WO2021191483A1 - Procedimiento para el nanorecubrimiento celular y su inmunoaislamiento - Google Patents

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WO2021191483A1
WO2021191483A1 PCT/ES2021/070202 ES2021070202W WO2021191483A1 WO 2021191483 A1 WO2021191483 A1 WO 2021191483A1 ES 2021070202 W ES2021070202 W ES 2021070202W WO 2021191483 A1 WO2021191483 A1 WO 2021191483A1
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elr
cells
elrs
cell adhesion
cell
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PCT/ES2021/070202
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French (fr)
Inventor
José Carlos RODRÍGUEZ CABELLO
Mª Carmen GARCÍA ARÉVALO
Riccardo Calafiore
Giuseppe BASTA
Ölle KORSGREN
Sofie INGVAST
Arturo IBÁÑEZ FONSECA
João MANO
Mariana OLIVEIRA
Original Assignee
Universidad De Valladolid
Universidade De Aveiro
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
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    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products

Definitions

  • the present invention falls within the field of cell therapy and the procedures for the generation of cell products used in said therapies.
  • the invention relates to a process for the nanocoating or nanoencapsulation of cells or cell groups, preferably of pancreatic islets or insulin-secreting ⁇ cells, which are to be subsequently transplanted into the body for the structural and / or functional repair of the cells. tissues.
  • Said nanocoating procedure based on the layer-by-layer technique and the use of modified elastin-type recombinamers, manages to immunoisolate the cells, which continue to be viable and functional, so that once implanted they can exert their function without triggering an immune response. by the recipient organism.
  • pancreatic islets including macro (hydrogels), micro (capsules) and nanoencapsulation (layers adhering to the cell membrane) systems, many of them used for the immunoisolation of islets.
  • pancreatic drugs for the treatment of diabetes Macroencapsulation consists, mainly, in embedding a large number of cells in reticular systems, such as hydrogels, and its main application is the administration of these cells in a specific tissue or organ to promote its regeneration, increasing the retention time of cells in that area by preventing their diffusion.
  • microencapsulation consists of containing cells in microparticles or microfibers created through the use of microfluidic systems or by micro-molding.
  • the small size of the microencapsulation systems improves, a priori, the diffusion of oxygen, nutrients and factors to the encapsulated cells. Its efficacy has been proven in the microencapsulation of different types of cells, including pancreatic islets, although there are major limitations, such as the poor stability of the biomaterials used or the lack of integration (vascularization) and biocompatibility of the same.
  • the most used method to coat cells is the “layer-by-layer” (LbL) or, in Spanish, layer by layer, (Richardson JJ, et al., 2016, Chemical Reviews, 116 (23): 14828-67).
  • this procedure consists of adding layers that interact with each other electrostatically.
  • polyelectrolytes polycations and polyanions
  • pancreatic islets for the treatment of diabetes (Krol S, et al., 2006, Nano Letters, 6 (9): 1933-9).
  • this system has not been tested in vivo and therefore its suitability in real application is unclear.
  • nanoencapsulation of other cell types has also been described, for example, mammalian cells in general, using the layer-by-layer technique with gelatin and PEG, demonstrating, for example, the protection of cells coated with this system against centrifugal force (Yang J, et al., 2017, Biomaterials, 133: 253-62).
  • this system can be used for applications such as coating of pancreatic islets for diabetes, due to its thickness, greater than 10 nm, which compromises the correct diffusion of factors from inside to outside the cell (in the case of insulin), and vice versa.
  • liver tissue in another example, it has been possible to obtain functional and vascularized liver tissue using the layer by layer technique, although in this case it is a complex system, using different cell types in the same culture to give rise to the final tissue, which can be implanted (Sasaki K, et al., 2017, Biomaterials, 133: 263-74).
  • this system has been introduced into immunosuppressed mice, so its effectiveness as an immunoisolation system has not been proven.
  • EP2737913B1 describes elastin-type recombinamers (ELRs) modified to comprise a cell adhesion sequence (RGD) and the amino acid lysine, which allows it to be modified to form covalent bonds between the ELR and a culture surface. previously functionalized cell.
  • ELRs elastin-type recombinamers
  • RGD cell adhesion sequence
  • amino acid lysine amino acid lysine
  • Rui R. Costa et al. They also generated coatings produced by the layer-by-layer technique based on chitosan bound to ELRs that also contained the RGD cell adhesion sequence. The cells thus adhere to the ELRs ⁇ RGD bound to chitosan which acts as a support (Rui R. Costa, et al., 2011, Small, 7, No. 18, 2640-2649).
  • a system based on the use of the genipin agent, has also been disclosed where two ELRs containing two different cell adhesion domains (RGD and REDV, respectively) are crossed. The union between both ELRs is carried out by electrospinning in the presence of said crosslinking agent.
  • a scaffold capable of being reabsorbed is achieved for its application in tissue regeneration in cardiovascular diseases, which comprises an internal layer formed by a ELR comprising RGD that binds endothelial precursor cells and an outer layer formed by another ELR comprising REDV (M Putzu, et al., 2016, Biofabrication 8 045009),
  • the invention referred to here solves the problem raised above by means of an optimized method for the immunoisolation of cells or cell groups, such as, for example, pancreatic islets or insulin-secreting ⁇ cells.
  • This procedure is based on cell nanoencapsulation or nanocoating with different layers of protein biopolymers, called elastin-type recombinamers (ELRs), a modified recombinant protein derived from natural elastin that adhere to cells using the layer-by-layer technique.
  • ELRs elastin-type recombinamers
  • This nanoencapsulation allows the subsequent use of said cells in cell therapy, since they continue to be viable and functional once coated and implanted, and do not induce immune rejection by the recipient organism.
  • this system provides correct permeability that allows both the secretion of factors, such as insulin, from inside the implant to the outside, as well as the entry of nutrients and oxygen to maintain cell viability.
  • the layer-by-layer technique is used to achieve a coating at the molecular level or nanocoating, that is, the deposition of a single layer of ELRs at a time, from the cell surface with several layers of ELRs capable of interlinking with each other. that isolate the cells or cell groups thus encapsulated from the outside, protecting them from external stimuli such as, for example, the immune response of the recipient organism.
  • the ELRs used in the process of the invention reactive alkyne or azide groups capable of reacting with each other by chemistry "click" orthogonally when found in a solution, which allows the formation of a cross-link through covalent bonds between an ELR molecule containing alkyne groups and another ELR molecule with azide groups present in the previous layer, thus giving rise to what, in the present invention, is called a bilayer arranged on the cell surface.
  • the process of the invention makes it possible to precisely control the number of bilayers that adhere and cover the cell surface, creating a stable multilayer system and also being a fast process, as it is a "click" type reaction. instantaneous, which can also be carried out under conditions compatible with cell viability.
  • it is a fully cyto and biocompatible method, which makes it suitable for the subsequent use of cells in clinical applications, and results in a homogeneous cell coating.
  • the ELRs used in the process of the invention have also preferably been modified to comprise bioactive amino acid sequences or cell adhesion sequences, such as the tripeptide L-Arg-Gly-L-Asp (RGD), which promotes specific cell adhesion via membrane integrins, or the tetrapeptide L-Leu-L-Arg-L-Glu-L-Leu (LREL, SEQ ID NO: 5), with the capacity to bind to collagen, mainly type I.
  • the incorporation of binding domains Collagen, such as the sequence SEQ ID NO: 5, has the advantage that it allows the ELR to interact with the extracellular matrix secreted by cell groups, which is involved in the maintenance of cohesion between cells, thus achieving an improved interaction with the cell surface.
  • ELRs are composed of repeats of the pentapeptide L-Val-L-Pro-Gly-X-Gly (VPGXG, SEQ ID NO: 6), where X can be any amino acid except L-Pro
  • the composition of said pentapeptide has been modulated to include amino acids L-Lys (K), which provide a positive charge to the ELR, thus allowing electrostatic interaction in a non-specific way with the cell surface whose charge is negative. Therefore, the combination of these positive charges (amino acids L-Lys in the amino acid sequence of the ELR) with the cell adhesion sequences allows a dual interaction with cells, in a non-specific and specific way, respectively.
  • the procedure described here enables cell nanocoating in a direct way, that is, without the need for the use of scaffolds or materials, such as chitosan, poly (sodium styrene sulphonate), heparin, gelatin or PEG, which act as binding support mobile.
  • This procedure also avoids the use of polyelectrolytes or crosslinking agents that can be cytotoxic.
  • the conditions of the process of the invention have been optimized to result in a cellular nanocoating that provides adequate permeability. while remaining stable and homogeneous.
  • the permeability of the coating is a key and determining aspect, since it is necessary that it not be permeable to proteins of different molecular size related to the immune response that would drastically decrease cell viability, from antibodies, of high weight. molecular, to proteins of the complement system, of relatively small size.
  • excessive impermeability could hinder the exchange of nutrients, oxygen and other factors necessary to maintain cell viability.
  • the non-permeability of the coating would cause a low or no secretion of factors by the cells, from inside the implant to the outside, such as, for example, insulin in the case of pancreatic islets, which would cause a loss of cellular functionality.
  • the optimal concentration of ELRs, the incubation time of the cells with the different solutions containing the ELRs, the number of necessary bilayers, the volume and the reaction temperature have been optimized by the inventors to achieve a stable, homogeneous nanocoating. , viable and functional that also presents adequate permeability.
  • results of the nanocoating of pancreatic islets and insulin-secreting ⁇ cells differentiated from human induced pluripotent cells are presented following the procedure of the invention, and the homogeneity and integrity of the coating is demonstrated (see Figs 2, 3 and 9), the functionality of the cells thus coated to release insulin (see Figs. 5, 6 and 11) and the survival and immunoisolation once the cells thus encapsulated have been transplanted into mice in vivo (see Figs. 8 , 12, 14 and 15).
  • a first aspect of the invention refers to an in vitro process for the nanocoating, nanoencapsulation or immunoisolation of cells, or cell groups, also called “process of the invention”, which comprises the following steps: a. immersing, for a time of between 5 and 30 min, the cells in a first solution that comprises at least one eiasine-type recombinant (ELR), where said ELR has been modified to comprise (i) azide groups or alkyne groups and (ii ) positive charges, b.
  • ELR eiasine-type recombinant
  • step (a) immerse, for a time between 1 and 5 min, the cells of step (a) in a second solution comprising another ELR, where said ELR has been modified to comprise: (i) alkyne groups, when the ELR of step (to) comprises azide groups, or (ii) azide groups, when the ELR of step (a) comprises alkyne groups, thus forming a bilayer of ELRs, and c.
  • steps (a) and (b) at least once more until at least two bilayers of ELRs are achieved, where the ELRs of steps (a) and (b) are at a concentration between 5 and 25 mg / ml , in a volume between 3 and 15 ml and where steps (a) and (b) are carried out at a temperature between 4 ° C and 5 ° C.
  • the process of the invention is based on the layer by layer or "layer by layer” (LbL) technique, since the deposition of the different layers of ELRs on the cell surface is done one by one, following consecutive steps (a ) and (b).
  • LbL layer by layer
  • layer is understood to mean the film or layer that adheres to the cell surface after contact of the cells with the first solution of step (a) or with the second solution of step (b).
  • a “bilayer” is, therefore, the film or layer that adheres to the cell surface after contact of the cells with the first solution of step (a) and with the second solution of step (b).
  • a bilayer will therefore be the result of the covalent bond between the ELR / s comprised in the first solution of step (a) and the ELR comprised in the second solution of step (b).
  • ELR elastin-type recombinant or biopolymer
  • VPGXG SEQ ID NO: 6, where X can be any amino acid except L-Pro
  • the ELRs of the invention are preferably produced by recombinant DNA technology, that is, by inserting the nucleotide sequence that encodes them in a suitable expression vector and the subsequent introduction and expression of the same in a forest cell to finally purify it. .
  • This recombinant production makes it possible to introduce, in the amino acid sequences of the ELRs, the modifications referred to in the present invention, in particular, the addition of cell adhesion sequences and positive charges, as well as the introduction of amino acids, such as lysine, that have amino groups that can be easily transformed to give azide or alkyne groups.
