WO2022106468A1 - Verfahren und laserscanningmikroskop zum abbilden einer mit verschiedenen fluoreszenzmarkern markierten struktur einer probe - Google Patents

Verfahren und laserscanningmikroskop zum abbilden einer mit verschiedenen fluoreszenzmarkern markierten struktur einer probe Download PDF

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WO2022106468A1
WO2022106468A1 PCT/EP2021/081989 EP2021081989W WO2022106468A1 WO 2022106468 A1 WO2022106468 A1 WO 2022106468A1 EP 2021081989 W EP2021081989 W EP 2021081989W WO 2022106468 A1 WO2022106468 A1 WO 2022106468A1
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Katrin Willig
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels

Definitions

  • the invention relates to a microscopic method for imaging a structure of a sample that is marked with different fluorescent markers. Such microscopic methods are also referred to as multicolor microscopy.
  • the invention relates to a method for imaging a structure of a sample marked with first fluorescence markers and switchable second fluorescence markers, which has the features of the preamble of independent patent claim 1 .
  • the invention relates to a laser scanning microscope for carrying out such a method, in particular with the features of the preamble of patent claim 6.
  • STED microscopes therefore, only one STED laser is used for various fluorescence markers. This is possible, for example, when the emission spectra of the different fluorescence markers are only slightly offset from one another, ie typically between 20 nm and 100 nm.
  • the different fluorescent markers are then excited with excitation light of different wavelengths from different colored lasers, each combined with the fluorescence arresting light from the same STED laser, and the fluorescent light from the different fluorescent markers is detected in spectrally separated channels.
  • the short-wave emitting fluorescence markers are de-excited somewhat more poorly by stimulated emission and correspondingly imaged with a somewhat poorer resolution than the longer-wave emitting fluorescence markers.
  • fluorescent proteins are used as fluorescent markers, since these can be produced by the cells or the organism itself after transfection with a corresponding DNA.
  • organic, cell-permeable fluorophores that are bound to a target protein with the help of so-called SNAP or HALO tags and can therefore be used in v/Vo-STED microscopy.
  • SNAP or HALO tags organic, cell-permeable fluorophores that are bound to a target protein with the help of so-called SNAP or HALO tags and can therefore be used in v/Vo-STED microscopy.
  • the number of such organic cell-permeable fluorescent markers is only small.
  • the predominant use of fluorescent proteins as fluorescent markers severely limits multicolor/nv/vo-STED microscopy. Fluorescent proteins with a large Stokes shift hardly exist or are not sufficiently photostable for use in STED microscopy, so that they bleach too quickly.
  • first and second fluorescent markers that are spectrally close together are often used in in vivo STED microscopy.
  • EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • EYFP Enhanced Yellow Fluorescent Protein
  • the emission spectra of these two fluorescent proteins are very similar, so the same STED wavelength can be used for the stimulated emission.
  • This well-known method of multi-color STED microscopy can be implemented with a single-color STED microscope, which is supplemented by a 405 nm laser for the switching light. Besides, only a 488 nm laser is required for the excitation light, a 595 nm STED laser for the fluorescence arresting light, and a single detection channel with a single detector. Two monochromatic images of the distributions of the first fluorescent markers on the one hand and the second fluorescent markers on the other hand are recorded one after the other.
  • the detection of the fluorescent light in the individual channel can be chosen to be spectrally broader because no spectral separation between the different fluorescent markers is carried out therein.
  • the structures in the sample can move between the individual images.
  • a co-localization of the different fluorescence markers is not clearly possible.
  • the switching process per pixel is significantly slower than the image acquisition time per pixel, this switching would increase the image acquisition time many times over.
  • the from Willig, KI, et al. (2011) is therefore not suitable for in v/Vo-STED microscopy.
  • the invention is based on the object of demonstrating a method for imaging a structure of a sample marked with various fluorescent markers and a corresponding laser scanning microscope for carrying out the method, which are suitable for multicolor/n v/o STED microscopy.
  • the object of the invention is achieved by a method having the features of independent patent claim 1 and by a laser scanning microscope having the features of patent claim 6 .
  • the dependent claims 2 to 4 relate to preferred embodiments of the method according to the invention and the dependent claims 7 to 10 relate to preferred embodiments of the laser scanning microscope according to the invention.
  • the method according to the invention serves to image a structure of a sample marked with first and second fluorescent markers, of which at least the second fluorescent markers can be switched.
  • a first light intensity distribution comprising first excitation light is applied to the sample at various first positions in order to excite the first fluorescence markers in a spatially limited first region to emit first fluorescence light.
  • the first fluorescent light is registered and assigned to the respective first position.
  • First switching light is then applied to the sample to switch the second fluorescent markers from a dark state to a second fluorescent state, and a second light intensity distribution comprising second excitation light is applied to the sample at different second positions to switch the second fluorescent markers to the second fluorescent state stimulate each in a spatially limited second area to emit second fluorescent light.
  • the second fluorescent light is registered and assigned to the respective second position.
  • the first light intensity distribution is applied to the sample at the various first positions that fall in one of several adjacent linear scanning areas, the first switching light is applied at least quasi-simultaneously throughout this one linear scanning area, and at the various second positions that fall in this one fall linear scanning area, applied to the second light intensity distribution before the sample is then applied in a next one of the adjacent line-shaped scanning areas with the first light intensity distribution.
  • the switching light is applied to the sample neither imagewise nor pixelwise, but linewise, the sample being exposed to the first switching light at least quasi-simultaneously in the respective entire linear scanning area.
  • the sample in the respective linear scanning area can be exposed to the switching light focused in a point manner, at least quasi-simultaneously, by repeated rapid traversing of the respective linear scanning area.
  • the switching light is applied to the entire one linear scanning area not only quasi but actually simultaneously, in that the respective linear scanning area is exposed to the first switching light through a first cylindrical lens.
  • the sample is exposed to a third light intensity distribution comprising third excitation light at different third positions, which fall in the one line-shaped scanning area, in order to Excite fluorescence markers in a spatially limited third region to emit third fluorescent light, with a first excitation wavelength of the first excitation light and a third excitation wavelength of the third excitation light being different.
  • the third fluorescent light is registered and assigned to the respective third position.
  • a spectral distinction is made between the first fluorescence markers and the third fluorescence markers, specifically at least by means of different first and third excitation wavelengths.
  • a further spectral distinction can be made when detecting the first and third fluorescent light in spectrally different detection channels.
  • Another embodiment of the method according to the invention is based on a sample in which the first fluorescent markers can also be switched.
  • the sample is not only exposed to the first switching light in order to switch the second fluorescent markers from their second dark state to their second fluorescent state, but also to switch the first fluorescent markers from a first fluorescent state to a first dark state switch.
  • second switching light of a second switching wavelength that differs from a first switching wavelength of the first switching light is applied to the sample in the next linear scanning area in order to convert the first fluorescent markers into switch the first fluorescent state and the second fluorescent markers to the second dark state.
  • This application also takes place at least quasi-simultaneously in the entire next line-shaped scanning area. It is preferably carried out by the second switching light being applied to the sample in the respective next linear scanning area through the first or a second cylindrical lens.
  • the first and the second fluorescent light can be registered using the same detector. If only first and second fluorescent light is registered overall, a single detector is also sufficient overall. This is possible because between the first and the second Fluorescence markers are distinguished with the help of the switching light. If third fluorescence markers are also present, the same detector can also be used for these as long as sufficient spectral differentiation is possible with the aid of the excitation light. Otherwise several spectrally different detection channels are to be provided.
  • the second fluorescent light can also be separated in that the intensity distribution of the fluorescent light over the respective linear area determined after the first switching light intensity distribution of the fluorescent light determined before the first switching light is subtracted.
  • the first and second fluorescent markers are distinguished at least by the first switching light that turns on the second fluorescent markers, the first and second excitation lights can have the same excitation wavelength. Then no additional excitation light source is required for the second excitation light.
  • the light intensity distributions each have a partial light intensity distribution of fluorescence prevention light, so that the method according to the invention is one of STED microscopy.
  • the fluorescence prevention light preferably has the same fluorescence prevention wavelength for all light intensity distributions, so that different fluorescence prevention light sources are not required for the different fluorescence markers, but one STED laser is sufficient.
  • the first and the second light intensity distribution can correspond completely.
  • the first switching wavelength of the first switching light can be equal to the first and/or the second excitation wavelength.
  • the first switching light and the first and/or the second excitation light then also differ with regard to their light intensity distribution in the sample.
  • the light intensity distributions of the first and second excitation lights are spot-like.
  • the light intensity distribution of the first switching light is at least quasi linear. In addition, there will be differences in intensity.
  • the positions of all light intensity distributions in the respective linear scanning area preferably match, so that the corresponding pixels of the recorded images of the different fluorescent markers in the sample are congruent.
  • the scanner can shift the sample relative to the lens and/or deflect the light between the light sources, the switching light source and the detection device on the one hand and the lens on the other.
  • the first light source is designed and arranged to apply a first light intensity distribution comprising first excitation light to the sample through the lens and with the aid of the scanner at various first positions in order to excite the first fluorescent markers in a spatially limited first region to emit first fluorescent light .
  • the first switching light source is designed and arranged to apply the first switching light to the sample through the objective in order to switch the second fluorescent markers to a second fluorescent state.
  • the first or the second light source is designed and arranged to apply a second light intensity distribution comprising second excitation light to the sample through the lens by means of the scanner at different second positions in order to detect the second fluorescent markers in the second fluorescent state in a spatially limited second area to stimulate the emission of second fluorescent light.
  • the detector arrangement is designed and arranged to register the first and the second fluorescent light and to assign them to the respective first or second position.
  • the light source(s) and the first switching light source are also designed and arranged to apply the first light intensity distribution to the sample at the various first positions, which are arranged in one of several adjacent linear scanning areas, the sample through the lens using the scanner in the entire line-shaped scanning area at least quasi-simultaneously with the second switching light, and to apply the second light intensity distribution to the sample at the various second positions in the respective linear scanning area before the first light source passes the sample through the lens by means of the scanner to the applied to different first positions, which are arranged in a next one of the adjacent line-shaped scanning areas, with the first light intensity distribution.
  • the laser scanning microscope according to the invention has a first cylindrical lens for focusing the first switching light from the first switching light source in the respective linear scanning area, which is arranged in a first plane conjugate to the rear aperture of the objective.
