WO2022078536A1 - Substance combination for inhibiting viral cysteine proteases - Google Patents

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WO2022078536A1
WO2022078536A1 PCT/DE2021/000142 DE2021000142W WO2022078536A1 WO 2022078536 A1 WO2022078536 A1 WO 2022078536A1 DE 2021000142 W DE2021000142 W DE 2021000142W WO 2022078536 A1 WO2022078536 A1 WO 2022078536A1
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Monika Aparecida CORONADO
Raphael Josef EBERLE
Dieter Willbold
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Forschungszentrum Jülich GmbH
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    • A61K31/473—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. acridines, phenanthridines

Definitions

  • FIG. 4 shows a number of fluorescence spectra of SARS-CoV-2 3CL per , which were recorded under the influence of different substance concentrations of suramin (Graph A) and quinacrine (Graph C).
  • FIG. 4 also shows binding saturation curves created for this purpose in order to determine the respective dissociation constant KD.
  • the abscissas (X axes) of the fluorescence spectra indicate the wavelengths in nm at which the fluorescence intensities were measured.
  • the arrow running from top to bottom in graphs A and C in FIG. 4 indicates the associated added substance concentration (0 to 48 pmol/L) of the active substance quinacrine/suramin for the individual fluorescence spectra recorded.
  • the ordinates (Y-axes) indicate the respectively measured fluorescence intensities in relative fluorescence units.
  • the arrows marked with an asterisk, which run parallel to the abscissa in graphs A and C, indicate the shift in the fluorescence maximum caused by the active substance.
  • FIG. 4 Graph C Fluorescence spectrum of SARS-CoV-2 3CL pro under the influence of quinacrine titration. Quinacrine causes a “blue edge excitation shift” of the visible Trp (*).
  • FIG. 4 Graph D A KD value could be determined with the aid of a binding saturation curve and a modified Hill equation SARS-CoV-2 3CL per -quinacrine interaction.

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Abstract

The present invention relates to a combination of the substances suramin and quinacrine for inhibiting viral cysteine proteases, more particularly for inhibiting viral 3CL proteases, and the use of said combination of substances for producing an inhibitor for viral cysteine proteases, more particularly 3CL proteases. The invention further relates to a combination of substances for treating a viral infection in an organism, more particularly for treating an infection with viruses from the coronaviridae family, and to the combination of substances as medication in the treatment of viral infections, more particularly to the treatment of an infection with viruses of the coronaviridae family.

Description

Beschreibung description
Stoffkombination zur Inhibierung von viralen Cysteinproteasen Combination of substances to inhibit viral cysteine proteases
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Stoffkombination aus Suramin und Quinacrin zur Inhibierung von viralen Cysteinproteasen, insbesondere zur Inhibierung von viralen 3CL Proteasen, sowie die Verwendung dieser Stoffkombination zur Herstellung eines Inhibitors für virale Cysteinproteasen, insbesondere 3CL Proteasen. The present invention relates to a substance combination of suramin and quinacrine for inhibiting viral cysteine proteases, in particular for inhibiting viral 3CL proteases, and the use of this substance combination for producing an inhibitor for viral cysteine proteases, in particular 3CL proteases.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine Stoffkombination zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae, sowie auf die Stoffkombination als Arzneimittel in der Behandlung von viralen Infektionen, insbesondere zur Behandlung einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae. The invention further relates to a combination of substances for treating a viral infection in an organism, in particular for treating an infection with viruses from the Coronaviridae family, and to the combination of substances as a medicament in the treatment of viral infections, in particular for treating an infection with viruses from the Coronaviridae family.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Stoffkombination als Arzneimittel sowie zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae, und weiterhin auf ein Verfahren zur Behandlung von viralen Infektionen, insbesondere von Infektionen mit Viren aus der Familie der Coronaviridae. In addition, the invention relates to the use of this combination of substances as a medicament and for the treatment of a viral infection in an organism, in particular for the treatment of an infection with viruses from the Coronaviridae family, and furthermore to a method for the treatment of viral infections, in particular infections with viruses from the Coronaviridae family.
Stand der Technik State of the art
Suramin und Quinacrin sind bekannte Substanzen, die bereits als Arzneistoffe zugelassen sind. Suramin wird beispielsweise unter den Handelsnamen Antrypol®, Belganyl®, Fourneau 309®, Germanin® Moranyl®, Naganol®, Naginin® vertrieben und eingesetzt. Quinacrin wird beispielsweise unter dem Handelsnamen Mepacrin eingesetzt. Suramin and quinacrine are known substances that are already approved as medicinal substances. Suramin is marketed and used, for example, under the trade names Antrypol®, Belganyl®, Fourneau 309®, Germanin® Moranyl®, Naganol®, Naginin®. For example, quinacrine is used under the trade name mepacrine.
Für Suramin sind unterschiedliche Anwendungsgebiete bekannt. So wird es beispielsweise, als Antiprotozoikum gegen die Schlafkrankheit und Onchozerkose eingesetzt. Außerdem ist es bekannt als Therapeutikum gegen HIV, verschiedene Krebsarten und Autismus. Different areas of application are known for suramin. For example, it is used as an antiprotozoal against sleeping sickness and onchocerciasis. It is also known as a therapeutic agent against HIV, various types of cancer and autism.
Quinacrin, synonym auch als Mepacrin bezeichnet, wurde in der Vergangenheit zur Malariaprophylaxe verwendet. Derzeit wird es beispielsweise bei Gardia- und Protozoen Infektionen eingesetzt. Quinacrine, synonymously referred to as mepacrine, was used in the past for malaria prophylaxis. It is currently used, for example, in Gardia and protozoan infections.
Der genaue Wirkungsmechanismus von Suramin auf den bisher bekannten Anwendungsgebieten ist nicht bekannt. Ein wichtiger Effekt scheint jedoch die Hemmung von Enzymen zu sein, die an der Oxidation des reduzierten Nikotinamid-Adenin-Dinukleotids (NADH) beteiligt sind, das bei vielen zellulären Reaktionen wie Atmung und Glykolyse als Coenzym fungiert. Suramin kann als Antagonist von P2-Rezeptoren und DNA/RNA bindenden Proteinen wirken oder als Agonist von Ryanodin-Rezeptoren. Es kann auch follikelstimulierende Hormonrezeptoren hemmen. The exact mechanism of action of suramin in the previously known areas of application is not known. However, an important effect appears to be the inhibition of enzymes involved in the oxidation of reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), which acts as a coenzyme in many cellular reactions such as respiration and glycolysis. Suramin can act as an antagonist of P2 receptors and DNA/RNA binding proteins or as an agonist of ryanodine receptors. It can also inhibit follicle-stimulating hormone receptors.
Suramin kann auch die Zika Virus NS2B/NS3 Protease inhibieren [12], Suramin can also inhibit Zika virus NS2B/NS3 protease [12],
Auch der genaue Wirkungsmechanismus von Quinacrin ist nicht bekannt, aber das Molekül scheint Translation und Transkription von DNA zu hemmen. Quinacrin wurde als Inhibitor der sauren Sphingomyelinase und Cholinesterase beschrieben. The exact mechanism of action of quinacrine is also unknown, but the molecule appears to inhibit translation and transcription of DNA. Quinacrine has been described as an inhibitor of acid sphingomyelinase and cholinesterase.
Suramin oder Quinacrin enthaltende Medikamente werden bis jetzt nicht gegen SARS-CoV- 2 Infektionen verwendet, allerdings konnte für Suramin [13] und Quinacrin [14] ein inhibierender Effekt gegen SARS-CoV-2 Zellkulturen beschrieben werden. Medicines containing suramin or quinacrine have not yet been used against SARS-CoV-2 infections, but an inhibitory effect against SARS-CoV-2 cell cultures has been described for suramin [13] and quinacrine [14].
Beide Substanzen sind Hauptbestandteil bekannter und zugelassener Arzneistoffe. Dadurch bedingt sind zu diesen beiden Substanzen Informationen zur Aufnahme in den Körper, pharmazeutische Parameter, Membrantransfer und Stoffkonzentrationen, die schädlich sind, bereits bekannt. Both substances are the main components of known and approved drugs. As a result, information on the absorption into the body, pharmaceutical parameters, membrane transfer and substance concentrations that are harmful is already known for these two substances.
Suramin wirkt gegen eine große Bandbreite von Parasiten, insbesondere gegen Protozoen. Durch seine extreme Giftigkeit kann es jedoch bei zu hoher Konzentration auch Körperzellen zerstören, weswegen mit erheblichen Nebenwirkungen zu rechnen ist, die aber durch strikte Handhabung der Dosierung minimiert werden können. Als Nebenwirkungen sind Übelkeit, Erbrechen, Nesselsucht, Nierenschäden, Nebennierenrindeninsuffizienz bekannt. Suramin is effective against a wide range of parasites, particularly protozoa. Due to its extreme toxicity, however, it can also destroy body cells if the concentration is too high, which is why considerable side effects are to be expected, but these can be minimized by strict handling of the dosage. Known side effects are nausea, vomiting, hives, kidney damage and adrenal insufficiency.
Für Quinacrin sind Kopfschmerzen, Schwindel und Magen-Darm-Störungen als Nebenwirkungen bekannt. Headaches, dizziness and gastrointestinal disorders are known to be side effects for quinacrine.
Zur Behandlung von viralen Infektionen, insbesondere von Infektionen mit Viren aus der Familie der Coronaviridae, wie beispielsweise SARS-CoV-2, ist es grundsätzlich wichtig, einen Arzneistoff einzusetzen, der sowohl eine komplette Bekämpfung der Infektion als auch eine gute Verträglichkeit des Arzneistoffs im zu behandelnden Organismus gewährleistet. For the treatment of viral infections, in particular infections with viruses from the Coronaviridae family, such as SARS-CoV-2, it is fundamentally important to use a drug that not only completely combats the infection but is also well tolerated by the drug treated organism guaranteed.
Darüber hinaus ist es wichtig, genaue Kenntnisse über irkmechanismen von Wirkstoffen zu gewinnen, die auf die Bekämpfung von viralen Infektionen einen Einfluss haben können. In addition, it is important to gain precise knowledge of the mechanisms of action of active ingredients that can have an impact on combating viral infections.
Aufgabe und Lösung task and solution
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Target zur Behandlung von viralen Infektionen, insbesondere von Infektionen mit Viren aus der Familie der Coronaviridae, ganz besonders von Infektionen mit SARS-COV-2 zu identifizieren und einen Wirkstoff zu diesem Target bereitzustellen und weiterhin auch einen Wirkstoff als Arzneimittel oder therapeutisches Mittel zur Behandlung von viralen Infektionen bereitzustellen. The object of the invention is to provide a target for the treatment of viral infections, in particular infections with viruses from the Coronaviridae family, especially of To identify infections with SARS-COV-2 and to provide an active substance to this target and further also to provide an active substance as a drug or therapeutic agent for the treatment of viral infections.
