WO2021059001A1 - Method for detecting specific polymorphisms in the xrcc4, xrcc1, xpa, errcc2, tgfb and nlrp3 genes, and associated diagnostic kit - Google Patents
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Abstract
The present invention relates to a method for detecting specific polymorphisms in the XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB and NLRP3 genes, and an associated disgnostic kit. Single nucleotide polymorphisms (SNP) are variations in the DNA sequence that occur when a single nucleotide is altered. This method is designed for the determination of specific polymorphisms in the XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 genes.
Description
UN MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE POLIMORFISMOS ESPECÍFICOS DE LOS GENES XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1, NLRP3 Y KIT DE A METHOD FOR THE DETECTION OF SPECIFIC POLYMORPHISMS OF THE GENES XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1, NLRP3 AND KIT OF
DIAGNÓSTICO ASOCIADO ASSOCIATED DIAGNOSIS
CAMPO DE LA INVENCIÓN FIELD OF THE INVENTION
La presente invención se relaciona con un método para la detección de polimorfismos específicos de los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB, NLRP3, y un kit de diagnóstico asociado. The present invention relates to a method for the detection of specific polymorphisms of the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB, NLRP3, and an associated diagnostic kit.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN BACKGROUND OF THE INVENTION
La presente invención se refiere a la detección de polimorfismos específicos de los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB, NLRP3; los polimorfismos son ejemplos de variación genética que corresponden a variaciones naturales en la secuencia del ADN que en algunas ocasiones tienen consecuencias clínicas. The present invention relates to the detection of specific polymorphisms of the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB, NLRP3; polymorphisms are examples of genetic variation that correspond to natural variations in the DNA sequence that sometimes have clinical consequences.
Los análisis genéticos pueden predecir la predisposición a una o más enfermedades por ejemplo en el documento US2014079836 se presentan resultados de la expresión genética completa y otros análisis moleculares del efecto de los antioxidantes en los sistemas biológicos, incluidas las células humanas específicamente diferentes. Sobre la base de estos análisis, se describen métodos y composiciones para modificar o influir en la vida útil de las células, tejidos, órganos y organismos. En varias realizaciones, se proporcionan métodos para modular la actividad del proceso de mantenimiento de genes con el fin de influir en la longitud y/o la integridad estructural del telómero en células vivas, así como métodos para modular la tasa/eficiencia de la respiración celular proporcionada por las mitocondrias, la biogénesis mitocondrial y el mantenimiento del potencial de membrana mitocondrial. Los compuestos que alteran la vida útil a modo de ejemplo incluyen antioxidantes naturales y sintéticos, como antioxidantes de plantas y compuestos de polifenol derivados del café cereza, té,
bayas, etc., que incluyen, entre otros, ácido cafeíco, ácido clorogénico, ácido ferúlico, ácido quínico, proantocianidinas, ubiquinona. , idebenona, o una forma sintética o derivados de los mismos. Genetic analyzes can predict predisposition to one or more diseases, for example US2014079836 presents results of complete gene expression and other molecular analyzes of the effect of antioxidants on biological systems, including specifically different human cells. Based on these analyzes, methods and compositions for modifying or influencing the lifespan of cells, tissues, organs and organisms are described. In various embodiments, methods are provided for modulating the activity of the gene maintenance process in order to influence telomere length and / or structural integrity in living cells, as well as methods for modulating the rate / efficiency of cellular respiration. provided by mitochondria, mitochondrial biogenesis, and maintenance of mitochondrial membrane potential. Exemplary shelf life altering compounds include natural and synthetic antioxidants such as plant antioxidants and polyphenol compounds derived from coffee, cherry, tea, berries, etc., including but not limited to caffeic acid, chlorogenic acid, ferulic acid, quinic acid, proanthocyanidins, ubiquinone. , idebenone, or a synthetic form or derivatives thereof.