  • this cylindrical lens With the help of this cylindrical lens, the respective entire line-shaped scanning area can be acted upon not only quasi but actually simultaneously with the first switching light.
  • the laser scanning microscope according to the invention has a third light source, which is designed and arranged to the sample, before the sample in the one linear scanning area is exposed to the switching light, at different third positions, which are in the one linear scanning area, with to apply a third light intensity distribution comprising third excitation light in order to excite the third fluorescent markers in a spatially limited third region to emit third fluorescent light.
  • a first excitation wavelength of the first excitation light and a third excitation wavelength of the third excitation light differ.
  • the detector arrangement is then designed and arranged to register the third fluorescent light and assign it to the respective third position. In this case, the detector arrangement can have different detectors for the first and the third fluorescent light in order to differentiate them spectrally.
  • a second switching light source is designed and arranged to expose the sample through the lens to a second switching light of a second switching wavelength that differs from a first switching wavelength of the first switching light in order to switch the first fluorescent markers to a first fluorescent state and the second Switch fluorescent markers to a first dark state.
  • the second switching light thus has a complementary function to the first switching light.
  • the first cylindrical lens can also be used to focus the second switching light from the second switching light source in the respective linear scanning area, or a second cylindrical lens is arranged to focus the second switching light from the second switching light source in the respective linear scanning area in a second plane conjugate to the rear aperture of the objective .
  • the first cylindrical lens or the second cylindrical lens can be arranged to be temporarily introduced into a beam path of the first or second light source in order to temporarily form the first or second switching light source from the first light source.
  • the first or second excitation wavelength can match the first or second switching wavelength.
  • the detector arrangement can have the same detector for the first and the second fluorescent light. Furthermore, all the light sources can have a same fluorescence prevention light source for fluorescence prevention light. i.e. a STED embodiment of the laser scanning microscope according to the invention may comprise a single STED laser as a fluorescence prevention light source for fluorescence prevention light.
  • FIG. 1 schematically shows a first embodiment of the laser scanning microscope according to the invention.
  • FIG. 2 explains a first embodiment of the method according to the invention, which can be carried out with the laser scanning microscope according to FIG.
  • FIG. 3 explains a second embodiment of the method according to the invention, which can also be carried out with the laser scanning microscope according to FIG.
  • Fig. 4 shows schematically a second embodiment of the laser scanning microscope according to the invention.
  • FIG. 5 explains an embodiment of the method according to the invention, which can be carried out with the laser scanning microscope according to FIG. FIGURE DESCRIPTION
  • the laser scanning microscope 1 shown in FIG. 1 only schematically and also not completely, but with a focus on the present invention, has an objective 2 in order to focus excitation light 12 from an excitation light source 3 into a sample 4 .
  • the sample 4 is arranged on a sample holder 5 that can be positioned in all three spatial directions.
  • An additional scanner 6 is provided for scanning the sample 4 with the excitation light 12 .
  • the scanner 6 also descans the fluorescent light 7 coming from the sample 4 so that it reaches a detector 8 which is arranged confocally to the excitation light 12 focused into the sample 4 .
  • a fluorescence prevention light source 9 for fluorescence prevention light 10 is provided as another part of a light source 26 .
  • a beam shaper 11 is arranged in the beam path of the fluorescence prevention light 10, which causes the fluorescence prevention light 10 focused by the lens 2 together with the excitation light 12 to form an intensity minimum surrounded by intensity maxima.
  • the excitation light source 3 and the fluorescence prevention light source 9 together form a light source 26 for providing a light intensity distribution in the focus of the lens 2, which includes the excitation light 12 with a central intensity maximum and the fluorescence prevention light 10 with a central intensity minimum.
  • the fluorescence prevention light 10 means that the fluorescence light 7 registered by the detector 8 is only emitted from a central area of the light intensity distribution focused in the sample 4 and can therefore be assigned to the respective position of this spatially limited area in the sample.
  • a first switching light source 13 for switching light 14 is provided.
  • a first cylindrical lens 15 is arranged in the beam path of the switching light 14 in a first plane conjugate to a rear aperture of the objective 2 .
  • a second cylindrical lens 16 can be introduced into the beam path of the excitation light 12 in a second plane conjugate to a rear aperture of the objective 2 in order to use the excitation light source 3 as the second switching light source 17 for the second switching light 18 .
  • dichroic mirrors 19 to 21 are provided in order to combine or separate the beam paths in the laser scanning microscope 1.
  • FIG. 2A schematically shows how the sample 4 is scanned along a linear region 22 or line having a light intensity distribution 23 from the excitation light 12 and the fluorescence prevention light 10 .
  • the light intensity distribution 23 successively takes on different Positions 24 in the area 22 a.
  • the fluorescent light 7 coming from the sample 4 is registered with the detector 8 according to FIG.
  • This fluorescent light originates from first fluorescent markers in the sample 4, which are in a fluorescent state during the first scanning of the area 22 with the light intensity distribution 23.
  • 2B shows how the first switching light 14 is then applied simultaneously to the sample 4 in the entire line-shaped area 22 . This results in the first fluorescent markers being converted from their fluorescent state to a dark state, while second fluorescent markers in the sample are converted from their dark state to a fluorescent state.
  • FIG. 2C the sample in the line-shaped area 22 is again scanned at the positions 24 with the light intensity distribution 23 of the excitation light 12 and the fluorescence prevention light 10.
  • FIG. The fluorescent light 7 registered by the detector 8 according to FIG. 1 now comes from the second fluorescent markers.
  • FIG. 2A′ indicates that the procedure illustrated in FIGS. 2A to 2C is carried out next in another line-shaped area 25 .
  • This other linear area 25 is further away from the one linear area 22 so that the first fluorescent marker and second fluorescent marker located therein are not influenced by the exposure of the linear area 22 to the first switching light 14 according to FIG. 2B.
  • a line-shaped area 25 closer to the line-shaped area 22 is not scanned until the first and second fluorescent markers spontaneously, i. H. thermally stimulated, have returned to their original states, i. H. the first fluorescent markers to their fluorescent state and the second fluorescent markers to their dark state.
  • FIG. 3 illustrates an embodiment of the method according to the invention, in which directly adjacent linear regions 22 and 25 can also be scanned directly one after the other.
  • the linear area 22 is first exposed to the second switching light 18 from the switching light source 17, with the cylindrical lens 16 forming the focus of the switching light 18 linearly across the area 22.
  • the second switching light With the second switching light, the first fluorescence markers are actively switched to their fluorescent state and the second fluorescence markers to their dark state.
  • FIGS. 3B to 3D this is followed by the steps illustrated in FIGS. 2A to 2C.
  • the first fluorescent markers in the sample 4 can be the switchable fluorescent protein Padron, which is switched on with the second switching light 18 of a second switching light wavelength of 488 nm and with the excitation light 12 of the same excitation wavelength of 488 nm to emit fluorescent light 7 of a fluorescent light wavelength of 515 nm is excited.
  • the spatial range from which the fluorescence light can originate is narrowed with fluorescence prevention light of the fluorescence prevention light wavelength of 595 nm by stimulated emission.
  • the second fluorescence markers are the switchable fluorescent protein Dronpa-M159T, which is switched off by the second switching light 18 with the switching light wavelength of 488 nm.
  • Dronpa-M159T is switched on with the first switching light 14 with a switching light wavelength of 405 nm. This first switching light 14 also turns off Padron.
  • the switched-on Dronpa-M159T is excited with the excitation light 12 of the excitation light wavelength of 488 nm to emit fluorescent light 7 of a fluorescent light wavelength of 511 nm and is switched off with the second switching light 18 of the same switching light wavelength of 488 nm.
  • the Dronpa-M159T which is turned on is excited with the excitation light 12
  • the range from which the fluorescence light 7 can originate is spatially narrowed by the fluorescence-prevention light 10 of the fluorescence-prevention light wavelength of 595 nm.
  • the same detector 8 is used for the fluorescent light 7 of the fluorescent light wavelengths of 511 nm and 515 nm from Dronpa-M159T or Padron.
  • the laser scanning microscope according to the invention therefore has only three light sources 3 or 17 , 9 and 13 and a single detector 8 .
  • the embodiment of the laser scanning microscope 1 according to the invention shown in FIG. 4 differs from that according to FIG. 1 by the following additional components.
  • the excitation light source 3 as a second switching light source 17
  • a separate second switching light source 17 with the cylindrical lens 16 for the switching light 18 is provided.
  • the excitation light source 3 for the excitation light 12 which forms the light source 26 for the light intensity distribution 23 together with the fluorescence prevention light source 9
  • there is another excitation light source 27 for further excitation light 28 which together with the fluorescence prevention light source 9 forms a further light source 29 forms for a further light intensity distribution.
  • the detector arrangement 31 has a further detection channel with a further detector 30 for different fluorescence light wavelengths of the fluorescence light 7 than the detector 8 .
  • Additional dichroic mirrors 33 to 35 and a mirror 36 are used for beam combination and separation or beam guidance.
  • a double arrow 32 indicates that the distance of the lens 32 can be moved quickly in the z-direction, for example with a piezo actuator, which means that the scanner 6 designed as an x/y scanner can be expanded to quickly scan the sample 4 in the z-direction is.
  • FIG. 5 The embodiment of the method according to the invention which is illustrated in FIG. 5 and can be carried out with the laser scanning microscope 1 according to FIG. 4 begins according to FIG. the linear area 22 covering the focus area, in which the switching light 18 is focused with the cylindrical lens 16. With the switching light 18 certain fluorescent markers in the sample are switched off to their dark state. Other fluorescent markers in the sample remain in their fluorescent state or are even switched to this fluorescent state. This is followed, as shown in FIG. 5B , by scanning the linear region 22 with the light intensity distribution 23 from the excitation light 12 from the excitation light source 3 and the fluorescence-preventing light 10 from the fluorescence-preventing light source 9 .
  • the same linear region 22 is then scanned again, but now with the additional light intensity distribution 37 from the additional excitation light 28 from the additional excitation light source 27 and the fluorescence prevention light 10 from the fluorescence prevention light source 9 . Since the excitation light wavelengths of the excitation light 12 and the further excitation light 28 differ, different fluorescence markers with different spectral properties are excited in the line-shaped region 22 and thus interrogated during the scanning according to FIGS. 5B and 5C.
