WO2022102687A1 - がん治療剤 - Google Patents

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WO2022102687A1
WO2022102687A1 PCT/JP2021/041444 JP2021041444W WO2022102687A1 WO 2022102687 A1 WO2022102687 A1 WO 2022102687A1 JP 2021041444 W JP2021041444 W JP 2021041444W WO 2022102687 A1 WO2022102687 A1 WO 2022102687A1
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WO
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cancer
lat1
tumor
therapeutic agent
inhibitor
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PCT/JP2021/041444
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English (en)
French (fr)
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好克 金井
隆一 大垣
仁 遠藤
登紀子 鈴木
Original Assignee
ジェイファーマ株式会社
国立大学法人大阪大学
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Publication date
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A61K31/423—Oxazoles condensed with carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a cancer therapeutic agent using an L-type amino acid transporter 1 (LAT1) inhibitor.
  • LAT1 L-type amino acid transporter 1
  • Therapeutic intervention for tumor angiogenesis is one of the rational strategies for anticancer treatment.
  • Various agents have been developed to target angiogenesis signaling pathways in endothelial cells, including neutralizing antibodies and decoy receptors for angiogenesis-promoting factors, as well as antibodies and inhibitors against receptor tyrosine kinase (RTK). rice field.
  • RTK receptor tyrosine kinase
  • Bevacizumab and ramucirumab are known as anticancer agents due to the effect of inhibiting angiogenesis (VEGF inhibition). Since these VEGF inhibitors also inhibit angiogenesis in normal tissues, side effects of the circulatory system such as gastrointestinal bleeding, gastrointestinal perforation, and arterial thromboembolism occur. That is, it clearly shows that inhibition of specific angiogenesis-promoting signaling pathways themselves in endothelial cells is not sufficient to control aberrant angiogenesis activity in tumors.
  • Tumor angiogenesis is considered a rational anticancer target.
  • efficacy and indications of anti-angiogenic therapy in clinical practice are relatively limited. Therefore, it is still required to clarify the distinctive features of the tumor endothelium that are important for pathological angiogenesis.
  • LAT1 forms a heterodimer complex with its coprotein 4F2hc and preferentially transports most essential amino acids [3, 4].
  • LAT1 is known to be upregulated in a wide range of primary tumors and metastatic lesions of tissue / organ origin in more than 20 [5-7]. Furthermore, the correlation between LAT1 expression and poor prognosis was triple-negative breast cancer [8], hyperproliferative ER-positive subtype breast cancer [9], bladder cancer [10], lung adenocarcinoma [11], and lung. It has been shown in a variety of tumors, including neuroendocrine tumors [12], pancreatic adenocarcinomas [13, 14], and biliary tract cancers [15]. Therefore, LAT1 in cancer cells is recognized as a new molecular target for antitumor therapy. Several LAT1 selective inhibitors have been synthesized, including JPH203, which showed significant antitumor effects in preclinical animal models [16-18].
  • An object of the present invention is to provide a highly effective therapeutic agent for cancer without side effects.
  • the purpose is to define the function of blood vessels and endothelial markers, and to establish a synergistic effect between intratumoral vascular control and tumor immunoregulation.
  • the present invention is an immune checkpoint inhibitor by suppressing the intracellular transport of amino acids mediated by LAT1 expressed in abnormal intratumoral vascular endothelial cells, including an L-type amino acid transporter 1 inhibitor (LAT1 inhibitor).
  • LAT1 inhibitor L-type amino acid transporter 1 inhibitor
  • a therapeutic agent for cancer which increases the response and suppresses the growth and / or metastasis of cancer cells.
  • the present invention also provides a tumor angiogenesis inhibitor, including a LAT1 inhibitor.
  • the LAT1 inhibitor of the present invention also acts as a drug for increasing the efficacy of the immune checkpoint inhibitor.
  • LAT1 / CD34 coexists in new blood vessels at the tumor site in human pancreatic cancer tissue, but LAT1 mRNA is stimulated by VEGF-A, FGF-2, and VEGF-A / FGF-2 in vascular endothelial cells (HUVEC).
  • LAT1 inhibitor especially JPH203, which will be described later, suppresses angiogenesis by aortic ring assay and plug assay with Matrigel, and in MIA PaCa-2 transplanted mice, tumor growth and intratumoral angiogenesis are caused by JPH203. It was strongly suppressed.
  • the analysis of the suppression mechanism of the angiogenesis-inducing signal by JPH203 in HUVEC revealed the following.
  • the amino acid signal mediated by LAT1 monitors the amino acid supply and allows the angiogenesis-inducing signal to pass through mTORC1 via the angiogenesis growth factor receptor (“gatting” control).
  • JPH203 suppresses amino acid uptake via LAT1 and suppresses mTORC1 activation, acts more predominantly than mTORC1 activation by angiogenesis-promoting factors, and blocks even if stimulation from angiogenesis growth factors enters mTORC1. It turns out that it will end up.
  • a LAT1 inhibitor represented by JPH203 inhibits LAT1 expressed in HUVEC and inhibits HUVEC angiogenesis.
  • the characteristics of normal blood vessels include the following. -Blood flow is stasis and flows smoothly without coagulation.-CD34 is expressed on endothelial cells, but LAT1 is not.
  • the characteristics of the blood vessel-like structures that are abundant in the tumor include the following.
  • ⁇ LAT1 is expressed and abnormalities such as tortuosity, dilation, obstruction, intravascular angiogenesis, excessive vascular branching, and sprouting are observed.
  • ⁇ Suppression of delivery of anticancer drugs, hypoxia, chromosomal instability, gene mutation invitation, etc. are observed.
  • ⁇ The lining of endothelial cells by pericite is reduced, the binding between endothelial cells is reduced, and the structure of perforated blood vessel walls is markedly changed.
  • the present invention uses LAT1 as a drug that selectively acts on the blood vessels of cancer cells by utilizing the difference in vascular structure between normal tissues and tumors, that is, focusing on the presence or absence of LAT1 expression. It is related to a therapeutic agent for cancer that has been present.
  • the therapeutic agent for cancer of the present invention contains a LAT1 inhibitor as an active ingredient.
  • LAT1 inhibitor used in the present invention both non-competitive inhibitors and competitive inhibitors can be used.
  • non-competitive inhibitor examples include those described in WO2014 / 112646.
  • Examples of the competitive inhibitor include those described in WO2008 / 081537, and in particular, O- (5-amino-2-phenylbenzoxazole-7-yl) methyl-3,5-dichloro-L-tyrosine (hereinafter referred to as “tyrosine”). , "JPH203”) is preferable.
  • the cancers targeted by the cancer therapeutic agent of the present invention include colon cancer, rectal cancer, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, cervical cancer, breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer, and biliary tract cancer.
  • lung cancer and pancreatic cancer are recommended.
  • the therapeutic agent for cancer of the present invention inhibits L-type amino acid transporter 1 (LAT1), but LAT1 is rarely present in normal cells (although it is found in bone marrow, blood-brain barrier, placenta, etc.). It is an order of magnitude lower than the expression level of cancer tissue, and no impairment of normal function was observed in the clinical study of JPH203), and it is expressed in tumor-related vascular endothelial cells of cancer. Does not affect normal cells in patients treated with.
  • the inhibitory effect of JPH203 is unique to LAT1 inhibition and clearly distinguishes the mechanism of action of LAT1 inhibitors from the mechanism of action of existing anti-angiogenic agents.
  • the therapeutic agent for cancer of the present invention makes it possible to construct an environment in which an immune checkpoint inhibitor that promotes the recovery of tumor immunity can respond, and as a drug for increasing the efficacy of the immune checkpoint inhibitor. Also works.
  • the LAT1 inhibitor represented by JPH203 was found in the blood and in the blood as compared with the blood JPH203 concentration among the subjects to whom the same dose was administered per body surface area, based on the results of pharmacokinetic parameter analysis obtained in clinical trials. It has been found that there are large individual differences in the concentration of N-acetylated substances in urine, and that there is a relationship between the difference in acetylation rate in the gene polymorphism of NAT2 and the safety and efficacy of JPH203. It has been found by the present inventor (PCT / JP2020 / 032828).
  • Non-Rapid type NAT2 gene is an intermediate type among the three phenotypes of the NAT2 gene having a fast acetylation rate (Rapid), an intermediate type (Intermediate), and a slow type (Slow). (Intermediate), and slow type (Slow) phenotypes.
  • the combination of mutant haplotype heterozygotes has been identified as a slow acetylation type (Slow) (Pharmacogenomics, Vol. 13, pp. 31-41, 2012).
  • the "NAT2 * 4" allele means a haplotype without SNP.
  • the Rapid type includes "NAT2 * 11, NAT2 * 12, NAT2 * 13" that do not cause amino acid mutations, in addition to "NAT2 * 4". Patients with it are also classified as Rapid type.
  • the phenotype of the NAT2 acetylating factor inferred by the two SNPs is determined by the analysis of the two SNPs: rs1041983 (282C> T) and rs1801280 (341T> C).
  • the NAT2 acetylating factor phenotype inferred by the three SNPs is determined by analysis of the three SNPs: rs17929929 (481C> T), rs179939 (590G> A) and rs1799931 (857G> A).
  • the four SNP-estimated NAT2 acetylator phenotypes are determined by analysis of the four SNPs: rs1801279 (191G> A), rs1801280 (341T> C), rs17999930 (590G> A), and rs1799931 (857G> A).
  • JPH203 which is a LAT1 inhibitor
  • NAT2 acetylated by NAT2
  • its inhibitory activity on cancer cells decreases.
  • the patient predominantly has a NAT2 genotype that is less susceptible to acetylation, i.e., in the NAT2 gene of a patient such as cancer, an intermediate type and a slow type of acetylation rate (Intermediate).
  • the acetylation rate of JPH203 is slowed down, so that acetylation is difficult and the activity of JPH203 continues for a long time.
  • the analysis of NAT2 gene polymorphism can be performed by a conventionally known method. For example, it can be performed by extracting DNA from the blood of a subject, processing the DNA by the microarray method, then reading the genotype and performing a test, and then performing data analysis.
  • the therapeutic agent for cancer of the present invention can be administered to a subject suffering from cancer by the following administration regimen in combination with the measurement of NAT2 gene polymorphism.
  • the subject having the Non-Rapid (Slow and / or Intermediate) type NAT2 gene is identified and selected; (2) The pharmaceutical composition is administered to the subject identified as having the Non-Rapid (Slow and / or Intermediate) type NAT2 gene.
  • the therapeutic agent for cancer of the present invention can be used in combination with a NAT2 inhibitor for the treatment of diseases such as cancer.
  • NAT2 inhibitors include acetaminophen.
  • JPH203 is rapidly N-acetylated by NAT2 in the liver cytosol to become Nac-JPH203, but it is known that Nac-JPH203 has lower selectivity and activity for LAT1 than JPH203.
  • the combined use with a NAT2 inhibitor suppresses the acetylation of JPH203 and maintains the effect of JPH203.
  • the therapeutic agent for cancer of the present invention is used as a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition comprises a LAT1 inhibitor or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • pharmaceutical additives may be included if necessary.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be orally administered in the form of a solid preparation such as a tablet, a granule, a fine granule, a powder, a capsule, or a liquid, a jelly, a syrup, or the like.
  • the physical drug may be administered parenterally in the form of an injection (intravascular, subcutaneous, intratumoral, etc.), a nasal agent, a suppository, an inhalant, a transdermal agent, or the like.
  • the therapeutic agent for cancer of the present invention is preferably in the form of an injection or an oral preparation such as the solid preparation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used as a therapeutic agent for cancer, it is preferably formulated as an injection.
  • injections include those containing a pH adjuster and cyclodextrins in the active ingredient of the present invention.
  • injections include intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular injections, and intravenous drip infusions.
  • Examples of the pH adjuster that can be blended in the injection of the present invention include alkali metal hydroxides such as sodium carbonate, potassium carbonate, sodium hydroxide and potassium hydroxide, sodium hydride and potassium hydride.
  • alkali metal hydroxides such as sodium carbonate, potassium carbonate, sodium hydroxide and potassium hydroxide, sodium hydride and potassium hydride.
  • Examples thereof include alkali metal hydrides, alkali metals or alkali earth metal carbonates, and sodium hydroxide and sodium carbonate are particularly preferable, and sodium hydroxide is more preferable.
  • the injection can be appropriately adjusted to an appropriate pH by using a pH adjusting agent.
  • the pH of the injection according to this embodiment is preferably 3 to 6, more preferably 3 to 5, further preferably 3 to 4.5, and 3.5 to 4.5. It is particularly preferable to have.
  • unmodified cyclodextrin examples include ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin and the like.
