasm or nucleus, but GST-mCherry is present only in the cytoplasm. This means that the cell membrane is torn and the nuclear envelope is not torn, but the EGFP (mass about 26 kDa) originally present in the nucleus leaked through a passive transport pathway by free diffusion.
  • EGFP is present only in the nucleus, but GST-mCherry is It is present only in the cytoplasm. This means that the cell membrane is torn and the nuclear envelope is not torn, but the leakage of EGFP (mass of about 26 kDa) originally present in the nucleus was suppressed by WGA.
  • Example 6 Comprehensive study on suppression of leakage of endogenous nucleoprotein into the cytoplasm by WGA
  • Example 5 the effect of WGA on suppression of leakage of forcedly expressed EGFP was observed, but the same was true for endogenous protein. Whether or not it showed an effect was verified by comparative quantitative mass spectrometry (iTRAQ method).
  • Sample preparation for the iTRAQ method was performed according to the following procedure. 1) Transfer 1 ⁇ 10 7 suspension-cultured HeLaS3 cells to a 1.5 mL tube, centrifuge, and then remove the supernatant. 2) Add 1 mL of basal buffer (20 mM HEPES buffer (pH 7.3), 110 mM CH 3 COOK, 2 mM (CH 3 COO) 2 Mg, 5 mM CH 3 COONa, 0.5 mM EGTA and protease inhibitor cocktail) and suspend. , Centrifuge and remove the supernatant.
  • basal buffer (20 mM HEPES buffer (pH 7.3), 110 mM CH 3 COOK, 2 mM (CH 3 COO) 2 Mg, 5 mM CH 3 COONa, 0.5 mM EGTA and protease inhibitor cocktail
  • FIG. 7 shows a comparative quantitative mass spectrometry (iTRAQ method) for proteins contained in the nuclear soluble fraction obtained by cell membrane permeation treatment with digitonin (Dig) or cell membrane permeation treatment with digitonin and WGA (Dig + WGA). It is a scatter diagram which shows the analysis result used.
  • the horizontal axis of the figure represents the mass of each detected protein in kDa units, and the vertical axis of the figure represents the ratio of the detected amount of the individual protein to the detected amount of the individual protein by the digitonin + WGA treatment.
  • Proteins increased 1.2 times or more and proteins decreased 0.8 times or less at p ⁇ 0.05 are represented by filled triangles ( ⁇ ) and squares ( ⁇ ), respectively.
  • Proteins that increased 1.2 times or more and proteins decreased 0.8 times or less at p> 0.05 are represented by white triangles ( ⁇ ) and squares ( ⁇ ), respectively. Proteins with a detected amount ratio of 0.8 or more and 1.2 or less are represented by white circles ( ⁇ ). The representative protein detected showed the gene name.
  • the comparative quantitative mass spectrometry of the cells subjected to the cell membrane permeation treatment was repeated three times, and a total of 1566 kinds of proteins detected in all three times were analyzed.
  • the protein ( ⁇ or ⁇ ) in which the ratio of the detected amount by jigitonin + WGA treatment to the detected amount by jigitonin treatment decreased to 0.8 times or less, that is, from the nuclear fraction significantly despite the addition of WGA.
  • the proteins in which the decrease was observed are a wide range of proteins having a molecular weight of 25 k or more and 175 k or less, and include nucleoporins (NUP54, NUP88, NUP93 and NUP160) constituting the nuclear pore complex. It is considered that these proteins migrated from the nuclear fraction to the insoluble fraction in the same manner as Nup62 shown in the experimental result of FIG. In some cases, glycoproteins (eg, Nup54, Nup93 and Nup88) that have undergone some O-linked GlcNAc modifications regardless of their molecular weight and their related factors (Nup160) are less than when treated with digitonin alone. There was a club.
  • Example 7 Examination of intracellular localization of known proteins by the method for fractionating nuclear-soluble proteins of the present invention Localization of proteins expressed in HeLaS3 cells and for which specific antibodies are available can be localized in HeLaS3 cells that have been adherently cultured. Fractionation of nuclear-soluble proteins including immuno-cell chemistry with Alexa488-labeled secondary antibody and cell membrane permeabilization with jigitonin (Dig) or cell membrane permeabilization with jigitonin and WGA (Dig + WGA) of the present invention. Each of the cytoplasmic fraction, nuclear fraction and insoluble fraction fractionated by the method was separated by electrophoresis and detected by the Western blotting method, and the percentage of the abundance ratio in each fraction was determined by densitometry.
  • Lysopure Trademark
  • Lysopure (Trademark) Nuclear / Cytoplasmic Protein Extractor Kit (Lysopure (Fuji Wako), Product Code 295-73901) sold by FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd. and Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.
  • NE-PER TM Nuclear and Cytoplasmic Extension Reagents (NE-PER (Thermo), Catalog No. 78833) sold by the respective manufacturers were used according to the instructions given by their respective manufacturers.
  • the method for fractionating the nuclear-soluble protein of the present invention in this example was carried out by the following procedure. 1) Transfer 1 ⁇ 10 7 suspension-cultured HeLaS3 cells that constitutively express the EGFP to a 1.5 mL tube, centrifuge, and then remove the supernatant. 2) Add 1 mL of basal buffer (20 mM HEPES buffer (pH 7.3), 110 mM CH 3 COOK, 2 mM (CH 3 COO) 2 Mg, 5 mM CH 3 COONa, 0.5 mM EGTA and protease inhibitor cocktail) and suspend. , Centrifuge and remove the supernatant.
  • basal buffer (20 mM HEPES buffer (pH 7.3), 110 mM CH 3 COOK, 2 mM (CH 3 COO) 2 Mg, 5 mM CH 3 COONa, 0.5 mM EGTA and protease inhibitor cocktail
  • the commercially available kit NE-PER and the cytoplasmic fraction obtained by the cell fractionation method of Digitonin and Digitonin + WGA of the present invention were concentrated using Amicon Ultra-0.5 10 kDa (MERCK UFC501024) until the total amount became 500 ⁇ L or less. .. Then, all cytoplasmic and nuclear fractions were adjusted to 500 ⁇ L by adding PBS. Next, 1.5 mL of 100% acetone kept warm at ⁇ 30 ° C. was added and mixed, and the mixture was allowed to stand at ⁇ 30 ° C. for 3 hours. Centrifuged at 500 xg for 5 minutes, supernatant removed, dissolved in 200 ⁇ L sample buffer, boiled at 95 ° C.
  • FIG. 8 GAPDH (0.4 ⁇ L), ⁇ Tubulin (1 ⁇ L), RanBP1 (5 ⁇ L), ⁇ actin (2.5 ⁇ L) and Importin ⁇ 1 (5 ⁇ L).
  • FIG. 8 GAPDH (0.4 ⁇ L), ⁇ Tubulin (1 ⁇ L), RanBP1 (5 ⁇ L), ⁇ actin (2.5 ⁇ L) and Importin ⁇ 1 (5 ⁇ L).
  • FIG. 10 NTF2 (5 ⁇ L), PPIA (2.5 ⁇ L), PFN1 (5 ⁇ L), TXN (5 ⁇ L), Ran (0.4 ⁇ L) and GFP (1 ⁇ L).
  • FIG. 8 shows a protein known to be localized only in the cytoplasm (Cytoplasm) (GAPDH, ⁇ -Tubulin and RanBP1), or a protein known to be localized in both the cytoplasm and the nucleus (Both) ( ⁇ ).
  • Cytoplasm Cytoplasm
  • Both a protein known to be localized in both the cytoplasm and the nucleus
  • FIG. 8 shows two types of commercially available cell fractionation kits (Lysopur (Fuji Wako) and NE-PER (Thermo)), a method for fractionation using only digitonin of the present invention (Digitonin), and digitonin of the present invention.
  • WGA Digitonin + WGA
  • the lower part of FIG. 8 is a band graph showing the result of quantifying the band of the western blot in the middle part by densitometry.
  • the gray, black and white parts of the band graph represent the percentages of the cytoplasmic fraction (Cyto), the nuclear fraction (Nuc) and the insoluble fraction (Ptt), respectively.
  • the three types of GAPDH, ⁇ -Tubulin, and RanBP1 mainly localized in the cytoplasm were fractionated mainly into the cytoplasmic fraction by all the nuclear soluble protein fractionation methods.
  • GAPDH is often used as a cytoplasmic marker, a part of it is also localized in the nucleus as can be seen from the immunostaining image.
  • digitonin or digitonin + WGA of the present invention a part thereof is also detected in the nuclear fraction. This is a result supporting that the method for fractionating the nuclear-soluble protein of the present invention more accurately reflects the intracellular localization than the commercially available kit of the comparative example. Similar results were obtained for ⁇ -actin and Importin- ⁇ , which are localized in both the cytoplasm and the nucleus.
  • FIG. 9 shows proteins (Lamine A / C and Nup62) known to be localized in the nuclear envelope and nuclear envelope complex (Nuclear envelope and NPCs) or the nucleus (Nucleus).
  • proteins Lamine A / C and Nup62
  • Nucleus Nucleus
  • Histon H3, HMGA1, RCC1, RanBP3 and PCNA an Alexa488-labeled secondary antibody.
  • FIG. 9 shows two types of commercially available cell fractionation kits (Lysopur (Fuji Wako) and NE-PER (Thermo)), a method for fractionation using only digitonin of the present invention (Digitonin), and the digitonin of the present invention.
  • WGA Digitonin + WGA
  • the lower part of FIG. 9 is a band graph showing the result of quantifying the band of the western blot in the middle part by densitometry.
  • the gray, black and white parts of the band graph represent the percentages of the cytoplasmic fraction (Cyto), the nuclear fraction (Nuc) and the insoluble fraction (Ptt), respectively.
  • lamin A / C which stably forms a network structure in the inner membrane of the nuclear envelope, is divided into a nuclear-soluble protein fractionation method using jigitonin and a nuclear-soluble protein fractionation method using jigitonin + WGA.
  • it is not fractionated into the nuclear fraction, but it is often detected in commercial products. It is considered that this is because it is forcibly solubilized by a surfactant or the like contained in a commercially available product.
  • Nup62 is a component of the nuclear pore complex and is a representative binding partner of WGA added to prevent leakage of nuclear proteins.
  • Nup62 is originally present in the cytoplasm and nucleoplasm in addition to the nuclear pore complex, it binds to WGA and is fractionated into an insoluble fraction during treatment.
  • Nup54 constituting the nuclear pore complex Nup93 and Nup160 are included, and these are also considered to have the same reason as Nup62.
  • the proteins constituting chromatin such as histone H3 are fractionated into the insoluble fraction by any of the nuclear soluble protein fractionation methods.
  • factors bound to chromatin such as HMGA1 and RCC1 are insoluble when fractionated by the method for fractionating a nuclear-soluble protein by digitonin of the present invention and the method for fractionating a nuclear-soluble protein by digitonin + WGA of the present invention.
  • Many fractions were fractionated, but most of the commercially available products were extracted as nuclear fractions. It is considered that this is forcibly eluted with a surfactant or the like like Lamine A / C.
  • the soluble nuclear proteins RanBP3 and PCNA are fractionated into nuclear fractions only by the method for fractionating the nuclear soluble protein by the jigitonin of the present invention and the fractionation method of the nuclear soluble protein by the jigitonin + WGA of the present invention, and are commercially available.
  • the method for fractionating a nuclear-soluble protein by digitonin of the present invention and the method for fractionating a nuclear-soluble protein by digitonin + WGA of the present invention have a soluble fraction in the nucleus in a form closer to true localization. It can be said that it can be obtained.
  • FIG. 10 The upper right end of FIG. 10 is a fluorescence micrograph of the results of observing the fluorescence emitted by EGFP after fixing the adherently cultured HeLaS3 cells that transiently express EGFP with paraformaldehyde (Para).
  • two types of commercially available cell fractionation kits Lisopure (Fuji Wako) and NE-PER (Thermo)
  • a fractionation method using only digitonin of the present invention Digitonin
  • Digitonin digitonin of the present invention
  • FIG. 10 shows two types of commercially available cell fractionation kits (Lysopure (Fuji Wako) and NE-PER (Thermo)), a fractionation method using only digitonin of the present invention (Digitonin), and the present invention.
  • the rest of the lower part of FIG. 10 is a band graph showing the results of quantifying the remaining bands of the Western blot in the middle part by densitometry.
  • the gray, black and white parts of the band graph represent the percentages of the cytoplasmic fraction (Cyto), the nuclear fraction (Nuc) and the insoluble fraction (Ptt), respectively.
  • the numbers in parentheses represent the mass of each protein.
  • NTF2 is another name for NUTF2 (alias symbol).