  • the different spectral properties of the fluorescence markers are different excitation spectra and/or fluorescence emission spectra, so that the differentiation between the different fluorescence markers by the excitation light 12 or 28 of different excitation light wavelengths and by the detection of the fluorescence light 7 with a different distribution depending on its fluorescence light spectrum over the detectors 8 and 30 is effected.
  • the linear area 22 is exposed to the switching light 14 from the switching light source 13, which is illuminated by the switching light 18 fluorescence marker in the sample 4 switched off by the switching light source 17 switches back to its fluorescent state.
  • FIG. 5B and 5C can be switched off in the area 22 with the switching light 14 .
  • FIG. 5D the line shape of the focus area is indicated, in which the switching light 14 is focused with the cylindrical lens 15.
  • Fig. 5E illustrates a subsequent step in which the line-shaped region 22 is scanned again with the same light intensity distribution 23 from the excitation light 12 and the fluorescence prevention light 10 as in Fig. 5B, but this time to turn off the during the scanning according to Fig. 5B and now query again with the switching light 14 switched on fluorescence marker. If the fluorescent markers switched on in the steps according to FIG.
  • the switching light 18 has a wavelength of 488 nm in order to switch off the reversibly switchable fluorescent protein rsEGFP2 to its dark state.
  • the excitation light 12 has the excitation light wavelength of 483 nm as in the step of FIG. 5E.
  • the further excitation light 28 in the step according to FIG. 5C has a further excitation light wavelength of 520 nm.
  • the fluorescence prevention light 10 has the fluorescence prevention wavelength of 595 nm in all steps.
  • the detector 8 detects the fluorescence light 7 from the EGFP in a detection wavelength range of 500 to 515 nm. This detection is essentially selective because of the excitation light 12 with the wavelength of 483 nm the citrine is only slightly excited and because citrine hardly emits fluorescent light 7 in the detection wavelength range between 500 and 515 nm.
  • the detection of the fluorescent light 7 from the citrine in the step according to FIG. 5C also takes place with the detector 30 selectively in a further detection wavelength range from 520 to 555 nm.
  • the EGFP emits in this detection wavelength range little.
  • the EGFP is not excited to a relevant extent with the further excitation light 28 of the excitation light wavelength of 520 nm.
  • the EGFP which is still fluorescent, is excited with the excitation light 12 in addition to the rsEGFP2 that is now switched on.
  • the fluorescent light 7 detected at each position 24 in the step according to FIG. 5E is to be subtracted from the fluorescent light 7 detected at the same position 24 in the step according to FIG determine.
  • Both detectors 8 and 30 can be active both in the step according to FIG. 5E and in the steps according to FIGS to draw the distribution of the different fluorescent markers in the sample.

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Abstract

Zum Abbilden einer mit ersten und schaltbaren zweiten Fluoreszenzmarkern markierten Struktur einer Probe (4) wird die Probe (4) an verschiedenen Positionen (24) in einem linienförmigen Abtastbereich (22) mit einer Lichtintensitätsverteilung (23) beaufschlagt, um die ersten Fluoreszenzmarker jeweils in einem räumlich begrenzten Bereich zur Emission von Fluoreszenzlicht (7) anzuregen, wobei das Fluoreszenzlicht (7) registriert und der jeweiligen Position (24) zugeordnet wird, dann in dem gesamten linienförmigen Abtastbereich (22) gleichzeitig mit Schaltlicht (14) beaufschlagt, um die zweiten Fluoreszenzmarker in einen fluoreszenten Zustand zu schalten, und anschließend an den verschiedenen Positionen (24) in dem einen Abtastbereich (22) mit der Lichtintensitätsverteilung (23) beaufschlagt, um die zweiten Fluoreszenzmarker in dem fluoreszenten Zustand jeweils in dem räumlich begrenzten Bereich zur Emission von Fluoreszenzlicht (7) anzuregen, wobei das Fluoreszenzlicht (7) registriert und der jeweiligen Position (24) zugeordnet wird, bevor die Probe (4) in einem daneben liegenden linienförmigen Abtastbereich (25) mit der Lichtintensitätsverteilung (23) beaufschlagt wird.

Description

VERFAHREN UND LASERSCANNINGMIKROSKOP ZUM ABBILDEN EINER MIT VERSCHIEDENEN FLUORESZENZMARKERN MARKIERTEN STRUKTUR EINER PROBE
TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf ein mikroskopisches Verfahren zum Abbilden einer mit Fluoreszenzmarkern verschiedenen markierten Struktur einer Probe. Solche mikroskopischen Verfahren werden auch als Mehrfarbenmikroskopie bezeichnet. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Abbilden einer mit ersten Fluoreszenzmarkern und schaltbaren zweiten Fluoreszenzmarkern markierten Struktur einer Probe, das die Merkmale des Oberbegriffs des unabhängigen Patentanspruchs 1 aufweist. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Laserscanningmikroskop zur Durchführung eines solchen Verfahrens, insbesondere mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs 6.
STAND DER TECHNIK
In der konventionellen oder der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie können Verteilungen verschiedener Fluoreszenzmarker, die bei unterschiedlichen Wellenlängen angeregt und/oder detektiert werden können, relativ einfach getrennt abgebildet werden. In der Mehrfarben-STED- Mikroskopie, in der eine Lichtverteilung, mit der eine Probe abgetastet wird, neben Anregungslicht zusätzliches Fluoreszenzverhinderungslicht aufweist, ergeben sich jedoch Schwierigkeiten, da für alle Fluoreszenzmarker sowohl ein Anregungslaser passend zum jeweiligen Anregungsspektrum als auch ein STED-Laser für die Abregung durch stimulierte Emission passend zum jeweiligen Fluoreszenzemissionsspektrum benötigt wird. Viele spektral unterschiedliche STED- Laser parallel einzusetzen, ist einerseits sehr teuer und zudem mit dem Nachteil verbunden, dass die für die kurzwelliger emittierenden Fluoreszenzmarker benötigte hohe Leistung des STED- Lasers, die längerwellig emittierenden Fluoreszenzmarker bleicht. ln kommerziell erhältlichen STED-Mikroskopen wird daher für verschiedene Fluoreszenzmarker nur ein STED-Laser verwendet. Dies ist zum Beispiel dann möglich, wenn die Emissionsspektren der verschiedenen Fluoreszenzmarker nur wenig, d. h. typischerweise zwischen 20 nm und 100 nm, zueinander versetzt sind. Die verschiedenen Fluoreszenzmarker werden dann mit Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlängen von verschiedenfarbigen Lasern angeregt, jeweils kombiniert mit dem Fluoreszenzverhinderungslicht von demselben STED-Laser, und das Fluoreszenzlicht von den verschiedenen Fluoreszenzmarkern wird in spektral getrennten Kanälen detektiert. Die kurzwelliger emittierenden Fluoreszenzmarker werden dabei etwas schlechter durch stimulierte Emission abgeregt und entsprechend mit etwas schlechterer Auflösung abgebildet als die langwelliger emittierenden Fluoreszenzmarker. Grundsätzlich bekannt ist überdies die Verwendung zweier unterschiedlicher Fluoreszenzmarker, die sich aufgrund unterschiedlicher Stokes-Verschiebungen im Wesentlichen nur hinsichtlich ihrer Anregungsspektren unterscheiden, so dass sie mit Anregungslicht unterschiedlicher Wellenlängen selektiv angeregt werden können, während ihre Emissionsspektren im Wesentlichen deckungsgleich sind, so dass sie mit Fluoreszenzverhinderungslicht von demselben STED-Laser in gleichem Maße durch stimulierte Emission abgeregt werden. Neben der spektralen Trennung des Fluoreszenzlichts von verschiedenen Fluoreszenzmarkern ist eine Trennung aufgrund unterschiedlicher Fluoreszenzlebensdauern mit Hilfe spezieller zeitlich hoch auflösender Detektoren bekannt.
Für die STED-Mikroskopie an lebenden Zellen, d. h. in vivo, werden größtenteils fluoreszierende Proteine als Fluoreszenzmarker verwendet, da diese von den Zellen oder dem Organismus nach Transfektion mit einer entsprechenden DNS selbst hergestellt werden können. Darüber hinaus gibt es organische, zellpermeable Fluorophore, die mit Hilfe sogenannter SNAP- oder HALO- Tags an ein Zielprotein gebunden und somit in der in v/Vo-STED-Mikroskopie verwendet werden können. Die Anzahl solcher organischer zellpermeabler Fluoreszenzmarker ist jedoch nur klein. Die überwiegende Verwendung von fluoreszierenden Proteinen als Fluoreszenzmarker schränkt die Mehrfarben-/n v/Vo-STED-Mikroskopie stark ein. Fluoreszierende Proteine mit großer Stokes- Verschiebung existieren kaum bzw. sind für eine Verwendung in der STED-Mikroskopie nicht ausreichend photostabil, so dass sie zu schnalle bleichen. Die Lebensdauern fluoreszierender Proteine unterscheiden sich kaum, was eine Trennung des Fluoreszenzlichts aufgrund ihrer unterschiedlichen Fluoreszenzlebensdauern unmöglich macht. Daher werden in der in vivo- STED-Mikroskopie häufig spektral eng beieinander liegende erste und zweite Fluoreszenzmarker verwendet. Als geeignet hat sich die Kombination von EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) und EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) mit einer Anregungswellenlänge und zwei Detektionskanälen oder mit zwei Anregungswellenlängen und zwei Detektionskanälen erwiesen.