  • modified cyclodextrin for example, dimethyl- ⁇ -cyclodextrin, dimethyl- ⁇ -cyclodextrin, dimethyl- ⁇ -cyclodextrin, hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, hydroxypropyl- ⁇ - Cyclodextrin, sulfobutyl ether- ⁇ -cyclodextrin, sulfobutyl ether- ⁇ -cyclodextrin, sulfobutyl ether- ⁇ -cyclodextrin, maltosyl- ⁇ -cyclodextrin and the like can be mentioned.
  • Cyclodextrins may be used alone or in any combination of two or more. Cyclodextrins are hydroxypropyl- ⁇ from the viewpoint of reducing the number of insoluble fine particles formed even when dissolved in a non-strongly acidic aqueous solution and improving the resolubility of the lyophilized preparation in a non-strongly acidic aqueous solution. -Cyclodextrin or sulfobutyl ether- ⁇ -cyclodextrin is preferable, and sulfobutyl ether- ⁇ -cyclodextrin is more preferable.
  • the sulfobutyl ether cyclodextrin has the structure shown in the following formula 1, and the inside of the cyclic structure is highly hydrophobic. Therefore, it forms a complex with O- (5-amino-2-phenylbenzoxazole-7-yl) methyl-3,5-dichloro-L-tyrosine, which is also highly hydrophobic, by hydrophobic interaction.
  • the reference to "sulfobutyl ether cyclodextrin complex" in the present specification refers to the above-mentioned hydrophobic interaction.
  • JPH203 when used as a LAT1 inhibitor, it may be used in an injection as its sulfobutyl ether / cyclodextrin complex (hereinafter referred to as “JPH203-SBECD”).
  • a buffering agent a suspending agent, a solubilizing agent, a stabilizer, an tonicity agent, a preservative and the like may be added to the injection according to the present invention, if necessary.
  • buffer examples include borate buffer, phosphate buffer, citric acid buffer, acetate buffer, Tris buffer and the like.
  • suspending agent examples include methyl cellulose, polysorbate 80, hydroxyethyl cellulose, gum arabic, tragant powder, sodium carboxymethyl cellulose, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, poloxamer, hydroxypropylmethyl cellulose (HPMC), sodium alginate and the like. Can be mentioned.
  • solubilizing agent examples include polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polysorbate 80, nicotinic acid amide, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, macrogol, glycerin fatty acid ester, lipoaminoacid, polyethylene glycol and the like.
  • examples of the stabilizer include sodium sulfite and sodium metasulfite
  • examples of the tonicity agent include glycerin and sodium chloride
  • preservatives include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, and sorbin. Examples include acid.
  • the pH of the lyophilized preparation when dissolved in water is preferably 3 to 6, more preferably 3 to 5, further preferably 3 to 4.5, and 3.5 to 4 It is particularly preferable to be .5.
  • the freeze-dried preparation can be produced by a conventionally known method for producing a freeze-dried preparation. For example, after freezing at a temperature of ⁇ 25 ° C. or lower, the temperature rises until the temperature reaches room temperature while maintaining the vacuum degree at about 20 Pa or lower. Examples thereof include a method of drying while warming.
  • the injection according to the present invention may be a lyophilized preparation. Such a lyophilized preparation can be used as a time-dissolving injection by dissolving it in, for example, distilled water for injection, an infusion solution, one of the electrolytic solutions, or two or more kinds of solvents thereof at the time of use.
  • Dosing regimens The medication regimens to which the therapeutic agents of the present invention are applied are patient type, race, age, weight, gender and medical condition; severity of condition to be treated; route of administration; and patient's liver. And it is selected according to various factors including renal function. Physicians can easily determine and prescribe the effective amount of drug needed to prevent, prevent or stop the progression of the condition.
  • the dose of the active ingredient of the pharmaceutical composition may be appropriately selected according to the degree of symptoms, age, sex, body weight, sensitivity difference, administration time, administration interval, etc. of the patient.
  • 1 mg / m 2 to 60 mg / m 2 (body surface area) is exemplified once, preferably 12.5 mg / m 2 to 60 mg / m 2 , 12.5 mg. / M 2 to 25 mg / m 2 or 10 mg / m 2 to 40 mg / m 2 (body surface area) is exemplified, and 25 mg / m 2 is particularly recommended.
  • the dose may be reduced to 12.5 mg / m 2 or the like depending on the symptoms.
  • the pharmaceutical composition is administered with a certain period of drug holiday following continuous administration for a certain period as one cycle.
  • the pharmaceutical composition is administered with a total of 14 days of 9 days of drug holiday following 5 consecutive days of continuous administration as one cycle.
  • -A certain amount of the pharmaceutical composition is continuously administered intravenously over a certain period of time.
  • -100 mL of pharmaceutical composition is administered intravenously over 90 minutes.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention can be used in combination with other anticancer agents.
  • an anticancer agent conventionally known ones can be used, for example, an alkylating agent, a metabolic antagonist, an antibiotic, a plant-derived anticancer agent, a platinum coordination compound, a camptothecin derivative, and a tyrosine kinase inhibitor. , Serins leonine kinase, phospholipid kinase, interferon, hormone preparations, immune checkpoint inhibitors, protein post-translation modification inhibitors and other antitumor agents.
  • the therapeutic agent for cancer of the present invention also acts as a drug for increasing the efficacy of the immune checkpoint inhibitor, it is recommended to use it in combination with the immune checkpoint inhibitor.
  • cancer therapeutic agent of the present invention may be used in combination with a NAT2 inhibitor such as acetaminophen, an antiangiogenic agent, for example, bemasizumab, ramucirumab, aflibercept and the like.
  • a NAT2 inhibitor such as acetaminophen
  • an antiangiogenic agent for example, bemasizumab, ramucirumab, aflibercept and the like.
  • the GST fusion recombinant protein of antibody-producing mouse LAT1 N-terminal 53 amino acids was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and purified by glutathione Sepharose 4B (GE Healthcare) affinity column chromatography.
  • Chickens (White Leghorn) were immunized with purified recombinant protein by intramuscular injection (initial injection with 200 ⁇ g mixed with Freund's complete adjuvant, 100 ⁇ g mixed with incomplete Freund and 4 additional injections at 2-week intervals).
  • antisera are collected and passed through a GST-bound Affi-Gel 10 column (Bio-Rad) for absorption of anti-GST antibody, followed by purification by antigen-bound Affi-Gel 10 column chromatography.
  • anti-mLAT1 (C) was obtained.
  • Human umbilical vein endothelial cells Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC, Corning) are 37 ° C. in EGM-2 medium (Lonza) containing 2% FBS and growth factors (VEGF-A, FGF-2, EGF, IGF-1). It was cultured in 5% CO 2 /95% air. Experiments were performed using cells with less than 9 passages.
  • RNAi HUVEC Gene knockdown by RNAi HUVEC was seeded on a 6 cm dish coated with collagen (0.7-1.0 ⁇ 10 4 cells / dish). The next day, LAT1 # 1 (s15653), # 2 (s15654), # 3 (s15655), or negative control # 2 (Ambion) Silencer Select siRNA was transfected using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Cells were used in the experiment 2 days after transfection.
  • HUVEC was seeded on collagen-coated 96-well plates (1.0 ⁇ 10 3 cells / well) in EGM-2 medium.
  • BCH 2-Aminobicyclo [2.2.1] heptane-2-carboxylic acid
  • JPH203 was added the next day (day 0).
  • LAT1 knockdown cells were seeded 48 hours after siRNA transfection (day 0). Cell proliferation was measured every 24 hours for 3 days with the CCK-8 kit (Dojindo).
  • Human pancreatic cancer MIA PaCa-2 cells (JCRB0070, JCRB) and lung cancer H520 cells (HTB-182, ATCC) have 10% FBS (Gibco) and 100 units / mL penicillin-100 ⁇ g. It was grown in DMEM (SIGMA-Aldrich) supplemented with / mL streptomycin (Nakalitesk). Prior to inoculation, cells were suspended in filtered PBS and mixed with growth factor reduced matrigel in a 1: 1 volume ratio to a final concentration of 2.5 ⁇ 107 cells / mL.
  • the tumor was resected and immunofluorescent analysis for CD34 was performed. From the obtained immunofluorescent images, a binary image was generated by manual thresholding and used to quantify vascular density with the ImageJ software "Analyze Particles" plug-in. Images were taken from at least 5 randomly selected microscopic fields of view in each section and 10 sections were analyzed for each tumor (50-100 images per tumor). The average number of blood vessels per mm 2 tissue area of each tumor was used for statistical analysis.
  • An orthotopic allogeneic tumor model was constructed by subcutaneously inoculating B16-F10 mouse melanoma cells (CRL-6475, ATCC) into Lat1 fl / fl / Tek-Cre or control Lat1 fl / fl mice.
  • the B16-F10 cell suspension in PBS was mixed with a growth factor-reduced matrigel in a 1: 1 volume ratio to a final concentration of 2.5 ⁇ 106 cells / mL.
  • the cell suspension was subcutaneously injected into the lower abdomen of 6-8 week old mice (0.5 x 106 cells, 0.2 mL / animal). Tumor volume was calculated daily as described above.
  • Lat1 fl mice carrying the floated Lat1 gene for conditional knockout are available from Unitech Co., Ltd. Generated by.
  • the targeting construct was designed to excise exon 3 of the Lat1 gene.
  • the 1.2 kb genomic region containing exon 3 was replaced with the corresponding genomic sequence sandwiched between pairs of loxP sequences.
  • a neomycin resistance gene cassette sandwiched between pairs of FRT sequences was also inserted downstream of exon 3. Long arms and short arms (5.4 kb and 2.3 kb, respectively) were added for homologous recombination. All genomic sequences were amplified from BAC clone RP23-46D12.
  • Diphtheria toxin A fragment (DTA) under the thymidine kinase promoter was used for negative selection.
  • the targeting construct was electroporated into mouse Bruce-4ES cells derived from C57BL / 6J. After selection with 200 ⁇ g / ml G418, successful target ES clones were screened by PCR. Homologous recombination was further confirmed by Southern blot analysis using two external probes (5'and 3'probes for SpeI digested genomic DNA) and an internal probe (Neo probe for EcoRV digested genomic DNA). Next, positive ES clones were injected into Balb / c blastocysts to obtain chimeric mice.
  • Reproductive line transmission was established by mating chimeric mice with C57BL / 6J mice, and the resulting heterozygous founder mice were further mated with CAG-FLP mice expressing Flp-recombinase under the control of the CAG promoter.
  • the neomycin resistance gene cassette on the FRT site side was resected. After confirming the removal of the neomycin resistance gene cassette by PCR, the resulting Lat1 fl mice were maintained on a C57BL / 6J genetic background.
  • Lat1 fl mice were mated with the following transgenic mice.
  • CAG-rtTA3 mice expressing reverse tetracycline-controlled transactivator 3 (rtTA3) under the control of the CAG promoter (B6N.FVB (Cg) -Tg (CAG-rtTA3) 4288Slowe / J) [19], and the tetracycline responsive promoter.
  • TetO-Cre mice expressing Cre recombinase under the control of B6.Cg-Tg (tetO-cre) 1Jaw / J) [20] were obtained from Jackson Laboratory.
  • Tek-Cre mice expressing the Cre recombinase gene under the endothelial cell-specific Tek promoter / enhancer (B6. Cg-Tg (Tek-cre) 1Ywa) [21] were purchased from the RIKEN BioResource Center. To avoid non-cell-specific deletion of the frozen Lat1 allele in the female germline of the Tek promoter [22], Tek-Cre-positive female mice were not used for mating. Genotyping PCR was performed using genomic DNA extracted from the tail chip by KOD One PCR Master Mix (TOYOBO). CAG-rtTA3, TetO-Cre, and Tek-Cre transgenes were analyzed by the protocol provided by those resources.
  • TOYOBO KOD One PCR Master Mix
  • the wild-type allele and the floated allele of the Lat1 gene are It was distinguished by the primers of Fw (5'-TATAGAGAGAGACTTGGGATGAAGC-3') and Rv (5'-CAGCACACTGATTGTGACAAAGG-3').
  • the flapped and knockout alleles of the Lat1 gene are Fw (5'-GTTCCAGTCTGGCATCTTAAGTAG-3'), It was distinguished by the primer of Rv (5'-CCCTGTGCTCAGACAGAAAATGAGA-3').
  • RNA from HUVEC and mouse aorta was extracted using Isogen II (Nippon Gene) and Agencourt RNAdvance Tissue Kit (Beckman Coulter), respectively. Quantitative real-time PCR was performed as previously reported [23].