  • Azide groups or alkyne groups can be incorporated into the ELRs by, for example, the introduction at the 4 (X) position of the VPGXG pentapeptide (SEG ID NO: 6), in one or more repeats of said pentapeptide within the ELR, of amino acids, preferably lysine, whose amino groups in the gamma position are easily able to give rise to the substitution reaction with reactive azide or alkyne groups. Said amino groups are transformed to subsequently carry out the delation reaction type "click".
  • the positive charges of the ELR of step (a) are L-Lys (K, lysines) present (introduced) at position 4 (X) of the amino acid sequence of the pentapeptide (SEG ID NO: 6, VPGXG ) in one, in several or in all its repetitions within the ELR.
  • all cell types are capable of being coated with the method of the invention, either for their immunoisolation or as a bioengineering technique that allows a subsequent application of these cells in advanced systems, such as, for example, in the generation of tissue to through the interaction of different cell types arranged in different layers.
  • Examples of cells that can be coated with the method of the invention are, but are not limited to, endothelial cells, neuronal cells, skeletal or smooth muscle cells, fibroblasts, insulin-secreting ⁇ cells, or pancreatic islets.
  • the cells are insulin-secreting ⁇ cells obtained by differentiation of human induced pluripotent cells (hiPSCs). This differentiation is obtained by incubating the hiPSCs with different culture media (supplemented with different growth factors), which are added and removed at different times, thus simulating the natural process of development of pancreatic islets, in the fact that the factors present in the environment are not always the same, being a dynamic process.
  • said method also comprises a step prior to step (a) that comprises seeding the cells in a cell strainer or "cell stainer", which allows to pass (submerge ) cells from one solution to another easily.
  • the ELR of step (a) further comprises a sequence of cell adhesion, more preferably the RGD cell adhesion sequence.
  • the RGD domain is well known in the art and consists, as its name suggests, of the amino acids arginine, glycine, and aspartic acid. This domain is recognized by cell surface proteins of various cell types and functions as a cell adhesion domain.
  • the "cell adhesion sequence" used in the present invention can be any of those known in the state of the art capable of specifically binding to a protein or to a protein fragment present on the cell surface, such as integrins.
  • the choice of the appropriate cell adhesion sequence will depend on the cell type to be coated with the method of the invention, being able to use, for example but without limiting us, the RGD domain, and the LREL domain (SEQ ID NO: 5), sequences that include domains L-Arg-L-Glu-L-Asp-L-Val (REDV, SEQ ID NO: 7) for the coating of endothelial cells, or sequences that include domains L-lle-L-Lys-L-Val- L-Ala-L-Val (IKVAV, SEQ ID NO: 8) for coating neuronal cells.
  • the ELR of step (a) comprises azide groups and the ELR of step (b) comprises alkyne groups.
  • the ELR of step (a) comprises SEQ ID NO: 1, even more preferably SEQ ID NO: 1 comprising groups azide (this latter sequence will also be referred to herein as "ELR-RGD-azide”). More preferably, the ELR of step (b) comprises SEQ ID NO: 2, even more preferably SEQ ID NO: 2 comprising alkyne groups (this latter sequence will also be referred to herein as "ELR ⁇ alkyne” ).
  • said method further comprises a final washing step, to remove excess ELRs.
  • Such washing can be carried out in the presence of buffered saline solutions, such as, but not limited to, phosphate saline buffer (PBS) or Hank's balanced salt solution (HBSS).
  • buffered saline solutions such as, but not limited to, phosphate saline buffer (PBS) or Hank's balanced salt solution (HBSS).
  • steps (a) and (b) are carried out in a volume of between 3 and 10 ml and at a temperature of 4 ° C.
  • steps (a) and (b) are repeated, according to step (c), at least two more times until get at least three bilayers of ELRs.
  • the cells are pancreatic islets.
  • the first solution of step (a) comprises a mixture of two ELRs, where both ELRs comprise azide groups and where one of the two ELRs also comprises an adhesion sequence cell that comprises, preferably consists of, SEQ ID NO: 5. More preferably, the proportion of the two ELRs in said mixture is 10% for the ELR that does not comprise the cell adhesion sequence and 90% for the ELR that comprises the cell adhesion sequence, or 20% for the ELR that does not comprise the cell adhesion sequence and 80% for the ELR that comprises the cell adhesion sequence, or 30% for the ELR that does not comprise the cell adhesion sequence. cell adhesion and 70% for the ELR comprising the cell adhesion sequence. Even more preferably, the ELR that does not comprise the cell adhesion sequence comprises, more preferably consists of, SEQ ID NO: 3 and the ELR that comprises the cell adhesion sequence comprises, more preferably consists of, SEQ ID NO: 4 .
  • SEQ ID NO: 3 comprising azide groups will also be referred to in the present invention as "ELR-K-azide” and SEQ ID NO: 4 comprising azide groups will also be referred to in the present invention as “ELR-LREL-azide. ”.
  • SEQ ID NO: 5 is LREL, and it is a domain with collagen binding capacity, fundamentally type I, which is present in the extra cellular matrix secreted by cells. The presence of this cell adhesion sequence in the ELR therefore allows its specific interaction with the cell surface.
  • the ELR of step (b) comprises SEQ ID NO: 2, more preferably SEQ ID NO: 2 comprising alkyne groups ("ELR-alkyne").
  • steps (a) and (b) of said procedure are carried out in a volume of between 5 and 15 ml and at a temperature of 5 ° C, and the step (a) is carried out for a time of 30 min.
  • said process further comprises shaking the cells throughout the process on a 360 ° rotary shaker.
  • This agitation prevents sedimentation and aggregation of the cells, facilitating a homogeneous coating. More preferably, this agitation is carried out at 3 rpm.
  • said method further comprises an additional step, between steps (a) and (b), of a first centrifugation, washing and a second centrifugation. More preferably, these two spins are carried out at 1000 rpm, for 1 min each, at 5 ° C.
  • centrifugation and washing steps serve to remove the first solution from step (a) and to remove ELR residues contained in the first solution that have not bound to the cell surface.
  • step (c) When the process of the invention is carried out on pancreatic islets, preferably the repetition of steps (a) and (b), according to step (c), gives rise to two bilayers of ELRs of the same composition. More preferably, after repeating step (c), two identical ELR bilayers are generated, each composed of an ELR-K-azide / ELR-LREL-azide layer joined to an ELR-alkyne layer. .
  • said process further comprises an additional step (d) in which steps (a) and (b) are repeated at least once more and in which the first solution of step (a) comprises an ELR modified to comprise azide groups and the cell adhesion sequence RGD and the second solution of step (b) comprises an ELR modified to comprise alkyne groups.
  • the ELR of the first solution comprises SEQ ID NO: 1, yet more preferably comprising azide groups (ELR-RGD-azide)
  • the ELR of the second solution comprises SEG ID NO: 2, even more preferably comprising alkyne groups (ELR-alkyne).
  • steps (a) and (b) are repeated, according to step (c), it is enough to achieve at least three, four, five, six, seven, eight or nine bilayers.
  • the cells originate from a mammal such as, but not limited to, humans, rodents, ruminants, felines or canids. More preferably, the cells are derived from a rat or human, even more preferably from a human.
  • Another aspect of the invention relates to isolated cells or isolated nano-coated cell groups obtained by the method of the invention.
  • said cells are insulin-secreting ⁇ cells obtained by differentiation of hiPSCs or pancreatic islets.
  • Another aspect of the invention relates to said cells or cell groups for use in medicine, preferably for tissue regeneration, both functional and structural, or cell therapy.
  • cell therapy is understood the administration to a subject, individual or patient of living cells capable of exerting a therapeutic effect by curing, mitigating or ameliorating the pathology or delaying or inhibiting its progression or course.
  • Another aspect of the invention refers to the nano-coated cells or cell groups obtained by the method of the invention when these are insulin-secreting ⁇ cells obtained by differentiating hiPSCs or pancreatic islets, for their use in the treatment and / or prevention of diabetes.
  • Another aspect of the invention refers to a method for the treatment and / or prevention of diabetes in a subject, which comprises the administration of a therapeutically effective amount of the nano-coated cells or cell groups obtained by the method of the invention when they are Insulin-secreting ⁇ cells obtained by differentiation of hiPSCs or pancreatic islets.
  • the "therapeutically effective amount” is the amount or concentration of cells that produces the desired effect without causing adverse effects.
  • the dose to achieve a therapeutically effective amount depends on a variety of factors such as, for example, the age, weight, sex or tolerance of the individual to whom the cells are to be administered. Therefore, said amount must be determined for each individual case.
  • Fig. 1 Scheme of the most preferred coating of pancreatic islets with different bilayers of ELRs.
  • Fig. 2 Fluorescence microscopy images of rat pancreatic islets coated with different numbers of bilayers (BL) formed by an ELR-azide-Acetylene Fluor 488 (green) and an ELR-alkyne-Cy5 (red). Scale: 100 ⁇ m.
  • FIG. 7 Immunhistochemical staining of T lymphocytes (CD3 positive) inside allogeneic pancreatic islets coated with three ELR bilayers, three weeks after their transplantation into the renal capsule of immunocompetent mice.
  • Fig. 8 Allogeneic pancreatic islets implanted under the renal capsule of immunocompetent mice and extracted at three weeks in perfect condition, at small (left) and high magnification (right). Note the expression of insulin, which has been stained by immunohistochemical techniques.
  • Fig. 13 Hematoxylin-eosin staining of uncoated insulin-secreting ⁇ -cell spheroids after implantation in mice and subsequent extraction.
  • Fig. 15 Comparison between insulin-secreting ⁇ -cell spheroids coated with three bilayers of ELRs (left) and uncoated spheroids (right). In the latter case, note the presence of a large number of infiltrated immune system cells (higher pixel intensity, in black, corresponding to the staining of the cell nuclei), which greatly compromises the stability and functionality of the spheroids due to this immune attack. In contrast, coated spheroids show great integrity and stability, highlighting the protective activity of ELRs.
  • EXAMPLE 1 OBTAINING, CHARACTERIZATION AND CHEMICAL MODIFICATION OF RECOMBINANT ELASTIN TYPE PROTEIN BIOPOLYMERS.
  • Amino acid sequence (SEQ ID NQ: 1): MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-MESLLP- ⁇ [(VPGIG) 2 (VPGKG) (VPGiG) 2 ] 2 AVTGRGDSPASS [(VPGIG) 2 (VPGKG) (VPGIG) 2 ] 2 ] ⁇ 6 -V
  • the theoretical Molecular Weight for biopolymer 1 is 60,661 Da and was estimated experimentally by polyacrylamide gel electrophoresis and by MALDI-TOF in a Q-Star model spectrometer, resulting in 60,525 Da.
  • the transition temperature obtained by DSC in PBS was 32.2 ° C.
  • This biopolymer contains RGD cell adhesion sequences, with the particularity that an isoleucine amino acid of the pentapeptide in position 3 and of the pentapeptide in position 8 of the series of 10 pentapeptides that flank the RGD adhesion sequence, has been changed by another of lysine. , carrier of amino groups capable of being transformed into azide groups, remaining distributed along the chain of biopolymer 1.
  • Amino acid sequence (SEQ ID NO: 2): MESLLPVGVPGVG [VPGKG (VPGVG) 5 ] 23 VPGKG (VPGVG) 3 VPGV
  • the theoretical Molecular Weight for biopolymer 2 is 60,451 Da and was estimated experimentally by polyacrylamide gel electrophoresis and by MALDI-TOF in a Q-Star model spectrometer, resulting in 60,243 Da.
  • the transition temperature obtained by DSC in PBS was 36.7 ° C.
  • This biopolymer can be considered inert as it does not contain bioactive sequences, being simply composed of pentapeptides derived from elastin. In addition, it has the particularity that five out of every six pentapeptides is substituted with an amino acid valine, while the remaining pentapeptide contains lysine, carrier of amino groups capable of being transformed into alkyne groups, being distributed along the chain of biopolymer 2 .