Bei der Verwendung aus Willig, K.I., et al.: Dual-label STED nanoscopy of living cells using photochromism, Nano Lett. 11 (2011) 3970-3973. doi:10.1021/nl202290w, ist ein Verfahren der Mehrfarben-STED-Mikroskopie bekannt, bei dem erste und zweite reversibel schaltbare Fluoreszenzproteine verwendet werden. Diese photochromen Fluoreszenzproteine können mit Schaltlicht zwischen einem fluoreszenten Zustand und einem nicht fluoreszenten Dunkelzustand hin und her geschaltet werden. Konkret werden zwei Proteine, die mit denselben Wellenlängen aber in entgegengesetzten Richtungen zwischen ihren fluoreszenten Zuständen und Dunkelzuständen geschaltet werden können, kombiniert. Konkret beschrieben wird die Verwendung der Fluoreszenzproteine Padron und Dronpa-M159T. Die Emissionsspektren dieser beiden Fluoreszenzproteine ist sehr ähnlich, so dass dieselbe STED-Wellenlänge für die stimulierte Emission verwendet werden kann. Dieses bekannte Verfahren der Mehrfarben-STED- Mikroskopie kann mit einem Einfarben-STED-Mikroskop umgesetzt werden, welches um einen 405 nm Laser für das Schaltlicht ergänzt ist. Daneben ist nur ein 488 nm Laser für das Anregungslicht, ein 595 nm STED-Laser für das Fluoreszenzverhinderungslicht und ein einziger Detektionskanal mit einem einzigen Detektor erforderlich. Nacheinander werden zwei monochromatische Abbildungen der Verteilungen der ersten Fluoreszenzmarker einerseits und der zweiten Fluoreszenzmarker andererseits aufgenommen. Die Detektion des Fluoreszenzlichts in dem einzelnen Kanal kann spektral breiter gewählt werden, weil darin keine spektrale Trennung zwischen den verschiedenen Fluoreszenzmarkern durchgeführt wird. Wenn jedoch nacheinander die ersten Fluoreszenzmarker und dann die zweiten Fluoreszenzmarker in einer lebenden Probe abgebildet werden, können sich die Strukturen in der Probe zwischen den einzelnen Aufnahmen bewegen. Somit ist eine Kolokalisierung der verschiedenen Fluoreszenzmarker nicht eindeutig möglich. Um die verschiedenen Fluoreszenzmarker annähernd gleichzeitig aufzunehmen, müsste zwischen den einzelnen Pixeln zwischen den verschiedenen Fluoreszenzmarkern hin und her geschaltet werden. Da aber der Schaltvorgang pro Pixel deutlich langsamer als die Bildaufnahmezeit pro Pixel ist, würde dieses Schalten die Bildaufnahmezeit um ein Vielfaches verlängern. Das aus Willig, K.I., et al. (2011) bekannte Verfahren ist somit für die in v/Vo-STED- Mikroskopie nicht geeignet. AUFGABE DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Abbilden einer mit verschiedenen Fluoreszenzmarkern markierten Struktur einer Probe sowie ein entsprechendes Laserscanningmikroskop zur Durchführung des Verfahrens aufzuzeigen, die für Mehrfarben-/n v/ o-STED- Mikroskopie geeignet sind.
LÖSUNG
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und durch ein Laserscanningmikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 6 gelöst. Die abhängigen Patentansprüche 2 bis 4 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und die abhängigen Patentansprüche 7 bis 10 bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Laserscanningmikroskops.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Abbilden einer mit ersten und zweiten Fluoreszenzmarkern markierten Struktur einer Probe, von denen zumindest die zweiten Fluoreszenzmarker schaltbar sind. Die Probe wird an verschiedenen ersten Positionen mit einer erstes Anregungslicht umfassenden ersten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt, um die ersten Fluoreszenzmarker jeweils in einem räumlich begrenzten ersten Bereich zur Emission von erstem Fluoreszenzlicht anzuregen. Dabei wird das erste Fluoreszenzlicht registriert und der jeweiligen ersten Position zugeordnet. Dann wird die Probe mit erstem Schaltlicht beaufschlagt, um die zweiten Fluoreszenzmarker aus einem Dunkelzustand in einen zweiten fluoreszenten Zustand zu schalten, und die Probe wird an verschiedenen zweiten Positionen mit einer zweites Anregungslicht umfassenden zweiten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt, um die zweiten Fluoreszenzmarker in dem zweiten fluoreszenten Zustand jeweils in einem räumlich begrenzten zweiten Bereich zur Emission von zweitem Fluoreszenzlicht anzuregen. Das zweite Fluoreszenzlicht wird registriert und der jeweiligen zweiten Position zugeordnet. Dabei wird die Probe an den verschiedenen ersten Positionen, die in einen von mehreren nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereichen fallen, mit der ersten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt, in diesem gesamten einen linienförmigen Abtastbereich zumindest quasi gleichzeitig mit dem ersten Schaltlicht beaufschlagt und an den verschiedenen zweiten Positionen, die in diesen einen linienförmigen Abtastbereich fallen, mit der zweiten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt, bevor die Probe dann in einem nächsten der nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereiche mit der ersten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt wird. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Schaltlicht also weder bildweise noch pixelweise, sondern zeilenweise auf die Probe aufgebracht, wobei die Probe in dem jeweiligen gesamten linienförmigen Abtastbereich zumindest quasi gleichzeitig mit dem ersten Schaltlicht beaufschlagt wird. So wird die Dauer des Schaltvorgangs für diesen linienförmigen Abtastbereich oder diese Zeile minimiert und nicht etwa auf die Dauer des Schaltvorgangs pro Pixel multipliziert mit der Anzahl der Pixel der jeweiligen Zeile verlängert. Daher tritt nur eine relativ kurze Verzögerung zwischen der Aufnahme der jeweiligen Zeile des Bilds der ersten Fluoreszenzmarker und der zweiten Fluoreszenzmarker auf, und die Aufnahmezeit für die gesamte interessierende Struktur der Probe wird durch das Schalten zwischen dem Abtasten des jeweiligen linienförmigen Abtastbereichs, d. h. der jeweiligen Zeile, mit der ersten und der zweiten Lichtintensitätsverteilung nicht wesentlich verlängert.
Soweit hier und im Folgenden sowie den Patentansprüchen irgendwelche Merkmale mit den adjektivischen Zahlworten erste/erster/erstes, zweite/zweiter/zweites oder dritte/dritter/drittes versehen sind, so dienen diese Zahlworte nicht dazu, eine Rang- oder Reihenfolge ansonsten gleich bezeichneter Merkmale zum Ausdruck zu bringen. Die adjektivischen Zahlworte dienen nur dazu, die ansonsten gleich bezeichneter Merkmale untereinander zu unterscheiden. Diese Unterscheidung bedeutet aber nicht, dass sich die Merkmale in irgendeiner Art und Weise unterscheiden müssen, soweit dies nicht zusätzlich zu dem Zahlwort angegeben ist. Beispielsweise können die ersten und die zweiten Positionen und die ersten und die zweiten Lichtintensitätsverteilung als solche gleich oder unterschiedlich sein.
Grundsätzlich kann die Probe in dem jeweiligen linienförmigen Abtastbereich durch wiederholtes schnelles Überfahren des jeweiligen linienförmigen Abtastbereichs mit dem punktförmig fokussierten Schaltlicht zumindest quasi gleichzeitig beaufschlagt werden. Vorzugsweise erfolgt die Beaufschlagung des gesamten einen linienförmigen Abtastbereichs mit dem Schaltlicht aber nicht nur quasi sondern tatsächlich gleichzeitig, indem der jeweilige linienförmige Abtastbereich durch eine erste Zylinderlinse hindurch mit dem ersten Schaltlicht beaufschlagt wird.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Abbilden einer Probe, die weiterhin mit dritten Fluoreszenzmarkern markiert ist, wobei sich die ersten Fluoreszenzmarker, die zweiten Fluoreszenzmarker und die dritten Fluoreszenzmarker in ihren Anregungs- und Emissionsspektren unterscheiden, wird die Probe, bevor die Probe in dem gesamten einen linienförmigen Abtastbereich zumindest quasi gleichzeitig mit dem Schaltlicht beaufschlagt wird, an verschiedenen dritten Positionen, die in den einen linienförmigen Abtastbereich fallen, mit einer drittes Anregungslicht umfassenden dritten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt, um die dritten Fluoreszenzmarker jeweils in einem räumlich begrenzten dritten Bereich zur Emission von drittem Fluoreszenzlicht anzuregen, wobei sich eine erste Anregungswellenlänge des ersten Anregungslichts und eine dritte Anregungswellenlänge des dritten Anregungslichts unterscheiden. Das dritte Fluoreszenzlicht wird registriert und der jeweiligen dritten Position zugeordnet. Für diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zwischen den ersten Fluoreszenzmarkern und den dritten Fluoreszenzmarkern spektral unterschieden, und zwar zumindest durch unterschiedliche erste und dritte Anregungswellenlängen. Eine weitere spektrale Unterscheidung kann bei der Detektion des ersten und dritten Fluoreszenzlichts in spektral verschiedenen Detektionskanälen vorgenommen werden.
Eine andere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens geht von einer Probe aus, in der die ersten Fluoreszenzmarker ebenfalls schaltbar sind. In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probe mit dem ersten Schaltlicht nicht nur beaufschlagt, um die zweiten Fluoreszenzmarker aus ihrem zweiten Dunkelzustand in ihren zweiten fluoreszenten Zustand zu schalten, sondern auch, um die ersten Fluoreszenzmarker aus einem ersten fluoreszenten Zustand in einen ersten Dunkelzustand zu schalten. Außerdem wird die Probe, bevor die Probe in dem nächsten der nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereiche mit der ersten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt wird, in dem nächsten linienförmigen Abtastbereich mit zweitem Schaltlicht einer sich von einer ersten Schaltwellenlänge des ersten Schaltlichts unterscheidenden zweiten Schaltwellenlänge beaufschlagt, um die ersten Fluoreszenzmarker in den ersten fluoreszenten Zustand und die zweiten Fluoreszenzmarker in den zweiten Dunkelzustand zu schalten. Auch dieses Beaufschlagen erfolgt zumindest quasi gleichzeitig in dem gesamten nächsten linienförmigen Abtastbereich. Vorzugsweise erfolgt es, indem die Probe in dem jeweiligen nächsten linienförmigen Abtastbereich durch die erste oder eine zweite Zylinderlinse hindurch mit dem zweiten Schaltlicht beaufschlagt wird.
In allen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens können das erste und das zweite Fluoreszenzlicht unter Verwendung eines selben Detektors registriert werden. Wenn insgesamt nur erstes und zweites Fluoreszenzlicht registriert wird, reicht auch insgesamt ein einziger Detektor aus. Dies ist möglich, weil zwischen den ersten und den zweiten Fluoreszenzmarkern mit Hilfe des Schaltlichts unterschieden wird. Wenn auch dritte Fluoreszenzmarker vorhanden sind, kann auch für diese derselbe Detektor verwendet werden, soweit eine ausreichende spektrale Unterscheidung mit Hilfe des Anregungslichts möglich ist. Sonst sind mehrere spektral verschiedene Detektionskanäle vorzusehen. Wenn mit dem ersten Schaltlicht ausschließlich die zweiten Fluoreszenzmarker ein- aber nicht zugleich die ersten oder ersten und zweiten Fluoreszenzmarker ausgeschaltet werden, kann das zweite Fluoreszenzlicht auch dadurch separiert werden, dass von der nach dem ersten Schaltlicht ermittelten Intensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts über den jeweiligen linienförmigen Bereich die vor dem ersten Schaltlicht ermittelte Intensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts abgezogen wird.