  • Example 1 Expression of LAT1 in intratumoral blood vessels of human pancreatic cancer tissue The expression of LAT1 in intratumoral blood vessels of human pancreatic cancer tissue was examined. Increased expression of LAT1 has been reported in cancers of various tissue origins, including pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) [13, 14]. Consistent with this, high expression of LAT1 was detected in cancer cells of PDA tissue by immunohistochemistry (Fig. 1, left figure). Interestingly, there was significant expression of LAT1 in interstitial vascular endothelial cells positive for the endothelial cell marker CD34. In contrast, endothelial cells of normal pancreatic tissue were largely negative for LAT1 staining.
  • PDA pancreatic ductal adenocarcinoma
  • FIG 1 Left Immunohistochemistry of LAT1 and CD34 in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) and normal pancreas. Representative images of CU1372-35-35006 (PDA) and CU2009 / 02 X-40 (normal pancreas) are shown. Arrows and arrowheads indicate tumor cells and endothelial cells, respectively. Black square; enlarged image.
  • Figure 1 right Endothelial LAT1 expression in tissue microarrays containing PDA and normal pancreas. Tissue spots are classified as high, low / medium, and negative, depending on the LAT1 staining intensity of the endothelial cells. The data displayed is the percentage for each group.
  • LAT1 in tumor-related blood vessels was further investigated in a human cancer cell xenograft tumor model of athymic nude mice.
  • Mouse LAT1-specific antibodies were generated to detect mouse LAT1 in blood vessels surrounded by cancer cells highly expressing human LAT1.
  • mouse LAT1 was detected in CD34-positive endothelial cells of pancreatic cancer MIA PaCa-2 cell tumor.
  • no clear LAT1 staining was detected in blood vessels of normal tissue except for cerebral capillaries for which LAT1 expression was previously reported [26,27]. Therefore, expression of LAT1 in the endothelial cells of tumor-related vessels was reproduced in xenograft tumor models of different tissue origin.
  • Example 2 Suppression of intratumor-generated blood vessels by administration of JPH203 Genetic and pharmacological inhibition of endothelial LAT1 suppresses angiogenesis and tumor growth It has been demonstrated that the LAT1 inhibitor JPH203 suppresses the growth of heterologous transplanted tumors. [16, 28-31].
  • the effect of JPH203 on tumor angioplasty was measured (Fig. 2, left).
  • Intratumoral vessel density decreased to about 45% of placebo-treated controls in JPH203-treated tumors (Fig. 2, right), suggesting that the reduction in tumor angiogenesis contributes to the antitumor effect of JPH203.
  • Example 3 Suppressive effect of JPH203 on tumor growth in vascular endothelium-specific LAT1 knockout mice
  • endothelial LAT1 suppresses tumor angiogenesis and, as a result, suppresses tumor growth. ..
  • FIG. 3 shows the intratumoral blood vessels visualized by intravenously injected FITC-dextran.
  • the lower right figure of FIG. 3 is a quantification of the blood vessel area of a tumor section.
  • Example 4 Effect of LAT1 gene deletion and LAT1 inhibition on proliferation of vascular endothelial cells Expression of LAT1 protein in HUVEC was confirmed by Western blotting (Fig. 4-1 upper left). Knockdown (KD) of LAT1 by siRNA that reduced the amount of LAT1 protein to 15-25% of the control suppressed the growth of HUVEC (Fig. 4-1 upper right). Similarly, LAT1 inhibition by JPH203 or BCH suppressed HUVEC proliferation in a concentration-dependent manner (Fig. 4-1 below). These results indicate that LAT1 plays an important role in endothelial cell proliferation.
  • Amino acid is an essential signal transduction molecule that activates the serine / threonine kinase complex mTORC1 (Mechanistic Target of rapamycin Complex 1), and supports cell growth and proliferation by integrating the signal transduction of nutrients and growth factors [32]. ].
  • mTORC1 Mechanism Target of rapamycin Complex 1
  • the most well-characterized downstream effectors of mTORC1 include the ribosomal protein S6 kinase p70S6K, which is a translation initiation regulator. Accumulation of non-aminoacylated tRNAs under amino acid deficiency also activates other signaling pathways known as the general amino acid control (GAAC) pathway [33, 34].
  • GAC general amino acid control
  • Non-aminoacylated tRNA causes global downregulation of translation by activating Gcn2 kinase in the GAAC pathway, inducing phosphorylation of eIF2 ⁇ , and inhibiting the recruitment of initiator methionyl tRNA to the ribosome.
  • LAT1 inhibition by JPH203 and LAT1 KD in HUVEC significantly reduced the phosphorylation of p70S6K and its substrate ribosomal protein S6.
  • Phosphorylation of eIF2 ⁇ is also increased, indicating activation of the GAAC pathway by amino acid deficiency.
  • LAT1-mediated amino acid transport in HUVEC is an essential prerequisite for activating translation initiation. Inhibition of endothelial LAT1 can down-regulate translation globally by suppressing mTORC1 activity and activating the GAAC pathway.
  • Example 5 Suppressive effect of JPH203 on activation of intracellular signal transduction pathway by vascular endothelial growth factor VEGF-A secreted from cancer cells
  • VEGF-A vascular endothelial growth factor
  • VEGF-A / VEGFR2 major downstream factors of VEGF-A / VEGFR2, including Erk1 / 2, Akt, p38, Src, FAK, p70S6K, and S6 ribosomal protein, also have similar transients in phosphorylation, except for PLC ⁇ , which shows a relatively delayed response. Showed the passage of time. JPH203 did not affect the phosphorylation of VEGFR2 and downstream factors, except for p70S6K and S6. Phosphorylation of p70S6K and S6 was significantly suppressed by JPH203 20 minutes after stimulation, revealing that VEGF-A-induced activation of mTORC1 is highly dependent on LAT1.
  • Akt [32] at Thr 308, located upstream of mTORC1 was largely unaffected by JPH203. Therefore, reduced mTORC1 activity is mediated by the Ragulator-Rag complex, which recruits mTORC1 to the surface of the lithosome independently of the RTK-PI3K-Akt axis and promotes interaction with the kinase activator Rheb. Most likely due to the decrease in [32].
  • FIG. 5 HUVEC starved of serum and growth factors was stimulated with VEGF-A (10 ng / mL) in the presence or absence of JPH203 (50 ⁇ M).
  • VEGF-A / VEGFR2 Downstream of VEGF-A / VEGFR2, which plays a major role in angiogenesis, major effector molecules such as Erk1 / 2, Akt, p38, Src, FAK, p70S6K, and PLC ⁇ are responsible for proliferation / survival / permeability of vascular endothelial cells. / Controls migration, etc.
  • mTORC1 suppressed by JPH203 is involved in the regulation of these cellular functions downstream of Akt.
  • the potent antiproliferative effect supported by global downregulation of translation is that endothelial LAT1 inhibition not only blocks the supply of amino acids as a building block for protein synthesis, but also interferes with amino acid signaling that controls the initiation of translation. It can also be achieved by doing.
  • Such a strong inhibitory effect on translation is unique to LAT1 inhibitors and clearly distinguishes the mechanism of action of LAT1 inhibitors from the mechanism of action of existing anti-angiogenic agents.
  • Endogenous and acquired tolerance to anti-angiogenic therapies often limits the interests of patients [1, 2].
  • Multiple redundant and compensatory angiogenesis-promoting signaling pathways present in endothelial cells are thought to play an important role in resistance.
  • a promising strategy for overcoming tolerance is to target multiple signaling pathways at the same time.
  • the combination of FGFR inhibitor and bevacizumab in a mouse tumor model almost completely suppressed tumor growth [37].
  • resistance to VEGFR2 inhibitors was suppressed by soluble decoy FGF receptors [38].
  • LAT1 is involved in VEGF-A-dependent activation of mTORC1 which plays an important role in cell processes related to angiogenesis such as migration and lumen formation in vitro as well as in vitro angiogenesis. Demonstrated to be essential [39-42].
  • This result suggests that the role of LAT1 in the activation of mTORC1 is mediated by the Ragulator-Rag complex independent of the RTK-PI3K-Akt axis.
  • Amino acid signaling via LAT1 behaves as a "gate control" signal, allowing angiogenesis-promoting VEGF-A signaling to flow downstream via mTORC1 (FIG. 6).
  • angiogenesis-promoting RTKs Similar to VEGFR signaling, multiple other angiogenesis-promoting RTKs, including FGFR and TIE-2, share the PI3K-Akt axis that activates mTORC1 [43]. Therefore, therapeutic inhibition of LAT1 by JPH203 may simultaneously interfere not only with VEGF-A / VEGFR2 signaling, but also with other angiogenesis-promoting signaling pathways in mTORC1 at the cost of angiogenesis-promoting growth factor signaling. It provides the possibility of avoiding the resistance resulting from function.
  • LAT1 is well known as a "tumor cell type transporter" that is very widely upregulated to support the growth and proliferation of tumor cells, but the examples here are of tumor cells and stromal endothelium. It presents new insights into the dual function of LAT1 in tumor progression in both.
  • a unique dual mechanism of action of the LAT1 inhibitor JPH203 as an antitumor agent ie, the established direct antiproliferative effect on tumor cells and the endothelial LAT1 through inhibition of LAT1 in tumor cells. The angiogenic effect of inhibition is emphasized.
  • LAT1 inhibitors when combined with other anti-angiogenic agents, suppresses the compensatory paracrine secretion of pro-angiogenic factors from tumor cells through down-regulation of protein synthesis in tumor cells. Is Rukoto. Therefore, combination therapy with LAT1 inhibitors and anti-angiogenic agents has a low risk of developing resistance and may exhibit beneficial synergistic antitumor effects.
  • LAT1 is a direct target gene for carcinogenic c-Myc [47, 48].
  • LAT1 is one of the cancer fetal proteins
  • HUVEC human umbilical vein endothelial cell
  • the signal transduction system in the regulation and maintenance of cell function has properties similar to those in cancer cells, which is why it is applied to the study of cancer cells.
  • Example 6 Since the above findings from cells and model animals are clinically recognized, the results are shown as examples.
  • Table 2 shows new lesions (other than the first cancer) found in the Phase 1 clinical trial [51] of JPH203 in patients with various advanced solid tumors who were refractory or intolerant to standard chemotherapy. Metastatic lesions to organs) are summarized.
  • JPH203 which is an inhibitor of LAT1
  • NAT2 a metabolite called N-acetylJPH203
  • Table 2 shows the number of new lesions and new lesions in all 16 patients enrolled in the Phase I study, divided into Rapid type (8 cases) and Non-rapid type (8 cases), which metabolize rapidly in NAT2.
  • the lesions are listed separately for the onset site.
  • the Rapid type of NAT2 showed new lesions in 7 of 8 cases, and the Non-rapid type showed new lesions in 4 of 8 cases.
  • the number of new lesions in the lung occupied by the vascular network was 5 out of 7 in Rapid and 1 in 4 in Non-rapid. It is important as an example of the present specification to clarify the association of JPH203 to tumor angiogenesis.
  • JPH203 has an anticancer effect on tumor angiogenesis.
  • LAT1 is upregulated in the tumor endothelium and plays a basic role in tumor angiogenesis.
  • a crosstalk between LAT1-mediated amino acid signaling and growth factor-dependent angiogenesis signaling has been revealed, and the nutrient-sensing hub kinase mTORC1 controls angiogenesis.
  • LAT1 targeted therapies may provide an ideal option, especially for enhancing cancer treatment with current anti-angiogenic therapies.
  • FIG. 7 shows a summary of the pharmacological effects of JPH203 on tumor tissues.
  • the following effects can be expected.
  • -The environment inside the tumor (abnormality of normal blood vessels and maintenance of hypoxia) that is favorable for the tumor is destroyed by JPH203, and normal blood vessels are cultivated.
  • ⁇ It can prevent the metastasis of cancer cells and the growth of cancer cells into normal tissues rich in blood flow.
  • -Promote anti-cancer effects that confine the cancer to a certain localized state and enable local delivery of anti-cancer drugs.
  • the therapeutic agent for cancer of the present invention can provide a therapeutic agent having no side effects and high effect, particularly having little effect on normal cells.
  • the number of blood vessels in the cancer tissue of the untreated (control) group of the vascular endothelial cell marker CD34 was significantly reduced by the treatment with JPH203. It is a figure which shows the tumor growth inhibitory effect in the vascular endothelium-specific LAT1 knockout mouse. The growth of LAT1 gene-expressing tumors transplanted into mice was significantly suppressed by knockdown (disruption) of the LAT1 gene. It is a figure which shows the effect of LAT1 gene deletion and LAT1 inhibition on the proliferation of tumor vascular endothelial cells. The proliferation of tumor vascular endothelial cells was significantly suppressed by each treatment. The effects of LAT1 KD and JPH203 on the mTORC1- and GAAC pathways are shown.