  • Amino acid sequence (SEQ ID NO: 3): MESLLP (VPGKG) 72 V
  • Biopolymer 3 does not have a transition temperature due to its strong hydrophilic character that makes the molecule stay hydrated, at least in the temperature range in which water is in a liquid state (4-100 ° C).
  • This biopolymer can be considered fundamentally inert as it does not contain bioactive sequences, being simply composed of pentapeptides derived from elastin, all of them substituted with the amino acid lysine, carrying amino groups capable of being transformed into azide groups, remaining distributed throughout the biopolymer chain 3.
  • unmodified amino groups are capable of nonspecifically interacting with the outer layer of the cell membrane.
  • Amino acid sequence (SEQ ID NO: 4): MESLLP ⁇ [VPGVG VPGSG VPGVG VPGKG VPGVG VPGSG VPGVG] 2 VAVTGRGDSPASSGGGGSGGGGSGGGGS [VPGVG VPGSG VPGVG VPGKG VPGVG VPGSG VPGVG] 2 ⁇ 6 V VGGGGSGGGGSHLRELHLNNNGGGGSGGGGS
  • Biopolymer 4 does not have a transition temperature due to its strong hydrophilic character that makes the molecule stay hydrated, at least in the temperature range in which water is in a liquid state (4-100 ° C).
  • This biopolymer contains RGD cell adhesion sequences, with the particularity that an amino acid sheath of the pentapeptide at position 4 and of the pentapeptide at position 11 of the series of 14 pentapeptides that flank the RGD adhesion sequence, has been changed by another of lysine. , carrier of amino groups capable of being transformed into azide groups, being distributed along the chain of biopolymer 4.
  • an amino acid sheath of the pentapeptides in position 2, 6, 9 and 13 has been replaced by another of serine, that maintains the hydrophilicity of the molecule thanks to the presence of alcohol groups that form stable hydrogen bonds with water.
  • biopolymer 4 contains type I collagen binding sequences, preferably the so-called LREL (SEQ ID NO: 5), this type of collagen being present in the extracellular matrix of different cell groups, such as, for example, pancreatic islets, improving the interaction with them,
  • biopolymer 1 ' was carried out by modifying the amino group at the gamma position of the lysine amino acids present in the eiastine pentapeptides. These amino groups are transformed to later carry out the delation reaction type "click" to form the different bilayers by "layer-by-layer.” Specifically, in biopolymer 1 the amino groups were modified giving rise to azide groups in biopolymer 1 '.
  • biopolymer 1 To characterize biopolymer 1 ', a MALDI-TOF spectrometry was performed and from said analysis it was deduced that the molecular weight of the polymer was 62,211 Da, observing a logical increase of 1,686 Da with respect to biopolymer 1, by substituting the amino groups belonging to to their lysines by azide groups.
  • the transition temperature of biopolymer 1 ' is 22.2 ° C and lower than that of biopolymer 1 of 32.2 ° C by 10.0 ° C. This behavior is due to the introduction of a strongly apolar group, such as the azide group, in this case, and the alkyne, in the case of biopolymer 2 '(see below), compared to the starting amino group. Therefore, this change in the transition temperature is a clear indicator of the modification of the biopolymers.
  • Biopolymers 2-4 were modified as described for biopolymer 1, giving rise to biopolymers 2'-4 ', respectively.
  • Transition temperature difference between biopolymer 2 and 2 ' 17.8 ° C.
  • Transition temperature difference between biopolymer 3 and 3 ' N.A.
  • biopolymer 4 Modification of biopolymer 4 to obtain biopolymer 4 (ELR-LREL-azide)
  • Transition temperature difference between biopolymer 4 and 4 ' N.A.
  • Pancreatic islets were obtained from a pancreas biopsy, combining enzymatic digestion with collagenase P in Hanks culture medium with incubation at 37 ° C for 15 minutes, and subsequent density gradient with Histopaque 1077 to obtain islets with high purity. After obtaining, a part of each batch was used for morphological characterization by histology and immunohistochemistry. On the other hand, the hormonal levels in the islets were also studied, as well as the DNA content, the insulin release capacity and the expression levels of different genes by qPCR. 2.2, Obtaining human induced pluripotent cells (hiPSCs) and differentiation to insulin-secreting ⁇ cells.
  • hiPSCs human induced pluripotent cells
  • Human induced pluripotent cells are obtained from the dedifferentiation of adult cells following well-established protocols (K Takahashi, et al., 2006, Cell, 126 (4), 663-676). Subsequently, they were cultured inside Matrigel hydrogels (Corning) with NutriStem XF medium (Biological Industries), which leads to the formation of spheroids, except when individual cells are needed, in which case the enzyme acutase is added, which breaks the cells. intercellular junctions. Once the spheroids were formed, they differentiated into insulin-secreting pancreatic ⁇ cells, specifically the cells that are part of the endoderm of the spheroid.
  • EXAMPLE 3 COVERING OF PANCREATIC ISLETS WITH ELRs THROUGH THE LAYER BY LAYER TECHNIQUE.
  • pancreatic islets The coating of pancreatic islets was carried out using an optimized method to achieve coating of islets, both rat and human, without loss of viability, introducing them into the solution containing the first mixture of ELRs, containing 70, 80 or 90% of ELR-LREL-azide and 30, 20 or 10% ELR-K ⁇ azide, in 15 ml centrifuge tubes. Subsequently, these tubes were placed on a 360 ° rotary shaker to avoid sedimentation and aggregation of the islets and thus achieve a homogeneous coating. Once the process was completed, they were gently centrifuged to remove the solution with the first ELR and add washing solution to remove the remains of the same that have not been attached to the surface of the islet.
  • the agitation and centrifugation process was repeated to add the solution containing the second ELR (ELR-alkyne), which reacts with the previous one to form a covalent bond and therefore form a stable layer-by-layer bilayer (BL) ”.
  • ELR-alkyne the second ELR
  • This whole process entailed an optimization of the different steps, modifying parameters such as the concentration of the ELRs, the volume of the solutions, the number of times the process is repeated (number of BLs), or the incubation time.
  • the characterization of the coating was carried out by marking the ELRs with fluorescent probes to be able to observe them by fluorescence microscopy.
  • the observation of the fluorescent coating was carried out with rat islets, similar in composition to those found in humans, using different numbers of BLs.
  • fluorescence microscopy Fig. 2
  • Fig. 3 confocal microscopy
  • the levels of insulin release in response to the addition of glucose were determined experimentally by means of a perfusion system, observing a similar release in the case of the islets coated with up to nine bilayers of ELR-azide and ELR-alkyne, in comparison with the Uncoated control islets, including the cases in which the conditions proposed in point 3.1 are used, that is, different ratios of combinations of ELR-K-azide and ELR-LREL-azide of the first layer of the first bilayer (10 / 90, 20/80 and 30/70%, respectively) (see Fig. 5 for the insulin release result with three bilayers and Fig. 6 for the rest of the conditions).
  • pancreatic islets To determine the stability and immunoisolation of pancreatic islets thanks to coating with ELRs, allogeneic islets coated with different numbers of bilayers were transplanted into mice. Subsequently, the islets were recovered after three weeks and their stability and the presence of insulin and glucagon releasing cells were verified by immunohistochemistry.
  • mice coated with three BLs composed of ELR-RGD-azide and ELR-alkyne were transplanted into the renal capsule of immunocompetent mice. After three weeks, the animals were sacrificed and the kidneys where the islets had been transplanted were recovered for immunohistochemical processing. Specifically, a specific staining of T lymphocytes was performed (anti-CD3 antibodies), observing a large number of them in the transplanted islets (Fig. 7), which shows an inefficient immunoisolation of the nanocoating with fresh bilayers.
  • EXAMPLE 4 COATING WITH ELRs USING THE LAYER BY LAYER TECHNIQUE OF INSULIN-SECRETING ⁇ CELLS OBTAINED THROUGH THE DIFFERENTIATION OF HUMAN INDUCED PLURIPOTENT CELLS (hiPSCs).
  • insulin-secreting ⁇ cells obtained through the differentiation of human induced pluripotent cells (hiPSCs), hereinafter insulin-secreting ⁇ cells
  • the so-called “cell strainers” or cell strainer were used. cells from one solution to another easily. In the first place, the cells were seeded in said "cell strainer” and immersed in the first ELR ⁇ azide solution, and then passed it to a second solution containing ELR-alkyne and reacting with the previous one. This step was repeated to obtain as many BLs as necessary, to finish with a washing step to remove excess ELRs.
  • this procedure involved optimization to achieve perfect immunoisolation of the insulin-secreting b cells. Specifically, the best protection was obtained with three bilayers of ELR-RGD-azide (SEQ ID NO: 1) and ELR-alkyne (SEQ ID NO: 2).
  • the coating was characterized by fluorescence and confocal microscopy, similar to that described in point 3.2 (Fig. 9).
  • lymphocytes inside the spheroids of Insulin-secreting ⁇ cells after implantation in mice.
  • a large infiltration of lymphocytes was observed in the case of the control spheroids (uncoated, Fig. 13), while no infiltrated lymphocytes were observed in the spheroids coated with three bilayers of ELRs (Fig. 14), demonstrating immunoisolation thanks to the coating.

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Abstract

La invención se refiere a un procedimiento optimizado para el nanorecubrimiento de células, tales como islotes pancreáticos o células β secretoras de insulina, con el objeto de provocar su inmunoaislamienio una vez trasplantadas al organismo receptor para terapia celular. Dicho procedimiento se basa en la nanoencapsulación celular mediante la técnica capa a capa con diferentes capas de recombinámeros de tipo elastina (ELRs) modificados para comprender grupos azida o alquino capaces de reaccionar entre sí mediante química "click", cargas positivas y secuencias de adhesión celular. Las células así recubiertas continúan siendo viables y funcionales una vez implantadas, y no inducen un rechazo inmunológico por parte del organismo receptor. Además, este sistema proporciona una correcta permeabilidad que permite tanto la secreción de factores, como la insulina, de dentro a fuera del implante, como la entrada de nutrientes y oxígeno para mantener la viabilidad celular.

Description

DESCRIPCIÓN
PROCEDIeIENTO PARA EL NANORECUBRIMIENTO CELULAR Y SU
INMUNOAISLAMIENTO
La presente invención se encuadra dentro del campo de la terapia celular y los procedimientos para la generación de los productos celulares empleados en dichas terapias. En particular, la invención se refiere a un procedimiento para el nanorecubrimiento o nanoencapsulación de células o grupos celulares, preferiblemente de islotes pancreáticos o células β secretoras de insulina, que van a ser posteriormente trasplantados al organismo para la reparación estructural y/o funcional de los tejidos. Dicho procedimiento de nanorecubrimiento, basado en la técnica capa a capa y el empleo de recombinámeros de tipo elastina modificados, consigue inmunoaislar las células, las cuales continúan siendo viables y funcionales, de manera que una vez implantadas pueden ejercer su función sin desencadenar una respuesta inmunológica por parte del organismo receptor.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Se han descrito múltiples sistemas de encapsulación de células o grupos celulares, como los islotes pancreáticos, incluyendo sistemas de macro (hidrogeles), micro (cápsulas) y nanoencapsulación (capas adheridas a la membrana celular), muchos de ellos utilizados para el inmunoaislamiento de islotes pancreáticos para el tratamiento de la diabetes. La macroencapsulación consiste, principalmente, en embeber un gran número de células en sistemas reticulares, como los hidrogeles, y su principal aplicación es la administración de esas células en un tejido u órgano concreto para promover la regeneración del mismo, aumentando el tiempo de retención de las células en esa zona al evitar su difusión. Por otro lado, la microencapsulación consiste en contener células en micropartículas o microfibras creadas mediante el uso de sistemas microfiuidicos o por micromoldeado. El pequeño tamaño de los sistemas de microencapsulación mejora, a priori, la difusión de oxígeno, nutrientes y factores a las células encapsuladas. Su eficacia ha sido probada en la microencapsulación de distintos tipos de células, incluyendo los islotes pancreáticos, aunque existen grandes limitaciones, como la poca estabilidad de los biomateriales utilizados o la falta de integración (vascularización) y biocompatibilidad de los mismos.