Da zwischen den ersten und den zweiten Fluoreszenzmarkern zumindest durch das erste Schaltlicht unterschieden wird, dass die zweiten Fluoreszenzmarker einschaltet, können weiterhin das erste und das zweite Anregungslicht eine gleiche Anregungswellenlänge aufweisen. Dann ist keine zusätzliche Anregungslichtquelle für das zweite Anregungslicht erforderlich.
Besonders bevorzugt sind Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei denen die Lichtintensitätsverteilungen jeweils eine Teillichtintensitätsverteilung von Fluoreszenzverhinderungslicht aufweisen, so dass es sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein solches der STED-Mikroskopie handelt. Vorzugsweise weist das Fluoreszenzverhinderungslicht bei allen Lichtintensitätsverteilungen eine gleiche Fluoreszenzverhinderungswellenlänge auf, so dass keine unterschiedlichen Fluoreszenzverhinderungslichtquellen für die verschiedenen Fluoreszenzmarker benötigt werden, sondern ein STED-Laser ausreicht.
Bei den STED-Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens können die erste und die zweite Lichtintensitätsverteilung vollständig übereinstimmen.
Bei allen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die erste Schaltwellenlänge des ersten Schaltlichts gleich der ersten und/oder der zweiten Anregungswellenlänge sein. Auch dann unterscheiden sich das erste Schaltlicht und das erste und/oder das zweite Anregungslicht bzgl. ihrer Lichtintensitätsverteilung in der Probe. Die Lichtintensitätsverteilungen des ersten und des zweiten Anregungslichts sind punktförmig. Die Lichtintensitätsverteilung des ersten Schaltlichts ist zumindest quasi linienförmig. Darüber hinaus werden Unterschiede bei der Intensität gegeben sein. Vorzugsweise stimmen bei allen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens die Positionen aller Lichtintensitätsverteilungen in dem jeweiligen linienförmigen Abtastbereich überein, so dass die entsprechenden Pixel der aufgenommenen Bilder der verschiedenen Fluoreszenzmarker in der Probe deckungsgleich sind.
Ein erfindungsgemäßes Laserscanningmikroskop zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens weist ein Objektiv, einen Scanner, eine erste Lichtquelle, eine erste Schaltlichtquelle, evtl, eine zweite Lichtquelle und eine Detektoranordnung auf. Der Scanner kann die Probe gegenüber dem Objektiv verlagern und/oder das Licht zwischen den Lichtquellen, der Schaltlichtquelle und der Detektionseinrichtung einerseits und dem Objektiv andererseits ablenken. Die erste Lichtquelle ist dazu ausgebildet und angeordnet, die Probe durch das Objektiv und mit Hilfe des Scanners an verschiedenen ersten Positionen mit einer erstes Anregungslicht umfassenden ersten Lichtintensitätsverteilung zu beaufschlagen, um die ersten Fluoreszenzmarker jeweils in einem räumlich begrenzten ersten Bereich zur Emission von erstem Fluoreszenzlicht anzuregen. Die erste Schaltlichtquelle ist dazu ausgebildet und angeordnet, die Probe durch das Objektiv mit erstem Schaltlicht zu beaufschlagen, um die zweiten Fluoreszenzmarker in einen zweiten fluoreszenten Zustand zu schalten. Die erste oder die zweite Lichtquelle ist dazu ausgebildet und angeordnet, die Probe durch das Objektiv mittels des Scanners an verschiedenen zweiten Positionen mit einer zweites Anregungslicht umfassenden zweiten Lichtintensitätsverteilung zu beaufschlagen, um die zweiten Fluoreszenzmarker in dem zweiten fluoreszenten Zustand jeweils in einem räumlich begrenzten zweiten Bereich zur Emission von zweitem Fluoreszenzlicht anzuregen. Die Detektoranordnung ist dazu ausgebildet und angeordnet, das erste und das zweite Fluoreszenzlicht zu registrieren und der jeweiligen ersten oder zweiten Position zuzuordnen. Die Lichtquelle(n) und die erste Schaltlichtquelle sind weiterhin dazu ausgebildet und angeordnet, die Probe an den verschiedenen ersten Positionen, die in einem von mehreren nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereichen angeordnet sind, mit der ersten Lichtintensitätsverteilung zu beaufschlagen, die Probe durch das Objektiv mittels des Scanners in dem gesamten linienförmigen Abtastbereich zumindest quasi gleichzeitig mit dem zweiten Schaltlicht zu beaufschlagen, und die Probe an den verschiedenen zweiten Positionen in dem jeweiligen linienförmigen Abtastbereich mit der zweiten Lichtintensitätsverteilung zu beaufschlagen, bevor die erste Lichtquelle die Probe durch das Objektiv mittels des Scanners an den verschiedenen ersten Positionen, die in einem nächsten der nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereiche angeordnet sind, mit der ersten Lichtintensitätsverteilung beaufschlagt. ln einer bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Laserscanningmikroskop eine erste Zylinderlinse zum Fokussieren des ersten Schaltlichts von der ersten Schaltlichtquelle in den jeweiligen linienförmigen Abtastbereich auf, die in einer ersten zur Rückapertur des Objektivs konjugierten Ebene angeordnet ist. Mit Hilfe dieser Zylinderlinse kann der jeweilige gesamte linienförmige Abtastbereich nicht nur quasi sondern tatsächlich gleichzeitig mit dem ersten Schaltlicht beaufschlagt werden.
In einer Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Laserscanningmikroskop eine dritte Lichtquelle auf, die dazu ausgebildet und angeordnet ist, die Probe, bevor die Probe in dem einen linienförmigen Abtastbereich mit dem Schaltlicht beaufschlagt wird, an verschiedenen dritten Positionen, die in dem einen linienförmigen Abtastbereich liegen, mit einer drittes Anregungslicht umfassenden dritten Lichtintensitätsverteilung zu beaufschlagen, um die dritten Fluoreszenzmarker jeweils in einem räumlich begrenzten dritten Bereich zur Emission von drittem Fluoreszenzlicht anzuregen. Dabei unterscheiden sich eine erste Anregungswellenlänge des ersten Anregungslichts und eine dritte Anregungswellenlänge des dritten Anregungslichts. Die Detektoranordnung ist dann dazu ausgebildet und angeordnet, das dritte Fluoreszenzlicht zu registrieren und der jeweiligen dritten Position zuzuordnen. Dabei kann die Detektoranordnung verschiedene Detektoren für das erste und das dritte Fluoreszenzlicht aufweisen, um diese spektral zu unterscheiden.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laserscanningmikroskops ist eine zweite Schaltlichtquelle dazu ausgebildet und angeordnet, die Probe durch das Objektiv mit zweitem Schaltlicht einer sich von einer ersten Schaltwellenlänge des ersten Schaltlichts unterscheidenden zweiten Schaltwellenlänge zu beaufschlagen, um die ersten Fluoreszenzmarker in einen ersten fluoreszenten Zustand und die zweiten Fluoreszenzmarker in einen ersten Dunkelzustand zu schalten. Das zweite Schaltlicht hat damit eine komplementäre Funktion zu dem ersten Schaltlicht.
Die erste Zylinderlinse kann auch zum Fokussieren des zweiten Schaltlichts von der zweiten Schaltlichtquelle in den jeweiligen linienförmigen Abtastbereich dienen, oder eine zweite Zylinderlinse ist zum Fokussieren des zweiten Schaltlichts von der zweiten Schaltlichtquelle in den jeweiligen linienförmigen Abtastbereich in einer zweiten zur Rückapertur des Objektivs konjugierten Ebene angeordnet. Die erste Zylinderlinse oder die zweite Zylinderlinse kann bei dem erfindungsgemäßen Laserscanningmikroskop dazu angeordnet sein, vorübergehend in einen Strahlengang der ersten oder zweiten Lichtquelle eingeführt zu werden, um aus der ersten Lichtquelle vorübergehend die erste oder zweite Schaltlichtquelle auszubilden. Wie bereits im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ausgeführt wurde, kann die erste oder zweite Anregungswellenlänge mit der ersten oder zweiten Schaltwellenlänge übereinstimmen.
Wie ebenfalls bereits im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren angesprochen wurde, kann die Detektoranordnung einen selben Detektor für das erste und das zweite Fluoreszenzlicht aufweisen. Weiterhin können alle Lichtquellen eine selbe Fluoreszenzverhinderungslichtquelle für Fluoreszenzverhinderungslicht aufweisen. D. h. eine STED- Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laserscanningmikroskops kann einen einzigen STED- Laser als Fluoreszenzverhinderungslichtquelle für Fluoreszenzverhinderungslicht umfassen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungsbeispiele weiter erläutert und beschrieben.
Fig. 1 zeigt schematisch eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laserscanningmikroskops.
Fig. 2 erläutert eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die mit dem Laserscanningmikroskop gemäß Fig. 1 ausführbar ist.
Fig. 3 erläutert eine zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die ebenfalls mit dem Laserscanningmikroskop gemäß Fig. 1 ausführbar ist.
