WO2021246893A1 - Биокомпозитный сфероид для восстановления костей - Google Patents
Биокомпозитный сфероид для восстановления костей Download PDFInfo
- Publication number
- WO2021246893A1 WO2021246893A1 PCT/RU2020/000264 RU2020000264W WO2021246893A1 WO 2021246893 A1 WO2021246893 A1 WO 2021246893A1 RU 2020000264 W RU2020000264 W RU 2020000264W WO 2021246893 A1 WO2021246893 A1 WO 2021246893A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- bone
- cells
- spheroids
- allogeneic
- subject
- Prior art date
Links
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 89
- 239000011173 biocomposite Substances 0.000 title claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 95
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 33
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 33
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 24
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 13
- 230000011164 ossification Effects 0.000 claims description 12
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 9
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 7
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 claims description 7
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 claims description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 6
- 210000002236 cellular spheroid Anatomy 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 4
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 238000005115 demineralization Methods 0.000 claims description 4
- 230000002328 demineralizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 19
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 12
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 11
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 11
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 10
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 10
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 9
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 8
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 8
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 8
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 7
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 6
- 102000008143 Bone Morphogenetic Protein 2 Human genes 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 6
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 6
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000035194 endochondral ossification Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical compound O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N Glycerol 2-phosphate Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 230000000278 osteoconductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004819 osteoinduction Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 description 1
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 description 1
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 1
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 1
- 238000009583 bone marrow aspiration Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004068 calcium phosphate ceramic Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004035 construction material Substances 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 108010023714 recombinant human bone morphogenetic protein-2 Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- FISGLHSNQHXMGY-UHFFFAOYSA-N sodium;aminoazanide Chemical group [Na+].[NH-]N FISGLHSNQHXMGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N suramin Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=C2C(NC(=O)C3=CC=C(C(=C3)NC(=O)C=3C=C(NC(=O)NC=4C=C(C=CC=4)C(=O)NC=4C(=CC=C(C=4)C(=O)NC=4C5=C(C=C(C=C5C(=CC=4)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)C)C=CC=3)C)=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005314 suramin Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/28—Bones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
Definitions
- the invention relates to medicine, namely to tissue engineering, regenerative medicine, plastic surgery, dentistry, traumatology and orthopedics.
- bone regeneration bone defects exceeding critical dimensions are of particular practical interest - this is the volume of lost tissue that the human body is not able to regenerate on its own.
- Transplantation of bone tissue or osteoplastic materials is in second place after blood transfusion.
- Regeneration using a graft or bone graft material is a long process, stretching for many months and years, requiring long-term and painful stabilization of bone fragments, often immobilization of the limb; to restore the functions of the damaged part of the musculoskeletal system, it takes a lot of time and far from it is always possible to achieve complete rehabilitation and avoid the patient's disability.
- One of the strategies of cell therapy is the use of multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells or bone marrow's own stromal cells.
- Human cells are relatively easy to obtain from bone marrow aspirates; bone marrow aspiration itself is a low-traumatic intervention that can be performed without incisions and under local anesthesia. These cells proliferate relatively easily in culture under conditions under which they retain the ability to differentiate into cell lines consisting of osteoblasts, adipocytes, and chondroblasts.
- One of the most important conditions for the expansion of these cells is rapid proliferation with the maximum preservation of their multipotency - passage of cells spread out on the bottom of the bottle in a low density of the monolayer.
- BMSC bone marrow stromal cells
- osteogenesis does not occur when a bone marrow suspension is injected subcutaneously and intramuscularly, and when BMSCs (multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells) are implanted in the form of cell aggregates without a carrier (Goshima J, Goldberg VM, Caplan Al (1991).
- BMSCs multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells
- the osteogenic potential of culture expanded rat marrow mesenchymal cells assayed in vivo in calcium phosphate ceramic blocks Clin Orthop 262: 298-311 Yoshikawa T, Ohgushi H, Tamai S (1996) Immediate bone forming capability of prefabricated osteogenic hydroxyapatite I Biomed Mater Res 32: 481-492).
- osteoblasts or chondrocytes are usually cultured in osteogenic or chondrogenic media when it is desired to increase the mass of osteoblasts or chondrocytes for bone or cartilage tissue repair. It is believed that cultivation under hypoxic conditions increases the survival rate and engraftment of spheroids when transplanted to a recipient, which leads to more efficient osteogenesis (SS Ho, B. P. Hung, N. Heyrani, M. A. Lee, JK Leach, Hypoxic preconditioning of mesenchymal stem cells with subsequent spheroid formation accelerates repair of segmental bone defects, Stem Cells 36 (9) (2016) 1393-1403).
- additives are often used in nutrient media for 3D cultures - various cytokines or differentiation inducers for an extended period of cultivation time to obtain and subsequent transplantation of spheroids consisting of differentiated cells.
- Cells within spheroids show greater osteogenic potential than induction organotypic traits in 2D monolayer culture cells and only with the subsequent formation of spheroids from them (SS Ho, A.T. Keown, B.
- MSCs were induced osteogenically either in monolayer or as spheroids.
- MSCs were seeded at 5000 cells / cm 2 in flasks with culture and maintained in osteogenic media (growth media containing standard osteogenic additives 10 mM beta-glycerophosphate, 50 ⁇ m g / ml ascorbate-2-phosphate, and 100 nMa dexamethasone) for 12 days.
- MSC were trypsinized and formed into spheroids of 15,000 MSCs in osteogenic medium using forced aggregation
- the plates were kept stationary in a standard incubator for 48 hours to ensure aggregation of cells into spheroids.
- MSCs were first formed into spheroids in an osteogenic medium and transferred into 6-well plates containing 2 ml of 1.5% agarose to prevent adhesion to tissue culture plastic.
- the spheroids were cultured in osteogenic medium for an additional 12 days, resulting in a total osteoinduction period of 14 days for both conditions.
- the described method of biofabrication of spheroids has a number of disadvantages.
- microparticles loaded with growth factors which are gradually released into the intercellular environment, were included in the composition of the spheroids.
- a microparticle-based growth factor delivery system was developed to provide endochondral ossification in aggregates of mesenchymal stem cells (hMSC) derived from human bone marrow.
- hMSC mesenchymal stem cells
- BMP-2 bone morphogenetic protein-2
- TGF-bI and BMP-2 The time during which endochondral ossification was best induced was used to develop a microparticle controlled delivery system for TGF-bI and BMP-2.
- Gelatin microparticles capable of relatively rapid release of TGF-bI and mineral-coated hydroxyapatite microparticles providing a longer release of BMP-2 were then incorporated into human MSC aggregates and cultured for 5 weeks after a predetermined time course for the sequential action of these cytokines.
- spheroids treated with exogenous growth factors Compared to cells in 2D culture, spheroids treated with exogenous growth factors, spheroids with incorporated microparticles loaded with TGF-bI and EZMP-2 showed increased chondrogenesis and alkaline phosphatase activity in the second week and a higher degree of mineralization by fifth week.
- staining was performed for collagen types I and II, osteopontin and osteocalcin proved the presence of cartilage and bone.
- This microparticulate system has potential as an easily implantable therapy for healing bone defects without the need for long-term chondrogenic priming in vitro (Dang PN, Dwivedi N, Phillips LM, Yu X, Herberg S, Bowernnan C, Solorio LD, Murphy WL, Alsberg E. Controlled Dual Growth Factor Delivery From Microparticles Incorporated Within Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell Aggregates for Enhanced Bone Tissue Engineering via Endochondral Ossification. Stem Cells Translational Medicine, 23 Dec 2015, 5 (2): 206-217) ...
- recombinant human bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) was adsorbed onto hydroxyapatite (Hap) nanoparticles and incorporated into spheroids. Under these conditions, spheroids exhibited more spatially uniform osteogenic differentiation throughout the spheroid and retained their differentiation after removal of soluble signals [J. Whitehead, A. Kothambawala, J. Kent Leach, Morphogen delivery by osteoconductive nanoparticles instructs stromal cell spheroid phenotype, Advanced Biosystems 0 (0) (2019) 1900141].