En lo referente a la nanoencapsulación, el método más utilizado para recubrir células es el “layer-by-layer” (LbL) o, en español, capa a capa, (Richardson JJ, et al., 2016, Chemical Reviews, 116(23): 14828-67). En su versión más básica, este procedimiento consiste en añadir capas que interaccionan entre sí electrostáticamente. De este modo, utilizando distintos polielectrolitos (policationes y polianiones), se ha conseguido recubrir islotes pancreáticos para el tratamiento de la diabetes (Krol S, etal., 2006, Nano Letters, 6(9):1933-9). Sin embargo, este sistema no se ha probado ¡n vivo y, por tanto, no queda clara su aptitud en una aplicación real. Además, la baja biocompatibilidad de este tipo de polielectrolitos podría comprometer la supervivencia del implante. De hecho, existen diversos ejemplos en la bibliografía sobre nanoencapsulación de islotes pancreáticos por la técnica capa a capa, mencionando todos ellos las desventajas que se le suponen a este sistema, como el uso de polielectrolitos citotóxicos o con baja biocompatibilidad, además de problemas derivados de la falta de integración del injerto, principalmente por la ausencia de vascularización, lo que compromete la viabilidad y funcionalidad a largo plazo de los islotes, ai igual que ocurre con los sistemas de microencapsulación (Kizilel S, et al., 2010, Tissue Engineering Part A., 16(7):2217-28).
Muy recientemente se ha descrito la nanoencapsulación de islotes pancreáticos con quitosano y poli(estireno sulfonato de sodio), consiguiendo un buen funcionamiento in vivo , con baja presencia dentro de los islotes tras su implantación y posterior recolección, reportando, además, una moderada angiogénesis (Syed F, et al., 2018, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 14(7):2191-203). En un ejemplo reciente similar, se ha reportado el uso de una nanoencapsulación con heparina y poiietilenglicoi (PEG) para aislar islotes pancreáticos, cuya efectividad se ha demostrado en primates no humanos, no reportándose, en principio, ninguna anormalidad en el tratamiento (Park H, et al., 2018, Biomaterials, 171:164-77). Dentro del mismo campo del tratamiento de la diabetes, se han utilizado también varios sistemas de nanoencapsulación para células β productoras de insulina, aunque solo en un caso se han implantado in vivo dando resultados satisfactorios (Fukuda Y, et al., 2018, Biomaterials, 160:82-91).
Por otro lado, también se ha descrito la nanoencapsulación de otros tipos celulares, por ejemplo, células de mamífero en general, utilizando la técnica capa a capa con gelatina y PEG, demostrando, por ejemplo, la protección de las células recubiertas con este sistema ante la fuerza centrífuga (Yang J, et al., 2017, Biomaterials, 133:253-62). No obstante, es dudoso que este sistema pueda utilizarse para aplicaciones como el recubrimiento de islotes pancreáticos para diabetes, debido a su espesor, mayor de 10 nm, lo que compromete la correcta difusión de factores de dentro afuera de la célula (en el caso de la insulina), y viceversa. En otro ejemplo, se ha conseguido obtener tejido hepático funcional y vascularizado utilizando la técnica capa a capa, aunque en este caso se trata de un sistema complejo, utilizando distintos tipos celulares en el mismo cultivo para dar lugar al tejido final, que puede ser implantado (Sasaki K, et al., 2017, Biomaterials, 133:263-74). Empero, este sistema se ha introducido en ratones inmunodeprimidos, por lo que no se ha comprobado su efectividad como sistema de inmunoaislamiento.
Por otro lado, en el documento EP2737913B1 se describen recombinámeros de tipo elastina (ELRs) modificados para comprender una secuencia de adhesión celular (RGD) y el aminoácido lisina, el cual permite ser modificado para formar enlaces covalentes entre el ELR y una superficie de cultivo celular previamente funcionalizada. En dicho documento se explica que la funcionalización de un soporte ( scaffold) con grupos alquino y del ELR con grupos azida permite interaccionar mediante química “click” al ELR así modificado con dicho soporte. Este sistema soporte/ELR se propone para llevar a cabo la recolección celular, ya que las células se adhieren ai biopolímero unido al soporte y posteriormente éstas pueden ser recuperadas mediante la inducción de un cambio de temperatura en el biopolímero, el cual es termosensible.
Se ha descrito también la generación de películas multicapa basadas en ELRs unidos a quitosano. La técnica empleada para desarrollar este sistema es la deposición capa a capa (J. S. Barbosa, et al., 2009, Nanoscale Res Lett, 4:1247-1253).
Rui R. Costa y col. también generaron recubrimientos producidos mediante la técnica capa a capa basados en quitosano unido a ELRs que además contenían la secuencia de adhesión celular RGD. Las células se adhieren así a los ELRs~RGD unidos al quitosano el cual actúa como soporte (Rui R. Costa, et al., 2011, Small, 7, No. 18, 2640- 2649).
Un sistema, basado en el empleo del agente genipina, ha sido también divulgado donde se entrecruzan dos ELRs conteniendo dos dominios de adhesión celular distintos (RGD y REDV, respectivamente). La unión entre ambos ELRs se lleva a cabo mediante electrospinning en presencia de dicho agente entrecruzante. Se consigue así un andamiaje ( scaffold) capaz de reabsorberse para su aplicación en regeneración tisuiar en enfermedades cardiovasculares, el cual comprende una capa interna formada por un ELR comprendiendo RGD que une células precursoras endoteliales y una capa externa formada por otro ELR comprendiendo REDV (M Putzu, et al., 2016, Biofabrication 8 045009),
Por último, se ha descrito el uso de ELRs modificados para incorporar L-lisinas, grupos azida o grupos ciclooctino (alquino) presentes en dos moléculas de ELR diferentes y secuencias RGD de adhesión celular. Ambos ELRs entrecruzan entre sí mediante química “click” gracias al empleo de la técnica electrospinning. Se generan asi microfibras bioactivas capaces de soportar el crecimiento celular (Israel González de Torre, etal., 2018, Acta Biomaterialia, doi: https://doi.org/10.1016/j.actbio.2018.03.027).
En resumen, la idea de recubrir células o grupos celulares, como los islotes pancreáticos, con el fin de mejorar su viabilidad y conseguir un inmunoaislamiento cuando son trasplantados a un organismo, ha sido estudiada a través de distintas técnicas de recubrimiento, sin embargo, su viabilidad y funcionalidad no ha sido óptima, debido, en el caso del alginato y otras biomoléculas, a la falta de estabilidad química y mecánica del biomaterial, además de su limitada biocompatibiiidad, lo que compromete el inmunoaislamiento de las células encapsuladas. Por otro lado, se han descrito en la bibliografía biopolímeros tipo elastina que reaccionan entre sí mediante una reacción química (“click”) que es rápida, eficaz y biocompatible y que permite el recubrimiento de diferentes superficies (biomateriales).
Sin embargo, sigue existiendo una necesidad en el estado del arte de disponer de procedimientos optimizados que permitan un nanorecubrimiento o nanoencapsulación directa de las células, preferiblemente de islotes pancreáticos o células β productoras de insulina, de manera que se consiga un eficiente inmunoaislamiento ín vivo, para que, una vez trasplantadas al organismo receptor, no se produzca un rechazo inmunológico. A su vez, dichos procedimientos deberían dar lugar a un recubrimiento celular biocompatible, estable y homogéneo y con la permeabilidad adecuada para permitir el paso de nutrientes y oxígeno desde el exterior al interior celular, lo cual asegura el mantenimiento y viabilidad de las células, así como de factores (por ejemplo, hormonas tales como la insulina en el caso de los islotes pancreáticos) liberados por las células, lo cual es fundamental para mantener la funcionalidad de las mismas durante la correspondiente aplicación terapéutica. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención aquí referida soluciona el problema anteriormente planteado mediante un procedimiento optimizado para el inmunoaislamiento de células o grupos celulares, tales como, por ejemplo, los islotes pancreáticos o las células β secretoras de insulina. Dicho procedimiento se basa en la nanoencapsulación o nanorecubrimiento celular con diferentes capas de biopolímeros proteicos, denominados recombinámeros de tipo elastina (ELRs), una proteína recombinante derivada de la elastina natural, modificados que se adhieren a las células mediante la técnica capa a capa. Esta nanoencapsulación permite el posterior uso de dichas células en terapia celular, ya que éstas continúan siendo viables y funcionales una vez recubiertas e implantadas, y no inducen un rechazo inmunológico por parte del organismo receptor. Además, este sistema proporciona una correcta permeabilidad que permite tanto la secreción de factores, como la insulina, de dentro a fuera del implante como la entrada de nutrientes y oxígeno para mantener la viabilidad celular.
En el procedimiento aquí descrito se utiliza la técnica capa a capa para conseguir un recubrimiento a nivel molecular o nanorecubrimiento, esto es, la deposición de una sola capa de ELRs cada vez, de la superficie celular con varias capas de ELRs capaces de entrecruzar entre sí que aíslan las células o grupos celulares así encapsulados del exterior, protegiéndolos de estímulos externos tales como, por ejemplo, la respuesta inmune del organismo receptor.
Con el objetivo de mejorar el método de capa a capa, teniendo en cuenta que las interacciones electrostáticas que se producen en dicho método son débiles y pueden dar lugar a un recubrimiento poco estable, en la invención aquí descrita se han aprovechado las propiedades de la química “click” para ELRs. De este modo, se ha conseguido la unión covalente entre ELRs, mejorando enormemente la estabilidad del recubrimiento. Para ello, se han incorporado, en los ELRs empleados en el procedimiento de la invención, grupos reactivos alquino o azida capaces de reaccionar entre sí por química “click” de forma ortogonal al encontrarse en una disolución, lo que permite la formación de un entrecruzamiento a través de enlaces covalentes entre una molécula de ELR que contiene grupos alquino y otra molécula de ELR con grupos azida presente en la capa anterior, dando así lugar a lo que, en la presente invención, se denomina una bicapa dispuesta sobre la superficie celular. De acuerdo con lo anterior, el procedimiento de la invención permite controlar de forma precisa el número de bicapas que se adhieren y recubren la superficie celular, creando un sistema multicapa estable y siendo además un proceso rápido, ai tratarse de una reacción tipo “click” instantánea, que además puede llevarse a cabo en condiciones compatibles con la viabilidad celular. Además, es un método totalmente cito y biocompatible, lo que lo hace adecuado para el posterior uso de las células en aplicaciones clínicas, y resulta en un recubrimiento celular homogéneo.
Los ELRs empleados en el procedimiento de la invención han sido además preferiblemente modificados para comprender secuencias de aminoácidos bioactivas o secuencias de adhesión celular, como por ejemplo el tripéptido L-Arg-Gly-L-Asp (RGD), que promueve la adhesión celular específica vía integrinas de membrana, o el tetrapéptido L-Leu-L-Arg-L-Glu-L-Leu (LREL, SEQ ID NO: 5), con capacidad de unión a colágeno, fundamentalmente tipo I. La incorporación de dominios de unión a colágeno, como la secuencia SEQ ID NO: 5, presenta la ventaja de que permite al ELR interaccionar con la matriz extracelular secretada por grupos celulares, la cual está involucrada en el mantenimiento de la cohesión entre las células, consiguiendo así una interacción mejorada con la superficie celular. Dichas secuencias de adhesión celular presentes en los ELRs facilitan la unión específica de los mismos al tipo celular que se desea recubrir. Del mismo modo, teniendo en cuenta que los ELRs están compuestos de repeticiones del pentapéptido L-Val-L-Pro-Gly-X-Gly (VPGXG, SEQ ID NO: 6), donde X puede ser cualquier aminoácido excepto L-Pro, en la presente invención se ha modulado la composición de dicho pentapéptido para incluir aminoácidos L-Lys (K), los cuales aportan una carga positiva al ELR, permitiendo así la interacción electrostática de forma inespecífica con la superficie celular cuya carga es negativa. Por tanto, la combinación de estas cargas positivas (aminoácidos L-Lys en la secuencia aminoacídica del ELR) con las secuencias de adhesión celular permite una interacción dual con las células, de forma inespecífica y específica, respectivamente.
