WO2022025043A1 - がんの治療薬又は診断薬 - Google Patents
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Abstract
本発明の課題は、がんに対して選択性が高く、毒性や副作用が少ない、がんの治療薬及び診断薬を提供することである。本発明によれば、光合成細菌を含む、がんの治療薬又は診断薬が提供される。
Description
本発明は、光合成細菌を用いたがんの治療薬又は診断薬に関する。
正常な血管内皮細胞とは異なり、がん組織や炎症部位の血管内皮細胞間には ２００ ｎｍ程度の広い隙間が開口しており、１０～１００ｎｍ程度にサイズが制御されたナノ粒子ががん組織に特異的に集積するＥＰＲ効果（Enhanced permeation and Retention Effect）が広く知られている。ＥＰＲ効果は、ナノ粒子を利用したドラッグデリバリーシステム関連の論文で数多く引用され、がん選択的化学療法の最も大きな支柱となっているが、ＥＰＲ効果に関する疑義、批判も数多く存在する。実際、固形がんに対しては、がん組織での血流の不均一性、がん中心部での高い組織圧といったがん阻害する環境要因がいくつもあり、ＥＰＲ効果そのものが有用ではないという致命的な欠陥が判明している（例えば、横山昌幸、Drug Delivery System, 33(2),p.89-97(2018)）。また、ＥＰＲ効果を利用した薬物担持体は、長い年月と多大な費用を掛けたにも関わらず、ヒト臨床試験では成功していない。
一方、腫瘍ターゲット性能を改善するためにがん細胞に特異的な抗体などを薬物担持体に搭載する戦略（例えば、小林久隆、Drug Delivery System, 29(4),p.274-284(2014)）がとられているが、抗体はがんを取り囲む間質バリアを透過することが難しく、十分な選択性と薬効が得られていない。また、がん患者間で異なるバイオマーカー（抗原）を発現しているため、各がん患者に適した抗体をOrder (Owner) madeで作製する必要性がある。しかし、抗体の作製そのものに多大な手間とコストが掛かっており、結果として生じる莫大な医療費が問題となっている。
近年、低酸素状態の腫傷内部で選択的に集積、生育及び増殖が可能な嫌気性微生物を利用したがん標的治療に注目が集まっている（Shibin Zhou et al. Nature Reviews Cancer, 18, p.727-743(2018)）。しかし、従来のがん細菌療法は、基本的には抗がん剤の運搬という、いわゆるドラッグデリバリーシステムの概念である。また、抗がん活性を発現するためには、遺伝子工学を用いた微生物の操作・改変が必要である。この結果、細菌が薬物耐性を獲得するといった予想不可能で、かつ制御不能な問題が生じる可能性がある。また、使用される細菌は、多くの場合、遺伝子改変によって弱毒化したサルモネラ菌や大腸菌であり、体内で再び強毒化するリスクを常に伴っている。
横山昌幸、Drug Delivery System,33(2),p.89-97(2018)
小林久隆、Drug Delivery System,29(4),p.274-284(2014)
Shibin Zhou et al. Nature Reviews Cancer, 18, p.727-743(2018)
ナノメディシンには、（１）不明瞭なメカニズムのＥＰＲ効果に依存しており、がんに対する選択性が低い、（２）強い副作用のある抗がん剤を利用すること、（３）合成に多大な手間とコストが掛かる、（４）腫傷内部は酸素が欠乏した状態のため酸素を利用する光線力学療法型のナノメディシンは効果が低い、という問題があった。
抗体療法には、（１）がん患者問で異なる発現量のバイオマーカーに対してオーダーメードで抗体を作る必要がある、（２）がん間質バリアを透過することができない（腫傷の表面のみに結合）ため、免疫細胞を利用しているものの、腫傷深部のがん細胞の排除は困難である、（３）作製に多大な手間とコストが掛かる、という問題があった。
従来の細菌療法には、（１）遺伝子改変によって弱毒化したサルモネラ菌、リステリア菌、大腸菌を利用するため、体内で再び強毒化（復帰変異）するリスクがあり、遺伝子改変により薬物耐性獲得の可能性がある、（２）受動的なドラッグデリバリーであり、煩雑な遺伝子設計が必要である、という問題がある。
本発明は、がんに対して選択性が高く、毒性や副作用が少ない、がんの治療薬及び診断薬を提供することを解決すべき課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、低酸素状態の腫瘍環境内で高選択的に集積・生育・増殖が可能であり、かつ生体透過性の高い近赤外光によって機能する光合成細菌を用いることによって、がんに対して選択性が高く、毒性や副作用が少ない、がんの治療薬及び診断薬を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の通りである。
＜１＞ 光合成細菌を含む、がんの治療薬又は診断薬。
＜２＞ 光合成細菌が、バクテリオクロロフィルを有する光合成細菌である、＜１＞に記載のがんの治療薬又は診断薬。
＜３＞ 光合成細菌が、紅色光合成細菌、又は緑色光合成細菌である、＜１＞又は＜２＞に記載のがんの治療薬又は診断薬。
＜４＞ 光合成細菌が、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）細菌、ブラストクロリス属（Blastochloris）細菌、アフィフェラ属（Afifella）細菌、ロドバクター属（Rhodobacter）細菌、パラロドスピリラム属（Pararhodospirillum）細菌、ロドミクロビウム属（Rhodomicrobium）細菌、ロドブラム属（Rhodovulum）細菌、又はマリクロマチウム属（Marichromatium）細菌である、＜１＞から＜３＞の何れか一項に記載のがんの治療薬又は診断薬。
＜５＞ 光照射と組み合わせて使用する、＜１＞から＜４＞の何れかに記載のがんの治療薬又は診断薬。
＜６＞ 光照射が近赤外光の照射である、請求項５に記載のがんの治療薬又は診断薬。
＜１＞ 光合成細菌を含む、がんの治療薬又は診断薬。
＜２＞ 光合成細菌が、バクテリオクロロフィルを有する光合成細菌である、＜１＞に記載のがんの治療薬又は診断薬。
＜３＞ 光合成細菌が、紅色光合成細菌、又は緑色光合成細菌である、＜１＞又は＜２＞に記載のがんの治療薬又は診断薬。
＜４＞ 光合成細菌が、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）細菌、ブラストクロリス属（Blastochloris）細菌、アフィフェラ属（Afifella）細菌、ロドバクター属（Rhodobacter）細菌、パラロドスピリラム属（Pararhodospirillum）細菌、ロドミクロビウム属（Rhodomicrobium）細菌、ロドブラム属（Rhodovulum）細菌、又はマリクロマチウム属（Marichromatium）細菌である、＜１＞から＜３＞の何れか一項に記載のがんの治療薬又は診断薬。
＜５＞ 光照射と組み合わせて使用する、＜１＞から＜４＞の何れかに記載のがんの治療薬又は診断薬。
＜６＞ 光照射が近赤外光の照射である、請求項５に記載のがんの治療薬又は診断薬。
本発明のがんの治療薬及び診断薬は、以下の利点を有する。
低酸素、免疫回避、化学走性に由来する明確な機構に従い、腫傷に対する高い選択性の発現が可能である。
副作用の強い抗がん剤は利用せず、使用する細菌は低毒性であるので、副作用や毒性が低い。
使用する細菌は無限に自己複製することが可能であり、製造費用は安い。
酸素を使う光線力学モードのみならず、酸素を必要としない温熱モードも発現可能であり、さらに、光を使用せずに細菌を投与するだけでがんを縮退させる効果がある。
細菌は固形がんに普遍的な微小環境に対して高選択的に集積、生育、増殖が可能である。
細菌は腫瘍深部に集積・生育・増殖が可能である。
遺伝子組み換えの必要がなく、腫傷に対する高選択性を発現できる。
低酸素、免疫回避、化学走性に由来する明確な機構に従い、腫傷に対する高い選択性の発現が可能である。
副作用の強い抗がん剤は利用せず、使用する細菌は低毒性であるので、副作用や毒性が低い。
使用する細菌は無限に自己複製することが可能であり、製造費用は安い。
酸素を使う光線力学モードのみならず、酸素を必要としない温熱モードも発現可能であり、さらに、光を使用せずに細菌を投与するだけでがんを縮退させる効果がある。
細菌は固形がんに普遍的な微小環境に対して高選択的に集積、生育、増殖が可能である。
細菌は腫瘍深部に集積・生育・増殖が可能である。
遺伝子組み換えの必要がなく、腫傷に対する高選択性を発現できる。
本発明は、光合成細菌を含む、がんの治療薬又は診断薬に関する。