Die Aufgaben der Erfindung werden gelöst durch eine Stoffkombination mit den Merkmalen des Hautanspruchs sowie durch Verwendung dieser Stoffkombination und das Verfahren zur Behandlung gemäß nebengeordneter Ansprüche. The objects of the invention are achieved by a substance combination with the features of the main claim and by using this substance combination and the treatment method according to the independent claims.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Stoffkombination, der Verwendung dieser Stoffkombination und des Verfahrens ergeben sich aus den darauf rückbezogenen Ansprüchen. Advantageous configurations of the combination of substances, the use of this combination of substances and the method result from the dependent claims.
Gegenstand der Erfindung: Subject of the invention:
Die Erfindung betrifft eine Stoffkombination enthaltend Suramin und Quinacrin. Diese Kombination von zwei bekannten Wirkstoffen hat die überraschende Wirkung eines Inhibitors für virale Cysteinproteasen, insbesondere für virale 3CL Proteasen. Im Folgenden wird für die Bezeichnung Cysteinprotease synonym auch die Bezeichnung Protease verwendet. The invention relates to a combination of substances containing suramin and quinacrine. This combination of two known active substances has the surprising effect of an inhibitor for viral cysteine proteases, in particular for viral 3CL proteases. In the following, the term protease is also used synonymously for the term cysteine protease.
Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung dieser Stoffkombination zur Herstellung eines Inhibitors für virale Cysteinproteasen, insbesondere für virale 3CL Proteasen. Die Stoffkombination wirkt vorteilhaft als Inhibitor für virale Cysteinproteasen, die in Viren aus der Familie der Coronaviridae vorkommen. Hier sind insbesondere Cysteinproteasen als Target für die erfindungsgemäße Stoffkombination geeignet, die in Viren aus der Gruppe der Viren SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKLH , HCoV- NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1 , Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines-CoV, Equines-CoV, Ratten- CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1 , Truthahn -CoV, Fasanen-CoV, Drossel-CoV HKU12, Sper- lings-CoV HKU17, Bronzemännchen-CoV HKU13, IBV vorkommen. The invention therefore also relates to the use of this combination of substances for the production of an inhibitor for viral cysteine proteases, in particular for viral 3CL proteases. The combination of substances acts advantageously as an inhibitor for viral cysteine proteases that occur in viruses from the Coronaviridae family. Here, cysteine proteases are particularly suitable as a target for the combination of substances according to the invention, which are found in viruses from the group of viruses SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKLH, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1 , Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines- CoV, Equines-CoV, Rat-CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1 , Turkey-CoV, Pheasant-CoV, Thrush-CoV HKU12, Sparrow-CoV HKU17, Bronzeman-CoV HKU13, IBV occur.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Stoffkombination zur Verwendung in der medizinischen Therapie. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Stoffkombination zur Vorbeugung oder Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae, die als Wirkstoff einen Inhibitor der viralen Cysteinprotease, insbesondere einer viralen 3CL Protease, enthält, der aus einer Stoffkombination enthaltend Suramin und Quinacrin ausgewählt ist bzw. besteht. Im Rahmen der Erfindung wurde herausgefunden, dass sowohl Suramin als auch Quinacrin eine virale Cysteinprotease, insbesondere eine virale 3CL Protease, effizient hemmen können und dass eine Kombination dieser beiden Moleküle, synonym auch als Wirkstoffe oder Wirkstoffkombination bezeichnet, diesen Effekt sogar noch verbessert. The invention further relates to a combination of pharmaceutical substances for use in medical therapy. The invention also relates to the combination of substances for the prevention or treatment of a viral infection in an organism, in particular an infection with viruses from the Coronaviridae family, which contains an inhibitor of the viral cysteine protease, in particular a viral 3CL protease, as an active ingredient, which consists of a combination of substances containing suramin and quinacrine is selected. Within the scope of the invention it was found that both suramin and quinacrine can efficiently inhibit a viral cysteine protease, in particular a viral 3CL protease, and that a combination of these two molecules, also referred to synonymously as active substances or active substance combination, even improves this effect.
Unter der Bezeichnung Suramin wird im Rahmen der vorliegenden Anmeldung eine Verbindung mit folgender Strukturformel (I) verstanden:
Figure imgf000005_0001
In the context of the present application, the term suramin is understood to mean a compound with the following structural formula (I):
Figure imgf000005_0001
Suramin kann in Rahmen der Erfindung beispielsweise auch in Form eines Salzes oder anderer in Handel erhältlichen Formen eingesetzt werden. Within the scope of the invention, suramin can also be used, for example, in the form of a salt or other commercially available forms.
Unter der Bezeichnung Quinacrin wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung der folgenden Strukturformel (II) verstanden, die aus einem 1 :1 Gemisch aus einer R- Form (oben) und einer S-Form (unten) besteht:
Figure imgf000005_0002
Quinacrin kann im Rahmen der Erfindung beispielsweise in Form seiner Hydrolysate oder anderer im Handel erhältlichen Formen eingesetzt werden. In the context of the present invention, the term quinacrine is understood to mean a compound of the following structural formula (II), which consists of a 1:1 mixture of an R form (above) and an S form (below):
Figure imgf000005_0002
Within the scope of the invention, quinacrine can be used, for example, in the form of its hydrolyzates or other commercially available forms.
Basierend auf Titrationsexperimenten der erfindungsgemäßen Inhibitoren in einem spezifischen Aktivitätstest konnten die IC50 Werte von beiden Wirkstoffen sowohl einzeln als auch in Kombination bestimmt werden (siehe Figur 2). Dabei zeigte Quinacrin einen I C50 Wert von 7.8 ± 0.9 pmol/L und Suramin einen Wert von 6.3 ± 0.8 pmol/L. Durch die Kombination beider Wirkstoffe, konnte eine Reduzierung der IC50 Wert um den Faktor 10 auf 0.46 ± 0.1 pmol/L nachgewiesen werden. Based on titration experiments of the inhibitors according to the invention in a specific activity test, the IC50 values of both active substances could be determined both individually and in combination (see FIG. 2). Here, quinacrine showed an I C50 value of 7.8 ± 0.9 pmol/L and suramin a value of 6.3 ± 0.8 pmol/L. By combining both active ingredients, a reduction in the IC50 value by a factor of 10 to 0.46 ± 0.1 pmol/L could be demonstrated.
Zusätzliche Aktivitätstests, basierend auf klassischen Michaelis-Menten Annahmen, konnten zeigen, dass Quinacrin ein kompetitiver und Suramin ein nichtkompetitiver (allosterischer) Cysteinprotease Inhibitor, insbesondere 3CL Protease Inhibitor, ist (siehe Figur 3). Dabei tritt der kompetitive Inhibitor in Konkurrenz mit dem Substrat, bindet also im aktiven Zentrum. Der nichtkompetitive Inhibitor dagegen bindet an einer allosterischen Bindestelle, die weiter entfernt vom aktiven Zentrum liegen kann. Diese Bindung induziert Konformationsänderungen des Cysteinprotease Proteins, insbesondere des 3CL Proteaseproteins, die auch das aktive Zentrum beeinflussen können und so die Enzymaktivität inhibieren. Zusätzlich durchgeführte Fluoreszenz Spektroskopie Experimente konnten diese Beobachtung unterstützen. Additional activity tests, based on classic Michaelis-Menten assumptions, were able to show that quinacrine is a competitive and suramin is a non-competitive (allosteric) cysteine protease inhibitor, in particular a 3CL protease inhibitor (see FIG. 3). The competitive inhibitor competes with the substrate and thus binds in the active center. The noncompetitive inhibitor, on the other hand, binds to an allosteric binding site that may be further away from the active site. This binding induces conformational changes in the cysteine protease protein, particularly the 3CL protease protein, which can also affect the active site and thus inhibit enzyme activity. Additionally performed fluorescence spectroscopy experiments supported this observation.
Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass Quinacrin und Suramin mit unterschiedlichen Proteinbereichen der 3CL Protease interagieren und darüber hinaus unterschiedlich starke Konformationsänderungen in diesem Protein anregen. Experimental results show that quinacrine and suramin interact with different protein regions of the 3CL protease and also stimulate different degrees of conformational changes in this protein.
Die Interaktion von Quinacrin mit der SARS-CoV-2 3CL Protease führte zu einem sogenannten „blue edge excitation shift'1. Dabei bewegte sich das Fluoreszenzmaximum um 10 nm von 330 nm nach 320 nm. Diese Bewegung des Fluoreszenzmaximums geht einher mit der Bewegung der Tryptophanreste in der Cysteinprotease in eine hydrophobe Umgebung. The interaction of quinacrine with the SARS-CoV-2 3CL protease led to a so-called 'blue edge excitation shift' 1 . The fluorescence maximum moved by 10 nm from 330 nm to 320 nm. This movement of the fluorescence maximum is accompanied by the movement of the tryptophan residues in the cysteine protease into a hydrophobic environment.
Die Bindung von Suramin an die SARS-CoV-2 3CL Protease dagegen führte zu einem starken „red edge excitation shift". Dabei bewegte sich das Fluoreszenz Maximum um 30 nm von 330 nm nach 360 nm. Dieser Vorgang ist definiert durch eine erhöhte Zugänglichkeit der Tryptophanreste mit dem Umgebungsmedium und ist typisch für Konformationsänderungen in der Proteinstruktur (siehe Figur 4). The binding of suramin to the SARS-CoV-2 3CL protease, on the other hand, led to a strong "red edge excitation shift". The fluorescence maximum moved by 30 nm from 330 nm to 360 nm. This process is defined by increased accessibility of the Tryptophan residues with the surrounding medium and is typical for conformational changes in the protein structure (see Figure 4).
Die Fluoreszenz Spektroskopie Resultate unterstützen die Ergebnisse der Aktivitätstests, die belegen, dass das Suramin und Quinacrin verschiedene Typen der Enzyminhibition für die Cysteinproteasen, insbesondere 3CL Proteasen, besitzen und dadurch auch mit verschiedenen Proteinregionen interagieren. The fluorescence spectroscopy results support the results of the activity tests, which show that the suramin and quinacrine have different types of enzyme inhibition for the Cysteine proteases, especially 3CL proteases, have and thus also interact with different protein regions.