El procedimiento aquí descrito posibilita el nanorecubrimiento celular de manera directa, es decir, sin que sea necesario el empleo de andamiajes o materiales, tales como quitosano, poli(estireno sulfonato de sodio), heparina, gelatina o PEG, que actúen como soporte de unión celular. Este procedimiento también evita el empleo de polielectrolitos o agentes entrecruzantes que puedan resultar citotóxicos.
Además, las condiciones del procedimiento de la invención han sido optimizadas para resultar en un nanorecubrimiento celular que proporcione una adecuada permeabilidad mientras que se mantiene estable y homogéneo. Como se ha comentado anteriormente, la permeabilidad del recubrimiento es un aspecto clave y determinante, puesto que es necesario que no sea permeable a proteínas de distinto tamaño molecular relacionadas con la respuesta inmune que disminuiría drásticamente la viabilidad celular, desde los anticuerpos, de elevado peso molecular, a las proteínas del sistema del complemento, de tamaño relativamente pequeño. Sin embargo, una excesiva impermeabilidad podría dificultar el intercambio de nutrientes, oxígeno y otros factores necesarios para mantener la viabilidad celular. Además, y este es un factor fundamental, la no permeabilidad del recubrimiento provocaría una baja o nula secreción de factores por parte de las células, desde dentro del implante hacia fuera, como, por ejemplo, la insulina en el caso de los islotes pancreáticos, lo que provocaría una pérdida de la funcionalidad celular. Así, la concentración de ELRs óptima, el tiempo de incubación de las células con las distintas soluciones conteniendo los ELRs, el número de bicapas necesarias, el volumen y la temperatura de reacción, han sido optimizados por los inventores para conseguir un nanorecubrimiento estable, homogéneo, viable y funcional que además presente una adecuada permeabilidad.
En los ejemplos mostrados más adelante se presentan resultados del nanorecubrimiento de islotes pancreáticos y células β secretoras de insulina diferenciadas a partir de células pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) siguiendo el procedimiento de la invención, y se demuestra la homogeneidad e integridad del recubrimiento (ver Figs. 2, 3 y 9), la funcionalidad de las células así recubiertas para liberar insulina (ver Figs. 5, 6 y 11) y la supervivencia y el inmunoaislamiento una vez trasplantadas las células así encapsuladas a ratones in vivo (ver Figs. 8, 12, 14 y 15).
Así, un primer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento in vitro para el nanorecubrimiento, nanoencapsulacíón o inmunoaislamiento de células, o grupos celulares, también llamado “procedimiento de la invención”, que comprende las siguientes etapas: a. sumergir, durante un tiempo de entre 5 y 30 min, las células en una primera disolución que comprende ai menos un recombinámero de tipo eíasíina (ELR), donde dicho ELR ha sido modificado para comprender (i) grupos azida o grupos alquino y (ii) cargas positivas, b. sumergir, durante un tiempo de entre 1 y 5 min, las células de la etapa (a) en una segunda disolución que comprende otro ELR, donde dicho ELR ha sido modificado para comprender: (i) grupos alquino, cuando el ELR de la etapa (a) comprende grupos azida, o (ii) grupos azida, cuando el ELR de la etapa (a) comprende grupos alquino, formando así una bicapa de ELRs, y c. repetir al menos una vez más las etapas (a) y (b) hasta conseguir a¡ menos dos bicapas de ELRs, donde los ELR de las etapas (a) y (b) están a una concentración de entre 5 y 25 mg/ml, en un volumen de entre 3 y 15 ml y donde las etapas (a) y (b) se llevan a cabo a una temperatura de entre 4°C y 5°C.
El procedimiento de la invención está basado en la técnica capa a capa o “layer by layer” (LbL), ya que la deposición de las distintas capas de ELRs sobre la superficie celular se hace de una en una, siguiendo las etapas consecutivas (a) y (b).
En la presente invención se entiende por “capa” la película o capa que se adhiere a la superficie celular tras el contacto de las células con la primera disolución de la etapa (a) o con la segunda disolución de la etapa (b). Una “bicapa” es, por tanto, la película o capa que se adhiere a la superficie celular tras el contacto de las células con la primera disolución de la etapa (a) y con la segunda disolución de la etapa (b). Una bicapa será, por tanto, el resultado de la unión covalente entre el/los ELR/s comprendido/s en la primera disolución de la etapa (a) y el ELR comprendido en la segunda disolución de la etapa (b).
Un “recombinámero o biopolímero de tipo elastina” (ELR o ELR) es una secuencia aminoacídica artificial, es decir, generada mediante técnicas de ingeniería genética, que comprende repeticiones del pentapéptido VPGXG (SEQ ID NO: 6, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto L-Pro) el cual está presente en la elastina natural. No es tóxico y por tanto es adecuado para la Interacción con las células.
Los ELRs de la invención se producen, preferiblemente, mediante tecnología del ADN recombinante, es decir, mediante la inserción de la secuencia nucleotídica que los codifica en un vector de expresión adecuado y la posterior introducción y expresión del mismo en una célula bospedadora para finalmente purificarlo. Esta producción recombinante posibilita introducir, en las secuencias aminoacídicas de los ELRs, las modificaciones referidas en la presente invención, en particular, la adición de secuencias de adhesión celular y de las cargas positivas, así como la introducción de aminoácidos, tales como la lisina, que presentan grupos amino que pueden ser fácilmente transformados para dar lugar a grupos azida o alquino.
Los grupos azida o grupos alquino se pueden incorporar a los ELR mediante, por ejemplo, la introducción en la posición 4 (X) del pentapéptido VPGXG (SEG ID NO: 6), en una o más repeticiones de dicho pentapéptido dentro del ELR, de aminoácidos, preferiblemente lisina, cuyos grupos amino en la posición gamma presenten facilidad para dar lugar a la reacción de sustitución con grupos azida o alquino reactivos. Dichos grupos amino se transforman para posteriormente llevar a cabo la reacción de delación tipo “click”.
En una realización preferida, las cargas positivas del ELR de la etapa (a) son L-Lys (K, lisinas) presentes (introducidas) en la posición 4 (X) de la secuencia aminoacídica del pentapéptido (SEG ID NO: 6, VPGXG) en una, en varias o en todas sus repeticiones dentro del ELR.
En general, todos los tipos celulares son susceptibles de ser recubiertos con el procedimiento de la invención, bien para su inmunoaislamiento o bien como técnica de bioingeniería que permita una posterior aplicación de esas células en sistemas avanzados, como por ejemplo en la generación de tejido a través de la interacción de distintos tipos celulares dispuestos en diferentes capas. Ejemplos de células que se pueden recubrir con el procedimiento de la invención son, pero sin limitarnos, células endoteliales, células neuronales, células de músculo liso o esquelético, fibroblastos, células β secretoras de insulina o islotes pancreáticos.
En otra realización preferida, las células son células β secretoras de insulina obtenidas mediante diferenciación de células pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs). Esta diferenciación se obtiene mediante la incubación de las hiPSCs con distintos medios de cultivo (suplementados con diferentes factores de crecimiento), que se van añadiendo y quitando a distintos tiempos, simulando, de este modo, el proceso natural de desarrollo de islotes pancreáticos, en el que los factores presentes en el entorno no son siempre los mismos, siendo un proceso dinámico. Cuando el procedimiento de la invención se aplica a estas células en particular, preferiblemente dicho procedimiento además comprende una etapa previa a la etapa (a) que comprende sembrar las células en un colador de células o “cell stainer”, el cual permite pasar (sumergir) las células de una disolución a otra fácilmente. Preferiblemente, cuando el procedimiento se lleva a cabo sobre estas células, el ELR de la etapa (a) además comprende una secuencia de adhesión celular, más preferiblemente la secuencia de adhesión celular RGD.
El dominio RGD es bien conocido en el arte y consiste, como su nombre indica, en los aminoácidos arginina, glicina y ácido aspártico. Este dominio es reconocido por proteínas de la superficie celular de diversos tipos celulares y funciona como un dominio de adhesión celular.
La “secuencia de adhesión celular” empleada en la presente invención puede ser cualquiera de entre las conocidas en el estado del arte capaz de unirse específicamente a una proteína o a un fragmento de proteína presente en la superficie celular, tai como las integrinas. La elección de la secuencia de adhesión celular adecuada dependerá del tipo celular que se pretenda recubrir con el procedimiento de la invención, pudiéndose utilizar, por ejemplo pero sin limitarnos, el dominio RGD, ei dominio LREL (SEQ ID NO: 5), secuencias que comprendan dominios L-Arg-L-Glu-L-Asp-L-Val (REDV, SEQ ID NO: 7) para el recubrimiento de células endoteliaies, o secuencias que comprendan dominios L-lle-L-Lys-L-Val-L-Ala-L-Val (IKVAV, SEQ ID NO: 8) para el recubrimiento de células neuronales.
En otra realización preferida, el ELR de la etapa (a) comprende grupos azida y el ELR de la etapa (b) comprende grupos alquino.
Cuando el procedimiento de la invención se lleva a cabo sobre células β secretoras de insulina obtenidas mediante diferenciación de hiPSCs, preferiblemente el ELR de la etapa (a) comprende la SEQ ID NO: 1 , aún más preferiblemente la SEQ ID NO: 1 comprendiendo grupos azida (a esta última secuencia también se hará referencia en la presente invención como “ELR-RGD-azida”). Más preferiblemente, el ELR de la etapa (b) comprende la SEQ ID NO: 2, aún más preferiblemente la SEQ ID NO: 2 comprendiendo grupos alquino (a esta última secuencia también se hará referencia en la presente invención como “ELR~alquino”).
Cuando el procedimiento de la invención se lleva a cabo sobre células β secretoras de insulina obtenidas mediante diferenciación de hiPSCs, preferiblemente dicho procedimiento además comprende una etapa final de lavado, para retirar el exceso de ELRs. Dicho lavado se puede llevar a cabo en presencia de soluciones salinas tamponadas, como por ejemplo, pero sin limitarnos, tampón salino fosfato (PBS, en inglés) o la solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Cuando el procedimiento de la invención se lleva a cabo sobre células β secretoras de insulina obtenidas mediante diferenciación de hiPSCs, preferiblemente las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en un volumen de entre 3 y 10 ml y a una temperatura de 4°C.
Cuando el procedimiento de la invención se lleva a cabo sobre células β secretoras de insulina obtenidas mediante diferenciación de hiPSCs, preferiblemente las etapas (a) y (b) se repiten, de acuerdo con la etapa (c), al menos dos veces más hasta conseguir al menos tres bicapas de ELRs.
En otra realización preferida, las células son islotes pancreáticos.
Cuando el procedimiento de la invención se lleva a cabo sobre islotes pancreáticos, preferiblemente la primera disolución de la etapa (a) comprende una mezcla de dos ELR, donde ambos ELRs comprenden grupos azida y donde uno de los dos ELR además comprende una secuencia de adhesión celular que comprende, preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO: 5. Más preferiblemente, la proporción de los dos ELRs en dicha mezcla es del 10% para el ELR que no comprende la secuencia de adhesión celular y del 90% para el ELR que comprende la secuencia de adhesión celular, o del 20% para el ELR que no comprende la secuencia de adhesión celular y del 80% para el ELR que comprende la secuencia de adhesión celular, o del 30% para el ELR que no comprende la secuencia de adhesión celular y del 70% para el ELR que comprende la secuencia de adhesión celular. Aún más preferiblemente, el ELR que no comprende la secuencia de adhesión celular comprende, más preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO: 3 y el ELR que comprende la secuencia de adhesión celular comprende, más preferiblemente consiste en, la SEQ ID NO: 4.
La SEQ ID NO: 3 que comprende grupos azida será también referida en la presente invención como “ELR-K-azida” y la SEQ ID NO: 4 que comprende grupos azida será también referida en la presente Invención como “ELR-LREL-azida”.