本発明で使用する光合成細菌としては、バクテリオクロロフィルを有する光合成細菌が好ましい。バクテリオクロロフィルとしては、バクテリオクロロフィルa、バクテリオクロロフィルb、バクテリオクロロフィルc、バクテリオクロロフィルd、バクテリオクロロフィルf、又はバクテリオクロロフィルgなどが挙げられ、これらのうちの一以上を有する光合成細菌を使用することができる。一例としては、バクテリオクロロフィルａ又はバクテリオクロロフィルｂを有する光合成細菌を挙げることができる。より具体的には、紅色光合成細菌、又は緑色光合成細菌を使用することができる。図１は、近赤外光で駆動する紅色光合成細菌の概念図を示す。図２は、バクテリアクロロフィル（BChl a）の化学構造を示す。
本発明で使用する光合成細菌としては、バクテリオクロロフィルを有する光合成細菌が好ましい。バクテリオクロロフィルとしては、バクテリオクロロフィルa、バクテリオクロロフィルb、バクテリオクロロフィルc、バクテリオクロロフィルd、バクテリオクロロフィルf、又はバクテリオクロロフィルgなどが挙げられ、これらのうちの一以上を有する光合成細菌を使用することができる。一例としては、バクテリオクロロフィルａ又はバクテリオクロロフィルｂを有する光合成細菌を挙げることができる。より具体的には、紅色光合成細菌、又は緑色光合成細菌を使用することができる。図１は、近赤外光で駆動する紅色光合成細菌の概念図を示す。図２は、バクテリアクロロフィル（BChl a）の化学構造を示す。
光合成細菌としては、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）細菌、ブラストクロリス属（Blastochloris）細菌、アフィフェラ属（Afifella）細菌、ロドバクター属（Rhodobacter）細菌、ルブリビバックス属（Rubrivivax）細菌、パラロドスピリラム属（Pararhodospirillum）細菌、ロドシスタ属（Rhodocista）細菌、マリクロマチウム属（Marichromatium）細菌、ファエオクロマチウム属（Phaeochromatium）細菌、ロドフェラックス属（Rhodoferax）細菌、ロドミクロビウム属（Rhodomicrobium）細菌、サーモクロマチウム属（Thermochromatium）細菌、クロロバキュラム属（Chlorobaculum）属細菌、ロドブラム属（Rhodovulum）細菌などが挙げられる。
上記の中でも、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）細菌、ブラストクロリス属（Blastochloris）細菌、アフィフェラ属（Afifella）細菌、ロドバクター属（Rhodobacter）細菌、パラロドスピリラム属（Pararhodospirillum）細菌、ロドミクロビウム属（Rhodomicrobium）細菌、ロドブラム属（Rhodovulum）細菌、又はマリクロマチウム属（Marichromatium）細菌が好ましい。
上記の中でも、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）細菌、ブラストクロリス属（Blastochloris）細菌、アフィフェラ属（Afifella）細菌、ロドバクター属（Rhodobacter）細菌、パラロドスピリラム属（Pararhodospirillum）細菌、ロドミクロビウム属（Rhodomicrobium）細菌、ロドブラム属（Rhodovulum）細菌、又はマリクロマチウム属（Marichromatium）細菌が好ましい。
紅色光合成細菌の具体例としては、Rhodopseudomonas Palustris、Blastochloris viridis、Afifella marina、Blastochloris sulfoviridis、Rhodobacter blasticus、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroides、Rhodopseudomonas pseudopalustris、Rubrivivax gelatinosus、Pararhodospirillum oryzae、Pararhodospirillum sulfurexigens、Rhodocista centenaria、Marichromatium litoris、Phaeochromatium fluminis、Rubrivivax gelatinosus、Rhodoferax fermentans、Rhodomicrobium udaipurense、Rhodomicrobium vannielii、Rhodovulum sulfidophilumなどが挙げられる。
緑色光合成細菌の具体例としては、Thermochromatium tepidum、及びChlorobaculum tepidumなどが挙げられる。
上記の中でも、Rhodopseudomonas Palustris、Blastochloris viridis、Pararhodospirillum oryzae、Pararhodospirillum sulfurexigens、Rhodomicrobium udaipurense、Rhodomicrobium vannielii、Rhodovulum sulfidophilum、Afifella marina、Rhodobacter sphaeroides、Marichromatium litoris、Rhodobacter capsulatus、又はBlastochloris sulfoviridisが特に好ましい。
緑色光合成細菌の具体例としては、Thermochromatium tepidum、及びChlorobaculum tepidumなどが挙げられる。
上記の中でも、Rhodopseudomonas Palustris、Blastochloris viridis、Pararhodospirillum oryzae、Pararhodospirillum sulfurexigens、Rhodomicrobium udaipurense、Rhodomicrobium vannielii、Rhodovulum sulfidophilum、Afifella marina、Rhodobacter sphaeroides、Marichromatium litoris、Rhodobacter capsulatus、又はBlastochloris sulfoviridisが特に好ましい。
上記した光合成細菌は、DSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）又はATCC（American Type Culture Collection）などから購入することができる。国内ではIFOを引き継いだ製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（NBRC）あるいは理研バイオリソースセンターに光合成細菌株が保存されており分与を行っており、これらの機関から入手することができる。
DSMZ
https://www.dsmz.de/collection/catalogue/microorganisms
ATCC
https://www.atcc.org/Advanced%20Search.aspx
NBRC
https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/nbrc/index.html
理研BRC
https://jcm.brc.riken.jp/ja/
上記以外にも、場合によっては国内の大学の研究室から分与を受けることが可能な細菌もある。
DSMZ
https://www.dsmz.de/collection/catalogue/microorganisms
ATCC
https://www.atcc.org/Advanced%20Search.aspx
NBRC
https://www.nite.go.jp/nbrc/cultures/nbrc/index.html
理研BRC
https://jcm.brc.riken.jp/ja/
上記以外にも、場合によっては国内の大学の研究室から分与を受けることが可能な細菌もある。
本発明のがんの治療薬又は診断薬は、光照射と組み合わせて使用することができる。即ち、光合成細菌を対象に投与し、がんが存在する患部に光合成細菌を集積させた後に、患部に光を照射することができる。光合成細菌は、光照射を受けることにより、蛍光、熱又は一重項酸素（活性酸素種：ＲＯＳ）を発生し、これによりがん細胞を殺傷することができる（図１）。
光照射はレーザー照射により行うことができる。光照射は、好ましくは近赤外光レーザーの照射である。近赤外光は、約０．７～２．５μｍの波長を有する電磁波であり、赤色の可視光線に近い波長を有している。
近赤外光の波長は特に限定されないが、好ましくは７００ｎｍ～２０００ｎｍであり、７００ｎｍ～１４００ｎｍ、７５０ｎｍ～１２００ｎｍ、７５０ｎｍ～１０００ｎｍ、又は７５０ｎｍ～９００ｎｍでもよい。一例としては、８０８ｎｍである。
