WO2022061429A1 - Uso de hexametoxilobelanina, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica e método de tratamento - Google Patents

Uso de hexametoxilobelanina, composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica e método de tratamento Download PDF

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WO2022061429A1
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Leonardo De Azevedo CALDERON
Carolina Bioni Garcia TELES
Ana Paula de Azevedo DOS SANTOS
Saara Neri FIALHO
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Fundação Oswaldo Cruz
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention belongs to the field of pharmacology, with particular application to the treatment of leishmaniasis.
  • Leishmaniasis are anthropozoonosis caused by protozoa of the genus Leishmania. They are transmitted by vector insects - sandflies - of the Lutzomyia genus in the New World and of the Phlebotomus genus in the Old World. The complex of different forms of leishmaniasis affects 12 million people on the planet (DESJEUX, 2004.).
  • Leishmaniasis manifests in two main clinical forms: visceral leishmaniasis (I), which can be fatal if left untreated, and tegumentary (II), whose mucocutaneous and cutaneous forms cause lesions that usually heal spontaneously but can leave scars or deformities, which lead this infectious disease to be classified as one of the six most important on the planet given its severity and prevalence (MARZOCHI; MARZOCHI, 1994; WHO, 2011; MARZOCHI et al., 2014) [005] The visceral form is considered the most serious among the leishmaniasis.
  • the treatment of choice for visceral leishmaniasis is pentavalent antimonials.
  • amphotericin B is the second choice.
  • the drug of choice is pentamidine. All these treatments have inadequacies such as low cure rate, adverse effects such as nephrotoxicity, splenotoxicity, pancreotoxity, cadiotoxicity, which suggest the urgency in the discovery or development of new medications or alternatives to increase efficiency and decrease patient toxicity (CROFT et al. ., 2006; BRAZIL, 2017).
  • the cutaneous form presents classic lesions that correspond to ulceration of raised edges, indurated and background with granulation tissue, which can evolve to the mucous form by hematogenous or lymphatic dissemination of the parasite (MARZOCHI, 1992; REY, 2008).
  • the parasite that causes Leishmaniasis is a protozoan of the Trypanosomatidae family.
  • Leishmanias that affect humans are classified into two phenotypic complexes grouped into two subgenera, each encompassing several species.
  • the Viannia complex that includes the braziliensis, guianensis, lainsoni, naifi complex and the Leishmania that includes mexicana, infantum, amazonensis, enrietii and hertigi (MARZOCHI, 1992).
  • the parasite can present three forms distinct: amastigotes, promastigotes and paramastigotes.
  • amastigote form is obligatorily intracellular, inhabiting the interior of the cells of the mononuclear phagocytic system of mammalian hosts. It has a rounded or oval shape, with a kinetoplast presenting vacuoles and is flagellated (MARZOCHI, 1992).
  • the promastigote form is elongated, presents free flagellum, is mobile with nucleus located in the central region of the cell, the kinetoplast between the anterior region and the nucleus presents granulations and small vacuoles. This form inhabits the digestive tract of invertebrate hosts (MARZOCHI, 1992; MICHALICK; RIBEIRO, 2011).
  • paramastigote forms have an oval or rounded shape similar to amastigotes, with a kinetoplast bordering the nucleus or posterior to it, a small free flagellum and are found attached to the vector's digestive tract.
  • the life cycle of Leishmania begins when the female sand fly takes a blood meal from an infected mammalian host and ingests amastigote forms of the parasite, free in the host's circulation or inside macrophages. If the blood ingested during this process has parasites, it goes to the midgut of the insect and the amastigotes transform into procyclic promastigotes, after five days they transform into metacyclic promastigotes, returning to be infective to the mammalian hosts.
  • the promastigote forms of this parasite differentiate into amastigote forms, able to multiply. These forms multiply in binary division until the cell ruptures, releasing into the circulation the amastigotes that can infect new neighboring cells and new vectors that will feed on this infected host, and can even infect domestic animals that will function as reservoirs of the disease (SILVEIRA , LAINSON; CORBETT, 2004).
  • Treatments for Leishmaniasis can be topical or systemic depending on the species of Leishmania involved in the infection, geographic region and clinical presentation of symptoms (MONGE-MAILLO; L ⁇ PEZ-VÉLEZ, 2013).
  • the drugs applied to the systemic treatment of leishmaniasis are pentavalent antimonials - sodium stibogluconate and meglumine antimoniate - and other antileishmanial agents such as amphotericin B, pentamidine, miltefosine and paromomycin.
  • pentavalent antimonials - sodium stibogluconate and meglumine antimoniate - and other antileishmanial agents such as amphotericin B, pentamidine, miltefosine and paromomycin.
  • the object of this invention represents a chemotherapeutic alternative to the pharmacological approaches available for the treatment of leishmaniasis.
  • S4 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine
  • the substance S4 belongs to the class of lobeline derivatives, whose actions on the dihydrofolate reductase enzyme and nicotinic receptors are known in the literature (SOARES-BEZERRA; LEON; GENESTRA, 2004; FELPIN; LEBRETON, 2004; FATOKI, et al., 2018).
  • the invention proposes the use of the compound 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine to prepare a medicament for the treatment of leishmaniasis.
  • the inventive concept presented also comprises pharmaceutical compositions containing the compound 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine and at least one pharmaceutically acceptable excipient. Still, other aspects of the invention provide for a pharmaceutical composition that contains other active ingredients with leishmanicidal action in addition to 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine.
  • compositions of the invention can also be used to prepare a medicament useful in the treatment of leishmaniasis.
  • the invention provides a method of treating leishmaniasis which comprises administering a therapeutically effective amount of the compound 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine to a subject with leishmaniasis.
  • Figure 1- Representative therapeutic scheme of compound S4 and amphotericin B used in mice of BALB/c strain.
  • FIG. 2 Cytotoxic concentration results for 50% of cells (CC 50 ) against THP-1, HepG2, Vero and murine macrophage.
  • THP-1, HepG2, Vero and murine macrophage (M0) cells were treated with compound S4 for 72 hours to obtain the respective CC 50 values.
  • ANFO amphotericin B
  • PTM pentamidine
  • S4 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine.
  • Results refer to the mean and standard deviation ( ⁇ ) of at least two independent results.
  • Columns marked with an asterisk (*) represent statistical difference from amphotericin B.
  • FIG. 3 Evaluation of hemolytic activity against human red blood cells.
  • Compound S4 was tested on red blood cells at 1%, at a concentration of 1,260 ⁇ M.
  • Positive control red blood cells hemolyzed with 0.05% saponin
  • Negative control 1% red blood cells in RPMI-1640 medium
  • RPMI-1640 absorbance of RPMI-1640 medium
  • PTM pentamidine
  • ANFO amphotericin B
  • S4 red blood cells treated with 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine. Results were expressed as mean ⁇ SD of three independent experiments. Columns marked with an asterisk (***) differ from the negative control group by the ANOVA test (p ⁇ 0.0001), followed by Tukey's post-test.
  • FIG. 4 Leishmanicidal evaluation of compound S4 and drugs pentamidine and amphotericin B on amastigote forms of L. (L.) amazonensis treated for 72 hours.
  • THP-1 cells were infected with L. (L.) amazonensis and treated for 72 hours.
  • Positive control THP-1 cells infected without treatment
  • ANFO THP-1 cells infected and treated with amphotericin B at a concentration of 2 ⁇ M
  • PTM THP-1 cells infected and treated with pentamidine at a concentration of 3 ⁇ M
  • S4 THP cells -1 infected and treated with 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine at a concentration of 80 ⁇ M.
  • FIG. 5 THP-1 cells infected by L. (L.) amazonensis with and without treatment to determine the growth inhibition of amastigotes (ICA 50 ).
  • THP-1 cells were infected with L. (L.) amazonensis and treated for 72 hours. After the treatment period, the cells were fixed on glass slides (duplicate) and stained with panoptic dye (NewProv, Brazil).
  • Black arrows indicate THP-1 cells infected by L. (L.) amazonensis. Black arrowheads indicate empty vacuoles.
  • - Scalar Bar 10 ⁇ m.
  • FIG. 6 Evaluation of the leishmanicidal activity of the compound S4 (3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine) and of amphotericin B in the development of lesion volume in BALB/c mice infected with L. (L. ) amazonensis.
  • Groups of BALB/c mice were infected subcutaneously (SC) in the footpad of the right hind paw with 2x10 6 /mL promastigotes of L. (L.) amazonensis.
  • the treatment took place for 10 days on alternate days, totaling five days of application.
  • the syringe image represents the days of application.
  • Figure 7 Skin lesion of BALB/c mice infected with L. (L.) amazonensis, during the days of treatment with the compound S4 (3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine) and amphotericin B. Groups of BALB/c mice were infected via SC in the plantar pad of the right hind paw with 2x10 6 /mL L. (L.) amazonensis promastigotes.
  • G1 Negative control (Uninfected and untreated group)
  • G2 Positive control (Infected and untreated group)
  • G3 Vehicle control (Infected group and treated with 3% DMSO plus RPMI-1640)
  • G4 Infected group and treated with 50 mg/kg of S4
  • G5 Infected group treated with 25 mg/kg of S4
  • G6 Infected group treated with 12.5 mg/kg of S4,
  • G7 Infected group treated with 5 mg/kg of amphotericin B
  • the photos were taken on the day of application of the S4 compound and amphotericin B. Representative image of one of the 5 animals in each group.
  • Figure 8 Evaluation of the leishmanicidal activity of the compound S4 (3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine) and of amphotericin B in BALB/c mice infected with L. (L) amazonensis.
  • Groups of BALB/c mice were infected via SC in the footpad of the right hind paw with 2x10 6 /mL L. (L.) amazonensis promastigotes.
  • the animals were treated intraperitoneally. The treatment took place for 10 days, on alternate days, totaling five days of application.
  • Negative control Uninfected and untreated group
  • Positive control Group infected without treatment
  • Vehicle control Infected group treated with 3% DMSO plus RPMI-1640
  • S4 Infected groups treated with S4 compound at concentrations of 50, 25, 12.5 mg/kg
  • ANF Infected group treated with amphotericin B at a concentration of 5 mg/kg.
  • Figure 9 Values of urea, creatine, TGO and TGP enzymes measured in BALB/c mice untreated and treated with compound S4 (3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine) at a concentration of 50 mg/ kg per day. Mice were treated by IP for 10 days on alternate days, totaling five days of application.
  • Control Untreated group
  • DMSO 3% group treated with DMSO 3%
  • ANFO 5 mg/kg treated with amphotericin B at a concentration of 5 mg/kg
  • S4 50 mg/kg Group treated with compound S4 at a concentration of 50 mg/kg.
  • the results shown represent the mean ⁇ standard deviation of the enzyme dosages of the animals in their referred groups.
  • the invention addresses the use of the substance 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine - also designated throughout the text as compound S4 - to prepare a drug to treat leishmaniasis.
  • the invention has based on the unprecedented identification of the leishmanicidal activity of the compound 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine, as illustrated in the examples.
  • compositions containing said substance are also within the scope of the invention, which is described in detail below.
  • the core of the invention comprises the use of the compound 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine (S4) to prepare a medicament for the treatment of leishmaniasis.
  • S4 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine
  • the medicament prepared with 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine is applied to the treatment of cutaneous and visceral leishmaniasis, mucocutaneous and cutaneous.
  • compositions of the invention may be prepared and formulated according to conventional methods, such as disclosed, for example, in the British, European and US Pharmacopoeias and in Remington: The Science and Practice of Pharmacy (GENNARO, AR Remington, a. science and practice of pharmacy. Guanabara Koogan, 2004).
  • compositions may comprise, in addition to the 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine compound, one or more pharmaceutically acceptable excipients and a carrier.
  • pharmaceutically acceptable excipient refers to substances that are not the active ingredient of a pharmaceutical composition, but are necessary for its formulation. In general, they are considered safe for medical and veterinary use according to established government standards.
  • pharmaceutically acceptable excipients are: dispersing agents, disintegrators, binders, fillers, lubricants, surfactants and preservatives.
  • the carriers can be, for example, water, buffers (e.g. phosphate-buffered saline), organic solvents such as alcohols or glycerin, glycols, aliphatic alcohols, mineral oil, vegetable oil and dimethyl sulfoxide; mixtures of water and organic solvents and mixtures of organic solvents, such as glycerin alcohol; lipid-based materials such as fatty acids, acylglycerols, phosphoglycerides, sphingolipids and waxes; protein-based materials such as collagen and gelatin; silicone-based materials (volatile and non-volatile); and hydrocarbon-based materials, such as microcomponents and polymer matrices.
  • organic solvents such as alcohols or glycerin, glycols, aliphatic alcohols, mineral oil, vegetable oil and dimethyl sulfoxide
  • mixtures of water and organic solvents and mixtures of organic solvents such as glycerin alcohol
  • lipid-based materials such as fatty
  • Said pharmaceutical compositions may be formulated for any route of administration, including, for example, topical, oral, nasal, rectal or parenteral administration.
  • parenteral includes subcutaneous injection, intradermal injection, intravascular (e.g., intravenous) injection, intramuscular injection, spinal injection, intracranial injection, intrathecal injection, and intraperitoneal injection, as well as any similar injection or infusion technique.
  • compositions can be formulated to be released at a predetermined rate.
  • Instant release can be achieved, for example, by sublingual administration (i.e., administration by mouth in such a way that the active ingredient(s) is/are rapidly absorbed by the blood vessels of the sublingual plexus).
  • the release rate can be varied using methods well known in the art, including (a) varying the thickness of the coating composition, (b) changing the amount of plasticizer addition to a coating (c) including ingredients additional agents, such as agents that modify the release, (d) change the composition, particle size, or particle shape of the matrix, and (e) provide one or more passes through the coating.
  • the amount of modulator contained in a sustained-release formulation depends, for example, on the method of administration (eg, the location of the implant), the rate and duration of expected release, and the nature of the condition to be treated or prevented.
