WO2021029181A1 - Ｃｌｓｐ阻害物質による影響を受けないｃｌｓｐ誘導体及びｃｌｓｐ活性の増強／保護剤 - Google Patents

Abstract

【課題】 アルツハイマー病等に関連する神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性がヒューマニンよりも強く、且つ、阻害剤による該活性の阻害作用を受けない、カルモジュリン様皮膚タンパク質（Calmodulin-like skin Protein：ＣＬＳＰ）誘導体、及び、ＣＬＳＰによるアルツハイマー病の抑制活性の増強又は保護作用・活性を有するポリペプチド等を提供すること。 【解決手段】 カルモジュリン様皮膚タンパク質（Calmodulin-like skin Protein：ＣＬＳＰ）の誘導体（変異体）であって、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性（ＣＬＳＰ活性）中心である内因性ヒューマニン相同領域（ＥＨＲ）を含み、該ＣＬＳＰ活性の阻害剤が結合する領域を含まないことを特徴とする、前記変異体、該変異体を有効成分として含むアルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制するための医薬組成物等。

Description

ＣＬＳＰ阻害物質による影響を受けないＣＬＳＰ誘導体及びＣＬＳＰ活性の増強／保護剤

　本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性を有し、且つ、阻害物質（阻害剤）による該活性の阻害又は抑制作用を受けない、カルモジュリン様皮膚タンパク質（Calmodulin-like skin Protein：ＣＬＳＰ）の誘導体、アディポネクチンのコラーゲン相同領域を含むポリペプチド等から成る、ＣＬＳＰが有する該活性（「ＡＤ保護活性」、「抗ＡＤ活性」、「ＣＬＳＰ活性」又は「ＣＬＳＰによる細胞毒性抑制活性」ともいう）の増強又は保護剤、ＣＬＳＰ又は該ＣＬＳＰ誘導体と該ポリペプチド等を含む融合タンパク質、及び、これらを有効成分として含む医薬組成物、特に、アルツハイマー病治療用の医薬組成物等に関する。

　アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知症を引き起こす主要な神経変性疾患である。ＡＤの病因は十分に解明されておらず、そしてＡＤのための疾患修飾（疾患の予防および進行抑制）療法はまだ実用化には程遠い段階である（1-3）。

　生理活性ペプチドである、ヒューマニンおよびＣＬＳＰは、毛様体神経栄養因子受容体α、ＷＳＸ‐１、およびｇｐ１３０からなるヘテロ三量体ヒューマニン受容体（ｈｔＨＮＲ）に対する生理学的アゴニストである（4-6）。それらは、ｈｔＨＮＲを介してインビトロでＡＤ関連ニューロン細胞死を阻害する（5,7）。また、ＣＬＳＰのトランスジェニック過剰発現は、ＡＤモデルマウスにおけるシナプス喪失および記憶喪失から保護する（8）。ただし、ヒューマニンの活性は弱く（５０％有効濃度は１～１０μＭ）（6,7）、生体内に存在するヒューマニンの濃度は神経保護効果を発揮するには不十分であると考えられる（6,9）。

　ＣＬＳＰは主に皮膚角化細胞で産生され、一部の末梢組織の上皮細胞でも若干産生される（10-12）。 ＣＬＳＰの腹腔内投与により、マウスにおけるスコポラミン誘発記憶障害が改善された（13）。また、ヒト脳脊髄液中に十分量のＣＬＳＰが存在する(14)。これらの実験事実から、ＣＬＳＰは末梢組織より血液循環によって運ばれて中枢神経系（ＣＮＳ）に到達し、血液脳関門を通過して神経組織に入ると推定される（14）。 ＣＬＳＰに於ける４０～６１番目の２２個のアミノ酸から成る配列であるＥＨＲ（内因性ヒューマニン相同領域）はＣＬＳＰ活性に不可欠であり（5）、野生型ＣＬＳＰの活性はヒューマニンよりも１０^５倍強力である（５０％有効濃度は１０‐１００ｐＭ）（5）。 また、測定されたヒト脳脊髄液中のＣＬＳＰの濃度（14）からすると、ＣＮＳにおけるＣＬＳＰ濃度は、ＡＤ保護因子として神経保護効果を示すに十分な濃度と推定される。これら公表された知見（5、6、8、9、13、及び14）から、インビボでのｈｔＨＮＲの中心的なアゴニストはヒューマニンではなくＣＬＳＰである可能性が高い。また、以前の研究(35)により、ＡＤ患者のＣＮＳにおいてはｈｔＨＮＲの活性化レベルが低下していることが示唆されている。そこで、さらなる推論として、ＡＤ患者のＣＮＳにおいてはｈｔＨＮＲの中心的アゴニストであるＣＬＳＰレベルが低下している可能性が提起された。しかしながら、本発明者らの直前の研究(14)により、ＣＬＳＰレベルそのものがＡＤ患者のＣＮＳで低下している可能性は否定された。

　ヒューマニンおよびＣＬＳＰ、並びに、これらの作用・効果に関しては、上記に数字で引用した参考文献（References）の他に、特許文献１にも詳細に記載されている。

　一方、アディポネクチンは、アディポネクチンＲ１およびアディポネクチンＲ２などの受容体に結合してＡＭＰキナーゼ媒介細胞内シグナリングを活性化することによって、インスリン感受性の増加、インスリン非依存性グルコースの取り込み、および脂肪酸分解などのさまざまな代謝作用を示す脂肪組織由来ペプチドホルモンである。結果として、このホルモンは、２型糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化症、非アルコール性脂肪性肝疾患、およびメタボリックシンドローム及び関連した代謝異常を抑制するという役割を果たすと考えられている。

　アディポネクチンの欠乏またはアディポネクチンシグナル伝達の異常な調節がＡＤの発症に関連しているという間接的な証拠が以下のように複数の研究で予備的なデータとして提示されている（31）。血清アディポネクチンレベルの上昇（29, 30）は、ＡＤの独立した危険因子である可能性がある（32）。逆に、血清アディポネクチン濃度が低いＩＩ型糖尿病患者ではＡＤ様の病状が発症することが研究により示された（33）。アディポネクチンレベルは、ＡＤ患者のＣＳＦにおいて低下されており、Ａβレベルの増加と逆相関している（30）。アディポネクチンノックアウトマウスはＡＤ様の症状及び病理所見を示す（34）。

特許第５９３９５２８号明細書

　ＣＬＳＰはｈｔＨＮＲ以外にも複数のタンパク質と結合することが示されている（15）が、それらの結合がＣＬＳＰ機能にどのように影響するかは明らかにされていない。
　本発明の第一の課題は、これらのＣＬＳＰ結合因子、および本発明において新たに発見したＣＬＳＰ結合因子が、ＣＬＳＰ活性を調節している可能性を検討し、調節しているタンパク質に関しては、その詳細なメカニズム解析を行うことである。
　第二の課題は、ＡＤ患者由来のサンプルを使用して、ＣＬＳＰ活性がＡＤの中枢神経系において低下していることを確認するとともに、これらＣＬＳＰ結合因子の異常がＡＤ発症に寄与している可能性を検討することである。
　更に、第三の課題は、阻害剤によるＣＬＳＰ活性の阻害又は抑制作用を受けないＣＬＳＰ誘導体、ＣＬＳＰ及び該ＣＬＳＰ誘導体の有するＣＬＳＰ活性の増強又は保護剤、ＣＬＳＰ又は該ＣＬＳＰ誘導体と増強又は保護剤との融合タンパク質、並びに、これらを有効成分として含むアルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制するための医薬組成物等を提供することである。

　本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、当該技術分野において以下の知見を初めて得て、本発明を完成した。

　まず、ＣＬＳＰ活性がアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＥ:ＡｐｏＥ；本実験で用いたＡｐｏＥ３とＡｐｏＥ４は一アミノ酸が異なる同族蛋白質で、生化学的性質はほぼ同じ）、１４－３－３タンパク質、およびカルレティキュリン（Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）などのＣＬＳＰ阻害物質（剤）によって抑制されることを見出した（図２および図３）。一連のデータはこれらＣＬＳＰ阻害物質が培地中のＣＬＳＰ濃度と同等から５倍までの濃度で完全なＣＬＳＰ抑制効果を示すことを実証している。ヒト中枢神経系にはＣＬＳＰ濃度より圧倒的に高い濃度のＡｐｏＥが存在することが知られている。例えば、ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＡｐｏＥ濃度は４０－２００nMと推定されている（18, 19）一方、ＣＬＳＰの濃度は3-6nMと推定されている（14）。従って、インビボのＣＮＳにおいてＣＬＳＰ活性がＣＬＳＰとその阻害物質のみからなる単純な系で規定されていると仮定すると、このような高濃度の内在性ＡｐｏＥによってＣＬＳＰの活性は完全に無効にされると考えられる（実際の正常生体内では後述のようにＣＬＳＰ保護物質が存在していてＣＬＳＰ活性を維持している（図５、図６、図７）。従って、治療手段として、ＡＤの中枢神経系において低下しているＣＬＳＰ活性（図１０、１１、表１、２、３、４）を、野生型ＣＬＳＰを増加させるという手法により出現させるためには、ＣＬＳＰ阻害物質による阻害を克服するために、ＣＮＳ中のＣＬＳＰ濃度を少なくとも４０－２００nM以上にまで増加させなければならない。しかし、ＣＬＳＰは血液脳関門を効率的に通過して中枢神経系に入ることができない（5, 14）ため、このことを末梢ルートからの野生型ＣＬＳＰ投与で達成するのは困難である。例えば、マウスにおいて、ＣＳＦおよび血清中のＣＬＳＰ濃度は、５ｎｍｏｌの野生型ＣＬＳＰの腹腔内注射の１時間後（通常最大濃度となることが予想される）に、それぞれ５ｎＭおよび５００nＭに達する（5）。したがって、単純な計算でＣＳＦ中に４０－２００nM以上の濃度に上昇させるためには少なくとも約１０倍以上の野生型ＣＬＳＰ投与が必要である。しかし、上記実験で投与された５ｎｍｏｌは既にマウスとしては非常に多い量であり、これ以上投与量を増やすのは現実的には困難である。すなわち、野生型ＣＬＳＰを末梢から注射することによって、ＣＬＳＰ活性をＣＮＳで出現させることはほぼ不可能である。従って、ＣＬＳＰを末梢投与することによってＣＬＳＰ活性をＣＮＳで出現させるためには、より効率的に血液脳関門を通過させる、および/またはＣＬＳＰをＣＬＳＰ阻害物質よる阻害効果から解放させる、変更又は工夫が必須である。

　本発明者は、ＡｐｏＥ４がＣＬＳＰのＣ末端領域（アミノ酸６２-１４６）を介してＣＬＳＰに結合することを見出した（図９および補足図Ｓ４）。この知見は、ＣＬＳＰのＮ末端領域（アミノ酸１-６１：「ＣＬＳＰ１‐６１」と略される）がＡｐｏＥに結合せず、そしてＡｐｏＥ媒介抑制を受けないことを示す。重要なこととして、本発明者はさらに、ＣＬＳＰ１‐６１が野生型ＣＬＳＰと同等の活性を有し、Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ誘導性の神経細胞死を抑制することを証明した（図Ｌ１）。 実際、Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ誘導性のニューロン死を完全に阻害する、大腸菌で産生させたＣＬＳＰ１‐６１および野生型ＣＬＳＰの最小必要濃度は同じで、０．５ｎＭである（図Ｌ１及び図２）。

　予想通り、ＣＬＳＰ１－６１により媒介されるＶ６４２Ｉ‐ＡＰＰ誘導性神経細胞死の抑制は、ＡｐｏＥ３のみならず、１４‐３‐３σタンパク質またはカルレティキュリンのような他のＣＬＳＰ阻害剤によって阻害されない（図Ｌ２）。以上のことから、ＣＬＳＰ１‐６１はＣＬＳＰ阻害物質による抑制から完全に解放され、しかも活性は野生型とほぼ同等であることから、インビボで野生型ＣＬＳＰよりはるかに低い濃度でＣＬＳＰ活性を示すＣＬＳＰ誘導体であることが実証された。

