WO2022050230A1 - Composition inhibiting activation of adenosine receptor - Google Patents

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Abstract

A composition for inhibiting the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or for treating, ameliorating or preventing diseases caused by abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, said composition comprising, as an active ingredient, a substance that inhibits the activation of adenosine A2A receptor and/or adenosine A2B receptor.

Description

アデノシン受容体の活性化を抑制する組成物A composition that suppresses the activation of adenosine receptors
　本発明は、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制することにより、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１またはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制するための組成物に関する。本発明はまた、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制することにより、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１またはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患の治療、改善、または予防をするための組成物に関する。さらにまた、本発明は、これら組成物の有効成分となる化合物の評価方法に関する。 The present invention relates to a composition for suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa by suppressing the activation of the adenosine A2A receptor and / or the adenosine A2B receptor. The present invention also treats, ameliorates, or prevents diseases caused by abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa by suppressing the activation of adenosine A2A and / or adenosine A2B receptors. With respect to the composition for doing. Furthermore, the present invention relates to a method for evaluating a compound as an active ingredient of these compositions.
　細菌、ウィルス等の感染、腫瘍、細胞傷害などに対し、生体は免疫反応によって応答する。その免疫反応は、免疫担当細胞間の直接的または間接的な相互作用により調節されている。そして、その調節には、マクロファージ、リンパ球等が産生する、インターロイキン、インターフェロンなどの各種サイトカインが、重要な役割を担っている。しかしながら、その一方で、サイトカインの産生異常は、異常な免疫反応を生体にもたらすことになる。 The living body responds to infections such as bacteria and viruses, tumors, cell damage, etc. by immune reaction. The immune response is regulated by direct or indirect interactions between immunocompetent cells. Various cytokines such as interleukin and interferon produced by macrophages, lymphocytes and the like play an important role in the regulation. However, on the other hand, abnormal cytokine production leads to an abnormal immune response in the living body.
　例えば、ＩＬ－２２は、Ｔｈ２２細胞等において大量に産生され、アトピー性皮膚炎の急性期、慢性期の皮膚症状を形成していると考えられている（非特許文献１）。より具体的には、診断基準（ＳＣＯＲＡＤ）に基づき重症に分類された成人のアトピー性皮膚炎患者では、皮膚へのホーミング受容体を発現する末梢血中のＴｈ２２の割合が、健常者と比較して有意に増加することが報告され（非特許文献２）、この知見からアトピー性皮膚炎の病態形成にＴｈ２２が関与する可能性が示唆されている。さらに、アトピー性皮膚炎では、Ｔｈ２細胞から産生されるＩＬ－３１が、その掻痒（かゆみ）に関与しており、起痒性を誘発するサイトカインと考えられている（非特許文献３）。また、乾癬では、ＩＦＮ－ｋａｐｐａが顕著に産生されているため、その病態に関与していることが示唆されている（非特許文献４）。さらに、ＩＦＮ－ｋａｐｐａは上皮細胞での発現が確認され、皮膚エリテマトーデス、全身性エリテマトーデスにおいてその上昇が確認される。また、ＩＦＮ－ｋａｐｐａの発現は、上皮細胞においてＩＦＮ－αおよび紫外線の照射で増強されるという報告がある（非特許文献５）。 For example, IL-22 is produced in large quantities in Th22 cells and the like, and is considered to form skin symptoms in the acute and chronic stages of atopic dermatitis (Non-Patent Document 1). More specifically, in adult atopic dermatitis patients classified as severe based on the diagnostic criteria (SCORAD), the ratio of Th22 in peripheral blood expressing homing receptors to the skin is higher than that in healthy subjects. (Non-Patent Document 2), and this finding suggests that Th22 may be involved in the pathogenesis of atopic dermatitis. Furthermore, in atopic dermatitis, IL-31 produced from Th2 cells is involved in the pruritus (itch) and is considered to be a cytokine that induces pruritus (Non-Patent Document 3). Further, in psoriasis, IFN-kappa is remarkably produced, which suggests that it is involved in the pathological condition (Non-Patent Document 4). Furthermore, IFN-kappa is confirmed to be expressed in epithelial cells, and its increase is confirmed in cutaneous lupus erythematosus and systemic lupus erythematosus. In addition, it has been reported that the expression of IFN-kappa is enhanced by irradiation with IFN-α and ultraviolet rays in epithelial cells (Non-Patent Document 5).
　このように、サイトカインの産生異常と、アトピー性皮膚炎などの免疫異常を伴う疾患との関連について多々報告されている。しかしながら、それらの産生に関与する物質や、その経路等は未だ十分に解明されていない。そのため、前記産生を抑制し、ひいてはこれら疾患を治療等する方法は、未だ確立していないのが現状である。 Thus, there have been many reports on the relationship between abnormal cytokine production and diseases associated with immune disorders such as atopic dermatitis. However, the substances involved in their production and their routes have not yet been fully elucidated. Therefore, at present, a method for suppressing the production and, by extension, treating these diseases has not yet been established.
　ところで、ＤＮＡを構成する塩基の一つであるアデノシンは、生体内において、神経伝達物質としても用いられている。神経伝達物質としてのアデノシンは、神経細胞から放出されたアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が、細胞膜表面に局在するアデノシン産生酵素によって修飾されることで生成される。より具体的には、細胞外に放出されたＡＴＰやアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）は、膜結合型エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ－１（ＣＤ３９）が触媒する加水分解によって、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）となる。次いで、もう一つのアデノシン産生酵素である、エクト－５’－ヌクレオシダーゼ（ＣＤ７３）が触媒する脱リン酸化反応によって、ＡＭＰはアデノシンに変換される。そして、このようにして産生された細胞外アデノシンは、神経細胞表面のアデノシン受容体、Ａ１、Ａ２ａ、Ａ２ｂ、Ａ３に作用して、神経細胞内にシグナルを伝達することが知られている。 By the way, adenosine, which is one of the bases constituting DNA, is also used as a neurotransmitter in the living body. Adenosine as a neurotransmitter is produced by modifying adenosine triphosphate (ATP) released from nerve cells with an adenosine-producing enzyme localized on the cell membrane surface. More specifically, extracellularly released ATP and adenosine diphosphate (ADP) are hydrolyzed by membrane-bound ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1 (CD39) to adenosine monophosphate. (AMP). AMP is then converted to adenosine by a dephosphorylation reaction catalyzed by another adenosine-producing enzyme, ect-5'-nucleosidase (CD73). It is known that the extracellular adenosine thus produced acts on adenosine receptors, A1, A2a, A2b, and A3 on the surface of nerve cells to transmit signals into nerve cells.
　また、神経伝達のみならず、アデノシンＡ２Ａ受容体のアゴニストが、喘息、慢性副鼻腔炎、アレルギー性皮膚炎などの治療に有効であるとの報告（特許文献１、段落０００４）や、自己免疫疾患、喘息、アトピー性皮膚炎、乾癬などの治療に有効であるとの報告（特許文献２、請求項１０、１２）がある。 In addition to neurotransmission, adenosine A2A receptor agonists have been reported to be effective in the treatment of asthma, chronic sinusitis, allergic dermatitis, etc. (Patent Document 1, paragraph 0004), and autoimmune diseases. , Asthma, atopic dermatitis, psoriasis and the like are reported to be effective (Patent Document 2, claims 10 and 12).
特表２００５－５１３０４３号公報Japanese Patent Publication No. 2005-514033 特開２００６－１６０６２８号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2006-160628
　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１またはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生に関与する物質を同定し、それを標的とした医薬を開発することにある。 The present invention has been made in view of the problems of the prior art, and the present invention is to identify a substance involved in the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, and to develop a drug targeting the substance. It is in.
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、アデノシンＡ２Ａ受容体のリガンドであるアデノシン、またはアデノシンＡ２Ａ受容体アゴニスト（ＰＳＢ０７７７）が、双方向混合リンパ球培養反応系（２ウェイＭＬＲ）において、ＩＬ－２２およびＩＬ－１７Ｆの産生を誘導することが明らかになった。また同様に、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞の培養系においても、アデノシンまたはＰＳＢ０７７７によって、これらサイトカインの産生は誘導されることが明らかになった。一方、アデノシンＡ２Ａ受容体のアンタゴニスト（イストラデフィリン）存在下においては、これらサイトカインの産生誘導が抑制された。 The present inventors have conducted diligent research to solve the above problems. As a result, adenosine, which is a ligand for the adenosine A2A receptor, or an adenosine A2A receptor agonist (PSB0777) induces the production of IL-22 and IL-17F in a bidirectional mixed lymphocyte culture reaction system (2-way MLR). It became clear to do. Similarly, it was revealed that adenosine or PSB0777 induces the production of these cytokines in a culture system of CD4 + T cells activated by CD3 / CD28 stimulation. On the other hand, in the presence of an adenosine A2A receptor antagonist (istradefylline), the induction of production of these cytokines was suppressed.
　また、ＩＬ－２２およびＩＬ－１７Ｆのみならず、アデノシンによって、ＩＬ－３１、ＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生が誘導され、さらに、これらサイトカインの産生も、イストラデフィリンの存在下では抑制された。 Moreover, not only IL-22 and IL-17F but also adenosine induced the production of IL-31 and IFN-kappa, and the production of these cytokines was also suppressed in the presence of istradefylline.
　また、アデノシンのみならず、ＡＴＰによっても、２ウェイＭＬＲにおける前記サイトカインの産生が誘導されることを、本発明者らは明らかにした。一方、アデノシン産生酵素に対する阻害剤（ＣＤ３９阻害剤またはＣＤ７３阻害剤）を、ＡＴＰ存在下での２ウェイＭＬＲに適用した場合には、前記サイトカインの産生は抑制された。 Further, the present inventors have clarified that the production of the cytokine in 2-way MLR is induced not only by adenosine but also by ATP. On the other hand, when an inhibitor for an adenosine-producing enzyme (CD39 inhibitor or CD73 inhibitor) was applied to a 2-way MLR in the presence of ATP, the production of the cytokine was suppressed.
　また、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞の培養系にて、アデノシンによって誘導されるＩＬ－３１の産生は、アデノシンＡ２Ｂ受容体のアンタゴニスト（ＭＲＳ１７５４）存在下でも抑制された。さらに、アトピー性皮膚炎モデル動物に、当該アンタゴニストを投与することによって、有意な病態抑制が認められた。 In addition, in a culture system of CD4 + T cells activated by CD3 / CD28 stimulation, adenosine-induced IL-31 production was suppressed even in the presence of an adenosine A2B receptor antagonist (MRS1754). Furthermore, significant pathological suppression was observed by administering the antagonist to atopic dermatitis model animals.
　以上のとおり、本発明者らは、アデノシン産生酵素が関与するＡＴＰからアデノシンへの生成、およびそれに続くアデノシン受容体の活性化によって、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１、およびＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生が誘導されることを見出した。そして、かかるアデノシン受容体の活性化、またはそれに至るその経路を抑制することによって、これらサイトカインの産生を抑制できることも明らかにし、本発明を完成するに至った。 As described above, the present inventors induce the production of IL-22, IL-31, and IFN-kappa by the production of ATP to adenosine involving adenosine-producing enzyme, and the subsequent activation of the adenosine receptor. Found to be done. Then, it was clarified that the production of these cytokines can be suppressed by suppressing the activation of such adenosine receptor or its pathway leading to it, and completed the present invention.
　本発明は、より詳しくは、以下を提供するものである。
［１］　ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生の抑制、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患の治療、改善、もしくは予防のための組成物であって、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質を有効成分として含有する組成物。
［２］　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　（ａ）被検化合物をアデノシンＡ２Ａ受容体に接触させる工程、および
　（ｂ）被検化合物とアデノシンＡ２Ａ受容体との結合を検出する工程、を含み、
　被検化合物がアデノシンＡ２Ａ受容体と結合する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
［３］　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　（ａ）被検化合物をアデノシンＡ２Ｂ受容体に接触させる工程、および
　（ｂ）被検化合物とアデノシンＡ２Ｂ受容体との結合を検出する工程、を含み、
　被検化合物がアデノシンＡ２Ｂ受容体と結合する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
［４］　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　（ａ）被検化合物の存在下で、アデノシンＡ２Ａ受容体リガンドをアデノシンＡ２Ａ受容体に接触させる工程、および
　（ｂ）アデノシンＡ２Ａ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ａ受容体との結合を検出する工程、を含み、
　被検化合物がアデノシンＡ２Ａ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ａ受容体との結合を阻害する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
［５］　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　（ａ）被検化合物の存在下で、アデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドをアデノシンＡ２Ｂ受容体に接触させる工程、および
　（ｂ）アデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ｂ受容体との結合を検出する工程、を含み、
　被検化合物がアデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ｂ受容体との結合を阻害する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
［６］　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　（ａ）被検化合物をアデノシンＡ２Ａ受容体を発現する細胞に接触させる工程、および
　（ｂ）アデノシンＡ２Ａ受容体の活性を検出する工程、を含み、
　被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物がアデノシンＡ２Ａ受容体の活性を低下させる場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
［７］　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　（ａ）被検化合物をアデノシンＡ２Ｂ受容体を発現する細胞に接触させる工程、および
　（ｂ）アデノシンＡ２Ｂ受容体の活性を検出する工程、を含み、
　被検化合物を接触させない場合と比較して、アデノシンＡ２Ｂ受容体の活性を低下させる場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
［８］　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　（ａ）被検化合物をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および
　（ｂ）被検化合物とアデノシン産生酵素との結合を検出する工程、を含み、
　被検化合物がアデノシン産生酵素と結合する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
［９］　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　（ａ）被検化合物の存在下で、アデノシン産生酵素の基質をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および
　（ｂ）アデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合を検出する工程、を含み、
　被検化合物がアデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合を阻害する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。
［１０］　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
　（ａ）被検化合物をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および
　（ｂ）アデノシン産生酵素の酵素活性を検出する工程、を含み、
　被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物がアデノシン産生酵素の酵素活性を低下させる場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。 The present invention, in more detail, provides:
[1] A composition for treating, ameliorating, or preventing a disease caused by suppression of IL-22, IL-31, or IFN-kappa production, or abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa. A composition comprising, as an active ingredient, a substance that suppresses the activation of the adenosine A2A receptor and / or the adenosine A2B receptor.
[2] The test compound treats and improves the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or the disease caused by the abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. Alternatively, it is a method for evaluating the probability of having a preventive activity.
It comprises (a) contacting the test compound with the adenosine A2A receptor and (b) detecting the binding between the test compound and the adenosine A2A receptor.
When the test compound binds to the adenosine A2A receptor, the activity suppresses the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or the disease caused by the abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. A method that is assessed as probable to have the activity of treating, ameliorating, or preventing.
[3] The test compound treats and improves the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or the disease caused by the abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. Alternatively, it is a method for evaluating the probability of having a preventive activity.
It comprises (a) contacting the test compound with the adenosine A2B receptor and (b) detecting the binding between the test compound and the adenosine A2B receptor.
When the test compound binds to the adenosine A2B receptor, the activity suppresses the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or the disease caused by the abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. A method that is evaluated as probable to have the activity of treating, ameliorating, or preventing.
[4] The test compound treats and improves the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or the disease caused by the abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. Alternatively, it is a method for evaluating the probability of having a preventive activity.
(A) The step of contacting the adenosine A2A receptor ligand with the adenosine A2A receptor in the presence of the test compound, and (b) the step of detecting the binding between the adenosine A2A receptor ligand and the adenosine A2A receptor. ,
When the test compound inhibits the binding of the adenosine A2A receptor ligand to the adenosine A2A receptor, the activity suppresses the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or IL-22, IL-31 or IFN. -A method that is evaluated to have the activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by abnormal production of kappa.
[5] The test compound treats and improves the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or the disease caused by the abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. Alternatively, it is a method for evaluating the probability of having a preventive activity.
(A) The step of contacting the adenosine A2B receptor ligand with the adenosine A2B receptor in the presence of the test compound, and (b) the step of detecting the binding between the adenosine A2B receptor ligand and the adenosine A2B receptor. ,
When the test compound inhibits the binding of the adenosine A2B receptor ligand to the adenosine A2B receptor, it has the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or IL-22, IL-31 or IFN. -A method that is evaluated to have the activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by abnormal production of kappa.
[6] The test compound treats and improves the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or the disease caused by the abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. Alternatively, it is a method for evaluating the probability of having a preventive activity.
It comprises (a) contacting the test compound with cells expressing the adenosine A2A receptor and (b) detecting the activity of the adenosine A2A receptor.
When the test compound reduces the activity of the adenosine A2A receptor as compared to the case where the test compound is not contacted, the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or IL-22, A method that is evaluated to have the activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by abnormal production of IL-31 or IFN-kappa.
[7] The test compound treats and improves the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or the disease caused by the abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. Alternatively, it is a method for evaluating the probability of having a preventive activity.
It comprises (a) contacting the test compound with cells expressing the adenosine A2B receptor and (b) detecting the activity of the adenosine A2B receptor.
When the activity of the adenosine A2B receptor is reduced as compared to the case where the test compound is not contacted, the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or IL-22, IL-31 or A method that is evaluated to have the activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by abnormal production of IFN-kappa.
[8] The test compound treats and improves the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or the disease caused by the abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. Alternatively, it is a method for evaluating the probability of having a preventive activity.