La SEQ ID NO: 5 es LREL, y es un dominio con capacidad de unión a colágeno, fundamentalmente de tipo I, el cual está presente en la matriz extra celular secretada por las células. La presencia de esta secuencia de adhesión celular en el ELR permite, por tanto, la interacción específica de éste con la superficie celular. Cuando el procedimiento de la invención se lleva a cabo sobre islotes pancreáticos, preferiblemente el ELR de la etapa (b) comprende la SEQ ID NO: 2, más preferiblemente la SEQ ID NO: 2 comprendiendo grupos alquino (“ELR-alquino”).
Cuando el procedimiento de la invención se lleva a cabo sobre islotes pancreáticos, preferiblemente las etapas (a) y (b) de dicho procedimiento se llevan a cabo en un volumen de entre 5 y 15 ml y a una temperatura de 5°C, y la etapa (a) se lleva a cabo durante un tiempo de 30 min.
Cuando el procedimiento de la invención se lleva a cabo sobre Islotes pancreáticos, preferiblemente dicho procedimiento además comprende agitar las células durante todo el procedimiento en un agitador rotatorio de 360°. Esta agitación evita la sedimentación y agregación de las células, facilitando un recubrimiento homogéneo. Más preferiblemente, esta agitación se lleva a cabo a 3 rpm.
Cuando el procedimiento de la invención se lleva a cabo sobre islotes pancreáticos, preferiblemente dicho procedimiento además comprende una etapa adicional, entre las etapas (a) y (b), de un primer centrifugado, lavado y un segundo centrifugado. Más preferiblemente, estos dos centrifugados se llevan a cabo a 1000 rpm, durante 1 min cada uno, a 5°C. Estos pasos de centrifugado y lavado sirven para retirar la primera disolución de la etapa (a) y para eliminar los restos de ELR contenidos en la primera disolución que no se hayan unido a la superficie celular.
Cuando el procedimiento de la invención se lleva a cabo sobre islotes pancreáticos, preferiblemente la repetición de las etapas (a) y (b), de acuerdo con la etapa (c), da lugar a dos bicapas de ELRs de igual composición. Más preferiblemente, tras la repetición de la etapa (c), se generan dos bicapas de ELRs idénticas compuestas, cada una de ellas, por una capa de ELR-K-azida/ELR-LREL-azida unida a una capa de ELR-alquino.
Cuando el procedimiento de la invención se lleva a cabo sobre islotes pancreáticos, preferiblemente dicho procedimiento además comprende una etapa adicional (d) en la que se repiten al menos una vez más las etapas (a) y (b) y en la que la primera disolución de la etapa (a) comprende un ELR modificado para comprender grupos azida y la secuencia de adhesión celular RGD y la segunda disolución de la etapa (b) comprende un ELR modificado para comprender grupos alquino. Más preferiblemente, en esta etapa adicional (d) el ELR de la primera disolución comprende la SEQ ID NO: 1, aún más preferiblemente comprendiendo grupos azida (ELR-RGD-azida), y el ELR de la segunda disolución comprende la SEG ID NO: 2, aún más preferiblemente comprendiendo grupos alquino (ELR-alquino).
En otra realización preferida, las etapas (a) y (b) se repiten, de acuerdo con la etapa (c), basta conseguir al menos tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve bicapas.
En otra realización preferida del procedimiento de la invención, las células proceden de un mamífero tal como, pero sin limitarnos, humanos, roedores, rumiantes, felinos o cánidos. Más preferiblemente, las células proceden de una rata o un humano, aún más preferiblemente de un humano.
Otro aspecto de la invención se refiere a las células aisladas o grupos celulares aislados nanorecubiertos obtenidos por el procedimiento de la invención. En una realización preferida, dichas células son células β secretoras de insulina obtenidas mediante diferenciación de hiPSCs o islotes pancreáticos.
Otro aspecto de la invención se refiere a dichas células o grupos celulares para su uso en medicina, preferiblemente para regeneración tisular, tanto funcional como estructural, o terapia celular.
Se entiende por “terapia celular la administración a un sujeto, individuo o paciente de células vivas capaces de ejercer un efecto terapéutico curando, mitigando o mejorando la patología o retrasando o inhibiendo el avance o curso de la misma.
Otro aspecto de la invención se refiere a las células o grupos celulares nanorecubiertos obtenidos por el procedimiento de la invención cuando éstas son células β secretoras de insulina obtenidas mediante diferenciación de hiPSCs o islotes pancreáticos, para su uso en el tratamiento y/o prevención de la diabetes.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para el tratamiento y/o prevención de la diabetes en un sujeto, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de las células o grupos celulares nanorecubiertos obtenidos por el procedimiento de la invención cuando éstas son células β secretoras de insulina obtenidas mediante diferenciación de hiPSCs o islotes pancreáticos. La “cantidad terapéuticamente efectiva” es ia cantidad o concentración de células que produce el efecto deseado sin provocar efectos adversos. La dosis para alcanzar una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores tales como, por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia dei individuo al que se le van a administrar las células. Por ello, dicha cantidad deberá ser determinada para cada caso individual.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fíg. 1. Esquema dei recubrimiento más preferido de islotes pancreáticos con distintas bicapas de ELRs.
Fig. 2. Imágenes de microscopía de fluorescencia de islotes pancreáticos de rata recubiertos con distinto número de bicapas (BL) formadas por un ELR-azida-Acetylene Fluor 488 (verde) y un ELR-alquino-Cy5 (rojo). Escala: 100 μm. Fig. 3. Imágenes de microscopía confocal de cortes de islotes pancreáticos de rata en distintas condiciones: sin recubrir, recubiertos con ELRs no fluorescentes, recubiertos por seis bicapas de ELR-azida-Acetylene Fluor 488 (RGD verde) y ELR-alquino-Cy5 (VKV rojo), y recubiertos por tres bicapas de ELR~azida-Cy5 (RGD rojo) y ELR-ciclo- Cy5 (VKV rojo) (ambos en rojo). Los núcleos de las células se tiñeron con DAPI (azul). Fig. 4, Imágenes de microscopía de fluorescencia de islotes no recubiertos y recubiertos con seis bicapas de ELRs marcados fluorescentemente (Cy5) tras 48 h en cultivo en presencia de las citoquinas TNF-α e IFN-γ o en ausencia de éstas (control). Las imágenes de calceína muestran las células vivas, mientras que las de PI se corresponden con las células muertas. Fig. 5. Secreción de Insulina de islotes recubiertos con tres bicapas de ELR-azida y ELR-alquino (línea negra) e islotes no recubiertos (control, línea gris) en respuesta a una exposición a glucosa. Fig. 6. Ensayo de liberación de insulina por estimulación con glucosa en el caso de islotes recubiertos con ELR-LREL-azida + ELR-K-azida y ELR-alquino (derecha), y no recubiertos (izquierda). Fig. 7, Tinción por inmunihistoquímica de linfocitos T (CD3 positivos) en el interior de islotes pancreáticos alogénicos recubiertos con tres bicapas de ELR, tres semanas después de su trasplante en la cápsula renal de ratones inmunocompetentes. Fig. 8. Islotes pancreáticos alogénicos implantados bajo la cápsula renal de ratones inmunocompetentes y extraídos a las tres semanas en perfecto estado, a pequeño (izquierda) y gran aumento (derecha). Nótese la expresión de insulina, la cual se ha teñido mediante técnicas de ínmunohistoquímica. Fig. 9. Imágenes de microscopía de fluorescencia (izquierda) y confocal (derecha) de esferoides de células β secretoras de insulina, recubiertos con tres bicapas de ELR- azida-Cy5 (rojo) y ELR-alquino-Cy5 (rojo), usando uno u otro como primera capa. Barra de escala correspondiente a 100 μm. Fig. 10. Tinción por ínmunohistoquímica del nanorrecubrimiento con ELRs (tres bicapas) con un anticuerpo anti-elastina, en esferoides de células β secretoras de insulina recubiertos (izquierda) y no recubiertos (derecha). Fig. 11. Liberación de insulina por la estimulación con distintas concentraciones de glucosa en células β secretoras de insulina no recubiertas (control) y recubiertas con tres bicapas de ELRs (RGD). C1 y C2 se corresponden con los ciclos de exposición a glucosa. Fig. 12. Morfología y viabilidad celular de células β secretoras de insulina obtenidas mediante la diferenciación de hiPSCs recubiertas con tres bicapas de ELRs extraídas tras 7 (izquierda) y 14 días (derecha) de implante in vivo en ratones. Las células vivas se muestran en píxeles brillantes y las muertas en píxeles negros. Fig. 13. Tinción de hematoxilina-eosina de esferoides de células β secretoras de insulina no recubiertas tras el implante en ratones y su posterior extracción. Fíg. 14. Tinción de hematoxilina-eosina de esferoides de células β secretoras de insulina recubiertas con tres bicapas de ELRs tras el implante en ratones y su posterior extracción.
Fig. 15, Comparación entre esferoides de células β secretoras de insulina recubiertas con tres bicapas de ELRs (izquierda) y esferoides no recubiertos (derecha). En este último caso, nótese la presencia de una gran cantidad de células del sistema inmune infiltradas (mayor intensidad de píxel, en negro, correspondiente a la tinción de los núcleos celulares), lo cual compromete enormemente la estabilidad y la funcionalidad de los esferoides por este ataque inmune. Por el contrario, los esferoides recubiertos muestran una gran integridad y estabilidad, resaltando la actividad protectora de los ELRs.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del procedimiento de la invención en la encapsulación o nanorecubrimiento de células para su inmunoaislamiento.
EJEMPLO 1. OBTENCIÓN, CARACTERIZACIÓN Y MODIFICACIÓN QUÍMICA DE BIOPOLÍMEROS PROTEICOS RECOMBINANTES TIPO ELASTINA.
1.1. Diseño, obtención y caracterización de los biopolímeros proteicos recombinantes tipo elastina.
El diseño y la obtención de las secuencias nucleotídicas sintéticas que codifican para las secuencias aminoacídícas de los distintos biopolímeros empleados se realizaron como está descrito en WO/2010/092224, Igualmente, la expresión, purificación y caracterización de los biopolímeros se llevó a cabo como está descrito en WO/2010/092224.
Se diseñaron los siguientes biopolímeros:
Nomenclatura: ELR-RGD
Secuencia aminoacídica (SEQ ID NQ: 1): MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH-MESLLP- {[(VPGIG)2(VPGKG)(VPGiG)2]2 AVTGRGDSPASS [(VPGIG)2(VPGKG)(VPGIG)2]2]}6-V
El Peso Molecular teórico para el biopolímero 1 es de 60.661 Da y se estimó experimentalmente por electroforesis en gel de poliacrilamida y por MALDI-TOF en un espectrómetro modelo Q-Star resultando ser 60.525 Da. La temperatura de transición obtenida mediante DSC en PBS fue de 32,2 °C.
Este biopolímero contiene secuencias de adhesión celular RGD, con la particularidad de que un aminoácido isoleucina del pentapéptido en posición 3 y del pentapéptido en posición 8 de la serie de 10 pentapéptidos que flanquean a la secuencia de adhesión RGD, ha sido cambiado por otro de lisina, portador de grupos amino capaces de ser transformados en grupos azida, quedando repartidos a lo largo de la cadena del biopolímero 1.
Biopolímero 2 de 727 aminoácidos
Nomenclatura: ELR
Secuencia aminoacídica (SEQ ID NO: 2): MESLLPVGVPGVG[VPGKG(VPGVG)5]23 VPGKG(VPGVG)3 VPGV
El Peso Molecular teórico para el biopolímero 2 es de 60.451 Da y se estimó experimentalmente por electroforesis en gel de poliacrilamida y por MALDI-TOF en un espectrómetro modelo Q-Star resultando ser 60.243 Da. La temperatura de transición obtenida mediante DSC en PBS fue de 36,7 °C.
Este biopolímero se puede considerar inerte ai no contener secuencias bioactivas, estando simplemente compuesto por pentapéptidos derivados de la elastina. Además, tiene la particularidad de que cinco de cada seis pentapéptidos está sustituido con un aminoácido valina, mientras que el pentapéptido restante contiene lisina, portador de grupos amino capaces de ser transformados en grupos alquino, quedando repartidos a lo largo de la cadena del biopolímero 2.