［配列番号１：ＣＬＳＰ（１－１４６）
mageltpeeeaqykkafsavdtdgngtinaqelgaalkatgknlseaqlrklisevdsdgdgeisfqefltaakkaragledlqvafrafdqdgdghitvdelrramaglgqplpqeeldamireadvdqdgrvnyeefarmlaqe （遺伝性多型により５８番目sはgの場合があるが、活性は同じ）

　更に、アディポネクチンがＣＬＳＰのＥＨＲ（内因性ヒューマニン相同領域）に結合すること（図１および図９、図Ｓ４）により、ＣＬＳＰ活性を増強し（活性増強因子；図７）、かつ全ての種類のＣＬＳＰ阻害物質からＣＬＳＰ活性を保護（保持）すること（活性保護因子；図５、図６）を発見した。 実際には、５０ｎＭまでの圧倒的に高い濃度のＣＬＳＰ阻害物質が存在していても、０．２‐０．２５ｎＭの濃度のアディポネクチンが存在すれば、１ｎＭのＣＬＳＰによって完全にＡＤ関連細胞死は抑制される（図５および図７）。この結果は、アディポネクチンが、ＣＬＳＰよりも圧倒的に高濃度のＣＬＳＰ阻害物質が存在するＣＮＳにおいて、ＣＬＳＰの活性を保つＣＬＳＰ活性保護因子であることを示している。

　さらに、臨床試料を用いて実験を行うことにより、ＣＳＦ中のアディポネクチンのレベルがＡＤ患者において０．３ｎＭに低下することを見出した（図１０、表１および２）。この結果は、以前の研究の結果と一致している（30）。さらに、ニューロン内ＣＬＳＰシグナル強度がＡＤ患者において低下することを見出した（図１１、表３および４）。これらの結果を合わせて考えると、ＡＤ患者において、何らかの原因でＣＮＳにおけるアディポネクチンレベルの低下が起こり、その結果ＣＬＳＰ活性が低下し、ニューロンがＡＤ関連毒性に感受性になること（すなわち神経毒性が出ること）が示唆される。

　本発明者はさらに、アディポネクチン（ＡＤＮ）のコラーゲン相同領域（ＡＤＮＣｏｌ：ＡＤＮに於ける４５～１０４番目のアミノ酸配列に相当）が単独でＣＬＳＰに結合し（図Ｓ４）、ＣＬＳＰ増強／保護活性を示すのに十分であることを見出した（図Ｌ３および図Ｌ４）。重要なことは、ＡＤＮＣｏｌのＣＬＳＰ増強／保護活性は野生型アディポネクチンのそれよりわずかに弱いだけであるという事実である。実際、完全なＣＬＳＰ増強／保護活性を付与するための野生型アディポネクチンの最小濃度は０．２‐０．２５ｎＭである一方、ＡＤＮＣｏｌのそれは０．５ｎＭである。また、アディポネクチンのＣ末端に位置する球状ドメインが通常のアディポネクチン受容体ＡｄｉｐｏＲ１および２を介したグルコース低下効果などのアディポネクチンの代謝活性の調節に必須であることが知られている（42）。従って、球状ドメインを欠損したＡＤＮＣｏｌはアディポネクチンのこれら代謝効果に欠けている。すなわち、球状ドメインを欠いたＡＤＮＣｏｌは、野生型ＡＤＮと同様に完全なＣＬＳＰ活性増強／保護作用を有するが、野生型ＡＤＮと異なり、通常のアディポネクチン受容体へ結合できず、その結果、いわゆる代謝調節活性（副作用になりうる活性）を示さないと考えられる。一方、以前に公表された研究（33,34）においては、アディポネクチンの抗ＡＤ活性は、通常のアディポネクチン受容体ＡｄｉｐｏＲ１および２の結合によって惹起される代謝調節活性によって媒介されると推定されている。

　上記の内容から、ＣＬＳＰ増強／保護剤としてのＡＤＮＣｏｌは、野生型アディポネクチンに対して４つの利点を有すると予想される。第一に、インビボ組織（ＣＮＳや末梢組織）における通常のアディポネクチン受容体ＡｄｉｐｏＲ１および２（通常型アディポネクチン受容体）の豊富さを考えると、かなりの割合の野生型アディポネクチンが通常型アディポネクチン受容体と複合体を作るのに消費されるのに対して、ＡＤＮＣｏｌはそのようなことがないと推測される。第二に、ＡＤにおけるＣＳＦアディポネクチンのレベルの低下は、ニューロン内の過リン酸化タウと不溶性複合体形成のために消費されていることに由来する可能性が示唆されている（30）が、この過程は、野生型アディポネクチンが通常型アディポネクチン受容体に結合してニューロンに取り込まれることによって引き起こされると推測される。ＡＤＮＣｏｌは、通常型アディポネクチン受容体に結合しないので、ニューロン中の過リン酸化タウと複合体を形成しない可能性が高い。以上の二点は、インビボでＣＬＳＰ増強／保護活性を示すのに必要なＡＤＮＣｏｌ量が野生型アディポネクチンと比較して少なくて済むことを示唆している。第三に、大量の野生型アディポネクチンは、通常型アディポネクチン受容体に結合して種々の代謝経路を活性化することによって副作用を引き起こす可能性があるが、ＡＤＮＣｏｌは通常受容体に結合しないためそのような副作用がないと推測される。第四に、野生型アディポネクチンのアミノ酸長（２４４アミノ酸：配列番号３）と比較して、ＡＤＮＣｏｌのアミノ酸長（６０アミノ酸：配列番号２）は相対的に短いので工業生産が容易となる。ＡＤＮＣｏｌのこれらすべての利点により、ＡＤＮＣｏｌは抗ＡＤ薬として野生型アディポネクチンよりも優れている。

　また、本発明者は、ＣＬＳＰ又はＣＬＳＰ誘導体と増強又は保護剤との融合タンパク質（ハイブリッドペプチド）がＣＬＳＰ１－６１および野生型ＣＬＳＰよりもＶ６４２Ｉ－ＡＰＰ誘導性の神経細胞死に対して強い保護活性を有する（図Ｌ５）ことを見出した。即ち、Ｖ６４２Ｉ－ＡＰＰ誘導ニューロン細胞死を完全に抑制するためのＣＬＳＰ１－６１とＡＤＮＣｏｌからなるハイブリッドペプチド（「ＣＬＳＰＣＯＬ」と命名）および野生型ＣＬＳＰとＡＤＮＣｏｌからなるハイブリッドペプチド（「ｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬ」と命名）の最小濃度は０．１ｎＭであり、ＣＬＳＰ１－６１および野生型ＣＬＳＰの最小濃度は０．５ｎＭであった（図Ｌ５）。また、ＣＬＳＰＣＯＬおよびｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬはＣＬＳＰ阻害剤により抑制されないか、抑制されてもその程度は軽度であった（図Ｘ１およびＸ２）。

　更に、ＣＬＳＰＣＯＬはｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬよりも効率的に血液脳関門を透過してＣＮＳに移行することを見出した（図Ｌ６および表１）。即ち、マウスにおいて、１０ｎｍｏｌのＣＬＳＰＣＯＬの腹腔内注射の１時間後のＣＬＳＰＣＯＬの濃度は、間質液（ＩＳＦ）含有脳ホモジネート中で７２ｎＭ、血清中で３２０ｎＭであった（図Ｌ６および表Ｌ１）。

［ＡＤＮＣｏｌ：配列番号２］
ghpghngapgrdgrdgtpgekgekgdpgligpkgdigetgvpgaegprgfpgiqgrkgep
［ＡＤＮ：配列番号３］
mlllgavllllalpghdqetttqgpgvllplpkgactgwmagipghpghngapgrdgrdgtpgekgekgdpgligpkgdigetgvpgaegprgfpgiqgrkgepgegayvyrsafsvgletyvtipnmpirftkifynqqnhydgstgkfhcnipglyyfayhitvymkdvkvslfkkdkamlftydqyqennvdqasgsvllhlevgdqvwlqvygegernglyadndndstftgfllyhdtn

　即ち、本発明は以下の態様にかかるものである。
［態様１］
カルモジュリン様皮膚タンパク質（Calmodulin-like skin Protein：ＣＬＳＰ）の誘導体（変異体）であって、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性（ＣＬＳＰ活性）中心である内因性ヒューマニン相同領域（ＥＨＲ）を含み、該ＣＬＳＰ活性の阻害剤が結合する領域を含まないことを特徴とする、前記誘導体。
［態様２］
ＥＨＲがアミノ酸配列（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＱＬＲＫＬＩＳＥＶＤＳ(あるいはＧ)ＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
から成る、態様１記載の誘導体。
［態様３］
阻害剤が結合する領域がＣＬＳＰ（配列番号１）のＣ末端領域のアミノ酸配列（アミノ酸６２～１４６）である、態様１又は２に記載の誘導体。
［態様４］
以下のアミノ酸配列：
（１）ＣＬＳＰのＮ末端領域のアミノ酸配列（アミノ酸１～６１）；
（２）上記（１）のアミノ酸配列に於いて、該アミノ酸配列に含まれるＥＨＲ以外のアミノ酸配列中に一個又は数個（例えば、２～５個程度）のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列； 又は
（３）上記（１）のアミノ酸配列に於いて、該アミノ酸配列に含まれるＥＨＲ以外のアミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
から成るポリペプチドである、態様１～３のいずれかに記載の誘導体。
［態様５］
阻害剤によるＣＬＳＰ活性の阻害又は抑制作用を受けない、態様１～４のいずれか一項に記載の誘導体。
［態様６］
阻害剤が、アポリポタンパク質Ｅ、１４‐３‐３タンパク質、およびカルレティキュリンから成る群から選択される、態様１～５のいずれか一項に記載の誘導体。
［態様７］
以下のアミノ酸配列：
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列（ＡＤＮＣｏｌ）；
（２）上記（１）のアミノ酸配列（ＡＤＮＣｏｌ）を含むアミノ酸配列；
（３）配列番号３に示されるアディポネクチンのアミノ酸配列に於いて、該アミノ酸配列に含まれるＡＤＮＣｏｌ以外のアミノ酸配列中に一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列； 又は
（４）配列番号３に示されるアディポネクチンのアミノ酸配列に於いて、該アミノ酸配列に含まれるＡＤＮＣｏｌ以外のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
から成るポリペプチド。
［態様８］
態様７に記載のポリペプチドから成る、ＣＬＳＰ又は態様１に記載のＣＬＳＰ誘導体の有するＣＬＳＰ活性の増強又は保護剤。
［態様９］
阻害剤によるＣＬＳＰ活性の阻害又は抑制作用から該ＣＬＳＰを保護し、又は、阻害剤の該作用を無効化することを特徴とする、態様８に記載の増強又は保護剤。
［態様１０］
前記ポリペプチドがアディポネクチンである、態様８又は９記載の増強又は保護剤。
［態様１１］
阻害剤が、アポリポタンパク質Ｅ、１４‐３‐３タンパク質、およびカルレティキュリンから成る群から選択される、態様８～１０のいずれか一項に記載の増強又は保護剤。
［態様１２］
ＣＬＳＰ又は態様１に記載のＣＬＳＰ誘導体と、態様７に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
［態様１３］
ＣＬＳＰのＮ末端領域のアミノ酸配列（アミノ酸１～６１）とＡＤＮＣｏｌから成る、態様１２に記載の融合タンパク質。
［態様１４］
阻害剤によるＣＬＳＰ活性の阻害又は抑制作用を受けない、態様１２または１３に記載の融合タンパク質。
［態様１５］態様１～６のいずれか一項に記載のＣＬＳＰ誘導体、態様７に記載のポリペプチド、態様８～１１のいずれか一項に記載の増強又は保護剤、又は、態様１２～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制するための医薬組成物。
［態様１６］アルツハイマー病に関連する記憶傷害又は神経変性を伴う疾病の予防または治療に用いられる、態様１５記載の医薬組成物。
［態様１７］態様１５又は１６に記載の医薬組成物を、神経細胞の細胞機能障害若しくは神経細胞死を伴う疾患、又は、記憶傷害若しくは神経変性を伴う疾病に罹患した又はその疑いのある個体に投与する段階を含む、該疾患又は疾病を治療する方法。
［態様１８］
疾患又は疾病がアルツハイマー病である、態様１７記載の方法。
［態様１９］態様１～６のいずれか一項に記載のＣＬＳＰ誘導体、態様７に記載のポリペプチド、又は、態様８～１１のいずれか一項に記載の増強又は保護剤、又は、態様１２～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質（以上をまとめて「本発明ポリペプチド」という）による、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性を検出する方法であって、（ａ）ＣＬＳＰの阻害剤の存在／非存在下、及び、本発明ポリペプチドの存在／非存在下に於いて、神経細胞の機能障害又は神経細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の機能障害又は神経細胞死を検出する工程、及び（ｃ）本発明ポリペプチドの存在／非存在下に於ける神経細胞の機能障害又は神経細胞死を比較する工程、を含む前記方法。
［態様２０］態様１～６のいずれか一項に記載のＣＬＳＰ誘導体、態様７に記載のポリペプチド、若しくは態様８～１１のいずれか一項に記載の増強又は保護剤、若しくは、態様１２～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質（以上をまとめて「本発明ポリペプチド」という）又はＣＬＳＰによる、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）本発明ポリペプチド又はＣＬＳＰの存在下、被検物質の有無で神経細胞の機能障害又は神経細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の機能障害又は神経細胞死を検出する工程、および（ｃ）本発明ポリペプチド又はＣＬＳＰによる神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性を調節する物質を選択する工程、を含む前記方法。