  • FIG. 10 the same verification was performed for the low molecular weight protein group and GFP identified by comparative quantitative mass spectrometry (iTRAQ method) in FIG. 7, in which leakage from the nucleus was suppressed by WGA. As a result, it was confirmed that WGA had an effect of suppressing leakage from the nucleus of all the verified proteins to varying degrees.
  • the cell membrane permeation treatment can be efficiently performed, and at the same time, the soluble protein fraction in the nucleus can be obtained in a state closer to the true localization. It can be analyzed with higher accuracy than. Therefore, the present invention is extremely useful as a means of basic research in the fields of life science and medicine.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本発明は、収率が高く、かつ、核内可溶性タンパク質の拡散による核外漏出を阻止できる、核可溶性タンパク質の分画方法と、該核可溶性タンパク質の分画方法を実施するためのキットを提供する。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法は、１０℃～３７℃の温度条件において、ジギトニンに細胞を曝露する工程を含む。前記温度条件は２５℃～３７℃であってもよい。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法は、ＷＧＡに細胞を曝露する工程を含むことができる。本発明は、ジギトニンを含む、本発明の核可溶性タンパク質の分画方法を実施するためのキットを提供する。本発明のキットは、ＷＧＡを含むことができる。

Description

核可溶性タンパク質の新規分画方法
　本発明は、細胞内タンパク質の分画方法及び該方法に用いるキットに関し、具体的には核可溶性タンパク質の分画方法及び該方法に用いるキットに関する。
　真核細胞のゲノムは核内に隔離されており、転写因子などの必要なタンパク質だけが選択的に核内に移行し、状況に応じて遺伝子発現などの恒常性維持機能を制御している。核－細胞質間の物質の行き来は、核膜表面に数百～数千個存在する核膜孔複合体を介して行われる。核膜孔複合体の通過経路は、大きく2種類に分けられる。１つは、核－細胞質間輸送因子によって認識され選択的に輸送される能動的輸送経路である（非特許文献１）。もう１つは、自由拡散による受動的輸送経路（非特許文献２）である。後者は、核膜孔複合体を通過するのに十分に小さい６０ｋＤａ以下のタンパク質のみが利用可能である（非特許文献３）。
　核可溶性タンパク質の分画方法は、これまでに多数開発され、核可溶性タンパク質を分画するためのキットも市販されている。方法は大きく分けて、２種類ある。図１は、従来技術（上段及び中段）及び本発明（下段）の核可溶性タンパク質の分画方法を対比して説明する模式図である。１つは、細胞膜（ＰＭ）と核膜（ＮＥ）を界面活性剤やホモジナイザーにより、穴を開けて可溶性タンパク質を溶出させ、核内のタンパク質を高塩濃度で溶出させる方法である（非特許文献４、図１、中段)。この方法では、より強固に核内の構造体に結合したタンパク質を取得できるが、一方で核可溶性タンパク質の多くは失われる可能性がある。もう１つの方法は、低張液又は、細胞膜（ＰＭ）に豊富なコレステロールに特異的に結合する界面活性剤ジギトニンを用いて、核膜は破れないように細胞膜を破って、細胞質画分を除去した後、核内タンパク質を溶出させる方法である(非特許文献５、６及び７、図１、上段)。
Ｋｉｍｕｒａ，　Ｍ．及びＩｍａｍｏｔｏ，　Ｎ．，　Ｔｒａｆｆｉｃ，　１５：７２７－７４８　（２０１４）． Ｔｉｍｎｅｙ，　Ｂ．Ｌ．，ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　２１５：５７－７６　（２０１６）． Ｇ▲ダイエレシス付きＯ小文字▼ｒｌｉｃｈ，　Ｄ．　，ＥＭＢＯ　Ｊ．　１７：２７２１－２７２７　（１９９８）． Ｌｅｅ，　Ｋ．Ａ．ら、Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ．　Ｔｅｃｈ．，　５：２２－３１　（１９８８）． Ａｄａｍ，　Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　１１１：８０７－８１６　（１９９０）． Ａｄａｍ，　Ｓ．Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１４１１：４７９－４８７　（２０１６）． Ｋｉｍｕｒａ，　Ｍ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１２２：３５３－７８　（２０１４）．
　ジギトニンによる従来の細胞膜透過処理方法では、細胞膜だけが破れて核膜は破れないという膜透過の細胞膜特異性を有する細胞を得る処理効率があまり良くなく、培養細胞１×１０７個／ｍＬ程度のスモールスケールの細胞サンプルを多種類同時に処理し、その処理効率まで検証した報告はない。加えて、拡散により核－細胞質間を自由に行き来することができる６０ｋＤａ以下の比較的質量の小さいタンパク質の一部が、処理中に核膜が破れていなくても核膜孔複合体を通過して核外へと漏出する。このため、完全な形で核可溶性タンパク質を分画する方法は確立されていなかった。
　本発明の課題は、細胞膜だけが破れて核膜は破れないという膜透過の細胞膜特異性を有する細胞を得る処理収率が高い核可溶性タンパク質の分画方法を提供することである。本発明のさらなる課題は、核内の可溶性タンパク質が拡散によって核膜孔から核外に漏出するのを阻止できる、核可溶性タンパク質の分画方法を提供することである。本発明のまたさらなる課題は、前記分画方法に用いるキットを提供することである。
　本発明の発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を進めた。ジギトニンによる細胞膜透過処理は、１９９０年に最初に報告した非特許文献５以来、氷上又は４℃で実行されており、非特許文献５の筆頭著者による２０１６年の実験法解説（非特許文献６）でも氷上でジギトニンによる細胞膜透過処理を行うこととされている。また本発明の発明者の属するグループによる非特許文献７でも、４℃の温度条件でジギトニンによる細胞膜透過処理を行った。これに対し、本発明の発明者は、驚くべきことに、細胞をジギトニンに曝露する工程の温度条件を１０℃以上とするほうが氷上よりも細胞膜特異的透過性細胞の収率が高いことを見出して本発明を完成した。
　本発明は核可溶性タンパク質の分画方法を提供する。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法は、１０℃～４２℃の温度条件において、ジギトニンに細胞を曝露する工程を含む。
　本発明の核可溶性タンパク質の分画方法において、前記温度条件は２５℃～３７℃とすることができる。
　本発明の核可溶性タンパク質の分画方法において、前記ジギトニンに細胞を曝露する工程は少なくとも１×１０７個／ｍＬの濃度の細胞を前記ジギトニンに曝露することを含み、細胞膜特異的な透過性を示す細胞が８５％以上であるジギトニンに曝露された細胞から、細胞質画分と、核画分及び不溶性画分とを分離する工程を含むことができる。
　本発明は、前記本発明の核可溶性タンパク質の分画方法を実施するためのキットを提供する。本発明のキットはジギトニンを含む。
　本発明の核可溶性タンパク質の分画方法は、コムギ胚芽凝集素（以下、「ＷＧＡ」という。）に細胞を曝露する工程を含むことができる。
　本発明は、前記ＷＧＡに細胞を曝露する工程を含む本発明の核可溶性タンパク質の分画方法を実施するためのキットを提供する。本発明のキットはジギトニン及びＷＧＡを含む。
従来技術（上段及び中段）及び本発明（下段）の核可溶性タンパク質の分画方法を対比して説明する模式図。 左は、ＧＦＰによる蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真（ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β）。中央は、ｍＣｈｅｒｒｙによる蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真（ＧＳＴ－ＮＰ　ＮＬＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ）。右は微分干渉顕微鏡写真（ＤＩＣ）。Ａは細胞膜も核膜も破れていない細胞、Ｂは細胞膜が破れているが、核膜は破れていない細胞、そして、Ｃは細胞膜も核膜も破れている細胞を表す。 左の写真の対は、氷上（Ｏｎ　ｉｃｅ　（～０℃））、０～２００μｇ／ｍＬのジギトニン存在下で細胞膜透過処理を施された浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞に蛍光融合タンパク質ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β及びＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙを添加して、同一視野をＧＦＰによる蛍光（写真の対の左）及びｍＣｈｅｒｒｙによる蛍光（写真の対の右）で観察した蛍光顕微鏡写真。右のグラフは、細胞膜透過処理の結果、細胞膜は破れたが、核膜は破れなかった細胞（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ（黒色））、細胞膜が破れなかった細胞（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ(白色））、並びに細胞膜及び核膜の両方が破れた細胞（ｏｖｅｒ（灰色））の構成比（百分率）を表す棒グラフ。棒グラフの横軸は各細胞の構成比（百分率）を表す。 左の写真の対は、２５℃、０～２００μｇ／ｍＬのジギトニン存在下で細胞膜透過処理を施された浮遊培養系ＨｅＬａＳ３細胞に蛍光融合タンパク質ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β及びＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙを添加して、同一視野をＧＦＰによる蛍光（写真の対の左）及びｍＣｈｅｒｒｙによる蛍光（写真の対の右）で観察した蛍光顕微鏡写真。右のグラフは、それぞれの条件での細胞膜透過処理の結果、細胞膜は破れたが、核膜は破れなかった細胞（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ（黒色））、細胞膜が破れなかった細胞（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ(白色））、並びに細胞膜及び核膜の両方が破れた細胞（ｏｖｅｒ（灰色））の構成比（百分率）を表す棒グラフ。棒グラフの横軸は各細胞の構成比（百分率）を表す。 左の写真の対は、異なる温度（氷上（Ｏｎ　ｉｃｅ）、１０℃、１５℃、２５℃及び３７℃）条件下で１００μｇ／ｍＬのジギトニン存在下で細胞膜透過処理を施された浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞に蛍光融合タンパク質ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β及びＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙを添加して、ＧＦＰによる蛍光（写真の対の左）及びｍＣｈｅｒｒｙによる蛍光（写真の対の右）で観察した蛍光顕微鏡写真。右のグラフは、それぞれの温度条件での細胞膜透過処理の結果、細胞膜は破れたが、核膜は破れなかった細胞（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ（黒色））、細胞膜が破れなかった細胞（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ(白色））、並びに細胞膜及び核膜の両方が破れた細胞（ｏｖｅｒ（灰色））の構成比（百分率）を表す棒グラフ。棒グラフの横軸は各細胞の構成比（百分率）を表す。 ヒトテロメア逆転写酵素遺伝子を導入したヒト網膜色素上皮細胞株（ＲＰＥ１）、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株（Ａ５４９）、ヒト乳腺癌細胞株（ＭＣＦ７）及びヒト骨肉種細胞株（Ｕ２ＯＳ）について、２５℃及び氷上（ｏｎ　ｉｃｅ）の温度条件下での細胞膜透過処理の後、各条件で１００個以上の細胞について細胞の状態の評価分類及びカウントを３回繰り返して得られた、細胞膜だけが破れ、核膜は破れなかった細胞（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ（黒色））、細胞膜が破れなかった細胞（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ（白色））及び細胞膜及び核膜の両方が破れた細胞（ｏｖｅｒ（灰色））の構成比を表す棒グラフ。棒グラフの縦軸は各細胞の構成比（百分率）を表す。各棒グラフの上の数値は３回のカウントでの平均値を表し、誤差棒は標準偏差を表す。 ＥＧＦＰを恒常的に発現する浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞を異なる細胞膜透過条件（ジギトニンなし（ｗ／ｏ　Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）か、ＮＰ－４０（０．１％　ＮＰ－４０）か、ジギトニン（１００μｇ／ｍｌ　Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）か、ジギトニン及びＷＧＡ（１００μｇ／ｍｌ　Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ　＋　１００μｇ／ｍｌ　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ＷＧＡ）か）で処理した後、同一視野を異なる光学条件で観察した顕微鏡写真。左は、ＥＧＦＰによる蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真。右は、ＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙによる蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真。 ジギトニン（Ｄｉｇ）による細胞膜透過処理か、ジギトニン及びＷＧＡ（Ｄｉｇ　＋　ＷＧＡ）による細胞膜透過処理かにより得られた核可溶性画分に含まれるタンパク質についての比較定量質量分析（ｉＴＲＡＱ法）を用いた解析結果を表す散布図。図の横軸は、検出したタンパク質のｋＤａ単位での質量を表し、図の縦軸は、ジギトニン処理での検出量に対するジギトニン＋ＷＧＡ処理での検出量の比を表す。ｐ＜０．０５で１．２倍以上に増加したタンパク質及び０．８倍以下に減少したタンパク質を、それぞれ、塗りつぶした三角（▲）及び四角（■）で表す。ｐ＞０．０５で１．２倍以上に増加したタンパク質及び０．８倍以下に減少したタンパク質を、それぞれ、白抜きの三角（△）及び四角（□）で表す。検出量の比が０．８以上１．２以下の範囲内のタンパク質を白抜きの丸（〇）で表す。検出した代表的なタンパク質は遺伝子名を示した。 上段は、細胞質（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）のみに局在することが既知のタンパク質（ＧＡＰＤＨ、α－Ｔｕｂｕｌｉｎ及びＲａｎＢＰ１）か、細胞質及び核の両方（Ｂｏｔｈ）に局在することが既知のタンパク質（β－ａｃｔｉｎ及びＩｍｐｏｒｔｉｎ　α１）かに対する抗体及びＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体を用いた接着培養したＨｅＬａＳ３細胞の蛍光顕微鏡写真。