近赤外光の波長は特に限定されないが、好ましくは７００ｎｍ～２０００ｎｍであり、７００ｎｍ～１４００ｎｍ、７５０ｎｍ～１２００ｎｍ、７５０ｎｍ～１０００ｎｍ、又は７５０ｎｍ～９００ｎｍでもよい。一例としては、８０８ｎｍである。
近赤外光の出力は、使用する光の波長等によって適宜選択すればよいが、例えば、０．５Ｗ以上、好ましくは０．７Ｗ以上、より好ましくは１．０Ｗ以上にすることができる。上限は特に限定されないが、一般的には、２０Ｗ以下であり、好ましくは１０Ｗ以下である。
光照射の時間は本発明の効果が得られる限り特に限定されないが、一般的には１分から３０分、好ましくは１分から２０分である。
光照射は１回だけ行ってもよいし、２回以上の複数回行ってもよい。
光照射の時間は本発明の効果が得られる限り特に限定されないが、一般的には１分から３０分、好ましくは１分から２０分である。
光照射は１回だけ行ってもよいし、２回以上の複数回行ってもよい。
光合成細菌を診断薬として使用する場合には、光合成細菌を投与した対象において、近赤外蛍光像を観察すればよい。例えば、７４０～１２００ｎｍの励起波長を用いて、８１０～１５００ｎｍの蛍光波長を観測することができる。
本発明のがんの治療薬又は診断薬を投与する対象としては、ヒト、又は非ヒト哺乳動物（例えば、マウスなどの実験動物）である。対象としては、がんを患っている対象が好ましい。
がんの具体例としては、乳がん、肺がん、子宮体がん、卵巣がん、膵がん、副腎皮質のがん、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、軟部肉腫、腎芽腫、神経膠芽腫、前立腺がん、肝がん、骨がん、軟骨肉腫、腎がん、膀胱がん、胃がん、結腸がん、直腸がん、甲状腺がん、頭頚部がん、皮膚がん（黒色腫など）などが挙げられるが、特に限定されない。
対象への投与方法としては、注射（皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、腫瘍内注射、および静脈内注射など）による投与、または局所投与などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは静脈内注射による投与である。
注射剤は、薬学的に許容可能な担体（例えば、生理食塩水、適当な緩衝液など）を用いて常法により製造することができる。
光合成細菌の投与量は、対象の状態に応じて適宜設定することができるが、細菌数として、一般的には１×１０7ＣＦＵ／ｋｇ～１×１０13ＣＦＵ／ｋｇであり、好ましくは１×１０8ＣＦＵ／ｋｇ～１×１０12ＣＦＵ／ｋｇである。
上記した投与量を、１回もしくは複数回にわたる分割用量（２、３、または４回の用量など）または単一の製剤で投与することができる。
上記した投与量を、１回もしくは複数回にわたる分割用量（２、３、または４回の用量など）または単一の製剤で投与することができる。
本発明によればさらに、以下が提供される。
＜Ａ１＞ 光合成細菌を対象に投与することを含む、がんの治療方法。
＜Ａ２＞ 光合成細菌を投与した対象に光を照射することをさらに含む、＜Ａ１＞に記載のがんの治療方法。
＜Ａ３＞ 光合成細菌を対象に投与することを含む、がんの診断方法。
＜Ｂ１＞ がんの治療又は診断において使用するための、光合成細菌。
＜Ｂ２＞ 光照射と組み合わせて使用する、＜Ｂ１＞に記載の光合成細菌。
＜Ｃ１＞ がんの治療薬又は診断薬の製造のための、光合成細菌の使用。
＜Ａ１＞ 光合成細菌を対象に投与することを含む、がんの治療方法。
＜Ａ２＞ 光合成細菌を投与した対象に光を照射することをさらに含む、＜Ａ１＞に記載のがんの治療方法。
＜Ａ３＞ 光合成細菌を対象に投与することを含む、がんの診断方法。
＜Ｂ１＞ がんの治療又は診断において使用するための、光合成細菌。
＜Ｂ２＞ 光照射と組み合わせて使用する、＜Ｂ１＞に記載の光合成細菌。
＜Ｃ１＞ がんの治療薬又は診断薬の製造のための、光合成細菌の使用。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜細菌培養＞
本研究で使用した細菌は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＢＲＣ）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より取得した。
Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（ＮＢＲＣ１６６６１）、Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓ（ＮＢＲＣ １０２６５９）、Ｐａｒａｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｏｒｙｚａｅ（ＮＢＲＣ１０７５７３）、Ｐａｒａｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｌｆｕｒｅｘｉｇｅｎｓ（ＮＢＲＣ１０４４３３）、Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｕｄａｉｐｕｒｅｎｓｅ（ＮＢＲＣ１０９０５７）、Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｖａｎｎｉｅｌｉｉ（ＮＢＲＣ１０００５０）、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ３５８８６）、Ａｆｉｆｅｌｌａ ｍａｒｉｎａ（ＮＢＲＣ１００４３４）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（ＮＢＲＣ１２２０３）、Ｍａｒｉｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｌｉｔｏｒｉｓ（ＮＢＲＣ１０４９３９）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＮＢＲＣ１６４３５）、Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｓｕｌｆｏｖｉｒｉｄｉｓ（ＮＢＲＣ１０３８０５）は、５４３ ＡＴＣＣ ｍｅｄｉｕｍ中で タングステンランプを照射しながら２６－３０℃の温度で嫌気培養した。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ（ＮＢＲＣ １０００１５）は、３８５ＮＢＲＣ ｍｅｄｉｕｍ中で ３７℃の温度で嫌気培養した。
本研究で使用した細菌は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＢＲＣ）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より取得した。
Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（ＮＢＲＣ１６６６１）、Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓ（ＮＢＲＣ １０２６５９）、Ｐａｒａｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｏｒｙｚａｅ（ＮＢＲＣ１０７５７３）、Ｐａｒａｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｌｆｕｒｅｘｉｇｅｎｓ（ＮＢＲＣ１０４４３３）、Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｕｄａｉｐｕｒｅｎｓｅ（ＮＢＲＣ１０９０５７）、Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｖａｎｎｉｅｌｉｉ（ＮＢＲＣ１０００５０）、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ３５８８６）、Ａｆｉｆｅｌｌａ ｍａｒｉｎａ（ＮＢＲＣ１００４３４）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（ＮＢＲＣ１２２０３）、Ｍａｒｉｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｌｉｔｏｒｉｓ（ＮＢＲＣ１０４９３９）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＮＢＲＣ１６４３５）、Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｓｕｌｆｏｖｉｒｉｄｉｓ（ＮＢＲＣ１０３８０５）は、５４３ ＡＴＣＣ ｍｅｄｉｕｍ中で タングステンランプを照射しながら２６－３０℃の温度で嫌気培養した。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ（ＮＢＲＣ １０００１５）は、３８５ＮＢＲＣ ｍｅｄｉｕｍ中で ３７℃の温度で嫌気培養した。