Diese Beobachtungen wurden ebenfalls durch Molekulares Docking und computerbasierte Simulationen belegt. Dabei wurde die Kristallstruktur von SARS-CoV-2 3CLpro Protease (PDB: 6M2Q) als Grundlage genommen, um den Einfluss der Quinacrin und Suramin Bindung auf die Proteinstruktur zu untersuchen. Während des Docking Prozesses wurde Quinacrin in das aktive Zentrum der Proteasestruktur gelagert und Suramin an eine Proteinregion des Dimers, das starke positive Oberflächenladungen besitzt. Danach wurde über eine Dauer von 300 ns eine computerbasierte Simulation gestartet, um zu beobachten, wie stabil die Interaktionen zwischen Proteinstruktur und Inhibitoren sind. Diese computerbasierten Experimente zeigten, dass Quinacrin stabil im aktiven Zentrum verbleibt und Suramin an einer möglichen allosterischen Bindestelle des Proteins (siehe Figuren 7 und 8) bindet, was wiederum im Einklang mit den vorherigen Ergebnissen des Aktivitätstests und der Fluoreszenz Spektroskopie war. Darüber hinaus konnten diese computerbasierten Dynamiken zeigen, dass die durch Suramin initiierte Konformationsänderung in der Proteinstruktur, auch zu einer Veränderung im aktiven Zentrum der Protease führt, was zu einer erhöhten Zugänglichkeit für die Interaktion mit Quinacrin führen kann. These observations were also supported by molecular docking and computer-based simulations. The crystal structure of SARS-CoV-2 3CL per protease (PDB: 6M2Q) was used as a basis to investigate the influence of quinacrine and suramin binding on the protein structure. During the docking process, quinacrine was localized to the active site of the protease structure and suramin to a protein region of the dimer that possesses strong positive surface charges. A computer-based simulation was then started over a period of 300 ns to observe how stable the interactions between protein structure and inhibitors are. These computational experiments showed that quinacrine remains stable in the active site and binds suramin to a putative allosteric binding site of the protein (see Figures 7 and 8), again in agreement with the previous activity assay and fluorescence spectroscopy results. Furthermore, these computational dynamics could show that the conformational change in the protein structure initiated by suramin also leads to a change in the active site of the protease, which may lead to an increased accessibility for the interaction with quinacrine.
Grundsätzlich konnte nachgewiesen werden, dass Quinacrin und Suramin an verschiedenen Regionen der Proteinoberfläche der viralen 3CL Protease interagiert und so bei einer kombinierten Gabe keine Konkurrenz um dieselbe Bindestelle im Protein auftreten kann. Suramin scheint dabei eine Konformationsänderung des 3CL Protease Proteins zu induzieren, die das aktive Zentrum zugänglicher für eine Quinacrin Bindung macht und dadurch zu einer weiteren, verbesserten Hemmung des Enzyms führt. In principle, it could be demonstrated that quinacrine and suramin interact in different regions of the protein surface of the viral 3CL protease and that, when administered together, there can be no competition for the same binding site in the protein. Suramin appears to induce a conformational change in the 3CL protease protein that makes the active site more accessible for quinacrine binding, thereby leading to further enhanced inhibition of the enzyme.
In einer vorteilhaften Ausführung der Stoffkombination liegt das Verhältnis der Stoffmengenkonzentrationen von Suramin zu Quinacrin bei (1-10) zu (1-10), wobei eine Stoffkombination mit einem Verhältnis der Stoffmengenkonzentrationen von Suramin zu Quinacrin von 1 zu 1 sich als vorteilhaft gezeigt hat. In an advantageous embodiment of the substance combination, the ratio of the substance concentrations of suramin to quinacrine is (1-10) to (1-10), with a substance combination having a substance concentration ratio of suramin to quinacrine of 1 to 1 being advantageous.
Die erfindungsgemäße Stoffkombination ist als pharmazeutische Formulierung zur Verwendung in der medizinischen Therapie geeignet. The combination of substances according to the invention is suitable as a pharmaceutical formulation for use in medical therapy.
Dabei kann diese pharmazeutische Formulierung, umfassend die erfindungsgemäße Stoffkombination, ein oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen. Hier sind alle nach dem Stand der Technik bekannte Arzneiträgerstoffe geeignet. Die Erfindung betrifft weiterhin Arzneimittel enthaltend die erfindungsgemäße Stoffkombination sowie eine pharmazeutisch akzeptierbaren Träger und die Verwendung der Stoffkombination in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von viralen Infektionen in einem Organismus. This pharmaceutical formulation, comprising the combination of substances according to the invention, can comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers. All excipients known from the prior art are suitable here. The invention further relates to medicaments containing the combination of substances according to the invention and a pharmaceutically acceptable carrier and the use of the combination of substances in the production of a medicament for the treatment of viral infections in an organism.
Die Stoffkombination oder pharmazeutische Formulierung oder das Arzneimittel ist insbesondere zur Verwendung in der anti-viralen Therapie oder zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus einsetzbar, wobei hier insbesondere die virale Infektion durch Viren aus der Familie der Coronaviridae, insbesondere human- und tierpathogene Viren aus der Gruppe der Viren SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV- HKU1 , HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1 , Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhi- nolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines-CoV, Equines-CoV, Ratten-CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1 , Truthahn -CoV, Fasanen-CoV, Dros- sel-CoV HKU12, Sperlings-CoV HKU17, Bronzemännchen-CoV HKU13, IBV, Anwendung finden. Die Stoffkombination, die pharmazeutische Formulierung oder das Arzneimittel kann daher vorteilhaft zur Behandlung viraler Infektionen in einem Menschen oder Tier eingesetzt werden. The combination of substances or pharmaceutical formulation or the drug can be used in particular for use in antiviral therapy or for the treatment of a viral infection in an organism, in particular viral infection by viruses from the Coronaviridae family, in particular human and animal pathogenic viruses the group of viruses SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKU1, HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1 , Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovine-CoV, equines-CoV, rat-CoV, pangolin-CoV, mink-CoV 1 , turkey-CoV, pheasant-CoV, thrush-CoV HKU12, sparrow-CoV HKU17, bronze male-CoV HKU13, IBV . The combination of substances, the pharmaceutical formulation or the medicament can therefore be used advantageously for the treatment of viral infections in a human or animal.
Die Erfindung betrifft weiterhin auch Verfahren zur Inhibierung einer viralen Cysteinprotease, insbesondere einer viralen 3CL Protease, sowie zur Behandlung oder Verhinderung einer Vi- rusinfektion in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer viralen Infektion durch Viren aus der Familie der Coronaviridae, insbesondere human- und tierpathogene Viren aus der Gruppe der Viren SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV- 229E, HCoV-HKU1 , HCOV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1 , Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines- CoV, Equines-CoV, Ratten-CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1 , Truthahn -CoV, Fasanen-CoV, Drossel-CoV HKU12, Sperlings-CoV HKU17, Bronzemännchen-CoV HKU13, IBV, bei dem die erfindungsgemäße Stoffkombination oder pharmazeutische Formulierung eingesetzt wird. Bei diesem Verfahren, werden einem Organismus, der für die Virusinfektion empfänglich ist oder daran leidet, die Stoffkombination oder pharmazeutische Formulierung oder das Arzneimittel verabreicht. The invention also relates to methods for inhibiting a viral cysteine protease, in particular a viral 3CL protease, and for treating or preventing a viral infection in an organism, in particular for treating a viral infection by viruses from the Coronaviridae family, in particular human and animal pathogens Viruses from the group of viruses SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKU1, HCOV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1 , Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines- CoV, Equines-CoV, Rat-CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1, Turkey-CoV, Pheasant-CoV, Thrush-CoV HKU12, Sparrow-CoV HKU17, Bronzeman-CoV HKU13, IBV, in which the substance combination according to the invention or pharmaceutical formulation is used. In this method, the combination of substances or pharmaceutical formulation or drug is administered to an organism susceptible to or suffering from the viral infection.
Die Verabreichung erfolgt dabei vorzugsweise in einer therapeutisch wirksamen Menge einer Stoffkombination oder pharmazeutische Formulierung an den Organismus. Vorzugsweise ist hier der Organismus ein Mensch oder ein Tier. Die erfindungsgemäße Stoffkombination oder pharmazeutische Formulierung kann dem Organismus beispielsweise oral, intravenös oder durch Inhalation verabreicht werden. The administration preferably takes place in a therapeutically effective amount of a combination of substances or pharmaceutical formulation to the organism. Preferably, the organism here is a human or an animal. The combination of substances or pharmaceutical formulation according to the invention can be administered to the organism, for example, orally, intravenously or by inhalation.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäßen Stoffkombination enthaltend Suramin und Quinacrin als therapeutisches Mittel sowie in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer viralen Infektion, insbesondere zur Behandlung einer Infektion durch Viren aus der Familie der Coronaviridae, insbesondere human- und tierpathogene Viren aus der Gruppe der Viren SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKU1 , HCoV-NL63, HCoV-0043, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1 , Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines-CoV, Equines-CoV, Ratten-CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1 , Truthahn -CoV, Fasa- nen-CoV, Drossel-CoV HKU12, Sperlings-CoV HKU17, Bronzemännchen-CoV HKU13, IBV In einer möglichen Ausgestaltung der Erfindung wird eine pharmazeutische Stoffkombination bereitgestellt, die ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel und eine therapeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Stoffkombination umfasst. The invention further relates to the use of the combination of substances according to the invention containing suramin and quinacrine as a therapeutic agent and in the manufacture of a medicament for the treatment of a viral infection, in particular for the treatment of an infection by viruses from the Coronaviridae family, in particular human and animal pathogenic viruses from the group the viruses SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKU1 , HCoV-NL63, HCoV-0043, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1 , Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines- CoV, Equines-CoV, Rat-CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1 , Turkey-CoV, Pheasant-CoV, Thrush-CoV HKU12, Sparrow-CoV HKU17, Bronzeman-CoV HKU13, IBV In a possible embodiment of the Invention provides a pharmaceutical combination of substances comprising a pharmaceutically acceptable diluent and a therapeutically effective amount of the combination of substances according to the invention.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Stoffkombination zur Herstellung eines Inhibitors für virale Cysteinproteasen, insbesondere für virale 3CL Proteasen. The invention also relates to the use of the substance combination according to the invention for the production of an inhibitor for viral cysteine proteases, in particular for viral 3CL proteases.
Es wird angenommen, dass die antivirale Wirkung der erfindungsgemäßen Stoffkombination, auf Viren aus der Familie der Coronaviridae darauf beruht, dass durch Hemmung der viralen Cysteinproteasen, insbesondere der viralen 3CL-Protease, die Polyproteinverarbeitung des translatierten, viralen Genoms in der Wirtszelle gestört oder verhindert wird, wodurch das Virus replikationsunfähig wird. It is assumed that the antiviral effect of the substance combination according to the invention on viruses from the Coronaviridae family is based on the fact that the polyprotein processing of the translated viral genome in the host cell is disrupted or prevented by inhibition of the viral cysteine proteases, in particular the viral 3CL protease , rendering the virus unable to replicate.