- BMP-2 hydroxyapatite
- biomaterials into spheroids is a promising method for the uniform and constant action of differentiating factors on cells within spheroids (PN Dang, N. Dwivedi, LM Phillips, XH Yu, S. Herberg, C. Bowerman, LD Solorio, WL Murphy , E.
- Allogeneic cells are preferred when a large number of cells are required and an effect on the immune response of the recipient is expected.
- the use of allogeneic cells is most suitable if the technology for preparing the cell material involves significant manipulations with cells ex vivo, which allows a lot of time to be spent on preparing the construct. Similar to the analysis of donated blood in blood banks, collections of allogeneic cells can be well characterized, differentiated and sorted according to their intended clinical uses based on their differentiation and regeneration capacity.
- the object of the present invention is to develop a new graft based on cell spheroids for efficient bone repair and a method for producing said graft.
- the technical result of this invention is the development and production of a graft for effective bone restoration based on cellular spheroids with a pronounced regenerative potential and characterized by the presence bone matrix with osteinduction properties.
- the preparation of spheroids in non-adhesive agarose wells is carried out from a mixture of crushed demineralized bone and a cell culture suspension (autologous multipotent bone marrow stromal cells), as a result, a particle of demineralized bone is packed inside the formed spheroid.
- a cell suspension stably forms a “shell” of cells and the extracellular matrix synthesized by them, which, as it were, packs a piece of demineralized bone matrix inside. It is impossible to form such a construct outside an agarose well of this size.
- the technical result of the present invention is also that the method according to the invention eliminates the need to use any differentiating media that slow down the growth of cell biomass.
- the present invention provides a reduction in the trauma of the subject, the bone marrow is harvested from the subject by puncture and aspiration of the bone marrow on an outpatient basis under local anesthesia.
- the method according to the invention makes it possible to obtain spheroids from multipotent bone marrow stromal cells rather quickly.
- a particle of bone matrix crushed demineralized human bone
- the bone marrow cells not only surround the bone particle in 3-7 days, but also form their own matrix, which forms a cocoon of fibers that holds the cells on a fragment of demineralized allogeneic bone matrix.
- Reparative bone regeneration in the recipient occurs due to the introduced sources of regeneration, osteoinductive materials with a large specific surface (crushed bone), protected from reactions to a foreign body.
- Such a graft also stimulates another method of bone regeneration - graft bone regeneration.
- the recipient's own tissues are activated and more intensively grow into the graft, including blood vessels and nerve fibers.
- the implementation of the method of obtaining a transplant based on cellular spheroids for the restoration of a subject's bone on the basis of autologous multipotent mesenchymal stromal cells of the bone marrow and crushed partially demineralized allogeneic bone including the following steps: a) isolation of cells from the subject's own bone marrow; b) culturing the cells isolated at stage a) in an adhesive culture in a nutrient culture medium without differentiation inducers; c) obtaining partially demineralized particles of allogeneic bone; d) transferring the cells obtained in step b) and particles of partially demineralized bone obtained in step c) into the wells of an agarose plate; e) aggregation of cells around particles of demineralized allogeneic bone into biocomposite-containing cell spheroids.
- the subject is a human.
- the culturing of the cells in step b) is carried out for 20-30 days.
- the transfer of cells in step d) is carried out at the rate of 8000-12000 cells per 1 well of an agarose plate.
- the spheroids are 250 to 600 microns in size.
- the particle diameter of the partially demineralized allogeneic bone is from 50 to 250 microns.
- the culture medium is a medium based on xenogenic animal sera, a medium based on autologous and allogeneic human sera of human blood thrombolysates, a serum-free medium and / or a synthetic medium
- the additional medium may include additives for growing cells.
- the aggregation of cells into cellular spheroids around a fragment of demineralized bone is carried out in agarose wells, where cells in the form of cell aggregates remain for up to 8 days.
- the degree of demineralization of the allogenic bone is not more than 30%.
- the present invention also relates to a graft for bone restoration of a subject, comprising cell spheroids based on cultured autologous multipotent bone marrow stromal cells of a subject, containing particles of crushed allogeneic demineralized bone, and obtained by the method of the invention.
- the degree of demineralization of the allogenic bone is not more than 30%, more particularly 10-30%.
- the subject is a human.
- the graft comprises spheroids ranging in size from 250 to 600 ⁇ m.
- the graft comprises spheroids containing allogeneic demineralized bone particles with a diameter of 50 to 250 km.
- the graft comprises an additional component, in particular, an alginate gel with osteogenesis inducers.
- an additional component in particular, an alginate gel with osteogenesis inducers.
- FIG. 1 Micrograph of a histological section of a biocomposite spheroid according to the invention (Mallory stain). In the center is a fragment of demineralized allograft, around the microtissue formed by MMSC BM.
- tissue refers to a system of cells and non-cellular structures that have a common structure, in some cases a common origin, and specialized in performing certain functions.
- Adhesive culture is a cell culture consisting of plastic-adherent cells capable of attaching to culture plastic or glass through their receptors.
- Bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells are multipotent cells of mesodermal origin in the bone marrow of an adult organism, capable of differentiating into several types of connective tissue cells - osteoblasts (bone tissue cells), chondrocytes and adipocytes.
- defects refers to bone tissue if it is absent, reduced in quantity, or otherwise damaged.
- a bone defect can be the result of illness, treatment for a disease, or injury.
- medium refers to a nutrient culture medium for the cultivation of spheroids according to the invention, for example, the medium can be selected from media based on xenogenic animal sera, autologous and allogeneic human sera, human blood thrombolysates, various serum-free commercial media.
- graft refers to spheroids
- transplant is the process of transplanting said spheroids into a subject, typically to repair a bone defect.
- spheroids refers to tightly packed ball-shaped cell aggregates formed by three-dimensional culture. Their important property is the ability for mutual adhesion and subsequent tissue fusion, as well as for adhesion to the elements of the extracellular matrix of the recipient. Tissue (cellular) spheroids have a tissue-like structure - often referred to as three-dimensional micro-tissues that maximize intercellular interactions.
- the graft according to the invention comprises spheroids from autologous multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells obtained according to the method according to the invention, and the graft optionally includes at least one additional component.
- a component can be an alginate gel or a gel based on hyaluronic acid (this gel can be obtained, in particular, by the method described in Molly M. Stevens, Robert P. Marini et al / In vivo engineering of organs: The bone bioreactor / PNAS August 9, 2005 102 (32) 11450-11455; https: //doi.ora/10.1073/pnas.0504705102).
- gelation can be initiated by mixing 2% (w / v) sodium alginate (FMC BioPolymer) in 30 mM Hepes containing 150 mM NaCl and 10 mM KCl, with an equal volume of a solution containing 75 mM CaCl in 10 mM Hepes containing 150 mM NaCl and 10 mM KCl using a sterile Y-blender.
- the gel cures within 1 min and has a Young's modulus of 0.17 MPa.
- Growth factors TGF-bI and FGF-2, R & D Systems
- TGF-bI and FGF-2, R & D Systems can be added to the gel, included in the composition at a concentration of 10 ng / ml.
- a HA-based gel was chemically modified to contain aldehyde groups (HA-ALD) by reaction with sodium periodate and hydrazide groups (HA-ADH) by interaction with adipine dihydrazide.
- HA hydrogels are prepared by mixing equal volumes of 2% (w / v) aqueous solutions of HA-ALD and HA-ADH.
- Suramin Bauer, Leverkusen, Germany
- the graft may contain a physiologically acceptable carrier, which, in particular, is Ham's F12 culture medium, basic, CLS.
- the graft may contain an NCTF® complex (LABORATOIRES FILORGA).
- Biocomposites are construction materials, they are constructed from two, three or more materials with different properties and are quite reliable connected to each other to ensure the operation of the resulting system as a whole. Biocomposites are structures created by nature.