Fig. 4 zeigt schematisch eine zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laserscanningmikroskops und
Fig. 5 erläutert eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die mit dem Laserscanningmikroskop gemäß Fig. 4 ausführbar ist. FIGURENBESCHREIBUNG
Das in Fig. 1 nur schematisch und auch nicht vollständig, sondern mit Augenmerk auf die vorliegende Erfindung dargestellte Laserscanningmikroskop 1 weist ein Objektiv 2 auf, um Anregungslicht 12 von einer Anregungslichtquelle 3 in eine Probe 4 zu fokussieren. Die Probe 4 ist auf einem in allen drei Raumrichtungen positionierbaren Probenhalter 5 angeordnet. Zum Abtasten der Probe 4 mit dem Anregungslicht 12 ist ein zusätzlicher Scanner 6 vorgesehen. Der Scanner 6 entscannt auch aus der Probe 4 kommendes Fluoreszenzlicht 7, so dass dieses zu einem Detektor 8 gelangt, der konfokal zu dem in die Probe 4 fokussierten Anregungslicht 12 angeordnet ist. Neben der Anregungslichtquelle 3 ist als weiterer Teil einer Lichtquelle 26 eine Fluoreszenzverhinderungslichtquelle 9 für Fluoreszenzverhinderungslicht 10 vorgesehen. In dem Strahlengang des Fluoreszenzverhinderungslichts 10 ist ein Strahlformer 11 angeordnet, der dazu führt, dass das von dem Objektiv 2 zusammen mit dem Anregungslicht 12 fokussierte Fluoreszenzverhinderungslicht 10 ein von Intensitätsmaxima umgebendes Intensitätsminimum ausbildet. Die Anregungslichtquelle 3 und die Fluoreszenzverhinderungslichtquelle 9 bilden also zusammen eine Lichtquelle 26 zur Bereitstellung einer Lichtintensitätsverteilung im Fokus des Objektivs 2, die das Anregungslicht 12 mit einem zentralen Intensitätsmaximum und das Fluoreszenzverhinderungslicht 10 mit einem zentralen Intensitätsminimum umfasst. Das Fluoreszenzverhinderungslicht 10 führt dazu, dass das Fluoreszenzlicht 7, das von dem Detektor 8 registriert wird, nur aus einem zentralen Bereich der in die Probe 4 fokussierten Lichtintensitätsverteilung emittiert wird und daher der jeweiligen Position eben dieses räumlich begrenzten Bereichs in der Probe zugeordnet werden kann. Weiterhin ist eine erste Schaltlichtquelle 13 für Schaltlicht 14 vorgesehen. In dem Strahlengang des Schaltlichts 14, in einer ersten zu einer Rückapertur des Objektivs 2 konjugierten Ebene ist eine erste Zylinderlinse 15 angeordnet. Eine zweite Zylinderlinse 16 kann in einer zweiten zu einer Rückapertur des Objektivs 2 konjugierten Ebene in den Strahlengang des Anregungslichts 12 eingeführt werden, um die Anregungslichtquelle 3 als zweite Schaltlichtquelle 17 für zweites Schaltlicht 18 zu nutzen. Um die Strahlengänge in dem Laserscanningmikroskop 1 zusammenzuführen bzw. zu trennen, sind dichroitische Spiegel 19 bis 21 vorgesehen.
Die Funktion des Laserscanningmikroskops 1 wird anhand Fig. 2 und einer darin illustrierten ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erläutert. Fig. 2A zeigt schematisch, wie die Probe 4 längs eines linienförmigen Bereichs 22 oder einer Zeile mit einer Lichtintensitätsverteilung 23 aus dem Anregungslicht 12 und dem Fluoreszenzverhinderungslicht 10 abgetastet wird. Dabei nimmt die Lichtintensitätsverteilung 23 nacheinander verschiedene Positionen 24 in dem Bereich 22 ein. Zu jeder dieser Positionen 24 wird das aus der Probe 4 kommende Fluoreszenzlicht 7 mit dem Detektor 8 gemäß Fig. 1 registriert. Dieses Fluoreszenzlicht stammt von ersten Fluoreszenzmarkern in der Probe 4, die sich während des ersten Abtastens des Bereichs 22 mit der Lichtintensitätsverteilung 23 in einem fluoreszenten Zustand befinden. Fig. 2B zeigt, wie die Probe 4 als nächstes in dem gesamten linienförmigen Bereich 22 gleichzeitig mit dem ersten Schaltlicht 14 beaufschlagt wird. Dies führt dazu, dass die ersten Fluoreszenzmarker aus ihrem fluoreszenten Zustand in einen Dunkelzustand überführt werden, während zweite Fluoreszenzmarker in der Probe aus ihrem Dunkelzustand in einen fluoreszenten Zustand überführt werden.
Gemäß Fig. 2C wird die Probe in dem linienförmigen Bereich 22 erneut an den Positionen 24 mit der Lichtintensitätsverteilung 23 aus dem Anregungslicht 12 und dem Fluoreszenzverhinderungslicht 10 abgetastet. Das dabei von dem Detektor 8 gemäß Fig. 1 registrierte Fluoreszenzlicht 7 stammt jetzt von den zweiten Fluoreszenzmarkern. Fig. 2A' deutet an, dass das in den Fig. 2A bis Fig. 2C illustrierte Vorgehen als nächstes in einem anderen linienförmigen Bereich 25 durchgeführt wird. Dieser andere linienförmige Bereich 25 ist hier weiter von dem einen linienförmigen Bereich 22 entfernt, damit die darin befindlichen ersten Fluoreszenzmarker und zweiten Fluoreszenzmarker von der Beaufschlagung des linienförmigen Bereichs 22 mit dem ersten Schaltlicht 14 gemäß Fig. 2B nicht beeinflusst sind. Ein näher an dem linienförmigen Bereich 22 liegender linienförmiger Bereich 25 wird erst dann abgetastet, wenn die ersten und zweiten Fluoreszenzmarker spontan, d. h. thermisch angeregt, wieder in ihre Ursprungszustände zurückgekehrt sind, d. h. die ersten Fluoreszenzmarker in ihren fluoreszenten Zustand und die zweiten Fluoreszenzmarker in ihren Dunkelzustand.
Fig. 3 illustriert eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem auch unmittelbar benachbarte linienförmige Bereich 22 und 25 direkt nacheinander abgetastet werden können. Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird gemäß Fig. 3A der linienförmige Bereich 22 zunächst mit dem zweiten Schaltlicht 18 von der Schaltlichtquelle 17 beaufschlagt, wobei die Zylinderlinse 16 den Fokus des Schaltlichts 18 linienförmig über den Bereich 22 hinweg formt. Mit dem zweiten Schaltlicht werden aktiv die ersten Fluoreszenzmarker in ihren fluoreszenten Zustand und die zweiten Fluoreszenzmarker in ihren Dunkelzustand geschaltet. Hieran schließen sich gemäß Fig. 3B bis Fig. 3D die in den Fig. 2A bis Fig. 2C illustrierten Schritte an. Darauf folgt gemäß Fig. 3A' das Beaufschlagen des nächsten, hier direkt daneben liegenden Bereichs 25 mit dem zweiten Schaltlicht 18. Das zeitnahe Abbilden der Intensitätsverteilungen der ersten und zweiten Fluoreszenzmarker in direkt nebeneinander liegenden linienförmigen Bereichen 22 und 25 verhindert, dass sich die mit den Fluoreszenzmarkern markierten Strukturen in der Probe 4 zwischenzeitlich wesentlich verändert haben.
Konkret kann es sich bei den ersten Fluoreszenzmarkern in der Probe 4 um das schaltbare fluoreszente Protein Padron handeln, das mit zweitem Schaltlicht 18 einer zweiten Schaltlichtwellenlänge von 488 nm eingeschaltet und mit dem Anregungslicht 12 derselben Anregungswellenlänge von 488 nm zur Emission von Fluoreszenzlicht 7 einer Fluoreszenzlichtwellenlänge von 515 nm angeregt wird. Dabei wird der räumliche Bereich, aus dem das Fluoreszenzlicht stammen kann mit Fluoreszenzverhinderungslicht der Fluoreszenzverhinderungslichtwellenlänge von 595 nm durch stimulierte Emission eingeengt. Die zweiten Fluoreszenzmarker sind dabei das schaltbare fluoreszente Protein Dronpa-M159T, das von dem zweiten Schaltlicht 18 mit der Schaltlichtwellenlänge 488 nm ausgeschaltet wird. Dronpa-M159T wird mit dem ersten Schaltlicht 14 einer Schaltlichtwellenlänge von 405 nm eingeschaltet. Dieses erste Schaltlicht 14 schaltet zugleich Padron aus. Das eingeschaltete Dronpa-M159T wird mit dem Anregungslicht 12 der Anregungslichtwellenlänge 488 nm zur Emission von Fluoreszenzlicht 7 einer Fluoreszenzlichtwellenlänge von 511 nm angeregt und mit dem zweitem Schaltlicht 18 derselben Schaltlichtwellenlänge von 488 nm ausgeschaltet. Auch beim Anregen des eingeschalteten Dronpa-M159T mit dem Anregungslicht 12 wird der Bereich, aus dem das Fluoreszenzlicht 7 stammen kann, durch das Fluoreszenzverhinderungslicht 10 der Fluoreszenzverhinderungslichtwellenlänge von 595 nm räumlich eingeengt. Für das Fluoreszenzlicht 7 der Fluoreszenzlichtwellenlängen von 511 nm und 515 nm von Dronpa-M159T bzw. Padron wird derselbe Detektor 8 verwendet. Für diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weist das erfindungsgemäße Laserscanningmikroskop also nur drei Lichtquellen 3 bzw. 17, 9 und 13 sowie einen einzigen Detektor 8 auf.
Die in Fig. 4 dargestellte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laserscanningmikroskops 1 unterscheidet sich gegenüber derjenigen gemäß Fig. 1 durch die folgenden zusätzlichen Komponenten. Statt die Anregungslichtquelle 3 auch als zweite Schaltlichtquelle 17 vorzusehen, ist eine separate zweite Schaltlichtquelle 17 mit der Zylinderlinse 16 für das Schaltlicht 18 vorgesehen. Weiterhin ist neben der Anregungslichtquelle 3 für das Anregungslicht 12, die zusammen mit der Fluoreszenzverhinderungslichtquelle 9 die Lichtquelle 26 für die Lichtintensitätsverteilung 23 ausbildet, eine weitere Anregungslichtquelle 27 für weiteres Anregungslicht 28 vorhanden, die zusammen mit der Fluoreszenzverhinderungslichtquelle 9 eine weitere Lichtquelle 29 für eine weitere Lichtintensitätsverteilung ausbildet. Außerdem weist die Detektoranordnung 31 einen weiterer Detektionskanäle mit einem weiteren Detektor 30 für andere Fluoreszenzlichtwellenlängen des Fluoreszenzlichts 7 als der Detektor 8 auf. Zusätzliche dichroitische Spiegel 33 bis 35 und ein Spiegel 36 dienen zur Strahlkombination und -trennung bzw. Strahlführung. Weiterhin ist durch einen Doppelpfeil 32 angedeutet, dass der Abstand des Objektivs 32, beispielsweise mit einem Piezoaktuator schnell in z-Richtung verfahrbar ist, wodurch der als x/y-Scanner ausgebildete Scanner 6 um eine schnelle Abtastbarkeit der Probe 4 in z-Richtung erweitert ist.