Dementsprechend ist ein Verfahren zur Behandlung einer Virusinfektion oder eines Virus aus der Familie der Coronaviridae vorgesehen, das für eine virale Cysteinprotease-Inhibierung, insbesondere virale 3CL-Protease-lnhibierung, in einem Säugetier empfänglich ist, einschließlich der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Stoffkombination oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes, Solvats oder Hydrats hiervon an das Säugetier, wobei das Säugetier ein Mensch oder ein Tier sein kann. Accordingly, there is provided a method of treating a viral infection or a Coronaviridae family virus susceptible to viral cysteine protease inhibition, particularly viral 3CL protease inhibition, in a mammal including administering a therapeutically effective amount of the composition of matter of the invention or a pharmaceutically acceptable salt, solvate or hydrate thereof to the mammal, which mammal may be human or animal.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Inhibierung der viralen Cysteinprotease, insbesondere der viralen 3CL-Protease, in einem Säugetier vorgesehen, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Stoffkombination oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes, Solvats oder Hydrats davon an das Säugetier einschließt. In einer Ausgestaltung ist das Säugetier ein Mensch oder ein Tier. Die Stoffkombination kann dabei oral, intravenös oder durch Inhalation verabreicht werden. In another aspect of the present invention, there is provided a method of inhibiting viral cysteine protease, particularly viral 3CL protease, in a mammal comprising administering a therapeutically effective amount of the compounds of the invention combination of substances or a pharmaceutically acceptable salt, solvate or hydrate thereof to the mammal. In one embodiment, the mammal is a human or an animal. The combination of substances can be administered orally, intravenously or by inhalation.
Obwohl die Erfindung in den Figuren und der vorangegangenen Beschreibung ausführlich dargestellt und beschrieben wurde, sind diese Abbildungen und Beschreibungen als illustrativ oder exemplarisch und nicht einschränkend zu betrachten. Es versteht sich, dass Änderungen und Modifikationen durch gewöhnliche Fertigkeiten im Rahmen der folgenden Ansprüche vorgenommen werden können. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung weitere Ausführungsformen mit einer beliebigen Kombination von Merkmalen aus verschiedenen Ausführungsformen, die oben und unten beschrieben sind. While the invention has been shown and described in detail in the figures and the foregoing description, these figures and descriptions are to be considered as illustrative or exemplary and not in a limiting sense. It is understood that changes and modifications can be made through ordinary skill within the scope of the following claims. In particular, the present invention includes further embodiments with any combination of features from different embodiments described above and below.
Spezieller Beschreibungsteil Special description part
Im Weiteren wird die Erfindung anhand von exemplarischen und experimentellen Untersuchungsergebnissen und einigen Figuren näher und detaillierter erläutert. Die Erfindung ist nicht auf die hier offenbarten exemplarischen Ausführungsbeispiele beschränkt. Alle beschriebenen und/oder bebilderten Merkmale können sich einzeln oder auch kombiniert in unterschiedlichen Ausführungsformen manifestieren. Die Merkmale der unterschiedlichen Ausführungsformen dieser Erfindung und ihre jeweiligen Vorteile werden beim Lesen der nachfolgend ausgeführten Ausführungsbeispiele in Zusammenhang mit den Figuren offenbart.The invention is explained in more detail below using exemplary and experimental test results and some figures. The invention is not limited to the exemplary embodiments disclosed herein. All features described and/or illustrated can manifest themselves individually or in combination in different embodiments. The features of the different embodiments of this invention and their respective advantages will be revealed by reading the exemplary embodiments set forth below in conjunction with the figures.
Dabei zeigen: show:
Figur 1 : Primäre Inhibitionstests von Quinacrin, Suramin und einer Kombination beider Moleküle gegen SARS-CoV-2 3CLpro. Figure 1: Primary inhibition tests of quinacrine, suramin and a combination of both molecules against SARS-CoV-2 3CL per .
Figur 2: Dosis-Wirkungs-Kurve zur ICso-Bestimmung. FIG. 2: Dose-response curve for ICso determination.
Figur 3: Lineweaver-Burk-Diagramme zur Bestimmung des Inhibitionsmodus von Quinacrin und Suramin gegen SARS-CoV-2 3CLpro. Figure 3: Lineweaver-Burk plots to determine the mode of inhibition of quinacrine and suramin against SARS-CoV-2 3CL per .
Figur 4: Fluoreszenzspektroskopie von SARS-CoV-2 3CLpro in Gegenwart von Suramin und Quinacrin. Figure 4: Fluorescence spectroscopy of SARS-CoV-2 3CL pro in the presence of suramin and quinacrine.
I) Aktivitätstest und Inhibitionstest I) Activity test and inhibition test
Zum Nachweis der Wirkung von Quinacrin, Suramin und einer Kombination von Suramin und Quinacrin auf die virale Cysteinproteaseaktivität, insbesondere auf die SARS-CoV-2 3CLpra Proteaseaktivität, wurden Inhibitionstests durchgeführt. Dabei wurde beispielhaft der Einfluss der einzelnen Wirkstoffe und in Kombination beider Wirkstoffe miteinander auf die Enzym-Aktivität der SARS-CoV-2 3CLpro untersucht. Inhibition assays were performed to demonstrate the effect of quinacrine, suramin, and a combination of suramin and quinacrine on viral cysteine protease activity, particularly SARS-CoV-2 3CL pra protease activity. The influence of the individual active ingredients and in combination of both active ingredients with each other on the enzyme activity of the SARS-CoV-2 3CL pro was examined as an example.
Die Aktivitätstests wurden unter Verwendung eines fluorogenen Substrats DABCYL- KTSAVLQJ.SGFRKME-EDANS (Bachem, Schweiz) in einem Puffer mit 20 mmol/L Tris pH 7,2, 200 mmol/L NaCI, 1 mmol/L EDTA und 1 mmol/L TCEP [1-3] durchgeführt. Diese Reaktionsmischung wurde in eine Corning 96-Well-Platte (Sigma Aldrich), enthaltend 0,5 pmol/L SARS-CoV-2 3CLpro Protein, pipettiert, und der Assay wurde mit der Zugabe des zuvor genannten Substrats in einer Endkonzentration von 50 pmol/L gestartet. Activity assays were performed using a fluorogenic substrate DABCYL-KTSAVLQJ.SGFRKME-EDANS (Bachem, Switzerland) in a buffer containing 20 mmol/L Tris pH 7.2, 200 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA and 1 mmol/L TCEP [1-3] performed. This reaction mixture was pipetted into a Corning 96-well plate (Sigma Aldrich) containing 0.5 pmol/L SARS-CoV-2 3CL per protein and the assay was performed with the addition of the aforementioned substrate to a final concentration of 50 pmol/L started.
Die Inhibierung der SARS-CoV-2 3CLpro-Aktivität durch Quinacrin und/oder Suramin wurde mit dem oben beschriebenen Aktivitätsassay untersucht. 10 pmol/L der Verbindungen wurden jeweils einzeln oder als Stoffkombination für einen ersten Screening-Test verwendet. Inhibition of SARS-CoV-2 3CL pro activity by quinacrine and/or suramin was assessed using the activity assay described above. 10 pmol/L of the compounds were used individually or as a combination of substances for a first screening test.
Für die anschließenden Inhibitionstests wurden 0,5 pmol/L des SARS-CoV-2 3CLpr0 Proteins mit 0-100 pmol/L Suramin oder 0-150 pmol/L Quinacrin inkubiert. Die Mischungen wurden 30 Minuten lang bei RT inkubiert. Nach Zugabe des Substrats mit einer Endkonzentration von 50 pmol/L wurde die Zunahme/Änderung der Fluoreszenzintensitäten in 60 s-lntervallen über 30 Minuten mit einem Plattenlesegerät Infinite 200 PRO (Tecan, Männedorf, Schweiz) gemessen. Die Temperatur wurde auf 37 °C eingestellt. Sobald das fluorogene Substrat von der SARS-CoV-2 3CLpro Protease gespalten wird, erhöht sich die messbare Fluoreszenz, da der FRET (Förster-Resonanzenergietransfer) Farbstoff des Substrats freigesetzt und damit messbar wird. Also entspricht eine hohe Fluoreszenzintensität einer hohen SARS-CoV-2 3CLpr0 Aktivität. Eine Reduktion der Fluoreszenzintensität kann daher auf eine entsprechende Inhibierung dieser Protease zurückgeführt werden. For the subsequent inhibition tests, 0.5 pmol/L of the SARS-CoV-2 3CL pr0 protein was incubated with 0-100 pmol/L suramin or 0-150 pmol/L quinacrine. The mixtures were incubated at RT for 30 minutes. After addition of the substrate at a final concentration of 50 pmol/L, the increase/change in fluorescence intensities was measured at 60 s intervals over 30 minutes using an Infinite 200 PRO plate reader (Tecan, Mannedorf, Switzerland). The temperature was set at 37°C. As soon as the fluorogenic substrate is cleaved by the SARS-CoV-2 3CL per protease, the measurable fluorescence increases because the FRET (Förster resonance energy transfer) dye of the substrate is released and thus becomes measurable. So a high fluorescence intensity corresponds to a high SARS-CoV-2 3CL pr0 activity. A reduction in the fluorescence intensity can therefore be attributed to a corresponding inhibition of this protease.
Die Anregungs- und Emissionswellenlängen betrugen 360 nm bzw. 460 nm. Die Inhibitionstests wurden als Triplikate durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Figur 1 als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Auf der Abszisse (X-Achse) sind unterschiedliche Versuchsansätze (1 bis 4) dargestellt. The excitation and emission wavelengths were 360 nm and 460 nm, respectively. The inhibition assays were performed in triplicate. The results are presented in Figure 1 as mean ± standard deviation. Different experimental approaches (1 to 4) are shown on the abscissa (X-axis).
Versuchsansatz 1 zeigt Ergebnisse ohne Zusatz eines Wirkstoffs bzw. Inhibitors (dunkelgrauer Balken 1). Test batch 1 shows results without the addition of an active ingredient or inhibitor (dark gray bar 1).
Versuchsansatz 2 zeigt Ergebnisse mit Zusatz von 10 pmol/L Quinacrin (hellgrauer Balken 2). Experimental batch 2 shows results with the addition of 10 pmol/L quinacrine (light gray bar 2).