  • compositions may comprise, in addition to the compound 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine, other active ingredients with leishmanicidal activity.
  • leishmanicidal designates a substance capable of promoting the death of parasites belonging to any of the species of the genus Leishmania, both in vitro and in vivo.
  • the substance with additional leishmanicidal action can be selected from pentavalent antimony compounds, pentamidine and amphotericin B.
  • a further embodiment of the invention comprises the use of any of the possible embodiments of said pharmaceutical compositions to prepare a medicament for treating leishmaniasis.
  • Yet another embodiment of the invention comprises a method of treating leishmaniasis which comprises administering an amount therapeutically effective compound of 3,3',4,4',5,5'-Hexamethoxylobelanine to an individual infected with any of the parasites belonging to any of the species of the genus Leishmania.
  • therapeutically effective depends on an individual's condition and the specific compound administered. The term refers to an amount effective to achieve a desired clinical effect. A therapeutically effective amount varies with the nature of the condition being treated, the time period of coverage of the desired activity, the age and condition of the individual, and is ultimately determined by the healthcare professional.
  • EXAMPLE 1 OBTAINING AND SOLUBILIZATION OF THE SYNTHETIC COMPOUND 3,3',4,4',5,5' HEXAMETHOXYLOBELANINE
  • the compound 3,3',4,4',5,5' Hexamethoxylobelanine is a synthetic substance derived from the chemical group methoxybenzene.
  • compound S4 was purchased commercially from the company Sigma-Aldrich. The compound was solubilized on the day of the respective experiments.
  • EXAMPLE 2 CYTOTOXICITY AND LEISHMANICIDAL ACTIVITY IN VITRO
  • Adherent cell lines HepG2 (derived from a human hepatoma) and Vero (derived from African green monkey kidney) were cultured as recommended by Calvo-Calle et al. (1994). Cells stored at -70°C were thawed at 37°C and cell contents transferred to 15 ml Falcon-type tubes containing five ml of incomplete RPMI-1640 medium. Then, centrifuged at room temperature at 1,500 rpm for five minutes, the supernatant was discarded and the pellet resuspended in complete RPMI-1640 medium.
  • the strains were cultivated in 75 cm 2 culture bottles (Corning, Tewksbury, USA) supplemented with complete RPMI-1640 medium and 40 pg/L of gentamicin (Sigma-Aldrich). The cells were kept in an oven at 37°C with 5% CO 2 , at 95% humidity, and the bottle medium was replaced every other day. After approximately 80% confluence, the cells were picked or used in the assays. of cytotoxicity.
  • the non-adherent THP-1 strain (human monocytic strain) was maintained under culture conditions, with a differential of repeats every three days, maintaining the proportion of 1x10 6 cells per mL (JAIN et al., 2012).
  • THP-1 cells were centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes at 24°C. Then, the supernatant was discarded and the pellet resuspended in 1 mL of complete RPMI-1640 medium. Cells were counted in a Neubauer chamber and adjusted at a ratio of 1.5x10 5 (cytotoxicity assay) and 2.5x10 6 (promastigote infection assay) cells/well in 96-well microplates and on sterile round coverslips (13 mm ) in 24-well plates with complete RPMI-1640 medium.
  • Phorbol-12-Myristate-13-acetate was used at 25 ng/mL. Cells were incubated in a humidified atmosphere with 5% CO 2 , 95% humidity at 37°C. After the incubation period, non-adhered cells were removed by washing with 1X PBS (JAIN et al., 2012).
  • Cytotoxicity assays were performed as described by Madureira et al. (2002). To prepare the plates, HepG2 and Vero adherent cells were treated with 1 ml of 0.25% trypsin-EDTA (Gibco/Invitrogen) so that they detached from the walls of the culture bottle. Then, they were incubated at 37°C for five minutes. At the end of the incubation, 9 ml of RPMI-1640 medium containing 10% FBS (complete) were added and the cells were centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes at room temperature.
  • trypsin-EDTA Gibco/Invitrogen
  • the supernatant was discarded and the pellet resuspended in 1 ml of complete RPMI-1640 medium.
  • the cells were counted in a Neubauer chamber and they were distributed in 96 microplates. wells at a concentration of 1x10 4 cells/well. Then, they were incubated for 12 to 16 hours in an oven at 37°C, 5% CO 2 and 95% humidity for the cells to adhere to the wells.
  • Peritoneal macrophages were obtained from inflammatory infiltrate induced in BALB/c mice by intraperitoneal inoculation of 2 mL of 3% Thioglycolate (Gibco® - Grand Island, NY, USA) (GORDON et al., 1974). After four days of inflammation, the mice were anesthetized and euthanized by cervical dislocation and 5 mL of ice-cold incomplete RPMI-1640 medium was injected into their peritoneal cavities and then retrieved again. The peritoneal exudate was centrifuged at 1,500 rpm for 10 minutes at 10°C. After centrifugation, the supernatant was discarded and the pellet resuspended in complete RPMI-1640 medium. You were counted in a Neubauer chamber and plated at the rate of 1x10 5 cells per well.
  • cytotoxicity was evaluated by means of the colorimetric test MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide - Sigma-Aldrich) according to the methodology described by Madureira et al. (2002). After differentiation and cell adhesion, a volume of 20 ⁇ L of compound S4 was added to the microplates in triplicate at the same serial concentrations described in item 2.4.3.
  • control parameters were used: positive viability control (untreated cells) and negative death control (cells treated with Lysis buffer - 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0.08% Triton X-100 , 0.008% saponin in 1x PBS, pH 7.5) and complete RPMI-1640 medium (blank).
  • the microplates were incubated at 37°C in an oven with 5% CO 2 and 95% humidity for 72 hours. After treatment, 20 ⁇ L of an MTT solution at a concentration of 5 mg/mL was added to each well; then the plates were incubated for four hours at 37°C in an oven with 5% CO 2 and 95% humidity. At the end of this period, the culture medium together with MTT were discarded and 100 ⁇ L of DMSO was added to each well to solubilize the formazan crystals metabolized by the cells that showed viability.
  • Optical reading was performed using a microplate spectrophotometer (Biochrom Asys, Expert Plus, Holliston, USA) at wavelengths of 570 nm. Cell viability was determined based on the following equation:
  • cytotoxic concentration for 50% of the cells was determined through concentration-response curves, as a function of non-linear regression, using the Origin program, as described in the leishmanicidal activity assays (item 2.4.4 ).
  • Non-cytotoxic concentrations of S4 for THP-1 cells were chosen for the 50% Amastigote Growth Inhibition (ICA 50 ) assay.
  • the strain of Leishmania (Leishmania) amazonensis was obtained from the Leishmania Collection bank of Instituto Oswaldo Cruz - CLIOC, Fiocruz do Rio de Janeiro. Maintenance took place in a BOD incubator (Tecnal) at an average temperature of 24°C in complete RPMI-1640 medium (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplemented with fetal bovine serum (FBS), previously inactivated at 10% (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2 mM L-glutamine, 20 nM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-22, ethanesulfonic acid; Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and 50 ⁇ g/mL of Gentamicin (Sigma-Aldrich).
  • the growth curve was obtained by counting daily during seven days. Promastigotes in exponential growth phase were used for leishmanicidal activity assays. Before each experiment, the viability and flagellar motility of the parasites were observed under an optical microscope (NIKON) at 400X magnification (AGNEW et al., 2001).
  • the growth curve was established. For this, 1x10 6 parasites per ml were resuspended in complete RPMI-1640 culture medium and incubated at 24°C in a BOD oven. The growth was evaluated by means of differential counting of the promastigotes, every two days, in a Neubauer hemocytometric chamber and with the aid of Erythrosine B dye (Sigma-Aldrich) at 0.04% (w/v) in an optical microscope with magnification. of 400X. Stained parasites were considered dead, while birefringent and mobile ones were considered alive. The calculation was performed considering only the number of live parasites.
  • promastigote forms of L. (L.) amazonensis were adjusted to a concentration of 1x10 6 parasites/mL in complete RPMI-1640 medium (item Growth curve of promastigote forms of L. (L.) amazonensis' ) and distributed in a volume of 180 ⁇ L of that concentration of parasites in 96-well flat-bottomed microplates (NUNC, Roskilde, Denmark).
  • a volume of 20 ⁇ L of compound S4 was added in triplicate to the final concentration of 1260-19.68 ⁇ M.
  • the final volume of parasites and compound in the assays was 200 ⁇ L per well.
  • microplates were incubated at 24°C for 72 hours in a BOD oven.
  • assays were performed using positive controls without treatment, negative controls with 9 ⁇ M pentamidine (SIGMA-Aldrich), 10 ⁇ M amphotericin B (Unianf®), RPMI-1640 medium (white) and DMSO solvent (Sigma-Aldrich). ) at 0.5%.
  • the amastigotes were treated with S4 at serial concentrations of 80-0.15 ⁇ M.
  • S4 serial concentrations of 80-0.15 ⁇ M.
  • macrophages infected by L. (L.) amazonensis incubated with complete RPMI-1640 medium were used, for the negative control, infected macrophages were used and treated with pentamidine (3-0.01 ⁇ M ) and amphotericin B (2- 0.004 pM) and wells containing only complete RPMI-1640 medium (blank).
  • 96-well microplates and 24-well plates were treated.
  • the plates were incubated at 32°C, 5% CO 2 for 72 hours.
  • the 96-well microplates were washed three times with 200 ⁇ L of incomplete RPMI-1640 medium and the process of cell lysis and parasite recovery was started (description in the next item).
  • the coverslips present in the 24-well plates, after the 72-hour period of treatment, were stained and analyzed according to the number of amastigotes per macrophages and determination of the phagocytic index (item Determination of the phagocytic index).
  • Cell lysis for parasite recovery was performed with the detergent sodium dodecyl sulfate (SDS-Sigma-Aldrich) at 0.05% in 20 ⁇ L of incomplete RPMI-1640 medium per well for 30 seconds under constant agitation, obtaining thus lysis of the cell membrane, which results in less loss of parasite viability.
  • 180 ⁇ L of complete RPMI-1640 medium was added to each well.
  • the plates were incubated for 48 hours at 24°C in a BOD oven for the differentiation of the parasites from their amastigote to promastigote form (MAIA et al., 2007).
  • the 96-well microplates were used for quantitative analysis and parasite survival using the AlamarBlue colorimetric method (description item Quantitative Analysis and Parasite Survival).
  • the 24-well plates had the coverslips removed and stained with panoptic dye (NewProv, Brazil) according to the manufacturer's instructions. Afterwards, they were mounted on slides for microscopy analysis with Entellan mounting medium (Merck).
  • a total of 100 cells per slide were analyzed, counted by optical microscopy (duplicates for each sample) with the aid of a 100X objective. Concomitantly, the images were recorded in an Eclipse 80i microscope (Nikon Instruments Inc.) in a 100X objective with the aid of a photographic camera (Nikon). Images were processed using NIS-Elements imaging software (Nikon Instruments Inc.). To determine the phagocytic index (IF), the percentage of infected macrophages in 100 total cells visualized and multiplying the average number of amastigotes per macrophages (BARBIERI et al., 1993). The phagocytic index was calculated according to the equation below:
  • IF % infected macrophages X average number of parasites per macrophage Quantitative analysis and survival of parasites
  • IS selectivity index
  • CC 50 value referring to the cytotoxic concentration for 50% of the cells
  • ICA 50 50% growth inhibition of amastigotes.
  • dpN standard deviation of the negative control
  • dpP standard deviation of the positive control
  • MN mean of the negative control
  • MP mean of the positive control.
  • Compound S4 showed similar cytotoxic activity results for THP-1 (302.55 ⁇ M) and HepG2 (384.88 ⁇ M) cells; the same, when evaluated against the cell of showed greater cytotoxicity, with a CC 50 value of 149.25 ⁇ M .
  • S4 showed no cytotoxic effect at the highest concentration tested (1,260 ⁇ M).
  • Table 2 In vitro cytotoxic activity using the MTT assay against THP-1, HepG2, Vero and 0 cells
  • CC 50 50% cytotoxic concentration of cells
  • ⁇ SD results correspond to the mean of three experiments for each sample and standard deviation
  • PTM pentamidine
  • ANFO Amphotericin B. 72-hour treatment
  • Amphotericin B was the drug that showed the lowest CC 50 value against macrophages: THP-l with CC 50 of 8.26 ⁇ M) and with CC 50 of 5.9 ⁇ M.
  • Figure 5 demonstrates the stained coverslips containing infected macrophages and the presence of empty vacuoles in these cells, after treatment with S4 and the drugs pentamidine and amphotericin B.
  • ICA 50 for compound S4 was 10 ⁇ M, infected and treated cells with pentamidine resulted in an average ICA 50 value of 1.5 ⁇ M, while with the drug amphotericin B, the ICA value 50 was 0.25 ⁇ M.
  • selectivity index (IS) value of compound S4 considering the ICA 50 values of L. (L.) amazonensis, results of IS greater than 10 were obtained against all cells tested (Table 3).
  • Compound S4 showed better IS values than pentamidine for THP-1, HepG2, Vero and (Table 4) cells.
  • ICA50 50% growth inhibition of amastigotes
  • ⁇ SD results correspond to the mean of three experiments for each sample and standard deviation
  • mice Male BALB/c mice were used, 8 to 10 weeks old and weighing between 21 and 24 g, from the Animal Creation and Experimentation Platform (PCEA) of Fiocruz Rondônia.
  • PCEA Animal Creation and Experimentation Platform
  • the animals were kept in a twelve-hour light/dark cycle, at a temperature of 22 ⁇ 2°C, with exhaust air present. Sterile food and water were provided ad libitum.
  • Three to five animals were kept in polypropylene or polycarbonate cages (30x19x13 cm), with shavings bedding, in accordance with CONCEA Normative Resolution No. 15, of December 16, 2013.
  • mice of the BALB/c strain were weighed, marked, infected and then randomly sorted according to weight. Identification occurred as described in Table 4, with a total of seven groups, each group containing the sample number of five animals.