  • JPH203 shows the suppression of JPH203 of the intracellular signal transduction pathway by the vascular endothelial growth factor VEGF-A secreted from a cancer cell. It is a figure which shows the suppression of the angioplasty induction signal by JPH203.
  • Amino acid signals mediated by LAT1 monitor amino acid supply and allow vascular growth factor to pass through mTORC1 (“gating” control).
  • JPH203 suppresses the intracellular transport of amino acids via LAT1 and acts more favorably on mTORC1 activation than stimulation of vascular endothelial growth factor, and blocks stimulation from vascular endothelial growth factor even if it enters mTORC1.
  • JPH203 suppresses LAT1 specifically expressed in cancer cells
  • the present invention is derived from the discovery that LAT1 is also expressed in abnormal intratumoral vascular endothelial cells.
  • the anticancer effect of JPH203 by inhibiting the function of LAT1 molecule present in two different sites of tumor tissue acts to suppress both cancer growth and metastasis.
  • the changes in tumor volume when JPH203 and anti-PD-1 antibody are administered to mice having a tumor individually or in combination are shown.
  • the amino acid transporter SLC7A5 confers a poor prognosis in the highly proliferative breast cancer subtypes and is a key therapeutic target in luminal B tumours.
  • Breast Cancer Res. 2018; 20:21. 10.
  • L-type amino acid transporter 1 (LAT1) predicts poor prognosis in pancreatic ductal adenocarcinomas. J Clin Pathol. 2012; 65: 1019-23. 15. Kaira K, Sunose Y, Ohshima Y, Ishioka NS, Arakawa K, Ogawa T, et al. Clinical significance of L-type amino acid transporter 1 expression as a prognostic marker and potential of new targeting therapy in biliary tract cancer. BMC Cancer. 2013; 13: 482. 16.
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  • the LAT1 inhibitor JPH203 reduces growth of thyroid carcinoma in a fully immunocompetent mouse model.
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Abstract

対象のがん疾患の治療に使用するための、Ｌ型アミノ酸トランスポーター１（ＬＡＴ１）阻害剤を含む、腫瘍内異常血管内皮細胞に発現するＬＡＴ１を介したアミノ酸の細胞内輸送を抑えることにより、がん細胞の増殖及び／または転移を抑制することを特徴とする、がんの治療剤である。該治療剤は、好ましくはＮｏｎ－Ｒａｐｉｄ（Ｓｌｏｗ及び／またはＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）型のＮＡＴ２遺伝子を有する前記対象に投与される。

Description

がん治療剤
　本発明は、Ｌ型アミノ酸トランスポーター１（ＬＡＴ１）阻害剤を用いるがん治療剤に関する。
　腫瘍血管新生への治療的介入は、抗がん治療の合理的な戦略の１つである。内皮細胞における血管新生シグナル伝達経路を標的とするために、血管新生促進因子に対する中和抗体およびデコイ受容体、ならびに受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に対する抗体および阻害剤を含む様々な薬剤が開発されてきた。しかしながら、臨床診療におけるそれらの有効性と適応症は比較的限定されている［１、２］。血管新生促進成長因子シグナル伝達とそれらの代償機能の冗長性は、抗血管新生療法に対する不十分な応答性と耐性を説明するメカニズムの１つである［１、２］。
　血管新生阻害(ＶＥＧＦ阻害)効果による抗がん剤として、ベバシズマブ、ラムシルマブが知られている。これらＶＥＧＦ阻害剤は、正常組織の血管新生をも阻害するため、それに伴う消化管出血、消化管穿孔、あるいは動脈血栓塞栓等の循環器系の副作用が発生している。即ち、内皮細胞における特定の血管新生促進シグナル伝達経路自体の阻害が、腫瘍における異常な血管新生活性を制御するのに十分ではないことを明確に示している。
　腫瘍の血管新生は、合理的な抗がん標的と見なされている。しかしながら、臨床診療における抗血管新生療法の有効性と適応症は比較的限られている。したがって、病理学的血管新生に重要な腫瘍内皮の明確な特徴を明らかにすることが依然として求められている。
　ＬＡＴ１は、その補助タンパク質４Ｆ２ｈｃとヘテロ二量体複合体を形成し、ほとんどの必須アミノ酸を優先的に輸送する［３、４］。ＬＡＴ１は、２０を超える組織／臓器起源の広範囲の原発腫瘍および転移性病変で発現上昇することが知られている［５－７］。さらに、ＬＡＴ１の発現と予後不良との相関関係は、トリプルネガティブ乳がん［８］、高増殖性ＥＲ陽性サブタイプの乳がん［９］、膀胱がん［１０］、肺腺がん［１１］、肺神経内分泌腫瘍［１２］、膵管腺がん［１３、１４］、および胆道がん［１５］など、さまざまな腫瘍で示されている。したがって、がん細胞におけるＬＡＴ１は、抗腫瘍療法の新たな分子標的として認識されている。前臨床動物モデルで顕著な抗腫瘍効果を示したＪＰＨ２０３を含むいくつかのＬＡＴ１選択的阻害剤が合成されている［１６－１８］。
　一方、血管細胞に目を移すと、正常組織における血管では、血流がうっ滞、凝固せずにスムーズに流れる。外来抗原によって活性化した樹状細胞のような抗原提示細胞は、リンパ節に移動され、それにより免疫細胞の活性化を促す。そして、血管内皮細胞マーカーＣＤ３４は発現しているが、ＬＡＴ１は発現していない。
ＷＯ２０１４／１１２６４６号 ＷＯ２００８／０８１５３７号
　本発明は、副作用がなく効果の高いがんの治療剤を提供することを目的とする。特に、正常細胞への影響が少ないがんの治療剤を提供することを目的とする。本発明はまた、副作用がなく効果の高いがんの治療方法を提供することを目的とする。
　さらには、血管の機能と内皮マーカーからの定義づけと腫瘍内血管制御と腫瘍免疫制御の相乗作用の構築を目的とする。
　すなわち本発明は、Ｌ型アミノ酸トランスポーター１阻害剤（ＬＡＴ１阻害剤）を含む、腫瘍内異常血管内皮細胞に発現するＬＡＴ１を介したアミノ酸の細胞内輸送を抑えることにより、免疫チェックポイント阻害薬の奏効性を上昇させ、がん細胞の増殖及び／または転移を抑制する、がんの治療剤を提供する。
　また本発明は、ＬＡＴ１阻害剤を含む、腫瘍血管新生抑制剤を提供する。
　更に、本発明のＬＡＴ１阻害剤は、免疫チェックポイント阻害薬の奏効性を上昇させるための薬剤としても作用する。
　本発明により、副作用がなく効果の高い、特に、正常細胞への影響が少ないがんの治療剤を提供することが可能となる。
　即ち、ヒト膵がん組織内腫瘍部位の新生血管にはＬＡＴ１／ＣＤ３４が共存するが、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）でのＶＥＧＦ－Ａ、ＦＧＦ―２、ＶＥＧＦ－Ａ／ＦＧＦ－２刺激によりＬＡＴ１　ｍＲＮＡは増大し、ＬＡＴ１阻害剤、特に、後述するＪＰＨ２０３は、大動脈リングアッセイ、マトリゲルでのプラグアッセイで血管新生を抑制し、またＭＩＡ　ＰａＣａ－２移植マウスでは腫瘍増大と腫瘍内血管新生等がＪＰＨ２０３により強く抑制された。実施例で示すように、ＨＵＶＥＣにおけるＪＰＨ２０３による血管新生誘導シグナルの抑制機序の解析で以下が明らかにされた。即ち、ＬＡＴ１を介するアミノ酸シグナルは、アミノ酸供給量をモニターして、血管新生成長因子受容体を介する血管新生誘導シグナルのｍＴＯＲＣ１通過を許可する（“ｇａｔｉｎｇ”制御）。ＪＰＨ２０３は、ＬＡＴ１を介するアミノ酸取り込みを抑制してｍＴＯＲＣ１活性化を抑え、血管新生促進因子によるｍＴＯＲＣ１活性化より優位に作用し、血管新生成長因子からの刺激がｍＴＯＲＣ１に入っても、そこで遮断してしまうことが判明している。
　即ち、ＪＰＨ２０３を代表とするＬＡＴ１阻害剤は、ＨＵＶＥＣに発現するＬＡＴ１を阻害し、ＨＵＶＥＣの血管新生を阻害する。
　正常な血管の特徴としては、以下のものが挙げられる。
・血流がうっ滞、凝固せずにスムーズに流れる
・ＣＤ３４が内皮細胞に発現しており、ＬＡＴ１は発現していない。
　一方で、腫瘍内に豊富に存在する血管様構造物の特徴としては、以下のものが挙げられる。
・ＬＡＴ１が発現し、蛇行、拡張、閉塞、血管内血管形成、過剰な血管分岐、発芽などの異常が認められる
・抗がん剤の送達の抑制、低酸素、染色体の不安定性、遺伝子変異の招来等がみられる
・ペリサイトによる内皮細胞の裏打ちが低下し、内皮細胞同士の結合低下、血管壁の穴あき構造変化等が顕著になる。
　そこで、本発明は、正常組織及び腫瘍内における血管構造の差異を利用して、即ち、ＬＡＴ１の発現の有無に焦点をあて、がん細胞の血管に選択的に作用する薬剤としてのＬＡＴ１を用いたがんの治療剤に関するものである。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　本発明のがんの治療剤は、ＬＡＴ１阻害剤を有効成分とする。
　本発明で用いるＬＡＴ１阻害剤としては、非競合阻害剤及び競合阻害剤のいずれも使用可能である。
　非競合阻害剤としては、例えばＷＯ２０１４／１１２６４６号に記載のものが例示される。
　競合阻害剤としては、ＷＯ２００８／０８１５３７号に記載のものが例示され、特に、Ｏ－（５－アミノ－２－フェニルベンズオキサゾール－７－イル）メチル－３，５－ジクロロ－Ｌ－チロシン（以下、「ＪＰＨ２０３」ということがある）が好ましい。
　本発明のがんの治療剤が対象とするがんとしては、結腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、膵臓がん、胆道がん、食道がん、大腸がん、前立腺がん、膀胱がん、脳腫瘍、胃がん、肝臓がん、皮膚がん、絨毛がん、腎がん、頭頚部がん、舌がん、骨髄腫、胸腺腫、中皮腫、下垂体腫瘍、転移性がん、及び浸潤がんよりなる群から選択される。
　なかでも、肺がん、膵がんが推奨される。
　本発明のがんの治療剤は、Ｌ型アミノ酸トランスポーター１（ＬＡＴ１）を阻害するものであるが、ＬＡＴ１は正常細胞には殆ど存在せず（骨髄、血液脳関門、胎盤等に認められるもののがん組織の発現量に比べて桁違いに低く、ＪＰＨ２０３の臨床試験では正常機能の障害は認めていない）、がんの腫瘍関連血管内皮細胞で発現するため、本発明のがんの治療剤が投与された患者では、正常細胞に作用を起こすことはない。ＪＰＨ２０３の阻害効果はＬＡＴ１阻害に特有であり、ＬＡＴ１阻害剤の作用機序と既存の抗血管新生剤の作用機序を明確に区別する。