細菌培養に利用した試薬は、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌより入手した。
＜細菌の光学特性解析＞
細菌分散液の吸光スペクトルは、室温でＵＶ-Ｖｉｓ-ＮＩＲ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｖ－７３０ ＢＩＯ；Ｊａｓｃｏ）を用いて測定した。細菌分散液の蛍光は、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｓ（ＦＰ－８６００ ＮＩＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ； Ｊａｓｃｏ ｏｒ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ－３； ＨＯＲＩＢＡ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ）を用いて測定した。
細菌分散液の吸光スペクトルは、室温でＵＶ-Ｖｉｓ-ＮＩＲ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｖ－７３０ ＢＩＯ；Ｊａｓｃｏ）を用いて測定した。細菌分散液の蛍光は、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｓ（ＦＰ－８６００ ＮＩＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ； Ｊａｓｃｏ ｏｒ Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ－３； ＨＯＲＩＢＡ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ）を用いて測定した。
各細菌（（ａ）Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ，、（ｂ）Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓ、（ｃ）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）のＵＶ－Ｖｉｓ－ＮＩＲ光吸収特性を図３に示す。また、各細菌のＵＶ－Ｖｉｓ－ＮＩＲ光吸収特性を図２４及び図２５に示す。細菌の濃度を固定して測定した結果である。
Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓの蛍光スペクトル（励起波長：８０５ｎｍ）を図４に示す。また、励起波長と蛍光波長を変更した際の各細菌の蛍光スペクトルを図２６及び図２７に示す。
Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓの蛍光スペクトル（励起波長：８０５ｎｍ）を図４に示す。また、励起波長と蛍光波長を変更した際の各細菌の蛍光スペクトルを図２６及び図２７に示す。
＜温度測定＞
レーザー照射した細菌分散液の温度変化は以下の方法で調査した。細菌を分散させたＰＢＳ緩衝液（１００μＬ）あるいは細菌を添加していないＰＢＳ緩衝液（１００μＬ）に８０８ｎｍの波長のファイバーカップル型の連続波レーザー（レーザースポット径， 約５ｍｍ；出力，１．２Ｗ，約６１．１ｍＷ ｍｍ-2； ＣｉｖｉｌＬａｓｅｒ）を照射した。レーザー照射時の溶液の温度変化は温度センサー（ＡＤ－５６０１Ａ；Ａ＆Ｄ）を用いて測定した。
近赤外レーザー照射時［波長：８０８ｎｍ、出力：１．２Ｗ（ｃａ．６１．１ｍＷ／ｍｍ2）、照射時間：５ｍｉｎ］の各細菌（（ａ）Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ，、（ｂ）Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓ、（ｃ）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）の分散液の温度変化を、図５に示す。
レーザー照射した細菌分散液の温度変化は以下の方法で調査した。細菌を分散させたＰＢＳ緩衝液（１００μＬ）あるいは細菌を添加していないＰＢＳ緩衝液（１００μＬ）に８０８ｎｍの波長のファイバーカップル型の連続波レーザー（レーザースポット径， 約５ｍｍ；出力，１．２Ｗ，約６１．１ｍＷ ｍｍ-2； ＣｉｖｉｌＬａｓｅｒ）を照射した。レーザー照射時の溶液の温度変化は温度センサー（ＡＤ－５６０１Ａ；Ａ＆Ｄ）を用いて測定した。
近赤外レーザー照射時［波長：８０８ｎｍ、出力：１．２Ｗ（ｃａ．６１．１ｍＷ／ｍｍ2）、照射時間：５ｍｉｎ］の各細菌（（ａ）Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ，、（ｂ）Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓ、（ｃ）Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）の分散液の温度変化を、図５に示す。
上記と同様に、近赤外レーザー照射時［波長：８０８ｎｍ、出力：１．２Ｗ（ｃａ．６１．１ｍＷ／ｍｍ2）、照射時間：２ｍｉｎ］の各細菌の分散液の温度変化を、図２８に示す。
＜活性酸素（ＲＯＳ）検出＞
ＲＯＳ分析は底辺が透明でメインボディが黒色の９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一重項酸素検出試薬ｓｉｎｇｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｏｒ ｇｒｅｅｎ（ＳＯＳＧ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを分散させたＰＢＳ緩衝液（１００μＬ，５×１０9ＣＦＵｍｌ-1）をＳＯＳＧを含むＰＢＳ緩衝液で希釈した。Ｒ．ＰａｌｕｓｔｒｉｓとＳＯＳＧの当該系中の終濃度は、それぞれ１．３×１０9ＣＦＵ ｍｌ-1、１μＭであった。次いで、サンプルに８０８ｎｍの波長の近赤外レーザーを出力１．２Ｗ（ｃａ．６１．１ｍＷｍｍ-2）、５分間照射した。Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを含まないＰＢＳ緩衝液をコントロールとして用いた。ＲＯＳ発生に伴う緑色蛍光はマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯ Ｍ Ｐｌｅｘ）（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ ｎｍ）を用いて測定した。
近赤外レーザー照射時［波長：８０８ｎｍ、出力：１．２Ｗｃａ．６１．１ｍＷ／ｍｍ2）、照射時間：５ｍｉｎ］のＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ分散液からの活性酸素種（ＲＯＳ）一重項酸素の発生挙動を図６に示す。
ＲＯＳ分析は底辺が透明でメインボディが黒色の９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一重項酸素検出試薬ｓｉｎｇｌｅｔ ｏｘｙｇｅｎ ｓｅｎｓｏｒ ｇｒｅｅｎ（ＳＯＳＧ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを分散させたＰＢＳ緩衝液（１００μＬ，５×１０9ＣＦＵｍｌ-1）をＳＯＳＧを含むＰＢＳ緩衝液で希釈した。Ｒ．ＰａｌｕｓｔｒｉｓとＳＯＳＧの当該系中の終濃度は、それぞれ１．３×１０9ＣＦＵ ｍｌ-1、１μＭであった。次いで、サンプルに８０８ｎｍの波長の近赤外レーザーを出力１．２Ｗ（ｃａ．６１．１ｍＷｍｍ-2）、５分間照射した。Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを含まないＰＢＳ緩衝液をコントロールとして用いた。ＲＯＳ発生に伴う緑色蛍光はマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯ Ｍ Ｐｌｅｘ）（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ ｎｍ）を用いて測定した。
近赤外レーザー照射時［波長：８０８ｎｍ、出力：１．２Ｗｃａ．６１．１ｍＷ／ｍｍ2）、照射時間：５ｍｉｎ］のＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ分散液からの活性酸素種（ＲＯＳ）一重項酸素の発生挙動を図６に示す。
＜細胞培養と細胞毒性評価＞