中段は、市販の２種類の細胞分画キット（Ｌｙｓｏｐｕｒｅ（Ｆｕｊｉ　Ｗａｋｏ）及びＮＥ－ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ））と、本発明のジギトニンのみによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）と、本発明のジギトニン及びＷＧＡによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ　＋　ＷＧＡ）とによって得られた、前記ＥＧＦＰを恒常的に発現する浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞の細胞質画分（Ｃｙｔｏ）、核画分（Ｎｕｃ）及び不溶性画分（Ｐｔｔ）を前記既知タンパク質の抗体により検出したウェスタンブロット。下段は、中段のウェスタンブロットのバンドをデンシトメトリーにより定量化した結果を表す帯グラフ。帯グラフの灰色、黒色及び白色の部分は、それぞれ、細胞質画分（Ｃｙｔｏ）、核画分（Ｎｕｃ）及び不溶性画分（Ｐｔｔ）の百分率を表す。 上段は、核膜内膜及び核膜孔複合体（Ｎｕｃｌｅａｒ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ａｎｄ　ＮＰＣｓ）に局在することが既知のタンパク質（ラミンＡ／Ｃ及びＮｕｐ６２）か、核（Ｎｕｃｌｅｕｓ）に局在することが既知のタンパク質（ヒストンＨ３、ＨＭＧＡ１、ＲＣＣ１、ＲａｎＢＰ３及びＰＣＮＡ）に対する抗体及びＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体を用いた接着培養したＨｅＬａＳ３細胞の蛍光顕微鏡写真。中段は、市販の２種類の細胞分画キット（Ｌｙｓｏｐｕｒｅ（Ｆｕｊｉ　Ｗａｋｏ）及びＮＥ－ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ））と、本発明のジギトニンのみによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）と、本発明のジギトニン及びＷＧＡによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ　＋　ＷＧＡ）とによって得られた、前記ＥＧＦＰを恒常的に発現する浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞の細胞質画分（Ｃｙｔｏ）、核画分（Ｎｕｃ）及び不溶性画分（Ｐｔｔ）を前記既知タンパク質の抗体により検出したウェスタンブロット。下段は、中段のウェスタンブロットのバンドをデンシトメトリーにより定量化した結果を表す帯グラフ。帯グラフの灰色、黒色及び白色の部分は、それぞれ、細胞質画分（Ｃｙｔｏ）、核画分（Ｎｕｃ）及び不溶性画分（Ｐｔｔ）の百分率を表す。 上段右端は、ＥＧＦＰを一過的に発現する接着培養したＨｅＬａＳ３細胞をパラホルムアルデヒド（Ｐａｒａ）で固定した後にＥＧＦＰの発する蛍光を観察した結果の蛍光顕微鏡写真。中段右端は、市販の２種類の細胞分画キット（Ｌｙｓｏｐｕｒｅ（Ｆｕｊｉ　Ｗａｋｏ）及びＮＥ－ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ））と、本発明のジギトニンのみによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）と、本発明のジギトニン及びＷＧＡによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ　＋　ＷＧＡ）とによって得られた、前記ＥＧＦＰを恒常的に発現する浮遊培養のＨｅＬａＳ３細胞の細胞質画分（Ｃｙｔｏ）、核画分（Ｎｕｃ）及び不溶性画分（Ｐｔｔ）を抗ＥＧＦＰ抗体により検出したウェスタンブロット。下段右端は、中段右端のウェスタンブロットのバンドをデンシトメトリーにより定量化した結果を表す帯グラフ。上段の残りは、パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａ）又はメタノール（Ｍｅｔｈ）で固定した後に既知タンパク質（ＮＴＦ２（１４ｋＤａ）、ＰＰＩＡ（１８ｋＤａ）、ＰＦＮ１（１５ｋＤａ）、ＴＸＮ（１２ｋＤａ）及びＲａｎ（２４ｋＤａ））に対する抗体を用いた接着培養したＨｅＬａＳ３細胞の蛍光顕微鏡写真。前記既知タンパク質はいずれもＷＧＡ添加により核内からの漏出が抑制されたことが図７で確認された。中段の残りは、市販の２種類の細胞分画キット（Ｌｙｓｏｐｕｒｅ（Ｆｕｊｉ　Ｗａｋｏ）及びＮＥ－ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ））と、本発明のジギトニンのみによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）と、本発明のジギトニン及びＷＧＡによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ　＋　ＷＧＡ）とによって得られた、前記を恒常的に発現する浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞の細胞質画分（Ｃｙｔｏ）、核画分（Ｎｕｃ）及び不溶性画分（Ｐｔｔ）を前記既知タンパク質の抗体により検出したウェスタンブロット。下段の残りは、中段の残りのウェスタンブロットのバンドをデンシトメトリーにより定量化した結果を表す帯グラフ。帯グラフの灰色、黒色及び白色の部分は、それぞれ、細胞質画分（Ｃｙｔｏ）、核画分（Ｎｕｃ）及び不溶性画分（Ｐｔｔ）の百分率を表す。カッコ内の数字は各タンパク質の質量を表す。なお、ＮＴＦ２はＮＵＴＦ２の別名（ａｌｉａｓ　ｓｙｍｂｏｌ）である。
　本発明の１つの実施態様は、約１０℃～約４２℃の温度条件において、ジギトニンに細胞を曝露する工程を含む、核可溶性タンパク質の分画方法である。
　本明細書の実施例によれば、ジギトニンに曝露された細胞のうち細胞膜だけが選択的に透過処理された細胞の構成比の百分率は、氷上、すなわち、０℃で細胞膜透過処理を行った細胞では２７％しかなかったが、１０℃、１５℃、２５℃又は３７℃で細胞膜透過処理を行った細胞では、それぞれ、９４％、８５％、９２％及び９１％あった。また、２５℃であれば、複数の培養細胞でジギトニンに曝露された細胞のうち細胞膜だけが選択的に透過処理された細胞の構成比の百分率は８６％～９３％であった。すなわち、１０℃～３７℃の幅広い温度範囲で細胞膜だけが選択的に透過処理された細胞の収率が一様に高かった。そこで、本発明の核可溶性タンパク質の分画方法では、細胞をジギトニンに曝露する工程の温度条件は、約１０℃～約４２℃の温度範囲内のいずれかの温度である。換言すると、前記温度条件は、１０℃、１１℃、１２℃，１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃及び４２℃からなる群から選択されるいずれか２つの温度を下限及び上限とし、前記下限及び上限を含む温度範囲に含まれるいずれかの温度である。この温度条件は、ニワトリのような鳥類の体温である約４２℃や、哺乳類細胞及び哺乳類細胞を宿主とする病原体の温度感受性突然変異体の解析に用いられる約３９℃を含む。
　本明細書において核可溶性タンパク質の分画方法とは、細胞の構成要素である細胞内小器官又は細胞下構造のうち、特定の細胞内小器官又は細胞下構造に局在するタンパク質を他の細胞内小器官又は細胞下構造から物理的に分離する方法を指す。ここで細胞内小器官又は細胞下構造には、核、細胞質、小胞体、ミトコンドリア、リソソーム、ペルオキシソーム、ゴルジ体、その他の膜構造と、染色体、紡錘体、動原体等が含まれるが、これらに限られない。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法は、細胞質及び核のうち少なくともいずれか一方を含むが他方を含まない画分を分離して回収する。ここで核分画を分離するためには、細胞表面の細胞膜を破る必要があるが、核膜も破れることがある。また、核膜は破れていない、すなわち、核膜が無傷の状態又は完全性を保った状態であっても、核膜孔という多数のタンパク質が集合した構造が存在する。核膜孔を介する核と細胞質との間の輸送には、能動的輸送経路及び受動的輸送経路が存在するが、そのうち受動的輸送経路は、単離された核においても機能するため、核内の分子、特に、可溶性で核膜孔を通過できる比較的分子量の小さいタンパク質は核の外に漏出する。したがって、細胞質画分と核画分との特異的な分離には、細胞膜及び核膜のうち細胞膜だけを選択的に破る、すなわち、細胞膜だけが透過性を有する細胞を得ることと、核内タンパク質が核外に漏出するのを抑制することとが両方とも重要である。
　このうち、細胞膜だけを選択的に破る手段として、膜成分のうちコレステロールが細胞膜に多いが核膜には少ないことを利用してコレステロールと特異的に結合して膜を破ることができるジギトニンが使われてきた。従来、ジギトニンによる細胞膜透過処理は、１９９０年に最初に報告した非特許文献５以来、氷上又は４℃で実行されており、非特許文献５の筆頭著者による２０１６年の実験法解説（非特許文献６）でも氷上又は４℃での温度でジギトニンによる細胞膜透過処理を行うこととされている。これに対し、本発明の発明者は、驚くべきことに、細胞をジギトニンに曝露する工程の温度条件は１０℃のほうが氷上よりも核分画の可溶性タンパク質の収率が高いことを見出した。
　本発明の核可溶性タンパク質の分画方法において、細胞をジギトニンに曝露する工程で用いる細胞透過処理溶液のジギトニンの濃度は、溶液中の他の成分の有無及び濃度と、細胞をジギトニンに曝露する際の温度条件とに応じて当業者は容易に決定することができる。前記溶液中のジギトニンの濃度は、例えば、細胞をジギトニンに曝露する工程を実施する温度条件が約１０℃～約４２℃の温度範囲内のいずれかの温度のとき、１００μｇ/ｍＬ～２００μｇ/ｍＬの間のいずれかの濃度とすることができる。換言すると、１００μｇ/ｍＬ、１０５μｇ/ｍＬ、１１０μｇ/ｍＬ、１１５μｇ/ｍＬ、１２０μｇ/ｍＬ、１２５μｇ/ｍＬ、１３０μｇ/ｍＬ、１３５μｇ/ｍＬ、１４０μｇ/ｍＬ、１４５μｇ/ｍＬ、１５０μｇ/ｍＬ、１５５μｇ/ｍＬ、１６０μｇ/ｍＬ、１６５μｇ/ｍＬ、１７０μｇ/ｍＬ、１７５μｇ/ｍＬ、１８０μｇ/ｍＬ、１８５μｇ/ｍＬ、１９０μｇ/ｍＬ、１９５μｇ/ｍＬ及び２００μｇ/ｍＬからなる群から選択されるいずれか２つのジギトニンの濃度を下限及び上限とし、前記下限及び上限を含むジギトニンの濃度範囲に含まれるいずれかのジギトニンの濃度である。前記ジギトニン濃度は、細胞をジギトニンに曝露する工程を実施する温度条件に応じて変えることもできる。
　本発明の核可溶性タンパク質の分画方法において、細胞をジギトニンに曝露する工程では、ジギトニンを含む細胞透過処理溶液としては、ジギトニンによる細胞膜透過処理を最初に報告した非特許文献５に記載のトランスポートバッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）、１１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、２ｍＭ　（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ、５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ及び０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ）のように細胞に対して等張性があってｐＨを制御できる緩衝剤を含むいずれの溶液を用いてもかまわない。前記ジギトニンを含む細胞透過処理溶液は、前記トランスポートバッファーの他、非特許文献６に記載のＰＢＳ（３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１．０６ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４及び１５５ｍＭ　ＮａＣｌ）、Ｌｉｎｄｅｒ，　Ｍ．Ｉ．ら（Ｄｅｖ．　Ｃｅｌｌ，　４３：１４１－１５６　（２０１７））に記載の改変されたジギトニン含有細胞膜透過バッファー（２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ　７．６、２５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、７．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭ　ショ糖、０．５ｍＭ　ＤＴＴ及び０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ）、Ｄｉｇｎａｍ，　、Ｊ．Ｄ．ら（Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１１：１４７５－８９　（１９８３））に記載のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　転写用バッファー（１２ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７．９）、１２％　グリセロール、０．３ｍＭ　ＤＴＴ、０．１２ｍＭ　ＥＤＴＡ、６０ｍＭ　ＫＣｌ及び１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２）、Ｋｒｕｄｅ，　Ｔ．（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２７５：１３６９９－１３７０７（２０００））に記載のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＤＮＡ複製用バッファー（２０ｍＭ　Ｋ－ＨＥＰＥＳ，　ｐＨ　７．８、１００ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び０．１ｍＭ　ＤＴＴ）、Ｈ▲上リング付きＡ小文字▼ｋｅｌｉｅｎ，　Ａ．Ｍ．ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，３４８：２５９－２６８（２００６））に記載のストレプトリシンＯを用いる細胞のリプログラミング用バッファー（５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ　８．２及び１ｍＭ　ＤＴＴ）を含むが、これらに限られない溶液を用いてもかまわない。また、分画されたタンパク質を保護するために、前記ジギトニンを含む細胞透過処理溶液は、ＢＳＡ、ポリビニルピロリドン等を、例えば１０ｍｇ／ｍＬ添加してもかまわない。さらに、核内タンパク質の活性を保持するために、ＡＴＰ（例えば２ｍＭ）又は解糖系その他の酵素を用いるエネルギー供給反応系を添加してもかまわない。さらに、カリウム、マグネシウム、ナトリウムイオンについては、酢酸塩ではなく、塩化物（ＭｇＣｌ２など)に置換してもかまわない。