Biopolímero 3 de 367 aminoácidos
Nomenclatura: ELR-K
Secuencia aminoacídica (SEQ ID NO: 3): MESLLP(VPGKG)72V
El Peso Molecular teórico para el biopolímero 3 es de 32.362 Da y se estimó experimentalmente por electroforesis en gel de poliacrilamida y por MALDI-TOF en un espectrómetro modelo Q-Star resultando ser 32.357 Da. El biopolímero 3 no tiene temperatura de transición debido a su marcado carácter hidrofílico que hace que la molécula se mantenga hidratada, ai menos en el rango de temperaturas en el que el agua se encuentra en estado líquido (4-100 °C).
Este biopolímero se puede considerar fundamentalmente inerte al no contener secuencias bioactivas, estando simplemente compuesto por pentapéptidos derivados de la elastina, todos ellos sustituidos con el aminoácido lisina, portador de grupos amino capaces de ser transformados en grupos azida, quedando repartidos a lo largo de la cadena del biopolímero 3. Por otro lado, los grupos amino no modificados son capaces de interaccionar inespecíficamente con la capa externa de la membrana celular.
Biopolímero 4 de 1201 aminoácidos Nomenclatura: ELR-LREL
Secuencia aminoacídica (SEQ ID NO: 4): MESLLP {[VPGVG VPGSG VPGVG VPGKG VPGVG VPGSG VPGVG]2 VAVTGRGDSPASSGGGGSGGGGSGGGGS [VPGVG VPGSG VPGVG VPGKG VPGVG VPGSG VPGVG]2 VGGGGSGGGGSHLRELHLNNNGGGGSGGGGS }6V
Ei Peso Molecular teórico para el biopolímero 4 es de 98.097 Da y se estimó experimentalmente por electroforesis en gel de poliacrilamida y por MALDI-TOF en un espectrómetro modelo G-Star resultando ser 97.922 Da. El biopolímero 4 no tiene temperatura de transición debido a su marcado carácter hidrofílico que hace que ia molécula se mantenga hidratada, ai menos en el rango de temperaturas en el que el agua se encuentra en estado líquido (4-100 °C).
Este biopolímero contiene secuencias de adhesión celular RGD, con la particularidad de que un aminoácido vaiina del pentapéptido en posición 4 y del pentapéptido en posición 11 de la serie de 14 pentapéptidos que flanquean a la secuencia de adhesión RGD, ha sido cambiado por otro de lisina, portador de grupos amino capaces de ser transformados en grupos azida, quedando repartidos a lo largo de ia cadena del biopolímero 4. Además, un aminoácido vaiina de los pentapéptidos en posición 2, 6, 9 y 13 ha sido sustituido por otro de serina, que mantiene la hidrofilicidad de la molécula gracias a la presencia grupos alcohol que forman puentes de hidrógeno estables con el agua. Por último, el biopolímero 4 contiene secuencias de unión a colágeno tipo I, preferentemente la denominada LREL (SEQ ID NO: 5), estando este tipo de colágeno presente en la matriz extracelular de distintos grupos celulares, como, por ejemplo, los islotes pancreáticos, mejorando la interacción con los mismos,
1.2. Modificación química de los biopolímeros proteicos recombinantes tipo elastina.
Modificación del biopolímero 1 para obtener el biopolímero 1' (ELR-RGD-azida)
La obtención del biopolímero 1' se llevó a cabo por la modificación del grupo amino en la posición gamma de los aminoácidos lisina presentes en los pentapéptidos de eiastina. Estos grupos amino se transforman para posteriormente llevar a cabo la reacción de delación tipo "click” para conformar las distintas bicapas por “layer-by-layer” . En concreto, en el biopolímero 1 se modificaron los grupos amino dando lugar a grupos azida en el biopolímero 1’.
Para caracterizar el biopolímero 1', se realizó una espectrometría MALDI-TOF y de dicho análisis se dedujo que el peso molecular del polímero era de 62.211 Da, observándose un lógico aumento de 1.686 Da con respecto al biopolímero 1 , al sustituir los grupos amino pertenecientes a sus lisinas por grupos azida.
La temperatura de transición del biopolímero 1' es de 22,2 °C e inferior a la del biopolímero 1 de 32,2 °C en 10,0 °C. Este comportamiento es debido a la introducción de un grupo fuertemente apolar, como son tanto el grupo azida, en este caso, y el alquino, en el caso del biopolímero 2' (ver debajo), frente al grupo amino de partida. Por tanto, este cambio en la temperatura de transición es un claro indicador de la modificación de los biopolímeros.
Los biopolímeros 2-4 fueron modificados como se ha descrito para el biopolímero 1 , dando lugar a los biopolímeros 2'-4', respectivamente.
Todos los polímeros modificados fueron caracterizados de manera similar al T. Se determinaron sus pesos moleculares por MALDI-TOF y su temperatura de la transición inversa por DSC (excepto en el caso del biopolímero 3’ y 4’, puesto que pese a la modificación no se observó una temperatura de transición), llegándose a conclusiones semejantes a las anteriores. Modificación del biopolímero 2 para obtener el biopolímero 2 (ELR-alquino)
Masa molar media experimental (MALDI-TOF): 62.271 Da.
Diferencia masa molar entre el biopolímero 2 y 2’: 2.028 Da.
Temperatura de transición (DSC) en PBS: 18,9 °C.
Diferencia temperatura de transición entre el biopolímero 2 y 2’: 17,8 °C.
Modificación del biopolímero 3 para obtener el biopolímero 3' (ELR-K-azida)
Masa molar media experimental (MALDI-TOF): 36.225 Da.
Diferencia masa molar entre el biopolímero 3 y 3’: 32357.
Temperatura de transición (DSC) en PBS: N.A.
Diferencia temperatura de transición entre el biopolímero 3 y 3’: N.A.
Modificación del biopolímero 4 para obtener el biopolímero 4 (ELR-LREL-azida)
Masa molar media experimental (MALDI-TOF): 99.278 Da.
Diferencia masa molar entre el biopolímero 4 y 4’: 1.181 Da.
Temperatura de transición (DSC) en PBS: N.A.
Diferencia temperatura de transición entre el biopolímero 4 y 4’: N.A.
EJEMPLO 2. AISLAMIENTO DE ISLOTES PANCREÁTICOS Y OBTENCIÓN DE CÉLULAS b SECRETORAS DE INSULINA A PARTIR DE CÉLULAS PLURIPOTENTES INDUCIDAS HUMANAS (hiPSCs).
2.1. Aislamiento de islotes pancreáticos.
Los islotes pancreáticos se obtuvieron a partir de una biopsia de páncreas, combinando la digestión enzimática con colagenasa P en medio de cultivo Hanks con incubación a 37°C durante 15 minutos, y posterior gradiente de densidad con Histopaque 1077 para obtener islotes con elevada pureza. Tras la obtención, una parte de cada lote se destinó a la caracterización morfológica por histología e inmunohistoquímica. Por otro lado, también se estudiaron los niveles hormonales en los islotes, así como el contenido de ADN, la capacidad de liberación de insulina y los niveles de expresión de distintos genes por qPCR. 2.2, Obtención de células pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) y diferenciación a células β secretoras de insulina.
Las células pluripotentes inducidas humanas se obtienen a partir de la desdiferenciación de céiulas adultas siguiendo protocolos bien establecidos (K Takahashi, et al., 2006, Cell, 126(4), 663-676). Posteriormente, se cultivaron en el interior de hidrogeles de Matrigel (Corning) con medio NutriStem XF (Biológical Industries), lo que conlleva una formación de esferoides, excepto cuando se necesitan células individuales, en cuyo caso se añade la enzima acutasa, que rompe las uniones intercelulares. Una vez formados los esferoides, se diferenciaron hacia células β pancreáticas secretoras de insulina, en concreto las células que forman parte del endodermo del esferoide. Para ello, se siguió un protocolo establecido (Pagliuca et al., 2014, Cell, 159(2), 428-439, y Vegas et al., 2016, Nature Medicine, 22(3), 306-311) con ligeras modificaciones en cuanto a los suplementos utilizados en los medios de cultivo. Tras 35 días de proceso, las células se disgregaron del esferoide y se tiñeron mediante inmunofluorescencia para determinar la presencia de insulina y/o glucagón, encontrando una expresión mucho mayor de la primera que del segundo, tal y como se desea para el tratamiento de la diabetes. Las células obtenidas a partir de la diferenciación de las hiPSCs secretan insulina en respuesta a glucosa, de forma similar a las céiulas b presentes en los islotes pancreáticos.
EJEMPLO 3. RECUBRIMIENTO DE ISLOTES PANCREÁTICOS CON ELRs MEDIANTE LA TÉCNICA CAPA A CAPA.
3.1. Método de recubrimiento.
El recubrimiento de islotes pancreáticos se llevó a cabo mediante un método optimizado para conseguir recubrir islotes, tanto de rata como humanos, sin pérdida de viabilidad, introduciéndolos en la disolución que contenía la primera mezcla de ELRs, conteniendo un 70, 80 o 90% de ELR-LREL-azida y un 30, 20 o 10% de ELR-K~azida, en tubos de centrífuga de 15 mi. Posteriormente, estos tubos se colocaron en un agitador rotatorio de 360° para evitar la sedimentación y agregación de los islotes y conseguir así un recubrimiento homogéneo. Una vez completado el proceso, se centrifugaron suavemente para retirar la disolución con el primer ELR y añadir solución de lavado para retirar los restos del mismo que no se hayan unido a la superficie del islote. Se repitió el proceso de agitación y centrifugación para asi añadir la disolución que contenía el segundo ELR (ELR-alquino), que reacciona con el anterior para formar un enlace covalente y por tanto formar una bicapa (BL) estable por layer-by-layer”. Todo este proceso conllevó una optimización de los distintos pasos, modificando parámetros como la concentración de los ELRs, el volumen de las disoluciones, el número de veces que se repite el proceso (número de BLs), o el tiempo de incubación.
En concreto, se hizo una optimización de la composición de ias dos primeras BLs, siendo estas determinantes para la consecución de un recubrimiento completo e íntegro alrededor de los islotes. Para ello, se utilizó como primera capa una mezcla de un ELR con un alto número de lisinas que permiten una interacción inespecífica con la superficie celular, modificado con azida (ELR-K-azida, SEQ ID NO: 3), en combinación con un ELR que incorpora el dominio LREL (SEQ ID NQ: 5) de unión a colágeno tipo i modificado con azida (ELR-LREL-azida, SEQ ID NO: 4), una proteína presente en la matriz extraceiular de los islotes pancreáticos. De este modo se consiguió una buena interacción con la superficie de los islotes y la formación de una primera BL íntegra y estable, repitiéndose ei proceso con la siguiente. Por tanto, en este punto fue necesaria una optimización de la relación entre el ELR-K-azida y el ELR-LREL-azida (ver Fig. 1). Por otro lado, las BLs que se asientan sobre las dos primeras bicapas no son tan determinantes, al interaccionar con ias anteriores, aportando una mayor densidad al nanorrecubrimiento para conseguir un inmunoaislamiento efectivo. La optimización se llevó a cabo según lo descrito en el punto 3.5.
3.2. Caracterización de la homogeneidad e integridad del recubrimiento de islotes pancreáticos obtenido por “layer-by-layer”.
La caracterización del recubrimiento se realizó marcando los ELRs con sondas fluorescentes para poder observarlos por microscopía de fluorescencia. En este caso, la observación del recubrimiento fluorescente se llevó a cabo con islotes de rata, similares en composición a los que se encuentran en humanos, utilizando distinto número de BLs. Mediante microscopía de fluorescencia (Fig. 2) se determinó que el recubrimiento más homogéneo y continuo, evitando la formación de agregados, se conseguía a partir de las tres bicapas. Además, por microscopía confocal (Fig. 3) de cortes de los islotes recubiertos se observó ia integridad de las bicapas alrededor del islote pancreático, que fueron recubiertos con seis BLs. 3.3. Caracterización in vitro de la permeoselectividad del recubrimiento de islotes pancreáticos obtenido por "layer-by-layer”.