マウス結腸がん細胞（Ｃｏｌｏｎ２６）ならびにヒト正常二倍体線維芽細胞（ＭＲＣ５）は、ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋより入手した。ヒト肺胞基底上皮腺がん細胞（Ａ５４９）、ヒト結腸腺がん（ＨＴ２９）は、ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌより購入した。マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）は、Ｒｉｋｅｎ Ｂｉｏ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより得た。Ｃｏｌｏｎ２６の培養は、１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、２－ｍＭ ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１－ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００ ＩＵ ｍｌ-1）を含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）を使用した。他の細胞は、１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、２－ｍＭ ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１－ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００ ＩＵ ｍｌ-1）、Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。細胞は３７℃、５％のＣＯ2雰囲気下の加湿チャンバー中で培養した。
マウス結腸がん細胞（Ｃｏｌｏｎ２６）ならびにヒト正常二倍体線維芽細胞（ＭＲＣ５）は、ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋより入手した。ヒト肺胞基底上皮腺がん細胞（Ａ５４９）、ヒト結腸腺がん（ＨＴ２９）は、ＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌより購入した。マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）は、Ｒｉｋｅｎ Ｂｉｏ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒより得た。Ｃｏｌｏｎ２６の培養は、１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、２－ｍＭ ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１－ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００ ＩＵ ｍｌ-1）を含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）を使用した。他の細胞は、１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、２－ｍＭ ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１－ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００ ＩＵ ｍｌ-1）、Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。細胞は３７℃、５％のＣＯ2雰囲気下の加湿チャンバー中で培養した。
細胞生存率は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（ＣＣＫ）－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とそのマニュアルに従い評価した。細胞（×１０3ｃｅｌｌｓ ｗｅｌｌ-1）を９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、一晩インキュベートした。次いで、細胞を細菌分散溶液に４時間暴露させ、新鮮な培養液で洗浄後、ＣＣＫ－８溶液中でインキュベートした。最後に４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ ＰＲＯ Ｍ Ｐｌｅｘ；Ｔｅｃａｎ）で測定することで細胞生存率を算出した。
紅色光合成細菌Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓの細胞毒性評価［異なる濃度のＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを４時間共培養させたときのマウス結腸がん細胞（Ｃｏｌｏｎ２６）、ヒト肺胞基底上皮腺がん細胞（Ａ５４９）、ヒト結腸腺がん細胞（ＨＴ２９）、ヒト正常二倍体線維芽細胞（ＭＲＣ５）の生存率を測定］を図７に示す。図７の各グラフは、左から、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏｎ２６、Ａ５４９、ＨＴ２９を示す。
上記と同様に、マウス結腸がん細胞（Ｃｏｌｏｎ２６）を用いて、各細菌の細胞毒性を評価した結果［異なる濃度の各細菌を４時間共培養させたときのマウス結腸がん細胞（Ｃｏｌｏｎ２６）の生存率を測定］を図２９～図３１に示す。
＜レーザー照射による細胞生存率評価＞
がん細胞生存性を評価するためにＣｏｌｏｎ２６、Ａ５４９、ＨＴ２９細胞（５×１０3 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し一晩インキュベートした。細胞は各濃度（０．１６、０．３１、０．６３、１．２５×１０9ＣＦＵ ｍｌ-1）のＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを分散させた細胞培養培地（１００μＬ）あるいはＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを含まない細胞培養培地（１００μＬ）で処理後、レーザー（波長８０８ｎｍ、出力１．２ Ｗ，～６１．１ｍＷ ｍｍ-2）を５分間照射した。レーザー照射後、細胞を洗浄し、新鮮な培地中でインキュベートした。細胞生存性はＣＣＫ－８ ｋｉｔを用いて、レーザー照射直後ならびにレーザー照射後２４時間インキュベートしたサンプルを調査した。
がん細胞生存性を評価するためにＣｏｌｏｎ２６、Ａ５４９、ＨＴ２９細胞（５×１０3 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し一晩インキュベートした。細胞は各濃度（０．１６、０．３１、０．６３、１．２５×１０9ＣＦＵ ｍｌ-1）のＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを分散させた細胞培養培地（１００μＬ）あるいはＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを含まない細胞培養培地（１００μＬ）で処理後、レーザー（波長８０８ｎｍ、出力１．２ Ｗ，～６１．１ｍＷ ｍｍ-2）を５分間照射した。レーザー照射後、細胞を洗浄し、新鮮な培地中でインキュベートした。細胞生存性はＣＣＫ－８ ｋｉｔを用いて、レーザー照射直後ならびにレーザー照射後２４時間インキュベートしたサンプルを調査した。
コントロール（細菌の存在しないＤＭＥＭ培地）ならびに異なる濃度のＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓと共存させた各種がん細胞に近赤外レーザーを照射した時［波長：８０８ｎｍ、出力：１．２Ｗ（ｃａ．６１．１ｍＷ／ｍｍ2）、照射時間：５ｍｉｎ］の生存率評価［細胞生存率はレーザー照射した２４時間後にＷＳＴ－８法により測定］を図８に示す。
＜マクロファージ細胞中のＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓの蛍光観察＞
ＲＡＷ２６４．７細胞（２．５×１０5ｃｅｌｌｓ ｗｅｌｌ-1）を２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し一晩インキュベートした。細胞はＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを分散させた細胞培養培地（１×１０8 ＣＦＵ）あるいはＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを含まない細胞培養培地に曝露後、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で２時間培養した。細胞を洗浄し、新鮮な培地中で４時間インキュベートし、近赤外蛍光ミラーユニット（ＩＲＤＹＥ８００－３３ＬＰ－Ａ－Ｕ０１；Ｓｅｍｒｏｃｋ）と対物レンズ（×６０ ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ａｐｅｒｔｕｒｅ １．３５；ＵＰＬＳＡＰＯ６０Ｘ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を搭載する蛍光顕微鏡システム（ＩＸ７３；Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて室温で観察した。