　更に、本発明のがんの治療剤は、腫瘍免疫の復活を促す免疫チェックポイント阻害薬が奏効できる環境を構築することが可能となり、免疫チェックポイント阻害薬の奏効性を上昇させるための薬剤としても作用する。
　一方、ＪＰＨ２０３を代表とするＬＡＴ１阻害剤は、臨床試験で得られた薬物動態パラメーター解析結果から、体表面積当たりで同じ投与量を投与した被験者間において、血液中ＪＰＨ２０３濃度に比べて、血中並びに尿中のＮアセチル化体濃度の個人差が大きいことが見出されており、ＮＡＴ２の遺伝子多型におけるアセチル化速度の相違と、ＪＰＨ２０３の安全性及び薬効との間に関連があることが、本発明者により見出されている（ＰＣＴ／ＪＰ２０２０／０３２８２８号）。
　即ち、本発明で用いるＬＡＴ１阻害剤は、Ｎｏｎ－Ｒａｐｉｄ（Ｓｌｏｗ及び／またはＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）型のＮＡＴ２遺伝子を有する（即ち、ＮＡＴ２によるアセチル化の遅いタイプの）がん等の患者に投与された場合、高い効果を奏することが可能となる。ここで、「Ｎｏｎ－Ｒａｐｉｄ型のＮＡＴ２遺伝子」とは、ＮＡＴ２遺伝子のアセチル化速度の速いタイプ（Ｒａｐｉｄ）、中間タイプ（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）、および遅いタイプ（Ｓｌｏｗ）の三つの表現型のうち、中間タイプ（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）、および遅いタイプ（Ｓｌｏｗ）の表現型を意味する。
　ＮＡＴ２の遺伝子多型を代表する７つのＳＮＰ（４８１Ｃ＞Ｔ，２８２Ｃ＞Ｔ，８５７Ｇ＞Ａ，８０３Ａ＞Ｇ，３４１Ｔ＞Ｃ，５９０Ｇ＞Ａ，１９１Ｇ＞Ａ）について、２－ＳＮＰ、３－ＳＮＰ、４－ＳＮＰの組み合わせ（表１）でＮＡＴ２のアセチル化の表現型（Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）が解析され、ＳＮＰなし（標準）ハプロタイプであるＮＡＴ２＊４のホモ接合体で構成されるものが、アセチル化の速いタイプ（Ｒａｐｉｄ）とされ、いずれか一つのハプロタイプが変異したヘテロ接合体が、アセチル化速度が中間のタイプ（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）とされ、そして、すべてが変異ハプロタイプのホモ接合体か二つ又はそれ以上の変異ハプロタイプのヘテロ接合体の組み合わせが、アセチル化の遅いタイプ（Ｓｌｏｗ）とされている（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３巻：３１－４１ページ，２０１２年）。ここで、「ＮＡＴ２＊４」アレルは、ＳＮＰなしハプロタイプを意味する。また、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３巻：３１－４１ページ，２０１２年によれば、Ｒａｐｉｄタイプは、「ＮＡＴ２＊４」以外にも、アミノ酸変異を起こさない「ＮＡＴ２＊１１，ＮＡＴ２＊１２，ＮＡＴ２＊１３」を有する患者もＲａｐｉｄタイプに分類されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　具体的には、２つのＳＮＰが推測するＮＡＴ２アセチル化因子の表現型は、２つのＳＮＰの分析：ｒｓ１０４１９８３（２８２Ｃ＞Ｔ）およびｒｓ１８０１２８０（３４１Ｔ＞Ｃ）によって決定される。３つのＳＮＰが推測するＮＡＴ２アセチル化因子表現型は、３つのＳＮＰの分析：ｒｓ１７９９９２９（４８１Ｃ＞Ｔ）、ｒｓ１７９９９３０（５９０Ｇ＞Ａ）およびｒｓ１７９９９３１（８５７Ｇ＞Ａ）によって決定される。４つのＳＮＰ推定ＮＡＴ２アセチレーター表現型は、４つのＳＮＰの分析：ｒｓ１８０１２７９（１９１Ｇ＞Ａ）、ｒｓ１８０１２８０（３４１Ｔ＞Ｃ）、ｒｓ１７９９９３０（５９０Ｇ＞Ａ）、およびｒｓ１７９９９３１（８５７Ｇ＞Ａ）によって決定される。
　例えば、ＬＡＴ１阻害剤であるＪＰＨ２０３がＮＡＴ２によりアセチル化されると、そのがん細胞に対する阻害活性が低下する。しかし患者が、アセチル化を受けにくいＮＡＴ２遺伝子表現型を優占的に有している場合、即ち、がん等の患者のＮＡＴ２遺伝子において、アセチル化速度の中間タイプ（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）、および遅いタイプ（Ｓｌｏｗ）の表現型を有する場合（Ｎｏｎ－Ｒａｐｉｄ型のＮＡＴ２遺伝子）は、ＪＰＨ２０３のアセチル化速度が遅くなるため、アセチル化されにくくなり、ＪＰＨ２０３の活性が長く続くことになる。
　尚、ＮＡＴ２遺伝子多型の分析は、従来公知の方法で行うことが可能である。例えば、被験者の血液からＤＮＡを抽出し、マイクロアレイ法によりＤＮＡを処理し、次いで遺伝子型を読み込んで検査を行い、続いてデータ解析を行うことにより行うことが可能である。
　したがって、本発明のがんの治療剤は、ＮＡＴ２遺伝子多型の測定と組み合わせて、以下の投与レジメでがんに罹患した対象に投与することができる。
　（１）　Ｎｏｎ－Ｒａｐｉｄ（Ｓｌｏｗ及び／またはＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）型のＮＡＴ２遺伝子を有する前記対象を同定して選択し； 
（２）　Ｎｏｎ－Ｒａｐｉｄ（Ｓｌｏｗ及び／またはＩｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）型のＮＡＴ２遺伝子を有すると同定された当該対象に当該医薬組成物を投与する。
　更に、本発明のがんの治療剤は、ＮＡＴ２阻害剤と併用して、疾患、例えばがんの治療に用いることができる。ＮＡＴ２阻害剤としては、例えば、アセトアミノフェンが例示される。
　例えば、ＪＰＨ２０３は肝サイトゾルでＮＡＴ２により速やかにＮ－アセチル化を受け、Ｎａｃ－ＪＰＨ２０３となるが、Ｎａｃ－ＪＰＨ２０３はＪＰＨ２０３に比べて、ＬＡＴ１への選択性及び活性が低下することがわかっており、ＮＡＴ２阻害剤との併用により、ＪＰＨ２０３のアセチル化を抑え、ＪＰＨ２０３の効果の維持をはかるものである。
医薬組成物
　本発明のがんの治療剤は、医薬組成物として用いられる。医薬組成物は、有効成分としてＬＡＴ１阻害剤又はその薬理学的に許容される塩を含む。また、必要に応じて医薬品添加物を含んでもよい。本発明の医薬組成物は、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉剤、カプセル剤などの固形製剤または液剤、ゼリー剤、シロップ剤などの形態で、経口投与することができ、あるいは、該医薬組成物薬は、注射剤(血管内、皮下、腫瘍内等)、経鼻剤、坐剤、吸入剤、経皮剤などの形態で、非経口的に投与してもよい。
　本発明のがんの治療剤は、好ましくは、注射剤または前記固形製剤のような経口剤の形態である。
　特に、本発明の医薬組成物は、がんの治療剤として用いられることから、好ましくは注射剤として製剤化される。そのような注射剤としては、本発明の有効成分にｐＨ調整剤、およびシクロデキストリン類を含むものが例示される。
　具体的な注射剤としては、例えば、静脈、皮下、皮内、筋肉内注射剤、点滴静注剤が挙げられる。
　本発明の注射剤に配合することができるｐＨ調整剤としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのようなアルカリ金属水酸化物、水素化ナトリウム、水素化カリウムのようなアルカリ金属水素化物、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の炭酸塩等が挙げられ、特に、水酸化ナトリウム、および炭酸ナトリウムが好ましく、水酸化ナトリウムがより好ましい。
　前記注射剤は、ｐＨ調整剤を用いて適当なｐＨに適宜調整されうる。本実施形態に係る注射剤のｐＨは、３～６であることが好ましく、３～５であることがより好ましく、３～４．５であることがさらに好ましく、３．５～４．５であることが特に好ましい。
　本発明の注射剤に配合することができるシクロデキストリン類としては、例えば、未修飾シクロデキストリン、修飾シクロデキストリンが挙げられる。未修飾シクロデキストリンとして、例えば、α－シクロデキストリン、β－シクロデキストリン、γ－シクロデキストリン等が挙げられる。また修飾シクロデキストリンとして、例えば、ジメチル－α－シクロデキストリン、ジメチル－β－シクロデキストリン、ジメチル－γ－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル－α－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル－γ－シクロデキストリン、スルホブチルエーテル－α－シクロデキストリン、スルホブチルエーテル－β－シクロデキストリン、スルホブチルエーテル－γ－シクロデキストリン、マルトシル－α－シクロデキストリン等が挙げられる。
　シクロデキストリン類は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。シクロデキストリン類は、強酸性ではない水溶液に溶解した場合でも形成される不溶性微粒子数を低減できるという観点及び凍結乾燥製剤の強酸性でない水溶液に対する再溶解性を改善するという観点から、ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、又は、スルホブチルエーテル－β－シクロデキストリンが好ましく、スルホブチルエーテル－β－シクロデキストリンがより好ましい。
　ここで、スルホブチルエーテル・シクロデキストリンは下記式１に示した構造であり、環状構造の内側は疎水性が高い。そのため、同じく疎水性の高いＯ－（５－アミノ－２－フェニルベンズオキサゾール－７－イル）メチル－３，５－ジクロロ－Ｌ－チロシンと、疎水性相互作用により複合体を構成する。本明細書中における「スルホブチルエーテル・シクロデキストリン複合体」との言及は、上記した疎水性相互作用によるものを指す。
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　特に、ＬＡＴ１阻害剤としてＪＰＨ２０３を用いる場合は、そのスルホブチルエーテル・シクロデキストリン複合体（以下、「ＪＰＨ２０３－ＳＢＥＣＤ」という）として注射剤中に使用してもよい。
　本発明に係る注射剤には、更に、必要により緩衝剤、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤等を添加してもよい。
　緩衝剤としては、例えば、ホウ酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、トリス緩衝剤等が挙げられる。
　懸濁化剤としては、例えば、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、アルギン酸ナトリウムなどが挙げられる。
　溶解補助剤としては、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マクロゴール、グリセリン脂肪酸エステル、リポアミノ酸（Ｌｉｐｏａｍｉｎｏａｃｉｄ）、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
　安定化剤としては、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウムなどが挙げられ、等張化剤としては、グリセリン、塩化ナトリウムなどが挙げられ、そして保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸などが挙げられる。
　凍結乾燥製剤を水に溶解した時のｐＨとしては、３～６であることが好ましく、３～５であることがより好ましく、３～４．５であることがさらに好ましく、３．５～４．５であることが特に好ましい。
　前記凍結乾燥製剤は、従来公知の凍結乾燥製剤の製造方法により作製することができ、例えば、－２５℃以下の温度で凍結後、真空度を約２０Ｐａ以下に保ちながら、室温に到達するまで昇温させつつ乾燥させる方法等が挙げられる。
　本発明に係る注射剤は、凍結乾燥製剤であってもよい。このような凍結乾燥製剤は、用時に、例えば、注射用蒸留水、輸液、電解液の１種、またはこれら２種以上の溶媒に溶解して用時溶解型注射剤として使用することができる。
投薬レジメ
　本発明のがんの治療剤が適用される投薬レジメは、患者のタイプ、人種、年齢、体重、性別および医学的状態；処置すべき状態の重症度；投与経路；ならびに患者の肝および腎機能をはじめとする様々な要因に従って選択される。医師は、その症状の進行を予防、阻止または停止させるために必要な薬物の有効量を容易に決定し、処方することができる。