- Bone is an organ of the musculoskeletal system, built primarily of bone tissue. From the point of view of materials science, bone is a biocomposite or a polymer composite. Specialists in the field of composites are intensively engaged in research on their properties. It is known that bone tissue contains three main components - the mineral substance hydroxylapatite ( ⁇ 70%), organic matter based on collagen protein ( ⁇ 20%) and water ( ⁇ 10%).
- the demineralized bone particles according to the invention are, in particular, the bone-grafting material Perfoost.
- a nutrient medium supplement is a product that is used to optimize basic media formulations, namely to support the growth and differentiation of various stem and progenitor cells, as well as primary cells, or to differentiate cells in a specific direction.
- Synthetic medium is a culture medium that is prepared from certain chemically pure organic and inorganic compounds taken in precisely specified concentrations and dissolved in double-distilled water.
- Spheroids which are dense three-dimensional cell aggregates, enhance the known beneficial effects of cell therapy, while increasing and lengthening the time of cell-to-cell signaling and cell matrix.
- Spheroids from multipotent stromal cells of the bone marrow not only demonstrate their increased survival, even in the center of multicellular aggregates, but it is also important that at the same time they maintain osteogenic potencies, and also produce an extensive set of secreted proteins that promote angiogenesis, reduce inflammation, they activate and attract their own endogenous cells of the recipient to participate in bone regeneration.
- tissue spheroids is a critical condition for the successful and prolonged survival of cells in the harsh conditions of post-transplant engraftment in the recipient's body; cells in the spheroid retain the ability to secrete trophic factors for a longer time than dissociated cells. Due to the presence of their own extracellular matrix, as well as a particle of demineralized allogeneic bone inside the spheroid and improved intercellular interactions, spheroids during transplantation create a local microenvironment favorable for organotypic bone regeneration.
- the patient's own bone marrow is used, which is a source of multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells.
- the biomaterial that is, the particles of the subject's demineralized bone
- the multipotent mesenchymal stromal cells of the bone marrow are enclosed in a membrane of their own cells, that is, the multipotent mesenchymal stromal cells of the bone marrow.
- the cells of the biocomposite spheroid interact with the inducer of their differentiation, on the other hand, they protect the biocomposite - allogeneic bone from rapid lysis, the body's reaction to a foreign body.
- a suspension of particles of crushed allogeneic demineralized bone was obtained by grinding ready-made demineralized bone blocks, prepared for clinical use in the form of bone blocks - osteoplastic material.
- MMSK BM multipotent mesenchymal stromal cells of bone marrow
- Mononuclear cells were isolated using a Percoll density gradient (Sigma-Aldrich), plated on plastic for tissue culture with a density of 1.8 s 10 5 cells per cm 2 in a medium containing 10 ng / ml fibroblast growth factor-2, and cultured at 37 ° C with 5% CO2. Non-adherent cells were removed by changing the culture medium after 4 days. Adhesive cells, primary MMSCs of BM, were cultured for another 10-14 days with a change of medium every 3 days.
- DMEM or DMEM / F12
- fetal bovine serum 50 ml penicillin 100 U / ml
- streptomycin 100 ⁇ g / ml at 100% humidity, 37 ° C, 5% CO2 (this medium and conditions are used at all stages of subsequent cultivation).
- cells are removed from plastic vials with trypsin / EDTA.
- the resulting cell suspension is washed from trypsin / EDTA, including using DMEM medium with 10% serum, followed by centrifugation (10 minutes at 200 g), the cell suspension is mixed with a suspension of 90 particles of crushed demineralized allogenic bone and transferred to 81 -well agarose plates with a well diameter of 800 microns at a concentration of up to 1.6 million cells per plate, where one particle of bone usually falls into the well, and approximately equal numbers of cultured bone marrow cells, spheroids begin to form inside the agarose wells, in the center which turns out to be a particle of allogeneic bone.
- Cell spheroids are formed from cultured autologous or allogeneic living bone marrow cells (multipotent bone marrow stromal cells) under 3D cultivation conditions inside agarose wells with a diameter of 800 ⁇ m with a diameter of 250 to 600 microns, and in the center of the forming spheroid there is a particle of crushed demineralized bone matrix with a diameter of 50 to 250 microns.
- a suspension of live cultured cells mixed with a suspension of crushed partially demineralized allogeneic bone matrix is poured into the well.
- a tissue spheroid is formed from cells and a newly synthesized extracellular matrix, in the central part of which there is a particle of demineralized bone matrix.
- the cells and matrix surround the bone particle and form a tissue-engineered construct that is resistant to mechanical stress.
- the sedimentation of cells and bone particles from suspensions occurs under the action of gravitational forces under conditions of three-dimensional cultivation and with a possible short rocking of the culture dishes.
- the mass of such spheroids can initiate the regeneration of the recipient's own tissues and organs by the type of transplant regeneration, forming a living framework for the accelerated regeneration of blood vessels, nerves and the recipient's own regenerating tissues.
- Spheroids stay in the wells for up to 8 days with a change of medium every 2-3 days.
- spheroids For transplantation of spheroids, they are collected from plates and transferred to a test tube, where they settle to the bottom without additional centrifugation. After that, the spheroids are placed in a syringe and transplanted to the subject into the defect zone through a needle or applicator with a diameter of at least 1 mm 2 . Transplantation can be done endoscopically.
- Mononuclear cells were isolated using a Percoll density gradient (Sigma-Aldrich), plated on tissue culture plastic with a density of 1.8 s 10 5 cells per cm 2 in a medium containing 10 ng / ml fibroblast growth factor-2, and stumps - Vibrated at 37 ° C with 5% CO2. Non-adherent cells were removed by changing the culture medium after 4 days. Adhesive cells, primary MMSCs of BM, were cultured for another 10-14 days with a change of medium every 3 days.
- DMEM or DMEM / F12
- a culture medium of the following composition: DMEM (or DMEM / F12) 450 ml, L-glutamine 292 mg, fetal bovine serum 50 ml, penicillin 100 U / ml, streptomycin 100 ⁇ g / ml, at 100% humidity, 37 ° C, 5% CO 2 (this medium and conditions are used at all stages of subsequent cultivation).
- cells are removed from plastic vials with trypsin / EDTA.
- the resulting cell suspension is washed from trypsin / EDTA, including using DMEM medium with 10% serum, followed by centrifugation (10 minutes at 200g), the cell suspension is mixed with a suspension of 90-100 particles of crushed demineralized allogeneic bone (bone alloimplant) and transferred into 81-well agarose plates with a well diameter of 800 ⁇ m at a concentration of up to 1.6 million cells per plate, where one particle of bone usually falls into the well, and approximately equal numbers of cultured bone marrow cells , inside the agarose wells, spheroids begin to form, in the center of which there is a particle of allogeneic bone.
- bone alloimplant crushed demineralized allogeneic bone
- a suspension of live cultured cells mixed with a suspension of crushed partially demineralized allogeneic bone matrix is poured into the well.
- a tissue spheroid is formed from cells and a newly synthesized extracellular matrix, in the central part of which there is a particle of demineralized bone matrix - bone alloimplant "Perfoost" crushed in a ball mill.
- Cells and re the matrix formed by the cells surround the bone particle and form a tissue-engineered construct resistant to external mechanical influences - micro tissue formed in the GE-culture of MMSC BM with a piece of crushed bone alloimplant in the center.
- the sedimentation of cells and bone particles from suspensions occurs under the action of gravitational forces under the conditions of three-dimensional cultivation and with a possible short rocking of the culture dishes.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, пластической хирургии, стоматологии, травматологии и ортопедии и состоит в разработке нового способа получения трансплантата в виде тканевых сфероидов из аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга субъекта с фрагментом измельченной частично деминерализованной аллогенной кости в центре этой тканеинженерной конструкции, обладающих выраженным регенерационным потенциалом и остеиндуктивными свойствами, для эффективного восстановления кости.
Description
БИОКОМПОЗИТНЫЙ СФЕРОИД ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОСТЕЙ
Область техники
Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, реге- неративной медицине, пластической хирургии, стоматологии, травматологии и ортопедии.