　本発明のＣＬＳＰ誘導体は、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性（ＣＬＳＰ活性）の中心である内因性ヒューマニン相同領域（ＥＨＲ）を含み、ＡｐｏＥ、または１４‐３‐３σタンパク質またはカルレティキュリンのようなＣＬＳＰ活性阻害剤が結合する領域を含まない。

　その結果、ＣＬＳＰ誘導体は野生型ＣＬＳＰと同程度のＣＬＳＰ活性を有しており、且つ、該阻害剤によるＣＬＳＰ活性の阻害又は抑制作用を実質的（有意）に受けない。以上のことから、これらのポリペプチドはＣＬＳＰ阻害剤による阻害・抑制から完全に解放され、インビボで野生型ＣＬＳＰよりはるかに低い濃度でＣＬＳＰ活性を示す。

　一方、配列番号２に示されるアミノ酸配列から成りアディポネクチンのコラーゲン相同領域であるポリペプチド、及び、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、例えば、三量体等の多量体アディポネクチンは、ＣＬＳＰ及び本発明のＣＬＳＰ誘導体のＣＬＳＰ１－６１内にあるＥＨＲに結合し、それらが有するＣＬＳＰ活性を増強する作用・効果を有する。

　更に、上記ポリペプチドはアポリポタンパク質Ｅ等の阻害剤によるＣＬＳＰ活性の阻害又は抑制からＣＬＳＰを保護し、又は該阻害剤による阻害又は抑制作用を無効化する作用・効果を有する。従って、上記ポリペプチドはアルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死の抑制活性の増強又は保護剤として有用である。

　また、本発明の融合タンパク質は、ＣＬＳＰやＣＬＳＰの一部分からなる誘導体より強力な抗ＡＤ活性を有する。また、融合タンパク質はＣＬＳＰ阻害剤による阻害を受けないか受けてもごく軽度なレベルである。さらに、同ペプチドはアディポネクチン由来する代謝関連活性を欠き、しかも標準的なアディポネクチン受容体との複合体形成のために消費されないと予想される。これら利点に加えて、融合タンパク質の一つであるＣＬＳＰＣＯＬはその血液脳関門移行が極めて良好であるという特徴を持つため、末梢投与できる理想的な抗ＡＤ薬となり得る可能性が高い。