　本発明のがんの治療剤において医薬組成物は、有効成分の投与量は、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与時期、投与間隔等に応じて適宜選択することができ、有効性および安全性の観点からは、１回、１ｍｇ／ｍ２～６０ｍｇ／ｍ２（体表面積）が例示され、好ましくは、１２．５ｍｇ／ｍ２～６０ｍｇ／ｍ２、１２．５ｍｇ／ｍ２～２５ｍｇ／ｍ２、又は１０ｍｇ／ｍ２～４０ｍｇ／ｍ２（体表面積）が例示され、特に２５ｍｇ／ｍ２が推奨される。また、症状に応じて、１２．５ｍｇ／ｍ２等に減量してもよい。
　本発明のがんの治療剤の投与レジメの例としては、例えば、
　－医薬組成物が、一定期間連続投与に続く一定期間の休薬を１サイクルとして投与される、
　－医薬組成物が、５日間の連続投与に続く９日間の休薬の計１４日を１サイクルとして投与される、
　－一定量の医薬組成物が、一定時間かけて静脈内持続投与される、
　－医薬組成物１００ｍＬが、９０分かけて静脈内持続投与される、
　－患者に対して１～６０ｍｇ／ｍ２で投与される、
　－患者に対して１２．５～６０ｍｇ／ｍ２で投与される、
　－患者に対して１２．５～２５ｍｇ／ｍ２で投与される、
　－患者に対して２５ｍｇ／ｍ２で投与される、
等が挙げられ、必要に応じてこれらを組み合わせて適用可能である。
他の薬剤との併用
　本発明のがん治療剤は、他の抗がん剤と併用することが可能である。そのような抗がん剤としては、従来公知のものが使用でき、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物由来抗がん剤、白金配位化合物、カンプトテシン誘導体、チロシンキナーゼ阻害剤、セリンスレオニンキナーゼ、リン脂質キナーゼ、インターフェロン、ホルモン製剤、免疫チェックポイント阻害剤、タンパク質翻訳後修飾阻害剤及びその他抗腫瘍剤が挙げられる。
　特に、本発明のがんの治療剤は、免疫チェックポイント阻害薬の奏効性を上昇させるための薬剤としても作用するので、免疫チェックポイント阻害剤との併用が推奨される。
　さらには、本発明のがん治療剤は、アセトアミノフェンのようなＮＡＴ２阻害剤、抗血管新生剤、例えば、ベマシズマブ、ラムシルマブ、アフリベルセプト等と併用してもよい。
　以下に具体的な実施形態を挙げて本発明を説明するが、本発明はその実施形態に限定されるものではなく、それらにおける様々な変更及び改変が当業者によって、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく実行され得ることが理解される。
抗体産生
　マウスＬＡＴ１　Ｎ末端５３アミノ酸のＧＳＴ融合組換えタンパク質を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させ、グルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティーカラムクロマトグラフィーで精製した。ニワトリ（ホワイトレグホン）を精製組換えタンパク質で筋肉注射により免疫（フロイントの完全アジュバントに２００μｇを混合して初回注射、不完全フロイントに１００μｇを混合して２週間間隔で４回の追加注射）した。最終注射の１週間後、抗血清を収集し、抗ＧＳＴ抗体の吸収のためにＧＳＴ結合Ａｆｆｉ－Ｇｅｌ　１０カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に通し、次に抗原結合Ａｆｆｉ－Ｇｅｌ　１０カラムクロマトグラフィーによる精製に供して抗ｍＬＡＴ１（Ｃ）を得た。
ヒト臍帯静脈内皮細胞
　ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、２％ＦＢＳおよび成長因子（ＶＥＧＦ－Ａ、ＦＧＦ－２、ＥＧＦ、ＩＧＦ－１）を含むＥＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）で３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気で培養した。継代数が９未満の細胞を使用して実験を行った。
ＲＮＡｉによる遺伝子ノックダウン
　ＨＵＶＥＣは、コラーゲンでコーティングされた６ｃｍディッシュに播種された（０．７～１．０×１０４細胞／ディッシュ）。翌日、ＬＡＴ１＃１（ｓ１５６５３）、＃２（ｓ１５６５４）、＃３（ｓ１５６５５）、またはネガティブコントロール＃２（Ａｍｂｉｏｎ）のＳｉｌｅｎｃｅｒ　Ｓｅｌｅｃｔ　ｓｉＲＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後に細胞を実験に使用した。
細胞増殖アッセイ
　ＨＵＶＥＣは、ＥＧＭ－２培地中のコラーゲンコーティングされた９６ウェルプレート（１．０×１０３細胞／ウェル）に播種された。２－アミノビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－カルボン酸（ＢＣＨ）またはＪＰＨ２０３が翌日（０日目）に追加された。ＬＡＴ１ノックダウンの場合、ｓｉＲＮＡトランスフェクション（０日目）の４８時間後に細胞を播種した。細胞増殖はＣＣＫ－８キット（同仁堂）により２４時間毎に３日間測定された。
動物腫瘍モデルの構築と血管の定量化
　ヒト膵臓がんＭＩＡ　ＰａＣａ－２細胞（ＪＣＲＢ００７０、ＪＣＲＢ）と肺がんＨ５２０細胞（ＨＴＢ－１８２、ＡＴＣＣ）は、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）と１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン－１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ナカライテスク）を補充したＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で成長させた。接種前に、細胞をろ過したＰＢＳに懸濁し、１：１の体積比で成長因子低減マトリゲルと混合して、最終濃度を２．５×１０７細胞／ｍＬにした。細胞懸濁液を６週齢のＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ雌マウスの下腹部に皮下注射した（５．０×１０６細胞、０．２ｍＬ／動物）。示されている場合、腫瘍のサイズをキャリパーで測定し、式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２）／２を使用して体積を計算した。長さと幅は、それぞれ腫瘍の最長と最短の寸法である。７日後、腫瘍の体積が１００～２５０ｍｍ３に達したときに、マウスを２つのグループに分け（各グループでｎ＝５）、生理食塩水中のＪＰＨ２０３－ＳＢＥＣＤ（２５ｍｇ／ｋｇ／日、ｉｖ）または同等の量のプラセボ対照のいずれかを毎日投与した。連続注射の１４日後、腫瘍を切除し、ＣＤ３４に対する免疫蛍光分析を行った。取得した免疫蛍光画像から、手動しきい値処理によりバイナリ画像が生成され、ＩｍａｇｅＪソフトウェアの「Ａｎａｌｙｚｅ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」プラグインによる血管密度の定量化に使用された。画像は、各セクションで少なくとも５つのランダムに選択された顕微鏡観察視野から取得され、各腫瘍について１０のセクションが分析された（腫瘍あたり５０～１００枚の画像）。各腫瘍のｍｍ２組織面積あたりの平均血管数を統計分析に使用した。
　同所性同系腫瘍モデルは、Ｂ１６－Ｆ１０マウスメラノーマ細胞（ＣＲＬ－６４７５、ＡＴＣＣ）をＬａｔ１ｆｌ／ｆｌ／Ｔｅｋ－Ｃｒｅまたは対照Ｌａｔ１ｆｌ／ｆｌマウスに皮下接種することによって構築された。ＰＢＳ中のＢ１６－Ｆ１０細胞懸濁液を１：１の体積比で成長因子低減マトリゲルと混合し、最終濃度を２．５×１０６細胞／ｍＬにした。細胞懸濁液を６～８週齢のマウスの下腹部に皮下注射した（０．５×１０６細胞、０．２ｍＬ／動物）。上記のように腫瘍体積を毎日計算した。移植の１０日後、パラフィン切片を使用して血管形成の定量化のために腫瘍を収集した。腫瘍内血管を可視化するために、腫瘍を採取する３５分前に、１００μＬのＦＩＴＣ－デキストラン（２，０００，０００ＭＷ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）溶液（生理食塩水中５ｍｇ／ｍＬ）を静脈注射した。血管面積を定量化するために、切片全体を分析した。取得したＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎの蛍光画像から、手動しきい値処理によりバイナリ画像が生成され、ＩｍａｇｅＪソフトウェアの「Ａｎａｌｙｚｅ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」プラグインによる血管面積の定量化に使用された。各腫瘍について８つの切片を分析して、平均血管面積（μｍ２／ｍｍ２組織面積）を計算し、統計分析に使用した。実験は、各グループ（Ｌａｔ１ｆｌ／ｆｌ／Ｔｅｋ－Ｃｒｅマウスと対照Ｌａｔ１ｆｌ／ｆｌマウス）に対してｎ＝４で実行された。
トランスジェニックマウス
　条件付きノックアウト用のｆｌｏｘｅｄ　Ｌａｔ１遺伝子を保持するＬａｔ１ｆｌマウスは、Ｕｎｉｔｅｃｈ　Ｃｏ．によって生成された。ターゲティングコンストラクトは、Ｌａｔ１遺伝子のエクソン３を切り出すように設計された。エクソン３を含む１．２ｋｂのゲノム領域は、ｌｏｘＰ配列のペアで挟みこんだ対応するゲノム配列に置き換えられた。ＦＲＴ配列のペアで挟み込んだネオマイシン耐性遺伝子カセットもエクソン３の下流に挿入された。相同組換えのために、ロングアームとショートアーム（それぞれ５．４ｋｂと２．３ｋｂ）が追加された。すべてのゲノム配列はＢＡＣクローンＲＰ２３－４６Ｄ１２から増幅された。チミジンキナーゼプロモーター下のジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴＡ）をネガティブセレクションに使用した。ターゲティング構築物を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊに由来するマウスブルース－４ＥＳ細胞にエレクトロポレーションした。２００μｇ／ｍｌのＧ４１８で選択した後、ターゲットに成功したＥＳクローンをＰＣＲでスクリーニングした。相同組換えは、２つの外部プローブ（ＳｐｅＩ消化されたゲノムＤＮＡに対する５’および３’プローブ）と内部プローブ（ＥｃｏＲＶ消化されたゲノムＤＮＡに対するＮｅｏプローブ）を使用したサザンブロット分析によってさらに確認された。次に、陽性ＥＳクローンをＢａｌｂ／ｃ胚盤胞に注入して、キメラマウスを得た。生殖系列伝達は、キメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配することによって確立され、得られたヘテロ接合ファウンダーマウスは、ＣＡＧプロモーターの制御下でＦｌｐ－リコンビナーゼを発現するＣＡＧ－ＦＬＰマウスとさらに交配され、ＦＲＴサイト側のネオマイシン耐性遺伝子カセットを切除した。ＰＣＲによるネオマイシン耐性遺伝子カセットの除去を確認した後、得られたＬａｔ１ｆｌマウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝的背景で維持された。
　Ｌａｔ１遺伝子の条件付きノックアウトでは、Ｌａｔ１ｆｌマウスを以下のトランスジェニックマウスと交配した。ＣＡＧプロモーター（Ｂ６Ｎ．ＦＶＢ（Ｃｇ）－Ｔｇ（ＣＡＧ－ｒｔＴＡ３）４２８８Ｓｌｏｗｅ／Ｊ）［１９］の制御下でリバーステトラサイクリン制御トランスアクチベーター３（ｒｔＴＡ３）を発現するＣＡＧ－ｒｔＴＡ３マウス、およびテトラサイクリン応答性プロモーターの制御下でＣｒｅリコンビナーゼを発現するＴｅｔＯ－Ｃｒｅマウス（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ｔｅｔＯ－ｃｒｅ）１Ｊａｗ／Ｊ）［２０］は、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。内皮細胞特異的Ｔｅｋプロモーター／エンハンサー（Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｔｅｋ－ｃｒｅ）１Ｙｗａ）［２１］の下でＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を発現するＴｅｋ－Ｃｒｅマウスは、理化学研究所バイオリソースセンターから購入した。Ｔｅｋプロモーターの雌性生殖細胞系列におけるｆｌｏｘｅｄ　Ｌａｔ１対立遺伝子の非細胞特異的削除を回避するために［２２］、Ｔｅｋ－Ｃｒｅ陽性の雌マウスは交配に使用されなかった。ジェノタイピングＰＣＲは、ＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）により、テールチップから抽出されたゲノムＤＮＡを使用して行われた。ＣＡＧ－ｒｔＴＡ３、ＴｅｔＯ－Ｃｒｅ、およびＴｅｋ－Ｃｒｅトランスジーンは、それらのリソースによって提供されるプロトコルによって分析された。Ｌａｔ１遺伝子の野生型対立遺伝子とｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子は、