　本発明の核可溶性タンパク質の分画方法は、ＮＰ－４０、Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０、ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０、Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｗｅｅｎ－８０、Ｂｒｉｊ－３５、Ｂｒｉｊ－５８、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ及びＣＨＡＰＳＯからなる群から選択される少なくとも１つ又は全ての界面活性剤を含まないことがある。さらに本発明の核可溶性タンパク質の分画方法は、非特許文献５に記載のトランスポートバッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）、１１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、２ｍＭ　（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ、５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ及び０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ）、非特許文献６及び７に記載のＰＢＳ（３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１．０６ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４及び１５５ｍＭ　ＮａＣｌ）、Ｌｉｎｄｅｒ，　Ｍ．Ｉ．ら（Ｄｅｖ．　Ｃｅｌｌ，　４３：１４１－１５６　（２０１７））に記載の改変されたジギトニン含有細胞膜透過バッファー（２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ　７．６、２５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、７．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭ　ショ糖、０．５ｍＭ　ＤＴＴ及び０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ）、Ｄｉｇｎａｍ，　、Ｊ．Ｄ．ら（Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１１：１４７５－８９　（１９８３））に記載のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　転写用バッファー（１２ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７．９）、１２％　グリセロール、０．３ｍＭ　ＤＴＴ、０．１２ｍＭ　ＥＤＴＡ、６０ｍＭ　ＫＣｌ及び１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２）、Ｋｒｕｄｅ，Ｔ．（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２７５：１３６９９－１３７０７（２０００））に記載のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＤＮＡ複製用バッファー（２０ｍＭ　Ｋ－ＨＥＰＥＳ，　ｐＨ　７．８、１００ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び０．１ｍＭ　ＤＴＴ）、及び、Ｈ▲上リング付きＡ小文字▼ｋｅｌｉｅｎ，　Ａ．Ｍ．ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，３４８：２５９－２６８（２００６））に記載のストレプトリシンＯを用いる細胞のリプログラミング用バッファー（５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ　８．２及び１ｍＭ　ＤＴＴ）からなる群から選択されるいずれかのバッファーのイオン強度よりイオン強度が高い塩は含まないことがある。例えば、４２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１Ｍ　尿素等は含まない。
　本発明の核可溶性タンパク質の分画方法において、細胞をジギトニンに曝露する工程の処理時間は、ジギトニン濃度及び温度の条件に応じて当業者が容易に決定することができる。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法において採用しうる処理時間の下限としては、例えば、通常、３０秒以上、好ましくは、１分以上、３分以上、または５分以上であり得るが、これらに限定されない。また、処理時間の上限としては、例えば、通常、２時間以下、好ましくは、１時間以下、４５分以下、３０分以下、又は１５分以下であり得るが、これらに限定されない。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法における一態様において、処理時間は、例えば、１０℃～４２℃の温度条件で、１００μｇ/ｍＬ～２００μｇ/ｍＬのジギトニンの濃度条件では、約５分間、例えば、４．５分間、４．６分間、４．７分間、４．８分間、４．９分間、５．０分間、５．１分間、５．２分間、５．３分間、５．４分間、５．５分間からなる群から選択されるいずれか２つの処理時間を下限及び上限とし、前記下限及び上限を含む処理時間の範囲内に含まれるいずれかの処理を採用することができるがこれに限定されない。
　本発明の核可溶性タンパク質の分画方法を施す対象は、細胞膜及び核膜の両方を有する真核生物の細胞である。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法を施す対象は、動物界、植物界及び菌界に属する細胞が好ましく、動物界に属する細胞がより好ましく、脊椎動物及び無脊椎動物が好ましく、１０℃～４２℃の体温を有する動物か、１０℃～４２℃の温度条件で生存することができる動物かの細胞がより好ましい。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法を施す対象は、魚類、両生類、は虫類、鳥類及びほ乳類に属する動物の細胞であってもよい。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法を施す対象は、生物個体から新鮮に単離された細胞でもよく、前記新鮮に単離された細胞を試験管内で培養増殖させた培養細胞でもよい。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法を施す対象が培養細胞の場合、該培養細胞は浮遊培養した細胞であっても、基質に接着した細胞であってもかまわない。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法を施す対象は、正常細胞であっても、初代培養細胞であっても、不死化していない、継代回数に制限のある細胞であっても、形質転換細胞、株化細胞、その他の不死化細胞であってもかまわない。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法を施す対象は、未分化多能性幹細胞と、栄養外胚葉細胞、細胞内胚葉細胞・中胚葉細胞、外胚葉細胞及び始原生殖細胞からなる群から選択されるいずれかの細胞由来の未分化細胞、分化細胞又は脱分化細胞であってもかまわない。未分化細胞は、いずれかの分化細胞タイプへの分化能を有する細胞と、いずれかの分化細胞タイプへの分化能を失った細胞とを含む。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法を施す対象は、核膜より細胞膜にコレステロールをより多く含む細胞が好ましい。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法を施す対象は、本明細書の実施例に用いた、ＨｅＬａＳ３浮遊培養細胞及び接着培養細胞（ヒト由来、子宮頸部類上皮腫）、ＲＰＥ１（ヒト由来、ヒトテロメア逆転写酵素遺伝子を導入した網膜色素上皮細胞株）、Ａ５４９（ヒト由来、肺胞基底上皮腺癌細胞株）、ＭＣＦ７（ヒト由来、乳腺癌細胞株）及びＵ２ＯＳ（ヒト骨肉種細胞株）の他、ＴＩＧ－１等のＴＩＧ細胞系統（ヒト由来、線維芽細胞）、ＷＩ－３８（ヒト由来、肺正常二倍体線維芽細胞）等の老化研究用細胞、ＨＣＴ１１６（ヒト由来、大腸癌）、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス由来、線維芽細胞株）、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＳＶ４０ウイルスＴ抗原を発現するＨＥＫ２９３）、ＨＵＶＥＣ（ヒト由来、臍帯静脈内皮細胞）、Ｃ２Ｃ１２（マウス由来、不死化筋芽細胞）、ＴＨＰ－１（ヒト由来、急性単球性白血病）、ＨＬ６０（ヒト由来、血球・リンパ系）、Ｋ５６２（ヒト由来、慢性骨髄性白血病）、Ｆ９（マウス由来、テラトーマ）、ＰＣ１２（ラット由来、褐色細胞腫）、Ｍ１（マウス由来、血球・リンパ系）、３Ｔ３－Ｌ１（マウス由来、胎仔）等の分化誘導可能な細胞株、ｉＰＳ－ＴＩＧ１２０－３ｆ７（ＴＩＧ細胞系統由来のｉＰＳ細胞）、ＥＳ－Ｄ３（マウス由来、ＥＳ細胞）等の哺乳類のｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞、哺乳類の造血幹細胞、Ｎｅｕｒｏ－２ａ（マウス由来、神経系）、ＷＥＨＩ－３ｂ（マウス由来、血球・リンパ系）、Ｐ３Ｕ１（マウス由来、血球・リンパ系）、ＭＥＦｓ（マウス由来、マウス胎児線維芽細胞）、Ｙ－１（マウス由来、副腎皮質）、ＣＯＳ－７（アフリカミドリザル由来、腎臓）、Ａ－４３１（ヒト由来、類上皮腫）及びＨｅｐ　Ｇ２（ヒト由来、肝臓）を含むが、これらに限られない、哺乳類の培養細胞であってもかまわない。
　本発明の核可溶性タンパク質の分画方法において、細胞をジギトニンに曝露する工程以外の工程では、いなかる温度条件を用いてもかまわない。氷上又は４℃の温度条件を用いることもできる。関心のあるタンパク質がプロテアーゼで分解するのを避けるためには、プロテアーゼ阻害剤を組み合わせて用いることもできるが、細胞をジギトニンに曝露する工程以外の工程の温度条件を氷上、４℃その他の低温とすることは、プロテアーゼ活性を抑制することにもつながる。
　本発明の１つの実施態様は、約２５℃～約３７℃の温度条件において、ジギトニンに細胞を曝露する工程を含む、核可溶性タンパク質の分画方法である。換言すると、本実施態様の核可溶性タンパク質の分画方法でジギトニンに細胞を曝露する工程に用いられる温度条件は、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃及び３７℃からなる群から選択されるいずれか２つの温度を下限及び上限とし、前記下限及び上限を含む温度範囲に含まれるいずれかの温度である。
　本発明の１つの実施態様は、前記ジギトニンに細胞を曝露する工程は少なくとも１×１０７個／ｍＬの濃度の細胞を前記ジギトニンに曝露することを含み、細胞膜特異的な透過性を示す細胞が８５％以上である細胞から、細胞質画分と、核画分及び不溶性画分とを分離する工程を含む本発明の核可溶性タンパク質の分画方法である。本発明において、ジギトニンに細胞を曝露する工程では、１×１０７個／ｍＬ、１．２５×１０７個／ｍＬ又はこれらより高い濃度、例えば、２×１０７個／ｍＬ、３×１０７個／ｍＬ、４×１０７個／ｍＬ、５×１０７個／ｍＬ、７×１０７個／ｍＬ、１×１０８個／ｍＬの細胞を用いることができる。本発明の方法のジギトニンに細胞を曝露する工程では、前記高い濃度の細胞をジギトニンに曝露しても、細胞膜特異的な透過性を示す細胞が少なくとも８５％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は、９７％以上得ることができる。あるいは、８６％以上、９１％以上、９２％以上、又は、９３％以上得ることができる。ここで細胞膜特異的な透過性とは、細胞膜は破れるが、核膜は破れないことを指す。細胞膜特異的な透過性を示す細胞の割合は、例えば、実施例２、３又は４に記載するように、蛍光融合タンパク質ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β及びＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙを加えて、それらの局在から決定することができる。細胞膜特異的な透過性を示す細胞が少なくとも８５％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は、９７％以上、あるいは、８６％以上、９１％以上、９２％以上、又は、９３％以上であるジギトニンに曝露された細胞とは、ジギトニンに曝露された細胞のうち、細胞膜は破れているが、核膜は破れていない細胞が、少なくとも８５％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は、９７％以上、あるいは、８６％以上、９１％以上、９２％以上、又は、９３％以上であることを意味する。
　前記細胞膜特異的な透過性を示す細胞が８５％以上である細胞は、少なくとも１×１０７個／ｍＬの濃度の細胞を前記ジギトニンに曝露することによって得られる。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法では、細胞膜が透過性を有する細胞を得る工程では、核膜は破れない、すなわち、核膜は無傷であることが細胞質画分及び核画分の特異的分画のために重要である。本発明の核可溶性タンパク質の分画方法は、前記細胞膜特異的な透過性を示す細胞が８５％以上である細胞から、細胞質画分と、核画分及び不溶性画分とを分離する工程の後に、核膜を破る、すなわち、核膜孔以外の核膜が透過性を有する細胞を得る工程を含んでもよい。さらに、本発明の核可溶性タンパク質の分画方法は、核膜孔以外の核膜が透過性を有する細胞を得る工程の後に、核画分と不溶性画分とを分離する工程を含んでもよい。
　本発明の１つの実施態様では、本発明の核可溶性タンパク質の分画方法は、ＷＧＡに細胞を曝露する工程をさらに含む。レクチンであるＷＧＡが核細胞質間輸送を阻害することは知られている（Ｆｉｎｌａｙ，　Ｄ．Ｒ．ら、Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，　１０４：１８９－２００　（１９８７）、及び、Ｍｏｈｒ，　Ｄ．ら、ＥＭＢＯ，　２８：２５４１－２５５３　（２００９））。したがってＷＧＡに細胞を曝露することによって、核内タンパク質が核外に漏出するのを抑制でき、本発明の核可溶性タンパク質の分画方法がより正確に核に局在する可溶性タンパク質を分離することを可能にする。図１は、従来技術（上段及び中段）及び本発明（下段）の核可溶性タンパク質の分画方法を対比して説明する模式図である。ＷＧＡはＮＰＣ（核膜孔複合体）をブロックするため、核内タンパク質が核外に漏出するのを抑制できる。
　ＷＧＡは、ビオチンその他のリガンドとコンジュゲートしたＷＧＡとすることができる。これにより例えばビオチン化ＷＧＡは、ビーズのような固体支持体に不動化されたストレプトアビジンと混合すると容易に吸着除去することができる。アビジン又はストレプトアビジンとビオチンの特異的結合の他に、相補性のある２本のオリゴヌクレオチドの特異的結合や、ＷＧＡ以外のレクチンとその認識糖、エフェクターおよび受容体分子、補助因子および酵素、酵素および酵素阻害剤等であってもよい。
　本発明の核可溶性タンパク質の分画方法は、ＷＧＡに細胞を曝露する工程は、ジギトニンに細胞を曝露する工程と同時に行うことが望ましい。しかし、ジギトニンに細胞を曝露する工程にＷＧＡが共存することを条件として、ジギトニンに細胞を曝露する工程の前からＷＧＡに細胞を曝露する工程が始まっていてもかまわない。逆に、ジギトニンに細胞を曝露する工程が終わった後もＷＧＡが残っていてもかまわない。
　本発明の１つの実施態様は、本発明の核可溶性タンパク質の分画方法を実施するためのキットである。本発明のキットは、ジギトニンを含む。