＜アポリポタンパク質Ｅ３、Ｅ４、およびアディポネクチンはＣＬＳＰに結合する＞　Ｃ末端にＨＡタグ付けされた、アポリポタンパク質Ｅ３、Ｅ４、アディポネクチン、およびアネキシンＩＩを、トランスフェクションによってＦ１１ニューロハイブリッド細胞に過剰発現させた。トランスフェクションの２４時間後に、Ｆ１１細胞を回収し細胞溶解物を調製した。３００μgの溶解物に対して別に調整した適量のＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ－ＭｙｃＨｉｓ結合セファロース４Ｂを加え、４℃で一晩インキュベートし、徹底的に洗浄し、続いてプルダウン沈降を行った。細胞溶解物やＧＳＴ‐ＭｙｃＨｉｓ（ＧＳＴ‐ＭＨ）およびＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓ（ＣＬＳＰ－ＭＨ）と結合しているセファロース４Ｂビーズからなるインプット、ならびに細胞溶解物のプルダウン沈降物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ展開させた後、ＨＡ（ヘマグルチニンＡ）およびｍｙｃ抗体を用いた免疫ブロット分析にかけた。 ＜アポリポタンパク質Ｅ３およびＥ４はＣＬＳＰ活性を抑制する＞　（ａ）ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に対してｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．２／ＭｙｃＨｉｓ－Ｖ６４２Ｉ－ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ－ＡＰＰ）をトランスフェクションした。次いで、表示された濃度のＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２－１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を、同濃度のＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓを含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２と交換した。トランスフェクション開始の４８時間後に、ＷＳＴ‐８細胞死アッセイキットを用いた細胞生存アッセイ、またはカルセインＡＭ染色、およびトリパンブルー排除細胞死アッセイを行った。また、細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。　（b、c）ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞に対してｐｃＤＮＡ３．１/ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１/ＭｙｃＨｉｓ‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）をトランスフェクションした。次いで、細胞を示された濃度のＢＳＡ、アポリポタンパク質Ｅ３（ｂ）、またはＥ４（ｃ）を含む／含まない、１ｎＭのＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ－ＭｙｃＨｉｓを含有する、ＤＭＥＭ／Ｆ１２－１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を、同じ濃度のＢＳＡ、アポリポタンパク質Ｅ３（b）、またはＥ４（c）を含む/含まない、１ｎＭのＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓまたはＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓを含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を採取してトリパンブルー排除細胞死アッセイを実施した。また、細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。 ＜１４－３－３ファミリータンパク質と分泌型カルレティキュリンはＣＬＳＰ活性を抑制する＞　（ａ‐ｅ）ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に対してｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ－Ｖ６４２Ｉ－ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）をトランスフェクションした。次いで、表示濃度のＢＳＡおよび１４－３－３アイソフォームを含む／含まない、１０ｎＭのＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ－ＭｙｃＨｉｓを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２－１０％ＦＢＳ中で細胞を培養した。トランスフェクションの２４時間後に、培地を、同じ濃度のＢＳＡまたは１４－３－３アイソフォームを含む/含まない、１０ｎＭのＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ－ＭｙｃＨｉｓを含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を採取してトリパンブルー排除細胞死アッセイを実施した。　（ｆ）ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を空のｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ－Ｖ６４２Ｉ－ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）でトランスフェクトした。次いで、細胞を１０ｎＭのＢＳＡ、カルレティキュリン、アネキシンＩＩ、またはアネキシンＶを含む/含まない、１０ｎＭのＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓを含むＤＭＥＭ / Ｆ１２-１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの２４時間後に、培地を、１０ｎＭのＢＳＡ、カルレティキュリン、アネキシンＩＩ、またはアネキシンＶを含む／含まない、同じ濃度のＧＳＴ‐ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ－ＭｙｃＨｉｓを含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を採取してトリパンブルー排除細胞死アッセイを実施した。細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた ＜アディポネクチンはアポリポタンパク質Ｅ３による阻害からＣＬＳＰ活性を保護する＞　（ａ‐ｃ）ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞を空のｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ－Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）でトランスフェクトした。次いで、細胞を１０ｎＭのアディポネクチン（ａ）、アネキシンＩＩ（ｂ）、またはアネキシンＶ（ｃ）を含む／含まない、１ｎＭのＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ－ＭｙｃＨｉｓを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２‐１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を、同じ組み合わせのタンパク質を含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、トリパンブルー排除細胞死アッセイを実施した。また、細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。 ＜アディポネクチンは、アポリポタンパク質Ｅ４による阻害からＣＬＳＰ活性を保護する＞　（ａ）ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞に対してｐｃＤＮＡ３．１/ ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１/ＭｙｃＨｉｓ‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ/ ＭｙｃＨｉｓ‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）をトランスフェクションした。次いで、表示濃度のアディポネクチンを含む/含まない、１０ｎＭのアポリポタンパク質Ｅ４を含む/含まない、１ｎＭのＧＳＴ‐ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓを含むＤＭＥＭ/ Ｆ１２-１０％ＦＢＳ中で細胞を培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を、同じ組み合わせのタンパク質を含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を回収してＷＳＴ‐８およびトリパンブルー排除細胞死アッセイを実施した。細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。　（ｂ）ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞にｐｃＤＮＡ３．１ / ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１/ ＭｙｃＨｉｓ‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）をトランスフェクションした。次いで、細胞を、１ｎＭのアディポネクチンを含む/含まない、段階的に濃度を増加させたアポリポタンパク質Ｅ４を含む/含まない、１ｎＭのＧＳＴ‐ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２-１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を、同じ組み合わせのタンパク質を含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を回収してＷＳＴ‐８およびトリパンブルー排除細胞死アッセイを実施した。細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。 ＜アディポネクチンは１４－３－３σおよびカルレティキュリンによる阻害からＣＬＳＰを保護する＞　（ａ、ｂ）ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞にｐｃＤＮＡ３ベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）でトランスフェクションした。 次いで、細胞を、２ｎＭの１４－３－３σ（ａ）または１０ｎＭのカルレティキュリン（ｂ）を含む／含まない、１ｎＭのアディポネクチンを含む／含まない、１ｎＭのＧＳＴ‐ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２‐１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を、同じ組み合わせのタンパク質を含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を回収してトリパンブルー排除細胞死およびＷＳＴ‐８アッセイを実施した。細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。 ＜アディポネクチンはＣＬＳＰ活性を増強する＞　（ａ）ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞にｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）をトランスフェクションした。次いで、細胞を、示された濃度のＧＳＴ‐ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓを含有するＤＭＥＭ／ Ｆ１２-１０％ＦＢＳ中で、２００ｐＭのアディポネクチンを含む／含まない培養液で培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を、同じ組み合わせのタンパク質を含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２と交換した。　（ｂ）ＳＨ-ＳＹ５Ｙ細胞にｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）をトランスフェクションした。次に、示された濃度のアディポネクチンを含む／含まない、示された濃度のＧＳＴ‐ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２-１０％ＦＢＳ中で細胞を培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を、同じ組み合わせのタンパク質を含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を採取してトリパンブルー排除細胞死およびＷＳＴ-８アッセイを実施した。細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。 ＜アディポネクチンとＣＬＳＰの結合の解離定数はアポリポタンパク質Ｅ４とＣＬＳＰの結合の解離定数と近似している＞　（ａ）アディポネクチンの存在はアポリポタンパク質Ｅ４とＣＬＳＰとの間の結合をわずかに抑制するにとどまる。 ＣＬＳＰ-ＭｙｃＨｉｓ結合セファロース４Ｂを含有するＰＢＳを、アディポネクチン、アネキシンＩＩ、組換えアポリポタンパク質Ｅ３、または同Ｅ４のいずれか一つあるいは二つと混合して４℃で一晩インキュベーションした後、十分に洗浄した。アッセイにおける各組み換えタンパク質の推定最終濃度は１ｎＭであった。次いで、プルダウンを行い、生じた沈殿物、およびＣＬＳＰ-ＭｙｃＨｉｓを結合させたセファロース４Ｂビーズと各組換えタンパク質をインプットとしてＳＤＳ‐ＰＡＧＥ展開し、続いて銀染色で可視化した。　（ｂ）解離定数を測定するためのスキャッチャード分析を行った。濃度２０ｐＭの組換えアポリポタンパク質Ｅ４またはアディポネクチンでコートした９６ウェルプレートの各ウェルを段階的に増加する濃度のＣＬＳＰ－ＨｉＢｉＴで満たし、室温で２時間インキュベーションした後、Ｗａｌｌａｃ　ＡＲＶＯ^ＴＭ　Ｘ５（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を用いた化学発光の測定により、ＨｉＢｉＴ活性を推定した。この実験はＮ＝２で実施し、２つのウェルの平均データ（平均）をさらなる分析に使用した。各平均ＣＬＳＰ‐ＨｉＢｉＴ活性（平均）から、ゼロ濃度での平均ＣＬＳＰ‐ＨｉＢｉＴ活性（バックグランド）を差し引いて、アディポネクチンまたはアポリポタンパク質Ｅ４に結合している実際のＣＬＳＰ－ＨｉＢｉＴ活性（Ｄｅｌ／ＭＥＡＮ）を得た。次いで、ＣＬＳＰ‐ＨｉＢｉＴ濃度および対応する化学発光強度（すなわちＣＬＳＰ－ＨｉＢｉＴ活性）からなる標準用量反応曲線を参照して、アポリポタンパク質Ｅ４またはアディポネクチンに結合したＣＬＳＰ－ＨｉＢｉｔの濃度（＜Ｂ＞で表される）を推定した。次いで、遊離ＣＬＳＰ‐ＨｉＢｉＴ濃度（非結合濃度）（＜Ｆ＞として示す）およびＢ／Ｆを計算した。解離定数は、Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアを用いたスキャッチャード分析によって計算した。 ＜アポリポタンパク質Ｅ４とアディポネクチンはＣＬＳＰの異なる部位に結合する＞　（ａ）ＣＬＳＰの欠失変異体の略図を示した。　（ｂ）Ｆ１１ニューロハイブリッド細胞に対してトランスフェクションによって、Ｃ末端がＦＬＡＧでタグ付けされた、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）およびアディポネクチン（ＡＤＮ）が過剰発現させた。トランスフェクションの２４時間後に、Ｆ１１細胞を回収して、細胞溶解物を調製した。ＦＬＡＧ抗体を用いたＡｐｏＥ４‐ＦＬＡＧおよびＡＤＮ‐ＦＬＡＧの免疫沈降には、３００μｇの細胞溶解物を使用した。別に、組換えＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓ（ＦＬ‐ＭＨ）またはＣ末端ＭｙｃＨｉｓタグ付きＣＬＳＰ欠失変異体を細菌中で産生させて精製した。次いで、これらの免疫沈降物および組換えタンパク質を、インプットとしてｍｙｃ抗体およびＦＬＡＧ抗体を用いてＳＤＳ‐ＰＡＧＥ展開し、免疫ブロット分析にかけた。 　（ｃ）（b）で作成したＡｐｏＥ４‐ＦＬＡＧおよびＡＤＮ‐ＦＬＡＧ免疫沈降物を精製組換えＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓ（ＦＬ‐ＭＨ）またはＣ末端ＭｙｃＨｉｓタグＣＬＳＰ欠失変異体と混合し、４℃で一晩インキュベーションし、続いて徹底的に洗浄した。次いで、プルダウンした沈殿物を、ｍｙｃ抗体およびＦＬＡＧ抗体を用いたＳＤＳ‐ＰＡＧＥ展開し、免疫ブロット分析にかけた。 ＜アディポネクチンはＡＤ患者のＣＳＦにおいて低下している＞　（ａ）表１に示すＡＤ患者および非ＡＤ対照から得たＣＳＦ中のアディポネクチン濃度をアディポネクチンＥＬＩＳＡシステムを用いて測定した。標準的な用量 - 応答線は、組換えアディポネクチンの段階的に増加する濃度を測定することによって作成した。　（ｂ）ＡＤ患者および非ＡＤ対照における各ＣＳＦアディポネクチン濃度をドットとしてプロットした（ＡＤ症例Ｎ＝１４、非ＡＤ症例Ｎ＝２０）。アディポネクチン濃度の平均±ＳＥＭも示されている（ＡＤ、０．３１±０．１３ｎＭ；非ＡＤ、０．９６±０．１９ｎＭ；対応のないＴ検定、ｐ＝０．００６５）。　（ｃ）８１～８８歳のＡＤ患者および非ＡＤ対照における各ＣＳＦアディポネクチン濃度をドットとしてプロットした（ＡＤ症例Ｎ＝６、非ＡＤ症例Ｎ ＝５）。 アディポネクチン濃度の平均±ＳＥＭも示されている（ＡＤ、０．３０±０．０７ｎＭ；非ＡＤ、１．４１±０．１６ｎＭ；対応のないＴ検定、ｐ ＜０．０００１）。 ＜ＡＤ皮質のニューロン内ＳＨ３ＢＰ５レベルは低下している＞　（ａ）２人のＡＤ患者（６５歳男性；７９歳女性）およびＡＬＳ患者（６６歳男性；７９歳男性）由来の側頭葉または後頭葉の外側錐体層をＳＨ３ＢＰ５に対する抗体で免疫染色した。免疫検出はチラミドレッド法で行った。スケールバー、２００ｍｍ。　（ｂ）細胞の免疫蛍光強度の定量化の例。細胞領域と細胞周囲の非細胞領域をマーキングで囲み、細胞領域の平均免疫蛍光強度（ｘ）および細胞周囲の非細胞領域の平均免疫蛍光強度（ｙ）を測定した。次いで、ニューロンにおける相対平均免疫蛍光強度を（x-y）によって計算し、x-y値にニューロン面積を掛けて、一つのニューロンにおけるＳＨ３ＢＰ５発現のレベルを計算した。　（ｃ）表２に示されるように、ＡＤ患者および筋萎縮性側鎖索硬化症（ＡＬＳ）患者からの側頭葉または後頭葉の外側錐体層の切片（（ａ）に示されるものを含む）をＳＨ３ＢＰ５に対する抗体で免疫染色した。免疫検出はチラミドレッド法で行った。「材料および方法」に詳細に記載されているように、免疫蛍光強度をＩｍａｇｅ Ｊ １．３７ｖで測定した。ＡＤ患者およびＡＬＳ患者における各相対強度をドットとしてプロットした（ＡＤ症例Ｎ＝７、ＡＬＳ症例Ｎ＝６）。免疫蛍光強度の平均±ＳＥＭも示した（ＡＤ、４６５６４±７７３７任意単位； ＡＬＳ、７９２２５±１０３０５任意単位；対応のないＴ検定、ｐ ＝ ０．０２５６）。 　（ｄ、ｅ）表３に示されるように、ＡＤ患者および非ＡＤの側頭皮質から得られた２０μＬの溶解物中のＳＨ３ＢＰ５濃度を、ＳＨ３ＢＰ５ ＥＬＩＳＡを用いて測定した。段階的に増加する濃度の組換えＳＨ３ＢＰ５を測定することによって標準的な用量反応線を作成した（ｄ）。ＡＤ患者および非ＡＤにおけるＳＨ３ＢＰ５の相対濃度をプロットした（各群につきＮ＝１０）（ｅ）。 相対的なＳＨ３ＢＰ５レベルの平均値±ＳＤも示した（ＡＤ、１０３．９±９．０任意単位；正常、１５９．４±１６．５任意単位；対応のないＴ検定、ｐ＝０．００８４）。 図Ｓ１（Supplementary Figure 1）＜アディポネクチンそれ自体はＶ６４２Ｉ‐ＡＰＰ誘導性神経細胞死を阻害しないし、ＣＬＳＰ媒介によるＶ６４２Ｉ‐ＡＰＰ誘導性神経細胞死の減少を阻害しない＞　ＳＨ-ＳＹ５Ｙ細胞にｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）をトランスフェクションした。次に、段階的に増加する濃度のアディポネクチンを含む／含まない、ＧＳＴ‐ＭＨまたはＣＬＳＰ‐ＭＨを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２-１０％ＦＢＳ中で細胞を培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を、段階的に増加する濃度のアディポネクチンを含む／含まない、ＧＳＴ‐ＭＨまたはＣＬＳＰ‐ＭＨを含むＮ２サプリメントを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を回収して、ＷＳＴ‐８細胞死アッセイキット（同仁堂、熊本、日本）またはカルセインＡＭ染色（同仁堂）、およびトリパンブルー排除細胞死アッセイを用いて細胞生存アッセイを実施した。また、細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。 図Ｓ２（Supplementary Figure 2）＜ヒトＣＳＦにおける１４‐３‐３σレベルは検出限界以下である＞　（ａ）８人の非ＡＤ患者（ＣＳＦ＃１‐８）から得た２０μLのＣＳＦ中の１４‐３‐３σ濃度を１４‐３‐３σＥＬＩＳＡシステムを用いて測定した。実験は２回行った。段階的に増加する濃度の標準１４‐３‐３σ（濃度；０．１９５から６．２５ｎＭ）および８人の非ＡＤ患者のＣＳＦの生の測定数をＡｂｓ４５０の列に示した。 次に、２つの数値の平均を計算し、平均Ａｂｓ４５０列に示した。ＰＢＳを負対照として使用した。各平均数からＰＢＳ数を差し引くことにより、Ｄｅｌ Ａｂｓ ４５０ｎｍ数を得た。　（ｂ）標準的な用量 - 応答線は、組換え１４‐３‐３σの段階的に増加する濃度を測定することによって作成した。これにより、このＥＬＩＳＡにより検出可能な最低限界が０．４ｎＭであると推定された。（ａ）におけるＤｅｌ Ａｂ ４５０ｎＭの各データのＣＳＦ １４－３－３σ濃度は検出限界以下である。 図Ｓ３（Supplementary Figure 3）＜三量体アディポネクチンは野生型アディポネクチンに匹敵するＣＬＳＰ活性化効果を有する＞　ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞にｐｃＤＮＡ３．１/ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１/ＭｙｃＨｉｓ‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）をトランスフェクションした。 次いで、細胞を、１ｎＭの三量体または野生型（モノ）アディポネクチンを含む／含まない、示された濃度のＧＳＴ‐ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２‐１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を、同じ組み合わせのタンパク質を含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２と交換した。トランスフェクション開始から４８時間後に、細胞を採取してＷＳＴ‐８アッセイおよびトリパンブルー排除細胞死アッセイを実施した。 細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。 「＊＊＊」ｐ ＜０．００１；「n.s.」有意ではない。 図Ｓ４（Supplementary Figure 4）＜ＣＬＳＰとＡｐｏＥ４またはアディポネクチンとの結合の詳細な解析＞　（ａ,b）＜アポリポタンパク質Ｅ４はＣＬＳＰのＣ末端領域に結合する＞ＣＬＳＰの欠失変異体の略図を（ａ）に示す。ＦＬＡＧでＣ末端にタグ付けされた、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）およびアディポネクチン（ＡＤＮ）を、トランスフェクションによってＦ１１ニューロハイブリッド細胞において過剰発現させた。トランスフェクションの２４時間後に、Ｆ１１細胞を細胞溶解物を調製した。ＦＬＡＧ抗体を用いたＡｐｏＥ４‐ＦＬＡＧおよびＡＤＮ‐ＦＬＡＧの免疫沈降には、３００μgの細胞溶解物を使用した。組換えＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓ（ＦＬ‐ＭＨ）またはＣ末端ＭｙｃＨｉｓタグ付きＣＬＳＰ欠失変異体を細菌中で産生させそして精製した。次に、これらの免疫沈降物および組換えタンパク質を、ｍｙｃおよびＦＬＡＧ抗体を用いてＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよび免疫ブロット分析にかけた（インプット）。ＡｐｏＥ４‐ＦＬＡＧおよびＡＤＮ‐ＦＬＡＧ免疫沈降物を組換えＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓ（ＦＬ‐ＭＨ）またはＣ末端ＭｙｃＨｉｓタグ付きＣＬＳＰ欠失変異体と混合し、４℃で一晩インキュベートし、続いて徹底的に洗浄した。次いで、プルダウン沈殿物を、ｍｙｃ抗体およびＦＬＡＧ抗体を用いてＳＤＳ‐ＰＡＧＥ展開し、イムノブロット分析にかけた。　（ｃ）＜ＣＬＳＰはアディポネクチンのコラーゲン相同領域に結合する＞ ６×ＨｉｓおよびＧ（ＨｉｓＧ）でＮ末端標識されたアディポネクチンのコラーゲン相同領域（ＡＤＮＣｏｌ）を細菌中で産生させた。またＣＬＳＰ‐ＦＬＡＧをトランスフェクションによりＦ１１ニューロハイブリッド細胞中で過剰発現させた。ＨｉｓＧ‐ＡＤＮＣｏｌ並びにＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降させた精製組換えＦＬＡＧ－ＣＬＳＰおよび対照（ベクター）をＳＤＳ－ＰＡＧＥ展開し、ＦＬＡＧおよびＨｉｓＧ抗体を用いた免疫ブロット分析に供した（インプット；左パネル）。精製した組換えＨｉｓＧ－ＡＮＤＣｏｌおよび免疫沈降したＣＬＳＰ－ＦＬＡＧまたは対照（ベクター）を次に混合し、そして４℃で一晩インキュベートし、続いて徹底的に洗浄した。 次いで、プルダウンした沈殿物をＦＬＡＧ抗体およびＨｉｓＧ抗体を用いたＳＤＳ‐ＰＡＧＥ展開し、イムノブロット分析にかけた（Ｃｏ‐ＩＰ；右パネル）。 図Ｓ５（Supplementary Figure 5）＜年齢とＣＳＦアディポネクチン濃度の間に相関はない＞　アディポネクチンレベルおよび年齢の生データを表１および表Ｓ１の全対象についてプロットした（Ｘ軸：年齢；Ｙ軸：ＣＳＦアディポネクチン濃度）。相関係数は０．００５５である。 図Ｓ６（Supplementary Figure 6）＜ニューロン中のＳＨ３ＢＰ５レベルは加齢による影響を受けない＞　図１１Ｃに示された、ＡＤ患者またはＡＬＳ患者に関するＳＨ３ＢＰ５データを、年齢に基づいて２つの群に分け、比較した。一方のグループは７０歳以下の人ともう一方は７１歳以上の人で構成されている。２つの群のＳＨ３ＢＰ５の平均±ＳＥＭ相対強度は５７４３９±１４４６５任意単位および６５２３７±７９７６任意単位だった（対応のないＴ検定、ｐ＝０．６３２８、ｔ＝０．４９、Ｒ二乗＝０．０２１、自由度＝１１、Ｆ検定によるp値=０．２４）。 図Ｌ１＜Ｖ６４２Ｉ－ＡＰＰ誘導神経細胞死を完全に抑制するＣＬＳＰ１－６１の最小濃度は５００ｐＭである＞　（ａ、ｂ）ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞にｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）でトランスフェクションした。 次いで、細胞を示された濃度のＧＳＴ‐ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ（１‐６１）‐ＭｙｃＨｉｓを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２‐１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの２４時間後に、培地を、同じ濃度のＧＳＴ‐ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ（１‐６１）‐ＭｙｃＨｉｓを含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を採取してトリパンブルー排除細胞死亡率、ＷＳＴ８、およびカルセインアッセイを実施した。また、細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。 図Ｌ２＜ＣＬＳＰ阻害物質は、ＣＬＳＰ１‐６１によるＶ６４２Ｉ‐ＡＰＰ誘導神経細胞死の抑制効果を阻害しない＞　ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞にｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）をトランスフェクションした。 次いで、細胞を、１０ｎＭのＢＳＡ、ＡｐｏＥ３、１４－３－３σ、またはカルレティキュリンと共に、１ｎＭのＧＳＴ‐ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ（１‐６１）‐ＭｙｃＨｉｓを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２‐１０％ＦＢＳ中で培養した トランスフェクションの２４時間後に、培地を、同じ濃度のＢＳＡ、ＡｐｏＥ３、１４－３－３σ、またはカルレティキュリンと共にＧＳＴ‐ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ（１‐６１）‐ＭｙｃＨｉｓを含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を採取してトリパンブルー排除細胞死亡率、ＷＳＴ８、およびカルセインアッセイを実施した。細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。 図Ｌ３＜アディポネクチンのコラーゲン相同領域はＣＬＳＰ活性を増強する＞　ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞にｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）をトランスフェクションした。次いで、細胞を、１ｎＭのＢＳＡ、アディポネクチン（ＦＬ）またはアディポネクチンのコラーゲン相同領域（Ｃｏｌ）と共に、１ｎＭまたは５０ｐＭのＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓを含有するＤＭＥＭ ／Ｆ１２－１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を、同じ組み合わせのタンパク質を含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ ／Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を採取してトリパンブルー排除細胞死亡率、ＷＳＴ８、およびカルセインアッセイを実施した。細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。 図Ｌ４＜５０ｐＭのＣＬＳＰを完全に活性化させるアディポネクチンのコラーゲン相同領域の最小濃度は５００ｐＭである＞　ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞にｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）をトランスフェクトションした。次いで、細胞を、５００μＭのＢＳＡ、２５０μＭのアディポネクチン（ＦＬ）または示された濃度のアディポネクチンのコラーゲン相同領域（Ｃｏｌ）を含み、５０ｐＭのＧＳＴ‐ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２－１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を、同じ組み合わせのタンパク質を含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を採取してトリパンブルー排除細胞死亡率、ＷＳＴ８、およびカルセインアッセイを実施した。細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。 図Ｌ５＜ＣＬＳＰＣＯＬは強力なＡＤ保護活性を有する＞　ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞にｐｃＤＮＡ３．１ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ－ＡＰＰ）をトランスフェクトした。次いで、細胞を１ｎＭのＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓ、ＣＬＳＰ１－６１－ＭｙｃＨｉｓ、ＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓ、または指示された濃度のＣＬＳＰＣＯＬまたはｗｔ‐ＣＬＳＰＣＯＬを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２－１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を同じ濃度の試薬を含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を採取してトリパンブルー排除細胞死アッセイを実施した。細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。 図Ｌ６＜ＣＬＳＰＣＯＬは血液脳関門を効率的に通過する＞　（ａ）表Ｌ１に示すように、段階的に増加させた濃度のｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬおよびＣＬＳＰＣＯＬについて４５０ｎＭで吸光度を測定することにより、標準用量反応線をシミュレートした。（ｂ）１０ｎｍｏｌのＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓＧ、ＣＬＳＰＣＯＬ、およびｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬの腹腔内注射の１時間後、ＥＬＩＳＡのためにマウスから脳および血清を採取した。表Ｌ１に示されるように、間質液（ＩＳＦ）を含む脳溶解物および血清中のＣＬＳＰＣＯＬおよびｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬの濃度をＥＬＩＳＡを使用して測定した。（ｃ）ＩＳＦ対血清濃度の比を計算し提示した。 図Ｘ１＜ＣＬＳＰＣＯＬはＡｐｏＥ３と１４‐３‐３σにより阻害されないがカルレティキュリンにより軽度に阻害される＞　ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞にｐｃＤＮＡ３．１ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ‐Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）をトランスフェクトした。次いで、細胞を１００pMのＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓあるいはＣＬＳＰＣＯＬと1 nMのＡｐｏＥ３、１４‐３‐３σ、あるいはカルレティキュリンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２－１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を同じ濃度の試薬を含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を採取してトリパンブルー排除細胞死アッセイを実施した。細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。 図Ｘ２＜ＣＬＳＰＣＯＬは１０倍以上高い濃度のカルレティキュリンにより阻害され始める＞　ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞にｐｃＤＮＡ３．１ＭｙｃＨｉｓベクター（ベクター）またはｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ－Ｖ６４２Ｉ－ＡＰＰ（Ｖ６４２Ｉ－ＡＰＰ）をトランスフェクトした。次いで、細胞をＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓ（１ｎＭ）、ＣＬＳＰ１－６１－ＭｙｃＨｉｓ（１ｎＭ）、ＣＬＳＰＣＯＬ（１００ｐＭ）、あるいはｗｔ‐ＣＬＳＰＣＯＬ（１００ｐＭ）と表示された濃度のカルレティキュリン或いは BSAを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２－１０％ＦＢＳ中で培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を同じ濃度の試薬を含有するＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２と交換した。トランスフェクションの開始から４８時間後に、細胞を採取してトリパンブルー排除細胞死アッセイを実施した。細胞溶解物をＡＰＰ抗体２２Ｃ１１を用いて免疫ブロット分析にかけた。