Уровень техники
Одной из актуальных проблем медицины является костная регенерация, особый практический интерес представляют дефекты костей превышающие критические размеры - это тот объем утраченной ткани, который организм человека не способен самостоятельно регенерировать. Трансплантация костной ткани или костнопластических материалов стоит на втором месте после переливания крови. Регенерация по трансплантату или костнопла- стическому материалу является длительным процессом, растягивающимся на многие ме- сяцы и годы, требующим длительной и болезненной стабилизации костных отломков, ча- сто иммобилизации конечности, для восстановления функций поврежденной части опорно- двигательного аппарата требуется много времени и далеко не всегда удается добиться полной реабилитации и избежать инвалидизации пациента.
Одной из стратегий клеточной терапии является использование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга или собственных стромальных клеток костного мозга. Человеческие клетки относительно легко получить из аспирата костного мозга, сама аспирация костного мозга - малотравматичное вмешательство, которое может производиться без разрезов и под местной анестезией. Эти клетки относительно легко раз- множаются в культуре в условиях, при которых они сохраняют возможность к дифферен- цировке в клеточные линии, состоящие из остеобластов, адипоцитов, хондробластов. Од- ним из важнейших условий экспансии этих клеток является быстрая пролиферация с мак- симальным сохранением своей мультипотентности - пассирование распластанных на дне флакона клеток в малой плотности монослоя. Известно, что несмотря на большой проли- феративный потенциал, клетки стромы костного мозга при культивировании в стандартных условиях, при использовании ксеногенных, в том числе фетальных сывороток, постепенно утрачивают свои пролиферативные способности и способности к дифференцировке прежде всего в адипоциты и хондроциты.
Клеточная терапия при костной патологии предлагает персонифицированное лече- ние для устранения дефектов скелетных тканей, возникающих в результате травм, неэф- фекгивного заживления повреждений или врожденных дефектов. Тем не менее, большин- ство методов клеточной терапии достигли ограниченного успеха на сегодняшний день. Обычно вводимые в растворе в виде монодисперсных клеток (суспензии), трансплантиро- ванные клетки быстро гибнут или недостаточно долго задерживаются в месте трансплан- тации, иногда мигрируя в окружающие мягкие ткани, поэтому их предполагаемые эффекты ограничиваются несколькими днями.
Для систем открытой трансплантации стромальных клеток костного мозга (СККМ) необходимым компонентом успешного остеогенеза является использование транспланта- ционного носителя и его определенные характеристики. Точно установлено, что остеогенез не происходит при инъецировании суспензии костного мозга подкожно и внутримышечно и при имплантации ММСК КМ (мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток кост- ного мозга) в виде агрегатов клеток без носителя (Goshima J, Goldberg VM, Caplan Al (1991). The osteogenic potential of culture expanded rat marrow mesenchymal cells assayed in vivo in calcium phosphate ceramic blocks. Clin Orthop 262:298-311. Yoshikawa T, Ohgushi H, Tamai S (1996). Immediate bone forming capability of prefabricated osteogenic hydroxyapatite. I Biomed Mater Res 32:481-492).
Крайне важно, для образования кости трансплантированным СККМ требуется нали- чие организованного субстрата, с которым они могут взаимодействовать - прикрепляться и пролиферировать в течение достаточно длительного периода для обеспечения диффе- ренцировки и остеогенеза. Подчеркнем, что для успешного формирования кости из культи- вированных стромальных клеток костного мозга, необходимо обеспечить контакт с носите- лем - деминерализованным костным матриксом или кристаллами гидроксиаппатита не ме- нее нескольких недель, чтобы обеспечить адекватное распространение и дифференциа- цию необходимую для начала остеогенеза. Из используемых на сегодня носителей для трансплантации СККМ наиболее успешными оказались конструкции на основе гидрокси- апатита (Krebsbach PH, Kuznetsov SA, Robey BP, Robey PG Bone Marrow Stromal Cells: Characterization and Clinical Application // Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. - 1999. - V. 10, N. 2. - p. 165-181).
Функции мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, изучаются в сформи- рованных из них сфероидах (C.S. Ong, X. Zhou, J. Han, C.Y. Huang, A. Nashed, S. Khatri, G. Mattson, T. Fukunishi, H. Zhang, N. Hibino, In vivo therapeutic applications of cell spheroids, Biotechnol Adv 36(2) (2018) 494-505).
Эти клетки обычно культивируют в остеогенных или хондрогенных средах, когда же- лательно нарастить массу остеобластов или хондроцитов для восстановления костной или хрящевой тканей. Есть мнение, что культивирование в условиях гипоксии увеличивает вы- живаемость и приживление сфероидов при пересадке реципиенту, что приводит к более эффективному остеогенезу (S.S. Но, В.Р. Hung, N. Heyrani, М.А. Lee, J.K. Leach, Hypoxic preconditioning of mesenchymal stem cells with subsequent spheroid formation accelerates repair of segmental bone defects, Stem Cells 36(9) (2018) 1393-1403).
После агрегации клеток в сфероиды часто используются добавки в питательные среды для 3D культур - различные цитокины или индукторы дифференцировки в течение продолжительного периода времени культивирования для получения и последующей трансплантации сфероидов, состоящих из дифференцированных клеток. Клетки внутри сфероидов демонстрируют больший остеогенный потенциал, по сравнению с индукцией
органотипических признаков у клеток 2D однослойных культуры и только с последующим образованием из них сфероидов (S.S. Но, А.Т. Keown, В. Addison, J.K. Leach, Cell migration and bone formation from mesenchymal stem cell spheroids in alginate hydrogels are regulated by adhesive ligand density, Biomacromolecules 18(12) (2017) 4331-4340.]. В этом примере сфероиды выращивались следующим способом. МСК индуцировали остеогенно либо в мо- нослое, либо в виде сфероидов. Для индукции монослоя, МСК были высеяны в количестве 5000 клеток/см2 в колбах с культурой и поддерживались в остеогенных средах (среды ро- ста, содержащие стандартные остеогенные добавки 10 мМ бета-глицерофосфат, 50 мкм г/мл аскорбат-2-фосфат, и 100 нМа дексаметазон) в течение 12 дней. Затем МСК были трипсинизированы и сформированы в сфероиды из 15000 МСК в остеогенной среде с ис- пользованием метода принудительной агрегации. Планшеты выдерживали в неподвижном состоянии в стандартном инкубаторе в течение 48 часов, чтобы обеспечить агрегацию кле- ток в сфероиды. Для индукции костных признаков МСК сначала формировали в сфероиды в остеогенной среде и переносили в 6-луночные планшеты, содержащие 2 мл 1,5% ага- розы, для предотвращения адгезии к пластику для тканевых культур. Сфероиды культиви- ровали в остеогенной среде в течение дополнительных 12 дней, в результате чего общий период остеоиндукции составлял 14 дней для обоих состояний. Однако, у описанного ме- тода биофабрикации сфероидов есть целый ряд недостатков. Во-первых, более крупные растворимые молекулы, такие как факторы роста, не проникают равномерно через весь сфероид из-за радиальных различий в клеточном фенотипе и накоплении внеклеточного матрикса, что приводит к неравномерной дифференцировке клеток в составе сфероида. Во-вторых, после того, как сфероиды удалены из питательных сред, в составе которых эти цитокины, костный фенотип теряется в течение нескольких дней.