It comprises (a) a step of contacting the test compound with an adenosine-producing enzyme, and (b) a step of detecting the binding between the test compound and the adenosine-producing enzyme.
Treatment and amelioration of diseases caused by IL-22, IL-31 or IFN-kappa production, or IL-22, IL-31 or IFN-kappa production abnormalities when the test compound binds to adenosine-producing enzymes. Alternatively, a method that is evaluated as having a probable activity to prevent it.
[9] The test compound treats and improves the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or the disease caused by the abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. Alternatively, it is a method for evaluating the probability of having a preventive activity.
It comprises (a) contacting the substrate of the adenosine-producing enzyme with the adenosine-producing enzyme in the presence of the test compound, and (b) detecting the binding between the substrate of the adenosine-producing enzyme and the adenosine-producing enzyme.
Abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or IL-22, IL-31 or IFN-kappa when the test compound inhibits the binding of the adenosine-producing enzyme substrate to the adenosine-producing enzyme. A method that is evaluated to have the activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by.
[10] The test compound treats and improves the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or the disease caused by the abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. Alternatively, it is a method for evaluating the probability of having a preventive activity.
It comprises (a) a step of contacting the test compound with an adenosine-producing enzyme, and (b) a step of detecting the enzyme activity of the adenosine-producing enzyme.
When the test compound reduces the enzymatic activity of the adenosine-producing enzyme, the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or IL-22, IL-31 or A method that is evaluated to have an activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by an abnormal production of IFN-kappa.
　本発明によれば、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制することによって、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制することが可能となる。従って、本発明の組成物は、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１またはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患の治療、改善、または予防のための医薬として有用である。また、本発明によれば、アデノシンＡ２Ａ受容体、アデノシンＡ２Ｂ受容体またはアデノシン産生酵素を標的として、このような医薬の候補化合物を効率的に評価し、スクリーニングすることも可能となる。 According to the present invention, it is possible to suppress the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa by suppressing the activation of the adenosine A2A receptor and / or the adenosine A2B receptor. Therefore, the compositions of the present invention are useful as pharmaceuticals for the treatment, amelioration, or prevention of diseases caused by abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa. Further, according to the present invention, it is also possible to efficiently evaluate and screen candidate compounds for such drugs by targeting adenosine A2A receptor, adenosine A2B receptor or adenosine producing enzyme.
２ウェイＭＬＲにおける、アデノシンによるＩＬ－１７ＦまたはＩＬ－２２産生誘導効果を示すグラフである。図中「＊＊」は、培地のみに対し、他の群が「Ｐ＜０．０１」であることを示す。It is a graph which shows the IL-17F or IL-22 production induction effect by adenosine in a 2-way MLR. In the figure, "**" indicates that the other groups have "P <0.01" with respect to the medium only. ２ウェイＭＬＲにおける、アデノシンＡ２Ａ受容体アゴニスト（ＰＳＢ０７７７）によるＩＬ－１７ＦまたはＩＬ－２２産生誘導効果を示すグラフである。図中「＊＊」および「＊」は、培地のみに対し、他の群が「Ｐ＜０．０１」および「Ｐ＜０．０５」であることを各々示す。It is a graph which shows the IL-17F or IL-22 production induction effect by an adenosine A2A receptor agonist (PSB0777) in a 2-way MLR. In the figure, "**" and "*" indicate that the other groups are "P <0.01" and "P <0.05" with respect to the medium only, respectively. アデノシン存在下の２ウェイＭＬＲにおける、アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニスト（イストラデフィリン）によるＩＬ－１７ＦまたはＩＬ－２２産生誘導に対する抑制効果を示すグラフである。図中「＊＊」は、アデノシンのみを加えた群のみに対し、他の群が「Ｐ＜０．０１」であることを示す。It is a graph which shows the inhibitory effect on the induction of IL-17F or IL-22 production by adenosine A2A receptor antagonist (istradefylline) in 2-way MLR in the presence of adenosine. In the figure, "**" indicates that only the group to which only adenosine is added has "P <0.01" in the other groups. ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞の培養系における、アデノシンによるＩＬ－１７ＦまたはＩＬ－２２産生誘導効果を示すグラフである。図中「＊＊」は、培地のみに対し、他の群が「Ｐ＜０．０１」であることを示す。また、「Ｎ．Ｄ．」は未検出であることを示す。3 is a graph showing the effect of adenosine on IL-17F or IL-22 production in a culture system of CD4 + T cells activated by CD3 / CD28 stimulation. In the figure, "**" indicates that the other groups have "P <0.01" with respect to the medium only. Further, "ND" indicates that it has not been detected. ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞の培養系における、ＰＳＢ０７７７の効果を示すグラフである。図中「＊＊」および「＊」は、培地のみに対し、他の群が「Ｐ＜０．０１」および「Ｐ＜０．０５」であることを各々示す。また、「Ｎ．Ｄ．」は未検出であることを示す。It is a graph which shows the effect of PSB0777 in the culture system of the CD4 + T cell activated by the stimulation of CD3 / CD28. In the figure, "**" and "*" indicate that the other groups are "P <0.01" and "P <0.05" with respect to the medium only, respectively. Further, "ND" indicates that it has not been detected. ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞の培養系における、アデノシン存在下、イストラデフィリンによるＩＬ－１７ＦまたはＩＬ－２２産生誘導に対する抑制効果を示すグラフである。図中「＊＊」は、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激中にアデノシンのみを加えた群のみに対し、他の群が「Ｐ＜０．０１」であることを各々示す。また、「Ｎ．Ｄ．」は未検出であることを示す。It is a graph which shows the inhibitory effect on the induction of IL-17F or IL-22 production by istradefylline in the presence of adenosine in the culture system of CD4 + T cells activated by the stimulation of CD3 / CD28. In the figure, "**" indicates that only the group to which only adenosine was added during CD3 / CD28 stimulation, whereas the other groups had "P <0.01". Further, "ND" indicates that it has not been detected. ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞の培養系における、アデノシンによるＩＬ－３１産生誘導効果、およびイストラデフィリンによる前記誘導に対する抑制効果を示すグラフである。図中「＊＊」は、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激中にアデノシンのみを加えた群に対し、他の群が「Ｐ＜０．０１」であることを各々示す。It is a graph which shows the effect of inducing IL-31 production by adenosine and the inhibitory effect on the induction by Istradefylline in the culture system of CD4 + T cells activated by the stimulation of CD3 / CD28. In the figure, "**" indicates that the group in which only adenosine was added during CD3 / CD28 stimulation was "P <0.01" in the other groups. ２ウェイＭＬＲにおける、ＡＴＰによるＩＬ－３１産生誘導効果、およびＣＤ３９阻害剤（ＡＲＬ６７１５６）による前記誘導に対する抑制効果を示すグラフである。図中「＊」は、ＡＴＰのみを加えた群に対し、更にＡＲＬ６７１５６を加えた群が「Ｐ＜０．０５」であることを示す。It is a graph which shows the IL-31 production-inducing effect by ATP and the inhibitory effect on the induction by a CD39 inhibitor (ARL67156) in 2-way MLR. In the figure, "*" indicates that the group to which ARL67156 is further added is "P <0.05" with respect to the group to which only ATP is added. ２ウェイＭＬＲにおける、ＡＴＰによるＩＬ－３１産生誘導効果、およびＣＤ７３阻害剤（ＡＭＰ－ＣＰ）による前記誘導に対する抑制効果を示すグラフである。図中「＊」は、ＡＴＰのみを加えた群に対し、更にＡＭＰ－ＣＰを加えた群が「Ｐ＜０．０５」であることを示す。It is a graph which shows the IL-31 production-inducing effect by ATP and the inhibitory effect on the induction by a CD73 inhibitor (AMP-CP) in 2-way MLR. In the figure, "*" indicates that the group to which AMP-CP was further added was "P <0.05" with respect to the group to which only ATP was added. ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞の培養系における、アデノシンによるＩＦＮ－ｋａｐｐａ産生誘導効果、およびイストラデフィリンによる前記誘導に対する抑制効果を示すグラフである。図中「＊」は、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激中にアデノシンのみを加えた群のみに対し、他の群が「Ｐ＜０．０５」であることを各々示す。It is a graph which shows the effect of inducing IFN-kappa production by adenosine and the inhibitory effect on the induction by Istradefylline in the culture system of CD4 + T cells activated by the stimulation of CD3 / CD28. In the figure, "*" indicates that only the group to which only adenosine was added during CD3 / CD28 stimulation, whereas the other groups had "P <0.05". ２ウェイＭＬＲにおける、ＡＴＰによるＩＦＮ－ｋａｐｐａ産生誘導効果、およびＡＲＬ６７１５６による前記誘導に対する抑制効果を示すグラフである。図中「＊」は、ＡＴＰのみを加えた群に対し、更にＡＲＬ６７１５６を加えた群が「Ｐ＜０．０５」であることを示す。It is a graph which shows the effect of inducing IFN-kappa production by ATP and the inhibitory effect on the induction by ARL67156 in 2-way MLR. In the figure, "*" indicates that the group to which ARL67156 is further added is "P <0.05" with respect to the group to which only ATP is added. ２ウェイＭＬＲにおける、ＡＴＰによるＩＦＮ－ｋａｐｐａ産生誘導効果、およびＡＭＰ－ＣＰによる前記誘導に対する抑制効果を示すグラフである。図中「＊」は、ＡＴＰのみを加えた群に対し、更にＡＭＰ－ＣＰを加えた群が「Ｐ＜０．０５」であることを示す。It is a graph which shows the effect of inducing IFN-kappa production by ATP and the effect of suppressing the induction by AMP-CP in 2-way MLR. In the figure, "*" indicates that the group to which AMP-CP was further added was "P <0.05" with respect to the group to which only ATP was added. ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞の培養系における、アデノシンによるＩＬ－３１産生誘導効果、およびアデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニスト（ＭＲＳ１７５４）による前記誘導に対する抑制効果を示すグラフである。図中「＊＊」は、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激中にアデノシンのみを加えた群のみに対し、「Ｐ＜０．０１」であることを示す。It is a graph which shows the IL-31 production-inducing effect by adenosine and the inhibitory effect on the induction by adenosine A2B receptor antagonist (MRS1754) in the culture system of CD4 + T cells activated by CD3 / CD28 stimulation. In the figure, "**" indicates that "P <0.01" is obtained only for the group in which only adenosine is added during CD3 / CD28 stimulation. アトピー性皮膚炎モデルマウスにおける、ＭＲＳ１７５４の効果を示す写真である。It is a photograph showing the effect of MRS1754 in atopic dermatitis model mouse. アトピー性皮膚炎モデルマウスにおける、ＭＲＳ１７５４の効果を示すグラフである。It is a graph which shows the effect of MRS1754 in atopic dermatitis model mouse.
　＜アデノシン受容体の活性化を抑制する物質を有効成分とする組成物＞
　本発明は、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生の抑制、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患の治療、改善、もしくは予防のための組成物であって、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質を有効成分として含有する組成物を提供する。 <Composition containing a substance that suppresses the activation of adenosine receptors as an active ingredient>
The present invention is a composition for treating, ameliorating, or preventing a disease caused by suppression of IL-22, IL-31 or IFN-kappa production, or abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. A composition comprising a substance that suppresses the activation of an adenosine A2A receptor and / or an adenosine A2B receptor as an active ingredient is provided.
　「アデノシン受容体」は、アデノシンに対するＧタンパク質共役型の受容体分子であり、ヒトでは、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、Ａ３の４種類のサブタイプが存在する。「アデノシン受容体」は、細胞表面上でそのリガンドであるアデノシンが結合することにより、刺激を受けると、細胞内でアデニル酸シクラーゼが活性化され、ｃＡＭＰの産生が亢進し、シグナルが伝達される（すなわち、アデノシン受容体が活性化する）。 The "adenosine receptor" is a G protein-coupled receptor molecule for adenosine, and in humans, there are four subtypes, A1, A2A, A2B, and A3. When the "adenosine receptor" is stimulated by the binding of its ligand, adenosine, on the cell surface, adenylate cyclase is activated in the cell, cAMP production is enhanced, and a signal is transmitted. (That is, the adenosine receptor is activated).
　「アデノシン受容体の活性化の抑制」は、当該活性化を完全に抑制すること（すなわち、阻害すること）のみならず、部分的に抑制することも含まれる。また、かかる抑制は、アデノシンのアデノシン受容体への結合を競合的に抑制することにより、またアデノシン受容体の結合定数に影響を及ぼしたり、受容体と不可逆的に結合したりするなどして、非競合的に行なうことができる。 "Suppression of adenosine receptor activation" includes not only complete suppression (that is, inhibition) of the activation, but also partial suppression. In addition, such inhibition competitively suppresses the binding of adenosine to the adenosine receptor, affects the binding constant of the adenosine receptor, and irreversibly binds to the receptor. It can be done non-competitively.
　かかる観点から、本発明にかかる「アデノシンＡ２Ａ受容体の活性化を抑制する物質」として、アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストが挙げられる。当該アンタゴニストは、公知の薬剤であってもよく、また、例えば、後述の被検化合物の評価法を利用して得られるものであってもよい。公知の薬剤としては、例えば、イストラデフィリン、プレラデナント、ヴィパデナント、カフェイン、ＳＣＨ－５８２６１、ＳＣＨ－４１２３４８、ＳＣＨ－４４２４１６、ＶＥＲ－６６２３、ＶＥＲ－６９４７、ＶＥＲ－７８３５、ＳＴ－１５３５、ＺＭ－２４１３８５、ＡＴＬ－４４４、ＭＳＸ－３、ＰＢＦ－５０９、ＡＺＤ４６３５（ＨＴＬ１０７１）、ＣＰＩ－４４４、ＡＢ９２８、ＢＡＹ－５４５、Ａ２ＡＲアンタゴニスト１、リバーシン、プロキシフィリンなどが挙げられるが、これらに制限されない。これら公知の薬剤の構造式を順に以下に示す。 From this point of view, an adenosine A2A receptor antagonist can be mentioned as a "substance that suppresses the activation of the adenosine A2A receptor" according to the present invention. The antagonist may be a known drug, or may be obtained by using, for example, the evaluation method of a test compound described later. Known agents include, for example, Istradefylline, Preladenant, Vipadenant, Caffeine, SCH-58261, SCH-421348, SCH-442416, VER-6623, VER-6497, VER-7835, ST-1535, ZM-241385. , ATL-444, MSX-3, PBF-509, AZD4635 (HTL1071), CPI-444, AB928, BAY-545, A2AR antagonist 1, reversine, proxyphilin and the like. The structural formulas of these known drugs are shown below in order.
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　さらに、「アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニスト」としては、例えば、特開平６－２１１８５６号公報、または特開２０１６－００３１８６号公報に開示されているような、アデノシンＡ２Ａ受容体に対して拮抗作用を示すキサンチン誘導体；例えば、特表２０１３－５２３７１１号公報、特表２０１２－５０５２６４号公報、特表２０１１－５１３４１７号公報、特表２０１１－５００８３３号公報、特表２０１１－５００８１９号公報、特表２０１０－５２３４９７号公報、特開２００８－２９７３１２号公報、特表２００９－５０８８７１号公報、特表２００８－５２４３３０号公報、特表２００７－５２１２４３号公報、または特表２００５－５０６３５２号公報に開示されているような、アデノシンＡ２Ａ受容体に対して拮抗作用を示すピリミジン誘導体；例えば、特表２０１１－５１４３５０号公報に開示されているような、アデノシンＡ２Ａ受容体に対して拮抗作用を示すアミノ－キノキサリン誘導体；例えば、特開２０１１－０９７８６９号公報に開示されているような、抗アデノシンＡ２Ａ受容体抗体およびその機能的断片などが挙げられる。 Further, as the "adenosine A2A receptor antagonist", for example, xanthin exhibiting an antagonistic effect on the adenosine A2A receptor as disclosed in JP-A-6-21856 or JP-A-2016-003186. Derivatives; for example, Japanese Patent Publication No. 2013-523711, Japanese Patent Publication No. 2012-505264, Japanese Patent Publication No. 2011-513417, Japanese Patent Publication No. 2011-500833, Japanese Patent Publication No. 2011-500919, Japanese Patent Publication No. 2010-523497. As disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-297312, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-508871, Japanese Patent Publication No. 2008-524330, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-521243, or Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-506352. A pyrimidine derivative that exhibits an antagonistic effect on the adenosine A2A receptor; for example, an amino-quinoxalin derivative that exhibits an antagonistic effect on the adenosine A2A receptor as disclosed in JP-A-2011-514350; eg, a special feature. Examples thereof include an anti-adenosine A2A receptor antibody and a functional fragment thereof as disclosed in Japanese Patent Publication No. 2011-07869.