ＲＡＷ２６４．７細胞（２．５×１０5ｃｅｌｌｓ ｗｅｌｌ-1）を２４－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し一晩インキュベートした。細胞はＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを分散させた細胞培養培地（１×１０8 ＣＦＵ）あるいはＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを含まない細胞培養培地に曝露後、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で２時間培養した。細胞を洗浄し、新鮮な培地中で４時間インキュベートし、近赤外蛍光ミラーユニット（ＩＲＤＹＥ８００－３３ＬＰ－Ａ－Ｕ０１；Ｓｅｍｒｏｃｋ）と対物レンズ（×６０ ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ａｐｅｒｔｕｒｅ １．３５；ＵＰＬＳＡＰＯ６０Ｘ，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を搭載する蛍光顕微鏡システム（ＩＸ７３；Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて室温で観察した。
Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（１×１０8ＣＦＵ／ｍＬ）と４時間共培養させたマウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）のＮＩＲ－Ｉ蛍光顕微鏡像（白色の矢印はマクロファージにより貪食されても近赤外蛍光を失わないＲ． Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを示す）を図２１に示す。
＜Ｉｎ ｖｉｖｏ抗がん実験と毒性評価＞
全ての動物実験は、北陸先端科学技術大学院大学の動物実験委員会の承認を得て実施した。４週齢のメスの野生型マウス（ｎ＝１０；ａｖｅｒａｇｅ ｗｅｉｇｈｔ＝１５ｇ； ＢＡＬＢ／ｃＣｒＳｌｃ）をＪａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃより購入し、一週間馴化させた。Ｃｏｌｏｎ２６細胞分散液（１×１０6ｃｅｌｌｓ）（１００μＬ）とｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ／ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）から成る混合溶液（ｖ／ｖ，１：１）をマウス側面腹部皮下２ヵ所に投与し、結腸がんモデルマウスを作成した。約２週間後、固形がん（～４００ｍｍ3）を形成させたマウスの尾静脈内にＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（１× １０9ＣＦＵ ｍｌ-1）あるいはＰＢＳ緩衝液を各２００μＬ投与した。右側の固形がんにのみ２日に一度のペースで近赤外レーザー［波長８０８ ｎｍ、出力（７１３ ｍＷ， ３６．３ ｍＷ ｍｍ-2）］を３分間照射した。ＩＲサーモグラフィー（ｉ７； ＦＬＩＲ， Ｎａｓｈｕａ）を用いてレーザー照射時のマウスの腫瘍表面温度を測定した。
全ての動物実験は、北陸先端科学技術大学院大学の動物実験委員会の承認を得て実施した。４週齢のメスの野生型マウス（ｎ＝１０；ａｖｅｒａｇｅ ｗｅｉｇｈｔ＝１５ｇ； ＢＡＬＢ／ｃＣｒＳｌｃ）をＪａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃより購入し、一週間馴化させた。Ｃｏｌｏｎ２６細胞分散液（１×１０6ｃｅｌｌｓ）（１００μＬ）とｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ／ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）から成る混合溶液（ｖ／ｖ，１：１）をマウス側面腹部皮下２ヵ所に投与し、結腸がんモデルマウスを作成した。約２週間後、固形がん（～４００ｍｍ3）を形成させたマウスの尾静脈内にＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（１× １０9ＣＦＵ ｍｌ-1）あるいはＰＢＳ緩衝液を各２００μＬ投与した。右側の固形がんにのみ２日に一度のペースで近赤外レーザー［波長８０８ ｎｍ、出力（７１３ ｍＷ， ３６．３ ｍＷ ｍｍ-2）］を３分間照射した。ＩＲサーモグラフィー（ｉ７； ＦＬＩＲ， Ｎａｓｈｕａ）を用いてレーザー照射時のマウスの腫瘍表面温度を測定した。
近赤外レーザー照射時［波長：８０８ｎｍ、出力：０．９Ｗ（ｃａ．４５．９ｍＷ／ｍｍ2）、照射時間：３ｍｉｎ］のＣｏｌｏｎ２６担がんモデルマウスの腫瘍表面温度測定［レーザーは細菌（２００μＬ、１×１０9ＣＦＵ）あるいはＰＢＳ（２００μＬ）をマウスの尾静脈に投与した２日後に照射］を図９に示す。図９の各グラフは、左から、ＰＢＳ、Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、ＰＢＳ＋Ｌａｓｅｒ、及びＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ＋レーザーを示す。
マウスの行動や性状、固形がんサイズ測定、マウス体重の推移は、２日に一度実施した。なお、固形がんのサイズは下式により算出した。
Ｖ ＝ Ｌ × Ｗ2／２
このとき、Ｖは固形がん体積、Ｌは固形がんの長さ、Ｗは固形がんの幅をそれぞれ示している。
Ｖ ＝ Ｌ × Ｗ2／２
このとき、Ｖは固形がん体積、Ｌは固形がんの長さ、Ｗは固形がんの幅をそれぞれ示している。
一方、Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓのｉｎ ｖｉｖｏ毒性評価は、マウス血液検査を実施することで調査した。具体的には、Ｒ． Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ分散液（１×１０9ＣＦＵ ｍｌ-1）あるいはＰＢＳ緩衝液を１０週齢のメスのマウス（ｎ＝５；ａｖｅｒａｇｅ ｗｅｉｇｈｔ＝２１ｇ、ＢＡＬＢ／ｃＣｒＳｌｃ、Ｊａｐａｎ ＳＬＣ）の尾静脈に各２００μＬ投与し、７日後と３０日後、腹部大動脈より血液採取した。全血球数（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔ：ＣＢＣ）ならびに生化学検査は、Ｊａｐａｎ ＳＬＣ， Ｉｎｃ．とＯｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．により解析された。ＣＢＣ及び生化学検査の結果を表１及び表２に示す。
＜コロニーカウント＞
Ｃｏｌｏｎ２６を播種した結腸がんモデルマウス（ｆｅｍａｌｅ，８ ｗｅｅｋｓ；ｎ＝ ５；ａｖｅｒａｇｅ ｗｅｉｇｈｔ＝１９ｇ；ａｖｅｒａｇｅ ｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅ～ ４００ｍｍ3；ＢＡＬＢ／ｃＣｒＳＩｃ；Ｊａｐａｎ ＳＬＣ）の尾静脈にＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（５×１０9ＣＦＵ ｍｌ-1）、Ｂ．ｖｉｒｉｄｉｓ（５×１０9ＣＦＵ ｍｌ-1）、細菌培養培地をそれぞれ２００μＬ投与した。１、２４、４８、１４４時間後に各組織と腫瘍を摘出し、切断後、重量を測定した。ペストルを使って４℃の温度下、ＰＢＳ緩衝液中でホモジナイズ後、混合物を２０分間、１５℃、３８０ｒｐｍ ｍｉｎ-1の速度で振とうした。上澄をＰＢＳ緩衝液で１０倍希釈し、各サンプル（１００μＬ）を寒天培地上に播種し、７日間、嫌気培養した。形成した細菌コロニー数はマニュアルで測定した。
Ｃｏｌｏｎ２６を播種した結腸がんモデルマウス（ｆｅｍａｌｅ，８ ｗｅｅｋｓ；ｎ＝ ５；ａｖｅｒａｇｅ ｗｅｉｇｈｔ＝１９ｇ；ａｖｅｒａｇｅ ｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅ～ ４００ｍｍ3；ＢＡＬＢ／ｃＣｒＳＩｃ；Ｊａｐａｎ ＳＬＣ）の尾静脈にＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（５×１０9ＣＦＵ ｍｌ-1）、Ｂ．ｖｉｒｉｄｉｓ（５×１０9ＣＦＵ ｍｌ-1）、細菌培養培地をそれぞれ２００μＬ投与した。１、２４、４８、１４４時間後に各組織と腫瘍を摘出し、切断後、重量を測定した。ペストルを使って４℃の温度下、ＰＢＳ緩衝液中でホモジナイズ後、混合物を２０分間、１５℃、３８０ｒｐｍ ｍｉｎ-1の速度で振とうした。上澄をＰＢＳ緩衝液で１０倍希釈し、各サンプル（１００μＬ）を寒天培地上に播種し、７日間、嫌気培養した。形成した細菌コロニー数はマニュアルで測定した。