Для устранения этих недостатков в состав сфероидов включали микрочастицы, нагруженные факторами роста, которые постепенно выделяются в межклеточную среду. Чтобы решить эту проблему, была разработана система доставки факторов роста на ос- нове микрочастиц для обеспечения эндохондрального окостенения в агрегатах мезенхи- мальных стволовых клеток (hMSC), полученных из костного мозга человека. Постепенное высвобождение растворимых трансформирующего фактора роста-bΐ (TGF-bI) и костного морфогенетического белка-2 (ВМР-2) из микрочастиц при различных определенных вре- менных параметрах приводил к различным степеням выраженности хондрогенеза и остео- генеза, что доказывалось изменением содержания специфическим для хряща гликозами- ногликаном и кальция - для костной ткани. Время, в течение которого лучше всего индуци- ровалась эндохондральная оссификация, использовалось для разработки системы контро- лируемой доставки на основе микрочастиц для TGF-bI и ВМР-2. Желатиновые микроча- стицы, способные к относительно быстрому высвобождению TGF-bI, и микрочастицы гид- роксиапатита с минеральным покрытием, обеспечивающие более длительное высвобож- дение ВМР-2, затем включали в агрегаты человеческих МСК и культивировали в течение 5
недель после заранее определенного временного курса для последовательного действия этих цитокинов. По сравнению с клетками в 2D культуре, сфероидами, обработанные экзо- генными факторами роста, сфероиды с включенными в них микрочастицами, нагружен- ными TGF-bI и ЕЗМР-2, демонстрировали усиление хондрогенеза и активность щелочной фосфатазы на второй неделе и большую степень минерализации к пятой неделе. Для под- тверждения признаков костной и хрящевой ткани осуществляли окрашивание для колла- гена типов I и II, остеопонтин и остеокальцин доказали наличие хряща и кости. Эта система, включенная в микрочастицы, имеет потенциал в качестве легко имплантируемой терапии для заживления дефектов кости без необходимости длительного хондрогенного праймиро- вания in vitro (Dang PN, Dwivedi N, Phillips LM, Yu X, Herberg S, Bowernnan C, Solorio LD, Murphy WL, Alsberg E. Controlled Dual Growth Factor Delivery From Microparticles Incorporated Within Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell Aggregates for Enhanced Bone Tissue Engineering via Endochondral Ossification. Stem Cells Translational Medicine, 23 Dec 2015, 5(2):206-217).
Чтобы продлить остеогенную дифференцировку, адсорбировали рекомбинантный человеческий костный морфогенетический белок-2 (ВМР-2) на наночастицах гидроксиапа- тита (НАр) и включили их в сфероиды. В этих условиях сфероиды проявляли более про- странственно однородную остеогенную дифференцировку по всему сфероиду и сохраняли их дифференцировку после удаления растворимых сигналов [J. Whitehead, А. Kothambawala, J. Kent Leach, Morphogen delivery by osteoconductive nanoparticles instructs stromal cell spheroid phenotype, Advanced Biosystems 0(0) (2019) 1900141].
Известно также, что загружали биоминерализованные полимерные микрочастицы адсорбированным ВМР-2, чтобы стимулировать остеогенную дифференцировку, или мик- рочастицы, нагружали TGF-1 , чтобы способствовать формированию хрящевого фенотипа. Включение биоматериалов в сфероиды является перспективным методом для равномер- ного и постоянного действия дифференцирующих факторов на клетки в составе сферои- дов (P.N. Dang, N. Dwivedi, L.M. Phillips, X.H. Yu, S. Herberg, C. Bowerman, L.D. Solorio, W.L. Murphy, E. Alsberg, Controlled dual growth factor delivery from microparticles incorporated within human bone marrow-derived mesenchymal stem cell aggregates for enhanced bone tissue engineering via endochondral ossification, Stem Cell Transl Med 5(2) (2016) 206-217).
Еще одной важной тенденцией в последнее десятилетие стало фокусирование вни- мания иммуномодуляции взаимодействий биоматериал-хозяин, что имеет решающее зна- чение для повышения эффективности костнопластических материалов. Если оставить не- модулированные воспалительные реакции, определяющие свойства межклеточной среды хозяина (локальная среда регенерации), обычно инициируется каскад клеточных и ткане- вых реакций, приводящих к местным реакциям на инородное тело, которые проявляются как воспаление, образование гигантских клеток, фиброз и, в, конечном итоге, подвергаются полному рассасыванию костнопластических материалов раньше, чем они успеют проявить
свои остеоиндуктивные и остеокондуктивные свойства, иногда наблюдается и поврежде- ние окружающих тканей хозяина.
Текущие ограничения для клинического использования сфероидов включают выбор источника клеток, есть две широкие категории: аллогенные или аутологичные. Аллогенные клетки являются предпочтительными, когда необходимо большое количество клеток, и предполагается воздействие на иммунный ответ организма реципиента. Использование аллогенных клеток является наиболее подходящим, если технология подготовки клеточ- ного материала включает значительные манипуляции с клетками ex vivo, что позволяет тратить много времени на подготовку конструкции. Подобно анализу донорской крови в банках крови, коллекции аллогенных клеток могут быть хорошо охарактеризованы, диффе- ренцированы и отсортированы по назначенным клиническим применениям на основании их способности кдифференцировке и регенерации. Тем не менее, вероятность отторжения тканеинженерной конструкции, даже при тщательном подборе совместимого донора, до- вольно высока, и объем финансовых затрат, связанных с длительной подготовкой транс- плантата ex vivo, потенциально является чрезмерно дорогостоящим в крупном масштабе. С другой стороны, источники аутологичных клеток сталкиваются со многими из тех же огра- ничений, что и современные методы клеточной терапии, такие как ограниченный объем забора собственного материала (ограниченные собственные донорские ресурсы аутоло- гичных тканей), боль и болезненность в донорских местах, а также увеличение времени и затрат, связанных с подготовкой клеточного материала или конструктов в тканеинженер- ных лабораториях ex vivo. Тем не менее, улучшения технологий забора клеток, их экспан- сии и формирования сфероидов плюс применение технологий искусственного изменения локальной среды регенерации in situ могут иметь решающее значение, позволяя более эф- фективно использовать аутологичные клетки для сборки достаточного количества сферо- идов, пригодных для клинического использования.
Таким образом, несмотря на имеющиеся способы восстановления костей, все они характеризуются рядом недостатков и ограничений, а также остается много препятствий, связанных с производством и трансплантацией сфероидов, поэтому сохраняется необхо- димость в разработке и создании новых способов и подходов к решению указанных про- блем.
Раскрытие изобретения
Задача настоящего изобретения состоит в разработке нового трансплантата на ос- нове клеточных сфероидов для эффективного восстановления костей и способа получения указанного трансплантата.
Техническим результатом данного изобретения является разработка и получение трансплантата для эффективного восстановления костей на основе клеточных сфероидов, обладающих выраженным регенеративным потенциалом и характеризующихся наличием
костного матрикса с остеиндукционными свойствами. При этом получение сфероидов в не- адгезивных агарозных лунках осуществляют из смеси измельченной деминерализованной кости и суспензии культуры клеток (аутологичных мультипотентных стромальных клеток костного мозга), в результате частица деминирализованной кости упаковывается внутрь образованного сфероида. В агарозной лунке (лунка 800 мкм диаметром, глубиной 2000 мкм в микроформованном агарозном геле) суспензия клеток устойчиво формирует «оболочку» из клеток и синтезированного ими внеклеточного матрикса, которая как бы упаковывает внутри кусочек деминерализованного костного матрикса. Вне агарозной лунки такого раз- мера сформировать такой конструкт невозможно.
Технический результат настоящего изобретения заключается также в том, что спо- соб по изобретению исключает необходимость использования любых дифференцирующих сред, замедляющих наращивание клеточной биомассы. Кроме того, настоящее изобрете- ние обеспечивает снижение травматичности субъекта, забор костного мозга субъекта про- водится путем пункции и аспирации костного мозга в амбулаторных условиях под местной анестезией.
Дополнительно, способ по изобретению позволяет получить сфероиды из мульти- потентных стромальных клеток костного мозга достаточно быстро. При образовании сфе- роида большая часть его центра представлена частицей костного матрикса (измельченной деминерализованной кости человека). Клетки костного мозга согласно способу по изобре- тению за 3-7 суток не только окружают частицу кости, но и образуют собственный матрикс, образующий кокон из волокон, удерживающий клетки на фрагменте деминерализованного аллогенного костного матрикса. Репаративная регенерация кости у реципиента происходит за счет внесенных источников регенерации, остеоиндуктивных материалов с большой удельной поверхностью (измельченная кость), защищенных от реакций на инородное тело. Такой трансплантат стимулирует также еще один способ регенерации кости - транспланта- ционную регенерацию кости. Собственные ткани реципиента активируются и более интен- сивно врастают в трансплантат, включая сосуды и нервные волокна.