  • the infection of the animals occurred subcutaneously (SC) with promastigotes of L. (L.) amazonensis (strain IFLA/BR/1967/PH8); after being washed with PBS IX, the parasites were counted in a Neubauer chamber and adjusted to 2x10 6 in 30 ⁇ L.
  • the parasites were in the third passage in stationary phase of in vitro culture.
  • PBS IX was used in the final volume of 30 ⁇ L. Inoculation took place on the right footpad of the hind paws in 30 mice (adapted from KROPF et al., 1997).
  • the treatment started on the 54th day of infection, when the infected paws reached an average of 0.38 mL of lesion volume. After the beginning of the treatment, the swelling of the paws and weight of the animals were measured every day until the day of euthanasia of the animals.
  • Compound S4 was solubilized in DMSO, not exceeding 3% and diluted in incomplete RPMI-1640 medium.
  • Amphotericin B was directly diluted in PBS IX.
  • the concentrations used in the treatment were calculated using the average weight of the animals, where the concentrations used were 50, 25, 12.5 mg/kg/day for compound S4 and 5 mg/kg/day for amphotericin B (Table 4) (adapted from MASIC et al., 2015).
  • RFU relative unit of fluorescence
  • Fluorescence test treated animals (G3 to G7)
  • Tissue weight values were divided according to the tissue weight of the paws of each animal
  • Fluorescence of the control Group of infected animals and untreated (G2)
  • Fluorescence Blank wells with complete RPMI-1640 medium only.
  • TGP glutamic pyruvic transaminase
  • TGO oxaloacetic glutamic transaminase
  • urea urea
  • creatinine colorimetric assays were performed using commercial kits according to the manufacturer's standards (Labtest Diagnostica, Lagoa Santa, Brazil). The reference values used as parameters were the animals of the control group without treatment.
  • amphotericin B (G7) was able to reduce the number of parasites in relation to the untreated infected control (G2); like the compound S4 at the highest concentration, this drug showed a statistically significant difference (p ⁇ 0.001) in relation to the infected group (Gl).
  • ALKHALDI A.
  • DE KONING H.P.
  • BUKHARI S.N.A.
  • BARBIERI C.L.
  • GIORGIO S.
  • MERJAN A.J.
  • FIGUEIREDO E. N. Glycosphingolipid Antigens of Leishmania (Leishmania) amazonensis Amastigotes Identified by Use of a Monoclonal Antibody. Infect. Immun., v. 61, no. 5, p. 2131-2137, 1993.
  • BATES P. A. Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture. Parasitology, v. 108, no. 01, p. 1-9, 1994.
  • BRAZIL MINISTRY OF HEALTH. DEPARTMENT OF HEALTH SURVEILLANCE. Department of Communicable Disease Surveillance. Tegumentary Leishmaniasis Surveillance Manual. Brasilia: Ministry of Health, 2017. 189 p.
  • CHAPPUIS F. et al. Visceral leishmaniasis: what are the needs for diagnosis, treatment and control?. Nature reviews microbiology, vol. 5, no. 11, p. 873-882, 2007.
  • KATSUNO K., BURROWS, JN, DUNCAN, K., HUIJSDUIJNEN, RH, KANEKO, T., KITA, K., MOWBRAY, CE SCHMATZ, D., WARNER, P., SLINGSBY, BT Hit and lead criteria in drug discovery for infectious diseases of the developing world. nat. Rev. Drug. Discov., v. 14, no. 11, p. 751-758, 2015.
  • KHOURI R.; NOVAIS, F.; SANTANA, G.; OLIVEIRA, C.L; SANTOS, MAV; BARRAL, A.; BARRA-NETO, M.; VAN, JW DETC induces Leishmania parasites killing in human in vitro and murine in vivo models: A promising therapeutic alternative in leishmaniasis. Pios One, v. 5, no. 12, p. 94-143, 2010.
  • MADUREIRA M.; MARTINS, A.P.; GOMES, M.; PAIVA, J.; PROEN ⁇ A, C. A.; ROS ⁇ RIO, V. Antimalarial activity of medicinal plants used in traditional medicine in S Tomé and Principe islands. J. Ethnopharmacol., v. 81, no. 1, p. 23-29, 2002.
  • MAIA C.; ROL ⁇ O, N.; NUNES, M.; GON ⁇ ALVES, L.; CAMPINO, L. Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum. Acta Tropica, v. 103, no. 2, p. 150-155, 2007.
  • MARZOCHI M. C. de A. Course-Infectious-parasitic diseases: leishmaniasis in Brazil: cutaneous leishmaniasis. J. bras. Med, v. 63, no. 5/6, p. 82-104, 1992.
  • MARZOCHI M.C.A.
  • MARZOCHI K. B. F. Tegumentary and visceral leishmaniasis in Brazil - Emerging anthropozoonosis and possibilities for their control.
  • MARZOCHI M.C.A.
  • MARZOCHI K.B.F.
  • FACUNDES A.
  • CONCEI ⁇ O-SILVA F. The issue of Leishmaniasis control in Brazil.
  • CONCEI ⁇ O-SILVA F.
  • ALVES C.R (Org.).
  • MASIC A.; HERNANDEZ, A.M.V.; HAZRA, S.; GLASER, J.; HOLZGRABE, U.; HAZRA, B.; SCHURIGT, U. Cinnamic acid bornyl ester derivatives from Valeriana wallichii exhibit antileishmanial in vivo activity in Leishmania major-infected BALB/c Mice. Pios One, v.10, n. 11, p. 1-20, 2015.
  • MICHALICK MSM
  • RIBEIRO RR Genus Leishmania.
  • NEVES DP Human Parasitology. 12 ed. S ⁇ o Paulo: Editora Atheneu, 2011. Cap 7, p 41-44.
  • MIKUS, J.; STEVERDING, D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye Alamar Blue®. parasitol. Int., v. 48, no. 3, p. 265-269, 2000.
  • PETERSEN A. L. de O. A. et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages.
  • PLoS One vol. 7, no. 11, p. e49496, 2012.
  • RODRIGUES R. F. Evaluation of leishmanicidal activity in vitro and in vivo of Mesoionic Thiadiazole compounds. Rio de Janeiro, 2007. xiv, 131 f.: il.; 30 cm. Dissertation (Master's) - Instituto Oswaldo Cruz, Parasitic Biology.
  • SILVEIRA F.T.
  • LAINSON R.
  • CORBETT C. E. P. Clinical and Immunopathological Spectrum of American Cutaneous Leishmaniasis with Special Reference to the Disease in Amazonian Brazil - A Review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 99, no. 3, p. 239-251, 2004.
  • TIUMAN TIUMAN
  • TS et al Recent advances in leishmaniasis treatment. International Journal of Infectious Diseases, v. 15, no. 8, p. e525-e532, 2011.
  • WANG W. et al. Protective effect of PEGylation against poly (amidoamine) dendrimer-induced hemolysis of human red blood cells. J. Biomed. mother Res., v. 93, no. 1, p. 59-64, 2010.

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Abstract

A invenção descreve a aplicação terapêutica do composto 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina no tratamento de leishmanioses. Composições farmacêuticas compreendendo 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina e uso destas também estão contemplados.

Description

USO DE HEXAMETOXILOBELANINA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO DE TRATAMENTO
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A invenção pertence ao campo da farmacologia, com particular aplicação ao tratamento das leishmanioses.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] As leishmanioses são antropozoonoses causadas protozoários do gênero Leishmania. São transmitidas por insetos vetores - flebotomíneos - do gênero Lutzomyia no novo mundo e do gênero Phlebotomus no velho mundo. O complexo das diferentes formas de leishmaniose afeta 12 milhões de pessoas no planeta (DESJEUX, 2004.).
[003] Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS, 2010), 90% dos casos de Leishmaniose Visceral ocorrem em Bangladesh, Brasil, índia, Nepal e Sudão e 90% dos casos da forma cutânea ocorrem no Afeganistão, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita e Síria. Por sua vez, a forma mucocutânea está presente em países como a Bolívia, Brasil e Peru (MS, 2017; WHO/OMS, 2010 e 2011). A OMS enquadra as leishmanioses entre as seis doenças infecto-parasitárias endêmicas de maior relevância, pelo seu alto coeficiente de detecção e capacidade de produzir deformidades (CHAPPUIS et al., 2007; WHO/OMS/TRS, 1990).
[004] As leishmanioses se manifestam em duas formas clínicas principais: leishmaniose visceral (I), que pode ser fatal se deixada sem tratamento, e tegumentar (II), cujas formas mucocutânea e cutânea causam lesões que geralmente se curam espontaneamente, mas podem deixar cicatrizes ou deformidades, o que levam essa doença infecciosa a ser classificada como uma das seis mais importantes do planeta dada a sua gravidade e prevalência (MARZOCHI; MARZOCHI, 1994; WHO, 2011; MARZOCHI et al., 2014) [005] A forma visceral é considerada a mais grave dentre as leishmanioses. Como o seu nome sugere, acomete as vísceras, afetando principalmente órgãos com alta concentração de leucócitos com destaque para medula óssea, fígado, baço e linfonodos levando frequentemente a anomalias no tamanho desses órgãos. Esta doença pode levar a óbito até 90% das pessoas acometidas pela doença se deixadas sem tratamento (CHAPPUIS et al., 2007; WHO/OMS, 2010 e 2011).
[006] O tratamento de primeira escolha para leishmaniose visceral são os antimoniais pentavalentes. Em casos mais graves, ou em pacientes que não respondem adequadamente ao tratamento com os antimoniais, a anfotericina B é a segunda escolha. Em último caso, o fármaco de escolha é a pentamidina. Todos esses tratamentos apresentam inadequações como baixa taxa de cura, efeitos adversos tais como nefrotoxidade, esplenotoxidade, pancreotoxidade, cadiotoxidade, que sugerem a urgência na descoberta ou desenvolvimento de novas medicações ou alternativas para aumentar a eficiência e diminuir a toxidade ao paciente (CROFT et al., 2006; BRASIL, 2017).
[007] A forma cutânea apresenta lesões clássicas que correspondem à ulceração de bordas elevadas, enduradas e de fundo com tecido de granulação, que pode evoluir para a forma mucosa por disseminação hematogênica ou linfática do parasito (MARZOCHI, 1992; REY, 2008).
[008] O parasito causador da Leishmaniose é um protozoário da família Trypanosomatidae. Atualmente, as Leishmanias que afetam o homem são classificadas em dois complexos fenotípicos agrupados em dois subgêneros, englobando várias espécies cada um deles. O complexo Viannia que inclui o complexo braziliensis, guianensis, lainsoni, naifi e o Leishmania que inclui mexicana, infantum, amazonensis, enrietii e hertigi (MARZOCHI, 1992).
[009] Morfologicamente, o parasito pode apresentar três formas distintas: amastigota, promastigotas e paramastigota.
[0010] A forma amastigota é obrigatoriamente intracelular, habitando o interior das células do sistema fagocítico mononuclear de hospedeiros mamíferos. Possui forma arredondada ou ovalada, com cinetoplasto apresentando vacúolos e é aflagelada (MARZOCHI, 1992).
[0011] A forma promastigota é alongada, apresenta flagelo livre, é móvel com núcleo localizado na região central da célula, o cinetoplasto entre a região anterior e o núcleo apresenta granulações e pequenos vacúolos. Esta forma habita o trato digestório dos hospedeiros invertebrados (MARZOCHI, 1992; MICHALICK; RIBEIRO, 2011).
[0012] As formas paramastigotas apresentam forma ovaladas ou arredondadas semelhantemente às amastigotas, com cinetoplasto margeando o núcleo ou posterior a este, pequeno flagelo livre e são encontradas aderidas ao trato digestório do vetor.
[0013] O ciclo de vida das Leishmanias se inicia quando a fêmea do flebotomíneo realiza o repasto sanguíneo em um hospedeiro mamífero infectado e ingere formas amastigotas do parasito, livres na circulação do hospedeiro ou no interior de macrófagos. Se o sangue ingerido durante esse processo possuir parasites, ele vai para o intestino médio do inseto e as amastigotas transformam-se em promastigotas procíclicas, após cinco dias transformam-se em promastigotas metacíclicas, voltando a ser infectante aos hospedeiros mamíferos.
[0014] As promastigotas metacíclicas migram para a probóscide do vetor e durante o hematofagismo são inoculadas no hospedeiro vertebrado (BATES, 1994). A presença de moléculas como a lipopolisacaridase e a proteína GP63 fazem com que estas formas resistam à ação lítica do complemento permitindo rápida fagocitose por células do sistema imune como neutrófilos, células dendríticas e, principalmente, macrófagos que foram atraídos até o local da inoculação iniciando uma reação inflamatória à infecção (GUEIRARD et al., 2008).
[0015] Após o processo de intemalização e formação do vacúolo parasitóforo, as formas promastigotas deste parasito diferenciam-se em formas amastigotas, aptas a se multiplicarem. Essas formas multiplicam-se em divisão binária até a ruptura da célula liberando na circulação as amastigotas que poderão infectar novas células vizinhas e novos vetores que venham a realizar o repasto neste hospedeiro infectado, podendo inclusive infectar animais domésticos que funcionarão como reservatórios da doença (SILVEIRA, LAINSON; CORBETT, 2004).
[0016] Os tratamentos para as Leishmanioses podem ser tópicos ou sistêmicos dependendo da espécie de Leishmania envolvida na infecção, região geográfica e apresentação clínica dos sintomas (MONGE-MAILLO; LÓPEZ-VÉLEZ, 2013).
[0017] De modo geral, os fármacos aplicados ao tratamento sistêmico das leishmanioses são os antimoniais pentavalentes - estibogluconato de sódio e antimoniato de meglumina - e outros agentes antileishmaniais como anfotericina B, a pentamidina, a miltefosina e a paromomicina. No entanto, tais opções terapêuticas apresentam elevada toxicidade para vários órgãos e sistemas, limitando a ampla utilização e subsidiando o desenvolvimento de novas abordagens farmacológicas com maior eficácia e menos efeitos adversos (PETERSEN, 2012; TIUMAN, 2011).