Versuchsansatz 3 zeigt Ergebnisse mit Zusatz von 10 pmol/L Suramin (hellgrauer Balken 3). Versuchsansatz 4 zeigt Ergebnisse mit Zusatz von 10 pmol/L der Stoffkombination Suramin plus Quinacrin (dunkelgrauer Balken 4). Experimental batch 3 shows results with the addition of 10 pmol/L suramin (light gray bar 3). Experimental batch 4 shows results with the addition of 10 pmol/L of the substance combination suramin plus quinacrine (dark gray bar 4).
Die Ordinate (Y-Achse) gibt die SARS-CoV-2 3CLpro Proteaseaktivität in % wieder. Jeder Versuchsansatz wurde mit frischem, gereinigtem SARS-CoV-2 3CLpro Protein durchgeführt. The ordinate (Y-axis) represents the SARS-CoV-2 3CL per protease activity in %. Each experimental batch was performed with fresh, purified SARS-CoV-2 3CL per protein.
Die Hemmung der Protease-Aktivität wurde mit folgender Gleichung (1) berechnet: The inhibition of protease activity was calculated using the following equation (1):
(1) Protease-Aktivität in [%] = Fluoreszenz-Intensität der nach der Inhibition verbleibenden Enzymaktivitäts-Intensität / Fluoreszenz-Intensität der Enzymaktivität ohne Inhibition (1) Protease activity in [%]=fluorescence intensity of the enzyme activity intensity remaining after inhibition/fluorescence intensity of the enzyme activity without inhibition
Für den Quinacrin-Suramin-Kombinationstest wurde eine Stammlösung mit einem Verhältnis der Stoffmengenkonzentrationen von Suramin zu Quinacrin von 1 :1 der beiden Wirkstoffe hergestellt. 0,5 pmol/L des SARS-CoV-2 3CLpr0 Proteins wurden mit 0 bis 75 pmol/L dieser kombinierten Stammlösung (Quinacrin und Suramin) inkubiert. Es konnte gezeigt werden, dass Quinacrin oder Suramin die Proteaseaktivität, jeweils als alleiniger Wirkstoff, um mehr als 60% (Quinacrin 64% und Suramin 73%) und die Kombination von Quinacrin-Suramin die Proteaseaktivität um mehr als 90% (Quinacrin-Suramin Kombination: 91%) hemmen können (Figur 1). Eine 100%ige Hemmung der Proteaseaktivität konnte bei einer Inkubation mit 75 mol/L mit der erfindungsgemäßen Kombination von Quinacrin und Suramin erreicht werden. For the quinacrine-suramin combination test, a stock solution with a ratio of the molar concentrations of suramin to quinacrine of 1:1 of the two active substances was prepared. 0.5 pmol/L of the SARS-CoV-2 3CL pr0 protein was incubated with 0 to 75 pmol/L of this combined stock solution (quinacrine and suramin). It could be shown that quinacrine or suramin the protease activity, each as sole active substance, by more than 60% (quinacrine 64% and suramin 73%) and the combination of quinacrine-suramin the protease activity by more than 90% (quinacrine-suramin combination : 91%) (Figure 1). A 100% inhibition of the protease activity could be achieved with an incubation with 75 mol/L with the combination of quinacrine and suramin according to the invention.
Die folgende Tabelle 1 zeigt Ergebnisse der Messungen der Proteaseaktivität bei unterschiedlichen Stoffmengenkonzentrationen von Quinacrin, Suramin und der Quinacrin-Suramin Kombination. Table 1 below shows the results of measurements of the protease activity at different molar concentrations of quinacrine, suramin and the quinacrine-suramin combination.
Tabelle 1 :
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ID ICso Bestimmung: Table 1 :
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ID ICso determination:
Um den Wert der halbmaximalen Inkubationskonzentration (IC50 Wert) für die einzelnen Wirkstoffe und die Stoffkombination zu bestimmen, wurde die Anfangsgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion gegen verschiedene Konzentrationen der Wirkstoffe mit Hilfe einer Dosis-Wirkungs-Kurve in der Software GraphPad Prism5 aufgetragen. In order to determine the value of the half-maximal incubation concentration (IC50 value) for the individual active substances and the substance combination, the initial rate of the enzymatic reaction was plotted against various concentrations of the active substances using a dose-response curve in the GraphPad Prism5 software.
In Figur 2 ist auf der Ordinate (Y-Achse) die zeitliche Zunahme der Fluoreszenzintensität [%] von SARS-CoV-2 3CLpro gegen den Logarithmus der Stoffmengenkonzentration in gmol/L (Abszisse X-Achse) von Quinacrin, Suramin und der Suramin-Quinacrin Kombination aufgetragen. Dabei zeigen die einzelnen Graphen folgendes: In Figure 2, the ordinate (Y-axis) shows the increase over time in the fluorescence intensity [%] of SARS-CoV-2 3CL per versus the logarithm of the molar concentration in gmol/L (abscissa X-axis) of quinacrine, suramin and suramin -Quinacrine combination applied. The individual graphs show the following:
Figur 2 Graph A: Dosis-Wirkungs-Kurve von Quinacrin auf SARS-CoV-2 3CLpro. Figur 2 Graph B: Dosis-Wirkungs-Kurve von Suramin auf SARS-CoV-2 3CLpro. Figur 2 Graph C: Dosis-Wirkungs-Kurve der Suramin-Quinacrin Kombination auf SARS- CoV-2 3CLpro. Figure 2 Graph A: Dose-response curve of quinacrine to SARS-CoV-2 3CL per . Figure 2 Graph B: Dose-response curve of Suramin on SARS-CoV-2 3CL per . Figure 2 Graph C: dose-response curve of the suramin-quinacrine combination on SARS-CoV-2 3CL per .
Dabei zeigte Quinacrin einen IC50 Wert von 7,8 ± 0,9 fimol/L, Suramin einen IC50 Wert von 6,3 ± 0,8 |imol/L und die Kombination beider einen IC50 Wert von 0,46 ±0,1 |imol/L. Quinacrine showed an IC50 value of 7.8 ± 0.9 μmol/L, suramin an IC50 value of 6.3 ± 0.8 μmol/L and the combination of both an IC50 value of 0.46 ±0.1 μL imole/L.
Ill) Bestimmung von Inhibitionsmodus und Inhibitionskonstante III) Determination of inhibition mode and inhibition constant
Basierend auf der bekannten Michaelis-Menten-Gleichung/ Kinetik wurden zusätzliche Proteaseaktivitätstests durchgeführt, um den Inhibitionsmodus von Quinacrin und Suramin auf die Proteaseaktivität näher zu untersuchen. Based on the well-known Michaelis-Menten equation/kinetics, additional protease activity tests were performed to investigate the mode of inhibition of quinacrine and suramin on protease activity in more detail.
Dazu wurde bei verschiedenen Endkonzentrationen der beiden Inhibitoren, Quinacrin oder Suramin, und des zuvor genannten Substrats die Reaktionsgeschwindigkeit der SARS-CoV- 2 3CLpro bestimmt. 0,5 pmol/L SARS-CoV-2 3CLpro wurde dazu mit dem jeweiligen Inhibitor Quinacrin oder Suramin in verschiedenen Konzentrationen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe der entsprechenden Konzentrationsreihe des Substrats eingeleitet und die Reaktionsgeschwindigkeit durch Bestimmung der Fluoreszenzintensität gemäß den zuvor unter I) beschriebenen allgemeinen Versuchsbedingungen bestimmt. Die Datenanalyse wurde mit Hilfe eines Lineweaver-Burk- Plots durchgeführt. Dabei wurde der Kehrwert der Reaktionsgeschwindigkeit (1/V) gegen den Kehrwert der Substratkonzentration (1 /[S]) aufgetragen [4,5], For this purpose, the reaction speed of the SARS-CoV-2 3CL pro was determined at different final concentrations of the two inhibitors, quinacrine or suramin, and the aforementioned substrate. For this purpose, 0.5 pmol/L SARS-CoV-2 3CL pro was incubated with the respective inhibitor quinacrine or suramin in various concentrations for 30 minutes at room temperature (RT). The reaction was then initiated by adding the appropriate concentration series of the substrate and the reaction rate was determined by determining the fluorescence intensity in accordance with the general test conditions described above under I). Data analysis was performed using a Lineweaver-Burk plot. The reciprocal of the reaction rate (1/V) was plotted against the reciprocal of the substrate concentration (1/[S]) [4,5],
Alle Messungen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die Inhibitionskonstante (K) wurde mit der folgenden Gleichung (2) ermittelt: All measurements were performed in triplicate and data presented as mean ± standard deviation. The inhibition constant (K) was determined using the following equation (2):
(2) Ki = IC50/(([S]/KM)+1 )) (2) Ki = IC 50 /(([S]/KM)+1 ))
Der Ki Wert gibt die Affinität des Enzyms bzw. der Protease zum jeweiligen Inhibitor an. Der ICsoWert wurde wie zuvor beschrieben bestimmt. Der KM Wert wurde aus einer Datenbank (BRENDA-Datenbank) gewonnen und [S] ist die Konzentration des in den Versuchsansätzen verwendeten Substrats [6]. The Ki value indicates the affinity of the enzyme or protease for the respective inhibitor. The ICso value was determined as previously described. The KM value was obtained from a database (BRENDA database) and [S] is the concentration of the substrate used in the experimental batches [6].
In Figur 3 ist auf der Abszisse (X-Achse) der Kehrwert der Substratkonzentration [1/S] angegeben. Auf der Ordinate (Y-Achse) ist der Kehrwert der Reaktionsgeschwindigkeit [1/V] aufgetragen. Die beiden Graphen A und B in Figur 3 zeigen: In FIG. 3, the reciprocal value of the substrate concentration [1/S] is given on the abscissa (X-axis). The reciprocal value of the reaction rate [1/V] is plotted on the ordinate (Y-axis). The two graphs A and B in Figure 3 show:
A: Lineweaver-Burk-Diagramm zur SARS-CoV-2 3CLpro Hemmung durch Quinacrin bei unterschiedlichen Endkonzentrationen von Quinacrin und zwar 0, 0,5, 1 ,0, 2,5 pmol/L. Die Ergebnisse bei den unterschiedlich eingestellten Endkonzentrationen von Quinacrin und die dazugehörigen Werte der Reaktionsgeschwindigkeiten sind in Graph A durch unterschiedliche Symbole (•, ■, , ♦) dargestellt. A: Lineweaver-Burk diagram for SARS-CoV-2 3CL per inhibition by quinacrine at different final concentrations of quinacrine, namely 0, 0.5, 1.0, 2.5 pmol/L. The results at the different adjusted final concentrations of quinacrine and the associated values of the reaction rates are represented in graph A by different symbols (•, ■, , ♦).