　本発明にかかる「アデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質」として、アデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニストが挙げられる。当該アンタゴニストは、公知の薬剤であってもよく、また、例えば、後述の被検化合物の評価法を利用して得られるものであってもよい。公知の薬剤としては、例えば、ＭＲＳ－１７５４、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３８（１，３－Ｄｉａｌｋｙｌ－８－（ｈｅｔｅｒｏ）ａｒｙｌ－９－ＯＨ－９－ｄｅａｚａｘａｎｔｈｉｎｅｓ）、ＡＴＬ－８０１、ＣＶＴ－６８８３（ＧＳ－６２０１）、ＭＲＳ－１７０６、ＯＳＩＰ－３３９，３９１、ＰＳＢ－６０３、ＰＳＢ－０７８８、ＰＳＢ－１１１５、ＰＳＢ－１９０１、ＩＳＡＭ　１４０などが挙げられるが、これらに制限されない。これら公知の薬剤の構造式を順に以下に示す。 Examples of the "substance that suppresses the activation of the adenosine A2B receptor" according to the present invention include an adenosine A2B receptor antagonist. The antagonist may be a known drug, or may be obtained by using, for example, the evaluation method of a test compound described later. Known agents include, for example, MRS-1754, Compound 38 (1,3-Dialkyl-8- (hetero) aryl-9-OH-9-deazaxansines), ATL-801, CVT-6883 (GS-6201), and the like. Examples thereof include, but are not limited to, MRS-1706, OSIP-339,391, PSB-603, PSB-0788, PSB-1115, PSB-1901, and ISAM 140. The structural formulas of these known drugs are shown below in order.
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　さらに、「アデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニスト」としては、例えば、特表２００５－５１６９７５号公報に開示されているような、アデノシンＡ２Ｂ受容体に対して拮抗作用を示すキサンチン誘導体；例えば、特表２００８－５０６５５７号公報、または特表２０２０－５３２５４１号公報に開示されているような、アデノシンＡ２Ｂ受容体に対して拮抗作用を示すピリミジン誘導体；アデノシンＡ２Ｂ受容体抗体およびその機能的断片などが挙げられる。 Further, as the "adenosine A2B receptor antagonist", for example, a xanthin derivative exhibiting an antagonistic effect on the adenosine A2B receptor as disclosed in Japanese Patent Publication No. 2005-516975; for example, Japanese Patent Publication No. 2008-506557. Examples thereof include pyrimidine derivatives exhibiting an antagonistic effect on adenosine A2B receptor; adenosine A2B receptor antibody and functional fragments thereof, as disclosed in Japanese Patent Publication No. 2020-532541.
　また、本発明において、アデノシン受容体の活性化を抑制する物質は、上述のアデノシンＡ２Ａ受容体の活性化を抑制する物質とアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質との組み合わせであってもよい。また、アデノシンＡ２Ａ受容体およびアデノシンＡ２Ｂ受容体双方の活性化を抑制する物質であってもよく、例えば、アデノシンＡ２Ａ受容体／アデノシンＡ２Ｂ受容体デュアルアンタゴニストが挙げられる。当該アンタゴニストは、公知の薬剤であってもよく、また、例えば、後述の被検化合物の評価法を利用して得られるものであってもよい。公知の薬剤としては、例えば、Ｅｔｒｕｍａｄｅｎａｎｔ（エツルマデナント、ＡＢ９２８）が挙げられるが、これに制限されない。この公知の薬剤の構造式を以下に示す。 Further, in the present invention, the substance that suppresses the activation of the adenosine receptor may be a combination of the above-mentioned substance that suppresses the activation of the adenosine A2A receptor and the substance that suppresses the activation of the adenosine A2B receptor. good. Further, it may be a substance that suppresses the activation of both the adenosine A2A receptor and the adenosine A2B receptor, and examples thereof include an adenosine A2A receptor / adenosine A2B receptor dual antagonist. The antagonist may be a known drug, or may be obtained by using, for example, the evaluation method of a test compound described later. Known agents include, but are not limited to, Etrumadenant (AB928), for example. The structural formula of this known drug is shown below.
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　本発明にかかる「アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質」は、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制し得ればよく、上述のようなアデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニスト、アデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニスト、アデノシンＡ２Ａ受容体／アデノシンＡ２Ｂ受容体デュアルアンタゴニストに限定されるものではない。 The "substance that suppresses the activation of the adenosine A2A receptor and / or the adenosine A2B receptor" according to the present invention may suppress the activation of the adenosine A2A receptor and / or the adenosine A2B receptor, as described above. The above are not limited to adenosine A2A receptor antagonists, adenosine A2B receptor antagonists, and adenosine A2A receptor / adenosine A2B receptor dual antagonists.
　例えば、アデノシンＡ２Ａ受容体およびアデノシンＡ２Ｂ受容体のリガンドであり、その活性化を誘導する、アデノシンは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が、細胞膜表面に局在するアデノシン産生酵素によって修飾されることで生成される。従って、このアデノシン生成を抑制することによっても、アデノシンＡ２Ａ受容体およびアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制することは可能となる。かかる観点から、本発明にかかる「アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質」として、アデノシン産生酵素の酵素活性を阻害する化合物も挙げられる。 For example, adenosine, which is a ligand for the adenosine A2A receptor and the adenosine A2B receptor and induces its activation, is obtained by modifying adenosine triphosphate (ATP) with an adenosine-producing enzyme localized on the cell membrane surface. Generated. Therefore, by suppressing this adenosine production, it is possible to suppress the activation of the adenosine A2A receptor and the adenosine A2B receptor. From this point of view, examples of the "substance that suppresses the activation of the adenosine A2A receptor and / or the adenosine A2B receptor" according to the present invention include compounds that inhibit the enzymatic activity of the adenosine-producing enzyme.
　「アデノシン産生酵素」は、アデノシン産生に関与する酵素を意味し、より具体的に、ＣＤ３９および／またはＣＤ７３が挙げられる。「ＣＤ３９」は、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ－１とも称されるタンパク質であり、ＡＴＰおよびＡＤＰの加水分解を触媒し、ＡＭＰを生成する。「ＣＤ７３」は、エクト－５’－ヌクレオシダーゼとも称されるタンパク質であり、ＡＭＰの脱リン酸化反応を触媒し、アデノシンを生成する。また、これらの酵素は、通常、膜貫通領域を有する膜結合型の形態をとるが、膜貫通領域を除いた可溶性の形態もとりうる。本発明のアデノシン産生酵素には、かかる可溶性のＣＤ３９および／またはＣＤ７３も含まれる。 "Adenosine-producing enzyme" means an enzyme involved in adenosine production, and more specifically, CD39 and / or CD73 can be mentioned. "CD39" is a protein also called ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1, which catalyzes the hydrolysis of ATP and ADP to produce AMP. "CD73" is a protein also called ect-5'-nucleosidase that catalyzes the dephosphorylation reaction of AMP to produce adenosine. In addition, these enzymes usually take a membrane-bound form having a transmembrane domain, but can also take a soluble form excluding the transmembrane domain. The adenosine-producing enzymes of the invention also include such soluble CD39 and / or CD73.
　本発明の組成物の有効成分となる「アデノシン産生酵素の酵素活性を抑制する化合物」（以下、「アデノシン産生酵素阻害剤」とも称する）は、アデノシン産生酵素の酵素活性を抑制するものであれば特に制限はない。なお、ここでの「抑制」においても、完全な抑制（阻害）のみならず、部分的に抑制することをも含まれる。 The "compound that suppresses the enzyme activity of the adenosine-producing enzyme" (hereinafter, also referred to as "adenosine-producing enzyme inhibitor"), which is the active ingredient of the composition of the present invention, is any as long as it suppresses the enzyme activity of the adenosine-producing enzyme. There are no particular restrictions. The "suppression" here also includes not only complete suppression (inhibition) but also partial suppression.
　本発明において、「アデノシン産生酵素阻害剤」は公知の薬剤であってもよく、また、例えば、後述の被検化合物の評価法を利用して得られるものであってもよい。ＣＤ３９に対する公知の阻害剤として、例えば、ＡＲＬ６７１５６、ＰＯＭ１（Ｈ２Ｎａ６Ｏ４０Ｗ１２）、ＰＳＢ０６１２６、ＰＳＢ０６９が挙げられるが、これらに制限されない。ＣＤ７３に対する公知の阻害剤として、例えば、ＡＭＰ－ＣＰ（アデノシン５’－（α，β－メチレン）二リン酸）、ＡＢ－６８０、ＰＳＢ－１２３７９、ＣＤ７３－ＩＮ－１が挙げられるが、これらに制限されない。これら公知の薬剤の構造式を順に以下に示す。 In the present invention, the "adenosine-producing enzyme inhibitor" may be a known drug, or may be obtained by using, for example, the evaluation method of a test compound described later. Known inhibitors for CD39 include, but are not limited to, ARL67156, POM1 (H 2 Na 6 O 40 W 12 ), PSB06126, PSB069. Known inhibitors for CD73 include, for example, AMP-CP (adenosine 5'-(α, β-methylene) diphosphate), AB-680, PSB-12379, CD73-IN-1. Not limited. The structural formulas of these known drugs are shown below in order.
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　さらに、ＣＤ７３に対する阻害剤としては、特表２０２０－５１７６５５号公報に開示されているような、ＣＤ７３の酵素活性を阻害するピリミジン誘導体、特表２０２０－５１５５５９号公報、特表２０１９－５３５７２０号公報または特表２０１７－５１３９５５号公報に開示されているような、ＣＤ７３の酵素活性を阻害するプリン誘導体（アデノシン誘導体など）が挙げられる。 Further, as an inhibitor against CD73, a pyrimidine derivative that inhibits the enzymatic activity of CD73, JP-A-2020-515559, JP-A-2019-535720, or JP-A-2019-535720, as disclosed in JP-A-2020-517655, or Examples thereof include purine derivatives (adenosine derivatives and the like) that inhibit the enzymatic activity of CD73, as disclosed in JP-A-2017-513955.
　また、特表２０１１－５１０９５３号公報、特開２０１５－０５７４０５号公報もしくは特表２０１９－５０９０１４号公報、または、特表２０１９－５０３７０９号公報、特表２０１８－５０１１９７号公報、特表２０１７－５３４６４８号公報、特表２０１８－５０２０５１号公報、国際公開第２０１８／１１０５５５号、国際公開第２０１６／０７５１７６号、国際公開第２０１６／０５５６０９号もしくは国際公開第２０１６／０８１７４８号に開示されているように、ＣＤ３９またはＣＤ７３に結合し、各酵素の酵素活性を阻害する、抗体およびその機能的断片も、アデノシン産生酵素阻害剤として利用し得る。さらにまた、特表２０１９－５３４０４２号公報または特表２０１９－５３１０９５号公報に開示されているように、ＣＤ３９またはＣＤ７３の転写産物にハイブリダイズする短鎖オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）も、アデノシン産生酵素阻害剤として利用し得る。 In addition, Japanese Patent Laid-Open No. 2011-510953, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2015-057405 or Japanese Patent Application Laid-Open No. 2019-509014, or Japanese Patent Application Laid-Open No. 2019-503709, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2018-501197, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2017-534648. CD39, as disclosed in Gazette, Publication No. 2018-502051, WO2018 / 110555, WO2016 / 075176, WO2016 / 055609 or WO2016 / 081748. Alternatively, antibodies and functional fragments thereof that bind to CD73 and inhibit the enzyme activity of each enzyme can also be used as adenosine-producing enzyme inhibitors. Furthermore, as disclosed in JP-A-2019-534042 or JP-A-2019-531095, short-chain oligonucleotides (siRNA, shRNA, miRNA, antisense oligonucleotides) that hybridize to the transcript of CD39 or CD73. Nucleotides, etc.) can also be used as adenosine-producing enzyme inhibitors.
　「アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質」には、その抑制活性を有する限り、薬理学上許容される塩、水和物または溶媒和物も含まれる。このような薬理学上許容される塩としては、特に制限はなく、各物質の構造などに応じて適宜選択することができ、例えば、酸付加塩（例えば、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、硫酸水素塩、硝酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩などの無機酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩）、塩基付加塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、亜鉛塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩）、有機アミン付加塩（例えば、モルホリン、ピペリジンなどの付加塩）、アミノ酸付加塩（例えば、リジン、グリシン、フェニルアラニンなどの付加塩）が挙げられる。また、水和物または溶媒和物としては、特に制限はなく、例えば、前記物質またはその塩１分子に対し、０．１～１０分子の水または溶媒が付加したものが挙げられる。 The "substance that suppresses the activation of the adenosine A2A receptor and / or the adenosine A2B receptor" also includes a pharmacologically acceptable salt, hydrate or solvate as long as it has the suppressive activity. Such a pharmacologically acceptable salt is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the structure of each substance and the like. For example, an acid addition salt (for example, a hydrochloride salt, a hydrogen bromide salt, a sulfuric acid) can be selected. Inorganic acid salts such as salts, hydrogen sulfates, nitrates, carbonates, hydrogen carbonates, phosphates, monohydrogen phosphates, dihydrogen phosphates, acetates, propionates, lactates, citrates, Organic acid salts such as tartrate), base addition salts (eg, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, zinc salt, aluminum salt, ammonium salt, tetramethyl Ammonium salts), organic amine addition salts (eg, morpholin, piperidine and other addition salts), amino acid addition salts (eg, lysine, glycine, phenylalanine and other addition salts). The hydrate or solvate is not particularly limited, and examples thereof include those in which 0.1 to 10 molecules of water or a solvent are added to one molecule of the substance or a salt thereof.
　さらに、「アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質」には、その抑制活性を有する限り、互変異性体、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体などの総ての異性体および異性体混合物が含まれる。さらにまた、前記物質が生体内で酸化、還元、加水分解、アミノ化、脱アミノ化、水酸化、リン酸化、脱水酸化、アルキル化、脱アルキル化、抱合などの代謝を受けてなおその阻害活性を示す化合物をも包含し、また本発明は生体内で酸化、還元、加水分解などの代謝を受けて前記物質を生成する化合物をも包含する。 Furthermore, "substances that suppress the activation of adenosine A2A and / or adenosine A2B receptors" include tautomers, geometric isomers, and optical isomers based on asymmetric carbons, as long as they have the inhibitory activity. Includes all isomers and isomer mixtures, such as stereoisomers. Furthermore, the substance undergoes metabolism such as oxidation, reduction, hydrolysis, amination, deamination, hydroxylation, phosphorylation, dehydration, alkylation, dealkylation, and conjugation in the living body, and its inhibitory activity is still present. The present invention also includes compounds showing the above, and the present invention also includes compounds that undergo metabolism such as oxidation, reduction, and hydrolysis in vivo to produce the above-mentioned substances.
　なお、「アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニスト」、「アデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニスト」、「アデノシンＡ２Ａ受容体／アデノシンＡ２Ｂ受容体デュアルアンタゴニスト」および「アデノシン産生酵素の酵素活性を抑制する化合物」に関しては、上述のとおり、多くの化合物が開発され市販もされている。そのため、購入することによって入手することができる。また市販されていなくとも、それら化合物の製造方法についても多々報告がなされている。そのため、当業者であれば、当該製造方法に沿って適宜調製することもできる。 The "adenosine A2A receptor antagonist", "adenosine A2B receptor antagonist", "adenosine A2A receptor / adenosine A2B receptor dual antagonist" and "compound that suppresses the enzymatic activity of adenosine producing enzyme" are as described above. , Many compounds have been developed and are commercially available. Therefore, it can be obtained by purchasing. In addition, many reports have been made on methods for producing these compounds, even if they are not commercially available. Therefore, those skilled in the art can appropriately prepare according to the production method.
　本発明の組成物は、医薬組成物（医薬品、医薬部外品、動物用医薬品など）、飲食品（動物用飼料を含む）、あるいは研究目的（例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏの実験）に用いられる試薬の形態でありうる。 The composition of the present invention is used for pharmaceutical compositions (pharmaceutical products, non-pharmaceutical products, veterinary drugs, etc.), foods and drinks (including animal feeds), or for research purposes (for example, in vitro or in vivo experiments). It can be in the form of a reagent to be used.
　本発明の組成物は、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患の治療、改善、もしくは予防に利用することができる。なお、これらサイトカインを産生する細胞として、特に制限はないが、例えば、ナイーブＴ細胞（ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞など）、エフェクターＴ細胞、記憶Ｔ細胞、もしくはこれらＴ細胞が活性化することにより生じるヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞など、または、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞が挙げられる。 The composition of the present invention can be used for the treatment, amelioration, or prevention of diseases caused by abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa. The cells that produce these cytokines are not particularly limited, but are, for example, naive T cells (naive CD4 + T cells, etc.), effector T cells, memory T cells, or helpers generated by activation of these T cells. Examples include T cells, regulatory T cells, etc., or epithelial cells, endothelial cells, keratin-producing cells.
　「ＩＬ－２２の産生異常に起因する疾患」としては、例えば、好中球性気管支喘息を含む好中球性気道炎症、歯周病、乾癬、潰瘍性大腸炎、重症アトピー性皮膚炎、尋常性ざ瘡、子宮内膜症、慢性副鼻腔炎、その他の種々の自己免疫病（例えば、関節リウマチや、多発性硬化症、１型糖尿病、自己免疫性腎炎）が挙げられるが、これらに制限されない。 "Disease caused by abnormal production of IL-22" includes, for example, neutrophil airway inflammation including neutrophil bronchial asthma, periodontal disease, psoriasis, ulcerative colitis, severe atopic dermatitis, and vulgaris. Examples include, but are limited to, psoriasis, endometriosis, chronic sinusitis, and various other autoimmune diseases (eg, rheumatoid arthritis, polysclerosis, type 1 diabetes, autoimmune nephritis). Not done.