［ＣＬＳＰ誘導体］
　カルモジュリン様皮膚タンパク質（Calmodulin-like skin Protein：ＣＬＳＰ）（アミノ酸配列１）に含まれる２２個のアミノ酸（アミノ酸４０～６１）から成るアミノ酸配列（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＱＬＲＫＬＩＳＥＶＤＳ（あるいはＧ）ＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
は、内因性ヒューマニン相同領域（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ｈｕｍａｎｉｎ－Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ　Ｒｅｇｉｏｎ：ＥＨＲ）又は内因性ヒューマニン様ドメイン（（Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　Ｈｕｍａｎｉｎ－Ｌｉｋｅ　Ｄｏｍａｉｎ：ＥＨＤ）と呼ばれ、ＣＬＳＰが介在する神経細胞死の抑制に於いて中心的な役割を果たすものである（特許文献１）。

　本発明のＣＬＳＰ誘導体は、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性（ＣＬＳＰ活性又はＣＬＳＰ抑制活性）の中心である内因性ヒューマニン相同領域（ＥＨＲ）を含み、該活性の阻害剤又は阻害物質（ＣＬＳＰ阻害剤）が結合する領域を含まないことを特徴とする。該阻害剤が結合する領域として、例えば、ＣＬＳＰ（配列番号１）のＣ末端領域のアミノ酸配列（アミノ酸６２～１４６）を挙げることが出来る。

　本発明において「アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性」とは、その原因又は因果関係に依らず、神経細胞における機能障害又は細胞死の少なくとも１つを抑制又は拮抗することを指す。神経細胞死の抑制は、完全な抑制ではなくても、有意に抑制されればよい。神経細胞死の抑制活性は、以下の実施例に記載された方法または他に記載の方法（例えば国際公開番号 ＷＯ００／１４２０４参照）に従って検定することができる。例えば、ＣＬＳＰ活性は、様々な神経細胞死アッセイを用いて、Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ誘導性神経細胞死の抑制活性として測定することが出来る。

　更に、阻害剤とＣＬＳＰとの結合は、本明細書の実施例に記載されているような、当業者に公知の任意の方法・手段（アッセイシステム）を用いて測定することが出来る。例えば、イムノブロット分析、プルダウン分析、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ　ＨｉＢｉＴ細胞外検出システム、及びＥＬＩＳＡ等により測定することが出来る。

　ここで、ＥＨＲの具体例として、アミノ酸配列（Ｉ）：
ＴＧＫＮＬＳＥＡＱＬＲＫＬＩＳＥＶＤＳ（あるいはＧ）ＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）、又は、特許文献１の請求項１に記載の２２個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を挙げることが出来る。更に、阻害剤が結合する領域の例としては、ＣＬＳＰ（配列番号１）のＣ末端領域のアミノ酸配列（アミノ酸６２～１４６）を挙げることが出来る。

　従って、本発明のＣＬＳＰ誘導体の好適例として、以下のアミノ酸配列：
（１）ＣＬＳＰのＮ末端領域のアミノ酸配列（アミノ酸１～６１）；
（２）上記（１）のアミノ酸配列に於いて、該アミノ酸配列に含まれるＥＨＲ以外のアミノ酸配列中に一個又は数個（例えば、２～５個程度）のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列； 又は
（３）上記（１）のアミノ酸配列に於いて、該アミノ酸配列に含まれるＥＨＲ以外のアミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
から成るポリペプチドを挙げることが出来る。

　本発明のＣＬＳＰ誘導体は、野生型ＣＬＳＰと同程度のＣＬＳＰ活性を有し、且つ、阻害剤が結合する領域を含まない為に、阻害剤によるＣＬＳＰ活性の阻害又は抑制作用を実質的（有意）に受けないことを特徴とする。尚、本発明のＣＬＳＰ誘導体には、例えば、欠失変異体等の各種変異体及びＥＨＲを含む融合タンパク質（ハイブリッドポリペプチド）等も含まれるが、ＥＨＲのみから成るポリペプチドは含まれない。

　一方、ＣＬＳＰ阻害剤としては、その構造的特徴等に特に制限はないが、例えば、培地中のＣＬＳＰ濃度と同程度または５倍以上の濃度でＣＬＳＰ活性に対する有意な阻害（抑制）効果を示す物質であり、例えば、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、１４‐３‐３タンパク質、およびカルレティキュリンから成る群から選択される。特に、ＡｐｏＥ（ＡｐｏＥ３及びＡｐｏＥ４）のＣＬＳＰ活性抑制効果が高いことが示された。