B: Lineweaver-Burk-Diagramm zur SARS-CoV-2 3CLpr0 Hemmung durch Suramin bei unterschiedlichen Endkonzentrationen von Suramin und zwar O, 0,5, 1 ,0, 2,5 pmol/L. Die Ergebnisse bei den unterschiedlich eingestellten Endkonzentrationen von Suramin und die dazugehörigen Werte der Reaktionsgeschwindigkeiten sind in Graph B durch unterschiedliche Symbole (•, ■, , ♦) dargestellt. B: Lineweaver-Burk diagram for SARS-CoV-2 3CL pr0 inhibition by suramin at different final concentrations of suramin, specifically 0.0.5, 1.0, 2.5 pmol/L. The results at the differently adjusted final concentrations of suramin and the associated values of the reaction rates are represented in graph B by different symbols (•, ■, , ♦).
Die in dieser Darstellung erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass Quinacrin ein kompetitiver Inhibitor und Suramin ein nicht-kompetitiver Inhibitor für virale Cysteinproteasen, insbesondere virale 3CL Proteasen ist. The results obtained in this presentation indicate that quinacrine is a competitive inhibitor and suramin is a non-competitive inhibitor of viral cysteine proteases, particularly viral 3CL proteases.
IV) Fluoreszenz-Spektroskopie IV) Fluorescence spectroscopy
Um die zuvor gewonnenen Ergebnisse zu verifizieren, wurden Fluoreszenz-Spektroskopie Untersuchungen durchgeführt. Dazu wurde eine intrinsische Trp-Fluoreszenz von SARS- CoV-2 3CLpro unter dem Einfluss von Quinacrin und Suramin gemessen. Auf der Grundlage dieses Experiments konnte die Dissoziationskonstante zwischen dem Protein und Quinacrin und Suramin bestimmt werden [7], Die Proteinprobe lag kurzzeitig in 25 mmol/L Tris-HCI pH 8,0, 150 mmol/L NaCI mit einer Endkonzentration von 10 pmol/L/50 pl vor. Die Proteinlösung in der Küvette (1 cm Schichtdicke) wurde schrittweise mit einer Wirkstoffstammlösung von 0 bis 48 pmol/L Quinacrin oder Suramin titriert (um eine Proteinverdünnung zu vermeiden, wurde die Molekülstammlösung mit der gleichen Proteinkonzentration - 10 pmol/L Protein + 500 pmol/L Molekülstamm - behandelt). Nach jeder Titration wurde eine Messung durchgeführt. Das Quenching der Protease-Fluoreszenz, AF (Fmax-F), bei 330 nm jedes Titrationspunktes wurde zur Anpassung einer Sättigungsbindungskurve mit Hilfe eines nichtlinearen Verfahrens zur Anpassung der kleinsten Quadrate verwendet, das an anderer Stelle [8] auf der Grundlage der folgenden Gleichung (3) [9] ausführlich diskutiert wurde: In order to verify the previously obtained results, fluorescence spectroscopy investigations were carried out. For this purpose, an intrinsic Trp fluorescence of SARS-CoV-2 3CL pro was measured under the influence of quinacrine and suramin. Based on this experiment, the dissociation constant between the protein and quinacrine and suramin could be determined [7]. The protein sample was briefly in 25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 150 mmol/L NaCl with a final concentration of 10 pmol/ L/50pl before. The protein solution in the cuvette (1 cm path length) was titrated stepwise with a drug stock solution from 0 to 48 pmol/L quinacrine or suramin (to avoid protein dilution, the molecule stock solution was made with the same protein concentration - 10 pmol/L protein + 500 pmol/ L molecular strain - treated). A measurement was carried out after each titration. The quenching of the protease fluorescence, AF (F max -F), at 330 nm of each titration point was used to fit a saturation binding curve using a non-linear least squares fit method reported elsewhere [8] based on the following equation (3) [9] has been discussed in detail:
(3) Y ~ Bmax [Q] / KD + [Q] wobei [Q] die Ligandenkonzentration in Lösung ist, die als Quencher wirkt, Y die spezifische Bindung ist, die durch Messung der Fluoreszenzintensität abgeleitet wird, Bmax die maximale Menge des Protease-Liganden-Komplexes bei Sättigung des Liganden ist und KD die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante ist. Der Prozentsatz der gebundenen Protease, d.h. Y, der sich aus dem Fluoreszenzintensitätsmaximum ergibt, wird gegen die Ligandenkonzentration aufgetragen (Siehe Figur 4 Graph B und D). Zusätzlich wurden die Daten mit einer modifizierten Hill-Gleichung angepasst, die folgende Beziehung ergibt (4) [10,11]: (3) Y ~ Bmax [Q] / KD + [Q] where [Q] is the concentration of ligand in solution that acts as a quencher, Y is the specific binding deduced by measuring fluorescence intensity, B max is the maximum amount of protease-ligand complex at saturation of the ligand, and KD is equilibrium -dissociation constant is. The percentage of bound protease, ie Y, resulting from the fluorescence intensity peak is plotted against the ligand concentration (See Figure 4 graphs B and D). In addition, the data were fitted with a modified Hill equation, which gives the following relationship (4) [10,11]:
(4) Log (F-Fmin)/(F) = m log KD + n log [Q] wobei Fmin die minimale Fluoreszenzintensität in Gegenwart des Liganden und KD die Gleichgewichtskonstante für den Protein-Ligand-Komplex ist. Die "Bindungskonstante" K ist definiert als der Kehrwert von KD. (4) log (F-Fmin)/(F) = m log K D + n log [Q] where Fmin is the minimum fluorescence intensity in the presence of the ligand and KD is the equilibrium constant for the protein-ligand complex. The "binding constant" K is defined as the reciprocal of KD.
Figur 4 (A und C) zeigt eine Anzahl von Fluoreszenzspektren von SARS-CoV-2 3CLpro, die unter Einfluss von unterschiedlichen Stoffkonzentrationen von Suramin (Graph A) und Quinacrin (Graph C) aufgenommen wurden. Figur 4 zeigt ebenfalls, jeweils dazu erstellte Bindungssättigungskurven zur Ermittlung der jeweiligen Dissoziationskonstante KD. FIG. 4 (A and C) shows a number of fluorescence spectra of SARS-CoV-2 3CL per , which were recorded under the influence of different substance concentrations of suramin (Graph A) and quinacrine (Graph C). FIG. 4 also shows binding saturation curves created for this purpose in order to determine the respective dissociation constant KD.
Die Abszissen (X-Achsen) der Fluoreszenzspektren geben die Wellenlängen in nm an, zu denen die Fluoreszenzintensitäten gemessen wurden. Der von oben nach unten verlaufende Pfeil in den Graphen A und C der Figur 4, gibt zu den einzelnen, aufgenommenen Fluoreszenzspektren die jeweils zugehörige, zugefügte Stoffkonzentration (0 bis 48 pmol/L) des Wirkstoffs Quinacrin/Suramin an. Die Ordinaten (Y-Achsen) geben die jeweils gemessenen Fluoreszenzintensitäten in relativen Fluoreszenzeinheiten an. Die in den Graphen A und C parallel zur Abszisse verlaufenden, mit Stern markierten Pfeile kennzeichnen die jeweils durch den Wirkstoff hervorgerufene Verschiebung des Fluoreszenzmaximums. The abscissas (X axes) of the fluorescence spectra indicate the wavelengths in nm at which the fluorescence intensities were measured. The arrow running from top to bottom in graphs A and C in FIG. 4 indicates the associated added substance concentration (0 to 48 pmol/L) of the active substance quinacrine/suramin for the individual fluorescence spectra recorded. The ordinates (Y-axes) indicate the respectively measured fluorescence intensities in relative fluorescence units. The arrows marked with an asterisk, which run parallel to the abscissa in graphs A and C, indicate the shift in the fluorescence maximum caused by the active substance.
Die Interaktion von Quinacrin mit der SARS-CoV-2 3CL Protease führte, wie schon zuvor erwähnt, zu einem sogenannten „blue edge excitation shift". Dabei bewegte sich das Fluoreszenzmaximum um 10 nm von 330 nm nach 320 nm. Diese Bewegung des Fluoreszenzmaximums geht einher mit der Bewegung der Tryptophanreste im Protein in eine hydrophobe Umgebung. As already mentioned, the interaction of quinacrine with the SARS-CoV-2 3CL protease led to a so-called "blue edge excitation shift". The fluorescence maximum moved by 10 nm from 330 nm to 320 nm. This movement of the fluorescence maximum is continuous accompanied by the movement of the tryptophan residues in the protein into a hydrophobic environment.
Die Bindung von Suramin an die SARS-CoV-2 3CL Protease dagegen führte zu einem starken „red edge excitation shift“. Dabei bewegte sich das Fluoreszenz Maximum um 30 nm von 330 nm nach 360 nm. Dieser Vorgang ist definiert durch eine erhöhte Zugänglichkeit der Tryptophanreste mit dem Umgebungsmedium und ist typisch für Konformationsänderungen in der Proteinstruktur. In contrast, the binding of suramin to the SARS-CoV-2 3CL protease led to a strong “red edge excitation shift”. The fluorescence maximum moved by 30 nm from 330 nm to 360 nm. This process is defined by increased accessibility of the tryptophan residues with the surrounding medium and is typical for conformational changes in the protein structure.
Figur 4 Graph A: Fluoreszenzspektren von SARS-CoV-2 3CLpro unter Einfluss der Suramin- titration. Suramin bewirkt einen „red edge excitation shift“ des sichtbaren Trp (*). Figur 4 Graph B: Mit Hilfe einer Bindungssättigungskurve und einer modifizierten Hill-Gleichung konnte eine Dissoziationskonstante (KD) ermittelt werden. Sie beträgt 4,5 ± 1 ,2 uM für die SARS-CoV-2 3CLpro-Suramin-Wechselwirkung. Figure 4 Graph A: Fluorescence spectra of SARS-CoV-2 3CL pro under the influence of suramin titration. Suramin causes a "red edge excitation shift" of the visible Trp (*). FIG. 4 Graph B: A dissociation constant (KD) could be determined with the aid of a binding saturation curve and a modified Hill equation. It is 4.5 ± 1.2 μM for the SARS-CoV-2 3CL per -suramin interaction.
Figur 4 Graph C: Fluoreszenzspektrum von SARS-CoV-2 3CLpro unter Einfluss der Quinacrintitration. Quinacrin bewirkt einen „blue edge excitation shift" des sichtbaren Trp (*). Figur 4 Graph D: Mit Hilfe einer Bindungssättigungskurve und einer modifizierten Hill-Gleichung konnte ein KD Wert ermittelt werden. Er beträgt 6,0 ± 1 ,8 uM für die SARS-CoV-2 3CLpro-Quinacrin-Wechselwirkung. Figure 4 Graph C: Fluorescence spectrum of SARS-CoV-2 3CL pro under the influence of quinacrine titration. Quinacrine causes a “blue edge excitation shift” of the visible Trp (*). FIG. 4 Graph D: A KD value could be determined with the aid of a binding saturation curve and a modified Hill equation SARS-CoV-2 3CL per -quinacrine interaction.