　「ＩＬ－３１の産生異常に起因する疾患」としては、起痒性の皮膚炎を主な病態とする疾患が挙げられ、より具体的には、結節性痒疹、アトピー性皮膚炎、接触湿疹、慢性特発性蕁麻疹、肥満細胞症、その他の種々の自己免疫疾患（例えば、水疱性類天疱瘡、乾癬、円形脱毛症）が挙げられるが、これらに制限されない。 Examples of the "disease caused by abnormal production of IL-31" include diseases mainly caused by prurigo dermatitis, and more specifically, prurigo nodularis, atopic dermatitis, contact eczema, and the like. Examples include, but are not limited to, chronic idiopathic urticaria, obesity dermatitis, and various other autoimmune disorders (eg, bullous pemphigoid, psoriasis, alopecia roundus).
　「ＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患」としては、例えば、炎症性皮膚疾患、腫瘍性皮膚疾患、遺伝性皮膚疾患（より具体的には、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患、乾癬、脱毛症、薬疹、薬剤性光線過敏症、光接触皮膚炎、皮膚リンフォーマ、メラノーマ）が挙げられるが、これらに制限されない。 "Disease caused by abnormal production of IFN-kappa" includes, for example, inflammatory skin disease, neoplastic skin disease, hereditary skin disease (more specifically, allergic disease such as atopic dermatitis, psoriasis, etc. Atopic dermatitis, drug rash, drug-induced photosensitivity, photocontact dermatitis, skin lymphoma, melanoma), but are not limited to these.
　本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合、有効成分として、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質を含有するものであれば、その剤形は特に限定されない。本発明の医薬組成物は、公知の製剤学的方法により、薬理学上許容される担体を含む、種々の剤形として製剤化することができる。 When the composition of the present invention is used as a pharmaceutical composition, the dosage form is not particularly limited as long as it contains a substance that suppresses the activation of the adenosine A2A receptor and / or the adenosine A2B receptor as an active ingredient. .. The pharmaceutical composition of the present invention can be formulated into various dosage forms including a pharmacologically acceptable carrier by a known pharmaceutical method.
　医薬組成物の剤型としては、特に制限はなく、例えば、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤など）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤など）、外用剤（坐剤、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入剤など）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤など）、その他、口腔用剤（ガム剤、トローチ剤、舌下錠、バッカル錠、付着剤など）、口腔用スプレー剤、口腔用半固形剤、歯磨剤、含嗽剤などが挙げられる。 The dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the desired administration method, for example, an oral solid preparation (tablet, coated tablet, granule, powder, capsule, etc.). , Oral solutions (internal solutions, syrups, elixirs, etc.), external preparations (suppositories, ointments, patches, gels, creams, external powders, sprays, inhalants, etc.), injections (solutions, suspensions, etc.) Turbid liquid, solid agent for errands, etc.), other oral agents (gum agent, troche agent, sublingual tablet, buccal tablet, adhesive, etc.), oral spray agent, oral semi-solid agent, dentifrice, gargle Examples include agents.
　経口固形剤としては、例えば、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質に、賦形剤、さらには必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤などの添加剤を加え、常法により製造することができる
　賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。 Oral solid preparations include, for example, substances that suppress the activation of adenosine A2A and / or adenosine A2B receptors, excipients, and if necessary, binders, disintegrants, lubricants, and colorants. As excipients that can be produced by a conventional method by adding additives such as flavoring and flavoring agents, for example, lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, starch, calcium carbonate, kaolin, microcrystalline cellulose, silicic acid and the like. Can be mentioned. Examples of the binder include water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl starch, methyl cellulose, ethyl cellulose, shelac, calcium phosphate, polyvinylpyrrolidone and the like. .. Examples of the disintegrant include dried starch, sodium alginate, canten powder, sodium hydrogencarbonate, calcium carbonate, sodium lauryl sulfate, stearate monoglyceride, lactose and the like. Examples of the lubricant include purified talc, stearate, borax, polyethylene glycol and the like. Examples of the colorant include titanium oxide and iron oxide. Examples of the flavoring / flavoring agent include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like.
　経口液剤としては、例えば、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などの添加剤を加え、常法により製造することができる。 The oral solution is produced by a conventional method, for example, by adding additives such as a flavoring / flavoring agent, a buffering agent, and a stabilizer to a substance that suppresses the activation of adenosine A2A receptor and / or adenosine A2B receptor. be able to.
　矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。 Examples of the flavoring / flavoring agent include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like. Examples of the buffer include sodium citrate and the like. Examples of the stabilizer include tragant, gum arabic, gelatin and the like.
　坐剤としては、例えば、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質に、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリドなどの公知の坐剤製剤用担体と、必要に応じてツイーン（ＴＷＥＥＮ：登録商標）などの界面活性剤などを加えた後、常法により製造することができる。 As the suppository, for example, a substance that suppresses the activation of the adenosine A2A receptor and / or the adenosine A2B receptor, a known carrier for suppository preparation such as polyethylene glycol, lanolin, cacao butter, and fatty acid triglyceride, and a necessary carrier. It can be produced by a conventional method after adding a surfactant or the like such as Tween (registered trademark) accordingly.
　軟膏剤としては、例えば、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤などを配合し、常法により混合し、製造することができる。 As the ointment, for example, a known base, stabilizer, wetting agent, preservative, etc. are blended with a substance that suppresses the activation of adenosine A2A receptor and / or adenosine A2B receptor, and mixed by a conventional method. , Can be manufactured.
　基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。 Examples of the base include liquid paraffin, white petrolatum, bleached beeswax, octyldodecyl alcohol, paraffin and the like. Examples of the preservative include methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate and the like.
　貼付剤としては、例えば、公知の支持体に軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤などを、常法により塗布し、製造することができる。支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタンなどのフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。 As the patch, for example, a cream, gel, paste or the like as an ointment can be applied to a known support by a conventional method to produce the patch. Examples of the support include cotton, rayon, a woven fabric made of chemical fibers, a non-woven fabric, a film such as soft vinyl chloride, polyethylene, and polyurethane, and a foam sheet.
　注射剤としては、例えば、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用などの注射剤を製造することができる。 As an injection, for example, a pH adjuster, a buffer, a stabilizer, an isotonic agent, a local anesthetic, etc. are added to a substance that suppresses the activation of adenosine A2A receptor and / or adenosine A2B receptor. , Injections for subcutaneous, intramuscular, intravenous, etc. can be produced by a conventional method.
　ｐＨ調節剤および緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。 Examples of the pH adjuster and buffer include sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate and the like. Examples of the stabilizer include sodium metabisulfite, EDTA, thioglycolic acid, thiolactic acid and the like. Examples of the tonicity agent include sodium chloride, glucose and the like. Examples of the local anesthetic include procaine hydrochloride, lidocaine hydrochloride and the like.
　口腔内に適用する製剤も、その性状に応じて、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。 A pharmaceutical product to be applied to the oral cavity can also be formulated by a known pharmaceutical method according to its properties.
　本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合には、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１またはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患の治療などに有効な１種もしくは２種以上の他の成分を配合することができる。また、この目的に有効な他の医薬組成物と併用してもよい。 When the composition of the present invention is used as a pharmaceutical composition, one or more other components effective for the treatment of diseases caused by abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa may be used. Can be blended. It may also be used in combination with other pharmaceutical compositions effective for this purpose.
　医薬組成物の投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒトおよび非ヒト動物が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらに制限されない。投与方法は、その剤型などに応じて適宜選択することができ、例えば、経口、外用、注射による投与などが挙げられる。投与量は、投与対象の種類、年齢、体重、性別、症状などに応じて適宜選択することができるが、例えば、ヒト成人１日あたり、有効成分であるアデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質の量として、例えば、０．０４～５００ｍｇの範囲内で選択される量が好ましいと考えられる。投与頻度としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１日あたりの投与量を、１日に１回で投与してもよいし、複数回に分けて投与してもよい。また、毎日ではなく、例えば、週に１～４回で投与してもよい。 The administration target of the pharmaceutical composition is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, and examples thereof include humans and non-human animals. Examples of non-human animals include, but are not limited to, mice, rats, cows, pigs, monkeys, dogs, cats and the like. The administration method can be appropriately selected depending on the dosage form and the like, and examples thereof include oral administration, external administration, and administration by injection. The dose can be appropriately selected according to the type, age, body weight, sex, symptoms, etc. of the subject to be administered, and for example, the active ingredient adenosine A2A receptor and / or adenosine A2B receptor per day for human adults. As the amount of the substance that suppresses the activation of the body, for example, an amount selected in the range of 0.04 to 500 mg is considered preferable. The frequency of administration is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, the daily dose may be administered once a day or divided into a plurality of doses. You may. It may also be administered, for example, 1 to 4 times a week instead of daily.
　本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、あるいは食品添加物でありうる。飲食品の具体例としては、ドリンク類、スープ類、乳飲料、清涼飲料水、茶飲料、アルコール飲料、ゼリー状飲料、機能性飲料などの液状食品；食用油、ドレッシング、マヨネーズ、マーガリンなどの油分を含む製品；飯類、麺類、パン類などの炭水化物含有食品；ハム、ソーセージなどの畜産加工食品；かまぼこ、干物、塩辛などの水産加工食品；漬物などの野菜加工食品；ゼリー、ヨーグルトなどの半固形状食品；みそ、発酵飲料などの発酵食品；洋菓子類、和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、冷菓、氷菓などの各種菓子類；カレー、あんかけ、中華スープなどのレトルト製品；インスタントスープ、インスタントみそ汁などのインスタント食品や電子レンジ対応食品などが挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。 When the composition of the present invention is used as a food and drink, the food and drink may be, for example, a health food, a functional food, a food for specified health use, a nutritional supplement, a food for the sick, or a food additive. Specific examples of foods and drinks include liquid foods such as drinks, soups, dairy drinks, soft drinks, tea drinks, alcoholic drinks, jelly-like drinks, and functional drinks; oils such as cooking oil, dressings, mayonnaise, and margarine. Products containing; Carbohydrate-containing foods such as rice, noodles and breads; Processed livestock foods such as ham and sausage; Processed marine foods such as kamaboko, dried fish and salted foods; Processed vegetable foods such as pickles; Half of jelly and yogurt Solid foods; Fermented foods such as miso and fermented beverages; Western confectionery, Japanese confectionery, candy, gums, gummy, chilled confectionery, ice confectionery and other confectionery; curry, ankake, Chinese soup and other retort products; instant soup, Examples include instant foods such as instant miso soup and foods compatible with microwave ovens. Further, healthy foods and drinks prepared in the form of powder, granules, tablets, capsules, liquid, paste or jelly can be mentioned.
　本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。飲食品においては、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患に有効な１種もしくは２種以上の成分を配合してもよい。また、この目的の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。 The food and drink in the present invention can be manufactured by a manufacturing technique known in the art. In foods and drinks, one or more components effective for diseases caused by abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa may be blended. In addition, it may be a multifunctional food or drink by combining it with other ingredients or other functional foods that exhibit this desired function.
　飲食品の摂取対象としては、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒトおよび非ヒト動物が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられるが、これらに制限されない。摂取量は、摂取対象の種類、年齢、体重、性別、症状などに応じて適宜選択することができるが、例えば、ヒト成人１日あたり、有効成分であるアデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質の量として、例えば、０．０４～５００ｍｇの範囲内で選択される量が好ましいと考えられる。摂取頻度は、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１日あたりの摂取量を、１日に１回で摂取してもよいし、複数回に分けて摂取してもよい。また、毎日ではなく、例えば、週に１～４回で摂取してもよい。 The target of food and drink can be appropriately selected according to the purpose, and examples thereof include humans and non-human animals. Examples of non-human animals include, but are not limited to, mice, rats, cows, pigs, monkeys, dogs, cats and the like. The amount of intake can be appropriately selected according to the type, age, body weight, sex, symptoms, etc. of the subject to be ingested, and for example, the active ingredient adenosine A2A receptor and / or adenosine A2B receptor per day for human adults. As the amount of the substance that suppresses the activation of the body, for example, an amount selected in the range of 0.04 to 500 mg is considered preferable. The frequency of intake can be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, the daily intake may be taken once a day or may be divided into a plurality of times. It may also be taken, for example, 1 to 4 times a week instead of daily.
　本発明の組成物の製品（医薬組成物、飲食品、試薬、これらを含む器具など）またはその説明書は、例えば、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生の抑制に用いられる旨、および／またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患の治療、改善、または予防に用いられる旨の表示を付したものでありうる。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。 The product of the composition of the present invention (pharmaceutical composition, food and drink, reagent, device containing these, etc.) or its description is used to suppress the production of, for example, IL-22, IL-31 or IFN-kappa. , And / or may be labeled as being used for the treatment, amelioration, or prevention of diseases caused by abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa. Here, "marked on the product or instruction manual" means that the label is attached to the main body, container, packaging, etc. of the product, or the instruction manual, package insert, advertisement, or other printed matter that discloses the information of the product. It means that the display is attached to.
　＜被検化合物の活性評価法＞
　本発明は、被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法を提供する。 <Method for evaluating the activity of the test compound>
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention treats and improves a disease caused by an activity in which a test compound suppresses the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or an abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. , Or provide a method for assessing the probability of having prophylactic activity.
　－第一および第二の態様－
　本発明の評価方法の第一の態様は、被検化合物とアデノシンＡ２Ａ受容体との結合を指標とする方法であり、（ａ）被検化合物をアデノシンＡ２Ａ受容体に接触させる工程、および（ｂ）被検化合物とアデノシンＡ２Ａ受容体との結合を検出する工程、を含む。 -First and second aspects-
The first aspect of the evaluation method of the present invention is a method using the binding of the test compound to the adenosine A2A receptor as an index, (a) a step of contacting the test compound with the adenosine A2A receptor, and (b). ) Includes a step of detecting the binding of the test compound to the adenosine A2A receptor.
　また、第一の態様として、（ａ）被検化合物をアデノシンＡ２Ｂ受容体に接触させる工程、および（ｂ）被検化合物とアデノシンＡ２Ｂ受容体との結合を検出する工程を含む、被検化合物とアデノシンＡ２Ｂ受容体との結合を指標とする方法も挙げられる。 Further, as a first aspect, the test compound comprises (a) a step of contacting the test compound with the adenosine A2B receptor, and (b) a step of detecting the binding between the test compound and the adenosine A2B receptor. A method using the binding to the adenosine A2B receptor as an index can also be mentioned.
　本発明の評価方法の第二の態様は、被検化合物とアデノシン産生酵素との結合を指標とする方法であり、（ａ）被検化合物をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および（ｂ）被検化合物とアデノシン産生酵素との結合を検出する工程、を含む。 The second aspect of the evaluation method of the present invention is a method using the binding between the test compound and the adenosine-producing enzyme as an index, (a) a step of bringing the test compound into contact with the adenosine-producing enzyme, and (b) a subject. The step of detecting the binding between the test compound and the adenosine-producing enzyme is included.
　これらの態様は、主として、後述の態様の評価のための一次的評価法として利用することができる。 These aspects can be mainly used as a primary evaluation method for the evaluation of the aspects described later.
　本発明の評価方法の対象とする「被検化合物」としては特に制限はなく、例えば、合成低分子化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、ペプチドライブラリー、ポリヌクレオチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液および培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物から採取した抽出物などが挙げられる。被検化合物は、アデノシンＡ２Ａ受容体、アデノシンＡ２Ｂ受容体またはアデノシン産生酵素の立体構造を基にしたｉｎ　ｓｉｌｉｃｏでのデザインを基に合成したものであってもよい。 The "test compound" to be the target of the evaluation method of the present invention is not particularly limited, and for example, a synthetic small molecule compound library, an expression product of a gene library, a peptide library, a polynucleotide library, an antibody, and a bacterial release. Examples include substances, extracts and culture supernatants of cells (microorganisms, plant cells, animal cells), purified or partially purified polypeptides, extracts from marine organisms, plants or animals, and the like. The test compound may be synthesized based on the design in silico based on the three-dimensional structure of the adenosine A2A receptor, adenosine A2B receptor or adenosine-producing enzyme.
　本発明の評価方法において使用する「アデノシンＡ２Ａ受容体」は、ヒトタンパク質の場合は、例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００６６６．２）やその部分ペプチドが挙げられる。但し、アデノシンＡ２Ａ受容体のアミノ酸配列には、個体差が生じうることを理解されたい。 In the case of a human protein, the "adenosine A2A receptor" used in the evaluation method of the present invention is, for example, a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 (NCBI Reference Sequence: NP_000666.2) or a partial peptide thereof. Can be mentioned. However, it should be understood that individual differences may occur in the amino acid sequence of the adenosine A2A receptor.
　本発明の評価方法において使用する「アデノシンＡ２Ｂ受容体」は、ヒトタンパク質の場合は、例えば、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００６６７．１）やその部分ペプチドが挙げられる。但し、アデノシンＡ２Ｂ受容体のアミノ酸配列にも、個体差が生じうることを理解されたい。 In the case of a human protein, the "adenosine A2B receptor" used in the evaluation method of the present invention includes, for example, a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 (NCBI Reference Sequence: NP_000667.1) or a partial peptide thereof. Can be mentioned. However, it should be understood that the amino acid sequence of the adenosine A2B receptor may also vary from individual to individual.