　本発明のキットにおいて、ジギトニンを含む細胞透過処理溶液としては、ジギトニンによる細胞膜透過処理を最初に報告した非特許文献５に記載のトランスポートバッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）、１１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、２ｍＭ　（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ、５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ及び０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ）のように細胞に対して等張性があってｐＨを制御できる緩衝剤を含むいずれの溶液を用いてもかまわない。本発明のキットにおける、前記ジギトニンを含む細胞透過処理溶液は、前記トランスポートバッファーの他、非特許文献６に記載のＰＢＳ（３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１．０６ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４及び１５５ｍＭ　ＮａＣｌ）、Ｌｉｎｄｅｒ，　Ｍ．Ｉ．ら（Ｄｅｖ．　Ｃｅｌｌ，　４３：１４１－１５６　（２０１７））に記載の改変されたジギトニン含有細胞膜透過バッファー（２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ　７．６、２５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、７．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭ　ショ糖、０．５ｍＭ　ＤＴＴ及び０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ）、Ｄｉｇｎａｍ，　、Ｊ．Ｄ．ら（Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１１：１４７５－８９　（１９８３））に記載のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　転写用バッファー（１２ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７．９）、１２％　グリセロール、０．３ｍＭ　ＤＴＴ、０．１２ｍＭ　ＥＤＴＡ、６０ｍＭ　ＫＣｌ及び１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２）、Ｋｒｕｄｅ，Ｔ．（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２７５：１３６９９－１３７０７（２０００））に記載のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＤＮＡ複製用バッファー（２０ｍＭ　Ｋ－ＨＥＰＥＳ，　ｐＨ　７．８、１００ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び０．１ｍＭ　ＤＴＴ）、Ｈ▲上リング付きＡ小文字▼ｋｅｌｉｅｎ，　Ａ．Ｍ．ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，３４８：２５９－２６８（２００６）．）に記載のストレプトリシンＯを用いる細胞のリプログラミング用バッファー（５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ　８．２及び１ｍＭ　ＤＴＴ）を含むが、これらに限られない溶液を用いてもかまわない。また、分画されたタンパク質を保護するために、前記ジギトニンを含む細胞透過処理溶液は、ＢＳＡ、ポリビニルピロリドン等を、例えば１０ｍｇ／ｍＬ添加してもかまわない。さらに、核内タンパク質の活性を保持するために、ＡＴＰ（例えば２ｍＭ）又は解糖系その他の酵素を用いるエネルギー供給反応系を添加してもかまわない。さらに、カリウム、マグネシウム、ナトリウムイオンについては、酢酸塩ではなく、塩化物（ＭｇＣｌ２など)に置換してもかまわない。
　本発明の細胞分画方法を実施するためのキットは、ＮＰ－４０、Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０、ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０、Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｗｅｅｎ－８０、Ｂｒｉｊ－３５、Ｂｒｉｊ－５８、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ及びＣＨＡＰＳＯからなる群から選択される少なくとも１つの界面活性剤を含まないことがある。代替的には、本発明の細胞分画方法を実施するためのキットは、ＮＰ－４０、Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０、ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０、Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｗｅｅｎ－８０、Ｂｒｉｊ－３５、Ｂｒｉｊ－５８、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１１４、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ及びＣＨＡＰＳＯからなる群の全ての界面活性剤を含まないことがある。さらに、本発明の細胞分画方法を実施するためのキットは、非特許文献５に記載のトランスポートバッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）、１１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、２ｍＭ　（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ、５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ及び０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ）、非特許文献６及び７に記載のＰＢＳ（３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１．０６ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４及び１５５ｍＭ　ＮａＣｌ）、Ｌｉｎｄｅｒ，　Ｍ．Ｉ．ら（Ｄｅｖ．　Ｃｅｌｌ，　４３：１４１－１５６　（２０１７））に記載の改変されたジギトニン含有細胞膜透過バッファー（２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ　７．６、２５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、７．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２５０ｍＭ　ショ糖、０．５ｍＭ　ＤＴＴ及び０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ）、Ｄｉｇｎａｍ，　、Ｊ．Ｄ．ら（Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１１：１４７５－８９　（１９８３））に記載のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　転写用バッファー（１２ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７．９）、１２％　グリセロール、０．３ｍＭ　ＤＴＴ、０．１２ｍＭ　ＥＤＴＡ、６０ｍＭ　ＫＣｌ及び１２ｍＭ　ＭｇＣｌ２）、Ｋｒｕｄｅ，　Ｔ．（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２７５：１３６９９－１３７０７（２０００））に記載のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＤＮＡ複製用バッファー（２０ｍＭ　Ｋ－ＨＥＰＥＳ，　ｐＨ　７．８、１００ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２及び０．１ｍＭ　ＤＴＴ）、及び、Ｈ▲上リング付きＡ小文字▼ｋｅｌｉｅｎ，　Ａ．Ｍ．ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．，３４８：２５９－２６８（２００６）．）に記載のストレプトリシンＯを用いる細胞のリプログラミング用バッファー（５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ　８．２及び１ｍＭ　ＤＴＴ）からなる群から選択されるいずれかのバッファーのイオン強度よりイオン強度が高い塩は含まないことがある。例えば、４２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１Ｍ　尿素等は含まない。
　本発明の１つの実施態様では、本発明の核可溶性タンパク質の分画方法を実施するためのキットは、ＷＧＡを含む。前記ＷＧＡは、ビオチンその他のリガンドとコンジュゲートしたＷＧＡとすることができる。
　本明細書において数値について修飾する連体詞「約」は、当該数値の９０％以上、かつ、１１０％以内の数値範囲であることを意味する。例えば、「約４０％」とは、３６％以上４４％以内の数値範囲の百分率を指す。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除および置換を行うことができる。
　実施例１　モデルタンパク質を用いる細胞膜及び核膜の透過状況の可視化
　本実施例では、細胞膜は破れているが、核膜は破れていない細胞を可視化する方策を検討した。
　蛍光融合タンパク質ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β、ＧＳＴ－ＮＰ　ＮＬＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙはいずれも細胞膜を透過することができない。しかしＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　βは、細胞膜が破れていれば、自ら核膜孔と相互作用し、核内へ到達することができる。これに対しＧＳＴ－ＮＰ　ＮＬＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙは、細胞膜が破れていれば、細胞質までは入れるが、核膜が破れていなければ、核内へ入ることはできない。したがって、ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　βと、ＧＳＴ－ＮＰ　ＮＬＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ又はＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙとを細胞外に添加したとき、両方とも細胞質及び核に分布する細胞は細胞膜も核膜も破れている。ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　βのみが細胞質及び核に分布し、ＧＳＴ－ＮＰ　ＮＬＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ又はＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙは細胞質のみに分布する細胞は細胞膜のみが破れている。そして、両方とも細胞質及び核に分布しない細胞は、細胞膜が破れていない。
　６．２５×１０５個のＨｅＬａＳ３浮遊培養細胞を１００μＬのジギトニン溶液と混合し、２５℃で５分間反応させて、細胞膜透過処理を施した。その後、０．５μＭ　ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β、及び、５μＭ　ＧＳＴ－ＮＰ　ＮＬＳ－ｍＣｈｅｒｒｙと混合して、ＥＧＦＰ（励起波長：４７３ｎｍ、蛍光波長：５０７ｎｍ）及びｍＣｈｅｒｒｙ（励起波長５５９ｎｍ、蛍光波長６１０ｎｍ）の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。前記ジギトニン溶液は、４０μｇ／ｍＬの濃度のジギトニンを添加した基本バッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）、１１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、２ｍＭ　（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ、５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ、０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ、及び、プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）、ＥＤＴＡフリー、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ　アルドリッチ　ジャパン合同会社）））である。
　図２は、４０μｇ／ｍＬのジギトニン溶液による２５℃で５分間の細胞膜透過処理の後、蛍光融合タンパク質ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β及びＧＳＴ－ＮＰ　ＮＬＳ－ｍＣｈｅｒｒｙと混合し、２つの蛍光融合タンパク質の局在状況が異なる細胞が混在する視野を選んで撮影した顕微鏡写真である。図２の左は、ＧＦＰによる蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真（ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β）で、図２の中央は、ｍＣｈｅｒｒｙによる蛍光を観察した光顕微鏡写真（ＧＳＴ－ＮＰ　ＮＬＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ）で、図２の右は微分干渉顕微鏡写真（ＤＩＣ）である。図２の白抜き文字のうち、Ａは細胞膜も核膜も破れていない細胞、Ｂは細胞膜が破れているが、核膜は破れていない細胞、そして、Ｃは細胞膜も核膜も破れている細胞を表す。
　図２に示すとおり、本実験では３種類の蛍光局在パターンの細胞（Ａ～Ｃ）が観察された。Ａは、両方の融合蛍光タンパク質の蛍光が全く観察されない細胞で、これは、細胞膜も核膜も破れていない細胞を意味する。Ｂは、ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　βの蛍光は細胞質及び核の両方に観察されるが、ＧＳＴ－ＮＰ　ＮＬＳ－ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光は細胞質だけに観察される細胞で、これは、細胞膜は破れているが、核膜は破れていない細胞を意味する。Ｃは、両方の融合蛍光タンパク質の蛍光がともに細胞質及び核に観察される細胞で、これは、細胞膜も核膜も破れている細胞を意味する。
　図２の実験結果から、前記蛍光タンパク質を細胞外に添加することによって細胞膜及び核膜の透過性を簡便に評価できることが明らかになった。そこで、以下の実施例では、この評価方法を用いて細胞膜透過処理の条件を詳細に検討した。
　実施例２　細胞膜透過処理における温度及びジギトニン濃度の検討
　本実施例では、細胞膜透過処理における温度及びジギトニン濃度を検討した。
　１×１０７個のＨｅＬａＳ３浮遊培養細胞を８００μＬのジギトニン溶液中で異なる温度（氷上（Ｏｎ　ｉｃｅ（～０℃））又は２５℃）条件下で５分間反応させて細胞膜透過処理を行い、その後、蛍光融合タンパク質ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β及びＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙを加えて、それらの局在から細胞の状態を判断した。前記ジギトニン溶液は、０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬの濃度のジギトニンを添加した基本バッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）、１１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、２ｍＭ　（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ、５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ、０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ、及び、プロテアーゼ阻害剤カクテル）である。
　図３－１の左の写真の対は、氷上（Ｏｎ　ｉｃｅ　（～０℃）、０～２００μｇ／ｍＬのジギトニン存在下で細胞膜透過処理を施された浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞に蛍光融合タンパク質ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β及びＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙを添加して、同一視野をＧＦＰによる蛍光（写真の対の左）及びｍＣｈｅｒｒｙによる蛍光（写真の対の右）で観察した蛍光顕微鏡写真である。図３－１の右のグラフは、細胞膜透過処理の結果、細胞膜は破れたが、核膜は破れなかった細胞（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ（黒色））、細胞膜が破れなかった細胞（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ(白色））、並びに細胞膜及び核膜の両方が破れた細胞（ｏｖｅｒ（灰色））の構成比（百分率）を表す棒グラフである。図３－２の左の写真の対は、２５℃、０～２００μｇ／ｍＬのジギトニン存在下で細胞膜透過処理を施されたＨｅＬａＳ３細胞に蛍光融合タンパク質ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β及びＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙを添加して、同一視野をＧＦＰによる蛍光（写真の対の左）で及びｍＣｈｅｒｒｙによる蛍光（写真の対の右）で観察した蛍光顕微鏡写真である。図３－２の右のグラフは、細胞膜透過処理の結果、細胞膜は破れたが、核膜は破れなかった細胞（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ（黒色））、細胞膜が破れなかった細胞（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ(白色））、並びに細胞膜及び核膜の両方が破れた細胞（ｏｖｅｒ（灰色））の構成比（百分率）を表す棒グラフである。図３－１及び図３－２の右の棒グラフの横軸は各細胞の構成比（百分率）を表す。
　図３－１及び図３－２の実験結果から、氷上では１５０μｇ／ｍＬ以上の濃度、２５℃では１００μｇ／ｍＬ以上の濃度で、ほぼ全ての細胞において、細胞膜は破れたが、核膜は破れなかった。すなわち、細胞膜だけを選択的に透過処理することができたといえる。このことから、通常行う氷上（～０℃）よりも２５℃の方が、より低濃度のジギトニンで透過処理を行うことができた。
　実施例３　細胞膜透過処理における温度条件の検討
　本実施例では、ジギトニン濃度を１００μｇ／ｍＬに固定して、細胞膜透過処理における温度条件をより詳細に検討した。
　１×１０７個のＨｅＬａＳ３浮遊培養細胞を８００μＬのジギトニン溶液中で異なる温度（氷上（Ｏｎ　ｉｃｅ）、１０℃、１５℃、２５℃又は３７℃）条件下で５分間反応させて細胞膜透過処理を行い、その後、蛍光融合タンパク質ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β及びＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙを加えて、それらの局在から細胞の状態を判断した。前記ジギトニン溶液は、１００μｇ／ｍＬのジギトニンを添加した基本バッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）、１１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、２ｍＭの（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ、５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ、０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ、及び、プロテアーゼ阻害剤カクテル）である。
　図４の左の写真の対は、異なる温度（氷上（Ｏｎ　ｉｃｅ）、１０℃、１５℃、２５℃又は３７℃）条件下で１００μｇ／ｍＬのジギトニン存在下で細胞膜透過処理を施された浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞に蛍光融合タンパク質ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β及びＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙを添加して、ＧＦＰによる蛍光（写真の対の左）及びｍＣｈｅｒｒｙによる蛍光（写真の対の右）で観察した蛍光顕微鏡写真である。図４の右のグラフは、それぞれの温度条件での細胞膜透過処理の結果、細胞膜は破れたが、核膜は破れなかった細胞（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ（黒色））、細胞膜が破れなかった細胞（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ(白色））、並びに細胞膜及び核膜の両方が破れた細胞（ｏｖｅｒ（灰色））の構成比（百分率）を表す棒グラフである。棒グラフの横軸は各細胞の構成比（百分率）を表す。
　図４の結果から、細胞膜だけが選択的に透過処理された細胞は、氷上、すなわち、０℃で細胞膜透過処理を行った細胞では２７％しかなかったが、１０℃、１５℃、２５℃又は３７℃で細胞膜透過処理を行った細胞では、それぞれ、９４％、８５％、９２％及び９１％あった。従来、ジギトニンによる細胞膜透過処理は、１９９０年に最初に報告した非特許文献５以来、氷上又は４℃で実行されており、非特許文献５の筆頭著者による２０１６年の実験法解説（非特許文献６）でも１０℃以上の温度でジギトニンによる細胞膜透過処理を行うことは開示も示唆もされていない。また本実施例では、０℃で細胞膜透過処理を行った細胞のうち細胞膜だけが選択的に透過処理された細胞は全体の２７％にすぎないのに対し、１０℃以上で細胞膜透過処理を行った細胞のうち細胞膜だけが選択的に透過処理された細胞は８５％～９４％と３倍以上多いという結果が得られた。
　この結果は、１０℃以上の温度でジギトニンによる細胞膜透過処理を行う本発明の核可溶性タンパク質の分画方法が、従来技術から予想できない顕著な作用効果を奏することを示している。
　実施例４　異なる細胞種での細胞膜透過処理効率の検討
　本実施例では、ジギトニン濃度を１００μｇ／ｍＬに固定し、実施例１～３で用いたヒト浮遊培養細胞のＨｅＬａＳ３とは異なる細胞タイプ由来のヒト培養細胞４種類を用いて細胞膜透過処理における温度条件をより詳細に検討した。
　ヒトテロメア逆転写酵素遺伝子を導入したヒト網膜色素上皮細胞株（ＲＰＥ１）、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株（Ａ５４９）、ヒト乳腺癌細胞株（ＭＣＦ７）又はヒト骨肉種細胞株（Ｕ２ＯＳ）は、いずれも培養基質に接着して増殖する培養細胞である。これらの細胞をトリプシン分解によって回収し、細胞数を１×１０７個にそろえ、８００μＬのジギトニン溶液中で２５℃又は氷上の温度条件下で５分間反応させて細胞膜透過処理を行い、その後、蛍光融合タンパク質ＧＦＰ－Ｉｍｐｏｒｔｉｎ　β及びＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙを加えて、それらの局在から細胞の状態を判断した。各条件で１００個以上の細胞について細胞の状態を評価して、細胞膜だけが破れ、核膜は破れなかった細胞、細胞膜の蛍光融合タンパク質透過性が不十分な細胞又は細胞膜及び核膜の両方が細胞膜の蛍光融合タンパク質を透過する細胞に分類してカウントする作業を３回繰り返した。前記ジギトニン溶液は、１００μｇ／ｍＬのジギトニンを添加した基本バッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）、１１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、２ｍＭ　（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ、５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ、０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ、及び、プロテアーゼ阻害剤カクテル）である。
　図５は、ヒト培養細胞ＲＰＥ１、Ａ５４９、ＭＣＦ７及びＵ２ＯＳについて、２５℃及び氷上（ｏｎ　ｉｃｅ）の温度条件下での細胞膜透過処理の後、各条件で１００個以上の細胞について細胞の状態の評価分類及びカウントを３回繰り返して得られた、細胞膜だけが破れ、核膜は破れなかった細胞（ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ（黒色））、細胞膜が破れなかった細胞（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ(白色））、並びに細胞膜及び核膜の両方が破れた細胞（ｏｖｅｒ（灰色））の構成比を表す棒グラフである。棒グラフの縦軸は各細胞の構成比（百分率）を表す。各棒グラフの上の数値は３回のカウントでの平均値を表し、誤差棒は標準偏差を表す。
　図５の結果から、氷上（ｏｎ　ｉｃｅ）での細胞膜透過処理では細胞種により細胞膜だけが破れる効率が大きく低下する場合があったが、２５℃での細胞膜透過処理では、４種類すべてにおいて、８０％以上の細胞で細胞膜だけが破れる処理が達成できたことが示された。特に、ｈＴＥＲＴ－ＲＰＥ１、Ａ５４９、ＭＣＦ７の３種類の細胞では９０％以上の高効率だった。一方、Ｕ２ＯＳについては、細胞の特性上、Ｔｒｙｐｓｉｎ処理後の操作の時点で、細胞が損傷を受けやすいため、少し低い効率となったと考えられる。
　本実施例の結果から、本発明の核可溶性タンパク質の分画方法は、細胞種にあまり影響されずに高効率で細胞膜だけを透過処理できることが示された。
　実施例５　ＷＧＡによる核可溶性タンパク質の細胞質への漏出抑制
　本実施例では、本発明の核可溶性タンパク質の分画方法における核可溶性タンパク質の細胞質への漏出抑制について検討した。
　１×１０７個のＥＧＦＰを恒常的に発現する浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞を８００μＬの細胞透過処理溶液中、２５℃で５分間反応させて細胞膜透過処理を行った。細胞透過処理溶液は、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）、１１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、２ｍＭ　（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ、５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ、０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤カクテルからなる基本バッファーをベースとして、基本バッファー（ジギトニンなし（ｗ／ｏ　Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ））か、ＮＰ－４０を添加した基本バッファー（０．１％　ＮＰ－４０）か、ジギトニンを添加した基本バッファー（１００μｇ／ｍｌ　Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）か、ジギトニン及びＷＧＡを添加した基本バッファー（１００μｇ／ｍｌ　Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ　＋　１００μｇ／ｍｌ　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ＷＧＡ）かを用いた。処理後にＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙを添加した基本バッファーを加えた。ＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙは２量体を形成し、質量が約１１０ｋであり、核膜が破れているかどうかの指標として細胞透過処理溶液に添加した。前記細胞膜透過処理の後、蛍光顕微鏡で観察し、ＥＧＦＰ及びＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙの局在から細胞の状態を判断した。
　図６は、ＥＧＦＰを恒常的に発現する浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞を異なる細胞膜透過条件（ジギトニンなし（ｗ／ｏ　Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）か、ＮＰ－４０（０．１％　ＮＰ－４０）、ジギトニン（１００μｇ／ｍｌ　Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）か、ジギトニン及びＷＧＡ（１００μｇ／ｍｌ　Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ　＋　１００μｇ／ｍｌ　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ＷＧＡ）か）で処理した後、同一視野を異なる光学条件で観察した蛍光顕微鏡写真である。左はＥＧＦＰによる蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真で、右はＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙによる蛍光を観察した蛍光顕微鏡写真である。
　図６の結果から、ジギトニンを含まない基本バッファーのみで処理した細胞（ｗ／ｏ　Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）は、ＥＧＦＰが細胞質にも核にも存在しているが、ＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙは細胞質にも核にも存在していない。これは細胞膜も核膜も破れていないことを意味する。０．１％のＮＰ－４０を含む基本バッファーで処理した細胞（０．１％　ＮＰ－４０）は、ＥＧＦＰが細胞質にも核にも存在していないが、ＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙは細胞質にも核にも存在している。これは細胞膜も核膜も破れていることを意味する。１００μｇ／ｍｌのジギトニンを含む基本バッファーで処理した細胞（１００μｇ／ｍｌ　Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）は、ＥＧＦＰが細胞質にも核にも存在していないが、ＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙは細胞質にだけ存在している。これは、細胞膜は破れており、核膜は破れていないが、もともと核内に存在していたＥＧＦＰ（質量約２６ｋＤａ）は自由拡散による受動的輸送経路を介して漏出したことを意味する。１００μｇ／ｍｌのジギトニン及び１００μｇ／ｍｌのビオチン化ＷＧＡを含む基本バッファーで処理した細胞（１００μｇ／ｍｌ　Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ　＋　１００μｇ／ｍｌ　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ　ＷＧＡ）は、ＥＧＦＰは核にだけ存在しているが、ＧＳＴ－ｍＣｈｅｒｒｙは細胞質にだけ存在している。これは、細胞膜は破れており、核膜は破れていないが、もともと核内に存在していたＥＧＦＰ（質量約２６ｋＤａ）はＷＧＡによって漏出が抑制されたことを意味する。
　実施例６　ＷＧＡによる内在性核タンパク質の細胞質への漏出抑制の網羅的検討
　実施例５では強制発現されたＥＧＦＰについてＷＧＡによる漏出抑制効果が認められたが、内在性のタンパク質についてもＷＧＡが同様の効果を示すかどうかを比較定量質量分析（ｉＴＲＡＱ法）により検証した。
　ｉＴＲＡＱ法のためのサンプル調製は以下の手順で行った。
１）浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞１×１０７個を１．５ｍＬのチューブに移し、遠心後、上清を除去する。
２）１ｍＬの基本バッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）、１１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、２ｍＭ　（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ、５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ、０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）を加え、懸濁し、遠心し、上清除去する。