Достижение указанного технического результата обеспечивается при осуществле- нии способа получения трансплантата на основе клеточных сфероидов для восстановле- ния кости субъекта на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромаль- ных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной аллогенной ко- сти, включающий следующие этапы: а) выделение клеток из собственного костного мозга субъекта; б) культивирование выделенных на стадии а) клеток в адгезивной культуре в пита- тельной культуральной среде без индукторов дифференцировки; в) получение частично деминерализованных частиц аллогенной кости; г) перенесение клеток, полученных на стадии б), и частиц частично деминерализо- ванной кости, полученной на стадии в), в лунки агарозного планшета;
д) агрегация клеток вокруг частиц деминерализованной аллогенной кости в биоком- позитсодержащие клеточные сфероиды.
В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой чело- века.
В частных вариантах воплощения изобретения культивирование клеток на стадии б) осуществляется в течение 20-30 дней. В частных вариантах воплощения изобретения перенесение клеток на стадии г) осуществляется из расчета 8000-12000 клеток на 1 лунку агарозного планшета.
В частных вариантах воплощения изобретения размер сфероидов составляет 250 до 600 мкм.
В частных вариантах воплощения изобретения диаметр частиц частично деминера- лизованной аллогенной кости составляет от 50 до 250 мкм.
В частных вариантах воплощения изобретения культуральная питательная среда представляет собой среду на основе ксеногенных сывороток животных, среду на основе аутологичной и аллогенной сывороток человека тромболизатов крови человека, бес- сывороточную среду и/или синтетическую среду, дополнительна среда может включать добавки для выращивания клеток.
В частных вариантах воплощения изобретения агрегация клеток в клеточные сфе- роиды вокруг фрагмента деминерализованной кости осуществляется в агарозных лунках, где клетки в виде клеточных агрегатов пребывают до 8 дня.
В частных вариантах воплощения изобретения степень деминерализации аллоген- ной кости составляет не более 30 %.
Настоящее изобретение также относится к трансплантату для восстановления кости субъекта, включающему клеточные сфероиды на основе культивированных аутологичных мультипотентных стромальных клеток костного мозга субъекта, содержащие частицы из- мельченной аллогенной деминерализованной кости, и полученных способом по изобрете- нию.
В частных вариантах воплощения изобретения степень деминерализации аллоген- ной кости составляет не более 30 %, более конкретно 10 - 30 %.
В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой чело- века.
В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат включает сфероиды с размером 250 до 600 мкм.
В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат включает сфероиды, содержащие частицы аллогенной деминерализованной кости с диаметром от 50 до 250 км.
В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат включает дополни- тельный компонент, в частности, альгинатный гель с индукторами остеогенеза.
Технический результат настоящего изобретения также достигается за счет приме- нения аутологичных мульти потентных стромальных клеток костного мозга и кусочков из- мельченной аллогенной деминерализованной кости субъекта для получения трансплан- тата в виде биокомпозитных клеточных сфероидов.
Краткое описание чертежей.
Фигура 1. Микрофотография гистологического среза биокомпозитного сфероида по изобретению (окраска по Маллори). В центре фрагмент деминерализованной аллокости, вокруг микроткань, сформированная ММСК КМ.
Определение и термины
Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, использу- ются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое зна- чение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, исполь- зуемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, вклю- чая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специа- листам.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интер- претируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
В описании данного изобретения термин «ткань» относится к системе клеток и неклеточных структур, обладающих общностью строения, в ряде случаев общностью происхождения, и специализированные на выполнении определенных функций.
Адгезивная культура - клеточная культура, состоящая из пластик-адгезивных клеток, способных посредством своих рецепторов прикрепляться к культуральному пластику или стеклу.
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) костного мозга — мультипотентные клетки мезодермального происхождения в костном мозге взрослого организма, способные дифференцироваться в несколько типов клеток со- единительной ткани - остеобласты (клетки костной ткани), хондроциты и адипоциты.
Используемый в данном документе термин «дефект» относится к костной ткани, если она отсутствует, уменьшено ее количество или она иначе повреждена. Дефект костей может быть результатом заболевания, лечения заболевания или травмы.
Термин «среда» относится к питательной культуральной среде, предназначен- ной для культивирования сфероидов по изобретению, к примеру среда может быть выбрана из сред на основе ксеногенных сывороток животных, аутологичной и
аллогенной сывороток человека тромболизатов крови человека, различных бессыво- роточных коммерческих сред.
Используемый в данной заявке термин «трансплантат» относится к сферои- дам, а термин «трансплантация» — это процесс пересадки указанных сфероидов в организм субъекта, как правило, для устранения дефекта кости.
Используемый в данной заявке термин «сфероиды» относится к плотно упако- ванным клеточным агрегатам шарообразной формы, сформированных путем трехмер- ного культивирования. Их важным свойством является способность к взаимной адге- зии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внекпеточ- ного матрикса реципиента. Тканевые (клеточные) сфероиды имеют тканеподобное строение - часто называют трехмерными микротканями, максимизирующими межкпе- точные взаимодействия.
Трансплантат по изобретению включает сфероиды из аутологичных мультипотент- ных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, полученные согласно способу по изобретения, наряду с этим трансплантат опционально включает, по меньшей мере, один дополнительны компонент. Так, в частности, таким компонентом может быть альгинатный гель или гель на основе гиалуроновой кислоты (указанный гель может быть получен, в частности, способом описанным в Molly М. Stevens, Robert Р. Marini et al/ In vivo engineering of organs: The bone bioreactor/ PNAS August 9, 2005 102 (32) 11450-11455; https://doi.ora/10.1073/pnas.0504705102). В частности, гелеобразование может быть иници- ировано путем смешивания 2% (вес/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCI и 10 мМ KCI, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ СаСЬ в 10 мМ Hepes, содержащего 150 мМ NaCI и 10 мМ KCI с использованием стерильного Y-образного смесителя. Гель отверждается в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 МПа. В состав геля может быть добавлены факторы роста (TGF-bI и FGF-2, R & D Systems), включены в состав в концентрации 10 нг/мл. В частных вариантах, гель на ос- нове ГК, НА (Genzyme) химически модифицировали так, чтобы он содержал альдегидные группы (HA-ALD) путем реакции с перйодатом натрия и гидразидными группами (HA-ADH) путем взаимодействия с адипиновым дигидразидом. Гидрогели ГА получают смешиванием равных объемов 2% (мас./об.) водных растворов HA-ALD и HA-ADH. Сурамин (Вауег, Ле- веркузен, Германия) включают в количестве (0,4 моль/литр) во время гелеобразования. Кроме того, трансплантат, может содержать физиологически приемлемый носитель, кото- рый, в частности, представляет собой Ham's F12 культуральная среда, базовая, CLS. В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат может содержать комплекс NCTF® (компания LABORATOIRES FILORGA).
«Композиты» — это материалы-конструкции, они конструируются из двух, трех или более материалов, обладающих различными свойствами и достаточно надежно
соединенных друг с другом, чтобы обеспечить работу полученной системы как единого целого. Биокомпозиты - это конструкции, созданные природой.
«Кость» — орган опорно-двигательного аппарата, построенный преимущественно из костной ткани. Кость с позиции материаловедения - это биокомпозит или полимерный композит. Исследованиями их свойств интенсивно занимаются специалисты в области ком- позитов. Известно, что костная ткань содержит три основных компонента — минеральное вещество гидроксилапатит (~70 %), органическое вещество на основе белка коллагена (~20 %) и воду (~10 %).
Частицы деминерализованной кости по изобретению, в частности, представляют со- бой костнопластический материал Перфоост.
Добавка к питательной среде - это продукт, который используется для оптимизации базовых рецептур сред, а именно для поддержания роста и дифференцировки различных стволовых клеток и клеток-предшественников, а также первичных клеток, или для диффе- ренцировки клеток в определенном направлении.
Синтетическая среда — культуральная питательная среда, которую готовят из определённых химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дважды дистиллированной воде.