　本発明の評価方法において使用する「アデノシン産生酵素」は、ヒトＣＤ３９タンパク質の場合は、例えば、配列番号：２～７のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１７６７、ＮＰ＿００１０９１６４５、ＮＰ＿００１１５７６５０、ＮＰ＿００１１５７６５１、ＮＰ＿００１１５７６５３、または、ＮＰ＿００１１５７６５４）やその部分ペプチドが挙げられる。ヒトＣＤ７３タンパク質の場合は、例えば、配列番号：８または９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１１９１７４２、または、ＮＰ＿００２５１７）やその部分ペプチドが挙げられる。但し、アデノシン産生酵素のアミノ酸配列には、個体差が生じうることを理解されたい。 In the case of the human CD39 protein, the "adenosine-producing enzyme" used in the evaluation method of the present invention is, for example, a protein consisting of the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 2 to 7 (NCBI Reference Sequence: NP_001767, NP_001091645, NP_001157650, NP_001157651, NP_001157653, or NP_001157654) and partial peptides thereof can be mentioned. In the case of the human CD73 protein, for example, a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8 or 9 (NCBI Reference Sequence: NP_001191742 or NP_002517) or a partial peptide thereof can be mentioned. However, it should be understood that individual differences may occur in the amino acid sequence of adenosine-producing enzymes.
　アデノシンＡ２Ａ受容体、アデノシンＡ２Ｂ受容体およびアデノシン産生酵素は各々、前記天然型のタンパク質やその部分ペプチドに加え、必要に応じて、それらの改変体や修飾体などを用いることができる。例えば、検出や精製を容易にするために、他の蛋白質（例えば、アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、β－ガラクトシダーゼなどの酵素、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）などの蛍光蛋白質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）などのタグ）との融合蛋白質を用いることができる。また、アデノシンＡ２Ａ受容体またはアデノシン産生酵素は、細胞表面に発現させた形態で用いることもできる。 As the adenosine A2A receptor, adenosine A2B receptor, and adenosine-producing enzyme, in addition to the above-mentioned natural protein and its partial peptide, variants and modifications thereof can be used as needed. For example, to facilitate detection and purification, other proteins (eg, enzymes such as alkaline phosphatase (SEAP), β-galactosidase, fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP), glutathione-S-transferase (GST)). (Tags such as) and fusion proteins can be used. The adenosine A2A receptor or adenosine-producing enzyme can also be used in the form expressed on the cell surface.
　被検化合物と、アデノシンＡ２Ａ受容体、アデノシンＡ２Ｂ受容体またはアデノシン産生酵素との「接触」は、当該評価系への被検化合物の添加などにより行うことができる。 "Contact" between the test compound and the adenosine A2A receptor, adenosine A2B receptor or adenosine-producing enzyme can be performed by adding the test compound to the evaluation system or the like.
　「被検化合物と、アデノシンＡ２Ａ受容体、アデノシンＡ２Ｂ受容体またはアデノシン産生酵素との結合の検出」には、公知の手法を適宜採用することができる。例えば、固定したアデノシンＡ２Ａ受容体、アデノシンＡ２Ｂ受容体またはアデノシン産生酵素に、被検化合物を接触させ、アデノシンＡ２Ａ受容体、アデノシンＡ２Ｂ受容体またはアデノシン産生酵素に結合する化合物を同定する方法が挙げられる。被検化合物とアデノシンＡ２Ａ受容体、アデノシンＡ２Ｂ受容体またはアデノシン産生酵素との結合を検出する手段としては、様々な公知の手段を利用することができるが、好適な手段の一例として、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーが挙げられる。 A known method can be appropriately adopted for "detection of binding between the test compound and the adenosine A2A receptor, adenosine A2B receptor or adenosine-producing enzyme". For example, there is a method of contacting a test compound with a fixed adenosine A2A receptor, adenosine A2B receptor or adenosine producing enzyme to identify a compound that binds to the adenosine A2A receptor, adenosine A2B receptor or adenosine producing enzyme. .. Various known means can be used as a means for detecting the binding between the test compound and the adenosine A2A receptor, adenosine A2B receptor or adenosine-producing enzyme, and as an example of a suitable means, surface plasmon resonance Biosensors that utilize the phenomenon can be mentioned.
　被検化合物が合成低分子化合物ライブラリーである場合には、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループット法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ　Ｎ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６；２７３（５２７４）４５８－４６４（１９９６）、Ｖｅｒｄｉｎｅ，Ｇ．Ｌ．Ｎａｔｕｒｅ　３８４　１１－１３　（１９９６）、Ｈｏｇａｎ　Ｊ.Ｃ．，Ｊｒ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ．３８４：１７－１９（１９９６））を利用することができる。 When the test compound is a synthetic small molecule compound library, for example, a high-throughput method by combinatorial chemistry technology (Writton NC et al., Science. 26; 273 (5274) 458-464 (1996), Verdine, GL Nature 384 11-13 (1996), Hogan JC, Jr Directed combinatorial chemistry. Nature. 384: 17-19 (1996) can be used.
　また、被検化合物がポリヌクレオチドライブラリーである場合には、例えば、インビトロセレクション法を利用することができる（ＳＥＬＥＸ法）（Ｔｕｅｒｋ　Ｃ．＆Ｇｏｌｄ　Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３；２４９（４９６８）：５０５－５１０（１９９０）、Ｇｒｅｅｎ　Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｏｍｐａｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２：７５－８６（１９９１）、Ｇｏｌｄ　Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｎｕ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　６４：７６３－９７　（１９９５）、Ｕｐｈｏｆｆ　Ｋ．Ｗ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：２８１－２８８（１９９６））。 Further, when the test compound is a polynucleotide library, for example, an in vitro selection method can be used (SELEX method) (Tuerk C. & Gold L., Science. 3; 249 (496): 505-. 510 (1990), Green R. et al., Methods Compan Methods Enzymol. 2: 75-86 (1991), Gold L. et al., Annu Rev Biochem 64: 763-97 (1995), Uphoff. et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 281-288 (1996)).
　その他、被検化合物の種類などに応じて、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した方法、免疫沈降法、酵母ツーハイブリッドシステムなどを利用することもできる。 In addition, depending on the type of test compound, a method using FRET (fluorescence resonance energy transfer), an immunoprecipitation method, a yeast two-hybrid system, etc. can also be used.
　以上の結果、被検化合物が、アデノシンＡ２Ａ受容体、アデノシンＡ２Ｂ受容体およびアデノシン産生酵素のうちの少なくとも１のタンパク質、その部分ペプチド、またはそれらの改変体もしくは修飾体と結合する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、または予防する活性を有する蓋然性があると評価される。 As a result of the above, when the test compound binds to at least one protein of adenosine A2A receptor, adenosine A2B receptor and adenosine-producing enzyme, a partial peptide thereof, or a variant or a modification thereof, IL-22. , IL-31 or IFN-kappa production inhibitory activity, or IL-22, IL-31 or IFN-kappa production abnormal activity to treat, ameliorate, or prevent diseases. Will be done.
　－第三の態様－
　本発明の評価方法の第三の態様は、被検化合物によるアデノシンＡ２Ａ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ａ受容体との結合の阻害を指標とする方法であり、（ａ）被検化合物の存在下で、アデノシンＡ２Ａ受容体リガンドをアデノシンＡ２Ａ受容体に接触させる工程、および（ｂ）アデノシンＡ２Ａ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ａ受容体との結合を検出する工程、を含む。 -Third aspect-
The third aspect of the evaluation method of the present invention is a method using the inhibition of the binding between the adenosine A2A receptor ligand and the adenosine A2A receptor by the test compound as an index, and (a) in the presence of the test compound. It comprises contacting the adenosine A2A receptor ligand with the adenosine A2A receptor and (b) detecting the binding of the adenosine A2A receptor ligand to the adenosine A2A receptor.
　また、第三の態様として、（ａ）被検化合物の存在下で、アデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドをアデノシンＡ２Ｂ受容体に接触させる工程、および（ｂ）アデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ｂ受容体との結合を検出する工程を含む、被検化合物によるアデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ｂ受容体との結合の阻害を指標とする方法も挙げられる。 Further, as a third aspect, (a) a step of contacting the adenosine A2B receptor ligand with the adenosine A2B receptor in the presence of the test compound, and (b) the adenosine A2B receptor ligand and the adenosine A2B receptor. There is also a method using the inhibition of the binding between the adenosine A2B receptor ligand and the adenosine A2B receptor by the test compound as an index, which comprises a step of detecting the binding.
　「アデノシンＡ２Ａ受容体リガンド」または「アデノシンＡ２Ｂ受容体リガンド」としては、例えば、天然リガンドであるアデノシンを用いることができる。この評価方法においては、例えば、固定したアデノシンＡ２Ａ受容体またはアデノシンＡ２Ｂ受容体や、細胞表面に発現させたアデノシンＡ２Ａ受容体またはアデノシンＡ２Ｂ受容体と、放射性物質や蛍光物質などの標識を行ったアデノシンとの結合を、被検化合物が阻害するか否かを、当該標識を指標に検出すればよい。ここでいう「阻害」には、完全な阻害および部分的な阻害の双方が含まれる。 As the "adenosine A2A receptor ligand" or the "adenosine A2B receptor ligand", for example, adenosine, which is a natural ligand, can be used. In this evaluation method, for example, a fixed adenosine A2A receptor or adenosine A2B receptor, an adenosine A2A receptor or adenosine A2B receptor expressed on the cell surface, and adenosine labeled with a radioactive substance or a fluorescent substance are used. Whether or not the test compound inhibits the binding to the drug may be detected using the label as an index. The term "inhibition" as used herein includes both complete inhibition and partial inhibition.
　以上の結果、被検化合物が、アデノシンＡ２Ａ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ａ受容体との結合を阻害する場合、および／または、アデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ｂ受容体との結合を阻害する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される。 As a result of the above, when the test compound inhibits the binding between the adenosine A2A receptor ligand and the adenosine A2A receptor, and / or when the binding between the adenosine A2B receptor ligand and the adenosine A2B receptor is inhibited, IL. It is likely to have the activity of suppressing the production of -22, IL-31 or IFN-kappa, or the activity of treating, ameliorating or preventing the disease caused by the abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. Is evaluated as.
　－第四の態様－
　本発明の評価方法の第四の態様は、被検化合物によるアデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合の阻害を指標とする方法であり、（ａ）被検化合物の存在下で、アデノシン産生酵素の基質をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および（ｂ）アデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合を検出する工程、を含む。 -Fourth aspect-
The fourth aspect of the evaluation method of the present invention is a method using the inhibition of the binding between the substrate of the adenosine-producing enzyme and the adenosine-producing enzyme by the test compound as an index, and (a) adenosine in the presence of the test compound. It comprises contacting the substrate of the producing enzyme with the adenosine producing enzyme, and (b) detecting the binding between the substrate of the adenosine producing enzyme and the adenosine producing enzyme.
　「アデノシン産生酵素の基質」としては、アデノシン産生酵素がＣＤ３９である場合には、例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰが挙げられ、アデノシン産生酵素がＣＤ７３である場合には、例えば、ＡＭＰが挙げられる。この評価方法においては、例えば、固定したアデノシン産生酵素や細胞表面に発現させたアデノシン産生酵素と、放射性物質や蛍光物質などの標識を行った基質との結合を、被検化合物が阻害するか否かを、当該標識を指標に検出すればよい。 Examples of the "adenosine-producing enzyme substrate" include ATP and ADP when the adenosine-producing enzyme is CD39, and AMP, for example, when the adenosine-producing enzyme is CD73. In this evaluation method, for example, whether or not the test compound inhibits the binding between the fixed adenosine-producing enzyme or the adenosine-producing enzyme expressed on the cell surface and the labeled substrate such as a radioactive substance or a fluorescent substance. It may be detected by using the sign as an index.
　以上の結果、被検化合物がアデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合を阻害する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される。 As a result of the above, when the test compound inhibits the binding between the substrate of the adenosine-producing enzyme and the adenosine-producing enzyme, the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or IL-22, IL- It is evaluated that there is a probability that it has an activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by abnormal production of 31 or IFN-kappa.
　－第五の態様－
　本発明の評価方法の第五の態様は、被検化合物によるアデノシンＡ２Ａ受容体の活性の抑制を指標とする方法であり、（ａ）被検化合物をアデノシンＡ２Ａ受容体を発現する細胞に接触させる工程、および（ｂ）アデノシンＡ２Ａ受容体の活性を検出する工程、を含む。 -Fifth aspect-
The fifth aspect of the evaluation method of the present invention is a method using the suppression of the activity of the adenosine A2A receptor by the test compound as an index, and (a) the test compound is brought into contact with cells expressing the adenosine A2A receptor. It comprises (b) a step of detecting the activity of the adenosine A2A receptor.
　また、第五の態様として、（ａ）被検化合物をアデノシンＡ２Ｂ受容体を発現する細胞に接触させる工程、および（ｂ）アデノシンＡ２Ｂ受容体の活性を検出する工程を含む、被検化合物によるアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性の抑制を指標とする方法も挙げられる。 Further, as a fifth aspect, adenosine by the test compound comprises (a) a step of contacting the test compound with a cell expressing the adenosine A2B receptor, and (b) a step of detecting the activity of the adenosine A2B receptor. A method using suppression of A2B receptor activity as an index can also be mentioned.
　本発明の評価方法の指標となるアデノシンＡ２Ａ受容体の活性としては、刺激に応答したアデノシンＡ２Ａ受容体からのシグナル伝達において生じる様々な事象が挙げられる。このようなシグナル伝達としては、例えば、ｃＡＭＰの上昇、ＰＫＡの活性化などが挙げられるが、これらに制限されない。本発明の評価方法の指標となるアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性としては、刺激に応答したアデノシンＡ２Ｂ受容体からのシグナル伝達において生じる様々な事象が挙げられる。このようなシグナル伝達としては、例えば、アデニル酸シクラーゼの活性化、ｃＡＭＰの上昇、ＰＫＡの活性化、ホスホリパーゼＣの活性化、イノシトール１，４，５－三リン酸の上昇、ジアシルグリセロールの上昇などが挙げられるが、これらに制限されない。 Examples of the activity of the adenosine A2A receptor, which is an index of the evaluation method of the present invention, include various events that occur in signal transduction from the adenosine A2A receptor in response to a stimulus. Examples of such signal transduction include, but are not limited to, an increase in cAMP and activation of PKA. Examples of the activity of the adenosine A2B receptor, which is an index of the evaluation method of the present invention, include various events occurring in signal transduction from the adenosine A2B receptor in response to a stimulus. Such signal transduction includes, for example, activation of adenylate cyclase, elevation of cAMP, activation of PKA, activation of phospholipase C, elevation of inositol 1,4,5-triphosphate, elevation of diacylglycerol, and the like. However, it is not limited to these.
　本発明の評価方法においては、例えば、アデノシンＡ２Ａ受容体リガンドおよびアデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドであるアデノシンの刺激により、細胞表面上のアデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドを活性化させてる反応系に、被検化合物を適用して、当該活性が阻害されるかを評価すればよい。これら活性の測定方法は公知であり、通常の方法や測定キットを用いて測定すればよい。 In the evaluation method of the present invention, for example, a reaction in which adenosine A2A receptor and / or adenosine A2B receptor ligand on the cell surface is activated by stimulation with adenosine A2A receptor ligand and adenosine A2B receptor ligand. The test compound may be applied to the system to evaluate whether the activity is inhibited. Methods for measuring these activities are known and may be measured using ordinary methods or measurement kits.
　以上の結果、被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物がアデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドの活性を低下させる場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される。 As a result of the above, when the test compound reduces the activity of the adenosine A2A receptor and / or the adenosine A2B receptor ligand as compared with the case where the test compound is not contacted, IL-22, IL-31 or IFN-kappa It is evaluated that there is a probability that it has an activity of suppressing the production of IL-22, or an activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by an abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa.
　－第六の態様－
　本発明の評価方法の第六の態様は、被検化合物によるアデノシン産生酵素の酵素活性の抑制を指標とする方法であり、（ａ）被検化合物をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および（ｂ）アデノシン産生酵素の酵素活性を検出する工程、を含む。 -Sixth aspect-
The sixth aspect of the evaluation method of the present invention is a method using the suppression of the enzyme activity of the adenosine-producing enzyme by the test compound as an index, (a) a step of contacting the test compound with the adenosine-producing enzyme, and (b). ) Includes a step of detecting the enzymatic activity of an adenosine-producing enzyme.
　本発明の評価方法の指標となるアデノシン産生酵素の酵素活性は、各基質の存在下、各酵素が触媒する反応によって得られる生成物（ＣＤ３９であればＡＭＰ、ＣＤ７３であればアデノシン）の量を、公知の手法（例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法）にて測定することによって検出することができる。また、かかる酵素活性には、前述のＡＭＰまたはアデノシン生成能のみならず、生成されたアデノシンなどによって誘導されるシグナル伝達において生じる様々な事象も挙げられる。このようなシグナル伝達としては、例えば、ｃＡＭＰの上昇、ＰＫＡの活性化などが挙げられるが、これらに制限されない。これら活性の測定方法は公知であり、通常の方法や測定キットを用いて測定すればよい。 The enzyme activity of the adenosine-producing enzyme, which is an index of the evaluation method of the present invention, is the amount of the product (AMP for CD39, adenosine for CD73) obtained by the reaction catalyzed by each enzyme in the presence of each substrate. , Can be detected by measurement by a known method (for example, liquid chromatography mass analysis method). In addition to the above-mentioned AMP or adenosine-producing ability, such enzyme activity also includes various events that occur in signal transduction induced by the produced adenosine and the like. Examples of such signal transduction include, but are not limited to, an increase in cAMP and activation of PKA. Methods for measuring these activities are known and may be measured using ordinary methods or measurement kits.