［アディポネクチン及びその誘導体］
　更に、本発明に於いて、アディポネクチン（配列番号３）は、そのコラーゲン相同領域（ＡＤＮＣｏｌ）であるポリペプチド（配列番号２）で、ＣＬＳＰ及び本発明のＣＬＳＰ誘導体のＣＬＳＰ１－６１領域内のＥＨＲに結合し、それらのＣＬＳＰ活性を増強する作用・効果を有すること、更に、アディポネクチン及び該ポリペプチドは、上記阻害剤によるＣＬＳＰ活性の阻害又は抑制作用から該ＣＬＳＰを保護し、又は、阻害剤の該作用を無効化する作用も有することが明らかにされた。

　従って、以下のアミノ酸配列：
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列（ＡＤＮＣｏｌ）；
（２）上記（１）のアミノ酸配列（ＡＤＮＣｏｌ）を含むアミノ酸配列、例えば、配列番号３に示されるアディポネクチン；
（３）配列番号３に示されるアディポネクチンのアミノ酸配列に於いて、該アミノ酸配列に含まれるＡＤＮＣｏｌ以外のアミノ酸配列中に一個又は数個（例えば、２～５個程度）のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列； 又は
（４）配列番号３に示されるアディポネクチンのアミノ酸配列に於いて、該アミノ酸配列に含まれるＡＤＮＣｏｌ以外のアミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
から成るポリペプチド（以下、「アディポネクチン及びその誘導体」ともいう）は、ＣＬＳＰ又は本発明のＣＬＳＰ誘導体の有するＣＬＳＰ活性の増強又は保護剤として有用である。尚、これらポリぺプチドは、例えば、三量体アディポネクチンのような多量体を形成していても良い。

　尚、「ＣＬＳＰ」には、本明細書に記載した配列番号１に示されるポリペプチド以外に、特許文献１に記載されているようなＣＬＳＰ活性を有する各種のＣＬＳＰに関連（類似）するポリペプチドも含有される。また、このようなＣＬＳＰ活性に関して、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死に対する「抑制」及び「阻害」は同義である。更に、本発明の増強又は保護剤の活性に関して、「保護」、「維持」及び「保持」は同義である。

［ＣＬＳＰ誘導体等とアディポネクチン誘導体等との融合タンパク質］
　更に、本発明は、上記ＣＬＳＰ誘導体の一例である、ＣＬＳＰ又はＣＬＳＰ誘導体と、アディポネクチン又はアディポネクチン誘導体を含む融合タンパク質（ハイブリッドポリペプチド）にも係るものである。該融合タンパク質は強力なＣＬＳＰ活性を有し、ＣＬＳＰ阻害剤による抑制を受けないか受けても軽度にとどまる。
　特にこの一好適例である、ＣＬＳＰのＮ末端領域のアミノ酸配列（アミノ酸１～６１）とＡＤＮＣｏｌから成る融合タンパク質（ＣＬＳＰＣＯＬ）は効率的に血液脳関門を透過してＣＮＳに移行することことが出来る。

　係る融合タンパク質は、それが有する所定の活性を損なわない限り、上記の各領域（要素）を構成するポリペプチド以外のアミノ酸配列を任意に含むことが出来る。例えば、タンパク質三次元構造の安定性等を向上させる目的で各領域の間に適当なアミノ酸配列から成るリンカー配列を挿入することも可能である。或いは、例えば、体内での安定性（血漿中の半減期等）等の向上等を目的として、公知の融合タンパク質に見られる免疫グロブリン定常領域等の当業者に公知の任意のアミノ酸配列をＣ末端側に付加することも可能である。
　このような、追加・挿入配列は当業者であれば、技術常識に基づき、抗原性等に配慮しつつ、適宜、設計・調製することが出来る。尚、抗原性に関しては、ＣＬＳＰ１－６１およびコラーゲン相同領域は内在性ヒトペプチドに由来するので、それらの抗原性は限定的であると推測される。
　更に、融合タンパク質に含まれる各領域が連結される順序（Ｎ末側又はＣ末側）に関しては特に制約はなく、当業者が適宜、選択・調製することが可能である。

　本発明のＣＬＳＰ誘導体、アディポネクチン及びその誘導体、ポリペプチドから成る、ＣＬＳＰ又は該ＣＬＳＰ誘導体の有するＣＬＳＰ活性の増強又は保護剤、並びに、融合タンパク質を構成するポリペプチドを、以下、単に、「本発明（の）ポリペプチド」とも称する。

　本発明ポリペプチドに関して、２つのアミノ酸配列における配列の同一性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における同一性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。

　上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列における同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができる。例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：２２６４－２２６８，１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：５８７３－５８７７，１９９３）により決定することが出来る。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｈｕｌらによって開発された（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０）。

　さらに、Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴはＢＬＡＳＴより感度良く同一性を決定するプログラムである（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い同一性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。

　或いは、配列間の同一性として、Ｔａｔｉａｎａ　Ａ．　Ｔａｔｕｓｏｖａらによって開発されたＢＬＡＳＴ　２　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓソフトウェア（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７－２５０，１９９９）を用いて決定した値を用いることも可能である。このソフトウェアは米国Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラム及びパラメーターは以下のとおりである。アミノ酸配列の場合、ｂｌａｓｔｐプログラムを用いパラメーターとしては、Ｏｐｅｎ　ｇａｐ：１１　ａｎｄ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｇａｐ：１　ｐｅｎａｌｔｉｅｓ，ｇａｐ　ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：５０，ｅｘｐｅｃｔ：１０，ｗｏｒｄ　ｓｉｚｅ：３，Ｆｉｌｔｅｒ：ＯＮを用いる。更に、高感度なＦＡＳＴＡソフトウェア（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４－２４４８，１９８８）を用いて同一性を示す配列をデータベースから検索することもできる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。

　上記の本発明ポリペプチドは、既知の方法により修飾、付加、変異、置換、または削除などにより改変された形態を持つことも可能である。このような官能基の改変は、当業者に公知の任意の方法を用いて、例えば、ポリペプチドの保護、ポリペプチドの安定性または組織移行性の制御、あるいはポリペプチドの活性の制御等を目的として行なうことが出来る。

　即ち、本発明ポリペプチドは翻訳後修飾などにより天然に修飾されていてもよい。また人工的に修飾されていてもよい。修飾には、ペプチドのバックボーン、アミノ酸側鎖、アミノ末端、またはカルボキシル末端などの修飾が含まれる。また、ポリペプチドは分岐していてもよく、環状でもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、［フラビン（ｆｌａｖｉｎ）、ヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、脂質、脂質誘導体、またはホスファチジルイノシトール］等の共有結合、クロスリンク形成、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、ピログルタミン酸化、カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、リン酸化、ユビキチン化などが含まれるが、これらに制限されない。更に、上記ペプチド又はポリペプチドは当業者に公知の任意の塩及びエステル体とすることも可能である。

　更に、本発明のポリペプチドは公知の任意の神経向性ペプチドとの融合ポリペプチドを形成することも出来、このような融合ポリペプチドは当業者に公知の任意の方法で容易に合成することができる。

　本発明のポリペプチドは、当業者に公知のＣＬＳＰ及びアディポネクチン等に関する遺伝子又はアミノ酸配列情報に基づき、ヒト及びマウス等の適当な種由来の細胞株等から調製することができ、更に、公知のペプチド合成技術により製造することが可能である。また、当業者に公知の遺伝子工学的手法を用いて、これらをコードするＤＮＡを含むベクター等を適当な宿主細胞等に導入して発現させることによって製造することも可能である。その際に、例えば、ＣＬＳＰ誘導体、又は、アディポネクチン誘導体の場合には、そのアミノ酸配列の一部を当業者に公知の方法・手段によって適宜改変することによって調製される。

　このようなベクターはプラスミド又はウイルス性ベクター等の当業者に公知の任意の形態であり、当業者に公知の任意の方法で容易に調製することが出来る。こうして得られたベクターには、本発明の部位特異的組換え酵素のコード領域以外に、５’および３’に非コード配列（核移行シグナル、タグ配列、非転写配列、非翻訳配列、プロモーター、エンハンサー、サプレッサー、転写因子結合配列、スプライシング配列、ポリＡ付加配列、ＩＲＥＳ、ｍＲＮＡ安定化・不安定化配列等を含む）が適宜含まれており、発現ベクターとして機能する。

　このようなベクターを用いた当業者に公知の任意の方法、例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、並びに、エレクトロポレーション及びパーティクルガン等の各種物理的方法によって、適当な宿主細胞を容易に形質転換させることが出来る。

　宿主細胞に特に制限はなく、例えば、ヒト、サル及びマウス等を含む哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び、大腸菌等の細菌類を用いることができる。こうして作製された形質転換細胞は当業者に公知の任意の条件で培養し、培養した菌体又はその培養上清等の適当な画分から目的とする本発明のポリペプチド等を容易に調製することが出来る。

　本発明ポリペプチドは、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制するための医薬組成物、例えば、アルツハイマー病に関連する記憶傷害又は神経変性を伴う疾病の予防または治療に用いられる医薬組成物、の有効成分として有用である。

　更に、本発明ポリペプチドを用いて、アルツハイマー病以外にも、記憶傷害又は神経変性を伴う疾病、例えば脳虚血による神経細胞の細胞死に起因する疾患を予防・治療することも可能である（Ｔ．Ｋｉｒｉｎｏ，１９８２，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，２３９：５７－６９）。その他、痴呆を伴うパーキンソン病（Ｍ．Ｈ．Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：２０４５－２０４７）、びまん性レービー小体（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ）病（Ｍ．Ｇ．Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６４６９－６４７３）、ダウン症に伴う痴呆なども、治療や予防の対象となる。また、ＡＰＰの類縁分子であるＡＰＬＰ１が、先天性ネフローゼ症候群の原因遺伝子といわれている（Ｌｅｎｋｋｅｒｉ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０２：１９２－１９６）ことから、ネフローゼ症候群などの腎疾患も治療や予防の対象となる。

　本発明の医薬組成物は、有効成分自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化することも可能である。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、徐放剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。本発明の医薬組成物は、水溶液、錠剤、カプセル、トローチ、バッカル錠、エリキシル、懸濁液、シロップ、点鼻液、または吸入液などの形態であり得る。有効成分であるペプチド又はポリペプチドの含有率は使用目的及び製剤形態等に応じて適宜決定すればよい。

　患者への投与は、有効成分の性質に応じて、例えば経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、脊髄腔内、脳室内、または経口的に行われうるがそれらに限定されない。脳神経変性疾患の治療に用いる場合においては、本発明の医薬組成物は、静脈内、脊髄腔内、脳室内または硬膜内注射を含む任意の適当な経路で中枢神経系に導入するのが望ましい。投与量、投与方法は、本発明の医薬組成物の有効成分の組織移行性、治療目的、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。例えば、１日1回～数回、１回の処置当り数十μl程度の薬剤を適当な期間に亘り投与することができる。有効成分は、例えば、１０ｐｍｏｌ～１００ｎｍｏｌ程度の範囲の濃度とすることができる。

　このように、本発明の医薬組成物は、アルツハイマー病等の神経細胞の細胞機能障害若しくは神経細胞死を伴う疾患、又は、記憶傷害若しくは神経変性を伴う疾病の予防または治療に広く用いることが出来る。

　従って、本発明は、本発明のポリペプチドを神経細胞に接触させる工程を含む、神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する方法、及び、本発明の医薬組成物を、アルツハイマー病等の神経細胞の細胞機能障害若しくは神経細胞死を伴う疾患、又は、記憶傷害若しくは神経変性を伴う疾病に罹患した又はその疑いのあるヒト等の動物である対象（個体）に投与する段階を含む、該疾患又は疾病を治療する方法神経変性障害を伴う疾患を治療する方法に係る。

　更に本発明は、本発明のポリペプチドによる神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性を検出する方法であって、（ａ）ＣＬＳＰの阻害剤の存在／非存在下、及び、該ポリペプチドの存在／非存在下に於いて、神経細胞の機能障害又は細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の細胞機能障害又は細胞死を検出する工程、及び（ｃ）該ポリペプチドの存在／非存在下に於ける神経細胞の機能障害又は神経細胞死を比較する工程等を含む方法に係る。

　上記の方法によって、本発明のポリペプチドによる神経細胞の機能障害又は細胞死を抑制する活性、及び、ＣＬＳＰの阻害剤からＣＬＳＰ又はＣＬＳＰ誘導体の有するＣＬＳＰ活性を増強又は保護する活性を検出することが出来る。