Ｆｗ（５’－ＴＡＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＧＣ－３’）、Ｒｖ（５’－ＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＡＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＧＧ－３’）のプライマーによって区別された。Ｌａｔ１遺伝子のｆｌｏｘｅｄ対立遺伝子とノックアウト対立遺伝子は、
Ｆｗ（５’－ＧＴＴＴＣＣＡＧＴＣＴＧＧＣＡＴＣＴＴＴＡＡＧＴＡＧ－３’）、
Ｒｖ（５’－ＣＣＣＴＧＴＧＣＴＣＡＧＡＣＡＧＡＡＡＴＧＡＧＡ－３’）のプライマーによって区別された。
免疫染色
　組織切片の免疫組織化学および免疫蛍光法は、以前に記載されたように実施した［２３］。
リアルタイムＰＣＲ
　ＨＵＶＥＣおよびマウス大動脈由来のトータルＲＮＡは、それぞれＩｓｏｇｅｎ　ＩＩ（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ）およびＡｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＲＮＡｄｖａｎｃｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して抽出した。定量的リアルタイムＰＣＲは、以前報告の通りに実施した［２３］。
ウエスタンブロッティング
　ＨＵＶＥＣの全細胞溶解物は以前の報告の通りに調製した［２４］。粗膜画分を以前のように調製し［２５］、１％ＮＰ－４０を用いて氷上で３０分間可溶化した。Ｌａｅｍｍｌｉバッファーと混合した後、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウエスタンブロット分析を行った［２４］。抗体処理されたＰＶＤＦメンブレンは、ＥＣＬプライムウエスタンブロッティング検出システムで化学発光させ、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｍａｇｅｒ　６８０（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって画像化された。
実施例１：ヒト膵がん組織の腫瘍内血管におけるＬＡＴ１の発現
　ヒト膵がん組織の腫瘍内血管におけるＬＡＴ１の発現を調べた。ＬＡＴ１の発現上昇は、膵管腺がん（ＰＤＡ）を含むさまざまな組織起源のがんで報告されている［１３、１４］。これと一致して、ＬＡＴ１の高発現は、免疫組織化学においてＰＤＡ組織のがん細胞で検出された（図１左図）。興味深いことに、内皮細胞マーカーＣＤ３４が陽性である間質の血管内皮細胞におけるＬＡＴ１の有意な発現を認めた。対照的に、正常な膵臓組織の内皮細胞は、ＬＡＴ１染色に対してほとんど陰性であった。この観察は、組織マイクロアレイ上の多数のサンプルで確認された（図１右図）。正常な膵臓組織のごく一部（２５．０％）のみが内皮細胞で陽性のＬＡＴ１染色を示した。分析された２０の組織スポットのうち、４つは低から中程度を示し、１つは強い染色を示した。対照的に、ＰＤＡ組織の大部分（８１．４％）は、内皮細胞でＬＡＴ１発現を示した。分析された７５の組織スポットのうち、２６は低から中程度を示し、３５は強い染色を示した。
図１左図：膵管腺がん（ＰＤＡ）および正常膵臓におけるＬＡＴ１およびＣＤ３４の免疫組織化学。ＣＵ１３７２－３５－３５００６（ＰＤＡ）およびＣＵ２００９／０２　Ｘ－４０（通常の膵臓）の代表的な画像が示されている。矢印と矢頭は、それぞれ腫瘍細胞と内皮細胞を示す。黒い四角；拡大画像である。
図１右図：ＰＤＡおよび正常な膵臓を含む組織マイクロアレイにおける内皮ＬＡＴ１発現。組織スポットは、内皮細胞のＬＡＴ１染色強度に応じて、高、低／中、および陰性に分類される。表示されているデータは、各グループのパーセンテージである。
　腫瘍関連血管におけるＬＡＴ１の発現は、無胸腺ヌードマウスのヒトがん細胞異種移植腫瘍モデルでさらに調べた。ヒトＬＡＴ１を高発現しているがん細胞に囲まれた血管でマウスＬＡＴ１を検出するために、マウスＬＡＴ１特異的抗体を生成した。得られた抗体を用いて、膵臓がんＭＩＡ　ＰａＣａ－２細胞腫瘍のＣＤ３４陽性内皮細胞でマウスＬＡＴ１が検出された。対照的に、ＬＡＴ１の発現が以前に報告されている脳毛細血管を除く正常組織の血管では、明確なＬＡＴ１染色は検出されなかった［２６、２７］。したがって、腫瘍関連血管の内皮細胞におけるＬＡＴ１の発現は、異なる組織起源の異種移植腫瘍モデルで再現された。
実施例２：ＪＰＨ２０３投与による腫瘍内造成血管の抑制
内皮ＬＡＴ１の遺伝的および薬理学的阻害は血管新生および腫瘍増殖を抑制する
　ＬＡＴ１阻害剤ＪＰＨ２０３が異種移植腫瘍の増殖を抑制することが証明されている［１６、２８－３１］。本実施例ではＪＰＨ２０３の静脈内投与により、ＭＩＡ　ＰａＣａ－２異種移植腫瘍の増殖が劇的に抑制されることを再確認した上で、ＪＰＨ２０３の腫瘍血管形成への作用を測定した（図２左）。腫瘍内血管密度はＪＰＨ２０３処理腫瘍ではプラセボ処理対照の約４５％に減少し（図２右）、これにより、腫瘍血管新生の減少がＪＰＨ２０３の抗腫瘍効果に寄与していると推測できる。
実施例３：血管内皮特異的ＬＡＴ１ノックアウトマウスにおける腫瘍増大に及ぼすＪＰＨ２０３の抑制効果
　次に、内皮ＬＡＴ１の枯渇が腫瘍の血管新生を抑制し、その結果、腫瘍の成長を抑制するかどうかを調べた。Ｂ１６－Ｆ１０マウスメラノーマ細胞の同所性同系腫瘍モデルでは、ＬＡＴ１の発現が腫瘍関連内皮細胞と腫瘍細胞で確認された（図３上中央図：ｎ＝４）。腫瘍がＬａｔ１ｆｌ／ｆｌ／Ｔｅｋ－Ｃｒｅマウスで作成された場合、成長は対照マウスと比較して大幅に抑制された（図３）。腫瘍内血管密度の分析により、Ｌａｔ１ｆｌ／ｆｌ／Ｔｅｋ－Ｃｒｅマウスでは腫瘍の血管面積が対照マウスの約５０％に減少したことが明らかになった（図３上中央図）。これらの結果は、腫瘍関連内皮細胞のＬＡＴ１が腫瘍血管新生に重要な役割を果たしていること、およびその機能または発現の抑制が抗腫瘍効果の発揮に寄与していることを示している。図３下左図は、静脈内注射されたＦＩＴＣ－デキストランによって視覚化された腫瘍内血管を示す。図３下右図は、腫瘍切片の血管面積を定量化したものである。
実施例４：血管内皮細胞の増殖におけるＬＡＴ１遺伝子欠失、ＬＡＴ１阻害の効果
　ＨＵＶＥＣにおけるＬＡＴ１タンパク質の発現は、ウエスタンブロッティングによって確認された（図４－１左上）。ＬＡＴ１タンパク質量をコントロールの１５～２５％に減少させたｓｉＲＮＡによるＬＡＴ１のノックダウン（ＫＤ）は、ＨＵＶＥＣの増殖を抑制した（図４－１右上）。同様に、ＪＰＨ２０３またはＢＣＨによるＬＡＴ１阻害は、濃度依存的にＨＵＶＥＣの増殖を抑制した（図４－１下図）。これらの結果は、ＬＡＴ１が内皮細胞の増殖に重要な役割を果たすことを示している。
　アミノ酸はセリン／スレオニンキナーゼ複合体ｍＴＯＲＣ１（Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ　Ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ　Ｃｏｍｐｌｅｘ １）を活性化する必須のシグナル伝達分子であり、栄養素と増殖因子のシグナル伝達を統合して細胞の成長と増殖をサポートする［３２］。ｍＴＯＲＣ１の最もよく特徴付けられた下流エフェクターには、翻訳開始のレギュレーターであるリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼｐ７０Ｓ６Ｋが含まれる。アミノ酸欠乏下での非アミノアシル化ｔＲＮＡの蓄積は、一般的なアミノ酸制御（ＧＡＡＣ）経路として知られている他のシグナル伝達経路も活性化する［３３、３４］。非アミノアシル化ｔＲＮＡは、ＧＡＡＣ経路のＧｃｎ２キナーゼを活性化し、ｅＩＦ２αのリン酸化を誘導し、イニシエーターメチオニルｔＲＮＡのリボソームへの動員を阻害することにより、翻訳のグローバルなダウンレギュレーションを引き起こす。図４－２に示すように、ＨＵＶＥＣにおけるＪＰＨ２０３によるＬＡＴ１阻害およびＬＡＴ１　ＫＤは、ｐ７０Ｓ６Ｋおよびその基質リボソームタンパク質Ｓ６のリン酸化を著しく低下させた。ｅＩＦ２αのリン酸化も増加し、アミノ酸欠乏によるＧＡＡＣ経路の活性化を示している。まとめると、これらの結果は、ＨＵＶＥＣにおけるＬＡＴ１を介したアミノ酸輸送が、翻訳開始を活性化するための不可欠な前提条件であることを示している。内皮ＬＡＴ１の阻害は、ｍＴＯＲＣ１活性を抑制し、ＧＡＡＣ経路を活性化することにより、翻訳をグローバルにダウンレギュレートできる。
実施例５：がん細胞から分泌される血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ－Ａによる細胞内シグナル伝達経路の活性化に対するＪＰＨ２０３の抑制効果
　図５左図に示すように、ＶＥＧＦ－Ａによる飢餓状態のＨＵＶＥＣの刺激は、２０分でＶＥＧＦＲ２リン酸化の一時的な増加をもたらした。リン酸化は、より長いインキュベーション時間（＞１時間）で減少したが、刺激前よりも高いレベルで維持された。Ｅｒｋ１／２、Ａｋｔ、ｐ３８、Ｓｒｃ、ＦＡＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、およびＳ６リボソームタンパク質を含むＶＥＧＦ－Ａ／ＶＥＧＦＲ２の主要な下流因子も、比較的遅延した応答を示すＰＬＣγを除いて、リン酸化において同様の一時的な時間経過を示した。ＪＰＨ２０３は、ｐ７０Ｓ６ＫとＳ６を除いて、ＶＥＧＦＲ２のリン酸化と下流因子に影響を与えなかった。ｐ７０Ｓ６ＫとＳ６のリン酸化は、刺激後２０分でＪＰＨ２０３によって大幅に抑制され、ｍＴＯＲＣ１のＶＥＧＦ－Ａ誘発活性化がＬＡＴ１に大きく依存していることが明らかになった。特に注目すべきは、ｍＴＯＲＣ１の上流に位置するＴｈｒ３０８でのＡｋｔのリン酸化［３２］が、ＪＰＨ２０３の影響を殆ど受けなかったことである。したがって、ｍＴＯＲＣ１活性の低下は、ＲＴＫ－ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ軸とは無関係にｍＴＯＲＣ１をリソソーム表面に動員し、キナーゼ活性化因子Ｒｈｅｂとの相互作用を促進するＲａｇｕｌａｔｏｒ－Ｒａｇ複合体によって媒介されるアミノ酸シグナル伝達の減少が原因である可能性が最も高い［３２］。
図５の左図：血清および成長因子の飢餓状態におかれたＨＵＶＥＣは、ＪＰＨ２０３（５０μＭ）の存在下または非存在下でＶＥＧＦ－Ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激された。
　血管新生において主要な役割を果たすＶＥＧＦ－Ａ／ＶＥＧＦＲ２の下流では、Ｅｒｋ１／２、Ａｋｔ、ｐ３８、Ｓｒｃ、ＦＡＫ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＬＣγなどの主要なエフェクター分子が、血管内皮細胞の増殖／生存／透過性／遊走などを制御している。既に上に述べたようにＪＰＨ２０３により抑制されたｍＴＯＲＣ１は、Ａｋｔの下流でこれらの細胞機能の制御に関与している。
考察
　この研究では、腫瘍血管内皮細胞で発現するアミノ酸トランスポーターＬＡＴ１が腫瘍血管新生の新しい重要な分子であることを明らかにした。ラット膀胱がんモデル［３５］とヒト神経膠腫組織［３６］に関するこれまでの限られた研究を拡張し、腫瘍血管内皮細胞の一般的な特徴としてＬＡＴ１発現上昇を確立した。内皮ＬＡＴ１と腫瘍血管新生の機能的関連性は、ＬＡＴ１の遺伝子ノックアウトおよび薬理学的阻害により、ｉｎ　ｖｉｖｏモデルで実証された（図２及び３）。翻訳のグローバルなダウンレギュレーションによってサポートされる強力な抗増殖効果は、内皮ＬＡＴ１阻害により、タンパク質合成のビルディングブロックとしてのアミノ酸の供給をブロックするだけでなく、翻訳の開始を制御するアミノ酸シグナル伝達を妨害することによっても達成できる。このような翻訳に対する強力な阻害効果はＬＡＴ１阻害剤に特有であり、ＬＡＴ１阻害剤の作用機序と既存の抗血管新生剤の作用機序を明確に区別するものである。