　以上の結果、被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物がアデノシン産生酵素の活性を低下させる場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される。 As a result of the above, when the test compound reduces the activity of the adenosine-producing enzyme, the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or IL, as compared with the case where the test compound is not contacted. It is evaluated to have the potential to have the activity of treating, ameliorating, or preventing diseases caused by abnormal production of -22, IL-31, or IFN-kappa.
　以上、本発明の評価方法について説明したが、複数の被検化合物に対して、本発明の評価方法を実施して、上記のアデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドへの結合、アデノシンＡ２Ａ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ａ受容体との結合の阻害、アデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ｂ受容体との結合の阻害、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性の抑制、上記のアデノシン産生酵素への結合、アデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合の阻害、あるいはアデノシン産生酵素の酵素活性の抑制を指標に化合物を選択すれば、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。従って、本発明は、このようなスクリーニング方法をも提供する。 The evaluation method of the present invention has been described above, but the evaluation method of the present invention is carried out for a plurality of test compounds to bind to the above-mentioned adenosine A2A receptor and / or adenosine A2B receptor ligand, and adenosine. Inhibition of binding between A2A receptor ligand and adenosine A2A receptor, inhibition of binding between adenosine A2B receptor ligand and adenosine A2B receptor, inhibition of adenosine A2A and / or adenosine A2B receptor activity, the above-mentioned adenosine IL-22, IL-31 or IFN-kappa can be selected by selecting a compound based on binding to adenosine, inhibition of binding of adenosine-producing substrate to adenosine-producing enzyme, or suppression of adenosine-producing enzyme activity. Compounds can be screened that have the activity of suppressing the production of, or the activity of treating, ameliorating, or preventing diseases caused by abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa. Therefore, the present invention also provides such a screening method.
　本発明の評価方法やスクリーニング方法によって同定された化合物については、実際に、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制を抑制するか否か、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有するか否かを検証することが好ましい。ＩＬ－２２、ＩＬ－３１またはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生抑制は、例えば、本実施例に記載のとおり、２ウェイＭＬＲなどを利用して、これら各種サイトカインの産生が抑制されるか否かにより評価することができる。また、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１またはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、または予防する活性は、各種モデル動物による実験において評価することができる。さらに、臨床試験において、実際にヒトにおける効果を評価することができる。 For the compounds identified by the evaluation method and screening method of the present invention, whether or not to actually suppress the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, IL-22, IL-31 or IFN. -It is preferable to verify whether or not the disease has an activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by abnormal production of kappa. The suppression of IL-22, IL-31 or IFN-kappa production is evaluated by, for example, as described in this example, whether or not the production of these various cytokines is suppressed by using 2-way MLR or the like. be able to. In addition, the activity of treating, ameliorating, or preventing diseases caused by abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa can be evaluated in experiments using various model animals. Furthermore, in clinical trials, it is possible to actually evaluate the effect in humans.
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on Examples, but the present invention is not limited to the following Examples.
　なお、各実施例における統計学的解析は、２群間の差はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して分析した。３群間以上の差は一元配置分散分析（ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ，ｏｎｅ－ｗａｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ）で、ｐ値（確率値，ｐ　ｖａｌｕｅ）が０．０５以下を有意差ありとし、ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡで有意差ありと判定された場合は、さらにＴｕｒｋｅｙ検定（Ｔｕｒｋｅｙ　ｈｏｎｅｓｔｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を行って２群間の有意差を分析した。 In the statistical analysis in each example, the difference between the two groups was analyzed using Student's t-test. Differences between 3 groups or more are one-way ANOVA, one-way ANOVA, where p value (probability value, p value) is 0.05 or less, and there is a significant difference. When it was determined that there was a significant difference in the above, a Turkey test (Turkey honestly significant difference) was further performed to analyze the significant difference between the two groups.
　また、皮膚炎スコアについての統計学的解析においては、クラスカル・ウォリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）で、ｐ値が０．０５以下を有意差ありとし、クラスカル・ウォリス検定で有意差ありと判定された場合は、さらにウィルコクソンの符号順位検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ　ｓｉｇｎｅｄ－ｒａｎｋ　ｔｅｓｔ）を行って２群間の有意差を分析した。 In the statistical analysis of the dermatitis score, the Kruskal-Wallis test determined that the p-value was 0.05 or less, and the Kruskal-Wallis test determined that there was a significant difference. In this case, Wilcoxon signed-rank test was further performed to analyze the significant difference between the two groups.
　分析にはＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアを使用した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意であると見做した。そして、各コントロールと比較して、Ｐ値が０．０５以下の群には＊印、０．０１以下の群には＊＊印を、各図中のグラフに付加した。なお、各図に示した実験におけるコントロールは以下のとおりである。
図１Ａ；培地、図１Ｂ；培地、図１Ｃ；培地＋アデノシン１００μＭ、図２Ａ；培地＋ＣＤ３／２８、図２Ｂ；培地＋ＣＤ３／２８、図２Ｃ；培地＋アデノシン６００μＭ＋ＣＤ３／２８、図３；培地＋ＣＤ３／ＣＤ２８＋アデノシン（６００μＭ）、図４Ａ；培地＋ＡＴＰ（１００μＭ）、図４Ｂ；培地＋ＡＴＰ（１００μＭ）、図５；培地＋ＣＤ３／ＣＤ２８＋アデノシン（６００μＭ）、図６Ａ；培地＋ＡＴＰ（１００μＭ）、図６Ｂ；培地＋ＡＴＰ（１００μＭ）、図７；培地＋アデノシン６００μＭ＋抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体。 KaleidaGraph software was used for the analysis. A P-value <0.05 was considered statistically significant. Then, as compared with each control, a * mark was added to the group having a P value of 0.05 or less, and a ** mark was added to the group having a P value of 0.01 or less to the graphs in each figure. The controls in the experiments shown in each figure are as follows.
FIG. 1A; medium, FIG. 1B; medium, FIG. 1C; medium + adenosine 100 μM, FIG. 2A; medium + CD3 / 28, FIG. 2B; medium + CD3 / 28, FIG. 2C; medium + adenosine 600 μM + CD3 / 28, FIG. 3; medium + CD3 /. CD28 + adenosine (600 μM), FIG. 4A; medium + ATP (100 μM), FIG. 4B; medium + ATP (100 μM), FIG. 5; medium + CD3 / CD28 + adenosine (600 μM), FIG. 6A; medium + ATP (100 μM), FIG. 6B; medium + ATP. (100 μM), FIG. 7; medium + 600 μM adenosine + anti-CD3 / CD28 antibody.
　（実施例１）　２ウェイＭＬＲにおけるアデノシンおよびイストラデフィリンの効果１
　Ｈ－２の異なるＢＡＬＢ／ｃとＳＪＬ／Ｊマウスの脾細胞から単核球を分離した。具体的には、８－１０週齢のメスのＨ－２の異なるＢＡＬＢ／ｃとＳＪＬ／Ｊマウスから脾臓を取り出し、その脾臓をホモジナイザー（ＧＰＥ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔｅｎｂｒｏｅｃｋ　Ｓｔｙｌｅ　Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ，Ｐｅｓｔｌｅ　ｄｉａｍｅｔｅｒ　１５ｍｍ）に加えて、５ｍＬのＤＭＥＭを加えた後、５回転させてホモジナイズして、さらに５ｍＬのＤＭＥＭを加えて、総量１０ｍＬの脾臓細胞を５０ｍＬチューブに移した。７ｍＬのＦｉｃｏｌｌ（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ｐｒｅｍｉｕｍ　１．０８４，ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を脾臓細胞溶液の入った５０ｍＬチューブの下端にピペットエイドを用いて、脾臓細胞溶液とＦｉｃｏｌｌの界面を乱さない様に静かに加え、室温で３０分１，５００ｒ．ｐ．ｍ．（４３０ｘｇ）で遠心した。遠心後、５０ｍＬチューブの下端から１ｃｍ離れた上部から、５０ｍＬチューブの中央付近のＦｉｃｏｌとＤＭＥＭの境界付近に白いバンドとして出現するＰｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣｓ）の層までをパスツールピペット回収し、その回収画分を新しい５０ｍＬチューブに移した。この回収画分に、合計４０ｍＬになるようにＤＭＥＭを加えて懸濁し、再び、室温で１０分１，５００ｒ．ｐ．ｍ．（４３０ｘｇ）で遠心した。遠心後、下端から２ｃｍを残して上清をアスピレーターで吸引し、懸濁して１５ｍＬチューブに移した。合計１２ｍＬになるようにＤＭＥＭを加え、室温で１０分１，５００ｒ．ｐ．ｍ．（４３０ｘｇ）で遠心した。遠心後、細胞ペレットを２ｍＬのＤ１０培地（ＤＭＥＭに、最終濃度が各々１０％のＦＣＳ、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μＭの２－メルカプトエタノールを加えた培地）で懸濁し、チュルク溶液に調製した細胞の一部を加えて、ビュルケルチュルク血球計算版を用いて単核球の細胞数を算出した。算出した後、調製した単核球にＤ１０培地を加えて、各３×１０６細胞／ｍｌに調整した。そして、ＭＬＲ反応を誘導するために、調製したＢＡＬＢ／ｃ由来の単核球、および、ＳＪＬ／Ｊ由来の単核球を１ｍｌずつ１２ウェルプレートで混合した（全体：６×１０６細胞／２ｍｌ）。 (Example 1) Effect of adenosine and isstradefylline on 2-way MLR 1
Mononuclear cells were isolated from the splenocytes of BALB / c and SJL / J mice with different H-2. Specifically, spleens are removed from 8-10 week-old female H-2 different BALB / c and SJL / J mice, and the spleens are added to homogenizers (GPE Scientific, Tenbroeck Style Homogenizer, Pestle diameter 15 mm). After adding 5 mL of DMEM, the cells were homogenized by rotating 5 times, and further 5 mL of DMEM was added to transfer spleen cells having a total volume of 10 mL to a 50 mL tube. Using a pipette aid, gently add 7 mL of Ficoll (Ficoll-Paque premium 1.084, GE healthcare) to the lower end of a 50 mL tube containing the spleen cell solution without disturbing the interface between the spleen cell solution and Ficoll, and at room temperature. 30 minutes at 1,500 r. p. m. Centrifugal at (430 xg). After centrifugation, a Pasteur pipette was collected from the upper part 1 cm away from the lower end of the 50 mL tube to the layer of Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) appearing as a white band near the boundary between Ficoll and DMEM near the center of the 50 mL tube. The recovered fraction was transferred to a new 50 mL tube. DMEM was added to this recovered fraction to make a total of 40 mL, suspended, and again at room temperature for 10 minutes at 1,500 r. p. m. Centrifugal at (430 xg). After centrifugation, the supernatant was aspirated with an ejector, leaving 2 cm from the lower end, suspended and transferred to a 15 mL tube. DMEM was added to make a total of 12 mL, and at room temperature for 10 minutes 1,500 r. p. m. Centrifugal at (430 xg). After centrifugation, place the cell pellet in 2 mL of D10 medium (DMEM with FCS with a final concentration of 10% each, 0.1 mg / mL streptomycin, 100 U / mL penicillin, 1 mM sodium pyruvate, 50 μM 2-mercaptoethanol. Suspended in (added medium), a part of the prepared cells was added to the Turku solution, and the number of mononuclear cells was calculated using the Bürkerturk hemocytometer. After calculation, D10 medium was added to the prepared mononuclear cells to adjust to 3 × 106 cells / ml each. Then, in order to induce the MLR reaction, the prepared BALB / c-derived mononuclear cells and SJL / J-derived mononuclear cells were mixed 1 ml each in a 12-well plate (total: 6 × 10 6 cells / 2 ml). ).
　そして、最終濃度が１００～１０００μＭになるようにアデノシンを加えて共培養し、培養開始から７日後の培養上清を回収して、培養上清に含まれるＩＬ－１７ＦおよびＩＬ－２２の濃度を、ＥＬＩＳＡ法で定量した。なお、ＩＬ－１７ＦおよびＩＬ－２２を定量するためのＥＬＩＳＡ法は、Ｄｕｏ　Ｓｅｔ　ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、その添付のマニュアルに従って行なった。 Then, adenosine is added so that the final concentration becomes 100 to 1000 μM, and the cells are co-cultured. The culture supernatant 7 days after the start of the culture is collected, and the concentrations of IL-17F and IL-22 contained in the culture supernatant are adjusted. , Quantified by ELISA method. The ELISA method for quantifying IL-17F and IL-22 was performed using a Duo Set kit (manufactured by R & D Systems) according to the attached manual.
　その結果、２ウェイＭＬＲ反応において、アデノシンの濃度依存的に、活性化した単核球において、ＩＬ－１７ＦおよびＩＬ－２２の産生が誘導されることが示された（図１Ａ）。 As a result, it was shown that in the 2-way MLR reaction, the production of IL-17F and IL-22 was induced in the activated mononuclear cells in adenosine concentration-dependent manner (FIG. 1A).
　また、アデノシン単独に代えて、最終濃度が０．０１～１０μＭになるようにアデノシンＡ２Ａ受容体アゴニストであるＰＳＢ０７７７アンモニウム塩（ＴＯＣＲＩＳ）を加えて共培養し、７日後の培養上清中に含まれるＩＬ－１７ＦおよびＩＬ－２２の濃度をＥＬＩＳＡ法で定量した。 In addition, instead of adenosine alone, PSB0777 ammonium salt (TOCRIS), which is an adenosine A2A receptor agonist, was added and co-cultured so that the final concentration was 0.01 to 10 μM, and the cells were co-cultured and contained in the culture supernatant after 7 days. The concentrations of IL-17F and IL-22 were quantified by the ELISA method.
　その結果、アデノシン単独と同様、ＰＳＢ０７７７の濃度に依存して、ＩＬ－１７ＦおよびＩＬ－２２の産生が、活性化した単核球において誘導されることが示唆された（図１Ｂ）。 As a result, it was suggested that the production of IL-17F and IL-22 was induced in activated mononuclear cells depending on the concentration of PSB0777 as well as adenosine alone (Fig. 1B).
　また、アデノシン単独に代えて、アデノシン（最終濃度、１００μＭ）と共に、最終濃度が０．０１～１ｎＭになるようにアデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストであるイストラデフィリンを加えて共培養し、７日後の培養上清中に含まれるＩＬ－１７ＦおよびＩＬ－２２の濃度をＥＬＩＳＡ法で定量した。 In addition, instead of adenosine alone, adenosine (final concentration, 100 μM) and istradefylline, which is an adenosine A2A receptor antagonist, were added so that the final concentration was 0.01 to 1 nM, and co-cultured after 7 days. The concentrations of IL-17F and IL-22 contained in the supernatant were quantified by the ELISA method.
　その結果、２ウェイＭＬＲにおける、アデノシンによる、ＩＬ－１７ＦおよびＩＬ－２２の産生誘導は、濃度依存的にアデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストである、イストラデフィリンにより、抑制されることが示された（図１Ｃ）。 As a result, it was shown that the induction of IL-17F and IL-22 production by adenosine in the 2-way MLR was suppressed by the concentration-dependent adenosine A2A receptor antagonist, istradefylline (Fig.). 1C).