Подробное раскрытие изобретение
Сфероиды, которые представляют собой плотные трехмерные клеточные агрегаты, усиливают известные полезные эффекты клеточной терапии, при этом увеличивая и про- длевая время передачи сигналов от клетки к клетке и клеточному матриксу. Сфероиды из мультипотентных стромальных клеток костного мозга не только демонстрируют свою по- вышенную выживаемость, даже в центре многоклеточных агрегатов, но и важно, что при этом сохраняют остеогенные потенции, а также продуцируют обширный набор секретиру- емых белков, которые способствуют ангиогенезу, снижают воспаление, активируют и при- влекают собственные - эндогенные клетки реципиента для участия в костной регенерации.
Важно отметить, что сохранение внеклеточного матрикса в тканевых сфероидах яв- ляется критическим условием для успешной и пролонгируемой выживаемости клеток в су- ровых условиях посттрансплантационного приживления в организме реципиента, клетки в сфероиде более длительно сохраняют способность к секреции трофических факторов, по сравнению с диссоциированными клетками. Благодаря наличию собственного внеклеточ- ного матрикса, а также частице деминерализованной аллогенной кости внутри сфероида и улучшенным межклеточным взаимодействиям, сфероиды при трансплантации создают ло- кальное микроокружение, благоприятное для органотипической регенерации кости.
В качестве источника остеогенных клеток для производства сфероидов согласно настоящему изобретению используется костный мозг самого пациента, который является источником мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. При
этом, в настоящем изобретении биоматериал, то есть частицы деминерализованной кости субъекта, заключены в оболочку из собственных клеток, то есть мультипотентных мезен- химальных стромальных клеток костного мозга. С одной стороны клетки биокомпозитного сфероида взаимодействую с индуктором их дифференцировки, с другой защищают био- композит - аллогенную кость от быстрого лизиса, реакции организма на инородное тело.
Суспензия частиц измельченной аллогенной деминерализованной кости получали путем измельчения готовых деминерализованных костных блоков, подготовленных для клинического применения в виде костных блоков - костнопластического материала.
Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) осуществляют следующим образом. ММСК КМ были вы- делены из заднего подвздошного гребня здоровых мужчин-доноров (43 ± 5 лет) путем пунк- ции аспирационной иглы и аспирации 25 мл костного мозга в шприц-контейнер. Аспират промывали модифицированной Дульбекко средой Игла с низким содержанием глюкозы с 10% предварительно протестированной фетальной бычьей сывороткой. Мононуклеарные клетки выделяли с использованием градиента плотности Percoll (Sigma-Aldrich), высевали на пластик для тканевой культуры с плотностью 1,8 c 105 клеток на см2 в среде, содержа- щей 10 нг/мл фактора роста фибробластов-2, и культивировали при 37°С с 5% СОг. Неад- гезивные клетки удаляли при смене культуральной среды через 4 дня. Адгезивные клетки, первичные ММСК КМ, культивировали в течение еще 10-14 дней со сменой среды каждые 3 дня. Затем их повторно высевали при 4x103 клеток на см2 и расширяли до 3-го пассажа: высевали в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пе- нициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, 5% СОг (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирова- ния).
После третьего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200д), кле- точную суспензию смешивают с суспензией из 90 частиц измельченной деминерализован- ной аллогенной кости и переносят в 81 -луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,6 млн клеток на планшет, где в лунку как правило попадает одна частица кости, и приблизительно равные количества культивированных клеток кост- ного мозга, внутри агарозных лунок начинают формироваться сфероиды, в центре которых оказывается частица аллогенной кости.
Из культивированных аутологичных или аллогенных живых клеток костного мозга (мультипотентные стромальные клетки костного мозга) в условиях 3D культивирования внутри агарозных лунок диаметром 800 мкм формируются клеточные сфероиды
диаметром от 250 до 600 мкм, причем в центре формирующегося сфероида оказывается частица измельченного деминерализованного костного матрикса диаметром от 50 до 250 мкм.
В лунку заливается суспензия живых культивированных клеток в смеси с суспензией измельченного частично деминерализованного аллогенного костного матрикса. В течение 3-7 суток в агарозной лунке в условиях трехмерного культивирования формируется ткане- вой сфероид из клеток и вновь синтезированного внеклеточного матрикса, в центральной части которого расположена частица деминерализованного костного матрикса. Клетки и матрикс окружают частицу кости и образуют тканеинженерный конструкт, устойчивый к ме- ханическим воздействиям. Осаждение клеток и костных частиц из суспензий происходит под действием сил гравитации в условиях трехмерного культивирования и при возможном недолгом покачивании культуральных чашек.
Следует отметить, что при таком способе культивирования внутри лунок происходит увеличение биомассы сфероидов за счет как клеточной пролиферации, так и синтеза но- вого внеклеточного матрикса. Поэтому более уместно говорить не о клеточном, а о ткане- вом сфероиде в этом случае, хотя часто клеточный и тканевой сфероид употребляются как синоним. Обычно в центральной части сфероида наблюдаются дистрофия, а иногда и апоптоз клеток. Измельченная кость замещает эту неблагоприятную зону, и является есте- ственным остеоиндукгором.
Благодаря дополнительному объему измельченных фрагментов аллогенной кости удается быстрее получить желаемые объемы пересаживаемого биоматериала и массы сфероидов - строительных блоков, которые могут быть использованы в виде биочернил для биопечати, либо, как трансплантат, несущий костнопластический материал для вос- становления костных дефектов, проявления остеоиндукции, стимуляции репаративного остеогенеза и эффективного наращивания объема костной ткани при трансплантации in vivo.
Масса таких сфероидов может инициировать регенерацию собственных тканей и органов реципиента по типу трансплантационной регенерации, формируя живой каркас для ускоренной регенерации сосудов, нервов и собственных регенерирующих тканей ре- ципиента.
Сфероидов пребывают в лунках на протяжении до 8 суток со сменой среды каждые 2-3 дня.
Для трансплантации сфероидов их собирают из планшетов и переносят в пробирку, где они осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования. После этого сферо- иды помещают в шприц и трансплантируют субъекту в зону дефекта через иглу или аппли- катор, диаметром не менее 1 мм2. Трансплантация может производиться эндоскопически.
Примеры осуществление изобретения
Пример 1.
У пациента из гребня подвздошной кости под местной анестезией путем прокола аспирационной иглой кортикальной пластики кости из губчатового вещества было аспири- ровано 25 мл костного мозга. Забранный материал в стерильном шприце передавался в клеточную лабораторию. Аспират промывали модифицированной Дульбекко средой Игла с низким содержанием глюкозы с 10% предварительно протестированной фетальной бы- чьей сывороткой. Мононуклеарные клетки выделяли с использованием градиента плотно- сти Percoll (Sigma-Aldrich), высевали на пластик для тканевой культуры с плотностью 1,8 c 105 клеток на см2 в среде, содержащей 10 нг/мл фактора роста фибробластов-2, и культи- вировали при 37°С с 5% СОг. Неадгезивные клетки удаляли при смене культуральной среды через 4 дня. Адгезивные клетки, первичные ММСК КМ, культивировали в течение еще 10-14 дней со сменой среды каждые 3 дня. Затем их повторно высевали при 4x103 клеток на см2 и расширяли до 3-го пассажа: высевали в пластиковые флаконы с культу- ральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, 5% С02 (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования).
После третьего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200д), кле- точную суспензию смешивают с суспензией из 90-100 частиц измельченной деминерали- зованной аллогенной кости (костного аллоимплантанта) и переносят в 81-луночные ага- розные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,6 млн клеток на план- шет, где в лунку как правило попадает одна частица кости, и приблизительно равные коли- чества культивированных клеток костного мозга, внутри агарозных лунок начинают форми- роваться сфероиды, в центре которых оказывается частица аллогенной кости.