Más específicamente el documento se relaciona con un método para modular la vida útil de una célula, tejido, órgano u organismo, o para aumentar o disminuir la respiración celular y/o la capacidad y/o biogénesis de las mitocondrias en una célula, tejido, órgano u organismo, que comprende el contacto con la célula, tejido, órgano u organismo con al menos un agente modulador de la vida útil seleccionado del grupo que consiste en: idebenona, o un análogo o derivado del mismo; un extracto de cacao; un extracto de café cereza; ácido quínico, o un análogo o derivado del mismo; ácido ferúlico, o un análogo o derivado del mismo; una proantocianidina, antocianidina, procianidina o cianidina; ácido clorogénico, o un análogo o derivado del mismo; un extracto de té; o resveratrol o una composición derivada de o relacionada químicamente con el resveratrol.. More specifically the document relates to a method to modulate the useful life of a cell, tissue, organ or organism, or to increase or decrease cellular respiration and / or the capacity and / or biogenesis of mitochondria in a cell, tissue, organ or organism, comprising contacting the cell, tissue, organ or organism with at least one life modulating agent selected from the group consisting of: idebenone, or an analog or derivative thereof; a cocoa extract; a coffee cherry extract; quinic acid, or an analog or derivative thereof; ferulic acid, or an analog or derivative thereof; a proanthocyanidin, anthocyanidin, procyanidin, or cyanidin; chlorogenic acid, or an analog or derivative thereof; a tea extract; or resveratrol or a composition derived from or chemically related to resveratrol ..
No obstante, lo anterior mostrado por el estado de la técnica, persiste la necesidad de suministrar métodos y elementos de kits de diagnóstico para evaluar células cancerígenas capaces de detectar polimorfismos en cierto tipo de genes. However, the foregoing shown by the state of the art, the need persists to provide methods and elements of diagnostic kits to evaluate cancer cells capable of detecting polymorphisms in certain types of genes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
A continuación, se describirá en detalle el para la detección de polimorfismos específicos de los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 , NLRP3 y kit de diagnóstico asociado. Next, the for the detection of specific polymorphisms of the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1, NLRP3 and associated diagnostic kit will be described in detail.
Los polimorfismos son ejemplos de variación genética que corresponden a variaciones naturales en la secuencia del ADN que en algunas ocasiones tienen consecuencias clínicas. Así, los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés) son variaciones en la secuencia de ADN que ocurren cuando se altera un solo nucleótido. Este método está diseñado para la determinación de polimorfismos
específicos en los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3 descritos a continuación (tabla 1): Polymorphisms are examples of genetic variation that correspond to natural variations in the DNA sequence that sometimes have clinical consequences. Thus, single nucleotide polymorphisms (SNPs) are variations in DNA sequence that occur when a single nucleotide is altered. This method is designed for the determination of polymorphisms Specific in the XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 genes described below (Table 1):
Tabla 1. Polimorfismos en los genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3
Table 1. Polymorphisms in the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3
Para llevar a cabo la detección de polimorfismos específicos de los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB, NLRP3, es necesario realizar el diseño correspondiente de cebadores y sondas que hacen parte del método de la presente invención.
Tabla 2. Secuencia de los cebadores hacia adelante y hacia atrás para la detección de polimorfismos en los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3
To carry out the detection of specific polymorphisms of the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB, NLRP3, it is necessary to carry out the corresponding design of primers and probes that are part of the method of the present invention. Table 2. Sequence of the forward and reverse primers for the detection of polymorphisms in the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3
Tabla 3. Secuencia de las sondas silvestres y mutantes para el ensayo de detección polimorfismos en los genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3.
Table 3. Sequence of wild-type and mutant probes for the polymorphism detection assay in the XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 genes.
Una vez amplificados los productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los cebadores diseñados, es necesario el uso de sondas que se encuentren fluoromarcadas para que detecten dentro de un dentro de un número desconocido de
copias de ADN si hay alelos mutantes dentro de la muestra analizada. A continuación, se describen estos diseños (figuras 1 a la 6) Once the polymerase chain reaction (PCR) products have been amplified with the designed primers, it is necessary to use probes that are fluorlabelled to detect within an unknown number of DNA copies if there are mutant alleles within the sample tested. These designs are described below (Figures 1 through 6)
Figura 1. Producto de 71 pares de bases como producto de PCR para la detección del polimorfismo rs2075685 en el gen XRCC4
Figure 1. 71 base pair product as a PCR product for the detection of the rs2075685 polymorphism in the XRCC4 gene
En esta imagen se puede observar el producto de PCR de 71 pares de bases para la detección del polimorfismo re2075685 del gen XRCC4. En color amarillo la secuencia a la que se aliena el cebador hacia adelante y en color morado a la que se alinea la secuencia hacia atrás. El nucleótido señalado con color verde corresponde al polimorfismo de un solo nucleótido que se espera detectar con las sondas silvestre y mutante. This image shows the 71 base pair PCR product for the detection of the re2075685 polymorphism of the XRCC4 gene. In yellow the sequence to which the primer is aligned forward and in purple color to which the sequence is aligned backward. The nucleotide marked with green color corresponds to the single nucleotide polymorphism that is expected to be detected with the wild type and mutant probes.
Figura 2. Producto de 78 pares de bases como producto de PCR para la detección del polimorfismo rs25487 en el gen XRCC1
En esta imagen se puede observar el producto de PCR de 78 pares de bases para la detección del polimorfismo rs25487 del gen XRCC1 . En color amarillo la secuencia a la que se aliena el cebador hacia adelante y en color morado a la que se alinea la secuencia hacia atrás. El nucleótido señalado con color verde corresponde al polimorfismo de un solo nucleótido que se espera detectar con las sondas silvestre y mutante. Figure 2. Product of 78 base pairs as a PCR product for the detection of the rs25487 polymorphism in the XRCC1 gene This image shows the 78 base pair PCR product for the detection of the rs25487 polymorphism of the XRCC1 gene. In yellow the sequence to which the primer is aligned forward and in purple color to which the sequence is aligned backward. The nucleotide marked with green color corresponds to the single nucleotide polymorphism that is expected to be detected with the wild type and mutant probes.
Figura 3. Producto de 71 pares de bases como producto de PCR para la detección del polimorfismo rs1800975 en el gen XPA
Figure 3. 71 base pair product as a PCR product for the detection of polymorphism rs1800975 in the XPA gene
En esta imagen se puede observar el producto de PCR de 71 pares de bases para la detección del polimorfismo rs1800975 del gen XPA. En color amarillo la secuencia a la que se aliena el cebador hacia adelante y en color morado a la que se alinea la secuencia hacia atrás. El nucleótido señalado con color verde corresponde al polimorfismo de un solo nucleótido que se espera detectar con las sondas silvestre y mutante.
This image shows the 71 base pair PCR product for the detection of the rs1800975 polymorphism of the XPA gene. In yellow the sequence to which the primer is aligned forward and in purple color to which the sequence is aligned backward. The nucleotide marked with green color corresponds to the single nucleotide polymorphism that is expected to be detected with the wild type and mutant probes.
Figura 4. Producto de 72 pares de bases como producto de PCR para la detección del polimorfismo rs13181 en el gen ERCC2
Figure 4. Product of 72 base pairs as a PCR product for the detection of the rs13181 polymorphism in the ERCC2 gene
En esta imagen se puede observar el producto de PCR de 72 pares de bases para la detección del polimorfismo rs 113181 del gen ERCC2. En color amarillo la secuencia a la que se aliena el cebador hacia adelante y en color morado a la que se alinea la secuencia hacia atrás. El nucleótido señalado con color verde corresponde al polimorfismo de un solo nucleótido que se espera detectar con las sondas silvestre y mutante. This image shows the 72 base pair PCR product for the detection of the polymorphism rs 113181 of the ERCC2 gene. In yellow the sequence to which the primer is aligned forward and in purple color to which the sequence is aligned backward. The nucleotide marked with green color corresponds to the single nucleotide polymorphism that is expected to be detected with the wild type and mutant probes.
Figura 5. Producto de 84 pares de bases como producto de PCR para la detección del polimorfismo rs1800469 en el gen TGFB1
Figure 5. 84 base pair product as a PCR product for the detection of polymorphism rs1800469 in the TGFB1 gene
En esta imagen se puede observar el producto de PCR de 84 pares de bases para la detección del polimorfismo rs1800469 del gen TGFB1 . En color amarillo la secuencia a la que se aliena el cebador hacia adelante y en color morado a la que se alinea la
secuencia hacia atrás. El nucleótido señalado con color verde corresponde al polimorfismo de un solo nucleótido que se espera detectar con las sondas silvestre y mutante. This image shows the 84 base pair PCR product for the detection of the rs1800469 polymorphism of the TGFB1 gene. In yellow the sequence to which the primer is aligned forward and in purple the sequence to which the primer is aligned. backward sequence. The nucleotide marked with green color corresponds to the single nucleotide polymorphism that is expected to be detected with the wild type and mutant probes.
Figura 6. Producto de 91 pares de bases como producto de PCR para la detección del polimorfismo rs25487 en el gen NLRP3
Figure 6. 91 base pair product as a PCR product for the detection of the rs25487 polymorphism in the NLRP3 gene
En esta imagen se puede observar el producto de PCR de 91 pares de bases para la detección del polimorfismo rs25487 del gen NLRP3. En color amarillo la secuencia a la que se aliena el cebador hacia adelante y en color morado a la que se alinea la secuencia hacia atrás. El nucleótido señalado con color verde corresponde al polimorfismo de un solo nucleótido que se espera detectar con las sondas silvestre y mutante. This image shows the 91 base pair PCR product for the detection of the rs25487 polymorphism of the NLRP3 gene. In yellow the sequence to which the primer is aligned forward and in purple color to which the sequence is aligned backward. The nucleotide marked with green color corresponds to the single nucleotide polymorphism that is expected to be detected with the wild type and mutant probes.
La técnica de Droplet Digital polymerase Chain reaction (ddPCR), es una técnica con una alta precisión que cuantifica moléculas de ácidos nucleicos encapsuladas en gotas, esto bajo el fundamento general de distribuir la muestra de forma aleatoria en un número elevado de particiones, de manera que contengan cero, una, o unas cuantas moléculas del ADN objetivo; posteriormente las particiones son sometidas a una reacción de amplificación en un termociclador. El número de copias del ADN objetivo se determina en función de la proporción de particiones positivas (aquellas donde hubo amplificación), clasificadas como tal, en función de su nivel de fluorescencia y utilizando un arreglo matemático que considera el volumen de la entidad de partición y la distribución de Poisson. Este método validado es capaz de
detectar dentro de un número desconocido de copias de ADN no mutado la presencia del 0,2% de ADN mutado, con una sensibilidad del 99%. The Droplet Digital polymerase Chain reaction (ddPCR) technique is a technique with high precision that quantifies nucleic acid molecules encapsulated in drops, this under the general basis of distributing the sample randomly in a high number of partitions, so containing zero, one, or a few molecules of the target DNA; subsequently the partitions are subjected to an amplification reaction in a thermal cycler. The number of copies of the target DNA is determined based on the proportion of positive partitions (those where there was amplification), classified as such, based on their level of fluorescence and using a mathematical arrangement that considers the volume of the partition entity and the Poisson distribution. This validated method is capable of detect within an unknown number of copies of non-mutated DNA the presence of 0.2% of mutated DNA, with a sensitivity of 99%.
Este método se realiza en tres pasos: generación de gotas, un ensayo de ddPCR con sondas de hidrólisis o EvaGreen y la lectura y análisis de resultados. En la primera parte del proceso la muestra de ADN analizada es particionada dentro de 20.000 gotas, posteriormente se realiza una reacción de PCR en cada uno de las gotas simultáneamente y una vez culminada la reacción de PCR, se realiza la lectura de la intensidad de la fluorescencia en cada una de los gotas. Luego se calcula la concentración del número de gotas con secuencias de ADN mutantes. This method is performed in three steps: droplet generation, a ddPCR assay with hydrolysis or EvaGreen probes, and reading and analysis of results. In the first part of the process, the analyzed DNA sample is partitioned into 20,000 drops, subsequently a PCR reaction is carried out on each of the drops simultaneously and once the PCR reaction is completed, the intensity of the intensity is read. fluorescence in each of the drops. Then the concentration of the number of droplets with mutant DNA sequences is calculated.
Para llevar a cabo el ensayo de detección de la inserción descrita, se debe seguir el procedimiento descrito más abajo. Se inicia con la elección de la muestra a analizar, seguido de la extracción del ADN de la muestra objeto de análisis y la cuantificación del ADN obtenido posterior al proceso de extracción. Una vez determinada la cantidad de ADN obtenida para análisis, se realiza en ensayo de ddPCR y se finaliza con la lectura y análisis de datos. La cuantificación del ADN tumoral se realiza en los siguientes equipos de espectrofotometría (tabla 4) To carry out the insertion detection assay described, the procedure described below should be followed. It begins with the choice of the sample to be analyzed, followed by the extraction of the DNA from the sample under analysis and the quantification of the DNA obtained after the extraction process. Once the amount of DNA obtained for analysis has been determined, it is performed in a ddPCR assay and it is finished with the reading and analysis of the data. The tumor DNA quantification is carried out in the following spectrophotometry equipment (table 4)
Tabla 4. Equipos de espectrofotometría para la cuantificación de ADN
Table 4. Spectrophotometry equipment for DNA quantification
Antes de dar inicio de la preparación de la mezcla para el ensayo de ddPCR, es necesario que las muestras de ADN extraídas de sangre y/o saliva sean llevadas a
una concentración de entre 5 a 20 ng/l; A continuación, se describe el proceso de preparación de la mezcla: Before starting the preparation of the mixture for the ddPCR assay, it is necessary that the DNA samples taken from blood and / or saliva be taken to a concentration of between 5 to 20 ng / l ; The process for preparing the mixture is described below:
Dejar a temperatura ambiente los siguientes reactivos (almacenados a -20°C o 4°C) durante 20 minutos Leave the following reagents at room temperature (stored at -20 ° C or 4 ° C) for 20 minutes
Reactivo Almacenamiento ddPCR mezcla -20°C Storage Reagent ddPCR mix -20 ° C
Cebadores hacia -20°C adelante y hacia atrás gBlock control positivo -20°C Primers towards -20 ° C forward and backward gBlock positive control -20 ° C
Hindlll-Hf -20°C Hindlll-Hf -20 ° C
Sondas silvestre y Wild probes and
4°C mutante 4 ° C mutant
Preparación de reactivos a. cebadores: agregar 1 - 5 pl de cebadores y 45 - 49 mI de agua b. Sondas: agregar 1 ,5 - 3,5mI de sondas y 46,5 - 48,5 mI de agua c. Enzima Hindlll: agregar 3-5 mI de enzima y 15-17 mI de solución amortiguadora de pH Reagent Preparation a. primers: add 1 - 5 µl of primers and 45 - 49 ml of water b. Probes: add 1.5 - 3.5mI of probes and 46.5 - 48.5mI of water c. Hindlll enzyme: add 3-5 ml of enzyme and 15-17 ml of pH buffer
Preparar mezcla de cada polimorfismo muestra (Rx): Agregar 10-14 mI de mezcla, 1 ,5 - 3,5mI de cada sonda, 5 -10 mI de cada cebador y 15-17mI de enzima Hindlll. De acuerdo a la siguiente información, es posible preparar mezclas para más de una muestra: Prepare mixture of each sample polymorphism (Rx): Add 10-14 ml of mixture, 1.5-3.5 ml of each probe, 5-10 ml of each primer and 15-17 ml of Hindlll enzyme. According to the following information, it is possible to prepare mixtures for more than one sample:
Agregar 18,4 - 22,4mI de esta mezcla en tubos de PCR. Add 18.4 - 22.4mI of this mix to PCR tubes.
Agregar 1 ,6 -5,6 mI de muestra en cada tubo. Agregar 1 ,6 -5,6 mI de gBlock en concentración 0,05fg/pl como control positivo para cada gen que es una secuencia de ADN de doble cadena verificada por secuenciación. Add 1.6-5.6 ml of sample to each tube. Add 1.6-5.6 ml of gBlock at a concentration of 0.05fg / pl as a positive control for each gene that is a double-stranded DNA sequence verified by sequencing.
Agregar 1 ,6 -5,6 I de agua como control sin ADN. Add 1.6-5.6 I of water as a control without DNA.
Realizar agitación y centrifugación al tubo que contiene la mezcla.
Poner un cartucho dentro de la base, cada cartucho tiene capacidad para 8 reacciones. Shake and centrifuge the tube containing the mixture. Put a cartridge inside the base, each cartridge has capacity for 8 reactions.
Dispensar 18-20 pl del mix preparado en cada pozo del cartucho junto con las muestras a analizar. Dispensar 68-72 pl de aceite generador de gotas con pipeta multicanal, tal como lo indica la siguiente figura: Dispense 18-20 µl of the prepared mix into each well of the cartridge along with the samples to be analyzed. Dispense 68-72 pl of drop-generating oil with a multichannel pipette, as indicated in the following figure:
Figura 7. Diagrama de cartucho de ddPCR para ubicación de las muestras y el aceite generador de gotas
Figure 7. ddPCR Cartridge Diagram for Sample Location and Drop Generating Oil
Tapar el cartucho con el gasket y ponerlo dentro del equipo generador de gotas Una vez generadas las gotas, remover el elástico sellador Cover the cartridge with the gasket and put it inside the drop generator equipment.Once the drops have been generated, remove the sealing elastic
Tomar una pipeta multicanal y graduarla a 40 mI. Take a multichannel pipette and graduate it to 40 ml.
Dispensar 40 mI de la columna de gotas del cartucho en la placa manteniendo la pipeta multicanal en un ángulo de aproximadamente 95° a una velocidad constante. Dispense 40 ml from the cartridge's column of drops onto the plate by holding the multichannel pipette at an angle of approximately 95 ° at a constant speed.
Tapar la placa y llevarla al equipo sellador. Cover the plate and take it to the sealing equipment.
Realizar una reacción en cadena de la polimerasa, las siguientes son las condiciones de PCR:
Temperatura Ciclos Tiempo Perform a polymerase chain reaction, the following are the PCR conditions: Temperature Cycles Time
95° C 1X 10 min 95 ° C 1X 10 min
94° C 4QX 030 min 94 ° C 4QX 030 min
60.5'C 40X 1 min 60.5'C 40X 1 min
96°c 1X 10 min 96 ° c 1X 10 min
4°C 1X ¥ 4 ° C 1X ¥
Una vez concluida el proceso de PCR para la obtención del producto que amplifica el fragmento de interés, se debe realizar la generación de los gotas, para la posterior lectura de las gotas y el análisis de los datos; después de lo cual se generaran los gotas y se podrá determinar a través de un sistema de referencia de cuadrantes, donde en el cuadrante A aparecen las gotas azules que tuvieron amplificación positiva para la mutación (polimorfismo); el cuadrante B muestra gotas naranjas que tienen tanto ampliación de la mutación como de la secuencia silvestre; el cuadrante C muestra gotas que no tuvieron ninguna amplificación; y el cuadrante D muestra gotas con amplificación de la secuencia silvestre, tal como se muestra en la siguiente figura; Once the PCR process to obtain the product that amplifies the fragment of interest is concluded, the generation of the drops must be carried out, for the subsequent reading of the drops and the analysis of the data; after which the drops will be generated and it can be determined through a quadrant reference system, where the blue drops that had positive amplification for the mutation (polymorphism) appear in quadrant A; Quadrant B shows orange droplets that have both mutation and wild-type sequence magnification; Quadrant C shows drops that did not have any amplification; and quadrant D shows droplets with amplification of the wild-type sequence, as shown in the following figure;
Figura 8. Diagrama en dos dimensiones en donde se encuentran las gotas generadas por la técnica de ddPCR
Figura 9. Caso de muestra con presencia de alelos mutantes de polimorfismo en los genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3
Figure 8. Two-dimensional diagram showing the drops generated by the ddPCR technique Figure 9. Sample case with the presence of mutant alleles of polymorphism in the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3
En esta imagen (2D) se observan los 4 clusters de gotas de las muestras a. gotas que no contienen ADN (círculos grises); b. gotas que contienen solo ADN no mutado (círculos verdes); c. gotas que contienen solo ADN mutado (círculos azules),· y d. gotas que contiene ADN mutado y no mutado (círculos naranjas). Se observa la presencia de ADN mutado en la muestra analizada.
In this image (2D) the 4 clusters of drops of the samples a are observed. drops that do not contain DNA (gray circles); b. drops containing only non-mutated DNA (green circles); c. drops containing only mutated DNA (blue circles), · and d. drops containing mutated and non-mutated DNA (orange circles). The presence of mutated DNA is observed in the analyzed sample.
Figura 10. Caso de muestra con ausencia de alelos mutantes de polimorfismo en los genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3
En esta imagen (2D) se observan los 4 clusters de gotas de las muestras a. gotas que no contienen ADN (círculos grises); b. gotas que contienen solo ADN no mutado (círculos verdes); c. gotas que contienen solo ADN mutado (círculos azules)· y d. gotas que contiene ADN mutado y no mutado (círculos naranjas). No se observa la presencia de ADN mutado en la muestra analizada.
Figure 10. Sample case with absence of polymorphism mutant alleles in the XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 genes In this image (2D) the 4 clusters of drops of the samples a are observed. drops that do not contain DNA (gray circles); b. drops containing only non-mutated DNA (green circles); c. drops containing only mutated DNA (blue circles) · and d. drops containing mutated and non-mutated DNA (orange circles). The presence of mutated DNA is not observed in the analyzed sample.
Claims
1. Un método para la detección de polimorfismos específicos de los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3 caracterizado porque comprende: a) Extracción de muestras de ADN extraído de saliva y/o sangre. b) Preparación de la muestra del paso a) en donde la muestra de ADN extraída de saliva o sangre es llevada a una concentración de 10-20 ng/uL. c) Preparar cebadores hacia adelante e cebadores reversos para los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3 a una temperatura de -20 grados Celsius d) Preparar un control positivo de bloques para los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3 a -20 grados Celsius e) Preparar sondas para los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3 a 4 grados centígrados. f) Realizar una mezcla de los cebadores de la etapa c) con las sondas de la etapa d) y agregar una enzima tipo Hindlll hasta una concentración de 20 000 unidades /mi y un agente generador de gotas. g) Generar una pluralidad de muestras en forma de gotas con la mezcla de la etapa f) h) Realizar una reacción en cadena de la polimerasa con la pluralidad de muestras en forma de gotas de la etapa f) a una temperatura de entre 4 y 95 grados Celsius en un rango de tiempo de entre 30 segundos y 600 segundos, y entre 1 y 40 ciclos. i) Determinar la ampliación positiva para la mutación. 1. A method for the detection of specific polymorphisms of the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 characterized in that it comprises: a) Extraction of DNA samples extracted from saliva and / or blood. b) Preparation of the sample from step a) where the DNA sample extracted from saliva or blood is brought to a concentration of 10-20 ng / uL. c) Prepare forward and reverse primers for the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 at a temperature of -20 degrees Celsius d) Prepare a positive block control for the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 at -20 degrees Celsius e) Prepare probes for the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 at 4 degrees centigrade. f) Mix the primers from step c) with the probes from step d) and add a Hindlll-type enzyme to a concentration of 20,000 units / ml and a droplet generating agent. g) Generate a plurality of drop-shaped samples with the mixture from step f) h) Carry out a polymerase chain reaction with the plurality of drop-shaped samples from step f) at a temperature between 4 and 95 degrees Celsius in a time range between 30 seconds and 600 seconds, and between 1 and 40 cycles. i) Determine the positive magnification for the mutation.
2. El método para la detección de polimorfismos específicos de los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3 de la reivindicación 1 caracterizado porque en la etapa c) los cebadores hacia adelante y hacia tras se encuentran en una cantidad entre 1 - 5 mI cada uno.
2. The method for the detection of specific polymorphisms of the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 of claim 1 characterized in that in step c) the forward and back primers are in an amount between 1 - 5 ml each.
3. El método para la detección de polimorfismos específicos de los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3 de la reivindicación 1 caracterizado porque la sonda de la etapa e) es del tipo silvestre y mutante y se encuentran en una cantidad en una concentración de 19.62 nanomolar a 19.55 nanomolar. 3. The method for the detection of specific polymorphisms of the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 of claim 1 characterized in that the probe of step e) is wild-type and mutant and they are found in an amount in a concentration of 19.62 nanomolar to 19.55 nanomolar.
4. El método para la detección de polimorfismos específicos de los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3 de la reivindicación 1 caracterizado porque en la etapa i), la ampliación positiva para la inserción presenta un sistema de contraste que permite determinar la presencia del alelo mutante de polimorfismo. 4. The method for the detection of specific polymorphisms of the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 of claim 1 characterized in that in step i), the positive amplification for the insertion presents a contrast system that allows to determine the presence of the mutant allele of polymorphism.
5. Un Kit de diagnóstico para la detección de polimorfismos específicos de los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3 caracterizado porque comprende: a) Cebadores hacia adelante (5’-3’) y cebadores reversos (3’-5’). b) Un control positivo de bloques. c) Un conjunto de sonda silvestre y mutante. 5. A diagnostic kit for the detection of specific polymorphisms of the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 characterized in that it comprises: a) Forward primers (5'-3 ') and reverse primers (3'-5 '). b) A positive block control. c) A wild-type and mutant probe set.
6. El Kit de diagnóstico para la detección de polimorfismos específicos de los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3 de la reivindicación 5 caracterizado porque el cebador hacia adelante (5’-3’) presenta las siguientes secuencias para los respectivos genes:
6. The diagnostic kit for the detection of specific polymorphisms of the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 of claim 5 characterized in that the forward primer (5'-3 ') presents the following sequences for the respective genes:
7. El Kit de diagnóstico para la detección de polimorfismos específicos de los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3 de la reivindicación 5 caracterizado porque el cebador hacia atrás (3’-5’) presenta las siguientes secuencias para los respectivos genes:
7. The diagnostic kit for the detection of specific polymorphisms of the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 of claim 5 characterized in that the back primer (3'-5 ') presents the following sequences for the respective genes:
8. El Kit de diagnóstico para la detección de polimorfismos específicos de los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3 de la reivindicación 5 caracterizado porque la sonda silvestre presenta las siguientes secuencias para los respectivos genes:
8. The diagnostic kit for the detection of specific polymorphisms of the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 of claim 5 characterized in that the wild-type probe presents the following sequences for the respective genes:
9. El Kit de diagnóstico para la detección de polimorfismos específicos de los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3 de la reivindicación 5 caracterizado porque la sonda mutante presenta las siguientes secuencias para los respectivos genes:
9. The diagnostic kit for the detection of specific polymorphisms of the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 of claim 5 characterized in that the mutant probe has the following sequences for the respective genes:
10. El Kit de diagnóstico para la detección de polimorfismos específicos de los genes XRCC4, XRCC1 , XPA, ERRCC2, TGFB1 y NLRP3 de la reivindicación 5 caracterizado porque el control positivo de bloques por cada gen, es una secuencia de ADN de doble cadena verificada por secuenciación.
10. The diagnostic kit for the detection of specific polymorphisms of the genes XRCC4, XRCC1, XPA, ERRCC2, TGFB1 and NLRP3 of claim 5 characterized in that the positive control of blocks for each gene is a verified double-stranded DNA sequence by sequencing.
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