　（実施例２）　ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアデノシンおよびイストラデフィリンの効果１
　脾臓細胞を調製するために、８－１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を摘出し、５ｍＬのＤＭＥＭの入った６ｃｍディッシュに置いた。ピンセットを用いて脾臓を培地内で、良く揉みほぐし、培地に溶出されたリンパ球を含む溶液を１５ｍＬチューブに移した。もう一度６ｃｍディッシュを５ｍＬのＤＭＥＭで洗浄した。上清をその１５ｍＬチューブに加え、総量１０ｍＬとした。すぐに１５ｍＬチューブの底にたまる組織断片を残して、上清を再び新しい１５ｍＬチューブに移し、室温、１，２００ｒ．ｐ．ｍ．（２７０ｘｇ）で５分間遠心分離し、リンパ球を含むペレットを得た。上清を除いて、ペレットをほぐした。その後、赤血球を除くために、２５０μｌのＮＨ４Ｃｌ－トリス溶液を加えかき混ぜた。その後、すばやく１０ｍＬのＤＭＥＭを加え、室温、１，２００ｒ．ｐ．ｍ．（２７０ｘｇ）で５分間遠心分離し、リンパ球を含むペレットを得た。上清を除いて、ペレットをほぐした後、再び１０ｍＬのＤＭＥＭを加えた。変性した赤血球を極力吸わないようにしてピペットでリンパ球を含む培地を新しい１５ｍＬチューブに移して、再び室温、１，２００ｒ．ｐ．ｍ．（２７０ｘｇ）で５分間遠心分離した。上清を除いた後、ペレットをほぐした。もう一度１０ｍＬのＤＭＥＭで懸濁し、室温、１，２００ｒ．ｐ．ｍ．（２７０ｘｇ）で５分間遠心分離した。上清を除いて、最後に２ｍＬのＤ１０培地（ＤＭＥＭに、最終濃度が各々１０％のＦＣＳ、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μＭの２－メルカプトエタノールを加えた培地）で懸濁した。その後、マニュアルに従って磁気ビーズ（ｍｏｕｓｅ　ＣＤ４　（Ｌ３Ｔ４）　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０４９－２０１））を用いたポジティブセレクションで、ＣＤ４＋Ｔ細胞を調製した。 (Example 2) Effect of adenosine and isstradefylline on CD4 + T cells 1
To prepare spleen cells, spleens were removed from 8-10 week old BALB / c mice and placed in a 6 cm dish containing 5 mL DMEM. The spleen was thoroughly kneaded in the medium using tweezers, and the solution containing the lymphocytes eluted in the medium was transferred to a 15 mL tube. The 6 cm dish was washed again with 5 mL DMEM. The supernatant was added to the 15 mL tube to give a total volume of 10 mL. Immediately transfer the supernatant to a new 15 mL tube again, leaving tissue fragments that collect at the bottom of the 15 mL tube, at room temperature 1,200 r. p. m. Centrifugation at (270 xg) for 5 minutes gave pellets containing lymphocytes. The supernatant was removed and the pellet was loosened. Then, 250 μl of NH4 Cl - Tris solution was added and stirred to remove erythrocytes. Then, 10 mL of DMEM was quickly added to room temperature at 1,200 r. p. m. Centrifugation at (270 xg) for 5 minutes gave pellets containing lymphocytes. After removing the supernatant and loosening the pellets, 10 mL of DMEM was added again. Transfer the medium containing lymphocytes to a new 15 mL tube with a pipette so as not to inhale the denatured red blood cells as much as possible. p. m. Centrifugation was carried out at (270 xg) for 5 minutes. After removing the supernatant, the pellet was loosened. Suspend again in 10 mL DMEM, room temperature, 1,200 r. p. m. Centrifugation was carried out at (270 xg) for 5 minutes. Finally, excluding the supernatant, 2 mL of D10 medium (in DMEM, FCS with a final concentration of 10%, 0.1 mg / mL streptomycin, 100 U / mL penicillin, 1 mM sodium pyruvate, 50 μM 2-mercapto Suspended in medium with ethanol added). Then, according to the manual, CD4 + T cells were prepared by positive selection using magnetic beads (mouse CD4 (L3T4) MicroBeads (Miltenyi Biotec, 130-049-201)).
　調製したマウスＣＤ４＋Ｔ細胞に、最終濃度が１００～１０００μＭになるようにアデノシンを加え、最終濃度が１μｇ／ｍＬの抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３εアゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ：１４５－２Ｃ１１）、および、最終濃度が０．５μｇ／ｍＬの抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ２８アゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ：３７．５１）を加えて、１×１０６細胞／５００μＬで２４穴プレートに播種して培養し、培養開始から７日後の細胞上清を回収した。回収した細胞上清に含まれるＩＬ－１７ＦおよびＩＬ－２２の濃度を、ＥＬＩＳＡ法で定量した。 Adenosine was added to the prepared mouse CD4 + T cells so that the final concentration was 100 to 1000 μM, and the anti-mouse CD3ε agonist antibody (BioLegend, Clone: 145-2C11) having a final concentration of 1 μg / mL and the final concentration were 0.5 μg / mL anti-mouse CD28 agonist antibody (BioLegend, Clone: 37.51) was added, seeded and cultured on a 24-well plate at 1 × 10 6 cells / 500 μL, and cultured on cells 7 days after the start of culture. Qing was recovered. The concentrations of IL-17F and IL-22 contained in the collected cell supernatant were quantified by the ELISA method.
　その結果、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞において、アデノシンの濃度依存的に、ＩＬ－１７ＦおよびＩＬ－２２の産生が誘導されることが示唆された（図２Ａ）。 As a result, it was suggested that the production of IL-17F and IL-22 was induced in CD4 + T cells activated by CD3 / CD28 stimulation in adenosine concentration-dependent manner (FIG. 2A).
　また、上記のアデノシン単独に代えて、調製したマウスＣＤ４＋Ｔ細胞に、最終濃度が０．０１～１０μＭになるようにアデノシンＡ２Ａ受容体アゴニストであるＰＳＢ０７７７アンモニウム塩を加え、最終濃度が１μｇ／ｍＬの抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３εアゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ：１４５－２Ｃ１１）、および、最終濃度が０．５μｇ／ｍＬの抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ２８アゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ：３７．５１）を加えて、１×１０６細胞／５００μＬで２４穴プレートに播種して培養し、培養開始から７日後の細胞上清を回収した。回収した細胞上清に含まれるＩＬ－１７ＦおよびＩＬ－２２の濃度を、ＥＬＩＳＡ法で定量した。 In addition, instead of the above adenosine alone, PSB0777 ammonium salt, which is an adenosine A2A receptor agonist, was added to the prepared mouse CD4 + T cells so that the final concentration was 0.01 to 10 μM, and the final concentration was 1 μg / mL. Anti-mouse CD3ε agonist antibody (BioLegend, Clone: 145-2C11) and anti-mouse CD28 agonist antibody (BioLegend, Clone: 37.51) with a final concentration of 0.5 μg / mL were added to 1 × 10 6 cells. The cells were seeded on a 24-well plate at / 500 μL and cultured, and the cell supernatant was collected 7 days after the start of the culture. The concentrations of IL-17F and IL-22 contained in the collected cell supernatant were quantified by the ELISA method.
　その結果、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞において、ＰＳＢ０７７７の濃度依存的に、ＩＬ－１７ＦおよびＩＬ－２２の産生が誘導されることが示唆された（図２Ｂ）。 As a result, it was suggested that the production of IL-17F and IL-22 was induced in the CD4 + T cells activated by the stimulation of CD3 / CD28 in a concentration-dependent manner of PSB0777 (Fig. 2B).
　さらに、調製したマウスＣＤ４＋Ｔ細胞に、アデノシン単独に代えて、アデノシン（最終濃度、６００μＭ）と共に、最終濃度が０．０１～１ｎＭになるようにアデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストであるイストラデフィリンを加え、最終濃度が１μｇ／ｍＬの抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３εアゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ：１４５－２Ｃ１１）、および、最終濃度が０．５μｇ／ｍＬの抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ２８アゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ：３７．５１）を加えて、１×１０６細胞／５００μＬで２４穴プレートに播種して培養し、培養開始から７日後の細胞上清を回収した。回収した細胞上清に含まれるＩＬ－１７ＦおよびＩＬ－２２の濃度を、ＥＬＩＳＡ法で定量した。 Furthermore, instead of adenosine alone, adenosine A2A receptor antagonist istradefylline was added to the prepared mouse CD4 + T cells together with adenosine (final concentration, 600 μM) so that the final concentration was 0.01 to 1 nM. Add an anti-mouse CD3ε agonist antibody (BioLegend, Clone: 145-2C11) with a final concentration of 1 μg / mL and an anti-mouse CD28 agonist antibody (BioLegend, Clone: 37.51) with a final concentration of 0.5 μg / mL. The cells were seeded on a 24-well plate at 1 × 10 6 cells / 500 μL and cultured, and the cell supernatant 7 days after the start of the culture was collected. The concentrations of IL-17F and IL-22 contained in the collected cell supernatant were quantified by the ELISA method.
　その結果、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞において、アデノシンによって、ＩＬ－１７ＦおよびＩＬ－２２の産生が誘導されるが、その誘導は、アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストであるイストラデフィリンによって濃度依存的に抑制されることが示された（図２Ｃ）。 As a result, in CD4 + T cells activated by CD3 / CD28 stimulation, adenosine induces the production of IL-17F and IL-22, which is induced by the adenosine A2A receptor antagonist Istradefylline. It was shown to be suppressed by phosphorus in a concentration-dependent manner (Fig. 2C).
　（実施例３）　ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアデノシンおよびイストラデフィリンの効果２
　実施例２に記載の方法と同様にして、ＣＤ４＋Ｔ細胞を調製した。調製したマウスＣＤ４＋Ｔ細胞に、最終濃度が６００μＭになるようにアデノシンを加え、最終濃度が１μｇ／ｍＬの抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３εアゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ：１４５－２Ｃ１１）、および、最終濃度が０．５μｇ／ｍＬの抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ２８アゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ：３７．５１）を加えて、１×１０６細胞／５００μＬで２４穴プレートに播種して培養し、培養開始から７日後の細胞上清を回収した。回収した細胞上清に含まれるＩＬ－３１の濃度を、ＥＬＩＳＡ法で定量した。なお、ＩＬ－３１定量のためのＥＬＩＳＡ法は、ＩＬ－３１　Ｍｏｕｓｅ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、その添付のマニュアルに従って行なった。 (Example 3) Effect of adenosine and isstradefylline on CD4 + T cells 2
CD4 + T cells were prepared in the same manner as described in Example 2. Adenosine was added to the prepared mouse CD4 + T cells so that the final concentration was 600 μM, and the anti-mouse CD3ε agonist antibody (BioLegend, Clone: 145-2C11) having a final concentration of 1 μg / mL and the final concentration of 0. 5 μg / mL of anti-mouse CD28 agonist antibody (BioLegend, Clone: 37.51) was added, and the cells were seeded and cultured on a 24-well plate at 1 × 10 6 cells / 500 μL, and the cell supernatant 7 days after the start of culture was obtained. Recovered. The concentration of IL-31 contained in the collected cell supernatant was quantified by the ELISA method. The ELISA method for IL-31 quantification was performed using IL-31 Mouse ELISA Kit (manufactured by Invitrogen) according to the attached manual.
　その結果、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞において、アデノシンにより、ＩＬ－３１産生が誘導されることが示唆された（図３の「培地」参照）。 As a result, it was suggested that adenosine induces IL-31 production in CD4 + T cells activated by CD3 / CD28 stimulation (see "medium" in FIG. 3).
　また、調製したマウスＣＤ４＋Ｔ細胞に、アデノシン単独に代えて、アデノシン（最終濃度、６００μＭ）と共に、最終濃度が０．０１～１ｎＭになるようにアデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストであるイストラデフィリンを加え、最終濃度が１μｇ／ｍＬの抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３εアゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ：１４５－２Ｃ１１）、および、最終濃度が０．５μｇ／ｍＬの抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ２８アゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ：３７．５１）を加えて、１×１０６細胞／５００μＬで２４穴プレートに播種して培養し、培養開始から７日後の細胞上清を回収した。回収した細胞上清に含まれるＩＬ－３１の濃度を、ＥＬＩＳＡ法で定量した。 In addition, instead of adenosine alone, adenosine A2A receptor antagonist istradefylline was added to the prepared mouse CD4 + T cells together with adenosine (final concentration, 600 μM) so that the final concentration was 0.01 to 1 nM. Add an anti-mouse CD3ε agonist antibody (BioLegend, Clone: 145-2C11) with a final concentration of 1 μg / mL and an anti-mouse CD28 agonist antibody (BioLegend, Clone: 37.51) with a final concentration of 0.5 μg / mL. The cells were seeded on a 24-well plate at 1 × 10 6 cells / 500 μL and cultured, and the cell supernatant 7 days after the start of the culture was collected. The concentration of IL-31 contained in the collected cell supernatant was quantified by the ELISA method.
　その結果、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞において、アデノシンの添加によって生じるＩＬ－３１産生誘導は、アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストであるイストラデフィリンによって濃度依存的に抑制されることが示された（図３）。 As a result, in CD4 + T cells activated by CD3 / CD28 stimulation, the induction of IL-31 production caused by the addition of adenosine is suppressed in a concentration-dependent manner by the adenosine A2A receptor antagonist istradefylline. Was shown (Fig. 3).
　（実施例４）　２ウェイＭＬＲにおける、ＣＤ３９阻害剤および／またはＣＤ７３阻害剤の効果１
　実施例１に記載の方法と同様にして、Ｈ－２の異なるＢＡＬＢ／ｃとＳＪＬ／Ｊマウスの脾細胞から単核球を分離し、各３×１０６細胞／ｍｌに調整した。それぞれの細胞を１ｍｌずつ１２ウェルプレートで混合した（全体：６×１０６細胞／２ｍｌ）。 (Example 4) Effect of CD39 inhibitor and / or CD73 inhibitor on 2-way MLR 1
Mononuclear cells were isolated from the spleen cells of BALB / c and SJL / J mice with different H-2 in the same manner as in Example 1 and adjusted to 3 × 106 cells / ml each. Each cell was mixed 1 ml each in a 12-well plate (overall: 6 x 106 cells / 2 ml).
　そして、ＡＴＰを最終濃度が１００μＭになるよう加えた後、ＣＤ３９阻害剤（ＡＲＬ６７１５６　三ナトリウム塩（ＴＯＣＲＩＳ））、または、ＣＤ７３阻害剤（アデノシン５’－（α，β－メチレン）二リン酸（ＡＭＰ－ＣＰ）ナトリウム塩（ＴＯＣＲＩＳ））を、最終濃度が１μＭになるように加え、共培養した。培養開始から７日後に培養上清を回収し、培養上清に含まれるＩＬ－３１の濃度を、ＥＬＩＳＡ法にて定量した。 Then, after adding ATP to a final concentration of 100 μM, a CD39 inhibitor (ARL67156 trisodium salt (TOCRIS)) or a CD73 inhibitor (adenosine 5'-(α, β-methylene) diphosphate (AMP). -CP) sodium salt (TOCRIS)) was added to a final concentration of 1 μM and co-cultured. The culture supernatant was collected 7 days after the start of the culture, and the concentration of IL-31 contained in the culture supernatant was quantified by the ELISA method.
　その結果、図４Ａおよび４Ｂに示すとおり、ＡＴＰを単核球に添加することによって、ＩＬ－３１の産生が誘導されることが明らかになった（図４Ａおよび４Ｂの「培地」）。 As a result, as shown in FIGS. 4A and 4B, it was clarified that the production of IL-31 was induced by adding ATP to mononuclear cells (“medium” in FIGS. 4A and 4B).
　さらに、ＡＴＰによって誘導されたＩＬ－３１の産生は、ＡＲＬ６７１５６またはＡＭＰ－ＣＰを添加することによって、抑制されることも明らかになった（図４Ａおよび４Ｂ）。 Furthermore, it was also revealed that ATP-induced IL-31 production was suppressed by the addition of ARL67156 or AMP-CP (FIGS. 4A and 4B).
　（実施例５）　ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアデノシンおよびイストラデフィリンの効果３
　実施例２に記載の方法と同様にして、ＣＤ４＋Ｔ細胞を調製した。調製したマウスＣＤ４＋Ｔ細胞に、最終濃度が６００μＭになるようにアデノシンを加え、最終濃度が１μｇ／ｍＬの抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３εアゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ：１４５－２Ｃ１１）、および、最終濃度が０．５μｇ／ｍＬの抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ２８アゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ：３７．５１）を加えて、１×１０６細胞／５００μＬで２４穴プレートに播種して培養し、培養開始から７日後の細胞上清を回収した。回収した細胞上清に含まれるＩＬ－３１の濃度を、ＥＬＩＳＡ法で定量した。 (Example 5) Effect of adenosine and isstradefylline on CD4 + T cells 3
CD4 + T cells were prepared in the same manner as described in Example 2. Adenosine was added to the prepared mouse CD4 + T cells so that the final concentration was 600 μM, and the anti-mouse CD3ε agonist antibody (BioLegend, Clone: 145-2C11) having a final concentration of 1 μg / mL and the final concentration of 0. 5 μg / mL of anti-mouse CD28 agonist antibody (BioLegend, Clone: 37.51) was added, and the cells were seeded and cultured on a 24-well plate at 1 × 10 6 cells / 500 μL, and the cell supernatant 7 days after the start of culture was obtained. Recovered. The concentration of IL-31 contained in the collected cell supernatant was quantified by the ELISA method.
　その結果、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞において、アデノシンにより、ＩＦＮ－ｋａｐｐａ産生が誘導されることが示唆された（図５の「培地」参照）。 As a result, it was suggested that adenosine induces IFN-kappa production in CD4 + T cells activated by CD3 / CD28 stimulation (see "medium" in FIG. 5).
　また、調製したマウスＣＤ４＋Ｔ細胞に、アデノシン単独に代えて、アデノシン（最終濃度、６００μＭ）と共に、最終濃度が１μＭになるようにアデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストであるイストラデフィリンを加え、最終濃度が１μｇ／ｍＬの抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ３εアゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ：１４５－２Ｃ１１）、および、最終濃度が０．５μｇ／ｍＬの抗ｍｏｕｓｅ　ＣＤ２８アゴニスト抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃｌｏｎｅ：３７．５１）を加えて、１×１０６細胞／５００μＬで２４穴プレートに播種して培養し、培養開始から７日後の細胞上清を回収した。回収した細胞上清に含まれるＩＦＮ－ｋａｐｐａの濃度を、ＥＬＩＳＡ法で定量した。なお、ＩＦＮ－ｋａｐｐａ定量のためのＥＬＩＳＡ法は、Ｍｏｕｓｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｋａｐｐａ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製）を用い、その添付のマニュアルに従って行なった。 In addition, instead of adenosine alone, adenosine (final concentration, 600 μM) and adenosine A2A receptor antagonist istradefylline were added to the prepared mouse CD4 + T cells so that the final concentration was 1 μM, and the final concentration was increased. Add 1 μg / mL anti-mouse CD3ε agonist antibody (BioLegend, Clone: 145-2C11) and anti-mouse CD28 agonist antibody (BioLegend, Clone: 37.51) with a final concentration of 0.5 μg / mL, 1 × The cells were seeded on a 24-well plate at 106 cells / 500 μL and cultured, and the cell supernatant was collected 7 days after the start of the culture. The concentration of IFN-kappa contained in the collected cell supernatant was quantified by the ELISA method. The ELISA method for IFN-kappa quantification was performed using Mouse interferon kappa ELISA Kit (manufactured by MyBioSource) according to the attached manual.