３）ブロックインキュベータで２５℃に保温しておいた８００μＬの細胞膜透過処理溶液（１００μｇ／ｍＬ　ジギトニンか、１００μｇ／ｍＬ　ジギトニン及び１００μｇ／ｍＬ　ビオチン化ＷＧＡかを添加した基本バッファー）を加えて混和する。
４）５分間２５℃で保温し、１分ごとに転倒混和する。
５）直ちに氷上へ移し、遠心し、上清を除去する。
６）１ｍＬの氷冷基本バッファーを加え混合し、再度遠心し、上清を除去する。
７）１ｍＬの氷冷基本バッファーを加え混合し、再度遠心し、上清を除去する。
８）遠心し、上清を除去し、４００μＬのＰＢＳ（３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１．０６ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、１５５ｍＭ　ＮａＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）を加え混合する。
９）液体窒素で凍結し、２５℃で解凍する。これを計２回繰り返す。
１０）１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収する。
１１）ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２８０（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、８０μＬのビーズ懸濁液をＰＢＳで洗浄後使用）と４℃で１時間混和し、上清を回収し、核画分とした。
　質量分析は、Ｑ　Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計及び解析ソフトＰｒｏｔｅｏｍｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｖｅｒ．　２．２（ともにサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いて実施した。
　図７は、ジギトニン（Ｄｉｇ）による細胞膜透過処理か、ジギトニン及びＷＧＡ（Ｄｉｇ　＋　ＷＧＡ）による細胞膜透過処理かにより得られた核可溶性画分に含まれるタンパク質についての比較定量質量分析（ｉＴＲＡＱ法）を用いた解析結果を表す散布図である。図の横軸は、検出した個々のタンパク質のｋＤａ単位での質量を表し、図の縦軸は、前記個々のタンパク質のジギトニン処理での検出量に対するジギトニン＋ＷＧＡ処理での検出量の比を表す。ｐ＜０．０５で１．２倍以上に増加したタンパク質及び０．８倍以下に減少したタンパク質を、それぞれ、塗りつぶした三角（▲）及び四角（■）で表す。ｐ＞０．０５で１．２倍以上に増加したタンパク質及び０．８倍以下に減少したタンパク質を、それぞれ、白抜きの三角（△）及び四角（□）で表す。検出量の比が０．８以上１．２以下の範囲内のタンパク質を白抜きの丸（〇）で表す。検出した代表的なタンパク質は、遺伝子名を示した。細胞膜透過処理した細胞の比較定量質量分析は３回繰り返して実験を行い、３回とも検出された、合計１５６６種類のタンパク質を解析した。
　図７の散布図において、ｐ＜０．０５で１．２倍以上に増加したタンパク質（▲）及び０．８倍以下に減少したタンパク質（■）の遺伝子名を以下の表１に列挙する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図７の結果から、ｐ＜０．０５でジギトニン処理での検出量に対するジギトニン＋ＷＧＡ処理での検出量の比が１．２倍以上に増加したタンパク質（▲）、すなわち、ＷＧＡによって有意な漏出抑制効果が認められたタンパク質のほとんどは、質量２５ｋＤａ以下の比較的低分子のタンパク質であった。逆に、ジギトニン処理での検出量に対するジギトニン＋ＷＧＡ処理での検出量の比が０．８倍以下に減少したタンパク質（□又は■）、すなわち、ＷＧＡを加えたにもかかわらず有意に核画分からの減少が認められたタンパク質は、分子量２５ｋ以上１７５ｋ以下の広い範囲のタンパク質で、核膜孔複合体を構成するヌクレオポリン（ＮＵＰ５４、ＮＵＰ８８、ＮＵＰ９３及びＮＵＰ１６０）を含む。これらのタンパク質は、図９の実験結果に示したＮｕｐ６２と同様に核画分から不溶画分に移行したと考えられる。分子量に関係なく一部のＯ－結合型ＧｌｃＮＡｃ修飾を受けている糖タンパク質（例えば、Ｎｕｐ５４，　Ｎｕｐ９３及びＮｕｐ８８）とその関連因子（Ｎｕｐ１６０）は、ジギトニンのみで処理した場合よりも減少するケースも一部あった。しかし、核－細胞質間輸送因子群のうちＣＳＥ１、ＲＡＮ及びＸＰＯ１は有意に増加したが、これら以外の核－細胞質間輸送因子群には有意に減少したものがないことから、前記核－細胞質間輸送因子群によって輸送される大部分の核タンパク質群に対して、ＷＧＡによる２次的な悪影響はほとんどないと考えられる。
　実施例７　本発明の核可溶性タンパク質の分画方法による既知タンパク質の細胞内局在の検討
　ＨｅＬａＳ３細胞で発現し、特異的抗体が入手可能なタンパク質について、接着培養したＨｅＬａＳ３細胞内での局在をＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体による免疫細胞化学的手法で確認するとともに、本発明のジギトニン（Ｄｉｇ）による細胞膜透過処理か、ジギトニン及びＷＧＡ（Ｄｉｇ　＋　ＷＧＡ）による細胞膜透過処理かを含む核可溶性タンパク質の分画方法によって分画された、細胞質画分、核画分及び不溶性画分のそれぞれを電気泳動によって分離しウェスタンブロッティング法によって検出し、各画分での存在量比の百分率をデンシトメトリで決定した。比較例として、富士フイルム和光純薬株式会社から販売されているリソピュア（商標）核・細胞質タンパク質エキストラクターキット（Ｌｙｓｏｐｕｒｅ（Ｆｕｊｉ　Ｗａｋｏ）、製品コード２９５－７３９０１）、及び、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社から販売されているＮＥ－ＰＥＲ（商標）　Ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＮＥ－ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ）、カタログ番号７８８３３）をそれぞれの製造者による指示書にしたがって使用した。
　本実施例における本発明の核可溶性タンパク質の分画方法は以下の手順で実施した。
１）前記ＥＧＦＰを恒常的に発現する浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞１×１０７個を１．５ｍＬのチューブに移し、遠心後、上清を除去する。
２）１ｍＬの基本バッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）、１１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＫ、２ｍＭ　（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｍｇ、５ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＮａ、０．５ｍＭ　ＥＧＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）を加え、懸濁し、遠心し、上清除去する。
３）ブロックインキュベータで２５℃に保温しておいた８００μＬの細胞膜透過処理溶液（１００μｇ／ｍＬ　ジギトニンか、１００μｇ／ｍＬ　ジギトニン及び１００μｇ／ｍＬ　ビオチン化ＷＧＡかを添加した基本バッファー）を加えて混和する。
４）５分間２５℃で保温し、１分ごとに転倒混和する。
５）直ちに氷上へ移し、遠心し、上清を除去する。この上清を回収して以下に説明するとおり細胞質画分として調製した。
６）１ｍＬの氷冷基本バッファーを加え混合し、再度遠心し、上清を除去する。
７）１ｍＬの氷冷基本バッファーを加え混合し、再度遠心し、上清を除去する。
８）遠心し、上清を除去し、４００μＬのＰＢＳ（３ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、１．０６ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、１５５ｍＭ　ＮａＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）を加え混合する。
９）液体窒素で凍結し、２５℃で解凍する。これを計２回繰り返す。
１０）１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収し、以下に説明するとおり核画分とした。
　市販キットＮＥ－ＰＥＲと、本発明のＤｉｇｉｔｏｎｉｎ及びＤｉｇｉｔｏｎｉｎ＋ＷＧＡの細胞分画法で取得した細胞質画分は、全量が５００μＬ以下になるまでＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５　１０　ｋＤａ　（ＭＥＲＣＫ　ＵＦＣ５０１０２４）を用いて濃縮した。その後、全ての細胞質画分と核画分は、ＰＢＳを加えて全量を５００μＬに揃えた。次に－３０℃で保温しておいた１００％アセトンを１．５ｍＬ加えて混和し、－３０℃で３時間静置した。５００×ｇで５分遠心し、上清を除去し、２００μＬのサンプルバッファーに溶かし、９５℃で１２分間ボイルしウェスタンブロットに使用した。不溶性画分は、２００μＬのサンプルバッファーと混和し、ソニケーション（Ｈａｎｄｙ　ｓｏｎｉｃ　（トミー精工　ＵＲ－２０Ｐ），　Ｐｏｗｅｒ：３，　５秒）し、９５℃で１２分間ボイルし、ウェスタンブロットに使用した。図８～図１０の各タンパク質のウェスタンブロッティングの電気泳動サンプルに添加した各画分のボイル後のサンプルバッファーの体積はカッコ内に示すとおりである。図８：ＧＡＰＤＨ（０．４μＬ）、αＴｕｂｕｌｉｎ（１μＬ）、ＲａｎＢＰ１（５μＬ）、βａｃｔｉｎ（２．５μＬ）及びＩｍｐｏｒｔｉｎα１（５μＬ）。図９：Ｌａｍｉｎ　Ａ／Ｃ（５μＬ）、Ｎｕｐ６２（５μＬ）、Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ３（０．４μＬ）、ＨＭＧＡ１（５μＬ）、ＲＣＣ１（５μＬ）、ＲａｎＢＰ３（５μＬ）及びＰＣＮＡ（５μＬ）。図１０：ＮＴＦ２（５μＬ）、ＰＰＩＡ（２．５μＬ）、ＰＦＮ１（５μＬ）、ＴＸＮ（５μＬ）、Ｒａｎ（０．４μＬ）及びＧＦＰ（１μＬ）。
　図８の上段は、細胞質（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）のみに局在することが既知のタンパク質（ＧＡＰＤＨ、α－Ｔｕｂｕｌｉｎ及びＲａｎＢＰ１）か、細胞質及び核の両方（Ｂｏｔｈ）に局在することが既知のタンパク質（β－ａｃｔｉｎ及びＩｎｐｏｒｔｉｎ　α１）かに対する抗体及びＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体を用いた接着培養したＨｅＬａＳ３細胞の蛍光顕微鏡写真である。図８の中段は、市販の２種類の細胞分画キット（Ｌｙｓｏｐｕｒｅ（Ｆｕｊｉ　Ｗａｋｏ）及びＮＥ－ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ））と、本発明のジギトニンのみによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）と、本発明のジギトニン及びＷＧＡによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ　＋　ＷＧＡ）とによって得られた、前記ＥＧＦＰを恒常的に発現する浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞の細胞質画分（Ｃｙｔｏ）、核画分（Ｎｕｃ）及び不溶性画分（Ｐｔｔ）を前記既知タンパク質の抗体により検出したウェスタンブロットである。図８の下段は、中段のウェスタンブロットのバンドをデンシトメトリーにより定量化した結果を表す帯グラフである。帯グラフの灰色、黒色及び白色の部分は、それぞれ、細胞質画分（Ｃｙｔｏ）、核画分（Ｎｕｃ）及び不溶性画分（Ｐｔｔ）の百分率を表す。
　図８に示すとおり、細胞質に主に局在するＧＡＰＤＨ、α－Ｔｕｂｕｌｉｎ、ＲａｎＢＰ１の３種類に関しては、全ての核可溶性タンパク質の分画方法で主に細胞質画分に分画された。しかしＧＡＰＤＨは、細胞質マーカーとしてよく利用されるが、免疫染色像から分かるように一部は、核内にも局在する。本発明のジギトニン又はジギトニン＋ＷＧＡによる核可溶性タンパク質の分画方法では、一部が核画分からも検出されている。これは、本発明の核可溶性タンパク質の分画方法が比較例の市販キットより正確に細胞内局在を反映していることを裏付ける結果である。細胞質と核の両方に局在するβ－ａｃｔｉｎ、Ｉｍｐｏｒｔｉｎ－αについては、どの方法でも同様な結果になった。
　図９の上段は、核膜内膜及び核膜孔複合体（Ｎｕｃｌｅａｒ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ａｎｄ　ＮＰＣｓ）に局在することが既知のタンパク質（ラミン　Ａ／Ｃ及びＮｕｐ６２）か、核（Ｎｕｃｌｅｕｓ）に局在することが既知のタンパク質（ヒストンＨ３、ＨＭＧＡ１、ＲＣＣ１、ＲａｎＢＰ３及びＰＣＮＡ）に対する抗体及びＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体を用いた接着培養したＨｅＬａＳ３細胞の蛍光顕微鏡写真である。図９の中段は、市販の２種類の細胞分画キット（Ｌｙｓｏｐｕｒｅ（Ｆｕｊｉ　Ｗａｋｏ）及びＮＥ－ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ））と、本発明のジギトニンのみによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）と、本発明のジギトニン及びＷＧＡによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ　＋　ＷＧＡ）とによって得られた、前記ＥＧＦＰを恒常的に発現する浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞の細胞質画分（Ｃｙｔｏ）、核画分（Ｎｕｃ）及び不溶性画分（Ｐｔｔ）を前記既知タンパク質の抗体により検出したウェスタンブロットである。図９の下段は、中段のウェスタンブロットのバンドをデンシトメトリーにより定量化した結果を表す帯グラフである。帯グラフの灰色、黒色及び白色の部分は、それぞれ、細胞質画分（Ｃｙｔｏ）、核画分（Ｎｕｃ）及び不溶性画分（Ｐｔｔ）の百分率を表す。
　図９の実験結果では、核膜内膜に安定して網目構造を形成しているラミン　Ａ／Ｃは、ジギトニンによる核可溶性タンパク質の分画方法と、ジギトニン＋ＷＧＡによる核可溶性タンパク質の分画方法とでは、核画分に分画されないが、市販品では多く検出される。これは、市販品に含まれる界面活性剤などによって、強制的に可溶化されているためと考えられる。Ｎｕｐ６２は核膜孔複合体の構成因子で、核タンパク質の漏出を防ぐために加えたＷＧＡの代表的な結合相手である。そのため、本来は核膜孔複合体以外にも余剰のＮｕｐ６２が細胞質と核質に存在するが、処理時にＷＧＡと結合し不溶性画分へ分画された。図７で、ジギトニンによる核可溶性タンパク質の分画方法よりもジギトニン＋ＷＧＡによる核可溶性タンパク質の分画方法で、核画分から減少している因子の中には、核膜孔複合体を構成するＮｕｐ５４、Ｎｕｐ９３、Ｎｕｐ１６０が含まれているが、これらもＮｕｐ６２と同様の理由だと考えられる。
　図９の実験結果では、核内の代表的なマーカータンパク質群については、ヒストンＨ３のようなクロマチンを構成しているタンパク質は、いずれの核可溶性タンパク質の分画方法でも不溶性画分に多く分画された。しかし、ＨＭＧＡ１やＲＣＣ１のようなクロマチンに結合している因子は、本発明のジギトニンによる核可溶性タンパク質の分画方法及び本発明のジギトニン＋ＷＧＡによる核可溶性タンパク質の分画方法で分画した場合は不溶性画分に多く分画されるが、市販品では多くが核画分として抽出された。これは、ラミンＡ／Ｃと同様に界面活性剤等により強制的に溶出していると考えられる。一方、可溶性の核タンパク質であるＲａｎＢＰ３とＰＣＮＡは、本発明のジギトニンによる核可溶性タンパク質の分画方法及び本発明のジギトニン＋ＷＧＡによる核可溶性タンパク質の分画方法だけで核画分に分画され、市販品では全て細胞質画分に分画された。これは、細胞質画分を取得する際に、細胞膜だけでなく核膜や核膜孔複合体にもダメージを与えてしまい、核内から漏れ出したと考えられる。以上の結果から、本発明のジギトニンによる核可溶性タンパク質の分画方法及び本発明のジギトニン＋ＷＧＡによる核可溶性タンパク質の分画方法は、核内の可溶性画分を、より真の局在に近い形で取得することができるといえる。