Die in Fig. 5 illustrierte, mit dem Laserscanningmikroskop 1 gemäß Fig. 4 ausführbare Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beginnt gemäß Fig. 5A mit dem Beaufschlagen des linienförmigen Bereichs 22 mit dem zweiten Schaltlicht 18 von der zweiten Schaltlichtquelle 17. Dabei ist die Form des linienförmigen, den linienförmigen Bereich 22 abdeckenden Fokusbereichs angedeutet, in den das Schaltlicht 18 mit der Zylinderlinse 16 fokussiert wird. Mit dem Schaltlicht 18 werden bestimmte Fluoreszenzmarker in der Probe in ihren Dunkelzustand ausgeschaltet. Andere Fluoreszenzmarker in der Probe bleiben in ihrem fluoreszenten Zustand oder werden sogar in diesen fluoreszenten Zustand eingeschaltet. Hieran schließt sich gemäß Fig. 5B das Abtasten des linienförmigen Bereichs 22 mit der Lichtintensitätsverteilung 23 aus dem Anregungslicht 12 von der Anregungslichtquelle 3 und dem Fluoreszenzverhinderungslicht 10 von der Fluoreszenzverhinderungslichtquelle 9 an. Anschließend wird gemäß Fig. 5C derselbe linienförmige Bereich 22 erneut, jetzt aber mit der weiteren Lichtintensitätsverteilung 37 aus dem weiteren Anregungslicht 28 von der weiteren Anregungslichtquelle 27 und dem Fluoreszenzverhinderungslicht 10 von der Fluoreszenzverhinderungslichtquelle 9 abgetastet. Da sich die Anregungslichtwellenlängen des Anregungslichts 12 und des weiteren Anregungslichts 28 unterscheiden, werden bei dem Abtasten gemäß Fig. 5B und Fig. 5C unterschiedliche Fluoreszenzmarker mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften in dem linienförmigen Bereich 22 angeregt und damit abgefragt. Die unterschiedlichen spektralen Eigenschaften der Fluoreszenzmarker sind unterschiedliche Anregungsspektren und/oder Fluoreszenzemissionsspektren, so dass die Unterscheidung zwischen den unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern durch das Anregungslicht 12 bzw. 28 unterschiedlicher Anregungslichtwellenlänge und durch die Detektion des Fluoreszenzlichts 7 mit unterschiedlicher von seinem Fluoreszenzlichtspektrum abhängiger Verteilung über die Detektoren 8 und 30 bewirkt wird. In einem folgenden, in Fig. 5D illustrierten Schritt wird der linienförmige Bereich 22 mit dem Schaltlicht 14 von der Schaltlichtquelle 13 beaufschlagt, das die mit dem Schaltlicht 18 von der Schaltlichtquelle 17 ausgeschalteten Fluoreszenzmarker in der Probe 4 wieder in ihren fluoreszenten Zustand einschaltet. Zusätzlich können die in den Schritten gemäß Fig. 5B und Fig. 5C bereits abgefragten Fluoreszenzmarker in dem Bereich 22 mit dem Schaltlicht 14 ausgeschaltet werden. In Fig. 5D ist die Linienform des Fokusbereichs angedeutet, in den das Schaltlicht 14 mit der Zylinderlinse 15 fokussiert wird. Fig. 5E illustriert einen folgenden Schritt, in dem der linienförmige Bereich 22 erneut mit derselben Lichtintensitätsverteilung 23 aus dem Anregungslicht 12 und dem Fluoreszenzverhinderungslicht 10 wie in Fig. 5B abgetastet wird, diesmal aber, um die während des Abtastens gemäß Fig. 5B ausgeschalteten und jetzt wieder mit dem Schaltlicht 14 eingeschalteten Fluoreszenzmarker abzufragen. Wenn dabei die in den Schritten gemäß Fig. 5B eingeschalteten Fluoreszenzmarker weiterhin eingeschaltet sind, sind die zu denselben Positionen mit den Detektoren 8 und 30 registrierten Intensitäten des Fluoreszenzlichts 7 von den in dem Schritt gemäß Fig. 5E registrierten Intensitäten des Fluoreszenzlichts 7 abzuziehen. Die Schritte gemäß den Fig. 5A bis Fig. 5E werden dann für den nächsten linienförmigen Bereich 25 wiederholt, der hier ein dem linienförmigen Bereich 22 direkt benachbarter linienförmiger Bereich 25 ist. Der Beginn dieser Wiederholung ist in Fig. 5A' dargestellt.
Konkret kann eine interessierende Struktur der Probe 4 für das in Fig. 5 illustrierte Verfahren mit EGFP als die in dem Schritt gemäß Fig. 5B abgefragten Fluoreszenzmarker, Citrine als die in dem Schritt gemäß Fig. 5C abgefragten Fluoreszenzmarker und rsEGFP2 als die in dem Schritt gemäß Fig. 5E abgefragten schaltbaren Fluoreszenzmarker markiert sein. Dabei weist das Schaltlicht 18 eine Wellenlänge von 488 nm auf, um das reversibel schaltbare fluoreszente Protein rsEGFP2 in seinen Dunkelzustand auszuschalten. In dem Schritt gemäß Fig. 5B weist das Anregungslicht 12 ebenso wie in dem Schritt gemäß Fig. 5E die Anregungslichtwellenlänge von 483 nm auf. Das weitere Anregungslicht 28 in dem Schritt gemäß Fig. 5C weist eine weitere Anregungslichtwellenlänge von 520 nm auf. Das Fluoreszenzverhinderungslicht 10 hat in allen Schritten die Fluoreszenzverhinderungswellenlänge von 595 nm. In dem Schritt gemäß Fig. 5B detektiert der Detektor 8 das Fluoreszenzlicht 7 von dem EGFP in einem Detektionswellenlängenbereich von 500 bis 515 nm. Diese Detektion ist im Wesentlichen selektiv, da von dem Anregungslicht 12 mit der Wellenlänge von 483 nm das Citrine nur wenig angeregt wird und weil Citrine in dem Detektionswellenlängenbereich zwischen 500 und 515 nm kaum Fluoreszenzlicht 7 emittiert. Auch die Detektion des Fluoreszenzlichts 7 von dem Citrine in dem Schritt gemäß Fig. 5C erfolgt mit dem Detektor 30 selektiv in einem weiteren Detektionswellenlängenbereich von 520 bis 555 nm. In diesem Detektionswellenlängenbereich emittiert das EGFP zwar ein wenig. Mit dem weiteren Anregungslicht 28 der Anregungslichtwellenlänge von 520 nm wird das EGFP aber nicht in relevantem Umfang angeregt. In dem Schritt gemäß Fig. 5E wird mit dem Anregungslicht 12 neben dem jetzt eingeschalteten rsEGFP2 auch das weiterhin fluoreszente EGFP angeregt. Entsprechend ist von dem Fluoreszenzlicht 7, das an jeder Position 24 in dem Schritt gemäß Fig. 5E detektiert wird, das in dem Schritt gemäß Fig. 5B an derselben Position 24 detektierte Fluoreszenzlicht 7 abzuziehen, um den auf das rsEGFP2 zurückgehenden Anteil des Fluoreszenzlichts 7 zu bestimmen. Sowohl in dem Schritt gemäß Fig. 5E als auch in den Schritten gemäß Fig. 5B und Fig. 5C können jeweils beide Detektoren 8 und 30 aktiv sein, um aus den dabei registrierten relativen Intensitäten des Fluoreszenzlichts 7 in den beiden Detektions- Wellenlängenbereichen weitere Rückschlüsse auf die Verteilung der verschiedenen Fluoreszenzmarker in der Probe zu ziehen.