Der KD Wert liefert zunächst keinen direkten Hinweis auf den Wirkmechanismus von Suramin und /oder Quinacrin auf virale Cysteinproteasen. Indirekt sagt der KD Wert jedoch etwas über die Qualität der Interaktion zwischen der Cysteinprotease und den beiden Molekülen Suramin und Quinacrin aus. The KD value initially provides no direct indication of the mechanism of action of suramin and/or quinacrine on viral cysteine proteases. Indirectly, however, the KD value says something about the quality of the interaction between the cysteine protease and the two molecules suramin and quinacrine.
Wenn die Interaktion schwach wäre, könnten die Inhibitoren einfach wieder von der Bindestelle der Cysteinproteasen diffundieren und die Hemmung würde wieder aufgehoben werden. If the interaction were weak, the inhibitors could simply diffuse back from the cysteine protease binding site and the inhibition would be reversed.
In kombinierter Betrachtungsweise des KD Werts mit den Resultaten aus den Inhibitor Tests kann jedoch zum einen aus den gute IC50 Werten, die auf eine deutliche Hemmung der Protease hinweisen und zum anderen aus den KD Werten, die im unteren pM Bereich liegen, was für eine solide Interaktion für unsere Moleküle spricht (ein Peptid kann im nM oder pM Bereich liegen), auf eine nachweisbare Hemmung und Interaktion der Molekülkombination Suramin und Quinacrin auf die Aktivität der viralen Cysteinproteasen, insbesondere SARS- CoV-2 3CLpro Proteinase geschlossen werden. In a combined view of the KD value with the results from the inhibitor tests, however, the good IC50 values, which indicate a clear inhibition of the protease, and the KD values, which are in the lower pM range, what a solid one Interaction for our molecules speaks (a peptide can be in the nM or pM range), a detectable inhibition and interaction of the molecule combination suramin and quinacrine on the activity of the viral cysteine proteases, in particular SARS-CoV-2 3CL per proteinase can be concluded.
Während die Erfindung anhand von besonderen Ausführungsbeispielen im vorangehenden Teil der Anmeldung eingehend beschrieben und bebildert wurde, sollen diese Beschreibung und die Figuren lediglich als Beispiel gelten, ohne dadurch einschränkend zu wirken. Es ist davon auszugehen, dass ein Fachmann im Rahmen seines Fachwissens selbst weitere Änderungen und Modifikationen der nachfolgenden Ansprüche vornehmen würde und könnte, die durch den Schutzbereich der Ansprüche mit abgedeckt sind. Insbesondere sind im Rahmen der Erfindung weitere Ausführungsformen mit jeder Art von Kombinationen der erwähnten Merkmale einzelner Ausführungsbeispiele mit umfasst. While the invention has been described and illustrated in detail in the preceding part of the application on the basis of particular exemplary embodiments, this description and the figures should only apply as an example without having any restrictive effect. It is to be assumed that a person skilled in the art would and could, within the scope of his or her specialist knowledge, make further changes and modifications to the following claims which are also covered by the scope of protection of the claims. In particular, further embodiments with any type of combination of the mentioned features of individual exemplary embodiments are also included within the scope of the invention.
Literatur: Literature:
[1] Zhang L, Lin D, Sun X, Curth U, Drosten C, Sauerhering L, et al. Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved a-ketoamide inhibitors. Science 2020;368(6489):409-412. [2] Zhang L, Lin D, Kusov Y, Nian Y, Ma Q, Wang J, De Wilde A, a-Ketoamides as broadspectrum inhibitors of coronavirus and enterovirus replication: Structure-based design, synthesis, and activity assessment. J. Med. Chem. 2020;63:4562-4578. [1] Zhang L, Lin D, Sun X, Curth U, Drosten C, Sauerhering L, et al. Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved a-ketoamide inhibitors. Science 2020;368(6489):409-412. [2] Zhang L, Lin D, Kusov Y, Nian Y, Ma Q, Wang J, De Wilde A, a-Ketoamides as broadspectrum inhibitors of coronavirus and enterovirus replication: Structure-based design, synthesis, and activity assessment. J Med Chem 2020;63:4562-4578.
[3] Ma C, Sacco MD, Hurst B, Townsend JA, Hu Y, Szeto T, et al. Boceprevir, GC-376, and calpain inhibitors II, XII inhibit SARS-CoV-2 viral replication by targeting the viral main protease. Cell Res. 2020;30(8):678-692. [3] Ma C, Sacco MD, Hurst B, Townsend JA, Hu Y, Szeto T, et al. Boceprevir, GC-376, and calpain inhibitors II, XII inhibit SARS-CoV-2 viral replication by targeting the viral main protease. Cell Res. 2020;30(8):678-692.
[4] Roy A, Lim L, Srivastava S, Lu Y, Song J, Solution conformations of Zika NS2B-NS3pro and its inhibition by natural products from edible plants. PloS one 2017;12:e0180632. [4] Roy A, Lim L, Srivastava S, Lu Y, Song J, Solution conformations of Zika NS2B-NS3pro and its inhibition by natural products from edible plants. Plos one 2017;12:e0180632.
[5] Motulsky H, Christopoulos A, Fitting models to biological data using linear and nonlinear regression: a practical guide to curve fitting. Oxford University Press. 2004 [5] Motulsky H, Christopoulos A, Fitting models to biological data using linear and nonlinear regression: a practical guide to curve fitting. Oxford University Press. 2004
[6] Wu QY, Jiang LL, Yang SG, Zuo Y, Wang ZF, Xi Z, et al. Hexahydrophthalimide-benzo- thiazole hybrids as a new class of protoporphyrinogen oxidase inhibitors: synthesis, structure-activity relationship, and DFT calculations. New J. Chem. 2014;38(9): 4510-4518. [6] Wu QY, Jiang LL, Yang SG, Zuo Y, Wang ZF, Xi Z, et al. Hexahydrophthalimide-benzothiazole hybrids as a new class of protoporphyrinogen oxidase inhibitors: synthesis, structure-activity relationship, and DFT calculations. New J Chem 2014;38(9):4510-4518.
[7] Coronado MA, Eberle RJ, Bieffert N, Feuerstein S, Olivier DS, de Moraes FR, et al. Zika virus NS2B/NS3 proteinase: A new target for an old drug-Suramin a lead compound for NS2B/NS3 proteinase inhibition, Antiviral Res. 2018;160:118-125. [7] Coronado MA, Eberle RJ, Bieffert N, Feuerstein S, Olivier DS, de Moraes FR, et al. Zika virus NS2B/NS3 proteinase: A new target for an old drug-suramin a lead compound for NS2B/NS3 proteinase inhibition, Antiviral Res. 2018;160:118-125.
[8] Johnson ML, Frasier SG, Nonlinear least-squares analysis. Meth. Enzymol. 1985;117:301-42. [8] Johnson ML, Frasier SG, Nonlinear least-squares analysis. Meth. Enzymol. 1985;117:301-42.
[9] Shaikh SMT, Seetharamappa J, Ashoka S, Kandagal PB, A study of the interaction between bromopyrogallol red and bovine serum albumin by spectroscopic methods, Dyes Pigments 2007;73:211-216. [9] Shaikh SMT, Seetharamappa J, Ashoka S, Kandagal PB, A study of the interaction between bromopyrogallol red and bovine serum albumin by spectroscopic methods, Dyes Pigments 2007;73:211-216.
[10] Wang G, Liu X, Yan C, Bai G, Lu Y, Probing the binding of trypsin to glutathione-stabilized gold nanoparticles in aqueous solution, Colloids Surf. B Biointerfaces 2015; 135:261 - 266. [10] Wang G, Liu X, Yan C, Bai G, Lu Y, Probing the binding of trypsin to glutathione-stabilized gold nanoparticles in aqueous solution, Colloids Surf. B Biointerfaces 2015; 135:261-266.
[11] Ahumada M, Lissi E, Montagut AM, Valenzuela-Henriquez F, Pacioni NL, Alarcon El, Association models for binding of molecules to nanostructures. Analyst 2017;142:2067-2089. [11] Ahumada M, Lissi E, Montagut AM, Valenzuela-Henriquez F, Pacioni NL, Alarcon El, Association models for binding of molecules to nanostructures. Analyst 2017;142:2067-2089.
[12] Coronado et al., Zika virus NS2B/NS3 proteinase: A new target for an old drug-Suramin a lead compound for NS2B/NS3 proteinase inhibition. 2018. Antiviral Res. 2018; 160:118- 125. [12] Coronado et al., Zika virus NS2B/NS3 proteinase: A new target for an old drug-suramin a lead compound for NS2B/NS3 proteinase inhibition. 2018. Antiviral Res. 2018; 160:118-125.
[13] Salgado-Benvindo et al., Suramin Inhibits SARS-CoV-2 Infection in Cell Culture by Interfering with Early Steps of the Replication Cycle. 2020, Antimicrob. Agents Chemother. 2020; 64(8):e00900-20. [13] Salgado-Benvindo et al., Suramin Inhibits SARS-CoV-2 Infection in Cell Culture by Interfering with Early Steps of the Replication Cycle. 2020, Antimicrobial. Agent's Chemother. 2020; 64(8):e00900-20.
[14] Duan et al., Identification of Drugs Blocking SARS-CoV-2 Infection using Human Pluripotent Stem Cell-derived Colonic Organoids. 2020, bioRxiv. [14] Duan et al., Identification of Drugs Blocking SARS-CoV-2 Infection using Human Pluripotent Stem Cell-derived Colonic Organoids. 2020, bioRxiv.

Claims

Patentansprüche patent claims
1 . Stoffkombination zur Inhibierung viraler Cysteinproteasen, insbesondere viraler 3CL Proteasen, enthaltend Suramin und Quinacrin. 1 . Substance combination for inhibiting viral cysteine proteases, in particular viral 3CL proteases, containing suramin and quinacrine.
2. Stoffkombination nach vorhergehendem Anspruch, wobei das Verhältnis der Stoffmengenkonzentration von Suramin zu Quinacrin das Verhältnis (1 - 10) zu (1 bis 10) ist. 2. Substance combination according to the preceding claim, wherein the ratio of the molar concentration of suramin to quinacrine is the ratio (1-10) to (1 to 10).
3. Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Inhibierung viraler Cysteinproteasen, die in Viren der Familie der Coronaviridae vorkommen. 3. Substance combination according to one of the preceding claims for inhibiting viral cysteine proteases which occur in viruses of the Coronaviridae family.
4. Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Inhibierung viraler Cysteinproteasen, die in Viren aus der Gruppe der Viren SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKU1 , HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1 , Mi- niopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines-CoV, Equines-CoV, Ratten- CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1 , Truthahn -CoV, Fasanen-CoV, Drossel-CoV HKU12, Sperlings-CoV HKU17, Bronzemännchen-CoV HKU13, IBV vorkommen. 4. Substance combination according to one of the preceding claims for inhibiting viral cysteine proteases in viruses from the group of viruses SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKU1, HCoV-NL63 , HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1, Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovine-CoV, equines-CoV, rat-CoV, pangolin-CoV, mink-CoV 1 , turkey-CoV, pheasant-CoV, thrush-CoV HKU12, sparrow-CoV HKU17, bronze man-CoV HKU13, IBV occur.
5. Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung bei der Herstellung eines Inhibitors für virale Cysteinproteasen, insbesondere für virale 3CL Proteasen. 5. Substance combination according to one of the preceding claims for use in the production of an inhibitor for viral cysteine proteases, in particular for viral 3CL proteases.
6. Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der medizinischen Therapie. 6. Substance combination according to one of the preceding claims for use in medical therapy.
7. Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung viraler Infektionen in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae. 7. Substance combination according to one of the preceding claims for the treatment of viral infections in an organism, in particular for the treatment of an infection with viruses from the Coronaviridae family.
8. Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche als Arzneimittel in der Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae. 8. Substance combination according to one of the preceding claims as a medicament in the treatment of a viral infection in an organism, in particular for the treatment of an infection with viruses from the Coronaviridae family.
9. Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung einer Infektion in einem Organismus mit Viren aus der Gruppe der Viren SARS-CoV, SARSr- CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKU1 , HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1 , Mi- niopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovines-CoV, Equines-CoV, Ratten- CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1 , Truthahn -CoV, Fasanen-CoV, Drossel-CoV HKU12, Sperlings-CoV HKU17, Bronzemännchen-CoV HKU13, IBV. 9. Substance combination according to one of the preceding claims for the treatment of an infection in an organism with viruses from the group of viruses SARS-CoV, SARSr-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-229E, HCoV-HKU1, HCoV- NL63, HCoV-OC43, HCoV-B814, HECV; Bat-CoV CDPHE15, bat-CoV HKU10, Miniopterus bat-CoV 1, Miniopterus bat-CoV HKU8, Scotophilus bat-CoV 512, Rhinolophus bat-CoV HKU2, PEDV, SADS-CoV, Canines-CoV, Felines-CoV, Bovine-CoV, Equines-CoV, Rat-CoV, Pangolin-CoV, Mink-CoV 1 , Turkey-CoV, Pheasant-CoV, Thrush-CoV HKU12, Sparrow-CoV HKU17, Bronzeman-CoV HKU13, IBV.
10. Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Behandlung viraler Infektionen in einem Menschen oder Tier. 10. Substance combination according to one of the preceding claims for the treatment of viral infections in a human or animal.
11 . Stoffkombination gemäß den vorhergehenden Ansprüchen in Verbindung mit einem 0- der mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern. 11 . Substance combination according to the preceding claims in connection with one 0- of the several pharmaceutically acceptable carriers.
12. Arzneimittel enthaltend eine Stoffkombination nach einem der Ansprüche 1 bis 11 sowie einen pharmazeutisch akzeptierbaren Träger. 12. Medicament containing a substance combination according to any one of claims 1 to 11 and a pharmaceutically acceptable carrier.
13. Verwendung einer Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 11 in der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Organismus, insbesondere zur Behandlung einer Infektion mit Viren aus der Familie der Coronaviridae. 13. Use of a substance combination according to any one of the preceding claims 1 to 11 in the manufacture of a medicament for the treatment of a viral infection in an organism, in particular for the treatment of an infection with viruses from the Coronaviridae family.
14. Verwendung einer Stoffkombination nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 11 in der Herstellung eines Inhibitors für virale Cysteinproteasen, insbesondere virale 3CL Proteasen. 14. Use of a substance combination according to any one of the preceding claims 1 to 11 in the production of an inhibitor for viral cysteine proteases, in particular viral 3CL proteases.
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Non-Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AHUMADA MLISSI EMONTAGUT AMVALENZUELA-HENRIQUEZ FPACIONI NLALARCON EI: "Association models for binding of molecules to nanostructures", ANALYST, vol. 142, 2017, pages 2067 - 2089
CLARISSE SALGADO-BENVINDO ET AL: "Suramin inhibits SARS-CoV-2 infection in cell culture by interfering 2 with early steps of the replication cycle", ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, vol. 64, no. 8, 8 June 2020 (2020-06-08), US, XP055766432, ISSN: 0066-4804, DOI: 10.1128/AAC.00900-20 *
CORONADO MAEBERLE RJBLEFFERT NFEUERSTEIN SOLIVIER DSDE MORAES FR ET AL.: "Zika virus NS2B/NS3 proteinase: A new target for an old drug-Suramin a lead compound for NS2B/NS3 proteinase inhibition", ANTIVIRAL RES, vol. 160, 2018, pages 118 - 125, XP085534512, DOI: 10.1016/j.antiviral.2018.10.019
DUAN ET AL.: "Identification of Drugs Blocking SARS-CoV-2 Infection using Human Pluripotent Stem Cell-derived Colonic Organoids", BIORXIV, 2020
DUAN XIAOHUA ET AL: "Identification of Drugs Blocking SARS-CoV-2 Infection using Human Pluripotent Stem Cell-derived Colonic Organoids", BIORXIV, 2 May 2020 (2020-05-02), XP055866102, Retrieved from the Internet <URL:https://doi.org/10.1101/2020.05.02.073320doi:> [retrieved on 20211125], DOI: 10.1101/2020.05.02.073320 *
EBERLE RAPHAEL J. ET AL: "The Repurposed Drugs Suramin and Quinacrine Cooperatively Inhibit SARS-CoV-2 3CLpro In Vitro", VIRUSES, vol. 13, no. 5, 10 May 2021 (2021-05-10), pages 873, XP055865020, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8170883/pdf/viruses-13-00873.pdf> DOI: 10.3390/v13050873 *
JOHNSON MLFRASIER SG: "Nonlinear least-squares analysis", METH. ENZYMOL., vol. 117, 1985, pages 301 - 42
MA CSACCO MDHURST BTOWNSEND JAHU YSZETO T ET AL.: "Boceprevir, GC-376, and calpain inhibitors II, XII inhibit SARS-CoV-2 viral replication by targeting the viral main protease", CELL RES, vol. 30, no. 8, 2020, pages 678 - 692, XP037208260, DOI: 10.1038/s41422-020-0356-z
MARINHO EMANUELLE MACHADO ET AL: "Virtual screening based on molecular docking of possible inhibitors of Covid-19 main protease", MICROBIAL PATHOGENESIS, ACADEMIC PRESS LIMITED, NEW YORK, NY, US, vol. 148, 30 June 2020 (2020-06-30), XP086352584, ISSN: 0882-4010, [retrieved on 20200630], DOI: 10.1016/J.MICPATH.2020.104365 *
MOTULSKY HCHRISTOPOULOS A: "Fitting models to biological data using linear and nonlinear regression: a practical guide to curve fitting", 2004, OXFORD UNIVERSITY PRESS
ROY ALIM LSRIVASTAVA SLU YSONG J: "Solution conformations of Zika NS2B-NS3pro and its inhibition by natural products from edible plants", PLOS ONE, vol. 12, 2017, pages e0180632
SALGADO-BENVINDO ET AL.: "Suramin Inhibits SARS-CoV-2 Infection in Cell Culture by Interfering with Early Steps of the Replication Cycle", ANTIMICROB. AGENTS CHEMOTHER, vol. 64, no. 8, 2020, pages e00900 - 20, XP055766432, DOI: 10.1128/AAC.00900-20
SERI JO ET AL: "Flavonoids with inhibitory activity against SARS-CoV-2 3CLpro", JOURNAL OF ENZYME INHIBITION AND MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 35, no. 1, 1 January 2020 (2020-01-01), GB, pages 1539 - 1544, XP055739978, ISSN: 1475-6366, DOI: 10.1080/14756366.2020.1801672 *
SHAIKH SMTSEETHARAMAPPA JASHOKA SKANDAGAL PB: "A study of the interaction between bromopyrogallol red and bovine serum albumin by spectroscopic methods", DYES PIGMENTS, vol. 73, 2007, pages 211 - 216, XP005650337, DOI: 10.1016/j.dyepig.2005.11.008
WANG GLIU XYAN CBAI GLU Y: "Probing the binding of trypsin to glutathione-stabilized gold nanoparticles in aqueous solution", COLLOIDS SURF. B BIOINTERFACES, vol. 135, 2015, pages 261 - 266, XP029360684, DOI: 10.1016/j.colsurfb.2015.07.063
WU QYJIANG LLYANG SGZUO YWANG ZFXI Z ET AL.: "Hexahydrophthalimide-benzothiazole hybrids as a new class of protoporphyrinogen oxidase inhibitors: synthesis, structure-activity relationship, and DFT calculations", NEW J. CHEM., vol. 38, no. 9, 2014, pages 4510 - 4518
YIN WANCHAO ET AL: "Structural basis for inhibition of the SARS-CoV-2 RNA polymerase by suramin", NAT. STRUCT. MOL. BIOL, vol. 28, no. 3, March 2021 (2021-03-01), pages 319 - 325, XP037407902, ISSN: 1545-9993, DOI: 10.1038/S41594-021-00570-0 *
ZHANG LLIN DKUSOV YNIAN YMA QWANG JDE WILDE A: "a-Ketoamides as broadspectrum inhibitors of coronavirus and enterovirus replication: Structure-based design, synthesis, and activity assessment", J. MED. CHEM., vol. 63, 2020, pages 4562 - 4578, XP055806728, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.9b01828
ZHANG LLIN DSUN XCURTH UDROSTEN CSAUERHERING L ET AL.: "Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved a-ketoamide inhibitors", SCIENCE, vol. 368, no. 6489, 2020, pages 409 - 412, XP055814007, DOI: 10.1126/science.abb3405
ZHU WEI ET AL: "Identification of SARS-CoV-2 3CL Protease Inhibitors by a Quantitative High-Throughput Screening", ACS PHARMACOLOGY & TRANSLATIONAL SCIENCE, vol. 3, no. 5, 4 September 2020 (2020-09-04), pages 1008 - 1016, XP055847027, ISSN: 2575-9108, Retrieved from the Internet <URL:https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acsptsci.0c00108> DOI: 10.1021/acsptsci.0c00108 *

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