Из культивированных аутологичных или аллогенных живых клеток костного мозга (мультипотентные стромальные клетки костного мозга) человека в условиях 3D культиви- рования внутри лунок в Микроформованном агарозном геле диаметром 800 мкм и глубиной 2000 мкм формируются клеточные сфероиды диаметром 500 мкм, причем в центре фор- мирующегося сфероида оказывается частица измельченного деминерализованного кост- ного матрикса диаметром 250 мкм (Фигура 1).
В лунку заливается суспензия живых культивированных клеток в смеси с суспензией измельченного частично деминерализованного аллогенного костного матрикса. В течение 3-7 суток в агарозной лунке в условиях трехмерного культивирования формируется ткане- вой сфероид из клеток и вновь синтезированного внеклеточного матрикса, в центральной части которого расположена частица деминерализованного костного матрикса - измель- ченного в шаровой мельнице костного аллоимплантанта «Перфоост». Клетки и вновь
образованный клетками матрикс окружают частицу кости и образуют тканеинженерный конструкт, устойчивый к внешним механическим воздействиям - микроткань образованную в ЗЭ-культуре ММСК КМ с кусочком измельченного костного аллоимплантанта в центре. Осаждение клеток и костных частиц из суспензий происходит под действием сил гравита- ции в условиях трехмерного культивирования и при возможном недолгом покачивании культуральных чашек.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоя- щего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных моди- фикаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Claims
1. Способ получения трансплантата на основе клеточных сфероидов для вос- становления кости субъекта на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной алло- генной кости, включающий следующие этапы: а) выделение клеток из собственного костного мозга субъекта; б) культивирование выделенных на стадии а) клеток в адгезивной культуре в пита- тельной культуральной среде без индукторов дифференцировки; в) получение частично деминерализованных частиц аллогенной кости; г) перенесение клеток, полученных на стадии б), и частиц частично деминерализо- ванной кости, полученной на стадии в), в лунки агарозного планшета; д) агрегация клеток вокруг частиц деминерализованной аллогенной кости в биоком- позитсодержащие клеточные сфероиды.
2. Способ по п.1 , в котором субъект представляет собой человека.
3. Способ по п.1 , в котором культивирование клеток на стадии б) осуществля- ется в течение 20-30 дней.
4. Способ по п.1 , в котором перенесение клеток на стадии г) осуществляется из расчета 8 000-12000 клеток на 1 лунку агарозного планшета.
5. Способ по п.1 , в котором размер сфероидов составляет 250 до 600 мкм.
6. Способ по п.1, в котором диаметр частиц частично деминерализованной ал- логенной кости составляет от 50 до 250 мкм.
7. Способ по п.1 , в котором культуральная питательная среда представляет со- бой среду на основе ксеногенных сывороток животных, среду на основе аутологичной и аллогенной сывороток человека тромболизатов крови человека, бессывороточную среду и/или синтетическую среду.
8. Способ по п.1 , в котором агрегация клеток в сфероиды вокруг фрагмента де- минерализованной кости осуществляется в агарозных лунках, где клетки в виде клеточных агрегатов пребывают до 8 дней.
9. Способ по п.1 , в котором степень деминерализации аллогенной кости состав- ляет не более 30 %.
10. Трансплантат для восстановления кости субъекта, включающий сфероиды на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга субъекта, содержащие частицы частично деминерализованной аллогенной кости, и полученный способом по п.1.
11. Т рансплантат по п.10, в котором степень деминерализации аллогенной кости составляет не более 30 %.
12. Трансплантат по п.10, в котором субъект представляет собой человека.
13. Трансплантат по п.10, в котором размер сфероидов составляет 250 до 600 мкм.
14. Трансплантат по п.10, в котором диаметр частиц аллогенной деминерализо- ванной кости составляет от 50 до 250 мкм.
15. Трансплантат по п.10, который дополнительно включает альгинатный гель с индукторами остеогенеза.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2020/000264 WO2021246893A1 (ru) | 2020-06-03 | 2020-06-03 | Биокомпозитный сфероид для восстановления костей |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2020/000264 WO2021246893A1 (ru) | 2020-06-03 | 2020-06-03 | Биокомпозитный сфероид для восстановления костей |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2021246893A1 true WO2021246893A1 (ru) | 2021-12-09 |
Family
ID=78831284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2020/000264 WO2021246893A1 (ru) | 2020-06-03 | 2020-06-03 | Биокомпозитный сфероид для восстановления костей |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2021246893A1 (ru) |
-
2020
- 2020-06-03 WO PCT/RU2020/000264 patent/WO2021246893A1/ru active Application Filing
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| YUICHIRO YAMAGUCHI;JUN OHNO;AYAKO SATO;HIROFUMI KIDO;TADAO FUKUSHIMA: "Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential", BMC BIOTECHNOLOGY, BIOMED CENTRAL LTD, vol. 14, no. 1, 6 December 2014 (2014-12-06), pages 105, XP021209785, ISSN: 1472-6750, DOI: 10.1186/s12896-014-0105-9 * |
| ZOE CESARZ, KENICHI TAMAMA: "Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells", STEM CELLS INTERNATIONAL, HINDAWI PUBLISHING CORPORATION, US, vol. 2016, 1 January 2016 (2016-01-01), US , pages 1 - 11, XP055341539, ISSN: 1687-966X, DOI: 10.1155/2016/9176357 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bunpetch et al. | Strategies for MSC expansion and MSC-based microtissue for bone regeneration | |
| Przekora | The summary of the most important cell-biomaterial interactions that need to be considered during in vitro biocompatibility testing of bone scaffolds for tissue engineering applications | |
| Annamalai et al. | Injectable osteogenic microtissues containing mesenchymal stromal cells conformally fill and repair critical-size defects | |
| Sordi et al. | Three-dimensional bioactive hydrogel-based scaffolds for bone regeneration in implant dentistry | |
| Yamada et al. | Bone regeneration following injection of mesenchymal stem cells and fibrin glue with a biodegradable scaffold | |
| Khaled et al. | Suppl 2: tissue engineering for bone production-stem cells, gene therapy and scaffolds | |
| Yoon et al. | Enhanced cartilage formation via three-dimensional cell engineering of human adipose-derived stem cells | |
| CN101448527B (zh) | 细胞-基质微球，制备方法和应用 | |
| US20070116680A1 (en) | Stem cells within gel microenvironments | |
| EP2606121B1 (en) | Compositions comrpising perivascular stem cells and nell-1 protein | |
| Zhao et al. | Osteogenic media and rhBMP-2-induced differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells encapsulated in alginate microbeads and integrated in an injectable calcium phosphate-chitosan fibrous scaffold | |
| Nae et al. | Human adipose-derived stem cells: definition, isolation, tissue-engineering applications | |
| Bicer et al. | Impact of 3D cell culture on bone regeneration potential of mesenchymal stromal cells | |
| CA2450720A1 (en) | In vivo bioreactors | |
| Li et al. | Biomimetic methacrylated gelatin hydrogel loaded with bone marrow mesenchymal stem cells for bone tissue regeneration | |
| Ishihara et al. | Biomaterials as cell carriers for augmentation of adipose tissue-derived stromal cell transplantation | |
| Nokhbatolfoghahaei et al. | Application of bioreactors to improve functionality of bone tissue engineering constructs: a systematic review | |
| KR100811537B1 (ko) | 지방조직 치료제의 조성, 이들 제조방법 및 그의 전달방법 | |
| Wang et al. | Exosomes and exosome composite scaffolds in periodontal tissue engineering | |
| Marijanovic et al. | Bioreactor-based bone tissue engineering | |
| CN114306732A (zh) | 一种促软骨修复水凝胶材料及其制备方法和应用 | |
| Eslaminejad et al. | Mesenchymal stem cell-based bone engineering for bone regeneration | |
| King et al. | Current applications of mesenchymal stem cells for tissue replacement in otolaryngology-head and neck surgery | |
| TW202134437A (zh) | 用於預防及治療組織疾病之基於ｍｉＲＮＡ之醫藥組成物及其用途 | |
| Martin et al. | Producing prefabricated tissues and organs via tissue engineering |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 20939072 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 20939072 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| 32PN | Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established |
Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 24.04.2023) |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 20939072 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |