WO2021141456A1 - Mhc 및 종양 항원을 동시 발현하는 항원제시세포를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 암 치료 - Google Patents

Mhc 및 종양 항원을 동시 발현하는 항원제시세포를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 암 치료 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a vaccine composition for preventing or treating cancer comprising an antigen presenting cell in which a complex of a major histocompatibility complex (MHC) and a tumor antigen is overexpressed on a cell surface, and cancer treatment using the same.
  • MHC major histocompatibility complex
  • An anticancer therapeutic cell vaccine for anticancer purposes is an anticancer vaccine by loading tumor antigens into specialized antigen-presenting cells, for example, dendritic cells, and administering the antigen to cancer patients. look forward to the performance of
  • epitope peptide incubation method which is commonly used for antigen loading, is mechanically dependent on the complementary restriction principle (epitope-MHC restriction) of specific MHC alleles and antigenic epitopes of antigen-presenting cells,
  • epitope-MHC restriction complementary restriction principle
  • the range of antigen-presenting epitope sequences and the overall antigen-presenting efficacy are inevitably limited by the specific MHC allele and its expression level already expressed in antigen-presenting cells.
  • One example provides a vaccine composition for preventing or treating cancer, comprising antigen presenting cells overexpressed on the cell surface in which a complex of a major histocompatibility complex (MHC) and a tumor antigen is overexpressed.
  • MHC major histocompatibility complex
  • Another example provides a method for treating cancer, comprising administering to a patient an antigen-presenting cell in which a complex of MHC and a tumor antigen is overexpressed on the cell surface.
  • Another example provides an antigen-presenting cell in which a complex of MHC and a tumor antigen is overexpressed on the cell surface for use in the treatment of cancer.
  • Another example provides the use of an antigen-presenting cell in which a complex of MHC and a tumor antigen is overexpressed on the cell surface for use in the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
  • gene constructs that simultaneously express an MHC allele and a tumor antigen gene; an expression vector containing the gene construct; RNA transcripts transcribed from the gene construct; Or it provides a method for preparing a vaccine composition for preventing or treating cancer, comprising introducing a polypeptide generated from the gene construct, expression vector, or RNA transcript into antigen-presenting cells.
  • the present invention uses a bicistronic gene construct or mRNA transcript that simultaneously and maximally expresses a patient's tumor-derived cell-specific MHC allele and a tumor antigen, in normalized specific antigen-presenting cells, "specific MHC allele" And it is based on the idea of solving the constraint factor of antigen presentation ability by the reference cell expression level.
  • the tumor-derived neoantigen sequence obtained in the patient tumor analysis and the tumor-derived MHC allele of each patient are simultaneously overexpressed in antigen-presenting cells, thereby generating the maximum amount of "epitope-MHC immunostimulatory complex" into cells. Maximizes the tumor antigen presentation efficacy of antigen-presenting cells by expressing them on the surface, and by administering them to patients, ultimately triggers the proliferation and activation of patient-specific anti-cancer T cells to the maximum, and increases and maximizes the effect of new antigen-specific anti-cancer immunity want to do
  • a vaccine composition for preventing or treating cancer comprising an antigen presenting cell in which a complex of a major histocompatibility complex (MHC) and a tumor antigen is overexpressed on a cell surface.
  • MHC major histocompatibility complex
  • an antigen-presenting cell in which a complex of MHC and a tumor antigen for use in cancer treatment is overexpressed on the cell surface.
  • an antigen-presenting cell in which a complex of MHC and a tumor antigen is overexpressed on the cell surface for use in the manufacture of a medicament for cancer treatment.
  • the antigen-presenting cell may be a dendritic cell.
  • the antigen-presenting cell comprises: a gene construct that simultaneously expresses an MHC allele and a tumor antigen gene; an expression vector containing the gene construct; or an RNA transcript transcribed from the gene construct that simultaneously expresses an MHC allele and a tumor antigen gene; Alternatively, by including a polypeptide generated from the gene construct, expression vector, or RNA transcript, the complex of MHC and tumor antigen may be overexpressed on the cell surface.
  • the MHC may be MHC class I or MHC class II.
  • the gene construct may include a nucleic acid sequence of an MHC allele and a nucleic acid sequence encoding a tumor antigen.
  • the nucleic acid sequence of the MHC allele may be fused with a sequence encoding beta-2-microglobulin (B2M) at its N-terminus.
  • B2M beta-2-microglobulin
  • the MHC allele and the tumor antigen may be derived from tumor cells of a cancer patient to be treated.
  • the tumor antigen may include a tumor-associated antigen (TAA), a tumor-specific antigen (TSA), or a neoantigen derived from a tumor.
  • TAA tumor-associated antigen
  • TSA tumor-specific antigen
  • neoantigen derived from a tumor may include a tumor-associated antigen (TAA), a tumor-specific antigen (TSA), or a neoantigen derived from a tumor.
  • the tumor-derived neoantigen may include a mutation specifically expressed in cancer cells.
  • the tumor-associated antigen is gp100, Melan-A/MART, MAGE-A, MAGE (melanoma antigen E), MAGE-3, MAGE-4, MAGE-A3, tyrosinase, TRP2 , NY-ESO-1, CEA (carcinogen antigen), PSA, p53, maglobin-A, survivin, Muc1 (mucin1)/DF3, metallophan stimullin-1 (metallopanstimulin-1, MPS-1), cytochrome P450 isoform 1B1, 90K/Mac-2 binding protein, Ep-CAM (MK-1), HSP-70, hTERT (TRT), LEA, LAGE-1 /CAMEL, TAGE-1, GAGE, 5T4, gp70, SCP-1, c-myc, Cyclin B1, MDM2, p62, Koc, IMP1, RCAS1, TA90, OA1, CT-7, HOM-MEL-40/SSX- 2, SSX
  • the gene construct encodes (a) in the 5' to 3' direction, a promoter, 5'-UTR, a nucleic acid sequence of an MHC allele, a nucleic acid sequence of an internal ribosome entry site (IRES), and a tumor antigen and a nucleic acid sequence comprising a 3'-UTR, or (b) in the 5' to 3' direction, a promoter, a 5'-UTR, a nucleic acid sequence encoding a tumor antigen, a nucleic acid sequence of an internal ribosome entry site (IRES), a nucleic acid sequence of an MHC allele, and a 3'-UTR.
  • the nucleic acid sequence of the MHC allele may be fused with a sequence encoding beta-2-microglobulin (B2M) at its N-terminus.
  • the RNA transcript may be an mRNA transcript.
  • the expression vector may be a bicistronic expression vector.
  • the gene construct, expression vector, RNA transcript, or polypeptide may be introduced into antigen-presenting cells by electroporation.
  • the antigen-presenting cells may be derived from autologous or allogeneic cancer patients.
  • the vaccine may be a personalized anti-cancer vaccine.
  • a gene construct that simultaneously expresses an MHC allele and a tumor antigen gene; an expression vector containing the gene construct; RNA transcripts transcribed from the gene construct;
  • a method for preparing a vaccine composition for preventing or treating cancer comprising introducing a polypeptide generated from the gene construct, expression vector, or RNA transcript into antigen-presenting cells.
  • FIG. 1 shows the structure of a gene construct simultaneously expressing an MHC class I allele (ORF1) and a tumor antigen (ORF2) and an mRNA transcript transcribed in vitro therefrom, according to an embodiment of the present application.
  • FIGS. 2A and 2B show the entire sequence structure of a reference template "LGV1007", according to an embodiment of the present application.
  • FIG. 3 shows the results of electrophoresis confirmation that mRNA transcripts were produced after in vitro transcription of the reference template "LGV1007" according to an embodiment of the present application.
  • Figures 4a, 4b and 4c show that the LGV1007 mRNA transcript according to an embodiment of the present application was electroporated into K562 cells and then, in order to derive a condition in which the expression level reaches a maximum, the LGV1007 mRNA transcript is 0 per 1 X 10 6 cells. , shows the results of confirming the expression level of HLA-A*0201 molecules for 9 days after electroporation into K562 cells in an amount of 3, 5, or 10 ⁇ g.
  • FIG. 5 shows the results of performing in vitro translation of the LGV1007 mRNA transcript according to an embodiment of the present application and confirming that the tumor antigen was expressed as a protein by Western blot.
  • Figure 6 (a) is the result of confirming by Western blot that the MHC class I allele (ORF1) was expressed as a protein after electroporation of LGV1007 mRNA transcript into K562 cells according to an embodiment of the present application, (b) is Shows the results confirmed by Western blot that all of the tumor antigen (ORF2) was expressed as a protein.
  • Figure 9 shows the structural description of the LGV1032 mRNA transcript and the cell expression results in personalized monocyte-derived dendritic cells (MoDC).
  • LGV1032 has the same bicistronic transcript configuration as LGV1007, maintains ORF2 (tumor antigen part), and has a GFP reporter protein positioned on ORF1 as a cell expression marker. It was confirmed that LGV1032, like LGV1007, was effectively expressed in individual autologous dendritic cells after introduction into the cell by the electroporation method.
  • An example herein relates to a nucleic acid molecule that simultaneously expresses an MHC and a tumor antigen.
  • nucleic acid composition that simultaneously expresses MHC and a tumor antigen.
  • RNA transcript from a gene construct that simultaneously expresses the MHC and the tumor antigen.
  • an antigen-presenting cell in which a complex of MHC and a tumor antigen is overexpressed on the cell surface; And it relates to a vaccine composition for preventing or treating cancer comprising the same.
  • nucleic acid refers to a DNA or RNA molecule or sequence
  • nucleic acid composition refers to a nucleic acid, nucleic acid molecule, or composition comprising such a nucleic acid sequence
  • gene construct refers to a nucleic acid construct operably linked such that a gene insert encoding a protein of interest is expressed.
  • the gene construct may be linear or circular, or single-stranded or double-stranded DNA, cDNA, RNA, etc. encoding two or more target proteins as bicistronic transcripts.
  • a gene construct may form part of a vector that can be used to transform, transfect or transfect a host, but is not limited thereto, and may itself be transcribed and/or translated in vitro.
  • operably linked means that the bonds between nucleic acid sequences are functionally linked.
  • a coding sequence eg, a sequence encoding a protein of interest
  • a coding sequence may be operably linked with appropriate regulatory elements to enable its replication, transcription and/or translation.
  • a coding sequence is operably linked to a promoter if the promoter is capable of driving transcription of the coding sequence.
  • Regulatory elements need not be contiguous with the coding sequence as long as they function correctly.
  • an intervening sequence that is not translated but transcribed may exist between the promoter sequence and the coding sequence, and the promoter sequence may still be considered “operably linked" to the coding sequence.
  • Each component in the gene construct must be operably linked to each other, and the linking of these component sequences can be accomplished by ligation (ligation) at convenient restriction enzyme sites, and when such sites do not exist, usually It can be performed using a synthetic oligonucleotide adapter or linker according to the method of
  • ribosomes can synthesize polypeptides even inside mRNA in eukaryotic cells, so that multiple polypeptides can be synthesized from one mRNA It means the system
  • the gene construct was designed so that the nucleic acid sequence encoding the MHC allele and the nucleic acid sequence encoding the tumor antigen can be simultaneously expressed from one mRNA.
  • prokaryotic cells have a polycistronic system capable of synthesizing several proteins at once by binding ribosomes to multiple positions of one mRNA, but eukaryotes, in principle, produce one mRNA from one promoter and the It has a monocistronic system in which only genes are translated and polypeptides are synthesized.
  • the gene construct of the present application can express several polypeptides from one mRNA in a eukaryotic cell, for example, by locating each gene under a respective promoter for expression, or IRES (internal ribosome) between two genes. entry site), it is possible to simultaneously express both genes under one promoter.
  • composition comprising (a given component)” can mean comprising or constituting essentially of a component other than the component described. .
  • MHC major histocompatibility complex
  • major histocompatibility complex refers to a protein that serves to provide antigenic fragments to immune cells so that the immune cells can differentiate between self and non-self molecules, MHC class I and MHC class
  • MHC class I is found in all nuclear-bearing cells
  • MHC class II is found in antigen-presenting cells. The technical idea provided herein is applicable to both MHC class I or MHC class II.
  • the adaptive immune response when a pathogen or antigen enters the body, antigen-presenting cells ingest it and break it down into short peptide fragments, and the peptide binds to MHC class I or MHC class II molecules within the cell and binds to the cell. can be transported to the surface.
  • T cells when peptides of pathogens or antigens bind to MHC class I or MHC class II and are presented on the cell surface of antigen-presenting cells, T cells recognize them through the T cell receptor (TCR) and are activated and initiate an immune response.
  • TCR T cell receptor
  • the peptide of the pathogen or antigen corresponds to an "epitope" of a T cell.
  • Human MHC is called human leukocyte antigen (HLA), and MHC class I (or HLA class I) molecules include HLA-A, HLA-B and HLA-C.
  • MHC class I molecules are composed of an alpha polypeptide chain and a beta-2-microglobulin. MHC class I molecules interact with CD8+ cytotoxic T cells and play an important role in organ transplant rejection or destruction of infected cells.
  • MHC class II (or HLA class II) molecules include HLA-DR, HLA-DQ and HLA-DP.
  • MHC class II molecules consist of an alpha polypeptide chain and a beta polypeptide chain. MHC class II molecules play an important role in eliciting cellular immunity by recognizing non-self antigens through interaction with CD4+ helper T cells.
  • the gene encoding MHC is a gene showing severe polymorphism, and a plurality of alleles exist to induce an immune response to various pathogens or antigens.
  • the number of HLA class I alleles has been reported to be more than 18,000 as of January 2020, and the number of HLA class II alleles has been reported to be more than 7,000.
  • HLA-A 5,735, HLA-B 7,053, HLA-C 5,653, HLA-DRB1 2,676, HLA-DQB1 1,771, HLA-DPB1 1,519, etc. were reported (www.ebi.ac.uk /imgt/hla/).
  • Relatively frequent alleles include HLA-A*2402, HLA-A*3303, HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-A*0206, HLA-A*3101, HLA-A*0207, HLA-A*2601, HLA-A*2602, HLA-A*3001, HLA-A*0101, HLA-A*3004, HLA-A*0203, HLA-A*0301, HLA-A*0205, HLA- A*0215N, HLA-A*2408, HLA-A*2420, HLA-A*2610, HLA-A*2901, HLA-A*2603, HLA-A*3201, HLA-B*5101, HLA-B* 1501, HLA-B*4403, HLA-B*3501, HLA-B*5801, HLA-B*4601, HLA-B*5401, HLA-B*1302, HLA-B*2705, HLA-B*0702, HLA-B*4006, H
  • the MHC allele is an MHC class I allele or an MHC class II allele.
  • the MHC allele is from a tumor of the subject patient.
  • the gene construct comprises a nucleic acid sequence of an MHC allele and a nucleic acid sequence encoding a tumor antigen.
  • a nucleic acid sequence encoding an MHC allele can be fused at its N-terminus with a sequence encoding B2M (beta-2-microglobulin), which is expressed at the cell surface when the MHC allele is expressed in antigen-presenting cells.
  • B2M beta-2-microglobulin
  • the human B2M gene encodes a protein of 119 amino acids with 20 N-terminal amino acids encoding a leader sequence.
  • a mature protein contains 99 amino acids.
  • the gene contains 4 exons and 3 introns, the first exon contains the 5' untranslated region, the entire leader sequence and the first two amino acids of the mature polypeptide; the second exon encodes most of the mature protein; the third exon encodes the last four amino acids and a stop codon of the mature protein; The fourth exon contains a 3' non-translated region.
  • the stability of the peptide on the MHC molecule can be increased by fusion with B2M, and the structural stability on the cell surface when expressed in antigen-presenting cells can be increased.
  • the sequence encoding B2M may include all or part of a nucleic acid residue corresponding to the entire human beta-2-microglobulin gene.
  • tumor antigen or “cancer antigen” refers to an antigen expressed in a tumor (cancer) and a molecule that elicits an immune response. Such an immune response may involve the production of antibodies, or the activation of certain immunologically-competent cells, or both.
  • Tumor antigens can be derived from tumor-bearing organisms, killed or inactivated whole tumor cells, or lysates, and include any antigen derived from a tumor. Lysate refers to a substance resulting from the application of a process that causes the division of the normal structure of a cell. Tumor antigen also includes any protein or other substance with antigenic properties that is included in tumor cells and expressed differently than in normal cells.
  • tumor antigens include Tumor-associated antigen (TAA) and Tumor-specific antigen (TSA).
  • TAA Tumor-associated antigen
  • TSA Tumor-specific antigen
  • Tumor-associated antigen is an antigen that is expressed more in cancer cells than in normal cells or at a different stage of differentiation from normal cells, and is a tumor shared antigen that is present in a small amount even in normal cells. Therefore, the immune response using this is highly likely to be disrupted by autotolerance, which is an immunosuppressive mechanism to prevent damage to own cells, or, conversely, unwanted organs may be attacked by autoimmunity.
  • tumor-associated antigens examples include gp100, Melan-A/MART, MAGE-A, MAGE (melanoma antigen E), MAGE-3, MAGE-4, MAGE-A3, tyrosinase, TRP2, NY -ESO-1, CEA (carcinogen antigen), PSA, p53, Mamaglobin-A, Survivin, Muc1 (mucin1)/DF3, metallopanstimulin-1 -1, MPS-1), cytochrome P450 isoform 1B1, 90K/Mac-2 binding protein, Ep-CAM (MK-1), HSP-70, hTERT (TRT), LEA, LAGE-1/CAMEL , TAGE-1, GAGE, 5T4, gp70, SCP-1, c-myc, Cyclin B1, MDM2, p62, Koc, IMP1, RCAS1, TA90, OA1, CT-7, HOM-MEL-40/SSX-2, SSX-1, SSX-4, HOM
  • Tumor-specific antigen refers to an antigen that is specifically present only in cancer cells.
  • TSA Tumor-specific antigen
  • neoantigens include cancer cell-specific gene mutations, and are selectively expressed only in cancer cells, unlike tumor-shared antigens, which are expressed in a trace amount even in normal cells, so that they are non-self-external epitopes (non-self-external epitopes) -self foreign epitope) and induces strong anticancer immune activity.
  • the receptor (TCR) of the T cell recognizes it. Since mutation does not occur in normal cells or tissues, the new antigen-specific T cells are self-reliant. Free from tolerance or autoimmune problems. Because of these advantages, new antigens are considered as ideal targets for T-cell-based cancer immunotherapy.
  • the causes of the occurrence of new antigens include frame-shift deletion or insertion, in which one or more nucleotides constituting DNA are added or deleted, which deviates from the decoding of the genetic code, and the substitution of one nucleotide with another.
  • New antigens are predicted through genome analysis of specific cancer cells of individual cancer patients. For example, DNA is extracted from cancer cells from the patient's tumor, DNA is extracted, and the nucleotide sequence is analyzed and compared with the nucleotide sequence of normal cells to determine the area where the mutation occurred. After selection, a new antigen that stimulates T cells can be identified among the nucleotide sequences of various mutations. This includes processing of big data such as next gene sequencing (NGS), whole-exome sequencing (WES) or RNA sequencing, MHC binding prediction computer program, or prediction of new antigens. For example, artificial intelligence (AI) may be used, but is not limited thereto. Since mutations are not shared between patients, the new antigen can be produced as a personalized cancer vaccine.
  • NGS next gene sequencing
  • WES whole-exome sequencing
  • RNA sequencing MHC binding prediction computer program
  • AI artificial intelligence
  • the new antigen can be produced as a personalized cancer vaccine.
  • APCs antigen-presenting cells
  • dendritic cells which capture and degrade antigens, then load them onto MHC molecules and display them on the surface. It can induce the activity of specific T lymphocytes.
  • Gene constructs may include transcriptional and translational expression control sequences that allow the gene of interest to be expressed in the host of choice.
  • Expression control sequences may include a promoter for effecting transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, and/or sequences regulating the termination of transcription and translation.
  • the start codon and stop codon are generally considered part of the nucleic acid sequence encoding the protein of interest, and must be functional in the subject when the genetic construct is administered and must be in frame with the coding sequence.
  • a gene construct may include (a) in 5' to 3' direction, a promoter, a 5'-UTR, a nucleic acid sequence encoding an MHC allele, a nucleic acid sequence of an internal ribosome entry site (IRES), encoding a tumor antigen and a nucleic acid sequence comprising a 3'-UTR, or (b) in the 5' to 3' direction, a promoter, a 5'-UTR, a nucleic acid sequence encoding a tumor antigen, a nucleic acid sequence of an internal ribosome entry site (IRES), a nucleic acid sequence encoding an MHC allele, and a 3'-UTR.
  • promoter refers to a DNA sequence site to which transcriptional regulators bind, and for the purpose of the present invention, a promoter capable of inducing strong and stable gene expression can be used to increase gene expression rate.
  • Promoters may be constitutive or inducible. Promoters include, but are not limited to, early and late promoters of adenovirus, simian virus 40 (SV40), mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, long terminal repeat (LTR) promoter of HIV, Moloney virus, cytomegalo Virus (CMV) promoter, Epstein virus (EBV) promoter, Loose Sacoma virus (RSV) promoter, RNA polymerase ⁇ promoter, T3 and T7 promoters, major operator and promoter regions of phage lambda, and the like can be exemplified.
  • SV40 simian virus 40
  • MMTV mouse mammary tumor virus
  • LTR long terminal repeat
  • CMV cytomegalo Virus
  • ESV Epstein virus
  • RSV Loose Sacoma virus
  • 5'-UTR untranslated region
  • 5'-UTR refers to a region present at the 5'-terminus of an mRNA transcript but not translated into amino acids. In genomic sequences, the 5'-UTR is generally defined as the region between the transcription start site and the initiation codon.
  • the 5'-UTR of vertebrate mRNA can range from tens to hundreds of bases in length. The translation of mRNA into protein begins with the binding of the 30S subunit of the ribosome to 5'-UTR.
  • 16S rRNA (16S ribosomal RNA) in the 30S subunit of the ribosome binds to the ribosome binding site (RBS) of 5'-UTR
  • tRNA recognizes and binds to the start codon (AUG) of mRNA. Translation into protein begins.
  • the ribosome binding site and the initiation codon of 5'-UTR are approximately 6 to 8 nucleotides apart, and in the ribosome binding site there is a sequence complementary to the sequence at the 3' end of 16S rRNA, which is Dalgarno) sequence.
  • IRES internal ribosome entry site
  • IRES internal ribosome entry site
  • ribosome entry site refers to a nucleotide sequence recognized by the ribosome as the start of the translation process when the transcript is translated. That is, IRES is a specific region that exists inside mRNA to which ribosomes directly bind to enable the synthesis of several polypeptides from one mRNA in eukaryotic cells, and plays a role in enabling the gene construct of the present application to become bicistronic. do.
  • the polypeptide coding sequence located on the 5' side of the IRES is translated from the cap structure at the 5' end, and the polypeptide coding sequence located on the other side of the IRES is translated by attaching a ribosome subunit to the IRES. Therefore, it is possible to separately obtain several polypeptides.
  • the IRES may be obtained from nature or synthetically, and may be derived from a virus such as poliovirus or EMC virus, or may be derived from a cell such as an immunoglobulin heavy chain binding protein (BiP) or an antenna gene (Antp) of Drosophila, but is not limited thereto. does not
  • 3'-UTR untranslated region
  • 3'-untranslated region refers to a region present at the 3'-terminus of an mRNA transcript but not translated into amino acids.
  • the gene construct may be an adapter or linker, an enhancer, a selectable marker (eg, an antibiotic resistance marker), a replication unit, a polyA sequence, a tag for purification (eg, GST, poly-Arg, FLAG, histidine-tag (His- tag) or c-my, etc.) or other sequences of construction and induction known to regulate the expression of genes in prokaryotic or eukaryotic cells or viruses thereof, and various combinations thereof, as appropriate.
  • a selectable marker eg, an antibiotic resistance marker
  • a replication unit e.g, a polyA sequence, a tag for purification (eg, GST, poly-Arg, FLAG, histidine-tag (His- tag) or c-my, etc.) or other sequences of construction and induction known to regulate the expression of genes in prokaryotic or eukaryotic cells or viruses thereof, and various combinations thereof, as appropriate.
  • RNA transcript transcribed from the aforementioned gene construct which simultaneously expresses an MHC allele and a tumor antigen.
  • RNA transcripts are bicistronic in that MHC alleles and tumor antigens can be simultaneously translated and synthesized from the RNA transcript.
  • the RNA transcript may be an mRNA transcript, and the above-described gene construct may be transcribed in a cell and then isolated and purified, but preferably, it may be transcribed in vitro by an in vitro transcription method.
  • the present application also relates to a bicistronic expression vector comprising said gene construct.
  • vector refers to a genetic construct comprising essential regulatory elements operably linked to express a gene insert encoding a target protein in a cell of an individual, and includes a plasmid, a viral vector, a bacteriophage vector, and a cozmid.
  • vectors can be used.
  • each component of the expression vector and the RNA transcript is replaced with a description of each component of the above-described gene construct.
  • Another example herein relates to a polypeptide, produced from the gene construct, an expression vector comprising the gene construct, or an RNA transcript transcribed from the gene construct.
  • Another example of the present application is the above-described gene construct; an expression vector containing the gene construct; RNA transcripts transcribed from the gene construct; or a composition for simultaneously expressing an MHC allele and a tumor antigen, comprising a polypeptide produced from said gene construct, expression vector or RNA transcript.
  • the present application also includes the gene construct; an expression vector containing the gene construct; RNA transcripts transcribed from the gene construct; or or to an antigen-presenting cell comprising a polypeptide produced from the gene construct, expression vector or RNA transcript.
  • the present application also includes the gene construct, an expression vector comprising the gene construct, an RNA transcript transcribed from the gene construct; Or it relates to a method for preparing a vaccine composition for preventing or treating cancer, comprising introducing a polypeptide generated from the gene construct, expression vector, or RNA transcript into antigen-presenting cells.
  • antigen presenting cell refers to any cell that achieves the purpose herein by promoting enhancement of an immune response to an antigen (eg, a tumor antigen).
  • Antigen-presenting cells include dendritic cells (DCs), macrophages, or B cells.
  • Antigen-presenting cells may be derived from autologous or allogeneic cancer patients.
  • autologous refers to cells obtained from an individual and used to treat the same individual, and "allogenic" refers to cells obtained from another individual of the same species.
  • Dendritic cells are the body's most effective antigen-presenting cell type, capable of phagocytosing foreign antigens and presenting them to naive (CD4+ or CD8+ T) and memory T cells.
  • Dendritic cells generally take up antigens by micropigmentation and/or phagocytosis, then intracellularly process these antigens and present the antigens to T cells of the immune system. This processing usually occurs within the body, but by isolating dendritic cells from the body, culturing them in vitro, presenting antigen to the in vitro cultured dendritic cells, and then interacting with the cells with T cells. It is possible to return to the body capable of eliciting an increased immune response to the antigen of interest. This process of presenting the antigen to dendritic cells is generally referred to as loading or pulsing or co-culture.
  • dendritic cell progenitors are obtained from a subject patient or allogeneic or heterogeneous individual and differentiated into dendritic cells, and then the above-described gene construct, RNA transcript, expression vector, or polypeptide may be introduced.
  • dendritic cells can be obtained by differentiation of monocytes isolated from the blood of a subject to be vaccinated. Techniques for the differentiation of dendritic cells from monocytes are well established in the art. As a non-limiting example, in a typical protocol, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) can be isolated from whole blood by density gradient centrifugation, and isolating monocytes from PBMCs utilizes the adherence of monocytes or uses immuno-autologous beads.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the isolated monocytes can be cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 to differentiate into immature dendritic cells.
  • Immature dendritic cells can be cultured in the presence of a maturation factor, typically a TLR-4 agonist, such as LPS, or cultured using a monocyte maturation cocktail comprising TNF ⁇ , IL-6, IL-1 ⁇ and PGE2 to be matured. Maturation of dendritic cells and vector introduction can be performed simultaneously.
  • RNA transcript, or expression vector into a cell can be accomplished by suitable standard techniques, as is known in the art, for example, electroporation, electroinjection, microinjection. ), calcium phosphate co-precipitation, calcium chloride/rubidium chloride method, retroviral infection, DEAE-dextran, cationic liposome method, polyethylene A glycol precipitation method (polyethylene glycol-mediated uptake), a gene gun (gene gun), etc. may be used, but the present invention is not limited thereto.
  • the circular structure can be cut with an appropriate restriction enzyme and introduced in a linear form.
  • a gene construct, RNA transcript, expression vector or polypeptide can be introduced by electroporation.
  • Electroporation refers to the application of an electric current or an electric field to a cell to facilitate entry of an impermeable material into the cell. For example, if a cell is suspended in a solution containing an impermeable substance to be introduced (eg, nucleic acid, vector vector, etc.) and a pulse of DC high voltage is passed through it, a hole is made in the cell membrane by electricity, and A permeable substance may be introduced into the cell.
  • the electroporation device may be a static type electroporation device or a flow type electroporation device.
  • a stationary type electroporation device comprises a specialized cuvette comprising an electrode embedded in a fluid in contact with a fixed amount of target cells. A molecule of interest is placed between two electrodes and pulsed with a high voltage.
  • Another example relates to a vaccine composition for preventing or treating cancer, including the above-described gene construct, RNA transcript, expression vector, or polypeptide, and a method for preparing the same.
  • Another example relates to a vaccine composition for preventing or treating cancer, including the antigen-presenting cell into which the above-described gene construct, RNA transcript, expression vector, or polypeptide is introduced, and a method for preparing the same.
  • Another example relates to a vaccine composition for preventing or treating cancer, comprising antigen-presenting cells in which a complex of an MHC allele and a tumor antigen is overexpressed on the cell surface, and a method for preparing the same.
  • the term "vaccine” refers to a formulation containing the antigen-presenting cells according to the present application and in a form that can be administered to a subject. Therefore, the vaccine composition of the present invention can be conveniently used to prevent, ameliorate, or treat diseases. After introduction into a subject or host, the vaccine is capable of eliciting an immune response including, but not limited to, the production of antibodies, cytokines and/or other cellular responses.
  • the MHC allele and the tumor antigen may be derived from tumor cells of a cancer patient to be treated to which the composition is administered.
  • the cancer vaccine composition of the present invention can overexpress the tumor antigen sequence obtained in the patient tumor analysis, particularly the neoantigen sequence and the tumor-derived MHC allele of each patient simultaneously in antigen-presenting cells (APC), whereby the maximum amount
  • APC antigen-presenting cells
  • the antigen-presenting cells included in the cancer vaccine composition of the present disclosure may simultaneously overexpress the MHC allele and the tumor antigen, whereby the MHC allele and the tumor antigen bind to the antigen-presenting cells.
  • Antigens can be presented to T lymphocytes by expressing them on the surface, and if T lymphocytes are activated through this, strong cancer-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are induced to destroy cancer cells, thereby immunologically treating cancer. have.
  • CTLs cancer-specific cytotoxic T lymphocytes
  • costimulatory substances abundantly expressed in antigen-presenting cells e.g., dendritic cells
  • T lymphocyte receptors and antigen-MHC conjugates e.g., T lymphocyte receptors and antigen-MHC conjugates
  • cytokines involved in T lymphocyte differentiation, growth, or influx Since it can regulate the activity of immune response by secreting it, it can be usefully used for anticancer immunotherapy.
  • the vaccine compositions herein may also include additional adjuvants that enhance the effectiveness of the vaccine.
  • Suitable adjuvants include (1) aluminum salts (alum) such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum sulfate, and the like; (2) oil-in-water emulsion formulations (with or without certain immunostimulatory agents such as muramyl peptides or bacterial cell wall components), such as (a) 5% squalene formulated into submicron particles, 0.5% Tween 80 and 0.5% span 85 (not required but optionally varying amounts of N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1',2'-dipalmitoyl-) MF59 (WO90/14837) containing sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine (MTP-PE), (b) microfluidized to sub-micron particles or large particle size 10% squalene
  • Vaccine compositions may include conventional saline or buffered aqueous solution media suspended or dissolved.
  • it may typically contain diluents such as water, saline, glycerol, ethanol, and the like, and auxiliary substances such as wetting agents, emulsifying agents, pH buffering agents and the like may be present in the composition.
  • Forms suitable for injection include sterile aqueous solutions (aqueous) or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersions. They must be stable under the conditions of manufacture and must be preserved against contamination of microorganisms such as bacteria or fungi. Contamination of microorganisms can be prevented by using various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like. In many cases, it is preferred to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride. Prolonged absorption of the injectable composition may be made possible by the use in the composition of an agent which delays absorption, for example, aluminum monostearate or gelatin.
  • a buffer solution such as PBS
  • sterile injectable solution is prepared by sterilizing by filtration.
  • dispersions are prepared by incorporating the various sterilized active ingredients into a sterile vehicle which contains a basic dispersion medium and the required other ingredients from those described above.
  • the preferred preparation methods are vacuum drying and freeze drying techniques. This technique obtains a powder of the active ingredient and any desired ingredient from a sterile-filtered solution thereof as described above.
  • the delivery of dendritic cells according to the present invention is particularly useful for inducing an immune response, in particular for inducing a response of cytotoxic T-lymphocytes to an antigen.
  • the immune response may be specific (T cells and/or B cells) and/or non-specific immune responses.
  • another aspect of the present invention relates to a method for generating, inducing, or promoting an immune response to an antigen in a human, particularly a cancer patient, wherein the method comprises an effective amount of the vaccine composition or antigen-presenting cell as described above. including administering to cancer patients.
  • the immune response preferably includes a cytotoxic T-lymphocyte response, and the cytotoxic lymphocyte response of the present invention may occur in conjunction with or independently of a helper T-cell response, a humoral response or other specific or non-specific immune response. .
  • Another aspect of the invention relates to the use of the dendritic cells of the invention in connection with the treatment and/or prevention of a disease state.
  • diseases that can be treated according to the method of the present invention include various cancer diseases and intractable cancer diseases.
  • the cancer may be a solid cancer or a blood cancer, including but not limited to breast cancer, lung cancer, prostate cancer, ovarian cancer, brain cancer, liver cancer, cervical cancer, endometrial cancer, uterine cancer, colon cancer, colorectal cancer, colorectal cancer , rectal cancer, kidney cancer, nephroblastoma, skin cancer, oral squamous cell carcinoma, epidermal cancer, nasopharyngeal cancer, head and neck cancer, bone cancer, esophageal cancer, bladder cancer, lymphatic cancer (eg Hodgkin's lymphoma or non-Hodgkin's lymphoma), stomach cancer, Pancreatic cancer, testicular cancer, thyroid cancer, thyroid follicular cancer, melanoma, myeloma, multiple myeloma, mesothelioma, osteosarcoma, myelodysplastic syndrome, tumor of mesenchymal origin, soft tissue sarcoma, liposarcoma
  • the lung cancer may be, for example, small cell lung carcinoma (SCLC) or non-small cell lung carcinoma (NSCLC).
  • the leukemia can be, for example, acute myeloid leukemia (AML), chronic myelogenous leukemia (CML), acute lymphocytic leukemia (ALL) or chronic lymphocytic leukemia (CLL).
  • the subject being treated may be a subject receiving second-line anti-hyperproliferative therapy.
  • the second-line anti-hyperproliferative therapy may be chemotherapy, radiation therapy, immunotherapy, phototherapy, cryotherapy, toxin therapy, hormone therapy, or surgery.
  • another aspect of the present invention provides a method of treating cancer by enhancing a tumor-specific immune response using the cancer vaccine composition. wherein the administration of the composition elicits, induces, or otherwise promotes an immune response that inhibits, stops, delays, or prevents the onset or progression of a disease state.
  • Direct delivery of the composition can generally be systemic, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, intravascular (intravenous), intramuscular, or local delivery, or delivered into an interstitial tissue.
  • the composition may also be administered to a lesion.
  • the dosing regimen may be a single dose or a multiple dose schedule.
  • an effective amount means an amount sufficient to achieve the desired result, eg, an amount effective to treat or prevent cancer, when administered to a subject, including a human.
  • the effective amount may vary depending on factors such as the disease state, age, sex, and weight of the individual. Dosage or therapeutic regimen can be adjusted to provide an optimal therapeutic response as will be understood by those skilled in the art.
  • a therapeutic regimen for a subject with a therapeutically effective amount may consist of a single administration or, alternatively, may include a series of applications.
  • the duration of the treatment phase depends on various factors such as the severity of the disease, the age of the individual, the concentration of the cancer vaccine, the patient's responsiveness to the cancer vaccine, or a combination thereof. It will also be appreciated that the effective dosage of the cancer vaccine used for treatment may be raised or lowered over the course of an individual therapeutic regimen. Variations in dosage may occur and will be apparent through standard diagnostic assays known in the art.
  • the cancer vaccines of the present invention may be administered before, during or after treatment with conventional anticancer agents, radiation therapy, hormone therapy, biotherapy, and/or surgical resection of the tumor.
  • the bicistronic vector for simultaneously expressing the tumor antigen is configured as shown in FIG. 1, and specifically, 5'UTR-ORF1 (recombinant B2M and MHC class I alleles comprising a fusion in the 5' to 3' direction, respectively. open reading frame; specifically, the coding sequence of a fusion protein comprising a B2M at the N-terminus and a tumor-derived MHC class I allele at the C-terminus) -IRES - ORF2 (multiple antigens with a beads-on-a-string structure) coding sequence of a recombinant protein composed of a sexual epitope) - contains a gene construct of 3'UTR.
  • 5'UTR-ORF1 recombinant B2M and MHC class I alleles comprising a fusion in the 5' to 3' direction, respectively. open reading frame; specifically, the coding sequence of a fusion protein comprising a B2M at the N-terminus and a tumor-derived
  • the reference template (Reference template) is named "LGV1007", the signal sequence in the N-terminal to C-terminal direction as ORF1, B2M and HLA-A*0201 It encodes a fusion protein (SEQ ID NO: 1) and a coding sequence of a covalent antigen recombinant protein (SEQ ID NO: 2) including NY-ESO1, MAGE-A3, SURVIVIN, MULTI-MAGE-A, and MELAN-A as ORF2.
  • the entire sequence structure of the LGV1007 is as shown in FIG.
  • LGV1007 is only a representative example according to an embodiment of the present application, and the base sequence of ORF1 and ORF2 may be changed to include a self-derived sequence customized according to individual cancer patients as described above, and ORF1 and Base sequences other than ORF2 can be optimized and standardized for antigen presentation using sequences well known in the art.
  • the bicistronic vector (DNA plasmid vector) obtained in Example 1 above was linearized by digestion with restriction enzyme Xbal, and the linearized DNA was obtained from the Expin TM combo GP kit ( GeneAll, 112-102).
  • the purified linearized plasmid template was used for in vitro transcription (IVT) mRNA production using the mMessage mMachine TM T7 Ultra transcription kit (ThermoFisher), according to the manufacturer's instructions.
  • the resulting mRNA transcripts were finally purified using LiCl precipitation.
  • the mRNA product was mixed lightly with LiCl precipitation solution (50 ⁇ L per 20 ⁇ L of IVT reaction) and incubated at -20°C for at least 30 minutes. Next, the samples were spun down by centrifugation at 20,000 ⁇ g for 14 min at 4°C. The pellet was then washed with 70% ethanol. The final mRNA product was resuspended in deionized water without nuclease. The amount of mRNA product was measured using Nanodrop2000.
  • the mRNA transcript obtained in item 2 above was transferred to human cells using cell electroporation.
  • K562 human bone marrow derived lymphoblastic leukemia cells (ATCC CCL-243 TM ) were electroporated using an AmaxaTM 4D-Nucleofector TM X Unit device and a SF Cell Line Nucleofector TM Solution (Lonza), according to the manufacturer’s protocol.
  • K562 cells were freshly isolated at 3 X 10 5 cells/ml two days before electroporation. On the day of electroporation, cells were counted and the required number of cells (1 ⁇ 2 X 10 6 cells) was prepared at room temperature.
  • Figure 4 shows the LGV1007 mRNA transcript in an amount of 0, 3, 5, or 10 ⁇ g per 1 X 10 6 cells in order to derive conditions for reaching the maximum expression level after electroporation of the LGV1007 mRNA transcript into K562 cells.
  • This maximal overexpression of the non-antigen-presenting cell i.e., tumor-specific individual patient
  • MHC-I allele has the effect of substantially unifying the MHC-I phenotype of the specific antigen-presenting cell to the patient's tumor, resulting in an individual patient It can be expected to maximize the activation of anti-cancer immune T cells.
  • the LGV1007 template DNA plasmid was transferred into a single tube using the TnT Quick Coupled Transcription/Translation Kit (Promega) or the 1-Step Human High-Yield Mini IVT Kit (Thermo Scientific). It was used for in vitro transcription/in vitro translation reactions and followed the manufacturer's manual. The reaction volume was scaled down from 100 ⁇ l to 25 ⁇ l.
  • reaction mixture was incubated at 30°C for 60-90 minutes, and in the case of the 1-Step Human High-Yield Mini IVT kit (Thermo Scientific), the reaction time was 6-16 hours. .
  • FIG. 5 shows the result of confirming by Western blot that in vitro translation of the LGV1007 mRNA transcript was performed and a Flag-tagged polyantigen recombinant protein was generated.
  • Figure 6 is the result of confirming by Western blot that both MHC class I allele (ORF1) and tumor antigen (ORF2) were expressed as proteins after electroporation of LGV1007 mRNA transcript into K562 cells, ORF1 (B2M-HLA-A* 0201) protein was confirmed to have a size of ⁇ 51 kDa (Fig. 6a), and ORF2 (tumor antigen fusion protein) was confirmed to be expressed at an expected size of ⁇ 30 kDa (Fig. 6b). However, since the tumor antigen fusion protein is rapidly degraded by the proteasome upon cell expression, it was confirmed that it was clearly expressed only by the in vitro translation method.
  • Flow cytometry was performed with an Intellicyt iQue TM Screener PLUS (Sartorius) flow cytometer. Specifically, 24-72 hours or up to 2 weeks after nucleofection, LGV series mRNA electroporated K562 cells were collected and centrifuged at 300 x g for 5 minutes. The cell pellet was resuspended in flow cytometry buffer (DPBS containing 1% FBS and 2 mM EDTA). For cell staining, APC conjugated-mouse anti-human HLA-A2 (BD Pharmigen) was added at the recommended concentration and then cells were stained by incubation for 30 minutes to 1 hour in the dark and room temperature. After staining incubation, cells were pelleted and resuspended in PBS. Flow cytometry results were analyzed with Intellicyt ForeCyt software (Sartorius).
  • K562apc antigen-presenting cells In K562apc antigen-presenting cells, a comparison of the superiority of immune activity efficacy between the conventional antigen loading method, peptide pulse, and RNA antigen loading, was tested. Specifically, on day 1, K562apc cells electroporated with LGV1007 mRNA transcripts (included five antigen sequences: SURVIVIN, MART1, NYESO1, MAGEA3, MULTIMAGE) prepared in Example 3 and a reference antigen (SURVIVIN 9 amino acids peptide) ) ELISPOT IFN ⁇ immune activity comparison experiments were performed with mounted K562apc cells or non-peptide-treated K562apc control cells.
  • LGV1007 mRNA transcripts included five antigen sequences: SURVIVIN, MART1, NYESO1, MAGEA3, MULTIMAGE
  • SURVIVIN 9 amino acids peptide SURVIVIN 9 amino acids peptide
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cell
  • PBMC Purified PBMC
  • APC Peripheral blood mononuclear cell
  • T cells 100 ⁇ L/well of T cells and 100 ⁇ L APCs/well were added (mixed in a ratio of 2:1 to 10:1 T cells vs. APC) and the cell mixture was incubated at 37° C. for 24 hours.
  • the culture medium was replaced with 10 U/mL IL-2 and 5 ng/mL IL-15 and re-supplemented with IL-2 after 7 days.
  • IFN ⁇ secreting T cells were analyzed by ELISPOT IFN ⁇ protocol (BD Bioscience) and according to the manufacturer's instructions.
  • PBMC T cell activation assay was performed by directly counting positive spots by observation with a dissecting microscope or automatically counting positive spots using an ELISPOT plate reader.
  • FIG. 8 shows the results of an ELISPOT IFN ⁇ secretion assay measuring the immune activity of PBMC T cells by K562 antigen-presenting cells electroporated with LGV1007 mRNA transcripts.
  • K562 antigen-presenting cells activated through electroporation with reference RNA, LGV1007, primed and activated PBMC CD8+ T cells bearing the homologous MHC class I allele (HLA-A*0201), thereby identifying positive spots that secrete IFN ⁇ . there was.
  • CD8 T cells derived from the heterologous MHC class I allele (non-HLA-A*0201) used as controls were not primed by APCs.
  • the LGV RNA antigen loading method effectively carried out antigen loading and antigen presentation not only in K562apc, which was technically optimized in the laboratory, but also in personalized autologous dendritic cells with various MHC class I and class II, extracted and cultured from each patient. An experiment was conducted to verify whether antigen-specific immune cell activation was effectively conducted, and the results are shown in FIGS. 9 and 10 .
  • LGV1032 has the same bicistronic transcript configuration as LGV1007 (Example 1) and maintains ORF2 (tumor antigen part), but has a structure in which ORF1 is a GFP reporter protein as a cell expression marker. Therefore, the manufacturing method of LGV1032 is the same as that of LGV1007. As a result of the flow cytometry analysis as described above, it was confirmed that LGV1032, like LGV1007, was effectively expressed in individual autologous dendritic cells after introduction into the cells by the electroporation method.
  • LGV1032 electroporated with individual-derived autologous dendritic cells (MoDC) effectively triggers antigen-specific T-cell immune activity.
  • LGV1032 electroporated autologous dendritic cells (FIG. 10, Rows 3 & 4) were compared to autologous dendritic cells (FIG. 10, Row 2) loaded with peptide antigen, which is a traditional method, MART1 antigen-specific TCRe T cells It was clearly verified by ELISPOT IFN ⁇ secretion spot enhancement that it triggers activation quite effectively.

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Abstract

MHC (major histocompatibility complex) 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 항원제시세포 (antigen presenting cell)를 포함하는 암 예방 또는 치료용 백신 조성물 및 이를 이용한 암 치료에 관한 것이다.

Description

MHC 및 종양 항원을 동시 발현하는 항원제시세포를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 암 치료
관련 출원들과의 상호 인용
본 출원은 2020년 1월 10일자 대한민국 특허출원 제10-2020-0003910호 및 2020년 10월 14일자 대한민국 특허출원 제10-2020-0133005호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 상기 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 참조로서 포함된다.
MHC (major histocompatibility complex) 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 항원제시세포 (antigen presenting cell)를 포함하는 암 예방 또는 치료용 백신 조성물 및 이를 이용한 암 치료에 관한 것이다.
항암 목적의 세포기반 치료백신(anticancer therapeutic cell vaccine)은 종양 항원들을 특화된 항원제시세포, 예를 들어, 수지상 면역세포(dendritic cells)에 항원을 탑재 (antigen loading)하여 암 환자에 투여함으로써 항암 백신 역할의 수행을 기대한다.
그러나, 항원탑재에 보편적으로 사용하는 에피토프 펩타이드 탑재 (epitope peptide incubation) 방법은, 기전적으로 항원제시세포의 특정 MHC 대립유전자(allele)와 항원 에피토프의 상보적 제한원리 (epitope-MHC restriction)에 따라, 항원제시세포에 기 발현되어 있는 특정 MHC 대립유전자 및 그 발현량 (expression level)에 의해 항원제시 가능한 에피토프 서열의 범위 및 전체적 항원제시효능이 제한될 수 밖에 없다.
종양 항원, 특히, 서로 다른 세포 특이적 MHC를 지닌 개별 암 환자들로부터 유래된 다양한 환자맞춤형 신항원 (neoantigen)을 치료 목적으로 표준화된 항암 세포백신에 이용하려면, 궁극적으로 개별 항원제시세포들의 MHC 제한성을 극복하는 새로운 세포백신 제작기술의 개발이 요구되므로 이를 해결하고자 한다.
일 예는, MHC (major histocompatibility complex) 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 항원제시세포 (antigen presenting cell)를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
다른 예는, MHC 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 항원제시세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.
다른 예는, 암 치료에 사용하기 위한 MHC 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 항원제시세포를 제공한다.
다른 예는, 암 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 MHC 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 항원제시세포의 용도를 제공한다.
다른 예는, MHC 대립유전자(allele) 및 종양 항원 유전자를 동시에 발현하는 유전자 컨스트럭트; 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터; 상기 유전자 컨스트럭트로부터 전사된 RNA 전사체; 또는 상기 유전자 컨스트럭트, 발현 벡터 또는 RNA 전사체로부터 생성된 폴리펩티드를 항원제시세포에 도입하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 백신 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 환자 종양유래 세포특이적 MHC 대립유전자 및 종양 항원을 동시에 최대량으로 발현하는 바이시스트로닉 유전자 컨스트럭트 또는 mRNA 전사체를 사용하여, 표준화된 특정 항원제시세포에서도, "특이적 MHC 대립유전자 및 기준 세포발현량에 의한 항원제시능의 제약요소"를 해결하고자 하는 아이디어에 기초한 것이다.
특히, 본 발명에서는 환자종양 분석에서 얻어진 종양유래 신항원 서열 (neoantigen sequence) 및 각 환자의 종양유래 MHC 대립유전자를 동시에 항원제시세포에서 과량 발현시켜, 최대량의 "epitope-MHC 면역자극 복합체"를 세포 표면에 발현하여 항원제시세포의 종양항원 제시 효능을 극대화하고, 이를 환자에게 투여함으로써, 궁극적으로 환자맞춤형 항암 T 세포의 증식 및 활성화를 최대한으로 촉발하고, 신항원 특이적 항암 면역 효과를 증대하며 극대화시키고자 한다.
본 발명의 한 측면에 따라, MHC (major histocompatibility complex) 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 항원제시세포 (antigen presenting cell)를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 백신 조성물이 제공된다.
또한, MHC 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 항원제시세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법이 제공된다.
또한, 암 치료에 사용하기 위한 MHC 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 항원제시세포가 제공된다.
또한, 암 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 MHC 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 항원제시세포의 용도가 제공된다.
일 구현예로, 상기 항원제시세포가 수지상 세포(dendritic cell)일 수 있다.
일 구현예로, 상기 항원제시세포는, MHC 대립유전자(allele) 및 종양 항원 유전자를 동시에 발현하는 유전자 컨스트럭트; 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 유전자 컨스트럭트로부터 전사된, MHC 대립유전자 및 종양 항원 유전자를 동시에 발현하는 RNA 전사체; 또는 상기 유전자 컨스트럭트, 발현 벡터 또는 RNA 전사체로부터 생성된 폴리펩티드를 포함함으로써, MHC 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 것일 수 있다.
일 구현예로, MHC 는 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 일 수 있다.
일 구현예로, 상기 유전자 컨스트럭트는 MHC 대립유전자의 핵산 서열 및 종양 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예로, MHC 대립유전자의 핵산 서열은 그 N-말단에 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 서열과 융합된 것일 수 있다.
일 구현예로, MHC 대립유전자 및 종양 항원은 치료대상 암 환자의 종양세포에서 유래한 것일 수 있다.
일 구현예로, 종양 항원은 종양-관련 항원(Tumor-associated antigen; TAA), 종양-특이적 항원(Tumor-specific antigen; TSA) 또는 종양유래 신항원(neoantigen)을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 종양유래 신항원(neoantigen)은 암 세포에 특이적으로 발현되는 돌연변이를 포함할 수 있다.
일 구현예로, 종양-관련 항원(TAA)은 gp100, Melan-A/MART, MAGE-A, MAGE (흑색종 항원 E), MAGE-3, MAGE-4, MAGE-A3, 티로시나아제, TRP2, NY-ESO-1, CEA (암배아 항원), PSA, p53, 마마글로빈-A(Mammaglobin-A), 서바이빈(Survivin), Muc1(뮤신1)/DF3, 메탈로판스티뮬린-1(metallopanstimulin-1, MPS-1), 시토크롬 P450 이소형(isoform) 1B1, 90K/Mac-2 결합 단백질, Ep-CAM (MK-1), HSP-70, hTERT (TRT), LEA, LAGE-1/CAMEL, TAGE-1, GAGE, 5T4, gp70, SCP-1, c-myc, 사이클린 B1, MDM2, p62, Koc, IMP1, RCAS1, TA90, OA1, CT-7, HOM-MEL-40/SSX-2, SSX-1, SSX-4, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HDAC5, MBD2, TRIP4, NY-CO-45, KNSL6, HIP1R, Seb4D, KIAA1416, IMP1, 90K/Mac-2 결합 단백질, MDM2, NY-ESO-1, 또는 LMNA일 수 있다.
일 구현예로, 상기 유전자 컨스트럭트는 (a) 5' 에서 3' 방향으로, 프로모터, 5'-UTR, MHC 대립유전자의 핵산 서열, IRES (internal ribosome entry site) 의 핵산 서열, 종양 항원을 코딩하는 핵산 서열, 및 3'-UTR 을 포함하거나, (b) 5' 에서 3' 방향으로, 프로모터, 5'-UTR, 종양 항원을 코딩하는 핵산 서열, IRES (internal ribosome entry site) 의 핵산 서열, MHC 대립유전자의 핵산 서열, 및 3'-UTR 을 포함 할 수 있다. 바람직한 구현예로, MHC 대립유전자의 핵산 서열은 그 N-말단에 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 서열과 융합된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 RNA 전사체는 mRNA 전사체일 수 있다.
일 구현예로, 상기 발현 벡터는 바이시스트로닉 발현 벡터일 수 있다.
일 구현예로, 상기 유전자 컨스트럭트, 발현 벡터, RNA 전사체, 또는 폴리펩티드가 전기천공법으로 항원제시세포에 도입된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 항원제시세포는 암 환자의 자가(autologous) 또는 동종(allogenic) 유래일 수 있다.
일 구현예로, 상기 백신은 개인 맞춤형 항암 백신일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따라, MHC 대립유전자(allele) 및 종양 항원 유전자를 동시에 발현하는 유전자 컨스트럭트; 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터; 상기 유전자 컨스트럭트로부터 전사된 RNA 전사체; 또는 상기 유전자 컨스트럭트, 발현 벡터 또는 RNA 전사체로부터 생성된 폴리펩티드를 항원제시세포에 도입하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 백신 조성물의 제조 방법이 제공된다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따른, MHC 클래스 I 대립유전자(ORF1) 및 종양 항원(ORF2)을 동시에 발현하는 유전자 컨스트럭트 및 이로부터 인 비트로 전사된 mRNA 전사체의 구조를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 본원의 일 실시예에 따른, 기준 주형(Reference template) "LGV1007"의 전체 서열 구조를 나타낸다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 기준 주형 "LGV1007"에 대한 인 비트로 전사를 수행하고 mRNA 전사체가 생산되었음을 전기영동법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4a, 4b 및 4c는 본원의 일 실시예에 따른 LGV1007 mRNA 전사체를 K562 세포에 전기천공한 후 발현량이 최대치에 도달하는 조건을 도출하기 위하여, LGV1007 mRNA 전사체를 1 X 106 세포 당 0, 3, 5, 또는 10μg의 양으로 K562 세포에 전기천공한 후 9일 동안 HLA-A*0201 분자의 발현량을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따라 LGV1007 mRNA 전사체의 인 비트로 번역을 수행하고 종양 항원이 단백질로 발현되었음을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 6의 (a)는 본원의 일 실시예에 따라 LGV1007 mRNA 전사체를 K562 세포에 전기천공한 후 MHC 클래스 I 대립유전자(ORF1)가 단백질로 발현되었음을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이고, (b)는 종양 항원(ORF2)이 모두 단백질로 발현되었음을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 LGV1007 mRNA 전사체를 K562 세포에 전기천공한지 24시간 이후에 K562 세포 표면에서의 발현량을 유세포 분석법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 LGV1007 mRNA 전사체가 전기천공된 K562 항원제시세포에 의한 PBMC T 세포의 면역 활성을 측정한 ELISPOT IFNγ 분비 분석 결과를 나타낸다.
도 9는 LGV1032 mRNA 전사체의 구조 설명과 개인 맞춤형 단핵구 유래 자가수지상세포 (MoDC, monocyte derived dendritic cells)에서의 세포 발현 결과를 보여준다. LGV1032는, LGV1007와 동종의 bicistronic 전사체 구조 (transcript configuration) 를 지니고 ORF2 (종양 항원파트)는 유지하며, ORF1에 세포발현 표지자로서 GFP reporter 단백질이 자리잡은 구조이다. LGV1032는, LGV1007처럼, 개인유래 자가 수지상 세포에서도 전기천공 방법에 의해서 세포내로 유입 후, 효과적으로 세포 발현 됨을 확인했다.
도 10은 개인 유래 자가수지상 세포로 전기천공 된 LGV1032가, 효과적인 항원제시를 통해서 항원특이적 T세포 면역활성을 촉발한다는 ELISPOT IFNγ 분비 검증 결과를 보여준다.
이하, 본 발명을 보다 자세히 설명한다.
본원의 일예는, MHC 및 종양 항원을 동시에 발현하는 핵산 분자에 관한 것이다.
또는, MHC 및 종양 항원을 동시에 발현하는 핵산 조성물에 관한 것이다.
또는, MHC 및 종양 항원을 동시에 발현하는, 유전자 컨스트럭트에 관한 것이다.
또는, MHC 및 종양 항원을 동시에 발현하는 유전자 컨스트럭트로부터의 RNA 전사체에 관한 것이다.
또는, MHC 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 항원제시세포; 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.
용어, "핵산", "핵산 분자", 또는 "핵산 서열" 은 DNA 또는 RNA 분자 또는 서열을 의미하며, "핵산 조성물"은 이러한 핵산, 핵산 분자 또는 핵산 서열을 포함하는 조성물을 의미한다.
용어, "유전자 컨스트럭트"는 목적 단백질을 코딩하는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 핵산 구조물을 말한다. 일구현예로, 유전자 컨스트럭트는 2 이상의 목적 단백질을 바이시스트로닉 전사체로서 암호화하는 선형 또는 원형, 또는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 DNA, cDNA, RNA 등일 수 있다. 유전자 컨스트럭트는 숙주를 형질전환, 형질감염 또는 트랜스펙션시키는데 사용할 수 있는 벡터의 일부를 이룰 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 그 자체로 인 비트로에서 전사 및/또는 번역될 수 있다.
용어, "작동가능하게 연결된"은 핵산 서열간의 결합이 기능적으로 연관되어 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 코딩 서열(예, 목적 단백질을 코딩하는 서열)은 이의 복제, 전사 및/또는 번역이 가능하도록 적절한 조절 요소들과 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 코딩 서열은 프로모터가 그 코딩 서열의 전사를 추진할 수 있는 경우 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것이다. 조절 요소들은 이것이 올바르게 기능하기만 한다면 코딩 서열에 인접할 필요가 없다. 예를 들어 번역되지 않지만 전사되는 개재 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있으며, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
유전자 컨스트럭트 내의 각 구성요소는 서로 작동 가능하게 연결되어야 하며, 이들 구성요소 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행될 수 있고, 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하여 수행될 수 있다.
용어 "바이시스트로닉(bicistronic)" 또는 이와 호환가능한 용어인 "폴리시스트로닉(polycistronic)"이란 진핵 세포 내에서 mRNA의 내부에서도 리보좀이 폴리펩티드를 합성할 수 있게 되어 하나의 mRNA로부터 여러 폴리펩티드가 합성 가능하게 된 시스템을 의미한다. 본원의 일 실시예의 경우, MHC 대립유전자를 코딩하는 핵산 서열 및 종양 항원을 코딩하는 핵산 서열이 하나의 mRNA 로부터 동시에 발현될 수 있도록 유전자 컨스트럭트를 디자인하였다.
일반적으로 원핵 세포는 하나의 mRNA의 여러 위치에 리보좀이 결합하여 한번에 여러 단백질을 합성할 수 있는 폴리시스트로닉(polycistronic) 시스템을 가지나, 진핵생물은 원칙적으로 하나의 프로모터에서 하나의 mRNA가 만들어지고 그 유전자만 번역되어 폴리펩티드가 합성되는 모노시스트로닉(monocistronic) 시스템을 갖는다. 그러나, 본원의 유전자 컨스트럭트는, 진핵 세포 내에서 하나의 mRNA 로부터 여러 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는데, 예를 들어, 각 유전자를 각각의 프로모터 하에 위치시켜 발현시키거나, 두 유전자 사이에 IRES(internal ribosome entry site)를 두어 하나의 프로모터 하에서 두 유전자를 동시에 발현시키는 것이 가능하다.
본 명세서에 기재된 바로서, "(소정의 성분을) 포함하는"은 기재된 성분 이외의 성분을 포함할 수 있는 것 (comprising) 또는 기재된 성분을 필수적으로 포함 (consisting essentially of)하는 것을 의미할 수 있다.
용어, "MHC (major histocompatibility complex)" 또는 "주조직적합성복합체"는 면역 세포가 자기, 비자기 분자를 구분할 수 있도록 항원 조각을 면역 세포에 제공하는 역할을 하는 단백질로서, MHC 클래스 I 과 MHC 클래스 II의 두 종류가 있으며, MHC 클래스 I은 핵이 있는 모든 세포에 있는 반면, MHC 클래스 II는 항원제시세포에서 발견된다. 본원에서 제공되는 기술적 사상은 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 모두에 적용 가능하다.
일반적으로, 후천적(adaptive) 면역 반응에서, 병원체 또는 항원이 체내에 들어오면 항원제시세포가 이를 섭취하여 짧은 펩티드 단편으로 분해시키고, 펩티드는 세포 내에서 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자와 결합하여 세포 표면으로 운반될 수 있다. 이와 같이 병원체 또는 항원의 펩티드가 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 에 결합하여 항원제시세포의 세포 표면에 제시되면, T 세포가 T 세포 수용체(TCR)를 통해 이를 인식하여 활성화되고 면역 반응을 시작하게 된다. 이러한 측면에서, 상기 병원체 또는 항원의 펩티드는 T 세포의 "에피토프"에 해당한다.
인간의 MHC 는 인간 백혈구 항원(HLA: Human Leukocyte antigen)이라고 하며, MHC 클래스 I (또는 HLA 클래스 I) 분자로는 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 가 있다. MHC 클래스 I 분자는 알파 폴리펩티드 사슬과 베타-2-마이크로글로불린으로 구성되어 있다. MHC 클래스 I 분자는 CD8+ 세포독성 T 세포와 상호작용을 하며 장기이식의 거부반응이나 감염된 세포를 파괴하는데 중요한 역할을 한다.
MHC 클래스 II (또는 HLA 클래스 II) 분자로는 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP 가 있다. MHC 클래스 II 분자는 알파 폴리펩티드 사슬과 베타 폴리펩티드 사슬로 구성되어 있다. MHC 클래스 II 분자는 CD4+ 보조 T 세포와 상호작용을 통해 비자기 항원을 인지하여 세포성 면역을 야기하는데 중요한 역할을 한다.
MHC 를 코딩하는 유전자는 심한 다형성(polymorphism)을 보이는 유전자로, 다양한 병원체 또는 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있도록 다수의 대립유전자(allele)가 존재한다. 예를 들어, 인간에서 HLA 클래스 I 대립유전자 수는 2020년 1월 기준으로 18,000개 이상이 보고되어 있고, HLA 클래스 II 대립유전자 수는 7,000개 이상이 보고되어 있다. 개별 유전자좌 별로는 HLA-A 5,735개, HLA-B 7,053개, HLA-C 5,653개, HLA-DRB1 2,676개, HLA-DQB1 1,771개, HLA-DPB1 1,519개 등이 보고되었다 (www.ebi.ac.uk/imgt/hla/). 비교적 빈도가 높은 대립유전자로는 HLA-A*2402, HLA-A*3303, HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-A*0206, HLA-A*3101, HLA-A*0207, HLA-A*2601, HLA-A*2602, HLA-A*3001, HLA-A*0101, HLA-A*3004, HLA-A*0203, HLA-A*0301, HLA-A*0205, HLA-A*0215N, HLA-A*2408, HLA-A*2420, HLA-A*2610, HLA-A*2901, HLA-A*2603, HLA-A*3201, HLA-B*5101, HLA-B*1501, HLA-B*4403, HLA-B*3501, HLA-B*5801, HLA-B*4601, HLA-B*5401, HLA-B*1302, HLA-B*2705, HLA-B*0702, HLA-B*4006, HLA-B*4801, HLA-B*4001, HLA-B*5502, HLA-B*1301, HLA-B*4002, HLA-B*5201, HLA-B*5901, HLA-B*1401, HLA-B*3901, HLA-B*6701, HLA-B*0801, HLA-B*1507, HLA-B*1518, HLA-B*3701, HLA-B*3802, HLA-B*0705, HLA-B*1538, HLA-B*3511, HLA-B*4003, HLA-B*4402, HLA-B*5001, HLA-B*5102, HLA-B*5601, HLA-B*1502, HLA-B*1511, HLA-B*1527, HLA-B*3503, HLA-B*4701, HLA-B*5605, HLA-B*570, HLA-Cw*0102, HLA-Cw*0304, HLA-Cw*1402, HLA-Cw*0702, HLA-Cw*0801, HLA-Cw*0401, HLA-Cw*0302, HLA-Cw*0303, HLA-Cw*1403, HLA-Cw*0602, HLA-Cw*0701, HLA-Cw*1202, HLA-Cw*0802, HLA-Cw*0202, HLA-Cw*0704, HLA-Cw*1203, HLA-Cw*0501, HLA-Cw*1505, HLA-Cw*0103, HLA-Cw*1502, HLA-Cw*1507 등을 예시할 수 있으나, 본원이 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 HLA 유전자들은 6번 염색체 단완에 4 megabase에 걸쳐 서로 근접해 위치하므로 부모에서 자식으로 유전이 될 때 하나의 일배체형(haplotype)으로 유전된다는 특징이 있다.
바람직한 구현예로, MHC 대립유전자는 MHC 클래스 I 대립유전자 또는 MHC 클래스 II 대립유전자이다.
바람직한 구현예로, MHC 대립유전자는 대상 환자의 종양에서 유래한 것이다.
또한 바람직한 구현예로, 유전자 컨스트럭트는 MHC 대립유전자의 핵산 서열 및 종양 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
또한, MHC 대립유전자를 코딩하는 핵산 서열은, 그 N-말단에 B2M(베타-2-마이크로글로불린)을 코딩하는 서열과 융합될 수 있는데, 이는 MHC 대립유전자가 항원제시세포에서 발현시 세포 표면에서의 구조적 안정성에 기여할 수 있다. B2M은 MHC, 특히 MHC 클래스 I의 알파 폴리펩티드 사슬을 안정화시키는 작용을 하는 약 12kDa의 비-당화된 단백질이다. 인간 B2M 유전자는 리더 서열을 암호화하는 20개 N-말단 아미노산을 갖는 119개 아미노산의 단백질을 암호화한다. 성숙 단백질은 99개 아미노산을 포함한다. 유전자는 4개의 엑손과 3개의 인트론을 포하며, 제1 엑손은 5' 비해독 영역, 전체 리더 서열 및 성숙 폴리펩티드의 제1의 2개의 아미노산을 포함하고; 제2 엑손은 성숙 단백질의 대부분을 암호화하고; 제3 엑손은 성숙 단백질의 마지막 4개의 아미노산 및 정지 코돈을 암호화하고; 제4 엑손은 3' 비-해독 영역을 포함한다. 본원에서는, B2M 과의 융합에 의하여 MHC 분자 상의 펩티드의 안정성이 증가되고, 항원제시세포에서 발현시 세포 표면에서의 구조적 안정성이 증가될 수 있다.
B2M을 코딩하는 서열은 전체 사람 베타-2-마이크로글로불린 유전자에 상응하는 핵산 잔기의 전체 또는 일부를 포함할 수 있다.
용어 "종양 항원(tumor antigen)" 또는 "암 항원(cancer antigen)"은 종양(암)에서 발현하는 항원으로서 면역 반응을 일으키는 분자를 말한다. 이러한 면역 반응은 항체 생성, 또는 특정 면역학적-적격 세포의 활성화, 또는 둘 모두를 수반할 수 있다.
종양 항원은 종양을 가진 유기체, 사멸되거나 비활성화된 전체 종양 세포, 또는 용해질로부터 유래될 수 있으며, 종양에서 유래한 임의의 항원을 포함한다. 용해질은 세포의 정상 구조의 분열을 야기시키는 과정의 적용으로부터 발생하는 물질을 말한다. 또한, 종양 항원은 종양 세포에 포함되고 정상 세포에서와는 상이하게 발현되는, 항원 특성을 지니는 임의의 단백질 또는 기타 물질을 포함한다.
예를 들어, 종양 항원은 종양-관련 항원(Tumor-associated antigen; TAA)과 종양-특이적 항원(Tumor-specific antigen; TSA)을 포함한다.
종양-관련 항원(TAA)은 정상 세포보다 암 세포에서 많이 나타나거나 정상 세포와 다른 분화단계에서 나타나는 항원으로, 정상 세포에서도 미량이 존재하는 종양 공유 항원(tumor shared antigen)이다. 따라서 이를 이용한 면역반응은 자기 세포의 손상을 방지하기 위한 면역억제 기전인 자가관용에 의해 무산될 가능성이 높고 혹은 반대로 자가면역으로 인해 원치 않는 장기가 공격받을 수 있다.
종양-관련 항원(TAA)의 예로는, gp100, Melan-A/MART, MAGE-A, MAGE (흑색종 항원 E), MAGE-3, MAGE-4, MAGE-A3, 티로시나아제, TRP2, NY-ESO-1, CEA (암배아 항원), PSA, p53, 마마글로빈-A(Mammaglobin-A), 서바이빈(Survivin), Muc1(뮤신1)/DF3, 메탈로판스티뮬린-1(metallopanstimulin-1, MPS-1), 시토크롬 P450 이소형(isoform) 1B1, 90K/Mac-2 결합 단백질, Ep-CAM (MK-1), HSP-70, hTERT (TRT), LEA, LAGE-1/CAMEL, TAGE-1, GAGE, 5T4, gp70, SCP-1, c-myc, 사이클린 B1, MDM2, p62, Koc, IMP1, RCAS1, TA90, OA1, CT-7, HOM-MEL-40/SSX-2, SSX-1, SSX-4, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HDAC5, MBD2, TRIP4, NY-CO-45, KNSL6, HIP1R, Seb4D, KIAA1416, IMP1, 90K/Mac-2 결합 단백질, MDM2, NY-ESO-1, 또는 LMNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
종양-특이적 항원(Tumor-specific antigen; TSA)은 암 세포에만 특이적으로 존재하는 항원을 말한다. 특히, 암 환자에서 종양이 증식할 때 암 세포 특이적인 유전자 돌연변이가 발생하여 T 세포를 자극할 수 있는 새로운 항원 에피토프가 생성되는데 이를 신항원(neoantigen)이라고 한다. 즉, 신항원(neoantigen)은 암세포 특이적인 유전자 돌연변이를 포함하며, 정상 세포에서도 미량 발현되는 종양 공유 항원과는 달리 암 세포에서만 선별적으로 발현되기 때문에 자가면역체계에 의해 비-자기 외부 에피토프(non-self foreign epitope)로 인식되어 강한 항암 면역활성을 유발한다.
변이가 일어난 DNA를 통해 생성된 펩타이드가 세포 표면의 MHC I에 전시되면 T세포의 수용체(TCR)가 이를 인식하는데, 정상 세포나 조직에서는 돌연변이가 발생하지 않기 때문에 신항원-특이적 T세포는 자가관용이나 자가면역 문제에서 자유롭다. 이러한 장점 때문에 신항원은 T세포 기반의 암 면역치료에 이상적인 타깃으로 여겨지고 있다.
신항원이 발생하는 원인으로는 DNA를 이루는 뉴클레오티드가 하나 또는 그 이상이 부가 또는 결실됨으로써 유전 암호의 해독이 어긋나는 프레임-시프트(frame-shift deletion or insertion), 하나의 뉴클레오티드가 다른 것으로 치환됨으로써 발생하는 점 돌연변이(point mutation), 그 외 스플라이스 부위(splice-site) 돌연변이, 리드쓰루(read-through) 돌연변이 또는 유전자 융합(gene-fusion) 돌연변이 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
신항원은 개별 암 환자의 특정 암세포 유전체 분석을 통해 예측되며, 일예로, 환자의 종양에서 암세포를 얻어 DNA를 추출한 뒤 염기서열을 분석하고, 이를 정상 세포의 염기서열과 비교 분석해 변이가 발생한 부분을 선별한 후, 변이가 발생한 여러 부분의 염기 서열 가운데 T 세포를 자극하는 신항원을 동정할 수 있다. 여기에는, 차세대 염기서열 분석법(Next gene sequencing, NGS), 전체 엑솜 시퀀싱(whole-exome sequencing, WES) 또는 RNA 시퀀싱(RNA sequencing)과 같은 빅데이터의 처리, MHC 결합 예측 컴퓨터프로그램, 또는 신항원 예측을 위한 인공지능(artificial intelligence, AI) 등이 활용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 환자마다 변이 형태가 공유되지 않기 때문에 신항원은 개인 맞춤형 항암 백신(personalized cancer vaccine)으로 제작 가능하다.
용어 "탑재(loading 또는 pulsing)" 란 수지상 세포와 같은 항원제시세포 (APC)가 항원을 포획하여 분해한 후 이를 MHC 분자에 실어 표면에 표출하는 것을 말하며, 이와 같이 항원이 탑재된 세포는 강력한 항원 특이적인 T 림프구의 활성을 유도할 수 있다.
유전자 컨스트럭트는, 해당 유전자가 선택된 숙주 내에서 발현될 수 있도록 하는 전사 및 해독 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 발현 조절 서열로는, 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및/또는 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.
예를 들어, 유전자 컨스트럭트는 (a) 5' 에서 3' 방향으로, 프로모터, 5'-UTR, MHC 대립유전자를 코딩하는 핵산 서열, IRES (internal ribosome entry site)의 핵산 서열, 종양 항원을 코딩하는 핵산 서열, 및 3'-UTR 을 포함하거나, (b) 5' 에서 3' 방향으로, 프로모터, 5'-UTR, 종양 항원을 코딩하는 핵산 서열, IRES (internal ribosome entry site) 의 핵산 서열, MHC 대립유전자를 코딩하는 핵산 서열, 및 3'-UTR 을 포함할 수 있다.
용어, "프로모터"는 전사조절인자들이 결합하는 DNA 염기서열 부위를 의미하며, 본 발명의 목적상 유전자 발현율을 높이기 위하여 강력하고 안정적인 유전자 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 사용할 수 있다.
프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 프로모터는 이에 제한되지는 않으나, 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 엡스타인 바이러스(EBV) 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터, RNA 폴리머라제 ±프로모터, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역 등을 예시할 수 있다.
용어, "5'-UTR (untranslated region)" 또는 "5'-비번역영역" 이란, mRNA 전사체의 5'-말단에 존재하지만 아미노산으로 번역되지 않는 영역을 말한다. 게놈 서열에서, 5'-UTR 은 전사 시작 부위와 개시 코돈 사이에 있는 영역으로 일반적으로 정의된다. 척추동물 mRNA의 5'-UTR 은 수 십 개의 염기에서 수 백개의 염기 길이에 이를 수 있다. mRNA 가 단백질로 번역되는 과정은, 리보좀의 30S 서브유닛이 5'-UTR 에 결합하는 것으로 시작된다. 구체적으로, 리보좀의 30S 서브유닛 내의 16S rRNA(16S ribosomal RNA)가 5'-UTR의 리보좀 결합 부위(ribosome binding site, RBS)에 결합하고, tRNA 가 mRNA 의 개시코돈(AUG)을 인식하여 결합하면 단백질로의 번역이 시작된다. 5'-UTR 의 리보좀 결합 부위와 개시 코돈은 대략 6 내지 8 뉴클레오티드 거리에 존재하고, 리보좀 결합 부위 안에는 16S rRNA 의 3' 말단의 서열과 상보적인 서열이 존재하는데, 이를 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열이라 한다.
용어 "IRES (internal ribosome entry site)" 또는 "내부 리보좀 유입 부위"는 전사체의 번역(translation)시 리보좀이 번역 진행의 시작으로 인식하는 염기서열을 말한다. 즉, IRES 는 진핵 세포에서 하나의 mRNA로부터 여러 폴리펩티드의 합성이 가능하도록 리보좀이 직접 결합하는 mRNA 내부에 존재하고 있는 특정 영역으로서, 본원의 유전자 컨스트럭트가 바이시스트로닉이 될 수 있도록 하는 역할을 한다. 즉, 번역이 이루어지는 과정에서 IRES 의 5' 쪽 측면에 위치한 폴리펩티드 코딩 서열은 5'말단의 캡 구조로부터 번역이 이루어지고 IRES 의 다른 측면에 위치한 폴리펩티드 코딩 서열은 IRES에 리보좀 서브유닛이 부착되어 번역이 이루어지므로, 여러 폴리펩티드를 각각 별도로 얻을 수 있게 된다.
IRES는 천연으로부터 또는 합성으로 수득될 수 있고, 폴리오바이러스, EMC 바이러스 등의 바이러스 유래이거나, 면역글로불린 중쇄 결합단백질(BiP), 초파리의 안테나유전자(Antp) 등의 세포 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어, "3'-UTR (untranslated region)" 또는 "3'-비번역영역" 이란, mRNA 전사체의 3'-말단에 존재하지만 아미노산으로 번역되지 않는 영역을 말한다.
그 외에, 유전자 컨스트럭트는 어댑터 또는 링커, 인핸서, 선별 마커(예컨대, 항생제 내성 마커), 복제가능단위, polyA 서열, 정제용 태그(예컨대, GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그 (His-tag) 또는 c-my 등)또는 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합을 등을 적절하게 포함할 수 있다.
본원은 또한, 전술한 유전자 컨스트럭트로부터 전사된, MHC 대립유전자 및 종양 항원을 동시에 발현하는, RNA 전사체에 관한 것이다. RNA 전사체로부터 MHC 대립유전자 및 종양 항원이 동시에 번역 및 합성될 수 있다는 점에서, RNA 전사체는 바이시스트로닉(bicistronic)이다.
RNA 전사체는 mRNA 전사체일 수 있으며, 전술한 유전자 컨스트럭트가 세포 내에서 전사된 다음 분리 및 정제될 수도 있으나, 바람직하게는 인 비트로 전사법에 의하여 시험관 내에서 전사될 수 있다.
본원은 또한, 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 바이시스트로닉 발현 벡터에 관한 것이다. 용어, "벡터(vector)"는 개체의 세포 내에서 목적 단백질을 코딩하는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 플라스미드, 바이러스 벡터, 박테리오파지 벡터, 코즈미드 벡터, 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다.
발현 벡터 및 RNA 전사체의 각 구성요소에 대한 설명은, 전술한 유전자 컨스트럭트의 각 구성요소에 대한 설명으로 대체한다.
본원의 다른 예는, 상기 유전자 컨스트럭트, 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터, 또는 상기 유전자 컨스트럭트로부터 전사된 RNA 전사체로부터 생성된, 폴리펩티드에 관한 것이다.
본원의 다른 예는, 전술한 유전자 컨스트럭트; 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터; 상기 유전자 컨스트럭트로부터 전사된 RNA 전사체; 또는 상기 유전자 컨스트럭트, 발현 벡터 또는 RNA 전사체로부터 생성된 폴리펩티드를 포함하는, MHC 대립유전자 및 종양 항원을 동시에 발현하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본원은 또한, 상기 유전자 컨스트럭트; 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터; 상기 유전자 컨스트럭트로부터 전사된 RNA 전사체; 또는 또는 상기 유전자 컨스트럭트, 발현 벡터 또는 RNA 전사체로부터 생성된 폴리펩티드를 포함하는, 항원제시세포에 관한 것이다.
본원은 또한, 상기 유전자 컨스트럭트, 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터, 상기 유전자 컨스트럭트로부터 전사된 RNA 전사체; 또는 상기 유전자 컨스트럭트, 발현 벡터 또는 RNA 전사체로부터 생성된 폴리펩티드를 항원제시세포에 도입하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 백신 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
용어 "항원제시세포"는 항원(예, 종양 항원)에 대한 면역 반응의 향상을 촉진함으로써 본원의 목적을 달성하는 임의의 세포를 말한다. 항원제시세포는 수지상 세포(dendritic cell, DC), 대식세포, 또는 B 세포를 포함한다. 항원제시세포는 암 환자의 자가(autologous) 또는 동종(allogenic) 유래일 수 있다. 용어 "자가 (autologous)"는 개체로부터 수득하여, 동일 개체를 치료하는데 사용되는 세포를 의미하고, "동종 (allogenic)"은 동일 종의 다른 개체로부터 수득한 세포를 의미한다.
수지상 세포(DC)는 신체의 가장 유효한 항원제시세포 유형으로, 이는 외래 항원을 포식하여 이를 나이브 (naive)(CD4+ 또는 CD8+ T) 및 기억 T 세포에 제시할 수 있다. 수지상 세포는 일반적으로 미세음세포작용 및/또는 포식작용에 의해 항원을 흡수한 후, 이러한 항원을 세포내적으로 가공한 후, 면역계의 T 세포에 항원을 제시한다. 이러한 가공은 일반적으로 신체 내에서 발생하지만, 신체로부터 수지상 세포를 분리하여, 이들을 시험관내에서 배양하고, 항원을 상기 시험관내에서 배양된 수지상 세포에 제공한 후, 상기 세포를 T 세포와 상호 작용하여 관심 항원에 대한 증가된 면역 반응을 유발시킬 수 있는 신체로 복귀시키는 것이 가능하다. 상기 항원을 수지상 세포에 제공하는 상기 과정은 일반적으로 탑재(loading 또는 pulsing) 또는 공동-배양으로 언급된다.
일 구체예로, 대상 환자 또는 동종 또는 이종의 개체로부터 수지상 세포의 전구세포를 얻어 수지상 세포로 분화시킨 뒤 전술한 유전자 컨스트럭트, RNA 전사체, 발현 벡터, 또는 폴리펩티드를 도입할 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포는 백신 투여 대상 환자의 혈액으로부터 단리된 단핵구의 분화에 의해 얻을 수 있다. 단핵구로부터 수지상 세포의 분화를 위한 기술은 당해 분야에 잘 확립되어 있다. 비제한적인 예로, 전형적 프로토콜에서, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 밀도 구배 원심분리에 의해 전체 혈액으로부터 단리될 수 있고, PBMC로부터 단핵구를 분리하는 것은 단핵구의 부착성을 이용하거나 면역-자가 비드를 이용하여 수행될 수 있다. 분리된 단핵구는 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에서 배양되어 미성숙 수지상 세포로 분화될 수 있다. 미성숙 수지상 세포는 성숙 인자, 전형적으로 TLR-4 효능제, 예컨대 LPS의 존재 하에서 배양되거나, TNFα, IL-6, IL-1β 및 PGE2를 포함하는 단핵구 성숙 칵테일이 사용하여 배양되어 성숙될 수 있다. 수지상 세포의 성숙과 벡터 도입은 동시에 수행될 수 있다.
유전자 컨스트럭트, RNA 전사체, 또는 발현 벡터를 세포에 도입하는 것은, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술, 예들 들어, 전기천공법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), 미세주입법(microinjection), 인산칼슘공동-침전법(calcium phosphate co-precipitation), 염화캄슘/염화루비듐법, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome)법, 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 때 원형의 구조물을 적절한 제한효소로 절단하여 선형의 형태로 도입할 수 있다.
바람직한 구현예로, 유전자 컨스트럭트, RNA 전사체, 발현 벡터 또는 폴리펩티드가 전기천공법으로 도입될 수 있다. 전기천공은 비투과성 물질의 세포로의 진입을 촉진시키기 위해 세포에 전류 또는 전기장을 적용시키는 것을 말한다. 예를 들어, 도입하고자 하는 비투과성 물질(예, 핵산, 벡벡터 등)이 포함된 용액에 세포를 현탁하여 직류고전압의 펄스를 통과시키면 전기에 의해 세포막에 구멍이 뚫리고 동시에 전기영동의 작용으로 비투과성 물질이 세포 내로 도입될 수 있다. 전기천공 장치는 정지 형태의 전기 천공 장치이거나 유동 형태의 전기 천공 장치일 수 있다. 정지 형태의 전기천공 장치는 고정량의 표적 세포와 접촉되는 유체 중에 매몰 성형된 전극을 포함하는 특화된 큐벳을 포함한다. 관심 분자는 두개의 전극 사이에 배치되고, 고전압으로 펄싱(pulsing)된다.
다른 예는, 전술한 유전자 컨스트럭트, RNA 전사체, 발현 벡터, 또는 폴리펩티드를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 백신 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
다른 예는, 전술한 유전자 컨스트럭트, RNA 전사체, 발현 벡터, 또는 폴리펩티드가 도입된 항원제시세포를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 백신 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
다른 예는, MHC 대립 유전자 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 항원제시세포를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 백신 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
용어 "백신"은 본원에 따른 항원제시세포를 함유하고 피검체에 투여될 수 있는 형태의 제형을 말한다. 따라서 본 발명의 백신 조성물은 질환을 예방하거나 개선시키거나 치료하기 위해 편리하게 사용될 수 있다. 피검체 또는 숙주로 도입된 후, 백신은 항체, 사이토카인 및/또는 기타 세포 반응의 생성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역 반응을 유발시킬 수 있다.
바람직한 구현예로, MHC 대립유전자 및 종양 항원은 상기 조성물이 투여되는 치료대상 암 환자의 종양 세포에서 유래된 것일 수 있다.
본원의 암 백신 조성물은 환자종양 분석에서 얻어진 종양항원 서열, 특히 신항원 서열 (neoantigen sequence) 및 각 환자의 종양유래 MHC 대립유전자를 동시에 항원제시세포 (APC)에서 과량 발현시킬 수 있으며, 이에 의하여 최대량의 항원(또는 epitope)-MHC 면역자극 복합체를 세포 표면에 발현하여 APC의 종양항원 제시 효능을 극대화함으로써, 궁극적으로 환자맞춤형 항암 T 세포의 증식 및 활성화를 최대한으로 촉발하여 항암 면역 효과를 증대시킬 수 있다.
구체적으로, 본원의 암 백신 조성물에 포함되는 항원제시세포(예, 수지상 세포)는 MHC 대립유전자 및 종양 항원을 동시에 과량 발현할 수 있으며, 이에 의하여 MHC 대립유전자 및 종양 항원이 결합하여 항원제시세포의 표면에 발현함으로써 T 림프구에 항원을 제시할 수 있고, 이를 통하여 T 림프구를 활성화시키면 강력한 암특이적 세포독성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocytes, CTL)가 유도되어 암세포를 파괴함으로써 암을 면역학적으로 치료할 수 있다. 또한, 항원제시세포(예, 수지상 세포)에서 풍부하게 발현되는 공동자극물질이 T 림프구 수용체와 항원-MHC 결합체간의 반응에 중요한 역할을 담당하며, T 림프구의 분화와 성장 또는 유입에 관련된 여러 싸이토카인을 분비하여 면역반응의 활성을 조절할 수 있기 때문에 항암 면역치료에 유용하게 이용될 수 있다,
본원의 백신 조성물은 또한 백신의 유효성을 증강시키는 추가의 면역보강제(adjuvant)를 포함할 수 있다. 적합한 면역보강제는 (1) 알루미늄염 (명반), 예를 들어 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄 등; (2) 수중유 에멀젼 제제 (뮤라밀 펩티드 또는 세균 세포벽 성분과 같은 특정 면역자극제를 함유하거나 함유하지 않음), 예를 들어 (a) 마이크론 이하의 입자로 제제화된 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈 80 및 0.5% 스팬 85 (필수적이지는 않지만, 선택적으로 다양한 양의 N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1',2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민(MTP-PE)을 함유함)를 포함하는 MF59 (WO90/14837), (b) 마이크론 이하의 입자로 마이크로유체화되거나 큰 입자 크기의 에멀젼을 생성하도록 진탕된, 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-블록화 중합체 및 N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP)을 포함하는 SAF, 및 (c) 모노포스포릴리피드 A (MPL), 트레할로오스 디마이콜레이트 (TDM), 및 세포벽 골격(CWS)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세균 세포벽 성분, 2% 스쿠알렌, 및 0.2% 트윈 80을 포함하는 RibiTM 면역보강제 시스템 (RAS); (3) 사포닌 면역보강제; (4) 프로인트의 완전 면역보강제(CFA) 및 불완전 면역보강제 (IFA); (5) 사이토카인, 예를 들어 인터루킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 등), 인터페론 (예를 들어, 감마 인터페론), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF) 등; (6) 세균의 ADP-리보실화 독소, 예를 들어 콜레라 독소 (CT), 백일해 독소 (PT), 또는 대장균 (E. coli)의 열에 불안정한 독소(LT), 특히 LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129의 탈독소화된 돌연변이체 (WO93/13302 및 WO92/19265); 및 (7) 백신의 유효성을 증강시키는 면역자극제로서 작용하는 기타 물질을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
백신 조성물은 현탁되거나 용해된 통상적인 염수 또는 완충된 수용액 배지를 포함할 수 있다. 예를 들어, 통상적으로 희석제, 예를 들어 물, 염수, 글리세롤, 에탄올 등을 포함할 수 있으며, 보조 물질, 예를 들어 습윤제, 유화제, pH 완충제 등이 조성물 중에 존재할 수 있다.
주사용으로 적합한 형태는 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 수성용액 (수용성) 또는 분산액 및 멸균분말을 포함한다. 이들은 제조 조건하에서 안정해야 하고, 세균 또는 진균과 같은 미생물의 오염에 대항하여 보존되어야 한다. 미생물의 오염은 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등을 사용하여 예방할 수 있다. 많은 경우에서, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사 조성물의 장시간 흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 중에 사용함으로써 가능할 수 있다.
전술한 용매 중에 필요량의 항원제시세포와 앞에서 열거한 다양한 기타 성분을 결합시키고, 필요에 따라 항원제시세포 및/또는 열에 민감한 면역보강제 싸이토카인 등을 제외한 나머지 성분들, 예를 들면 PBS와 같은 완충용액을 여과 멸균함으로써 멸균 주사용액을 제조한다. 일반적으로, 기본적인 분산배지 및 전술한 것으로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 다양한 멸균화 활성성분을 포함시킴으로써 분산액을 제조한다. 멸균 주사용액의 제조용 멸균분말의 경우, 바람직한 제조방법은 진공건조 및 동결건조 기법이다. 이러한 기법에 의해 활성성분, 및 전술한 이의 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 목적하는 성분의 분말을 얻는다.
본 발명의 작용을 어떤 식으로든 제한하지 않으면서, 본 발명에 따라 수지상 세포를 전달하는 것은 면역반응을 유도하는데, 특히 항원에 대한 세포독성 T-림프구의 반응을 유도하는데 특히 유용하다. 상기 면역반응은 특이적 (T 세포 및/또는 B 세포) 및/또는 비특이적 면역반응일 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 인간, 특히 암환자에서 항원에 대한 면역반응을 일으키거나, 유도하거나, 또는 촉진하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 전술한 바와 같은 백신 조성물 또는 항원제시세포의 유효량을 암환자에 투여하는 것을 포함한다.
상기 면역반응은 세포독성 T-림프구 반응을 포함하는 것이 바람직하며, 본 발명의 세포독성 림프구 반응은 헬퍼 T 세포반응, 체액성 반응 또는 기타 특이적이거나 비특이적인 면역반응과 함께 또는 독립적으로 일어날 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병 상태의 치료 및/또는 예방에 관련하여 본 발명의 수지상세포를 사용하는 것에 관계된다. 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 질병의 예로는 각종 암 질환 및 난치성 암질환을 포함한다.
예를 들어, 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있고, 비제한적인 예시로는, 유방암, 폐암, 전립선암, 난소암, 뇌암, 간암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁암, 결장암, 대장암, 결장직장암, 직장암, 신장암, 콩팥모세포종, 피부암, 경구 편평 상피암, 표피암, 비인두암, 두경부암, 골암, 식도암, 방광암, 림프관암(예를들어, 호지킨 림프종 또는 비-호지킨 림프종), 위암, 췌장암, 고환암, 갑상선암, 갑상샘소포암, 흑색종, 골수종, 다발성 골수종, 중피종, 골육종, 골수이형성 증후군, 간엽 기원의 종양, 연조직 육종, 지방육종, 위장 기질 육종, 악성 말초 신경집 종양 (MPNST), 유잉 육종, 평활근육종, 간엽 연골육종, 림포육종, 섬유육종, 횡문근육종, 기형암종, 신경모세포종, 수모 세포종, 신경교종, 피부의 양성 종양, 또는 백혈병일 수 있다. 폐암은, 예를 들어 소세포폐암종(SCLC) 또는 비-소세포폐암종(NSCLC)일 수 있다. 백혈병은, 예를 들어 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 림프구성 백혈병(ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병(CLL)일 수 있다. 치료되는 피검체는 2차적인 항-과다증식 요법을 받고 있는 피검체일 수 있다. 예를 들어, 2차적인 항-과다증식 요법은 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 광선요법, 냉동요법, 독소요법, 호르몬요법, 또는 외과수술일 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 암 백신 조성물을 이용하여 종양-특이적인 면역반응을 증강시킴으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다. 여기서, 상기 조성물의 투여는, 질병 상태의 발병 또는 진행을 저해하거나, 중지시키거나, 지연시키거나, 예방하는 면역반응을 일으키거나, 유도하거나 또 다르게는 촉진한다.
조성물의 직접 전달은 일반적으로 전신적, 피하, 피내, 복강내, 혈관내(정맥내), 근육내 또는 국소 전달될 수 있고, 또는 조직의 간극으로 전달된다. 조성물은 또한 병변으로 투여될 수 있다. 투여 요법은 단일 용량 또는 다중 용량 스케줄일 수 있다.
용어 "유효량"은 인간을 비롯한 개체에게 투여하였을 때, 원하는 결과를 달성하는데 충분한 양, 예를 들어 암을 치료 또는 예방하는데 효과적인 양을 의미한다. 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중 등의 인자들에 따라 달라질 수 있다. 투여량 또는 치료 용법은 당업자들이 이해하는 바와 같이 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정할 수 있다.
치료학적 유효량을 이용한 개체의 치료 용법은 1회 투여로 구성되거나, 또는 다른 예로, 일련의 적용을 포함할 수 있다. 치료기의 기간은 질환의 중증도, 개체의 연령, 암 백신의 농도, 암 백신에 대한 환자의 반응성 또는 이들의 조합과 같은 다양한 인자에 따라 결정된다. 또한, 치료에 사용되는 암 백신의 유효 투여량은 개별 치료 용법의 코스 동안 높이거나 낮출 수 있는 것으로 이해될 것이다. 투여량에 변화가 생길 수 있으며, 당해 기술 분야에 공지된 표준 진단 분석을 통해 명확해질 수 있다. 본 발명의 암 백신은, 몇몇 측면들에서, 통상적인 항암제, 방사선치료, 호르몬 치료, 바이오테라피 및/또는 외과적 종양 절제를 이용한 치료 전에, 치료 중에 또는 치료 후에, 투여할 수 있다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 바이시스트로닉 발현 벡터의 제조
MHC 클래스 I 대립유전자 및 종양 항원을 동시에 발현하기 위한 바이시스트로닉 벡터는 도 1과 같이 구성되어 있으며, 구체적으로 5' 에서 3' 방향으로 각각 5'UTR - ORF1 (재조합 B2M 및 MHC 클래스 I 대립유전자의 융합을 포함하는 오픈 리딩 프레임; 구체적으로, N-말단에 B2M 및 C-말단에 종양-유래 MHC 클래스 I 대립유전자를 포함하는 융합단백질의 코딩 서열) - IRES - ORF2 (beads-on-a-string 구조의 다중 항원성 에피토프로 구성된 재조합 단백질의 코딩 서열) - 3'UTR 의 유전자 컨스트럭트를 포함한다. 구체적으로, 기준 주형(Reference template)은 "LGV1007"로 명명하며, ORF1 로서 N-말단에서 C-말단 방향으로 신호서열, B2M 및 HLA-A*0201을 포함하는 융합단백질(서열번호 1)을 코딩하는 서열을 가지고, ORF2 로서 NY-ESO1, MAGE-A3, SURVIVIN, MULTI-MAGE-A, 및 MELAN-A 을 포함하는 공유항원 재조합 단백질(서열번호 2)의 코딩 서열을 가진다. 이러한 상기 LGV1007 의 전체 서열구조는 도 2에 나타낸 바와 같고, 상기 LGV1007 의 5' 말단의 BamHI 으로부터 3' 말단의 XbaI 제한효소 위치를 포함하는 전체 DNA 서열(3,523bp)을 서열번호 3에 나타내었으며, 이의 유전자합성을 의뢰하여 수득하였다 (GeneArt, Thermo Fisher). 그러나 LGV1007 는 본원의 일실시예 따른 대표 예시에 불과할 뿐이며, 그 염기서열은 전술된 바와 같이 개별 암 환자에 따라 맞춤형으로 자가 유래의 서열을 포함하도록 ORF1 및 ORF2 염기서열이 변화될 수 있으며, ORF1 및 ORF2를 제외한 염기서열들은 당업계에 널리 알려진 서열들을 이용하여 항원제시를 위하여 최적화 및 표준화할 수 있다.
실시예 2. 인 비트로 전사(in vitro transcription, IVT)를 이용한 mRNA 전사체 생성
바이시스트로닉 mRNA 전사체를 생성하기 위하여, 전술한 실시예 1에서 수득한 바이시스트로닉 벡터 (DNA 플라스미드 벡터)를 제한효소 Xbal 를 사용하여 절단함으로써 선형화하였고, 선형화된 DNA 를 ExpinTM combo GP 키트(GeneAll, 112-102)를 사용하여 정제하였다. 정제한 선형화된 플라스미드 주형을, mMessage mMachineTM T7 Ultra transcription kit (ThermoFisher)를 사용한 IVT (in vitro transcription) mRNA 생산에 사용하였고, 제조자의 지시서에 따랐다. 생성된 mRNA 전사체들을 LiCl 침전법을 사용하여 최종 정제하였다. 구체적으로, mRNA 산물을 LiCl 침전 용액 (IVT 반응물 20 μL 당 50 μL)가볍게 혼합하고 -20℃에서 30분 이상 인큐베이션하였다. 다음으로, 샘플들을 4℃에서 14분간 20,000x g 에서 원심분리로 스핀 다운하였다. 그 후 펠렛을 70% 에탄올로 세척하였다. 최종 mRNA 산물을 뉴클레아제가 없는 탈이온수에 재현탁하였다. mRNA 산물의 양을 Nanodrop2000 을 사용하여 측정하였다.
도 3은 기준 주형 LGV1007에 대한 인 비트로 전사를 수행하고 mRNA 전사체가 생산되었음을 PAGE 전기영동법으로 확인한 결과로서, 생성물의 예상되는 정확한 사이즈 (~3.5Kb, 레인 1)를 확인하였다
실시예 3. 세포내 mRNA 감염을 위한 세포 전기천공
전술한 항목 2에서 수득한 mRNA 전사체를 세포 전기천공법을 사용하여 인간 세포에 전이시켰다. K562 인간 골수 유래 림프아구성 백혈병 세포 (ATCC CCL-243TM)를 AmaxaTM 4D-NucleofectorTM X Unit 장치 및 SF Cell Line NucleofectorTM Solution (Lonza)를 사용하여 전기천공하였고, 제조자의 프로토콜에 따랐다. K562 세포를 전기천공하기 이틀 전에 3 X 105 cells/ml 로 신선하게 분리하였다. 전기천공 당일, 세포를 계수하고, 필요한 수의 세포(1~2 X 106 cells)를 실온에 준비하였다. 전기천공 전, 세포들을 무혈청 RPMI 또는 Opti-MEM (Gibco)로 두번 세척하였고, 100 μl의 SF Cell Line 4D NucleofectorTM X Solution (82 μl의 뉴클레오펙션 용액, 18 μl의 보충제) 내에 최종적으로 재현탁하였다. 그 뒤, 0.1 ml의 세포 현탁액을 program FF-120 을 이용하여 인 비트로 전사된(IVT) LGV1007 mRNA 0~20 μg과 함께 혼합하였다. 전기천공 후, 신선 배양 배지를 세포 현탁액에 첨가하고, 전기천공된 세포들을 37℃, CO2 세포 배양 인큐베이터에서 바로 인큐베이션하였다.
도 4는 LGV1007 mRNA 전사체를 K562 세포에 전기천공한 후 발현량이 최대치에 도달하는 조건을 도출하기 위하여, LGV1007 mRNA 전사체를 1 X 106 세포 당 0, 3, 5, 또는 10μg의 양으로 K562 세포에 전기천공한 후 9일 동안 HLA-A*0201 분자의 발현량을 확인한 결과로서, 전사체 10μg을 전기천공한 후 24시간에 최대 발현량 (최대 ~65배 기준치 발현량)이 관찰되었으며, 48시간 이후에는 급격히 감소하여 5~2배 기준치 정도의 발현량으로 지속적으로 유지되었다. 이러한, 비항원제시세포 (즉, 개별 환자 종양 맞춤형) MHC-I 대립유전자의 최대치 과량 발현은, 실질적으로 특정 항원제시세포의 MHC-I 표현형을, 환자종양 맞춤형으로 단일화시키는 효과를 일으켜서, 개별 환자의 항암면역 T 세포를 활성화를 최대화 시키는 작용을 기대할 수 있다.
실시예 4. mRNA 산물의 인 비트로 번역(in vitro translation)
Flag-태그된 폴리항원 재조합 단백질의 인 비트로 번역을 위하여, LGV1007 주형 DNA 플라스미드를, TnT Quick Coupled Transcription/Translation 키트 (Promega) 또는 1-Step Human High-Yield Mini IVT 키트 (Thermo Scientific)를 사용한 단일 튜브 인 비트로 전사/인 비트로 번역 반응에 사용하였고, 제조자의 매뉴얼에 따랐다. 반응 부피를 100 μl 에서 25 μl로 스케일 다운하였다. TnT Quick Coupled Transcription/Translation 키트 (Promega)의 경우, 반응 혼합물을 30℃에서 60~90분간 인큐베이션하였고, 1-Step Human High-Yield Mini IVT 키트 (Thermo Scientific)의 경우 반응시간이 6~16 시간이었다.
도 5는 LGV1007 mRNA 전사체의 인 비트로 번역을 수행하고 Flag-태그된 폴리항원 재조합 단백질이 생성되었음을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
실시예 5. 단백질 발현 분석
K562 세포로의 mRNA 전기천공 후, B2M 및 HLA-A*0201 이 융합된 재조합 MHC-I 단백질의 세포 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 또한 인 비트로 번역된 flag-태그된 폴리항원 재조합 단백질의 웨스턴 블롯을 수행하여 폴리항원 재조합 단백질의 단백질 발현을 확인하였다. 구체적으로, LGV1007 mRNA 가 전기천공된 K562 세포를 수집하고, PBS 로 두번 세척하고, 4℃에서 프로테아제 저해제 칵테일 (ATTO)를 함유하는 RIPA 용해 버퍼(ATTO) 에서 용해하였다. 표준 웨스턴 블롯 프로토콜에 따라, 20~30 μg의 단백질을 SDS 샘플 버퍼와 혼합하고, Tris-Glycine precast 12% 또는 4-20% 겔 (KOMABIOTECH) 상에서 러닝(running) SDS-PAGE로 분석하였다. 면역블롯 항체들을 다음 소스로부터 수득하였다: 베타-2 마이크로글로불린(Cell Signaling) 및 FLAG (Sigma-Aldrich). 항-베타-2 마이크로글로불린 항체 또는 항-FLAG M2 항체를 4℃에서 밤새 적용하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (HRP) 결합된 2차 항체들 (Santa Cruz Biotechnology)를 실온에서 1시간 적용하였다. 증강된 화학발광 감지 키트 (ECL, Amersham 또는 Pierce)를 사용하여 면역반응성 단백질들을 규명하였다. 웨스턴 블롯팅의 신호는 Amersham Imager 680 을 사용하여 검출하였다.
도 6은 LGV1007 mRNA 전사체를 K562 세포에 전기천공한 후 MHC 클래스 I 대립유전자(ORF1) 및 종양 항원(ORF2)이 모두 단백질로 발현되었음을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과로, ORF1 (B2M-HLA-A*0201) 단백질은 ~51 kDa 사이즈를 확인했고 (도 6a), ORF2 (종양 항원 융합단백질)은 ~30 kDa 정도의 예상되는 크기에서 발현됨을 확인하였다(도 6b). 그러나, 종양 항원 융합단백질은, 세포발현 시에는 신속히 프로테아좀에 의해 분해되므로, 인 비트로 번역 방법에 의해서만 명백히 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 6. 유세포 분석
Intellicyt iQueTM Screener PLUS (Sartorius) 유세포 분석기로 유세포 분석을 수행하였다. 구체적으로, 뉴클레오펙션(nucleofection) 후 24 ~ 72 시간 또는 최대 2주에, LGV 시리즈 mRNA가 전기천공된 K562 세포를 수집하고 300 x g로 5분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 유세포분석 버퍼(1% FBS 및 2 mM EDTA 함유 DPBS)에 재현탁하였다. 세포 염색을 위해, APC 접합된-마우스 항-인간 HLA-A2 (BD Pharmigen)을 권장 농도로 첨가한 다음, 세포를 어둠 및 실온에서 30분 ~ 1시간 동안 인큐베이션하여 염색하였다. 염색 인큐베이션 후, 세포를 펠렛화하고 PBS 에 재현탁하였다. 유세포분석 결과는 Intellicyt ForeCyt 소프트웨어(Sartorius) 로 분석하였다.
도 7은 LGV1007 mRNA 전사체를 1 X 106 세포 당 1ug의 양으로 K562 세포에 전기천공한지 24시간 이후에 K562 세포 표면에서의 발현량을 유세포 분석법을 이용하여 확인한 결과로서, 기준치 대비 ~10배 이상의 과량 발현을 확인하였다.
실시예 7. ELISPOT IFNγ 사이토카인 분비 분석을 사용한 면역 세포 활성화
K562apc 항원제시세포에서, 기존의 전통적인 항원탑재 방법인 펩타이드 탑재 (peptide pulse)와 RNA 항원 탑재 간의 면역활성 효능 우위 비교를 실험하였다. 구체적으로, 1일째, 실시예 3에서 제조한, LGV1007 mRNA 전사체 (포함된 다섯 항원서열: SURVIVIN, MART1, NYESO1, MAGEA3, MULTIMAGE)가 전기천공된 K562apc 세포와, 참고항원(SURVIVIN 9 amino acids 펩타이드) 탑재된 K562apc 세포, 또는 펩타이드 무처리 K562apc 대조군 세포와 ELISPOT IFNγ 면역활성 비교 실험을 진행했다. APC 2.5 x 10e5 cells/ml 의 세포 현탁액 중의 정제된 PBMC (Peripheral blood mononuclear cell) CD8+ T 세포를 자극하였다. 100 μL/웰의 T 세포와 100 μL APCs/웰을 첨가하고 (2:1 내지 10:1 비율로 T 세포 vs. APC 비율로 혼합) 세포 혼합물을 37℃에서 24시간 인큐베이션하였다. 2일째, 배양 배지를 10 U/mL IL-2 및 5 ng/mL IL-15 로 교체하고 7일 후 IL-2 를 재보충하였다. APC 자극 11일 후, ELISPOT IFNγ 프로토콜(BD Bioscience)로 IFNγ 분비 T 세포를 분석하였고 제조자의 지시서에 따랐다. 양성 스팟(spot) 발색을 주의깊게 모니터링하고 완전히 건조할 때까지 실온에서 2시간 ~ 밤새 분석 플레이트를 공기 중에 건조하였다. 해부 현미경으로 관찰하여 직접 양성 스팟을 세거나 ELISPOT 플레이트 리더를 사용하여 자동으로 양성 스팟을 세어 PBMC T 세포 활성화 분석을 하였다.
도 8은 LGV1007 mRNA 전사체가 전기천공된 K562 항원제시세포에 의한 PBMC T 세포의 면역 활성을 측정한 ELISPOT IFNγ 분비 분석 결과를 나타낸다. Reference RNA인 LGV1007 의 전기천공을 통해서 활성화된 K562 항원제시세포는 동종의 MHC 클래스 I 대립유전자형 (HLA-A*0201)을 지닌 PBMC CD8+ T 세포들을 프라이밍 활성화시켜서, IFNγ 를 분비하는 양성 스팟들을 확인할 수 있었다. 반면, 대조군으로 사용한 이종 MHC 클래스 I 대립유전자형 (non-HLA-A*0201) 유래의 CD8 T 세포들은 APC 들에 의해 프라이밍 되지 않았다. 본 실험을 통해서, LGV1007 mRNA 전사체가 전기천공된 K562apc 세포는, 전통적인 펩타이드 항원 탑재 대비, 뛰어난 ex vivo human PBMC 면역세포 활성화를 도출함을 확인했다.
실시예 8. LGV1032 가 도입된 자가 수지상 세포의 제조 및 이를 이용한 면역 세포 활성화
LGV RNA 항원탑재 방법이, 실험실에서 기술적으로 최적화된 K562apc 뿐만 아니라, 각 환자에서 추출 후 배양숙성된, 다양한 MHC class I 과 class II를 가지는, 개인맞춤형 자가 수지상 세포에서도 효과적으로 항원탑재 및 항원제시를 통해서 항원특이적 면역세포 활성화를 효과적으로 촉발하는 지를 검증하는 실험을 진행하였으며, 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 9는 LGV1032 mRNA 전사체의 구조 및 개인 유래 자가 수지상 세포에서의 세포 발현을 확인한 FACS 분석 결과를 나타낸다. LGV1032는, LGV1007 (실시예 1)과 동종의 바이시스트로닉 전사체 구조 (transcript configuration) 를 지니며 ORF2 (종양 항원파트)는 유지하되, ORF1에 세포발현 표지자로서 GFP 리포터 단백질이 자리잡은 구조이다. 따라서 LGV1032의 제조방법은 LGV1007의 제조방법과 동일하다. 전술한 바와 같은 유세포 분석 결과, LGV1032는, LGV1007처럼, 개인유래 자가 수지상 세포에서도 전기천공 방법에 의해서 세포 내로 유입 후, 효과적으로 세포 발현 됨을 확인했다. 개인 유래 또는 개인 맞춤형 자가 수지상세포는 혈액을 채취 후, 단구세포 (monocytes)를 수지상세포로 미숙성 상태로 일단 분화 (immature dendritic cell) 시킨 후, 성숙 과정을 거쳐서 숙성 수지상세포 (mature dendritic cell)를 얻는다. 이러한 시험관 내 세포 분화 및 숙성과정은 일주일 정도 걸리지만, 최종 숙성 수지상세포는 최대치의 항원 제시능을 보유하는 것으로 알려져 있다. 도 9의 GFP 리포터 단백질의 FACS 분석 결과에서 보듯, LGV1032는 효과적으로 모든 단계 (monocyte, immature DC, mature DC)의 세포들에 전기천공 되며, 세포유입 후, 형질발현 됨을 확인했다.
도 10은, 개인 유래 자가 수지상 세포(MoDC)로 전기천공 된 LGV1032가 항원특이적 T세포 면역활성을 효과적으로 촉발 함을 증명한, ELISPOT IFNγ 분비 스팟 증대 확인 결과를 보여준다. LGV1032 전기천공 된 자가수지상세포 (도 10, 열 3 & 4) 들은, 전통적 방법인 펩타이드 항원이 탑재 (peptide pulse) 된 자가수지상세포 (도 10, 열 2)에 비해서, MART1 항원 특이적 TCRe T 세포 활성화를 상당히 효과적으로 촉발함을, ELISPOT IFNγ 분비 스팟 증대를 통해서 분명히 검증했다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. MHC (major histocompatibility complex) 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 항원제시세포 (antigen presenting cell)를 포함하는,
    암 예방 또는 치료용 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항원제시세포가 수지상 세포(dendritic cell)인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항원제시세포는,
    MHC 대립유전자(allele) 및 종양 항원 유전자를 동시에 발현하는 유전자 컨스트럭트;
    상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터; 또는
    상기 유전자 컨스트럭트로부터 전사된, MHC 대립유전자 및 종양 항원 유전자를 동시에 발현하는 RNA 전사체; 또는
    상기 유전자 컨스트럭트, 발현 벡터 또는 RNA 전사체로부터 생성된 폴리펩티드를 포함함으로써
    MHC 및 종양 항원의 복합체가 세포 표면에 과발현된 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, MHC 는 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 인, 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 유전자 컨스트럭트가 MHC 대립유전자의 핵산 서열 및 종양 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    MHC 대립유전자의 핵산 서열이 그 N-말단에 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 서열과 융합된 것인, 조성물.
  7. 제3항에 있어서,
    MHC 대립유전자 및 종양 항원이 치료대상 암 환자의 종양세포에서 유래한 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    종양 항원이 종양-관련 항원(Tumor-associated antigen; TAA), 종양-특이적 항원(Tumor-specific antigen; TSA) 또는 종양유래 신항원(neoantigen)을 포함하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    종양유래 신항원(neoantigen)이 암 세포에 특이적으로 발현되는 돌연변이를 포함하는 것인, 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    종양-관련 항원(TAA)은 gp100, Melan-A/MART, MAGE-A, MAGE (흑색종 항원 E), MAGE-3, MAGE-4, MAGE-A3, 티로시나아제, TRP2, NY-ESO-1, CEA (암배아 항원), PSA, p53, 마마글로빈-A(Mammaglobin-A), 서바이빈(Survivin), Muc1(뮤신1)/DF3, 메탈로판스티뮬린-1(metallopanstimulin-1, MPS-1), 시토크롬 P450 이소형(isoform) 1B1, 90K/Mac-2 결합 단백질, Ep-CAM (MK-1), HSP-70, hTERT (TRT), LEA, LAGE-1/CAMEL, TAGE-1, GAGE, 5T4, gp70, SCP-1, c-myc, 사이클린 B1, MDM2, p62, Koc, IMP1, RCAS1, TA90, OA1, CT-7, HOM-MEL-40/SSX-2, SSX-1, SSX-4, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HDAC5, MBD2, TRIP4, NY-CO-45, KNSL6, HIP1R, Seb4D, KIAA1416, IMP1, 90K/Mac-2 결합 단백질, MDM2, NY-ESO-1, 또는 LMNA인, 조성물.
  11. 제3항에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트가,
    (a) 5' 에서 3' 방향으로, 프로모터, 5'-UTR, MHC 대립유전자의 핵산 서열, IRES (internal ribosome entry site)의 핵산 서열, 종양 항원을 코딩하는 핵산 서열, 및 3'-UTR 을 포함하거나,
    (b) 5' 에서 3' 방향으로, 프로모터, 5'-UTR, 종양 항원을 코딩하는 핵산 서열, IRES (internal ribosome entry site)의 핵산 서열, MHC 대립유전자의 핵산 서열, 및 3'-UTR 을 포함하는, 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    MHC 대립유전자의 핵산 서열이 그 N-말단에 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 서열과 융합된 것인, 조성물.
  13. 제3항에 있어서,
    상기 RNA 전사체가 mRNA 전사체인, 조성물.
  14. 제3항에 있어서,
    상기 발현 벡터가 바이시스트로닉 발현 벡터인, 조성물.
  15. 제3항에 있어서,
    상기 유전자 컨스트럭트, 발현 벡터, RNA 전사체, 또는 폴리펩티드가 전기천공법으로 항원제시세포에 도입된 것인, 조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 항원제시세포가 암 환자의 자가(autologous) 또는 동종(allogenic) 유래인, 조성물.
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