　抗血管新生療法に対する内因性および獲得性の耐性は、患者の利益を制限することがよくある［１、２］。内皮細胞に存在する複数の冗長で代償性の血管新生促進シグナル伝達経路は、耐性において重要な役割を果たすと考えられている。耐性を克服するための有望な戦略は、複数のシグナル伝達経路を同時に標的とすることである。実際に、マウス腫瘍モデルにおけるＦＧＦＲ阻害剤とベバシズマブの組み合わせは、腫瘍増殖をほぼ完全に抑制した［３７］。膵島マウス腫瘍では、ＶＥＧＦＲ２阻害剤に対する耐性は、可溶性デコイＦＧＦ受容体によって抑制された［３８］。本研究では、ｉｎ　ｖｉｖｏでの血管新生と同様に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの遊走や管腔形成などの血管新生に関連する細胞プロセスで重要な役割を果たすｍＴＯＲＣ１のＶＥＧＦ－Ａ依存性活性化にＬＡＴ１が不可欠であることを実証した［３９－４２］。この結果は、ｍＴＯＲＣ１の活性化におけるＬＡＴ１の役割が、ＲＴＫ－ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ軸とは独立したＲａｇｕｌａｔｏｒ－Ｒａｇ複合体によって媒介されることを示唆している。ＬＡＴ１を介したアミノ酸シグナル伝達は、「ゲート制御」シグナルとして振る舞い、血管新生促進性ＶＥＧＦ－Ａシグナル伝達がｍＴＯＲＣ１を介してその下流に流れることを可能にする（図６）。ＶＥＧＦＲシグナル伝達と同様に、ＦＧＦＲおよびＴＩＥ－２を含む他の複数の血管新生促進ＲＴＫは、ｍＴＯＲＣ１を活性化するＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ軸を共有する［４３］。したがって、ＪＰＨ２０３によるＬＡＴ１の治療的阻害は、ＶＥＧＦ－Ａ／ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達だけでなく、ｍＴＯＲＣ１における他の血管新生促進シグナル伝達経路にも同時に干渉する可能性があり、血管新生促進成長因子シグナリングの代償機能から生じる耐性を回避する可能性を提供する。
　ＬＡＴ１は腫瘍細胞の成長と増殖をサポートするために非常に広くアップレギュレートされる「腫瘍細胞型トランスポーター」としてよく知られているが、ここでの実施例は、腫瘍細胞と間質内皮の両方における腫瘍進行におけるＬＡＴ１の二重機能への新しい洞察を示している。この点で、抗腫瘍剤としてのＬＡＴ１阻害剤ＪＰＨ２０３のユニークな二重作用機序、すなわち、腫瘍細胞におけるＬＡＴ１の阻害を介した腫瘍細胞への確立された直接的な抗増殖効果および内皮ＬＡＴ１の阻害による血管新生効果が強調される。魅力的な推測は、他の抗血管新生剤と組み合わせた場合、ＬＡＴ１阻害剤の投与により、腫瘍細胞におけるタンパク質合成のダウンレギュレーションを通じて、腫瘍細胞からの血管新生促進因子の代償性パラクリン分泌が抑制されることである。したがって、ＬＡＴ１阻害剤と抗血管新生剤の併用療法は、耐性を発現するリスクが低く、有益な相乗的な抗腫瘍効果を示す可能性がある。
　いくつかの証拠により、腫瘍血管内皮細胞は、特徴的なタンパク質の発現において正常組織の血管内皮細胞とは異なることが示されている［４４－４６］。ここでの実施例は、ＬＡＴ１発現の増加もこのような腫瘍内皮特異的特性の一部であることを示している。腫瘍組織だけでなく、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＨＵＶＥＣ培養や、ＶＥＧＦ－ＡおよびＦＧＦ－２が培地に補充されたｅｘ／ｉｎ　ｖｉｖｏ血管新生アッセイにおける内皮細胞でも、内皮ＬＡＴ１発現を検出した。これらの血管新生促進因子は、ＨＵＶＥＣにおけるＬＡＴ１の発現を誘導した。ＬＡＴ１が発がん性ｃ－Ｍｙｃの直接的な標的遺伝子であることが以前に報告されている［４７、４８］。個体発生では、内皮細胞におけるｃ－Ｍｙｃの発現はＶＥＧＦＲ２［４９］とＦＧＦＲ［５０］によって調節されている。詳細を解明するためにさらなる研究が待たれるが、ＶＥＧＦ－ＡおよびＦＧＦ－２が豊富な腫瘍微小環境は、腫瘍血管内皮におけるＬＡＴ１の発現上昇を部分的に説明している可能性がある。ＬＡＴ１はがん胎児タンパク質の一つで、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）はＬＡＴ１遺伝子／タンパクが残存している健常細胞と考えられる。細胞機能の調節維持におけるシグナル伝達系はがん細胞でのシグナル伝達と類似した性質があることががん細胞の研究に応用される所以である。
実施例６
　以上の細胞やモデル動物からの知見が臨床でも認められるので、その結果を実施例として示す。表２に標準的化学療法が不応あるいは不耐となった種々の進行性固形がん患者を対象としたＪＰＨ２０３の第１相臨床試験［５１］で認められた新病変（初発のがん以外の臓器への転移病変）をまとめた。上述したように、ＬＡＴ１の阻害剤のＪＰＨ２０３はＮＡＴ２で代謝されてＮ－アセチルＪＰＨ２０３という代謝物になるとＬＡＴ１の阻害活性が低下して抗がん効果が減弱される。表２には第I相試験に組み入れられた全１６例を、ＮＡＴ２での代謝が早いＲａｐｉｄタイプ（８症例）とＮｏｎ－ｒａｐｉｄタイプ（８症例）に分けて、新病変の発症症例数と新病変発症部位に分けて記載した。ＮＡＴ２のＲａｐｉｄタイプでは８例中７例に新病変を認め、Ｎｏｎ－ｒａｐｉｄタイプでは８例中４例に新病変を認めた。特に、血管網で占められている肺への新病変はＲａｐｉｄでは７例中５例、Ｎｏｎ－ｒａｐｉｄでは４例中１例であった。腫瘍血管新生へのＪＰＨ２０３の関連性を明らかにする本明細書の実施例として重要である。即ち、進行性固形がん患者の肺での新病変発現は、Ｒａｐｉｄの５例に比してＮｏｎ－ｒａｐｉｄでは１例と明らかな差異が認められた。
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 ・ＪＰＨ２０３の作用（ＮＡＴ２のＮｏｎ－ｒａｐｉｄ＞Ｒａｐｉｄ顕著な例）としては転移抑制作用がある（７ｖｓ４）
・肺転移はＪＰＨ２０３により５倍強く抑制される（５ｖｓ１）
・ＪＰＨ２０３の腫瘍血管新生抑制作用の関与が大きい。
　肺はその大半が血管網で形成され、血流の豊富な臓器である。全身で発症したがん種の終末期には多くのがん細胞が血行性に肺に集積し新病変（転移巣）を形成する。国際的な治験の評価にはＲＥＣＩＳＴの基準が採択されて、新病変が認められると治験はＰＤ（進行がん）と判断されて（初発のがんの大きさの増大変化には切り離して）中止される。表２の新病変無しの計５例が治験続行となった。表２のＲａｐｉｄタイプの新病変無の１例は腫瘍の増大が明らかで、中断された。一方、Ｎｏｎ－ｒａｐｉｄタイプの新病変無の全４例は治験が続行された。
　ＲａｐｉｄタイプではＪＰＨ２０３の奏効無（無効）と判定されたが、Ｎｏｎ－ｒａｐｉｄタイプでは肺の新病変を示した１例以外はＪＰＨ２０３の奏功性の評価が行われた。換言すれば、ＪＰＨ２０３の奏功性を予測できる一つの可能性は肺転移の抑制である可能性が高いと考えられた。以上より、ＪＰＨ２０３は腫瘍血管新生の阻害効果は一つの抗がん作用であると結論された。
　要約すると、アミノ酸トランスポーターＬＡＴ１が腫瘍内皮で発現上昇し、腫瘍血管新生に基本的な役割を果たすことを示している。ＬＡＴ１を介したアミノ酸シグナル伝達と成長因子依存性血管新生シグナル伝達の間のクロストークが明らかになり、栄養素感知ハブキナーゼｍＴＯＲＣ１が血管新生を制御している。ＬＡＴ１標的療法は、特に現在の抗血管新生療法によるがん治療を強化するための理想的なオプションを提供する可能性がある。図７には、腫瘍組織に及ぼすＪＰＨ２０３の薬理作用の要約を示す。
　本発明により、以下の効果が期待できる。
・腫瘍に好都合な腫瘍内環境（正常血管の異常化と低酸素の維持）をＪＰＨ２０３により破壊し、正常血管の育成を図る。
・血流に富んだ正常組織内へのがん細胞の転移とがん細胞の増殖を阻止できる。
・がんを一定の限局した状態に閉じ込め、局所的な抗がん剤の送達を可能にする抗がん効果を促進させる。
参考例：抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体とＪＰＨ２０３等との組合せ
　抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体とＪＰＨ２０３等との組合せが、これら薬剤をそれぞれ単独で投与する場合と比べて顕著な抗がん効果を奏することを示す実験データを図８に示す。この図は、腫瘍を有するマウス（個体数：４）に、ＪＰＨ２０３を一日に一回１２．５ｍｇ／ｋｇ投与した場合、抗ＰＤ－１抗体を一週間に一回６．２５ｍｇ／ｋｇ投与した場合、及びこれらを組み合わせた場合（すなわち、ＪＰＨ２０３を一日に一回１２．５ｍｇ／ｋｇ投与し、かつ、抗ＰＤ－１抗体を一週間に一回６．２５ｍｇ／ｋｇ投与した場合）の腫瘍体積の変化を示す。図に示されるように、ＪＰＨ２０３の投与と抗ＰＤ－１抗体の投与とを組み合わせた場合、それぞれを単独で投与した場合と比べて、腫瘍体積が顕著に減少する。
　本発明のがんの治療剤により、副作用がなく効果の高い、特に、正常細胞への影響が少ない治療剤を提供できる。
ヒト膵がん組織の腫瘍内血管におけるＬＡＴ１の発現を示す図である。がん組織内のＣＤ３４陽性細胞にはＬＡＴ１の発現が認められる。同じヒトの正常膵組織内ＣＤ３４陽性血管内皮細胞にはＬＡＴ１の発現は認めない。右のグラフは血管内皮細胞での正常と膵がん内皮細胞でのＬＡＴ１染色の定量結果を示す。がん組織内でのＬＡＴ１陽性細胞は高値を示す。 ＪＰＨ２０３投与による腫瘍内新生血管の抑制を示す図である。血管内皮細胞マーカーＣＤ３４の無処置（対照）群のがん組織内血管数はＪＰＨ２０３処置により有意に減少した。 血管内皮特異的ＬＡＴ１ノックアウトマウスにおける腫瘍増大抑制効果を示す図である。マウスに移植したＬＡＴ１遺伝子発現腫瘍の増大はＬＡＴ１遺伝子ノックダウン（破壊）によって有意な増殖抑制が認められた。 腫瘍血管内皮細胞の増殖におけるＬＡＴ１遺伝子欠失、ＬＡＴ１阻害の効果を示す図である。腫瘍血管内皮細胞の増殖は各処置によって有意に抑制された。 ＬＡＴ１　ＫＤおよびＪＰＨ２０３のｍＴＯＲＣ１－およびＧＡＡＣ経路への影響を示す。 がん細胞から分泌される血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ－Ａによる細胞内シグナル伝達経路のＪＰＨ２０３の抑制を示す図である。 ＪＰＨ２０３による血管形成誘導シグナルの抑制を示す図である。ＬＡＴ１を介するアミノ酸シグナルは、アミノ酸供給量をモニターして、血管成長因子のｍＴＯＲＣ１通過を許可する（“ｇａｔｉｎｇ”制御）。ＪＰＨ２０３は、ＬＡＴ１を介するアミノ酸の細胞内輸送を抑え、ｍＴＯＲＣ１活性化に血管内皮成長因子の刺激より優位に作用し、血管内皮成長因子からの刺激がｍＴＯＲＣ１に入っても、そこで遮断する。 腫瘍組織に及ぼすＪＰＨ２０３の薬理作用の要約を示す図である。がん細胞に特異的に発現するＬＡＴ１をＪＰＨ２０３が抑制する抗がん効果は既に周知の事実であるが、本発明は腫瘍内異常血管内皮細胞にもＬＡＴ１が発現している事の発見に起因し、腫瘍組織の二つの異なる部位に存在するＬＡＴ１分子の機能阻害によるＪＰＨ２０３の抗がん効果はがんの増殖と転移の両面の抑制に作用する。 腫瘍を有するマウスに、ＪＰＨ２０３及び抗ＰＤ－１抗体を、それぞれ単独でまたは組み合わせて投与した場合の腫瘍体積の変化を示す。
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Claims (10)

  1. 　Ｌ型アミノ酸トランスポーター１（ＬＡＴ１）阻害剤を含む、腫瘍内異常血管内皮細胞に発現するＬＡＴ１を介したアミノ酸の細胞内輸送を抑えることにより、がん細胞の増殖及び／または転移を抑制することを特徴とする、がんの治療剤。
  2. 　ＬＡＴ１阻害剤が、腫瘍血管新生抑制剤として作用する、請求項１に記載の治療剤。
  3. 　がんにおける腫瘍新生血管にＬＡＴ１が存在する、請求項１または２に記載の治療剤。
  4. 　がんが、結腸がん、直腸がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、膵臓がん、胆道がん、食道がん、大腸がん、前立腺がん、膀胱がん、脳腫瘍、胃がん、肝臓がん、皮膚がん、絨毛がん、腎がん、頭頚部がん、舌がん、骨髄腫、胸腺腫、中皮腫、下垂体腫瘍、転移性がん、及び浸潤がんからなる群から選択される、請求項１～３のいずれかの請求項に記載の治療剤。
  5. 　がんが肺がんである、請求項４に記載の治療剤。
  6. 　がんが膵がんである、請求項４に記載の治療剤。
  7. 　免疫チェックポイント阻害薬の奏効性を上昇させるための薬剤となる、請求項１～６のいずれかの請求項に記載の治療剤。
  8. 　ＬＡＴ１阻害剤が、Ｏ－（５－アミノ－２－フェニルベンズオキサゾール－７－イル）メチル－３，５－ジクロロ－Ｌ－チロシンである、請求項１～７のいずれかの請求項に記載の治療剤。
  9. 　ＬＡＴ１阻害剤を含む、腫瘍血管新生抑制剤。
  10. 　ＬＡＴ１阻害剤が、Ｏ－（５－アミノ－２－フェニルベンズオキサゾール－７－イル）メチル－３，５－ジクロロ－Ｌ－チロシンである、請求項９に記載の腫瘍血管新生抑制剤。
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