近赤外で駆動するＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを用いた抗腫瘍活性評価［ＰＢＳ（２００μＬ）あるいはＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ分散液（２００μＬ、１×１０9ＣＦＵ）をマウス尾部静脈から投与し、レーザーはマウス右側の腫瘍にのみ照射（波長：８０８ｎｍ、出力：０．９Ｗ（ｃａ．４５．９ｍＷ／ｍｍ2）、照射時間：３ｍｉｎ）；グラフ中の黒色の矢印は細菌あるいはＰＢＳ投与した日、赤色の矢印はレーザーを照射した日をそれぞれ示す］を図１０に示す。
各処置後のマウスの写真（矢印はレーザーを照射した各腫瘍を示す）を図１１に示す。
各種処置を施した３４日後の摘出した腫瘍の写真を図１２に示す。
各処置における３４日間のマウス生存率を図１３示す。
各処置後のマウスの写真（矢印はレーザーを照射した各腫瘍を示す）を図１１に示す。
各種処置を施した３４日後の摘出した腫瘍の写真を図１２に示す。
各処置における３４日間のマウス生存率を図１３示す。
腫瘍内で特異的に生育したＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓに由来する赤色コロニーの写真（Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（２００μＬ、１×１０9ＣＦＵ／ｍＬ）をＣｏｌｏｎ２６担がんモデルマウスに尾静脈投与した２日後に各種臓器ならびに腫瘍を取り出し、抽出液を寒天培地に塗布後、嫌気条件で培養）を図１５に示す。
各種臓器ならびに腫瘍中のＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ生菌数［Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（２００μＬ、１×１０9ＣＦＵ／ｍＬ）をＣｏｌｏｎ２６担がんモデルマウスに尾静脈投与した７日後に各種臓器ならびに腫瘍を取り出し、抽出液を寒天培地上、嫌気条件で培養］を図１６に示す。
各種臓器ならびに腫瘍のＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓに由来する蛍光強度［Ｒ． Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（２００μＬ、１×１０9 ＣＦＵ／ｍＬ）をＣｏｌｏｎ２６担がんモデルマウスに尾静脈投与し、経時的に蛍光バイオイメージング解析し、蛍光強度を測定］を図１７に示す。
各種臓器ならびに腫瘍のＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓの生菌数［Ｒ． Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（２００μＬ、１×１０9 ＣＦＵ／ｍＬ）をＣｏｌｏｎ２６担がんモデルマウスに尾静脈投与し、経時的に各種臓器ならびに腫瘍を取り出し、抽出液を寒天培地に塗布後、嫌気条件下で培養し、形成したコロニー数を測定］を図１８に示す。
各種臓器ならびに腫瘍中のＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ生菌数［Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（２００μＬ、１×１０9ＣＦＵ／ｍＬ）をＣｏｌｏｎ２６担がんモデルマウスに尾静脈投与した７日後に各種臓器ならびに腫瘍を取り出し、抽出液を寒天培地上、嫌気条件で培養］を図１６に示す。
各種臓器ならびに腫瘍のＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓに由来する蛍光強度［Ｒ． Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（２００μＬ、１×１０9 ＣＦＵ／ｍＬ）をＣｏｌｏｎ２６担がんモデルマウスに尾静脈投与し、経時的に蛍光バイオイメージング解析し、蛍光強度を測定］を図１７に示す。
各種臓器ならびに腫瘍のＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓの生菌数［Ｒ． Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（２００μＬ、１×１０9 ＣＦＵ／ｍＬ）をＣｏｌｏｎ２６担がんモデルマウスに尾静脈投与し、経時的に各種臓器ならびに腫瘍を取り出し、抽出液を寒天培地に塗布後、嫌気条件下で培養し、形成したコロニー数を測定］を図１８に示す。
腫瘍内で特異的に生育したＢｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓに由来する緑色コロニーの写真［Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓ（２００ μＬ、１×１０9 ＣＦＵ／ｍＬ）をＣｏｌｏｎ２６担がんモデルマウスに尾静脈投与した２日後に各種臓器ならびに腫瘍を取り出し、抽出液を寒天培地に塗布後、嫌気条件で培養］を図１９に示す。
各種臓器ならびに腫瘍中のＢｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓ生菌数［Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓ（２００μＬ、１×１０9ＣＦＵ／ｍＬ）をＣｏｌｏｎ２６担がんモデルマウスに尾静脈投与した７日後に各種臓器ならびに腫瘍を取り出し、抽出液を寒天培地上、嫌気条件で培養］を図２０に示す。
各種臓器ならびに腫瘍中のＢｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓ生菌数［Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓ（２００μＬ、１×１０9ＣＦＵ／ｍＬ）をＣｏｌｏｎ２６担がんモデルマウスに尾静脈投与した７日後に各種臓器ならびに腫瘍を取り出し、抽出液を寒天培地上、嫌気条件で培養］を図２０に示す。
＜Ｉｎ ｖｉｖｏ蛍光バイオイメージング＞
ＮＩＲ－Ｉ蛍光を用いた細菌の生体内分布を測定するためにＣｏｌｏｎ２６から成るマウス結腸がんモデルマウス（ｆｅｍａｌｅ；８ｗｅｅｋｓ；ｎ＝３；ａｖｅｒａｇｅ ｗｅｉｇｈｔ＝１９ｇ；ａｖｅｒａｇｅ ｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅ＝４３０ｍｍ3；ＢＡＬＢ／ｃＣｒＳＩｃ；Ｊａｐａｎ ＳＬＣ）の尾静脈にＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（２００μＬ， １×１０9ＣＦＵ）を含む細菌培養培地あるいは細菌を含まないＰＢＳ緩衝液を投与した。マウスならびに主要生体組織の近赤外蛍光像をＶＩＳＱＵＥTM ＩｎＶｉｖｏ Ｓｍａｒｔ－ＬＦ（Ｖｉｅｗｏｒｋｓ）を用いて観察した。励起波長ならびに蛍光波長はそれぞれλex＝７４０-７９０ｎｍ，λem＝８１０-８６０ｎｍである。また画像解析はＣｌｅＶｕｅTM ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｉｅｗｏｒｋｓ）を用いた。
Ｃｏｌｏｎ２６担がんモデルマウスのＩｎ ｖｉｖｏ近赤外Ｉ領域（ＮＩＲ－Ｉ）蛍光バイオイメージング（Ｅｘ：７４０ｎｍ－７９０ｎｍ、Ｅｍ：８１０ｎｍ－８６０ｎｍ）［画像はＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（２００μＬ、１×１０9ＣＦＵ／ｍＬ）あるいはＰＢＳ（２００μＬ）をマウスの尾静脈投与した５日後に撮影、矢印は腫瘍の位置を示す］を図１４に示す。
ＮＩＲ－Ｉ蛍光を用いた細菌の生体内分布を測定するためにＣｏｌｏｎ２６から成るマウス結腸がんモデルマウス（ｆｅｍａｌｅ；８ｗｅｅｋｓ；ｎ＝３；ａｖｅｒａｇｅ ｗｅｉｇｈｔ＝１９ｇ；ａｖｅｒａｇｅ ｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅ＝４３０ｍｍ3；ＢＡＬＢ／ｃＣｒＳＩｃ；Ｊａｐａｎ ＳＬＣ）の尾静脈にＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（２００μＬ， １×１０9ＣＦＵ）を含む細菌培養培地あるいは細菌を含まないＰＢＳ緩衝液を投与した。マウスならびに主要生体組織の近赤外蛍光像をＶＩＳＱＵＥTM ＩｎＶｉｖｏ Ｓｍａｒｔ－ＬＦ（Ｖｉｅｗｏｒｋｓ）を用いて観察した。励起波長ならびに蛍光波長はそれぞれλex＝７４０-７９０ｎｍ，λem＝８１０-８６０ｎｍである。また画像解析はＣｌｅＶｕｅTM ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｉｅｗｏｒｋｓ）を用いた。