　具体的な操作は、例えば、本明細書に記載された方法に従って行うことができる。この方法は、本発明のポリペプチドが様々な細胞における細胞死に対して抑制効果を有するかどうかを決定したり、その抑制効果を定量するために用いられ得る。細胞としては特に制限はなく、細胞死を起し得るさまざまな細胞が用いられる。また、細胞死の誘導は、それぞれの細胞に応じて公知の細胞死誘導系を使用することができる。また、神経細胞を用いて、神経細胞死を誘導するさまざまな刺激、環境変化、または遺伝子発現などの諸条件に対する本発明のポリペプチド等の効果を検出するためにも用いられ得る。また、このような検出は、生物種や亜種、または個体間に存在し得る、神経細胞死における本発明のポリペプチド等に対する感受性の違いを検出するために用いられ得る。これにより、例えば民族、人種、または個人間で、本発明のポリペプチドの有効性を検討することができる。このような方法により、例えば臨床適用に向けた詳細な条件検討を行うことができる

　又、本発明は、本発明のポリペプチド又はＣＬＳＰによる神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性を調節する物質（被検物質）をスクリーニングする方法にも係る。この方法は、本発明のポリペプチド又はＣＬＳＰによる神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性に対する該被検物質による効果（影響）をアッセイするために用いられ得る。本発明のポリペプチド又はＣＬＳＰは、神経細胞表面に作用して細胞死抑制効果を発揮すると考えられる。この方法を用いれば、これらポリペプチドの細胞表面への接触を阻害し得る候補化合物や、逆に促進し得る候補化合物の作用を検証することができる。

　このスクリーニング方法は、（ａ）本発明のポリペプチド又はＣＬＳＰの存在下、被検物質の有無で神経細胞の機能障害又は神経細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の機能障害又は神経細胞死を検出する工程、および（ｃ）本発明のポリペプチド又はＣＬＳＰによる神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性を調節する物質を選択する工程、を含む。工程（ｃ）においては、任意の対照における場合と比較することができる。例えば、工程（ｃ）において、被検物質の非存在下において検出した場合に比べ、被検物質の存在下において神経細胞の機能障害又は神経細胞死を促進または抑制する化合物を選択することができる。神経細胞の機能障害又は神経細胞死を促進する化合物は、本発明のポリペプチド又はＣＬＳＰによる作用を阻害する化合物の候補となり、神経細胞死を更に抑制する化合物は、本発明のポリペプチド又はＣＬＳＰによる作用をさらに促進する化合物の候補となる。

　また、上記のスクリーニングにおいて、被検物質とは別の化合物における場合を対照とすることもできる。例えば、工程（ｂ）で本発明のポリペプチド又はＣＬＳＰによる神経細胞の機能障害又は神経細胞死の抑制を調節し得る別の化合物を用いて検出し、工程（ｃ）において、該化合物の存在下における場合に比べ、工程（ａ）で用いた被検物質存在下において神経細胞の機能障害又は神経細胞死をより促進または抑制する化合物を選択することもできる。このようなスクリーニングにおいては、本発明のポリペプチド又はＣＬＳＰによる神経細胞の機能障害又は神経細胞死の抑制の調節能に関して、既存の化合物よりもさらに高い効果を有する化合物をスクリーニングすることができる。

　上記のスクリーニングに用いる被検物質としては、例えば、精製タンパク質（抗体を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、合成低分子化合物のライブラリー、土壌などの天然材料、放線菌ブロースなどの細菌放出物質を含む溶液などが挙げられるが、これらに制限されない。神経細胞死の誘導や本発明のポリペプチドの投与は、当業者に公知の任意の方法に従って行うことができる。

　被検物質を細胞に適用する時期に特に制限はなく、本発明のポリペプチドを適用する前、後、または同時に適用することができる。被検試料の適用方法に制限はなく、培養細胞系であれば、例えば培地に添加される。また核酸であれば、細胞内に導入されてもよい。その他の任意の投与方法により被検試料を適用することができる。

　上記の化合物の作用の検査により評価された物質、あるいはスクリーニングにより得られた物質は、本発明のポリペプチドの活性を調節する化合物の候補となり、アルツハイマー病を含む疾患の予防や治療への応用が考えられる。

　更に本発明は、本発明のポリペプチドに結合する物質（化合物）のスクリーニング方法であって、（ａ）該ポリペプチドに被検物質を接触させる工程、（ｂ）該ポリペプチド等と被検物質との結合活性を検出する工程、（ｃ）該ポリペプチドに結合する活性を有する物質を選択する工程、を含む方法に係る。

　本発明のポリペプチドは、スクリーニングの手法に応じて、可溶性ポリペプチドとして、また担体に結合させた形態としてスクリーニングに用いることができる。本発明のポリペプチドは標識されていてもよい。標識としては、放射性同位元素による標識、蛍光物質による標識、ビオチンやジゴキシゲニンによる標識、タグ配列の付加などが挙げられる。

　スクリーニングに用いる被検物質としては、例えば、精製タンパク質（抗体を含む）、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成ペプチドのライブラリー、細胞抽出液、細胞培養上清、合成低分子化合物のライブラリー、土壌などの天然材料、放線菌ブロースなどの細菌放出物質を含む溶液などが挙げられるが、これらに制限されない。被検物質は、必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識などが挙げられるが、これらに制限されない。

　例えば、本発明のポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする場合は、本発明のポリペプチドを固定したアフィニティーカラムに本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現していることが予想される組織または細胞の細胞抽出物をのせ、カラムに特異的に結合するタンパク質を精製することにより、本発明のポリペプチドに結合するタンパク質のスクリーニングを実施することが可能である。

　さらに、本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現していることが予想される組織若しくは細胞（例えば脳皮質組織、またはＦ１１などの神経細胞）よりファージベクターを用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、アガロース上にプラークを形成させ、標識した本発明のポリペプチド等を用いてウエストウエスタンブロッティング法によりスクリーニングしたり、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域などのＤＮＡ結合ペプチドおよびＧＡＬ４転写活性化領域などの転写活性化ペプチドを、それぞれ本発明のポリペプチド等と被検タンパク質との融合タンパク質として発現させ、ＤＮＡ結合ペプチドの結合配列を有するプロモーターの下流に連結させたレポーター遺伝子の発現を通して本発明のポリペプチド等と被検タンパク質との結合を検出する「ｔｗｏハイブリッドシステム」等に従い実施することも可能である。

　本発明のスクリーニングにより、本発明のポリペプチドに対する受容体をクローニングすることも考えられる。この場合、被検試料は受容体を発現していることが予想される組織または細胞、例えば脳皮質組織、神経細胞株、または神経芽細胞腫や奇形腫細胞などから調製することが好ましい。神経細胞株としては、例えばＦ１１細胞、ＰＣ１２細胞（Ｌ．Ａ．ＧｒｅｅｎｅおよびＡ．Ｓ．Ｔｉｓｃｈｌｅｒ，１９７６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７３：２４２４－２４２８）、ＮＴＥＲＡ２細胞（Ｊ．ＳｋｏｗｒｏｎｓｋｉおよびＭ．Ｆ．Ｓｉｎｇｅｒ，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６０５０－６０５４）、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（Ｌ．Ｏｄｅｌｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，２２４：６９－８２）等が挙げられる。

　また、固定化した本発明のポリペプチドに、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーなどを作用させ、結合する分子をスクリーニングすることも考えられる。また、表面プラズモン共鳴現象を利用した結合の検出によるスクリーニングも可能である（例えばビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）など）。これらのスクリーニングは、コンビナトリアルケミストリー技術を用いたハイスループットスクリーニングにより行うことも可能である。

　本発明のスクリーニングにより得られた本発明のポリペプチドに結合する化合物は、本発明のポリペプチドの活性を調節する化合物の候補となり、アルツハイマー病を含む疾患の予防や治療への応用が考えられる。

　以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。

［複数のＣＬＳＰ相互作用因子の同定］
　１４－3－３σ、１４－３－３β、カルレティキュリン、ＥＲｐ２７、ヌクレオリン、アネキシンＩＩ、およびアネキシンＶなどの複数のタンパク質が、以前の研究において推定ＣＬＳＰ結合因子として同定された（15）。 それらの中で、細胞外空間に分泌されることが報告されているものを本発明における分析のために選択した。また、新たに、本発明において、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）とアディポネクチンがＣＬＳＰと結合することを見出した（図１）。

［アポリポタンパク質Ｅ、１４‐３‐３タンパク質、およびカルレティキュリンはＣＬＳＰの阻害物質である］
　以前に示されたように（5）、Ｖ６４２Ｉ－アミロイドβ前駆体タンパク質（Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ）の過剰発現は、ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞死を引き起こすが、細菌で産生された組換えＣＬＳＰ（５００ｐＭあるいは１ｎＭ）と同時インキュベーションすることによってＶ６４２Ｉ‐ＡＰＰ誘導性のニューロン死が完全に抑制された（図２ａ）。用量反応性分析によれば、細菌で産生されたＣＬＳＰの５０％有効濃度が約２００ｐＭであると推定され（図２ａ）、哺乳動物細胞で産生された組換えＣＬＳＰのそれよりわずかに大きいことが示された（5）。興味深いことに、組み換えアポリポタンパク質Ｅ３またはＥ４（ＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４）の培地への添加は、用量応答的にＶ６４２Ｉ‐ＡＰＰ誘導性のニューロン死のＣＬＳＰ媒介保護を阻害した（図２ｂおよびｃ）。ＡｐｏＥ３は５ｎＭの濃度で１ｎＭのＣＬＳＰの効果を完全に阻害し（図２ｂ）、一方、ＡｐｏＥ４は１ｎＭの濃度で１ｎＭのＣＬＳＰの効果を完全に阻害した（図２ｃ）。この結果は、ＡｐｏＥ４の阻害効果がＡｐｏＥ３よりもわずかに強いことを示している。同様に、組換え１４‐３‐３σとの同時インキュベーションにより、Ｖ６４２Ｉ‐ＡＰＰ誘導性のニューロン死のＣＬＳＰ媒介保護が阻害された（図３ａ）。１０ｎＭのＣＬＳＰに対する１４－３－３σによる阻害効果が１０ｎＭの濃度で観察され始め、そしてこの特定の実験において２０ｎＭの組換え１４－３－３σを添加したときに完全な阻害が得られた。他の１４－３－３タンパク質もまた、Ｖ６４２Ｉ－ＡＰＰ誘導性の神経細胞死のＣＬＳＰ媒介阻害を阻害したが、５０ｎＭの組換え１４－３－３σのときに完全な阻害が得られた（図３ｂ～ｅ）。同様に、カルレティキュリンは、５０ｎＭの濃度で１０ｎＭ　ＣＬＳＰの効果を完全に阻害した（図３ｆ）。したがって、これらの結果は、ＣＬＳＰ阻害剤が培地中のＣＬＳＰ濃度と同等または５倍以上の濃度で完全なＣＬＳＰ阻害効果を示すことを実証している。対照的に、アネキシンＩＩ、アネキシンＩＶ、またはアディポネクチンは、培地中のＣＬＳＰ濃度の５倍または１０倍高い濃度でさえ阻害活性を示さなかった（図３ｆおよび図Ｓ－１）。

［アディポネクチンは非常に高濃度のＣＬＳＰ阻害物質の存在下においてもＣＬＳＰ活性を維持させる］
　ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＣＬＳＰの濃度は３～６ｎＭと推定される（14）。ＡｐｏＥは星状膠細胞およびミクログリアから産生され、ヒトＣＮＳにおいて、かなりの割合のＡｐｏＥが脂質および他のアポリポタンパク質と同時に高密度リポタンパク質様リポタンパク質形成に動員されることが知られている（16、17）。ヒトＣＳＦ中のＡｐｏＥの濃度は４０～２００ｎＭ（18‐20）と推定されている。一方、ヒトＣＳＦ中の１４‐３‐３σの濃度は１ｎＭよりはるかに低いと推定した（図Ｓ２参照）。また、以前の研究により、ヒトＣＳＦ中の１４－３－３γの濃度は１ｎＭより低いと推定されている（21）。さらに、ヒト血清中のカルレティキュリンの濃度はほぼ１０ｐＭ前後と推定された（22）が、ヒトＣＳＦ中の濃度は現在まで測定されていない。これら知見を総合すると、全体量としてのＡｐｏＥの濃度はＣＬＳＰ機能を完全に阻害するに必要な濃度を１０倍以上上回っている。一方、他の阻害物質の濃度は、ヒトＣＮＳ中のＣＬＳＰを阻害するのには不十分である可能性が高い。