[0018] Neste contexto, o objeto desta invenção representa uma alternativa quimioterápica às abordagens farmacológicas disponíveis para tratamento de leishmanioses. Objetivamente, descreve-se a atividade leishmanicida do composto 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina (S4) e sua potencial aplicação no tratamento de leishmanioses. A substância S4 pertence à classe de derivados da Lobelina, cujas ações sobre a enzima dihidrofolato redutase e receptores nicotínicos são conhecidas na literatura (SOARES- BEZERRA; LEON; GENESTRA, 2004; FELPIN; LEBRETON, 2004; FATOKI, et al., 2018). A atividade leishmanicida de compostos contendo grupamentos metoxibenzeno também já é descrita (ALKHALDI et al., 2019), sem, contudo, divulgar ou prever os efeitos surpreendentes do composto S4. Assim, a aplicação de S4 ao tratamento de leishmanioses será descrita a seguir de maneira inédita.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0019] A invenção propõe o uso do composto 3,3',4,4',5,5'- Hexametoxilobelanina para preparar um medicamento para tratamento de leishmanioses.
[0020] O conceito inventivo que se apresenta também compreende composições farmacêuticas contendo o composto 3,3',4,4',5,5'- Hexametoxilobelanina e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Ainda, outros aspectos da invenção dão conta de uma composição farmacêutica que contenha outros ingredientes ativos com atuação leishmanicida além de 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina.
[0021] Consequentemente, as composições farmacêuticas da invenção também podem ser usadas para preparar um medicamento útil no tratamento de leishmanioses.
[0022] Ainda, a invenção prevê um método de tratamento de leishmanioses que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina a um indivíduo com leishmaniose.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1- Esquema terapêutico representativo do composto S4 e anfotericina B empregado em camundongos de linhagem BALB/c.
Figura 2 - Resultados de concentração citotóxica para 50% das células (CC50) frente a THP-1, HepG2, Vero e macrófago murino. As células THP-1, HepG2, Vero e macrófago murino (M0) foram tratadas com o composto S4 por 72 horas para obter os respectivos valores de CC50. ANFO = anfotericina B, PTM = pentamidina, S4 = 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina. Os resultados referem-se à média e desvio padrão (±) de no mínimo dois resultados independentes. Colunas marcadas com asterisco (*) representam diferença estatística em relação a anfotericina B. Colunas marcadas com cerquilhas (#) representam diferença estatística em relação a pentamidina (*/# = p<0,05 e ***/### = p<0,001), seguido por pós-teste de Tukey.
Figura 3 - Avaliação da atividade hemolítica frente a hemácias humanas. O composto S4 foi testado em hemácias a 1%, em concentração de 1.260 μM. Controle positivo = hemácias hemolisadas com saponina 0,05%, Controle negativo = hemácia a 1% em meio RPMI-1640, RPMI-1640 = absorbância do meio RPMI-1640, PTM = pentamidina, ANFO = anfotericina B, S4 = hemácias tratadas com 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina. Os resultados foram expressos como média ± DP de três experimentos independentes. Colunas marcadas com asterisco (***) diferem do grupo controle negativo pelo teste ANOVA (p < 0,0001), seguido por pós-teste de Tukey.
Figura 4 - Avaliação leishmanicida do composto S4 e fármacos pentamidina e anfotericina B sobre formas amastigotas de L. (L.) amazonensis tratados por 72 horas. Células THP-1 foram infectadas com L. (L.) amazonensis e tratados por 72 horas. Controle positivo = células THP-1 infectadas sem tratamento, ANFO = células THP-1 infectadas e tratadas com anfotericina B na concentração de 2 μM, PTM = células THP-1 infectadas e tratadas com pentamidina na concentração de 3 μM, S4 = células THP-1 infectadas e tratadas com 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina na concentração de 80 μM. Após o período de tratamento, as células foram fixadas em lâminas de vidro (duplicata) e coradas com corante panótico (NewProv, Brasil). O número de amastigotas por células e índice fagocítico foram determinados pela contagem de 100 células/lamínula. Os resultados referem-se à média e desvio padrão (±) de triplicatas de um experimento representativo. Colunas marcadas com asterisco (*) representam diferença estatística significante em relação ao controle positivo (* = p<0,05 e *** = p<0,001), seguido por pós- teste de Tukey.
Figura 5 - Células THP-1 infectadas por L. (L.) amazonensis com e sem tratamento para determinação da inibição do crescimento de amastigotas (ICA50). Células THP-1 foram infectadas com L. (L.) amazonensis e tratados por 72 horas. Após o período de tratamento, as células foram fixadas em lâminas de vidro (duplicata) e coradas com corante panótico (NewProv, Brasil). A = Controle positivo (células THP-1 infectadas sem tratamento), B = células THP-1 infectadas e tratadas com pentamidina na concentração de 3 μM, C = células THP-1 infectadas e tratadas com anfotericina B na concentração de 2 μM, D = células THP-1 infectadas e tratadas com 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina (S4) na concentração de 80 μM. As setas de cor preta indicam células THP-1 infectadas por L. (L.) amazonensis. Pontas das setas pretas indicam vacúolos vazios. - = Escalar Bar 10 μm.
Figura 6 - Avaliação da atividade leishmanicida do composto S4 (3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina) e da anfotericina B no desenvolvimento de volume da lesão em camundongos BALB/c infectados com L. (L.) amazonensis. Os grupos de camundongos BALB/c foram infectados via subcutânea (SC) no coxim plantar da pata direita traseira com 2x106/mL promastigotas de L. (L.) amazonensis. O tratamento ocorreu durante 10 dias em dias alternados, totalizando cinco dias de aplicação. A imagem da seringa representa os dias de aplicação. A medida do volume da lesão foi acompanhada a cada dois dias durante todo o período de experimentação; após o início do tratamento, foi monitorado diariamente. O inchaço foi determinado usando Pletismômetro de pata (Insight). Controle negativo (G1) = grupo não infectado, Controle positivo (G2) = grupo infectado sem tratamento, Controle veículo (G3) = grupo infectado e tratado com DMSO 3% mais RPMI-1640, (G4) = grupo infectado e tratado com S4 (50 mg/kg/dia), (G5) = grupo infectado e tratado com S4 (25 mg/kg/dia), (G6) = grupo infectado e tratado com S4 (12,5 mg/kg/dia), (G7) = ANFO: anfotericina B (5 mg/kg/dia). As medidas apresentadas demonstram a diferença entre as patas não infectadas, as infectadas e tratadas. Colunas marcadas com asterisco (*) representam diferença estatística significativa (* = p<0,05 e *** = p<0,0001) quando comparado ao grupo controle positivo (G2 = grupo infectado sem tratamento), seguido por pós-teste de Tukey. Os resultados referem-se à média e desvio padrão (±) do número amostrai de cinco animais por grupo (n=5).
Figura 7 - Lesão cutânea de camundongos da linhagem BALB/c infectados com L. (L.) amazonensis, durante os dias de tratamento com o composto S4 (3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina) e a anfotericina B. Os grupos de camundongos BALB/c foram infectados via SC no coxim plantar da pata direita traseira com 2x106/mL promastigotas de L. (L.) amazonensis. G1 = Controle negativo (Grupo não infectado e sem tratamento), G2 = Controle positivo (Grupo infectado sem tratamento) G3 = Controle veículo (Grupo infectado e tratado com DMSO 3% mais RPMI-1640), G4 = Grupo infectado e tratado com 50 mg/kg de S4, G5 = Grupo infectado e tratado com 25 mg/kg de S4, G6 = Grupo infectado e tratado com 12,5 mg/kg de S4, G7 = Grupo infectado e tratado com 5 mg/kg de anfotericina B. As fotos foram tiradas no dia da aplicação do composto S4 e anfotericina B. Imagem representativa de um dos 5 animais de cada grupo.
Figura 8 - Avaliação da atividade leishmanicida do composto S4 (3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina) e da anfotericina B em camundongos BALB/c infectados com L. (L) amazonensis. Os grupos de camundongos BALB/c foram infectados via SC no coxim plantar da pata direita traseira com 2x106/mL promastigotas de L. (L.) amazonensis. Os animais foram tratados por via intraperitoneal. O tratamento ocorreu durante 10 dias, em dias alternados, totalizando cinco dias de aplicação. Controle negativo = Grupo não infectado e sem tratamento, Controle positivo = Grupo infectado sem tratamento, Controle veículo = Grupo infectado e tratado com DMSO 3% mais RPMI-1640, S4 = Grupos infectados e tratados com composto S4 nas concentrações de 50, 25, 12,5 mg/kg, ANF = Grupo infectado e tratado com anfotericina B na concentração de 5 mg/kg. Os dados foram expressos como leitura da unidade relativa de fluorescência de parasites vivos. Grupos marcados com asterisco (***) apresentam significância estatística quando comparados com grupo controle positivo (Grupo infectado sem tratamento) pelo teste ANOVA (p<0,0001), seguido por pós-teste de Tukey. Médias e os desvios padrão foram analisados entre os números de animais em cada grupo. Os grupos tinham número amostrai de 5 animais (n=5).
Figura 9 - Valores das enzimas ureia, creatina, TGO e TGP dosados dos camundongos BALB/c não tratados e tratados com composto S4 (3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina) na concentração de 50 mg/kg por dia. Os camundongos foram tratados por via IP durante 10 dias em dias alternados, totalizando cinco dias de aplicação. Controle = Grupo não tratado, DMSO 3% = grupo tratado com DMSO a 3%, ANFO 5 mg/kg = tratado com anfotericina B na concentração de 5 mg/kg, S4 50 mg/kg = Grupo tratado com composto S4 na concentração de 50 mg/kg. Os resultados mostrados representam a média ± desvio padrão das dosagens enzimáticas dos animais em seus referidos grupos. Grupos marcados com asterisco (***) apresentam significância estatística quando comparado com grupo controle (Grupo sem tratamento) pelo teste ANOVA (p<0,001), seguido por Teste de Tukey. Médias e os desvios padrões foram analisados entre os números de animais em cada grupo. Os grupos tinham número amostrai de 5 animais (n=5 ).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0020] A invenção aborda o uso da substância 3,3',4,4',5,5'- Hexametoxilobelanina - também designada ao longo do texto por composto S4 - para preparar um medicamento para tratar leishmanioses. O invento tem base na identificação inédita da atividade leishmanicida do composto 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina, conforme está ilustrado nos exemplos.
[0022] Composições farmacêuticas contendo a referida substância, o uso destas composições para preparar medicamentos e métodos de tratamento de leishmaniose também estão compreendidos no escopo da invenção, que é descrita detalhadamente a seguir.
[0023] A não ser que seja definido de maneira distinta, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a presente invenção pertence. O relatório descritivo também provê definições de termos para auxiliar na interpretação daquilo que é aqui descrito e das reivindicações. A terminologia utilizada na descrição da invenção tem finalidade de descrever concretizações preferenciais somente, sem qualquer intenção de limitar o escopo de seus ensinamentos.
[0024] Salvo quando indicado em contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar dependendo das propriedades a serem obtidas.
[0025] O cerne da invenção compreende o uso do composto 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina (S4) para preparar um medicamento para tratamento de leishmaniose.
[0026] Em um aspecto particular da invenção, o medicamento preparado com 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina é aplicado ao tratamento de leishmaniose tegumentar e visceral, mucocutânea e cutânea.
[0027] Outra modalidade da invenção compreende composições farmacêuticas que contêm 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina. As composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas e formuladas de acordo com os métodos convencionais, tais como divulgados, por exemplo, nas Farmacopeias Britânicas, Europeias e dos Estados Unidos e em Remington: a ciência e prática da farmácia (GENNARO, A. R. Remington, a ciência e a prática da farmácia. Guanabara Koogan, 2004).
[0028] No contexto da invenção, as composições farmacêuticas podem compreender, além do composto 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis e um veículo.
[0029] O termo “excipiente farmaceuticamente aceitável” se refere a substâncias que não são o ingrediente ativo de uma composição farmacêutica, mas são necessárias à sua formulação. De maneira geral, são considerados seguros para uso médico e veterinário de acordo com os padrões governamentais estabelecidos. São exemplos não exaustivos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis: agentes dispersantes, desintegradores, aglutinantes, preenchedores, lubrificantes, agentes surfactantes e conservantes.
[0030] Os veículos podem ser, por exemplo, água, tampões (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), solventes orgânicos, tais como álcoois ou glicerina, glicóis, álcoois alifáticos, óleo mineral, óleo vegetal e dimetil sulfóxido; misturas de água e solventes orgânicos e misturas de solventes orgânicos, tais como álcool glicerina; materiais à base de lipídios, como ácidos graxos, acilgliceróis, fosfoglicerídeos, esfingolípidos e ceras; materiais à base de proteínas, como colágeno e gelatina; materiais à base de silicone (voláteis e não voláteis); e materiais à base de hidrocarbonetos, como microcomponentes e matrizes poliméricas.
[0031] As referidas composições farmacêuticas podem ser formuladas para qualquer via de administração, incluindo, por exemplo, administração tópica, oral, nasal, retal ou parenteral. O termo parenteral, como aqui utilizado, inclui injeção subcutânea, injeção intradérmica, injeção intravascular (por exemplo, intravenosa), injeção intramuscular, injeção espinhal, injeção intracraniana, injeção intratecal e injeção intraperitoneal, bem como qualquer técnica semelhante de injeção ou infusão.
[0032] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para serem liberadas a uma taxa predeterminada. A liberação instantânea pode ser obtida, por exemplo, por administração sublingual (isto é, administração pela boca de tal maneira que o(s) ingrediente(s) ativo(s) é/são rapidamente absorvidos pelos vasos sanguíneos do plexo sublingual).