　その結果、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞において、アデノシンの添加によって生じるＩＦＮ－ｋａｐｐａ産生誘導は、アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストであるイストラデフィリンによって抑制されることが示された（図５）。 The results showed that in CD4 + T cells activated by CD3 / CD28 stimulation, the induction of IFN-kappa production caused by the addition of adenosine was suppressed by the adenosine A2A receptor antagonist istradefylline. (Fig. 5).
　（実施例６）　２ウェイＭＬＲにおける、ＣＤ３９阻害剤および／またはＣＤ７３阻害剤の効果２
　実施例１に記載の方法と同様にして、Ｈ－２の異なるＢＡＬＢ／ｃとＳＪＬ／Ｊマウスの脾細胞から単核球を分離し、各３×１０６細胞／ｍｌに調整した。それぞれの細胞を１ｍｌずつ１２ウェルプレートで混合した（全体：６×１０６細胞／２ｍｌ）。 (Example 6) Effect of CD39 inhibitor and / or CD73 inhibitor on 2-way MLR 2
Mononuclear cells were isolated from the spleen cells of BALB / c and SJL / J mice with different H-2 in the same manner as in Example 1 and adjusted to 3 × 106 cells / ml each. Each cell was mixed 1 ml each in a 12-well plate (overall: 6 x 106 cells / 2 ml).
　そして、ＡＴＰを最終濃度が１００μＭになるよう加えた後、ＣＤ３９阻害剤（ＡＲＬ６７１５６　三ナトリウム塩（ＴＯＣＲＩＳ））、または、ＣＤ７３阻害剤（アデノシン５’－（α，β－メチレン）二リン酸（ＡＭＰ－ＣＰ）ナトリウム塩（ＴＯＣＲＩＳ））を、最終濃度が１μＭになるように加え、共培養した。培養開始から７日後に培養上清を回収し、培養上清に含まれるＩＦＮ－ｋａｐｐａの濃度を、ＥＬＩＳＡ法にて定量した。 Then, after adding ATP to a final concentration of 100 μM, a CD39 inhibitor (ARL67156 trisodium salt (TOCRIS)) or a CD73 inhibitor (adenosine 5'-(α, β-methylene) diphosphate (AMP). -CP) sodium salt (TOCRIS)) was added to a final concentration of 1 μM and co-cultured. The culture supernatant was collected 7 days after the start of the culture, and the concentration of IFN-kappa contained in the culture supernatant was quantified by the ELISA method.
　その結果、図６Ａおよび６Ｂに示すとおり、ＡＴＰを単核球に添加することによって、ＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生が誘導されることが明らかになった（図６Ａおよび６Ｂの「培地」）。 As a result, as shown in FIGS. 6A and 6B, it was clarified that the production of IFN-kappa was induced by adding ATP to mononuclear cells (“medium” in FIGS. 6A and 6B).
　さらに、ＡＴＰによって誘導されたＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生は、ＡＲＬ６７１５６またはＡＭＰ－ＣＰを添加することによって抑制されることも明らかになった（図６Ａおよび６Ｂ）。 Furthermore, it was also revealed that ATP-induced IFN-kappa production was suppressed by the addition of ARL67156 or AMP-CP (FIGS. 6A and 6B).
　（実施例７）　ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＭＲＳ１７５４の効果
　アデノシンＡ２Ａ受容体アンタゴニストであるイストラデフィリンの代わりに、アデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニストであるＭＲＳ１７５４を、最終濃度が０．０１～１０ｎＭになるように、アデノシン（最終濃度：６００μＭ）と共に、調製したマウスＣＤ４＋Ｔ細胞に加えた以外は、実施例３に記載の方法と同様にして。当該細胞の培養上清に含まれるＩＬ－３１の濃度をＥＬＩＳＡ法で定量した。 (Example 7) Effect of MRS1754 on CD4 + T cells Instead of istradefylline, which is an adenosine A2A receptor antagonist, MRS1754, which is an adenosine A2B receptor antagonist, is used so that the final concentration is 0.01 to 10 nM. The same procedure as described in Example 3 except that it was added to the prepared mouse CD4 + T cells together with adenosine (final concentration: 600 μM). The concentration of IL-31 contained in the culture supernatant of the cells was quantified by the ELISA method.
　その結果、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を受けて活性化したＣＤ４＋Ｔ細胞において、アデノシンの添加によって生じるＩＬ－３１産生誘導は、アデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニストによっても濃度依存的に抑制されることが示された（図７）。 As a result, it was shown that in CD4 + T cells activated by CD3 / CD28 stimulation, the induction of IL-31 production caused by the addition of adenosine was also suppressed in a concentration-dependent manner by an adenosine A2B receptor antagonist. (Fig. 7).
　（実施例８）　アトピー性皮膚炎モデルマウスにおけるＭＲＳ１７５４の効果
　ＮＣ／Ｎｇａマウスの背部をバリカンで剃毛し、２％　２，４，６－トリニトロクロロベンゼン（ＴＮＣＢ）（エタノールとアセトンを４：１に混合した液体にＴＮＣＢを溶解したもの）を１５０μＬ滴下することにより、アトピー性皮膚炎モデルマウスを調製した。ＭＲＳ１７５４を５％の濃度になるようにワセリンに混合してクリームを調製し、各クリームを背部に塗布し、その病態変化を観察した。そして、観察された病態をスコア化し（病態の項目およびスコアは、表１の欄外に示す）、ＭＲＳ１７５４による効果を評価した。 (Example 8) Effect of MRS1754 on atopic dermatitis model mice The back of NC / Nga mice was shaved with hair clippers, and 2% 2,4,6-trinitrochlorobenzene (TNCB) (ethanol and acetone 4: 1). Atopic dermatitis model mice were prepared by dropping 150 μL of TNCB dissolved in a liquid mixed with the above. A cream was prepared by mixing MRS1754 with petrolatum to a concentration of 5%, each cream was applied to the back, and the change in the pathological condition was observed. Then, the observed pathological conditions were scored (the pathological condition items and scores are shown in the margin of Table 1), and the effect of MRS1754 was evaluated.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
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　その結果、開始から７日目において、誘導（＋）群と比較して薬剤効果群（クリーム塗布群）で有意な病態抑制が観察された（図８Ａ）。また、表１および図８Ｂに示すとおり、皮膚炎スコアにおいても、薬剤効果群は、誘導（＋）群に対し、統計学上有意な抑制効果を示した。 As a result, on the 7th day from the start, a significant suppression of the pathological condition was observed in the drug effect group (cream application group) as compared with the induction (+) group (FIG. 8A). In addition, as shown in Table 1 and FIG. 8B, the drug effect group also showed a statistically significant inhibitory effect on the induction (+) group in the dermatitis score.
　なお、アトピー性皮膚炎において、ＩＬ－２２は、Ｔｈ２２細胞等から大量に産生され、その病態形成に関与していると考えられている（非特許文献１、２）。さらに、アトピー性皮膚炎では、Ｔｈ２細胞から産生されるＩＬ－３１が、強力なかゆみを誘発するサイトカインであると考えられている（非特許文献３）。 In atopic dermatitis, IL-22 is produced in large quantities from Th22 cells and the like, and is considered to be involved in the formation of its pathological condition (Non-Patent Documents 1 and 2). Furthermore, in atopic dermatitis, IL-31 produced from Th2 cells is considered to be a cytokine that induces strong itch (Non-Patent Document 3).
　上述の培養系にて示したとおり、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制することによって、これらサイトカインの産生誘導を抑制することが可能となる。 As shown in the culture system described above, by suppressing the activation of the adenosine A2A receptor and / or the adenosine A2B receptor, it is possible to suppress the induction of production of these cytokines.
　よって、アトピー性皮膚炎において、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体に対するアンタゴニストは、上記モデル動物において示した炎症等の抑制効果のみならず、強力なかゆみを鎮める効果も奏し得る。 Therefore, in atopic dermatitis, the antagonist to the adenosine A2A receptor and / or the adenosine A2B receptor can exert not only the effect of suppressing inflammation and the like shown in the above model animal, but also the effect of suppressing strong itching.
　以上説明したように、本発明は、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１またはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患の治療などに有用であり、主として、医療分野に貢献するものである。また、本発明は、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１またはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生の調節を行う基礎研究においても貢献するものである。 As described above, the present invention is useful for the treatment of diseases caused by abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, and mainly contributes to the medical field. The present invention also contributes to basic research for regulating the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa.

Claims (10)

  1. 　ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生の抑制、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患の治療、改善、もしくは予防のための組成物であって、アデノシンＡ２Ａ受容体および／またはアデノシンＡ２Ｂ受容体の活性化を抑制する物質を有効成分として含有する組成物。 A composition for treating, ameliorating, or preventing a disease caused by suppression of IL-22, IL-31 or IFN-kappa production, or abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. , A composition containing, as an active ingredient, a substance that suppresses the activation of the adenosine A2A receptor and / or the adenosine A2B receptor.
  2. 　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　（ａ）被検化合物をアデノシンＡ２Ａ受容体に接触させる工程、および
    　（ｂ）被検化合物とアデノシンＡ２Ａ受容体との結合を検出する工程、を含み、
    　被検化合物がアデノシンＡ２Ａ受容体と結合する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。     The test compound treats, improves, or prevents diseases caused by the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa, or the abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa. A method of assessing the probability of having activity,
    It comprises (a) contacting the test compound with the adenosine A2A receptor and (b) detecting the binding between the test compound and the adenosine A2A receptor.
    When the test compound binds to the adenosine A2A receptor, the activity suppresses the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or the disease caused by the abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. A method that is assessed as probable to have the activity of treating, ameliorating, or preventing.
  3. 　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　（ａ）被検化合物をアデノシンＡ２Ｂ受容体に接触させる工程、および
    　（ｂ）被検化合物とアデノシンＡ２Ｂ受容体との結合を検出する工程、を含み、
    　被検化合物がアデノシンＡ２Ｂ受容体と結合する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。     The test compound treats, improves, or prevents diseases caused by the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa, or the abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa. A method of assessing the probability of having activity,
    It comprises (a) contacting the test compound with the adenosine A2B receptor and (b) detecting the binding between the test compound and the adenosine A2B receptor.
    When the test compound binds to the adenosine A2B receptor, the activity suppresses the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or the disease caused by the abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa. A method that is evaluated as probable to have the activity of treating, ameliorating, or preventing.
  4. 　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　（ａ）被検化合物の存在下で、アデノシンＡ２Ａ受容体リガンドをアデノシンＡ２Ａ受容体に接触させる工程、および
    　（ｂ）アデノシンＡ２Ａ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ａ受容体との結合を検出する工程、を含み、
    　被検化合物がアデノシンＡ２Ａ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ａ受容体との結合を阻害する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。     The test compound treats, improves, or prevents diseases caused by the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa, or the abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa. A method of assessing the probability of having activity,
    (A) The step of contacting the adenosine A2A receptor ligand with the adenosine A2A receptor in the presence of the test compound, and (b) the step of detecting the binding between the adenosine A2A receptor ligand and the adenosine A2A receptor. ,
    When the test compound inhibits the binding of the adenosine A2A receptor ligand to the adenosine A2A receptor, the activity suppresses the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or IL-22, IL-31 or IFN. -A method that is evaluated to have the activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by abnormal production of kappa.
  5. 　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　（ａ）被検化合物の存在下で、アデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドをアデノシンＡ２Ｂ受容体に接触させる工程、および
    　（ｂ）アデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ｂ受容体との結合を検出する工程、を含み、
    　被検化合物がアデノシンＡ２Ｂ受容体リガンドとアデノシンＡ２Ｂ受容体との結合を阻害する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。     The test compound treats, improves, or prevents diseases caused by the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa, or the abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa. A method of assessing the probability of having activity,
    (A) The step of contacting the adenosine A2B receptor ligand with the adenosine A2B receptor in the presence of the test compound, and (b) the step of detecting the binding between the adenosine A2B receptor ligand and the adenosine A2B receptor. ,
    When the test compound inhibits the binding of the adenosine A2B receptor ligand to the adenosine A2B receptor, it has the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or IL-22, IL-31 or IFN. -A method that is evaluated to have the activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by abnormal production of kappa.
  6. 　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　（ａ）被検化合物をアデノシンＡ２Ａ受容体を発現する細胞に接触させる工程、および
    　（ｂ）アデノシンＡ２Ａ受容体の活性を検出する工程、を含み、
    　被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物がアデノシンＡ２Ａ受容体の活性を低下させる場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。     The test compound treats, improves, or prevents diseases caused by the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa, or the abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa. A method of assessing the probability of having activity,
    It comprises (a) contacting the test compound with cells expressing the adenosine A2A receptor and (b) detecting the activity of the adenosine A2A receptor.
    When the test compound reduces the activity of the adenosine A2A receptor as compared to the case where the test compound is not contacted, the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or IL-22, A method that is evaluated to have the activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by abnormal production of IL-31 or IFN-kappa.
  7. 　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　（ａ）被検化合物をアデノシンＡ２Ｂ受容体を発現する細胞に接触させる工程、および
    　（ｂ）アデノシンＡ２Ｂ受容体の活性を検出する工程、を含み、
    　被検化合物を接触させない場合と比較して、アデノシンＡ２Ｂ受容体の活性を低下させる場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。     The test compound treats, improves, or prevents diseases caused by the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa, or the abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa. A method of assessing the probability of having activity,
    It comprises (a) contacting the test compound with cells expressing the adenosine A2B receptor and (b) detecting the activity of the adenosine A2B receptor.
    When the activity of the adenosine A2B receptor is reduced as compared to the case where the test compound is not contacted, the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or IL-22, IL-31 or A method that is evaluated to have the activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by abnormal production of IFN-kappa.
  8. 　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　（ａ）被検化合物をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および
    　（ｂ）被検化合物とアデノシン産生酵素との結合を検出する工程、を含み、
    　被検化合物がアデノシン産生酵素と結合する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。     The test compound treats, improves, or prevents diseases caused by the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa, or the abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa. A method of assessing the probability of having activity,
    It comprises (a) a step of contacting the test compound with an adenosine-producing enzyme, and (b) a step of detecting the binding between the test compound and the adenosine-producing enzyme.
    Treatment and amelioration of diseases caused by IL-22, IL-31 or IFN-kappa production, or IL-22, IL-31 or IFN-kappa production abnormalities when the test compound binds to adenosine-producing enzymes. Alternatively, a method that is evaluated as having a probable activity to prevent it.
  9. 　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　（ａ）被検化合物の存在下で、アデノシン産生酵素の基質をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および
    　（ｂ）アデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合を検出する工程、を含み、
    　被検化合物がアデノシン産生酵素の基質とアデノシン産生酵素との結合を阻害する場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。     The test compound treats, improves, or prevents diseases caused by the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa, or the abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa. A method of assessing the probability of having activity,
    It comprises (a) contacting the substrate of the adenosine-producing enzyme with the adenosine-producing enzyme in the presence of the test compound, and (b) detecting the binding between the substrate of the adenosine-producing enzyme and the adenosine-producing enzyme.
    Abnormal production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or IL-22, IL-31 or IFN-kappa when the test compound inhibits the binding of the adenosine-producing enzyme substrate to the adenosine-producing enzyme. A method that is evaluated to have the activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by.
  10. 　被検化合物が、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生を抑制する活性、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性を評価する方法であって、
    　（ａ）被検化合物をアデノシン産生酵素に接触させる工程、および
    　（ｂ）アデノシン産生酵素の酵素活性を検出する工程、を含み、
    　被検化合物を接触させない場合と比較して、被検化合物がアデノシン産生酵素の酵素活性を低下させる場合、ＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生、またはＩＬ－２２、ＩＬ－３１もしくはＩＦＮ－ｋａｐｐａの産生異常に起因する疾患を治療、改善、もしくは予防する活性を有する蓋然性があると評価される方法。     The test compound treats, improves, or prevents diseases caused by the activity of suppressing the production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa, or the abnormal production of IL-22, IL-31, or IFN-kappa. A method of assessing the probability of having activity,
    It comprises (a) a step of contacting the test compound with an adenosine-producing enzyme, and (b) a step of detecting the enzyme activity of the adenosine-producing enzyme.
    When the test compound reduces the enzymatic activity of the adenosine-producing enzyme, the production of IL-22, IL-31 or IFN-kappa, or IL-22, IL-31 or A method that is evaluated to have an activity of treating, ameliorating, or preventing a disease caused by an abnormal production of IFN-kappa.
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