BEZUGSZEICHENLISTE
Laserscanningmikroskop
Objektiv
Anregungslichtquelle
Probe
Probenhalter
Scanner
Fluoreszenzlicht
Detektor
Fluoreszenzverhinderungslichtquelle
Fluoreszenzverhinderungslicht
Strahlformer
Anregungslicht
Schaltlichtquelle
Schaltlicht
Zylinderlinse
(zweite) Zylinderlinse
(zweite) Schaltlichtquelle
(zweites) Schaltlicht dichroitischer Spiegel dichroitischer Spiegel dichroitischer Spiegel linienförmiger Bereich
Lichtintensitätsverteilung
Position nächster linienförmiger Bereich
Lichtquelle
(weitere/dritte) Anregungslichtquelle
(weiteres/drittes) Anregungslicht
(weitere/drittes) Lichtquelle
(weiterer) Detektor
Detektoranordnung
Doppelpfeil dichroitischer Spiegel dichroitischer Spiegel dichroitischer Spiegel Spiegel (weitere) Lichtintensitätsverteilung

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1 . Verfahren zum Abbilden einer mit ersten Fluoreszenzmarkern und schaltbaren zweiten Fluoreszenzmarkern markierten Struktur einer Probe (4), wobei die Probe (4) an verschiedenen ersten Positionen (24) mit einer erstes Anregungslicht (12) umfassenden ersten Lichtintensitätsverteilung (23) beaufschlagt wird, um die ersten Fluoreszenzmarker jeweils in einem räumlich begrenzten ersten Bereich zur Emission von erstem Fluoreszenzlicht (7) anzuregen, wobei das erste Fluoreszenzlicht (7) registriert und der jeweiligen ersten Position (24) zugeordnet wird, wobei die Probe (4) mit erstem Schaltlicht (14) beaufschlagt wird, um die zweiten Fluoreszenzmarker aus einem zweiten Dunkelzustand in einen zweiten fluoreszenten Zustand zu schalten, und wobei die Probe (4) an verschiedenen zweiten Positionen (24) mit einer zweites Anregungslicht (12) umfassenden zweiten Lichtintensitätsverteilung (23) beaufschlagt wird, um die zweiten Fluoreszenzmarker in dem zweiten fluoreszenten Zustand jeweils in einem räumlich begrenzten zweiten Bereich zur Emission von zweitem Fluoreszenzlicht (7) anzuregen, wobei das zweite Fluoreszenzlicht (7) registriert und der jeweiligen zweiten Position (24) zugeordnet wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (4) an den verschiedenen ersten Positionen (24) in einem Abtastbereich (22) von mehreren nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereichen (22, 25) mit der ersten Lichtintensitätsverteilung (23) beaufschlagt wird, in dem gesamten einen linienförmigen Abtastbereich (22) zumindest quasi gleichzeitig mit dem ersten Schaltlicht (14) beaufschlagt wird und an den verschiedenen zweiten Positionen (24) in dem einen linienförmigen Abtastbereich (22) mit der zweiten Lichtintensitätsverteilung (23) beaufschlagt wird, bevor die Probe (4) in einem nächsten Abtastbereich (25) der nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereiche (22, 25) mit der ersten Lichtintensitätsverteilung (23) beaufschlagt wird. 2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (4) in dem jeweiligen linienförmigen Abtastbereich (22, 25) durch eine erste Zylinderlinse (15) hindurch mit dem ersten Schaltlicht (14) beaufschlagt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Probe (4) mit dritten Fluoreszenzmarkern markiert ist und wobei sich die ersten Fluoreszenzmarker, die zweiten Fluoreszenzmarker und die dritten Fluoreszenzmarker in ihren Anregungs- und Emissionsspektren unterscheiden, dadurch gekennzeichnet, dass, bevor die Probe (4) in dem gesamten einen linienförmigen Abtastbereich (22) zumindest quasi gleichzeitig mit dem ersten Schaltlicht (14) beaufschlagt wird, die Probe (4) an verschiedenen dritten Positionen (24) in dem einen linienförmigen Abtastbereich (22) mit einer drittes Anregungslicht (28) umfassenden dritten Lichtintensitätsverteilung (37) beaufschlagt wird, um die dritten Fluoreszenzmarker jeweils in einem räumlich begrenzten dritten Bereich zur Emission von drittem Fluoreszenzlicht (7) anzuregen, wobei sich eine erste Anregungswelle des ersten Anregungslichts (12) und eine dritte Anregungswelle des dritten Anregungslichts (28) unterscheiden und wobei das dritte Fluoreszenzlicht (7) registriert und der jeweiligen dritten Position (24) zugeordnet wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die ersten Fluoreszenzmarker ebenfalls schaltbar sind, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (4) mit dem ersten Schaltlicht (14) beaufschlagt wird, um die ersten Fluoreszenzmarker aus einem ersten fluoreszenten Zustand in einen ersten Dunkelzustand zu schalten, und dass, bevor die Probe (4) in dem nächsten der nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereiche (22, 25) mit der ersten Lichtintensitätsverteilung (23) beaufschlagt wird, die Probe (4) in dem gesamten nächsten linienförmigen Abtastbereich (25) zumindest quasi gleichzeitig mit zweitem Schaltlicht (18) einer sich von einer ersten Schaltwellenlänge des ersten Schaltlichts (14) unterscheidenden zweiten Schaltwellenlänge beaufschlagt wird, um die ersten Fluoreszenzmarker in den ersten fluoreszenten Zustand und die zweiten Fluoreszenzmarker in den zweiten Dunkelzustand zu schalten, wobei die Probe (4) in dem jeweiligen nächsten linienförmigen Abtastbereich vorzugsweise durch die erste oder eine zweite Zylinderlinse (15, 16) hindurch mit dem zweiten Schaltlicht (18) beaufschlagt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erste und das zweite Fluoreszenzlicht (7) unter Verwendung eines selben Detektors (8) registriert werden und/oder dass das erste und das zweite Anregungslicht (12) eine gleiche Anregungswellenlänge aufweisen und/oder dass die Lichtintensitätsverteilungen (23, 37) jeweils eine Teillichtintensitätsverteilung von Fluoreszenzverhinderungslicht (10) aufweisen, wobei das Fluoreszenzverhinderungslicht (10) bei allen Lichtintensitätsverteilungen (23, 37) eine gleiche Fluoreszenzverhinderungswellenlänge aufweist und/oder dass die erste und die zweite Lichtintensitätsverteilung (23) übereinstimmen und/oder dass das die erste Schaltwellenlänge gleich der ersten und/oder der zweiten Anregungswellenlänge ist und/oder dass die Positionen (24) aller Lichtintensitätsverteilungen (23, 37) in dem jeweiligen linienförmigen Abtastbereich (22, 25) übereinstimmen.
6. Laserscanningmikroskop (1) zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einem Objektiv (2), einem Scanner (6), einer ersten Lichtquelle (26), die dazu ausgebildet und angeordnet ist, die Probe (4) durch das Objektiv (2) mittels des Scanners (6) an verschiedenen ersten Positionen (24) mit einer erstes Anregungslicht (12) umfassenden ersten Lichtintensitätsverteilung (23) zu beaufschlagen, um die ersten Fluoreszenzmarker jeweils in einem räumlich begrenzten ersten Bereich zur Emission von erstem Fluoreszenzlicht (7) anzuregen, und einer ersten Schaltlichtquelle (13), die dazu ausgebildet und angeordnet ist, die Probe (4) durch das Objektiv (2) mit erstem Schaltlicht (14) zu beaufschlagen, um die zweiten Fluoreszenzmarker aus einem zweiten Dunkelzustand in einen zweiten fluoreszenten Zustand zu schalten, wobei die erste oder eine zweite Lichtquelle (26) dazu ausgebildet und angeordnet ist, die Probe (4) durch das Objektiv (2) mittels des Scanners (6) an verschiedenen zweiten Positionen - 22 -
(24) mit einer zweites Anregungslicht (12) umfassenden zweiten Lichtintensitätsverteilung (23) zu beaufschlagen, um die zweiten Fluoreszenzmarker in dem zweiten fluoreszenten Zustand jeweils in einem räumlich begrenzten zweiten Bereich zur Emission von zweitem Fluoreszenzlicht (7) anzuregen, und mit einer Detektoranordnung (31), die dazu ausgebildet und angeordnet ist, das erste und das zweite Fluoreszenzlicht (7) zu registrieren und der jeweiligen ersten oder zweiten Position (24) zuzuordnen, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle(n) (26) und die erste Schaltlichtquelle (13) dazu ausgebildet und angeordnet sind, die Probe (4) an den verschiedenen ersten Positionen (24) in einem Abtastbereich (22) von mehreren nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereichen (22, 25) mit der ersten Lichtintensitätsverteilung (23) zu beaufschlagen, durch das Objektiv (2) mittels des Scanners (6) in dem gesamten einen linienförmigen Abtastbereich (22) zumindest quasi gleichzeitig mit dem ersten Schaltlicht (14) zu beaufschlagen, und an den verschiedenen zweiten Positionen (24) in dem einen linienförmigen Abtastbereich (22) mit der zweiten Lichtintensitätsverteilung (23) zu beaufschlagen, bevor die erste Lichtquelle (26) die Probe (4) durch das Objektiv (2) mittels des Scanners (6) an den verschiedenen ersten Positionen (24) in einem nächsten Abtastbereich (25) der nebeneinander liegenden linienförmigen Abtastbereiche (22, 25) mit der ersten Lichtintensitätsverteilung (23) beaufschlagt, wobei vorzugsweise eine erste Zylinderlinse zum Fokussieren des ersten Schaltlichts (14) von der ersten Schaltlichtquelle (13) in den jeweiligen linienförmigen Abtastbereich (22, 25) in einer ersten zur Rückapertur des Objektivs (2) konjugierten Ebene angeordnet ist.
7. Laserscanningmikroskop (1) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine dritte Lichtquelle (29) dazu ausgebildet und angeordnet ist, die Probe (4), bevor die Probe (4) in dem einen linienförmigen Abtastbereich (22) mit dem ersten Schaltlicht (14) beaufschlagt wird, an verschiedenen dritten Positionen (24) in dem einen linienförmigen Abtastbereich (22) mit einer drittes Anregungslicht (28) umfassenden dritten Lichtintensitätsverteilung (37) zu beaufschlagen, um die dritten Fluoreszenzmarker jeweils in einem räumlich begrenzten dritten Bereich zur Emission von drittem Fluoreszenzlicht (7) anzuregen, wobei sich eine erste Anregungswellenlänge des ersten Anregungslichts (12) und eine dritte Anregungswellenlänge des dritten Anregungslichts (28) unterscheiden und wobei die Detektoranordnung (31) dazu ausgebildet und - 23 - angeordnet ist, das dritte Fluoreszenzlicht (7) zu registrieren und der jeweiligen dritten Position (24) zuzuordnen, wobei die Detektoranordnung (31) vorzugsweise verschiedene Detektoren (8, 30) für das erste und das dritte Fluoreszenzlicht (7) aufweist.
8. Laserscanningmikroskop (1) nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweite Schaltlichtquelle (18) dazu ausgebildet und angeordnet ist, die Probe (4) durch das Objektiv (2) mit zweitem Schaltlicht (18) einer sich von einer ersten Schaltwellenlänge des ersten Schaltlichts (14) unterscheidenden zweiten Schaltwellenlänge zu beaufschlagen, um die ersten Fluoreszenzmarker in einen ersten fluoreszenten Zustand und die zweiten Fluoreszenzmarker in einen ersten Dunkelzustand zu schalten, wobei vorzugsweise die erste Zylinderlinse (15) auch zum Fokussieren des zweiten Schaltlichts (18) von der zweiten Schaltlichtquelle (17) in den jeweiligen linienförmigen Abtastbereich (22, 25) dient oder eine zweite Zylinderlinse (16) zum Fokussieren des zweiten Schaltlichts (18) von der zweiten Schaltlichtquelle (17) in den jeweiligen linienförmigen Abtastbereich (22, 25) in einer zweiten zur Rückapertur des Objektivs (2) konjugierten Ebene angeordnet ist.
9. Laserscanningmikroskop (1) nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die erste oder zweite Zylinderlinse (15, 16) dazu angeordnet ist, vorübergehend in einen Strahlengang der ersten oder zweiten Lichtquelle (26) eingeführt zu werden, um aus der ersten Lichtquelle (26) vorübergehend die erste oder zweite Schaltlichtquelle (13, 17) auszubilden.
10. Laserscanningmikroskop (1) nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektoranordnung (31) einen selben Detektor (8) für das erste und das zweite Fluoreszenzlicht (7) aufweist und/oder dass alle Lichtquellen (26, 29) eine selbe Fluoreszenzverhinderungslichtquelle (9) für Fluoreszenzverhinderungslicht (10) aufweisen.
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