[0033] A taxa de liberação pode ser variada usando métodos bem conhecidos na técnica, incluindo (a) variação da espessura da composição do revestimento, (b) alteração da quantidade da maneira de adição de plastificante em um revestimento (c) inclusão de ingredientes adicionais, tais como agentes que modificam a liberação, (d) alteração da composição, tamanho das partículas ou formato das partículas da matriz e (e) fornecimento de uma ou mais passagens através do revestimento. A quantidade de modulador contido em uma formulação de liberação sustentada depende, por exemplo, do método de administração (por exemplo, a localização do implante), a taxa e a duração da liberação esperada e a natureza da condição a ser tratada ou impedido.
[0034] Em um aspecto da invenção, as composições podem compreender, além do composto 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina, outros ingredientes ativos com atividade leishmanicida.
[0035] O termo “leishmanicida” designa uma substância capaz de promover a morte de parasitos pertencentes a qualquer uma das espécies do gênero Leishmania, tanto in vitro quanto in vivo.
[0036] Em concretizações particulares destas composições, a substância com ação leishmanicida adicional pode ser selecionada de compostos antimoniais pentavalentes, pentamidina e anfotericina B.
[0037] Uma modalidade adicional da invenção compreende o uso de qualquer uma das possíveis concretizações das referidas composições farmacêuticas para preparar um medicamento para tratar leishmanioses.
[0038] Ainda, outra modalidade da invenção compreende um método de tratamento de leishmaniose que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina a um indivíduo infectado com qualquer um dos parasitos pertencentes a qualquer uma das espécies do gênero Leishmania.
[0039] A expressão “terapeuticamente eficaz”, conforme usada aqui, depende da condição de um indivíduo e do composto específico administrado. O termo refere-se a uma quantidade eficaz para alcançar um efeito clínico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz varia de acordo com a natureza da condição a ser tratada, o período temporal de cobertura da atividade desejada, a idade e a condição do indivíduo e, em última análise, é determinada pelo profissional de saúde.
[0040] Embora várias formas de realização que incorporam os ensinamentos da invenção tenham sido aqui mostradas e descritas em detalhes, àqueles versados na técnica será possível vislumbrar prontamente muitas outras formas de realização variadas que possam ainda incorporar esses ensinamentos. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tomarão aparentes aos peritos na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações a seguir.
[0041] A invenção será agora descrita por meio de exemplos, os quais pretendem apenas ilustrar as possíveis concretizações englobadas pelo conceito inventivo aqui descrito, não sendo, de modo algum, limitativos quanto ao escopo e a abrangência da presente invenção.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1: OBTENÇÃO E SOLUBILIZAÇÃO DO COMPOSTO SINTÉTICO 3,3',4,4',5,5' HEXAMETOXILOBELANINA
[0042] O composto 3,3',4,4',5,5' Hexametoxilobelanina (S4) é uma substância sintética derivada do grupo químico metoxibenzeno. Para concretizar os exemplos a seguir, o composto S4 foi adquirido comercialmente da empresa Sigma-Aldrich. O composto foi solubilizado no dia da realização dos respectivos experimentos.
[0043] Nos ensaios subsequentes, o composto S4 foi solubilizado em dimetilsulf óxido (DMSO-Sigma- Aldrich). A concentração final de DMSO nas soluções de trabalho não ultrapassou o limite de 0,5% em ensaios in vitro e 3% nos ensaios in vivo.
Tabela 1: Estrutura química, nomenclatura e peso molecular do composto S4.
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EXEMPLO 2: CITOTOXICIDADE E ATIVIDADE LEISHMANICIDA IN VITRO
Material e Métodos
Cultivo de linhagens celulares
[0044] As linhagens celulares aderentes HepG2 (derivada de um hepatoma humano) e Vero (derivada de rim do macaco- verde africano) foram cultivadas como recomendado por Calvo-Calle et al. (1994). As células armazenadas em temperatura de -70°C foram descongeladas a 37°C e o conteúdo celular transferido para tubos do tipo Falcon de 15 mL contendo cinco mL de meio RPMI-1640 incompleto. Em seguida, ocorreu a centrifugação em temperatura ambiente a 1.500 rpm por cinco minutos, o sobrenadante foi desprezado e o pellet ressuspenso em meio RPMI-1640 completo.
[0045] O cultivo das linhagens ocorreu em garrafas de cultura de 75 cm2 (Corning, Tewksbury, EUA) suplementadas com meio RPMI-1640 completo e 40 pg/L de gentamicina (Sigma- Aldrich). As células foram mantidas em estufa a 37°C com 5% de CO2, a 95% de umidade, e o meio das garrafas foi substituído em dias alternados. Após a confluência de aproximadamente 80%, as células foram repicadas ou utilizadas nos ensaios de citotoxicidade.
[0046] A linhagem não-aderente THP-1 (linhagem monocítica humana) foi mantida nas condições de cultivo, com diferencial de repiques a cada três dias, mantendo a proporção de 1x106 células por mL (JAIN et al., 2012).
Diferenciação de células THP-1
[0047] As células THP-1 foram centrifugadas a 1.500 rpm por 10 minutos a 24°C. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em 1 mL de meio RPMI-1640 completo. As células foram contadas em câmara de Neubauer e ajustadas na proporção de 1,5x105 (ensaio de citotoxicidade) e 2,5x106 (ensaio de infecção com promastigotas) células/poço em microplacas de 96 poços e sobre lamínulas redondas estéreis (13 mm) em placas de 24 poços com meio RPMI-1640 completo. Para a diferenciação completa de monócitos não aderentes (THP-1) em macrófagos aderentes, foi utilizado Forbol-12-Miristato-13-acetato (PMA-Sigma- Aldrich) a 25 ng/mL. As células foram incubadas em atmosfera úmida com 5% de CO2, a 95% de umidade a 37°C. Após o período de incubação, as células não aderidas foram removidas por lavagem com PBS 1X (JAIN et al., 2012).
Preparo das placas para os ensaios de citotoxicidade com células de linhagem [0048] Os ensaios de citotoxicidade foram realizados como descrito por Madureira et al. (2002). Para o preparo das placas, as células aderentes HepG2 e Vero foram tratadas com 1 mL de tripsina-EDTA a 0,25% (Gibco/Invitrogen) para que as mesmas descolassem das paredes da garrafa de cultura. Em seguida, foram incubadas a 37°C por cinco minutos. Ao término da incubação, foram adicionados 9 mL de meio RPMI-1640 contendo 10% de SFB (completo) e as células foram centrifugadas a 1.500 rpm por 10 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em 1 mL de meio RPMI-1640 completo. A contagem das células ocorreu em câmara de Neubauer e as mesmas foram distribuídas em microplacas de 96 poços na concentração de 1x104 células/poço. Em seguida, foram incubadas por 12 a 16 horas em estufa a 37°C, 5% de CO2 e 95% de umidade para adesão das células aos poços.
Obtenção dos macrófagos peritoneais murinos para ensaios de toxicidade [0049] Macrófagos (M0) peritoneais foram obtidos a partir de infiltrado inflamatório induzido em camundongos BALB/c através de inoculação intraperitoneal de 2 mL de Tioglicolato 3% (Gibco® - Grand Island, NY, USA) (GORDON et al., 1974). Após quatro dias de inflamação, os camundongos foram anestesiados e eutanasiados por deslocamento cervical e 5 mL de meio RPMI-1640 incompleto gelado foram injetados em suas cavidades peritoneais e, em seguida, recuperado novamente. O exsudado peritoneal foi centrifugado a 1.500 rpm por 10 minutos à temperatura de 10°C. Após centrifugação, ocorreu o descarte do sobrenadante e o pellet ressuspenso em meio RPMI-1640 completo. Os
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foram contados em uma câmara de Neubauer e plaqueados na proporção de 1x105 células por poço.
Ensaio de citotoxicidade utilizando MTT
[0050] A citotoxicidade foi avaliada por meio do teste colorimétrico MTT (brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2, 5-difenil-2H-tetrazólio - Sigma- Aldrich) de acordo com metodologia descrita por Madureira et al. (2002). Após diferenciação e adesão das células, o volume de 20 μL do composto S4 foi adicionado às microplacas em triplicata nas mesmas concentrações seriadas descritas no item 2.4.3. Como parâmetros de controles foram utilizados: controle positivo de viabilidade (células não tratadas) e controle negativo de morte (células tratadas com tampão de Lise - 20 mM de Tris-HCl, 5 mM de EDTA, 0,08% de Triton X-100, 0,008% de saponina em PBS lx, em pH 7,5) e meio RPMI-1640 completo (branco). As microplacas foram incubadas a 37°C em estufa com 5% de CO2 e 95% de umidade por 72 horas. Após o tratamento, adicionou-se a cada poço 20 μL de uma solução de MTT na concentração de 5 mg/mL; em seguida, as placas foram incubadas por quatro horas a 37°C em estufa com 5% de CO2 e 95% de umidade. Ao final desse período, o meio de cultura juntamente com MTT foram desprezados e 100 μL de DMSO adicionados a cada poço para a solubilização dos cristais de formazan metabolizados pelas células que apresentavam viabilidade.
[0051] A leitura óptica foi realizada por meio de um espectrofotômetro de microplacas (Biochrom Asys, Expert Plus, Holliston, USA) nos comprimentos de onda de 570 nm. A viabilidade das células foi determinada com base na seguinte equação:
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Determinação do CC50
[0052] A concentração citotóxica para 50% das células (CC50) foi determinada através de curvas concentração-resposta, em função de regressão não-linear, por meio do programa Origin, como descritos nos ensaios de atividade leishmanicida (item 2.4.4). Concentrações não-citotóxicas de S4 para as células THP-1 foram escolhidas para o ensaio de Inibição de Crescimento de 50% de Amastigotas (ICA50).
Manutenção dos parasitos
[0053] A Cepa de Leishmania (Leishmania) amazonensis (IFLA/BR/67PH8) foi obtida do banco de Coleção de Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz - CLIOC, Fiocruz do Rio de Janeiro. A manutenção ocorreu em estufa incubadora BOD (Tecnal) com temperatura média de 24°C em meio RPMI-1640 (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) completo suplementado com soro fetal bovino (SFB), previamente inativado à 10% (Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), L-glutamina a 2 mM, 20 nM HEPES (N-2-hidroxietilpiperazina-N'-22, ácido etanosulfônico; Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e 50 μg/mL de Gentamicina (Sigma-Aldrich).
[0054] A curva de crescimento foi obtida por contagem diária durante sete dias. Promastigotas em fase exponencial de crescimento foram utilizadas para os ensaios de atividade leishmanicida. Antes de cada experimento, foi observada a viabilidade e a motilidade flagelar dos parasitos em microscópio óptico (NIKON) no aumento de 400X (AGNEW et al., 2001).
Curva de crescimento de formas promastigotas de L. (L.) amazonensis
[0055] Para a propagação in vitro das formas promastigotas, foi estabelecida a curva de crescimento. Para tanto, 1x106 parasitos por mL foram ressuspensos em meio de cultura RPMI-1640 completo e incubados a 24°C em estufa BOD. O crescimento foi avaliado por meio de contagem diferencial das promastigotas, a cada dois dias, em câmara hemocitométrica de Neubauer e com o auxílio do corante Eritrosina B (Sigma-Aldrich) a 0,04% (p/v) em microscópico óptico com aumento de 400X. Os parasitos corados eram considerados mortos, enquanto aqueles birrefringentes e móveis foram considerados vivos. O cálculo foi realizado considerando apenas o número de parasitos vivos. Para calcular a média aritmética das contagens foi utilizado o número de parasitos contido em 1 mL de cultura. O cálculo foi realizado utilizando a fórmula: n° de parasitos = média dos quatro quadrantes x n° da diluição x 104 [0056] Após atingir o final da fase logarítmica os parasitos foram centrifugados a 1.200 rpm por 10 minutos e lavados em solução estéril PBS IX pH 7,4 (tampão salina fosfato) com a mesma centrifugação. Após a lavagem, os parasitos foram ressuspensos em meio RPMI-1640 completo e o crescimento foi acompanhado até os repiques subsequentes ou utilizadas nos ensaios de atividade leishmanicida (AGNEW et al., 2001).
Atividade leishmanicida sobre formas promastigotas in vitro
Para a avaliação da atividade leishmanicida, formas promastigotas de L. (L.) amazonensis foram ajustadas na concentração de 1x106 parasitos/mL em meio RPMI-1640 completo (item Curva de crescimento de formas promastigotas de L. (L.) amazonensis') e distribuídas no volume de 180 μL dessa concentração de parasitos em microplacas de 96 poços de fundo chato (NUNC, Roskilde, Dinamarca). Juntamente foi adicionado o volume de 20 μL do composto S4 em triplicata na concentração final de 1.260-19,68μM . O volume final de parasitos e do composto nos ensaios foi de 200 μL por poço. As microplacas foram incubadas a 24°C por 72 horas em estufa BOD. Em paralelo, foram realizados ensaios utilizando os controles positivos sem tratamento, negativo com 9 μM de pentamidina (SIGMA-Aldrich), 10 μM de anfotericina B (Unianf®), meio RPMI-1640 (branco) e o solvente DMSO (Sigma- Aldrich) a 0,5%.
[0057] Após os períodos de tratamento, foram adicionados a cada poço 20 μL (2 mM) de uma solução de AlamarBlue (Sigma-Aldrich) e, em seguida, as placas foram novamente incubadas em estufa BOD ao abrigo da luz por cinco horas a 24°C. Após esse período, foi realizada a leitura em um espectrofotômetro (Biotek, Synergy) em fluorescência nos parâmetros 530/25 (excitação) e 590/35 (emissão) (Adaptado de ROLÓN et al., 2006). Os valores foram processados pelo programa Gen5® 5.11. A fluorescência obtida foi usada para os cálculos de viabilidade parasitária com base na seguinte equação:
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Determinação do IC50
[0058] A inibição de crescimento para 50% da população de parasitos (IC50) foi determinada por meio de curvas concentrações-resposta, em função de regressão não linear, por meio do programa Origin (Origin Lab Corporation, Northampton, MA, EUA, Versão 9.1). Em subsequência o composto S4 foi encaminhado para os ensaios de citotoxicidade frente as células THP-1, HepG2, Vero e macrófagos murinos
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Atividade leishmanicida contra formas Amastigotas em células THP-1 in vitro [0059] Para a infecção da cultura de células THP-1 diferenciadas (tópico Diferenciação de células THP-1) com promastigotas de L. (L.) amazonensis, utilizou-se a proporção de 1:10 célula/parasito; esta proporção foi usada para os ensaios de determinação do índice fagocítico (análise microscópica por contagem direta) e recuperação dos parasitos.