　図１０の上段右端は、ＥＧＦＰを一過性に発現する接着培養したＨｅＬａＳ３細胞をパラホルムアルデヒド（Ｐａｒａ）で固定した後にＥＧＦＰの発する蛍光を観察した結果の蛍光顕微鏡写真である。図１０の中段右端は、市販の２種類の細胞分画キット（Ｌｙｓｏｐｕｒｅ（Ｆｕｊｉ　Ｗａｋｏ）及びＮＥ－ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ））と、本発明のジギトニンのみによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）と、本発明のジギトニン及びＷＧＡによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ　＋　ＷＧＡ）とによって得られた、前記ＥＧＦＰを恒常的に発現するＨｅＬａＳ３細胞の細胞質画分（Ｃｙｔｏ）、核画分（Ｎｕｃ）及び不溶性画分（Ｐｔｔ）を抗ＥＧＦＰ抗体により検出したウェスタンブロットである。図１０の下段右端は、中段右端のウェスタンブロットのバンドをデンシトメトリーにより定量化した結果を表す帯グラフである。図１０の上段の残りは、パラホルムアルデヒド（Ｐａｒａ）又はメタノール（Ｍｅｔｈ）で固定した後に既知タンパク質（ＮＴＦ２（１４ｋＤａ）、ＰＰＩＡ（１８ｋＤａ）、ＰＦＮ１（１５ｋＤａ）、ＴＸＮ（１２ｋＤａ）及びＲａｎ（２４ｋＤａ））に対する抗体及びＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体を用いた接着培養したＨｅＬａＳ３細胞の蛍光顕微鏡写真である。前記既知タンパク質はいずれもＷＧＡ添加により核内からの漏出が抑制されたことが図７で確認された。図１０の中段の残りは、市販の２種類の細胞分画キット（Ｌｙｓｏｐｕｒｅ（Ｆｕｊｉ　Ｗａｋｏ）及びＮＥ－ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ））と、本発明のジギトニンのみによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）と、本発明のジギトニン及びＷＧＡによる分画方法（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ　＋　ＷＧＡ）とによって得られた、前記ＥＧＦＰを恒常的に発現する浮遊培養したＨｅＬａＳ３細胞の細胞質画分（Ｃｙｔｏ）、核画分（Ｎｕｃ）及び不溶性画分（Ｐｔｔ）を前記既知タンパク質の抗体により検出したウェスタンブロットである。図１０の下段の残りは、中段の残りのウェスタンブロットのバンドをデンシトメトリーにより定量化した結果を表す帯グラフである。帯グラフの灰色、黒色及び白色の部分は、それぞれ、細胞質画分（Ｃｙｔｏ）、核画分（Ｎｕｃ）及び不溶性画分（Ｐｔｔ）の百分率を表す。カッコ内の数字は各タンパク質の質量を表す。なお、ＮＴＦ２はＮＵＴＦ２の別名（ａｌｉａｓ　ｓｙｍｂｏｌ）である。
　図１０では、図７において、比較定量質量分析（ｉＴＲＡＱ法）によって同定した、ＷＧＡによって核内からの漏出が抑制された低分子量のタンパク質群とＧＦＰについても同様の検証を行った。その結果、検証した全てのタンパク質において、程度の差はあるが、ＷＧＡによる核からの漏出抑制効果が確認できた。
　以上の実験結果から、市販のキットと比較しても本発明のジギトニン＋ＷＧＡによる核可溶性タンパク質の分画方法が優れていることが確認できた。また、分画の全ての工程を通して、ジギトニン以外の界面活性剤を使わず、高塩濃度や低張のバッファーを用いないため、ヒストン関連タンパク質の強制的な溶出を抑えられ、可溶性の核内タンパク質のみを高精度で取得することができる。
　本発明によれば、効率よく細胞膜透過処理を行うことができると同時に核内の可溶性タンパク質画分をより真の局在に近い状態で取得することができるため、細胞レベルの生命現象を、従前と比較してより高い精度で解析できる。従って、本発明はライフサイエンス分野や医薬分野における基礎研究の手段として極めて有用である。
　本出願は、２０２０年１２月２日付で日本国に出願された特願２０２０－２００６４１を基礎としており、ここで言及することによりその内容のすべてが本明細書に組み込まれるものである。

Claims (6)

  1. 　約１０℃～約４２℃の温度条件において、ジギトニンに細胞を曝露する工程を含む、核可溶性タンパク質の分画方法。
  2. 　前記温度条件は約２５℃～約３７℃である、請求項１に記載の核可溶性タンパク質の分画方法。
  3. 　前記ジギトニンに細胞を曝露する工程は少なくとも１×１０７個／ｍＬの濃度の細胞を前記ジギトニンに曝露することを含み、細胞膜特異的な透過性を示す細胞が８５％以上である細胞から、細胞質画分と、核画分及び不溶性画分とを分離する工程を含む、請求項１又は２に記載の核可溶性タンパク質の分画方法。
  4. 　ＷＧＡに細胞を曝露する工程を含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の核可溶性タンパク質の分画方法。
  5. 　ジギトニンを含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の分画方法を実施するためのキット。
  6. 　ジギトニン及びＷＧＡを含む、請求項４に記載の分画方法を実施するためのキット。
PCT/JP2021/044140 2020-12-02 2021-12-01 核可溶性タンパク質の新規分画方法 WO2022118894A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022566962A JPWO2022118894A1 (ja) 2020-12-02 2021-12-01

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020-200641 2020-12-02
JP2020200641 2020-12-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022118894A1 true WO2022118894A1 (ja) 2022-06-09

Family

ID=81853982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/044140 WO2022118894A1 (ja) 2020-12-02 2021-12-01 核可溶性タンパク質の新規分画方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2022118894A1 (ja)
WO (1) WO2022118894A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008511289A (ja) * 2004-07-23 2008-04-17 ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド 細胞周期フェーズマーカー
JP2019510224A (ja) * 2016-03-18 2019-04-11 ベックマン コールター， インコーポレイテッド 標的検体の細胞内局在
JP2020506671A (ja) * 2016-12-29 2020-03-05 イルミナ インコーポレイテッド 細胞区画内の生体分子への直交アクセスおよび細胞区画内の生体分子のタグ付けのための分析システム

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008511289A (ja) * 2004-07-23 2008-04-17 ジーイー・ヘルスケア・ユーケイ・リミテッド 細胞周期フェーズマーカー
JP2019510224A (ja) * 2016-03-18 2019-04-11 ベックマン コールター， インコーポレイテッド 標的検体の細胞内局在
JP2020506671A (ja) * 2016-12-29 2020-03-05 イルミナ インコーポレイテッド 細胞区画内の生体分子への直交アクセスおよび細胞区画内の生体分子のタグ付けのための分析システム

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAKOTO KIMURA, KETAN THAKAR, SAMIR KARACA, NAOKO IMAMOTO, RALPH H KEHLENBACH: "Novel Approaches for the Identification of Nuclear Transport Receptor Substrates", NUCLEAR PORE COMPLEXES AND NUCLEOCYTOPLASMIC TRANSPORT - METHODS, 1 January 2014 (2014-01-01), NL, pages 353 - 378, XP009537234, ISBN: 978-0-12-417160-2, DOI: 10.1016/B978-0-12-417160-2.00016-3 *
MOHR DAGMAR, FREY STEFFEN, FISCHER TORSTEN, GÜ TTLER THOMAS, GÖ RLICH DIRK: "Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes", THE EMBO JOURNAL, vol. 28, 1 January 2009 (2009-01-01), pages 2541 - 2553, XP055937153 *
OGAWA Y., IMAMOTO, N.: "Methods to separate nuclear soluble fractions reflecting localizations in living cells", ISCIENCE, vol. 24, no. 12, pages 1 - 19, XP055937158 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2022118894A1 (ja) 2022-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Capalbo et al. The midbody interactome reveals unexpected roles for PP1 phosphatases in cytokinesis
US11674952B2 (en) Embryonic cell-based therapeutic candidate screening systems, models for Huntington's Disease and uses thereof
Hawryluk-Gara et al. Vertebrate Nup53 interacts with the nuclear lamina and is required for the assembly of a Nup93-containing complex
Du et al. Cardiac myofibrillogenesis inside intact embryonic hearts
Sakaguchi et al. Relationship between contact inhibition and intranuclear S100C of normal human fibroblasts
JP6873946B2 (ja) 角膜内皮細胞マーカー
Dráberová et al. Differential expression of human γ‐tubulin isotypes during neuronal development and oxidative stress points to a γ‐tubulin‐2 prosurvival function
Remenyi et al. Persistent replication of a chikungunya virus replicon in human cells is associated with presence of stable cytoplasmic granules containing nonstructural protein 3
Eilbracht et al. Protein NO52—a constitutive nucleolar component sharing high sequence homologies to protein NO66
Fichtman et al. Imaging metazoan nuclear pore complexes by field emission scanning electron microscopy
Yoon et al. Wnt4 and ephrinB2 instruct apical constriction via Dishevelled and non-canonical signaling
Whitlock et al. Cell surface-bound La protein regulates the cell fusion stage of osteoclastogenesis
WO2022118894A1 (ja) 核可溶性タンパク質の新規分画方法
Wei et al. The N-terminal leucine-zipper motif in PTRF/cavin-1 is essential and sufficient for its caveolae-association
Pasternak et al. RhopH2 and RhopH3 export enables assembly of the RhopH complex on P. falciparum-infected erythrocyte membranes
Bala et al. Emp is a component of the nuclear matrix of mammalian cells and undergoes dynamic rearrangements during cell division
Bisbal et al. KIF4 mediates anterograde translocation and positioning of ribosomal constituents to axons
Ishii et al. Cytosolic subunits of ATP synthase are localized to the cortical endoplasmic reticulum‐rich domain of the ascidian egg myoplasm
Prekeris Analyzing the functions of Rab11-effector proteins during cell division
Niepel et al. Rapid isolation of functionally intact nuclei from the yeast Saccharomyces
Zhuang et al. Evolution of the fusogenic activity of the receptor FGFRL1
Choi et al. Assaying microtubule nucleation by the γ-tubulin ring complex
JP4920239B2 (ja) ミトコンドリア膜タンパク質群およびそれらをコードする遺伝子群
Cao et al. A poxvirus decapping enzyme localizes to mitochondria to regulate RNA metabolism and translation, and promote viral replication
JP5891561B2 (ja) ミトコンドリア膜タンパク質群およびそれらをコードする遺伝子群

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21900645

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022566962

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21900645

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1