Se comprobó la impermeabilidad a las citoquinas TNF-α e IFN-γ del recubrimiento de seis bicapas sobre islotes pancreáticos humanos, lo que se traduce en una mayor viabilidad celular cuando los islotes se cultivan en presencia de estas citoquinas ( Fig. 4), confirmando la efectividad del recubrimiento.
3.4. Determinación in vitro de la liberación de insulina por los islotes pancreáticos recubiertos.
Los niveles de liberación de insulina en respuesta a la adición de glucosa se determinaron experimentalmente mediante un sistema de perfusión, observando una liberación similar en el caso de los islotes recubiertos con hasta nueve bicapas de ELR- azida y ELR-alquino, en comparación con los islotes control no recubiertos, incluyendo los casos en los que se utilizan las condiciones propuestas en el punto 3.1, es decir, diferentes ratios de combinaciones de ELR-K-azida y ELR-LREL-azida de la primera capa de la primera bicapa (10/90, 20/80 y 30/70%, respectivamente) (ver Fig. 5 para el resultado de liberación de insulina con tres bicapas y Fig. 6 para el resto de condiciones).
3.5. Determinación de la capacidad de inmunoaislamiento in vivo dei nanorrecubrimiento de ELRs sobre islotes pancreáticos.
Para la determinación de la estabilidad y el inmunoaislamiento de los islotes pancreáticos gracias ai recubrimiento con ELRs, se trasplantaron islotes alogénicos recubiertos con diferente número de bicapas en ratones. Posteriormente, se recuperaron los islotes tras tres semanas y se comprobó por inmunohistoquímica su estabilidad y la presencia de células liberadoras de insulina y glucagón.
En un primer caso, se trasplantaron islotes de ratón recubiertos con tres BLs compuestas de ELR-RGD-azida y ELR-alquino en la cápsula renal de ratones inmunocompetentes. Tras tres semanas, se sacrificaron los animales y se recuperaron los riñones donde se habían trasplantado los islotes para su procesamiento inmunohistoquímico. En concreto, se realizó una tinción específica de linfocitos T (anticuerpos anti-CD3), observándose un gran número de los mismos en los islotes trasplantados (Fig. 7), lo cual demuestra un inmunoaislamiento ineficiente del nanorrecubrimiendo con fres bicapas.
En sucesivos experimentos, se probaron distintas cantidades de BLs, en concreto tres, seis, nueve y doce, así como periodos de incubación de los islotes en las disoluciones de ELRs de hasta una hora, sin conseguir una mejora en cuanto al inmunoaislamiento.
Esta mejora se consiguió finalmente modificando la composición de las BLs, esto es, los ELRs utilizados en cada capa, incorporando en las dos primeras bicapas un ELR rico en cargas positivas para una mejor interacción electrostática inespecífica con la superficie de los islotes (ELR-K-azida, SEQ ID NO: 3), en combinación con un ELR que contiene dominios de unión al colágeno presente en dicha superficie (ELR-LREL-azida, SEQ ID NO: 4), los cuales reaccionan con un ELR-alquino para formar las BLs por “layer by iayer”. Este procedimiento se describe con detalle en la sección 3.1 y en la Fig. 1. De este modo, se consiguió un recubrimiento que permitió el inmunoaislamiento de los islotes pancreáticos y, por tanto, el no reconocimiento de los mismos por el sistema inmune del organismo receptor del trasplante (Fig. 8).
EJEMPLO 4. RECUBRIMIENTO CON ELRs MEDIANTE LA TÉCNICA CAPA A CAPA DE CÉLULAS β SECRETORAS DE INSULINA OBTENIDAS MEDIANTE LA DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS PLURIPOTENTES INDUCIDAS HUMANAS (hiPSCs).
4.1. Método de recubrimiento.
Para el método de recubrimiento utilizado para las células β secretoras de insulina obtenidas mediante la diferenciación de células pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs), en adelante células β secretoras de insulina, se utilizaron los denominados “cell strainers” o colador de células, que permite pasar las células de una disolución a otra fácilmente. En primer lugar, se sembraron las células en dicho “cell strainer” y se sumergieron en la primera disolución de ELR~azida, para después pasarla a una segunda disolución que contenía ELR-alquino y que reacciona con la anterior. Este paso se repitió para obtener tantas BLs como sean necesarias, para finalizar con un paso de lavado para retirar el exceso de ELRs. Al igual que en el caso de los islotes pancreáticos (Ejemplo 3), este procedimiento conllevó una optimización para conseguir un perfecto inmunoaislamiento de las células b secretoras de insulina. Específicamente, la mejor protección se obtuvo con tres bicapas de ELR-RGD-azida (SEQ ID NO: 1) y ELR-alquino (SEQ ID NO: 2).
4.2. Caracterización de la homogeneidad e integridad del recubrimiento por “layer- by-layer” de células β secretoras de insulina.
El recubrimiento se caracterizó por microscopía de fluorescencia y confocal, de forma similar a lo descrito en el punto 3.2 (Fig. 9).
Por otro lado, se realizó una tinción por inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-elastina, de tal modo que se pudo observar el recubrimiento alrededor de esferoides de células β secretoras de insulina (Fig. 10).
4.3. Determinación in vitro de la liberación de insulina por células β secretoras de insulina nanorrecubiertas con ELRs por “layer-by-layer”.
La medida de los niveles de insulina liberada por las células β secretoras de insulina recubiertas con tres bicapas de ELRs mostró una respuesta diferencial, liberando más insulina ai aumentar la concentración de glucosa en el medio (Fig. 11), tal y como ocurre de forma fisiológica.
4.4. Determinación de la capacidad de Inmunoaislamiento in vivo de células β secretoras de insulina recubiertas.
Se determinó, en primer lugar, la viabilidad de las células β secretoras de insulina recubiertas con tres bicapas de ELRs tras 7 y 14 días post-implante en ratones, demostrándose una buena viabilidad (Fig. 12).
Por otro lado, se estudió la presencia de linfocitos en el interior de los esferoides de células β secretoras de insulina tras implantarlos en ratones. Se observó una gran infiltración de linfocitos en el caso de los esferoides control (no recubiertos, Fig. 13), mientras que no se observaron linfocitos infiltrados en los esferoides recubiertos con tres bicapas de ELRs (Fig. 14), lo que demuestra el inmunoaislamiento gracias al recubrimiento.
En la Fig. 15 se puede observar un resultado similar, en el que los esferoides de células b secretoras de insulina recubiertos mediante “layer~by~layer con tres BLs de ELRs (ELR-RGD-azida (SEG ID NO: 1) y ELR-alquino (SEG ID NO: 2)) están en perfecto estado, mientras que los esferoides no recubiertos contienen una gran cantidad de células del sistema inmune infiltradas, por lo que su estabilidad está completamente comprometida.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento in vitro para el nanorecubrimiento de células que comprende las siguientes etapas: a. sumergir, durante un tiempo de entre 5 y 30 min, las células en una primera disolución que comprende al menos un recombinámero de tipo elastina (ELR), donde dicho ELR ha sido modificado para comprender grupos azida o grupos alquino y cargas positivas, b. sumergir, durante un tiempo de entre 1 y 5 min, las células de la etapa (a) en una segunda disolución que comprende otro ELR, donde dicho ELR ha sido modificado para comprender: (i) grupos alquino, cuando el ELR de la etapa (a) comprende grupos azida, o (ii) grupos azida, cuando el ELR de la etapa (a) comprende grupos alquino, formando así una bicapa de ELRs, y c. repetir ai menos una vez más las etapas (a) y (b) hasta conseguir ai menos dos bicapas de ELRs, donde los ELR de las etapas (a) y (b) están a una concentración de entre 5 y 25 mg/ml, en un volumen de entre 3 y 15 ml y donde las etapas (a) y (b) se llevan a cabo a una temperatura de entre 4°C y 5°C.
2. El procedimiento según la reivindicación 1 , donde las cargas positivas del ELR de la etapa (a) son L-Lys presentes en la posición 4 de la secuencia aminoacídica del ELR,
3. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde las células son células β secretoras de insulina obtenidas mediante diferenciación de células pluripotentes Inducidas humanas.
4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende una etapa previa a la etapa (a) que comprende sembrar las células en un colador de células.
5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el ELR de la etapa (a) además comprende una secuencia de adhesión celular.
6. El procedimiento según la reivindicación 5, donde la secuencia de adhesión celular es RGD.
7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el ELR de la etapa (a) comprende grupos azida y el ELR de la etapa (b) comprende grupos alquino.
8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el ELR de la etapa (a) comprende la SEG ID NO: 1.
9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el ELR de la etapa (b) comprende la SEQ ID NO: 2.
10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que además comprende una etapa final de lavado.
11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en un volumen de entre 3 y 10 mi y a una temperatura de 4°C.
12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , donde las etapas (a) y (b) se repiten, de acuerdo con la etapa (c), al menos dos veces más hasta conseguir ai menos tres bicapas de ELRs.
13. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde las células son islotes pancreáticos.
14. El procedimiento según la reivindicación 13, donde la primera disolución de la etapa (a) comprende una mezcla de dos ELR, donde ambos ELRs comprenden grupos azida y donde uno de los dos ELR además comprende una secuencia de adhesión celular que comprende la SEQ ID NO: 5.
15. El procedimiento según la reivindicación 14, donde la proporción de los dos ELRs en la mezcla es del 10% para el ELR que no comprende la secuencia de adhesión celular y del 90% para el ELR que comprende la secuencia de adhesión celular, o del 20% para el ELR que no comprende la secuencia de adhesión celular y del 80% para el ELR que comprende la secuencia de adhesión celular, o del 30% para el ELR que no comprende la secuencia de adhesión celular y del 70% para el ELR que comprende la secuencia de adhesión celular.
16. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, donde el ELR que no comprende la secuencia de adhesión celular comprende la SEQ ID NO: 3 y el ELR que comprende la secuencia de adhesión celular comprende la SEQ ID NO: 4.
17. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, donde el ELR de la etapa (b) comprende la SEQ ID NO: 2.
18. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, donde las etapas (a) y (b) se llevan a cabo en un volumen de entre 5 y 15 ml y a una temperatura de 5°C, y donde la etapa (a) se lleva a cabo durante un tiempo de 30 min.
19. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, que además comprende agitar las células durante todo el procedimiento en un agitador rotatorio de 360°.
20. El procedimiento según la reivindicación 19, donde la agitación se lleva a cabo a 3 rpm.
21. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, que además comprende una etapa adicional, entre las etapas (a) y (b), de centrifugado, lavado y centrifugado.
22. El procedimiento según la reivindicación 21, donde el centrifugado se lleva a cabo a 1000 rpm, durante 1 min, a 5°C.
23. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 22, donde ia repetición de las etapas (a) y (b), de acuerdo con la etapa (c), da lugar a dos bicapas de ELRs de igual composición.
24. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 23, que además comprende una etapa adicional (d) en la que se repiten al menos una vez más las etapas (a) y (b) y en la que la primera disolución de la etapa (a) comprende un ELR modificado para comprender grupos azida y la secuencia de adhesión celular RGD y la segunda disolución de la etapa (b) comprende un ELR modificado para comprender grupos alquino.
25. El procedimiento según la reivindicación 24, donde en ¡a etapa adicional (d) el ELR de ia primera disolución comprende la SEQ ID NO: 1 y el ELR de la segunda disolución comprende la SEQ ID NO: 2.
26. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, donde las células proceden de un humano.
27. Células aisladas nanorecubiertas obtenidas por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.
28. Células según la reivindicación 27, que son células β secretoras de insulina obtenidas mediante diferenciación de células pluripotentes inducidas humanas o islotes pancreáticos.
29. Células según cualquiera de las reivindicaciones 27 o 28 para su uso en medicina.
30. Células según la reivindicación 28 para su uso en el tratamiento y/o prevención de la diabetes.
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