[0060] Após lavagem com PBS IX das células THP-1 tratadas com PMA para o processo de diferenciação dos monócitos em macrófagos aderentes, 200 μL de cultura diluída com promastigotas de L. (L.) amazonensis (2,5x106 parasitos/mL) foram acrescentados às placas de 24 poços (contendo lamínulas redondas estéreis de 13 mm) e microplacas de 96 poços. Em seguida, a adição dos parasitos à cultura de células THP-1 diferenciadas, as placas foram incubadas a 32°C, 5% de CO2 durante 24 horas para que ocorresse a infecção. Posteriormente, ao período de infecção, ocorreu a lavagem dos poços com PBS IX para remoção das promastigotas não internalizadas (CALLAHAN et al., 1996; JAIN et al., 2012).
Tratamento das células THP-1 infectadas
[0061] Após o período de infecção, as amastigotas foram tratadas com S4 nas concentrações seriadas de 80-0,15 μM . Como controle positivo foram usados macrófagos infectados por L. (L.) amazonensis incubados com meio RPMI-1640 completo, para o controle negativo, foram usados macrófagos infectados e tratados com pentamidina (3-0,01 μM ) e anfotericina B (2-0,004 pM) e poços contendo somente meio RPMI-1640 completo (branco).
Nessas condições foram tratadas as microplacas de 96 e placas de 24 poços (com lamínulas - contraprova dos resultados obtidos das microplacas de 96 poços). As placas foram incubadas a 32°C, 5% de CO2 durante 72 horas. Passado o período de tratamento, as microplacas de 96 poços foram lavadas três vezes com 200 μL de meio RPMI-1640 incompleto e iniciado o processo de lise das células e recuperação dos parasitos (descrição no próximo item). As lamínulas presentes nas placas de 24 poços, após o período de 72 horas de tratamento, foram coradas e analisadas de acordo com o número de amastigotas por macrófagos e determinação do índice fagocítico (item Determinação do índice fagocítico).
Lise controlada e recuperação dos parasitos
[0062] A lise celular para recuperação dos parasitos foi feita com o detergente Dodecil sulfato de sódio (SDS- Sigma- Aldrich) a 0,05% em 20 μL de meio RPMI-1640 incompleto por poço por 30 segundos sob agitação constante, obtendo assim a lise da membrana celular, o que resulta em uma menor perda de viabilidade dos parasitos. Após a lise controlada, foram adicionados 180 μL de meio RPMI-1640 completo a cada poço. Em seguida, as placas foram incubadas durante 48 horas a 24°C em estufa BOD para que ocorresse a diferenciação dos parasitos de sua forma amastigota para promastigota (MAIA et al., 2007). As microplacas de 96 poços foram usadas para análise quantitativa e sobrevivência dos parasitos usando o método colorimétrico AlamarBlue (descrição item Análise quantitativa e sobrevivência dos parasitos).
Determinação do índice fagocítico
[0063] Posteriormente ao período de incubação e infecção, as placas de 24 poços tiveram as lamínulas retiradas e coradas com corante panótico (NewProv, Brasil) segundo as instruções do fabricante. Após, foram montadas em lâminas para análise de microscopia com meio de montagem Entellan (Merck).
[0064] Foi analisado um total de 100 células por lâminas, contadas por microscopia óptica (duplicatas para cada amostra) com auxílio da objetiva de 100X. Concomitantemente, foi realizado o registro das imagens em microscópio Eclipse 80i (Nikon Instruments Inc.) na objetiva de 100X com auxílio de uma câmera fotográfica (Nikon). As imagens foram processadas no software de imagem NIS-Elements (Nikon Instruments Inc.). Para determinação do índice fagocítico (IF), foi contada a porcentagem de macrófagos infectados em 100 células totais visualizadas e multiplicando a média do número de amastigotas por macrófagos (BARBIERI et al., 1993). O índice fagocítico foi calculado de acordo com a equação abaixo:
IF= % de macrófagos infectados X número médio de parasitos por macrófago Análise quantitativa e sobrevivência dos parasitos
[0065] Após a lise controlada e incubação, a sobrevivência intracelular (amastigotas) de L. (L.) amazonensis nas microplacas de 96 poços e a consequente proliferação de promastigotas (extracelulares) foram quantificadas por meio do indicador fluorescente AlamarBlue (adaptado por MIKUS et al., 2000; KHOURI et al., 2010). Para isso, 20 μL de uma solução de AlamarBlue a 2 mM foram adicionados às microplacas e estas incubadas em estufa a 24°C por cinco horas. A fluorescência foi determinada em um espectrofotômetro (Biotek, Synergy) a uma excitação de 530/25 e 590/35 de emissão. Os valores foram processados pelo programa Gen5® 5.11. Os resultados foram expressos nos valores de Inibição de Crescimento de 50% de Amastigotas (ICA50). As curvas concentrações-resposta foram determinadas como descrito no item (2.4.4), onde o ICA50 foi obtido por meio da seguinte fórmula:
ICA (%) = 100 - (fluorescência teste - fluorescência Branco X 100)
(fluorescência controle sem tratamento - fluorescência Branco)
Determinação do índice de seletividade
[0066] O índice de seletividade (IS) foi obtido calculando-se a razão entre o valor de CC50 e os valores de ICA50. O valor resultante deste cálculo reflete quantas vezes o composto S4 é seletivo ao parasito em relação às células, sendo que quanto maior o valor do IS menos tóxico o composto é para a célula hospedeira (KATSUNO et al., 2015). Quando não foi possível calcular o valor de CC50, o IS foi determinado como maior do que a razão entre a maior concentração testada e os valores de ICA50. O índice de seletividade do composto foi obtido com base na seguinte equação: IS = CC50 / ICA50
Onde: IS = índice de seletividade, CC50 = valor referente à concentração citotóxica para 50% das células; ICA50 = inibição de crescimento de 50% das amastigotas.
Controle de qualidade - Z’ - factor
[0067] Durante a fase dos ensaios de atividade leishmanicida nas formas promastigotas, amastigotas assim como nos ensaios de citotoxicidade, os experimentos foram submetidos a um parâmetro de controle de qualidade dos resultados obtidos. O parâmetro utilizado para esse controle foi o Z'- f actor (ZHANG; CHUNG; OLDENBURG, 1999), um fator estatístico adimensional que indica a qualidade pelo grau de diferença entre controles positivos e negativos. Os valores de Z'-factor foi calculado com base na fórmula abaixo:
Z'-factor = 1-3 (dpN + dpP) / (MN - MP)
Onde: dpN = desvio padrão do controle negativo, dpP = desvio padrão do controle positivo, MN = média do controle negativo, MP = média do controle positivo.
Determinação da citotoxicidade frente a eritrócitos humanos
[0068] A determinação da atividade hemolítica foi realizada como descrito por Wang et al. (2010), o composto S4 foi testado em concentrações seriadas de 1.260-19,68 μM . Juntamente realizou-se ensaios com os fármacos Pentamidina em concentrações seriadas de 9-0,14 μM e anfotericina B em concentrações entre 5-0,078 μM .
[0069] Após diluição, 20 μL foram adicionados a 180 μL de uma suspensão de eritrócitos humanos a 1% em microplacas de fundo em “U” (KASVI). As microplacas foram incubadas por 30 minutos a 37 °C em agitação a cada cinco minutos. Após incubação, a placa foi centrifugada a 1.500 rpm por 10 minutos. Então, o sobrenadante foi transferido para microplacas de 96 poços em fundo chato (placas de leitura). A absorbância do sobrenadante foi obtida em um espectrofotômetro de microplacas (Biochrom Asys, Expert Plus, Holliston, USA) a 540 nm. Como parâmetro de controle positivo de hemólise foi utilizado 0,05% de saponina (Sigma- Aldrich), como controle negativo foi usado o sobrenadante das hemácias não lisadas cultivadas somente em meio RPMI-1640 incompleto (branco), a hemólise foi calculada com base na fórmula abaixo:
Análises estatísticas
[0070] As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do programa GraphPad Prism versão 6.0 e Origin versão 9.1. Para realização dos cálculos de IC50, CC50 e ICA50 foram feitas regressões não lineares das médias e dos valores referentes a cada concentração, com os valores sendo observados com base de no mínimo três experimentos independentes.
[0071] Em todos os métodos utilizados, as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando o valor de p obtido apresentou resultado menor que 0,05 (p < 0,05).
Resultados
Atividade citotóxica
[0072] O composto S4 apresentou resultados de atividade citotóxica semelhantes para células THP-1 (302,55 μM) e HepG2 (384,88 μM) ; o mesmo, quando avaliado contra a célula de
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apresentou maior citotoxicidade, com um valor de CC50 de 149,25 μM . Contra as células da linhagem Vero, S4 não apresentou efeito citotóxico na maior concentração testada (1.260 μM). Tabela 2 - Atividade citotóxica in vitro utilizando o ensaio de MTT frente às células THP-1, HepG2, Vero e 0
Figure imgf000027_0003
CC50 = concentraçâo citotoxíca de 50% das células, ± DP = resultados correspondem à média de três experimentos para cada amostra e desvio padrao,
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= Macrófagos peritoneaís murinos, PTM = pentamidina; ANFO = anfotericina B. Tratamiento de 72 horas
[0073] Ao comparar os resultados de toxicidade celular do S4 frente aos fármacos de referência (Tabela 2), observa-se que este composto apresentou menor toxicidade que as drogas pentamidina e anfotericina B, em relação às células THP-1 (Figura 2A), HepG2 (Figura 2B), Vero (Figura 2C) e M0 (Figura 2D) com significância estatística de p<0,05 e p<0,001.
[0074] A anfotericina B foi o fármaco que apresentou valor de CC50 mais baixo contra macrófagos: THP-lcom CC50 de 8,26 μM) e
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com CC50 de 5,9 μM.
[0075] Os resultados obtidos referentes à atividade citotóxica do composto S4 foi avaliada para dar continuidade aos ensaios de inibição de crescimento contra formas amastigotas (ICA50) em células THP-1 infectadas com promastigotas de L. (L.) amazonensis. Assim, foram avaliadas concentrações não citotóxicas do composto S4 contra células THP- 1.
Avaliação da atividade hemolítica do composto S4
[0076] Subsequentemente, o composto foi submetido ao teste de hemólise para avaliar sua capacidade hemolítica frente a eritrócitos humanos. Os resultados demonstraram um nível de segurança satisfatório frente a este parâmetro, visto que a concentração de 1.260, maior concentração utilizada, não ocasionou a hemólise das hemácias. Observa-se na Figura 3 que os valores de absorbância do composto, foram semelhantes ao controle negativo de hemácia em meio RPMI-1640 incompleto. Quando comparado a absorbância hemolítica do controle de saponina a 0,05%, utilizada como controle positivo de hemólise, foi possível observar valores maiores de absorbância (média de 0,526 nm).
Atividade leishmanicida contra formas promastigotas de L. (L.) amazonensis [0077] O composto S4 foi testado quanto à sua atividade leishmanicida in vitro contra promastigotas de L. (L.) amazonensis por 72 horas, o composto apresentou resultado de inibição de crescimento de 50% da população de parasites (IC50) de 37 μM (± 0,31). Em paralelo, foram feitos controles de morte com os fármacos de referência pentamidina e anfotericina B. A pentamidina apresentou valor de IC50 de 0,38 μM (± 0,014), quando avaliados os resultados para anfotericina B, esta apresentou IC50 de 0,043 μM (± 0,03). Os valores de IC50 foram determinados em curvas concentração- resposta.
Recuperação de promastigotas após lise de células THP-1 infectadas com L. (L. ) amazonensis e análise de índice de seletividade
[0078] Após os ensaios de atividade leishmanicida e citotoxicidade, foram determinados os valores das concentrações que reduziram em 50% o número de amastigotas (ICA50) no modelo de células THP-1 infectados com L. (L.) amazonensis, tratadas com o composto S4, para isso foram utilizadas as concentrações seriadas de 80-0,15 μM . As concentrações foram determinadas selecionando os valores abaixo daqueles que permitiam uma viabilidade celular acima de 80% nos testes de citotoxicidade contra as células THP- 1.
[0079] Para confirmação dos resultados de recuperação e sobrevivência dos parasites (microplacas de 96 poços), foi realizada como contraprova a contagem do número de amastigotas por macrófagos e o índice fagocítico (IF); os ensaios foram realizados em placas de 24 poços. Para a obtenção desses resultados, foram usadas células THP-1 diferenciadas em macrófagos aderentes, onde as mesmas foram cultivadas em lamínulas de vidro e infectadas com promastigotas de L. (L.) amazonensis. [0080] Os resultados apresentados na Figura 4 mostram que, nos poços controle de macrófagos infectados (controle positivo) cultivados somente em meio RPMI-1640 completo, observou-se uma porcentagem média de macrófagos infectados de 57,75%, com índice fagocítico (IF) de 2,35. Contrário a isso, ao avaliar as células THP-1 infectadas e tratadas com o S4 (80 μM), este apresentou valores de 1,75% de macrófagos infectados e IF de 0,0021. Ao determinar a quantidade de amastigotas nas células tratadas com composto S4 em relação ao controle, observou-se a inibição de crescimento do parasito de 97,89%. Esses resultados indicam que S4 apresenta inibição de crescimento significativa contra formas amastigotas de L. (L.) amazonensis.
[0081] Ao avaliar os ensaios com os fármacos pentamidina (3 μM) e anfotericina B (2 μM ), também foi possível observar uma diminuição significativa no número de amastigotas por macrófagos. Para a pentamidina, a porcentagem média de macrófagos infectados foi de 11,66% e o IF de 0,06 com inibição de crescimento dos parasites de 77,92%. Os valores para anfotericina B foram os mais significativos entre esses fármacos, tanto para porcentagem de macrófagos infectados como IF, ambos com valor de zero, quando comparado com o controle positivo a anfotericina B inibiu em 100% o crescimento dos parasites.
[0082] A Figura 5 demonstra as lamínulas coradas contendo macrófagos infectados e a presença de vacúolos vazios nessas células, após o tratamento com S4 e os fármacos pentamidina e anfotericina B.
[0083] Após o tratamento por 72 horas, foi realizada a lise controlada da membrana com SDS a 0,05% para análise quantitativa de recuperação e sobrevivência dos parasites (ensaio em placas de 96 poços). A viabilidade das formas promastigotas foi determinada por teste fluorimétrico (Alamarblue). As curvas concentração-resposta foram usadas para determinar os valores de ICA50. Para o cálculo de ICA50 foi considerado como controle positivo as células THP-1 infectadas sem tratamento.
[0084] O resultado de ICA50 para o composto S4 foi de 10 μM, as células infectadas e tratadas com pentamidina resultou em um valor médio de ICA50 de 1,5 μM, enquanto que com o fármaco anfotericina B, o valor de ICA50 foi de 0,25 μM . Ao avaliar o valor de índice de seletividade (IS) do composto S4, considerando os valores ICA50 de L. (L.) amazonensis, obtiveram-se resultados de IS maior que 10 contra todas as células testadas (Tabela 3). O composto S4 apresentou valores de IS melhores que a pentamidina para as células THP-1, HepG2, Vero e (Tabela 4).
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Tabela 3 - Atividade leishmanicida in vitro frente às formas amastigotas de L. (L.) amazonensis e análise de índice de seletividade frente às células THP-
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ICA50 = Inibição de Crescimento de 50% das amastigotas, ± DP = resultados correspondem à média de três experimentos para cada amostra e desvio padrão, IS = índice de seletividade: Resultados foram expressos calculando-se a razão entre o valor da concentração citotóxica para as células (CC50) e o valor de inibição de crescimento 50% dos parasitos (ICA50), = Macrófagos murinos, PTM = Pentamidina, ANFO = Anfotericina B.
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EXEMPLO 3: ATIVIDADE LEISHMANICIDA IN VIVO
Material e Métodos
Critério de seleção do composto para ensaio in vivo
[0085] Os critérios utilizados para dar continuidade aos ensaios in vivo, foram baseados nos parâmetros de inibição de crescimento de amastigota < a 10 μM, índice de seletividade > a 10 (razão calculada entre a forma amastigota e as células THP-1) (adaptado de IOSET et al., 2009).
Obtenção dos animais
[0086] Foram utilizados camundongos da linhagem BALB/c, machos de 8 a 10 semanas e com peso entre 21 e 24 g, provenientes da Plataforma de Criação e Experimentação Animal (PCEA) da Fiocruz Rondônia. [0087] Os animais foram mantidos em um ciclo de doze horas de claro/escuro, em temperatura de 22 ± 2°C, com exaustão de ar presente. Agua e ração esterilizada foram fornecidas ad libitum. As quantidades de três a cinco animais foram mantidas em gaiolas de polipropileno ou policarbonato (30x19x13 cm), com cama de maravalha, de acordo com a Resolução Normativa n° 15, de 16 de dezembro de 2013, do CONCEA.
Infecção dos animais com promastigotas de L. (L.) amazonensis
[0088] Os camundongos da linhagem BALB/c foram pesados, marcados, infectados e, em seguida, separados de forma aleatória de acordo com o peso. A identificação ocorreu como descrito na Tabela 4, com o total de sete grupos, cada grupo continha o número amostrai de cinco animais. A infecção dos animais ocorreu via subcutânea (SC) com promastigotas de L. (L.) amazonensis (cepa IFLA/BR/1967/PH8); após serem lavadas com PBS IX, os parasitos foram contados em câmara de Neubauer e ajustados para 2x106 em 30 μL. Os parasitos estavam na terceira passagem em fase estacionária de cultivo in vitro. Como veículo de inoculação dos parasitos, foi utilizado PBS IX no volume final de 30 μL. A inoculação ocorreu no coxim plantar direito das patas traseiras em 30 camundongos (adaptado de KROPF et al., 1997).
Tabela 4 - Separação dos grupos experimentais para os testes quimioterápicos in vivo para avaliação da atividade leishmanicida.
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[0089] Para a avaliação do inchaço nos grupos infectados ou não infectados, as patas foram imersas na cuba do aparelho Pletismômetro (Insight). A cuba contém um volume adequado de água onde, ao emergir a pata do animal, esse volume é deslocado emitindo um valor por mL (ATTIA et al., 2015). O peso dos animais foi obtido usando a balança digital (Shimadzu). O inchaço das patas e o peso dos animais foram monitorados a cada dois dias durante todo o período de experimentação (adaptado de MASIC et al., 2015).
Tratamento com o composto S4 (3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina) e anfotericina B
[0090] O tratamento iniciou-se no 54° dia de infecção, quando as patas infectadas atingiram a média de 0,38 mL de volume da lesão. Após o início do tratamento, foram mensurados o inchaço das patas e peso dos animais todos os dias até o dia da eutanásia dos animais.
[0091] O composto S4 foi solubilizado em DMSO, não ultrapassando 3% e diluído em meio RPMI-1640 incompleto. A anfotericina B foi diluída diretamente em PBS IX. As concentrações usadas no tratamento foram calculadas usando a média de peso dos animais, onde as concentrações usadas foram 50, 25, 12,5 mg/kg/dia para o composto S4 e 5 mg/kg/dia para anfotericina B (Tabela 4) (adaptado de MASIC et al., 2015).
[0092] O volume de inchaço das patas dos animais infectados e tratados com o composto S4 foi comparado diretamente com o volume das patas dos animais infectados e não tratados (G2) e com o volume dos animais infectados e tratados com 5 mg/kg de anfotericina B (G7), fármaco de referência. Um grupo infectado e tratado com DMSO 3% + RPMI-1640 incompleto (G3 veículo) foi considerado também como grupo controle. O tratamento ocorreu via intraperitoneal (VIP) com o auxílio de seringas de insulina de 1 mL, no volume final de 500 μL/animal. As aplicações do composto S4 e Anfotericina B ocorreram durante cinco dias, em dias alternados, totalizando assim 10 dias de tratamento (Figura 1).
Quantificação da carga parasitária do linfonodo e da lesão de pata dos camundongos infectados tratados e não tratados [0093] Os animais foram eutanasiados no 64° dia pi (um dia após o último tratamento) e as lesões das patas e os linfonodos assepticamente removidos. Em seguida, foram pesados em balança analítica (Bioprecisa, 210g X 0,000 lg). Partes dos tecidos das patas e linfonodo foram macerados em 1 mL de meio RPMI-1640 completo. Ao término da maceração, o conteúdo resultante foi diluído 100x em meio RPMI-1640 completo e plaqueados em microplacas de 96 poços no volume final de 200 μL.
[0094] Após seis dias de incubação em estufa BOD a 24°C, a quantificação da carga parasitária foi realizada pelo método do AlamarBlue, no qual uma alíquota de 20 μL (2 mM) foi adicionada a cada poço, em seguida, as placas foram novamente incubadas em estufa BOD a 24°C por cinco horas. Simultaneamente, foram feitos poços contendo somente meio RPMI-1640 completo (branco). A leitura da reação foi realizada em um espectrofotômetro (Biotek, Synergy) em fluorescência nos parâmetros 530/25 (excitação) e 590/35 (emissão) (RODRIGUES, 2007). A quantificação dos parasitos foi determinada com base na seguinte equação:
Figure imgf000033_0001
Onde: RFU = unidade relativa de fluorescência, Fluorescência teste = animais tratados (G3 ao G7), Peso do tecido = os valores foram divididos de acordo com o peso do tecido das patas de cada animal, Fluorescência do controle = Grupo de animais infectados e não tratados (G2), Fluorescência Branco = poços somente com meio RPMI-1640 completo. Análises bioquímica
[0095] Para as análises bioquímicas foram utilizados 20 animais não infectados, os animais foram separados em quatro grupos contendo cinco animais cada. Os grupos consistiram em: grupo tratado com PBS IX (controle), grupo tratado com DMSO a 3%, grupo tratado com anfotericina B a 5 mg/kg e grupo tratado com 50 mg/kg do composto S4, maior concentração usada nos ensaios in vivo. O tratamento ocorreu VIP durante 10 dias, em dias alternados, totalizando cinco dias de aplicação do composto. Para as análises bioquímicas dos níveis séricos de transaminase glutâmica pirúvica (TGP), transaminase glutâmica oxaloacética (TGO), ureia e creatinina foram realizados ensaios colorimétricos utilizando kits comerciais de acordo com as normas do fabricante (Labtest Diagnostica, Lagoa Santa, Brasil). Os valores de referências utilizados como parâmetros, foram os animais do grupo controle sem tratamento.
Análises estatísticas
[0096] As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do programa GraphPad Prism versão 6.0 e Origin versão 9.1.
[0097] Para a análise da evolução do inchaço das lesões dos camundongos, foi utilizado o Teste Two-way repeated measure ANOVA, seguido pelo teste de múltiplas comparações Tukey. Para a análise do ensaio bioquímico foi utilizado ANOVA, seguido por teste de múltiplas comparações Tukey.
[0098] Em todos os métodos utilizados, as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando o valor de p obtido apresentou resultado menor que 0,05 (p < 0,05).
Resultados
Efeito do composto S4 (3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina) no desenvolvimento da lesão em camundongos BALB/c
[0099] O possível efeito leishmanicida do composto S4 foi avaliado em camundongos BALB/c infectados com L. (L.) amazonensis. O tratamento iniciou-se no 54° dia após a infecção, por meio de injeções intraperitoneais. Para este ensaio, foram determinados os parâmetros de inchaço da pata e carga parasitária estimada pela recuperação dos parasitos. A avaliação da efetividade do tratamento foi realizada em todos os grupos experimentais. Esta avaliação ocorreu por intermédio do monitoramento do volume de inchaço das patas inoculadas com o parasito (G2 e G3), em comparação com o volume de inchaço das patas dos animais não infectados (Gl).
[00100] Ao longo do período de tratamento foi observada a diminuição no volume das patas dos animais infectados e tratados com o fármaco anfotericina B (Grupo 7). No entanto, essa diminuição foi significativa a partir do 62° dia quando comparada com a dos grupos controles (Grupos G2 e G3).
[00101] Ao relacionar os resultados do tratamento com o composto S4, observou-se que não houve diminuição significativa do inchaço das patas dos animais, em nenhuma das concentrações testadas, durante os dias de tratamento (Figura 6).
[00102] Quando correlacionado o grupo Gl com outros grupos que foram infectados e tratados é possível observar significância estatística (p<0,0001) durante todo o período de experimento. Este resultado era previsto, já que este grupo não foi infectado. A Figura 7 representa o desenvolvimento das lesões cutâneas durante o período de tratamento.
Quantificação da recuperação de parasitos da lesão de pata dos camundongos infectados e tratados com S4 (3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina)
[00103] Após análise do inchaço das lesões dos camundongos, foram feitas as análises de quantificação e recuperação dos parasitos dos linfonodos e das patas dos animais não tratados, tratados com o composto S4 e a anfotericina B. A recuperação dos parasitos foi estimada pelo método colorimétrico Alarmablue.
[00104] Quando comparado os resultados RFU (unidade relativa de fluorescência) entre o controle negativo (Gl, não infectado) com o controle positivo (G2) e controle veículo (G3), foi possível observar uma diferença estatística significativa entre esses grupos (p<0,001). Esses parâmetros demonstram a seguridade da metodologia empregada. Não foi observada diferença estatística na carga parasitária entre o grupo controle positivo (G2) e controle de veículo (G3).
[00105] Ao analisar o grupo tratado com o composto S4 na maior concentração de 50 mg/kg (G4), observa-se uma diminuição significativa (p<0,001) em relação ao grupo controle de infecção (G2). A recuperação de parasitos para esse grupo G4 foi de apenas 10% em relação à do grupo infectado G2 (considerado o controle de 100% dos parasitos recuperados). Ao analisar os grupos tratados com as menores concentrações de S4, G5 (25 mg/kg) e G6 (12,5 mg/kg), a diminuição da parasitemia observada não foi significativa (Figura 8).
[00106] Como esperado, a administração da anfotericina B (G7), na concentração de 5 mg/kg, foi capaz de diminuir o número de parasitos em relação ao controle infectado não tratado (G2); assim como o composto S4 na maior concentração, este fármaco apresentou diferença estatística significativa (p<0,001) em relação ao grupo infectado (Gl).
[00107] Juntamente a avaliação do parâmetro da carga parasitária, avaliou-se a disseminação dos parasitos nestes animais. Para isso, utilizou-se o linfonodo drenante de lesão, que foi retirado após o mesmo período de tratamento. Observou-se que não houve disseminação de parasito nos grupos experimentais, com os valores de RFU em todos os grupos muito próximos ao grupo controle infectado G2 (média RFU de 59), do grupo infectado e do grupo tratado na maior concentração do composto G4 (média da RFU de 67) (Dados não mostrados).
Análises bioquímicas
[00108] Nos ensaios realizados in vivo, foram avaliados parâmetros bioquímicos por meio da dosagem sérica de transaminases glutâmico pirúvica (TGP) e transaminase glutâmico oxaloacética (TGO), enzimas associadas a hepatotoxicidade; por intermédio da concentração sérica de ureia e creatinina (função renal); além da avaliação de toxicidade sistêmica mensurando a massa corporal dos animais. [00109] Para as análises bioquímicas de dosagens das enzimas hepáticas de TGO, TGP, foram realizados ensaios usando o mesmo protocolo de tratamento da atividade leishmanicida in vivo, ressaltando que neste experimento os animais não estavam infectados. Neste ensaio, havia um grupo controle sem tratamento, um grupo tratado com DMSO 3%, um grupo tratado com anfotericina B (5 mg/kg) e um grupo tratado com a maior concentração do composto S4 (50 mg/kg). O grupo controle sem tratamento foi utilizado como parâmetro para as dosagens.
[00110] Para as dosagens das enzimas hepáticas TGO e TGP, quando comparado as dosagens enzimáticas entre o grupo controle (sem tratamento) e o grupo tratado com o composto S4, observou-se aumentos significativos (p<0,0001) para o grupo tratado com o composto (Figura 9).
[00111] Com intuito de avaliar a toxicidade renal, foram analisados os níveis de ureia e creatina. Nestes parâmetros não foi observada diferença significativa na concentração dessas enzimas para o grupo de animais controle (não tratados) e os grupos tratados com DMSO 3%, anfotericina B (5 mg/kg) e S4 na concentração de 50 mg/kg (Figura 9).
[00112] O controle de peso foi verificado antes da infecção, a cada dois dias durante o período de experimentação e ao iniciarmos o tratamento as tomadas de peso dos animais foram aferidas todos os dias. Isso ocorreu para os grupos tratados com o composto S4, para o fármaco de referência anfotericina B e nos grupos tratados e não tratados.
[00113] Quando avaliado os resultados referentes ao peso dos animais, houve ganho em todos os grupos experimentais. Não houve diferença estatística significativa entre os grupos controle infectado e sem tratamento e o infectado e tratado com o veículo (DMSO 3% + RPMI-1640). O grupo tratado com a anfotericina B e os demais grupos de animais infectados e tratados com o composto S4 (50, 25 e 12,5 mg/kg/dia) não apresentaram variação de peso, isto é, não foi observada alteração nas médias dos pesos dos camundongos tratados com nenhuma das três concentrações de S4 utilizadas no ensaio in vivo. Os resultados apresentados na Tabela 5 mostram a média de peso durante os dias de tratamento.
Tabela 5 - Avaliação do peso médio de camundongos BALB/c infectados com L. (L.) amazonensis tratados com S4 (3,3',4,4',5,5'- Hexametoxilobelanina) nas concentrações (50, 25 e 12,5 mg/kg) e anfotericina B (5 mg/kg).
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G1 = Controle negativo (Grupo não infectado e sem tratamento), G2 = Controle positivo (Grupo infectado sem tratamento) G3 = Controle veículo (Grupo infectado e tratado com DMSO 3% mais RPMI), G4 = Grupo infectado e tratado com S4 na concentração de 50 mg/kg, G5 = Grupo infectado e tratado com S4 na concentração de 25 mg/kg, G6 = Grupo infectado e tratado com S4 na concentração de 12,5 mg/kg, G7 = Grupo infectado e tratado com anfotericina B na concentração de 5 mg/kg, TTO = tratamento.1 Os valores apresentados se referem às médias e desvio padrão (±) de cada grupo. Os grupos tinham número amostrai de 5 animais (n=5).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[00114] AGNEW, P.; HOLZMULLER, P.; MICHALAKIS, Y.;
SERENO, D.; LEMESRE, J. L.; RENAUD, F. In vitro Growth of Leishmania amazonensis Promastigotes Resistant to Pentamidine Is Dependent on
Interactions among Strains. Antimicrob. Agents Chemother., v. 45, n. 6, p. 1928-1929, 2001.
[00115] ALKHALDI, A.; DE KONING, H. P.; BUKHARI, S. N. A.
Antileishmanial and antitrypanosomal activity of symmetrical dibenzyl- substituted α, β-unsaturated carbonyl-based compounds. Drug design, development and therapy, v. 13, p. 1179, 2019.
[00116] ATTIA, H.; AYMEN, B.; RABIAA, M. S.; MARTINEZ, P.
A. L.; MKANNEZ, G.; ATRI, C.; CHOURABI, K.; GUERFALI, F. Z.; LAOUINI, D. Comparison Between Plethysmometer and Caliper Methods to Monitor Lesion-Size Induced by Leishmania major Infection in BALB/c Mouse Experimental Model. Adv. Anim. Vet. Sci., v. 3, n. 6, p. 179-185, 2015.
[00117] BARBIERI, C. L.; GIORGIO, S.; MERJAN, A. J.; FIGUEIREDO, E. N. Glycosphingolipid Antigens of Leishmania (Leishmania) amazonensis Amastigotes Identified by Use of a Monoclonal Antibody. Infect. Immun., v. 61, n. 5, p. 2131-2137, 1993.
[00118] BATES, P. A. Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture. Parasitology, v. 108, n. 01, p. 1-9, 1994.
[00119] BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE. Departamento de Vigilância das Doenças Transmissíveis. Manual de vigilância da leishmaniose tegumentar. Brasilia: Ministério da Saúde, 2017. 189 p.
[00120] CALLAHAN, H. L.; KELLEY, C.; PEREIRA, T.; GROGL, M. Microtubule inhibitors: structure-activity analysis suggest rational models to identify potentially active compounds. Antimicrob. Agents Chemother., v. 40, n. 4, p. 947- 952, 1996.
[00121] CALVO-CALLE, J.; MORENO, A.; ELING, W.; NARDIN, E. In vitro development of infectious liver stages of P. yoelii and P. berghei malaria in human cell lines. Exp. Parasitol., v. 79, n. 3, p. 362-373, 1994.
[00122] CHAPPUIS, F. et al. Visceral leishmaniasis: what are the needs for diagnosis, treatment and control?. Nature reviews microbiology, v. 5, n. 11, p. 873-882, 2007.
[00123] CROFT, S. L.; SUNDAR, S.; FAIRLAMB, A. Drug
Resistance in Leishmaniasis. C. Mic. Reviews, v. 19, n. 1, p. 111-126, 2006.
[00124] DESJEUX, P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases, v. 27, n. 5, p. 305-318, 2004. [00125] FATOKI, T. H. et al. Functional compounds of Lobelia inflata revealed novel potential targets for chronic cough therapy. Journal of Advances in Medical and Pharmaceutical Sciences, p. 1-13, 2018.
[00126] FELPIN, F. X.; LEB RETON, J. History, chemistry and biology of alkaloids from Lobelia inflata. Tetrahedron, v. 60, n. 45, p. 10127-10153, 2004
[00127] GENNARO, A. R. Remington, a ciência e a prática da farmácia. Guanabara Koogan, 2004.
[00128] GUEIRARD, P. et al. Trafficking of Leishmania donovani promastigotes in non-lytic compartments in neutrophils enables the subsequent transfer of parasites to macrophages. Cellular microbiology, v. 10, n. l, p. 100-111, 2008.
[00129] IOSET, J. R.; BRUN, R.; WENZLER, T.; KAISER, M.; YARDLEY, V. Drug Screening for Kinetoplastids Diseases, A Training Manual for Screening in Neglected Diseases. DNDi and Pan- Asian Screening Network, 2009. p. 1-74. 2009.
[00130] JAIN, S. K.; SAHU, R.; WALKER, L. A.; TEKWANI, B. L. A parasite rescue and transformation assay for antileishmanial screening against intracellular Leishmania donovani amastigotes in THP1 human acute monocytic leukemia cell line. J. Vis. Exp., v. 70, n. 1, p. 4054-4068, 2012.
[00131] KATSUNO, K., BURROWS, J. N., DUNCAN, K., HUIJSDUIJNEN, R. H., KANEKO, T., KITA, K., MOWBRAY, C. E. SCHMATZ, D., WARNER, P., SLINGSBY, B. T. Hit and lead criteria in drug discovery for infectious diseases of the developing world. Nat. Rev. Drug. Discov., v. 14, n. 11, p. 751-758, 2015.
[00132] KHOURI, R.; NOVAIS, F.; SANTANA, G.; OLIVEIRA, C. L; SANTOS, M. A. V.; BARRAL, A.; BARRA-NETO, M.; VAN, J. W. DETC induces Leishmania parasites killing in human in vitro and murine in vivo models: A promising therapeutic alternative in leishmaniasis. Pios One, v. 5, n. 12, p. 94-143, 2010.
[00133] KROPF, P.; ETGES, R.; SCHOPF, L.; CHUNG, C.; SYPEK, J.; MULLER, I. Characterization of T cell-mediated responses in nonhealing and healing Leishmania major infections in the absence of endogenous IL-4. J. Immunol., v. 159, n. 7, p. 3434-3443, 1997.
[00134] MADUREIRA, M.; MARTINS, A. P.; GOMES, M.; PAIVA, J.; PROENÇA, C. A.; ROSÁRIO, V. Antimalarial activity of medicinal plants used in traditional medicine in S Tomé and Principe islands. J. Ethnopharmacol., v. 81, n. 1, p. 23-29, 2002.
[00135] MAIA, C.; ROLÃO, N.; NUNES, M.; GONÇALVES, L.; CAMPINO, L. Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum. Acta Tropica, v. 103, n. 2, p. 150-155, 2007.
[00136] MARZOCHI, M. C. de A. Curso-Doenças infecto-parasitárias: leishmanioses no Brasil: as leishmanioses tegumentares. J. bras. Med, v. 63, n. 5/6, p. 82-104, 1992.
[00137] MARZOCHI, M. C. A.; MARZOCHI, K. B. F. Tegumentary and visceral leishmanioses in Brazil - Emerging anthropozoonosis and possibilities for their control. Cad. Sau. Publica., v. 10, n. 2, p. 359-375. 1994.
[00138] MARZOCHI, M. C. A.; MARZOCHI, K. B. F.; FACUNDES, A.; CONCEIÇÃO-SILVA, F. A questão do controle das Leishmanioses no Brasil. In: CONCEIÇÃO-SILVA, F.; ALVES, C. R (Org.). Leishmanioses do Continente Americano. Rio de Janeiro: Fiocruz, 2014. v. 1, p. 431-463.
[00139] MASIC, A.; HERNANDEZ, A. M. V.; HAZRA, S.; GLASER, J.; HOLZGRABE, U.; HAZRA, B.; SCHURIGT, U. Cinnamic acid bornyl ester derivatives from Valeriana wallichii exhibit antileishmanial in vivo activity in Leishmania major-infected BALB/c Mice. Pios One, v.10, n. 11, p. 1-20, 2015.
[00140] MICHALICK, M. S. M.; RIBEIRO, R. R. Gênero Leishmania. In: NEVES, D.P. Parasitologia Humana. 12 ed. São Paulo: Editora Atheneu, 2011. Cap 7, p 41-44.
[00141] MIKUS, J.; STEVERDING, D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye Alamar Blue®. Parasitol. Int., v. 48, n. 3, p. 265-269, 2000.
[00142] MONGE-MAILLO, B.; LÓPEZ-VÉLEZ, R.. Therapeutic options for old world cutaneous leishmaniasis and new world cutaneous and mucocutaneous. Drugs, v. 73, p. 1889-1920, 2013.
[00143] PETERSEN, A. L. de O. A. et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One, v. 7, n. 11, p. e49496, 2012.
[00144] REY, L. Parasitologia. Guanabara Koogan, 4. ed. Rio de Janeiro, 2008.
[00145] RODRIGUES, R. F. Avaliação da atividade leishmanicida in vitro e in vivo dos compostos Mesoiônicos Tiadiazóis. Rio de Janeiro, 2007. xiv, 131 f.: il.; 30 cm. Dissertação (mestrado) - Instituto Oswaldo Cruz, Biologia Parasitária.
[00146] SILVEIRA, F. T.; LAINSON, R.; CORBETT, C. E. P. Clinical and Immunopathological Spectrum of American Cutaneous Leishmaniasis with Special Reference to the Disease in Amazonian Brazil - A Review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 99, n. 3, p. 239-251, 2004.
[00147] SOARES-BEZERRA, R. J.; LEON, L.; GENESTRA, M. Recentes avanços da quimioterapia das leishmanioses: moléculas intracelulares como alvo de fármacos. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 40, n. 2, p. 139-149, 2004.
[00148] TIUMAN, T. S. et al. Recent advances in leishmaniasis treatment. International Journal of Infectious Diseases, v. 15, n. 8, p. e525- e532, 2011. [00149] WANG, W. et al. Protective effect of PEGylation against poly (amidoamine) dendrimerinduced hemolysis of human red blood cells. J. Biomed. Mater. Res., v. 93, n. 1, p. 59-64, 2010.
[00150] WHO (WORLD HEALTH ORGANIZATION). Control of the leishmaniases. Technical Report Series. WHO, Geneva, n. 793, p. 158, 1990.
[00151] WHO/OMS - World Health Organization/Programmes and projects/Leishmaniasis 07/04/2010
[00152] WHO, Expert Committee on the Control of the Leishmaniases. II. World Health Organization. III. Series, www.who.int/leishmaniasis/en: Pesquisado em 07/04/11. 2011.
[00153] ZHANG, J. H., CHUNG, T. D., OLDENBURG, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen., v. 4, p. 67-73, 1999.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Uso do composto 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina caracterizado pelo fato de que é para preparar um medicamento para tratamento de leishmaniose.
2. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o composto 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um ou mais ingredientes ativos com atividade leishmanicida.
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o um ou mais ingredientes ativos é selecionado do grupo que consiste em: compostos antimoniais pentavalentes, pentamidina e anfotericina B.
5. Uso de uma composição farmacêutica, como a definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que é preparar um medicamento para tratamento de leishmaniose.
6. Método de tratamento de leishmaniose caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto 3,3',4,4',5,5'-Hexametoxilobelanina a um indivíduo com leishmaniose.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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ALKHALDI ABDULSALAM AM, DE KONING HARRY P, BUKHARI SYED NASIR ABBAS: "Antileishmanial and antitrypanosomal activity of symmetrical dibenzyl-substituted α,β-unsaturated carbonyl-based compounds", DRUG DESIGN, DEVELOPMENT AND THERAPY, vol. Volume 13, 1 January 2019 (2019-01-01), pages 1179 - 1185, XP055924041, DOI: 10.2147/DDDT.S204733 *

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