Ｃｏｌｏｎ２６担がんモデルマウスのＩｎ ｖｉｖｏ近赤外Ｉ領域（ＮＩＲ－Ｉ）蛍光バイオイメージング（Ｅｘ：７４０ｎｍ－７９０ｎｍ、Ｅｍ：８１０ｎｍ－８６０ｎｍ）［画像はＲ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（２００μＬ、１×１０9ＣＦＵ／ｍＬ）あるいはＰＢＳ（２００μＬ）をマウスの尾静脈投与した５日後に撮影、矢印は腫瘍の位置を示す］を図１４に示す。
ＮＩＲ－ＩＩ蛍光バイオイメージングは、Ｓｕｍｍｉｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによって実施された。ＨＴ２９から成るヒト結腸腺がんモデルマウス（ｆｅｍａｌｅ；１０ｗｅｅｋｓ；ｎ＝３；ａｖｅｒａｇｅ ｗｅｉｇｈｔ ＝２１ｇ；ａｖｅｒａｇｅ ｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅ＝１００ｍｍ3；ＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ－ｎｕ／ｎｕ；Ｊａｐａｎ ＳＬＣ）の固形がんにＢ．ｖｉｒｉｄｉｓ（２０μＬ，１×１０8ＣＦＵ）を含むＰＢＳ緩衝液を投与した。Ｂ．ｖｉｒｉｄｉｓに由来するＮＩＲ－ＩＩ蛍光は、ＳＡＩ－１０００（Ｓｈｉｍａｚｕ）を用いてレーザー出力２Ｗ、露光時間２００ｍｓｅｃの下、観察を行った。
Ｂ．ｖｉｒｉｄｉｓのＮＩＲ－ＩＩ蛍光による血管造影は、同じＨＴ２９から成るヒト結腸腺がんモデルマウス（ｎ ＝３）の尾静脈にＢ．ｖｉｒｉｄｉｓ（２００μＬ，１×１０9ＣＦＵ）を含むＰＢＳ緩衝液を投与し、同システム（レーザー出力＝１０Ｗ、露光時間＝４００ｍｓｅｃ）を用いて測定した。
Ｂｌａｓｔｏｃｈｌｏｒｉｓ ｖｉｒｉｄｉｓを用いた近赤外ＩＩ領域（ＮＩＲ－ＩＩ）蛍光バイオイメージングによる血管造影（Ｅｘ：９８０ｎｍ、Ｅｍ：１０００ｎｍ－１７００ｎｍ）［Ｂ．ｖｉｒｉｄｉｓ（２００μＬ、１０9ＣＦＵ）をヌードマウス尾静脈に投与後撮影］を図２３に示す。
＜Ｉｎ ｖｉｖｏ光音響（ＰＡ）イメージング＞
ＰＡイメージングは、ｍｕｌｔｉ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｏｐｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ （ＭＳＯＴ）ｉｎＶｉｓｉｏｎ ２５６－ＴＦ ｓｙｓｔｅｍ（ＳＹＳ－ＭＳＯＴｉＶ２５６ＴＦ；ｉＴｈｅｒａ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いてＳｕｍｍｉｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによって実施された。Ｒ． Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（２０μＬ，１×１０8ＣＦＵ）を分散させたＰＢＳ緩衝液をＨＴ２９から成るヒト結腸腺がんモデルマウス（ｆｅｍａｌｅ；１０ｗｅｅｋｓ；ｎ＝３；ａｖｅｒａｇｅ ｗｅｉｇｈｔ＝２１ｇ；ａｖｅｒａｇｅ ｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅ＝１００ｍｍ3；ＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ－ｎｕ／ｎｕ；Ｊａｐａｎ ＳＬＣ）の固形がんに投与することでＰＡ像を得た。
ＰＡイメージングは、ｍｕｌｔｉ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｏｐｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ （ＭＳＯＴ）ｉｎＶｉｓｉｏｎ ２５６－ＴＦ ｓｙｓｔｅｍ（ＳＹＳ－ＭＳＯＴｉＶ２５６ＴＦ；ｉＴｈｅｒａ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いてＳｕｍｍｉｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによって実施された。Ｒ． Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（２０μＬ，１×１０8ＣＦＵ）を分散させたＰＢＳ緩衝液をＨＴ２９から成るヒト結腸腺がんモデルマウス（ｆｅｍａｌｅ；１０ｗｅｅｋｓ；ｎ＝３；ａｖｅｒａｇｅ ｗｅｉｇｈｔ＝２１ｇ；ａｖｅｒａｇｅ ｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅ＝１００ｍｍ3；ＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ－ｎｕ／ｎｕ；Ｊａｐａｎ ＳＬＣ）の固形がんに投与することでＰＡ像を得た。
Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓを用いたマウス腫瘍の光音響（ＰＡ）イメージング［ＨＴ２９担がんモデルマウスの腫瘍内にＰＢＳ（２０μＬ）（写真左側）、Ｒ．Ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（２０μＬ，１０8ＣＦＵ／ｍＬ）（写真右側）を投与し撮影］を図２２に示す。
＜データの統計解析＞
データ中の±は標準偏差、ｎは使用したサンプル数を示している。データの統計解析は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔを用いた。＊、＊＊、＊＊＊は、それぞれ＜ ０．０５、＜ ０．００５、＜ ０．００１のｐ値を示している。
データ中の±は標準偏差、ｎは使用したサンプル数を示している。データの統計解析は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔを用いた。＊、＊＊、＊＊＊は、それぞれ＜ ０．０５、＜ ０．００５、＜ ０．００１のｐ値を示している。
Claims (6)
- 光合成細菌を含む、がんの治療薬又は診断薬。
- 光合成細菌が、バクテリオクロロフィルを有する光合成細菌である、請求項１に記載のがんの治療薬又は診断薬。
- 光合成細菌が、紅色光合成細菌、又は緑色光合成細菌である、請求項１又は２に記載のがんの治療薬又は診断薬。
- 光合成細菌が、ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas）細菌、ブラストクロリス属（Blastochloris）細菌、アフィフェラ属（Afifella）細菌、ロドバクター属（Rhodobacter）細菌、パラロドスピリラム属（Pararhodospirillum）細菌、ロドミクロビウム属（Rhodomicrobium）細菌、ロドブラム属（Rhodovulum）細菌、又はマリクロマチウム属（Marichromatium）細菌である、請求項１から３の何れか一項に記載のがんの治療薬又は診断薬。
- 光照射と組み合わせて使用する、請求項１から４の何れかに記載のがんの治療薬又は診断薬。
- 光照射が近赤外光の照射である、請求項５に記載のがんの治療薬又は診断薬。
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|---|---|---|---|
| EP21848142.2A EP4190340A4 (en) | 2020-07-29 | 2021-07-27 | THERAPEUTIC DRUG OR DIAGNOSTIC DRUG AGAINST CANCER |
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| WO2023223869A1 (ja) * | 2022-05-19 | 2023-11-23 | 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学 | 抗腫瘍剤、画像生成方法、細菌、及び製造方法 |
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| WWE | Wipo information: entry into national phase |
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| ENP | Entry into the national phase |
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| NENP | Non-entry into the national phase |
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