　上記のように、ヒトＣＮＳ中には、非常に大量のＣＬＳＰ阻害物質（主としてＡｐｏＥからなる）が存在するためＣＬＳＰ活性はインビボではゼロであるように見える。しかし、以前の検討（35）によると、少なくとも正常人ではＣＬＳＰ活性が存在すると考えた方が自然である。そこで、次に、他のＣＬＳＰ結合物質のいずれかがＣＬＳＰ阻害物質からＣＬＳＰを保護して活性を保つという仮説を検討した。このために、候補であるアネキシンＩＩ、アネキシンＶ、またはアディポネクチンの組換えタンパク質を、ＣＬＳＰ（１ｎＭ）およびＡｐｏＥ３（１０ｎＭ）を含む細胞死アッセイ系に、ＡｐｏＥ３の濃度に等しい濃度で添加した。その結果、アディポネクチンは、ＡｐｏＥ３を介したＣＬＳＰ活性の阻害を完全に無効にした（ＣＬＳＰ保護活性）（図４ａ）。一方、試験した濃度では、アネキシンＩＩもアネキシンＶもそのような中和活性を示さなかった（図４ｂおよびｃ）。アディポネクチンの最小無効化濃度を決定するために、次にアディポネクチンの濃度を段階的に減少させた。その結果、アディポネクチンはＡｐｏＥ４のＣＬＳＰ阻害活性を以下の濃度比で完全に抑制した（ＣＬＳＰ、１ｎＭ； ＡｐｏＥ４、１０ｎＭ：アディポネクチン、１ｎＭ）（図５ａ）。さらに、更に濃度を下げて１００ｐＭの濃度でも、アディポネクチンは、ＡｐｏＥ４のＣＬＳＰ抑制活性を部分的に抑制した（ＣＬＳＰ、１ｎＭ：ＡｐｏＥ４、１０ｎＭ：アディポネクチン、１００ｐＭ）。一方、逆にＡｐｏＥ４の濃度を５０ｎＭまで増加させても、１ｎＭのアディポネクチンによる保護効果は全く減弱されなかった（図５ｂ）。これらの結果は、１ｎＭのアディポネクチンが、圧倒的な高濃度のＡｐｏＥ４の存在下でさえも活性型ＣＬＳＰの濃度を１００％有効レベルに維持することを示している。野生型アディポネクチンは生体内で自発的に多量体化し、３種類の多量体型を形成する。そして、３量体は低分子量、６量体は中分子量、そして８量体あるいはそれ以上などは高分子量アディポネクチンと呼ばれる（23）。以前の研究により、中あるいは高分子量アディポネクチンが通常アディポネクチン受容体を介した代謝調節活性において中心的な役割を担っていることが知られている（23）。本研究では、中分子量または高分子量のアディポネクチンを形成しない組み換え三量体アディポネクチンを使用して、三量体アディポネクチンが野生型アディポネクチンと同様のＣＬＳＰ増強効果を有することを見出した（図Ｓ３）。この結果は、アディポネクチンの中分子量または高分子量多量体化がアディポネクチンのＣＬＳＰ保護効果に必須ではないことを意味している。以前の研究により、アディポネクチンの通常受容体を介する代謝調節機能に関して、中分子量または高分子量多量体化されたアディポネクチンがより高い活性を示すことが知られている（23）。総合すると、ここで発見されたアディポネクチンのＣＬＳＰ保護活性は通常アディポネクチン受容体を介する効果ではない可能性を強く支持している。さらに、ＡｐｏＥ以外のＣＬＳＰ阻害物質に関しても同様な検討を行い、１４－３－３σまたはカルレティキュリンによるＣＬＳＰ阻害効果に対してもアディポネクチンは完全に保護活性を示すことを見出した（ＣＬＳＰ、１ｎＭ：１４－３－３σまたはカルレティキュリン、２ｎＭまたは１０ｎＭ：アディポネクチン、１ｎＭ）（図６）。

［アディポネクチンはＣＬＳＰ活性を増強する］
　さらに、アディポネクチンは，上記のＣＬＳＰ保護効果に加えて、ＣＬＳＰ活性そのものを増強する効果も有していることも見いだした。図２ａに示されるように、ＣＬＳＰは、５０ｐＭの濃度ではＶ６４２Ｉ‐ＡＰＰ誘導細胞死に対して抑制活性を示さなかった。 しかしながら、２００ｐＭのアディポネクチンの存在下では、５０ｐＭまたは２５ｐＭの濃度でＣＬＳＰはそれぞれほぼ完全なまたは部分的な細胞死抑制活性を示した（図７ａ）。この結果は、アディポネクチンがＣＬＳＰに結合することによってＣＬＳＰ活性を増強することを示している。本発明者らはさらに、同時投与されたアディポネクチンの濃度が１００ｐＭに減少された場合でも、アディポネクチンが５０ｐＭの濃度のＣＬＳＰに対して部分的増強活性を示すことを見出した（図７ｂ）。これらの結果をまとめると、単独では活性のない５０ｐＭのＣＬＳＰに完全な細胞死抑制活性を与えるための最小アディポネクチン濃度が２００～２５０ｐＭであることを示している。

［アディポネクチンとＣＬＳＰの結合の解離定数はアポリポタンパク質Ｅ４とＣＬＳＰの結合の解離定数と近似している］　
　以上示したように、アディポネクチンが５０倍濃度の高いＡｐｏＥのＣＬＳＰ活性阻害効果を完全に無効にする（保護効果）ことが示された（図４および図５）。このようなアディポネクチンに付与された強力なＣＬＳＰ保護効果は以下に示されるような二つのメカニズムにより説明可能である。第一に、アディポネクチンとＡｐｏＥはＣＬＳＰの同じ場所に競合的に結合し、かつ、アディポネクチンとＣＬＳＰとの間の結合親和性がアポリポタンパク質ＥとＣＬＳＰとの間のそれよりはるかに強力である（競合的拮抗薬）場合である。第二に、アディポネクチンは、ＡｐｏＥ結合領域とは異なるＣＬＳＰの領域に結合することにより、単独結合ではＣＬＳＰ活性を上昇させ、ＣＬＳＰ阻害物質の結合が同時にある場合、その阻害効果を抑制してＣＬＳＰ活性を保つ（非競合的拮抗薬）場合である。

　これら２つのメカニズムのいずれが正しいかを検討した。まず、ＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４の存在が、ＣＬＳＰとアディポネクチンまたはアネキシンＩＩにいかなる影響を及ぼすか、或いはその逆はどうかを見るために、ＣＬＳＰを共有結合させたセファロース４Ｂビーズ（ＣＬＳＰビーズ）に、当該タンパク質を混和させ、プルダウンアッセイ（共沈実験）を行い、ＣＬＳＰとの結合を検討した（図８ａ）。条件として、混合物中のＣＬＳＰ、アディポネクチン、アネキシンＩＩ、ＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４の濃度は全て１ｎＭとなるように設定した。まず、他のタンパク質が存在しない場合、一定量のアディポネクチン、アネキシンＩＩ、ＡｐｏＥ３、またはＡｐｏＥ４がＣＬＳＰビーズと共沈した（レーン２～４および７）。次に、アディポネクチンとともに共沈させると、わずかに減少するもののなおかなりの量のＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４がＣＬＳＰビーズと共沈した（レーン５および８）。同様に、ＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４とともに共沈させると、わずかに減少するものの依然としてかなりの量のアディポネクチンが共沈した（レーン５および８）。重要なことは、共沈ＡｐｏＥの量は共沈アディポネクチンの量と等しいかまたはそれよりわずかに多かったことである（図１０ａ）。一方、アネキシンＩＩを加えても、ＣＬＳＰと共沈するＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４の沈殿量を減少させなかった（レーン６および９）。逆に、ＡｐｏＥ３またはＡｐｏＥ４の存在下では、ほとんど量のアネキシンＩＩがＣＬＳＰビーズと共沈しなかった（レーン６および９）。これらの結果は、アディポネクチンがＣＬＳＰへの結合に関してＡｐｏＥと競合することによってＡｐｏＥの阻害作用を抑制しているのではないことを示している（第一の可能性の否定）。

　次に、ＣＬＳＰとアディポネクチンの間、ならびにＣＬＳＰとＡｐｏＥ４の間の結合に関する解離定数（Ｋｄ）を測定した（図８ｂおよびｃ）。この目的のために、アディポネクチンまたはＡｐｏＥ４タンパク質を９６ウェルプレートにコンジュゲートした。 化学発光産生タグであるＨｉＢｉＴでＣ末端タグ付けされた様々な濃度の組換えＣＬＳＰを、同時インキュベーションのためにプレートに添加した。洗浄後、ウェル上のアディポネクチンまたはＡｐｏＥ４に結合しているＣＬＳＰ―ＨｉＢｉＴの量を測定した。スキャッチャード分析により、アディポネクチンとＣＬＳＰとの間、またはＡｐｏＥ４とＣＬＳＰとの間の解離定数はそれぞれ８．８または７．８ｐＭと測定された（図８ｃ）。両者が近似しているというこの結果は上記の第１の可能性を完全に否定した。

［アディポネクチンとアポリポ蛋白質Ｅ４はＣＬＳＰの異なるサブドメインに結合する］
　２番目の可能性を探るために、ＡｐｏＥ４‐ＭｙｃＨｉｓおよびアディポネクチン‐ＭｙｃＨｉｓを作成し、以前に構築された組み換え野生型ＣＬＳＰまたはＣＬＳＰ欠失変異体（5、図９ａ）と混合させて、プルダウンアッセイを行った（図９）。その結果、ＡｐｏＥ４に対して、ＥＨＲのみからなる変異体が共沈（結合）しない一方、他の４つのＣＬＳＰ変異体は結合した。一方、アディポネクチンに対して、ΔＮ２のみが結合する一方、他の４つの変異体は結結合しなかった（図９ｂおよびｃ）。これらの結果は、ＣＬＳＰにおけるＡｐｏＥ４結合部位はＥＨＲの外側にあり、アディポネクチン結合部位はＥＨＲを含むことを意味している。それ故、アディポネクチンはＥＨＲに結合することによりＣＬＳＰ活性を増強および保護すること、そして一旦ＥＨＲにアディポネクチンが結合すると、非ＥＨＲ領域を介して起こるＣＬＳＰ阻害物質の阻害効果がキャンセルされることが明らかになった。

　さらに同様のプルダウン実験を行うことにより、アディポネクチンががアミノ酸１－６１からなるＣＬＳＰのＮ末端領域に結合するのに対して、ＡｐｏＥ４はそれに結合しないことを見出した（図Ｓ４ａおよびｂ）。図9の結果と合わせるとこの結果は、ＡｐｏＥがＣＬＳＰのＣ末端領域（アミノ酸６２～１４６）に結合することを意味している。また、別の類似実験により、本発明者らはまた、ＣＬＳＰがアディポネクチンの中央部分に位置するアディポネクチンのいわゆる「コラーゲン相同領域（ＡＤＮＣｏｌ）」に結合することを見出した（図Ｓ４ｃ）。

［ＣＳＦ中のアディポネクチン濃度はＡＤ患者において著しく低下している］
　ヒトＣＮＳ中のアディポネクチン濃度を推定するために、アディポネクチンＥＬＩＳＡアッセイキットを用いて、剖検ＡＤ患者および非ＡＤ症例から得たＣＳＦ中のアディポネクチンのレベルを測定した（表１、表Ｓ１、および図１０）。その結果、ＣＳＦアディポネクチンのレベルが、ＡＤ患者では非ＡＤ症例よりも低いことを見出した（図１０ｂ、表１）。ＡＤ患者におけるＣＳＦアディポネクチンの平均±ＳＥＭ濃度は０．３１±０．１３ｎＭであったが、非ＡＤ症例におけるそれは０．９６±０．１９ｎＭであった（対応のないＴ検定、ｐ＝０．００６５）。この結果は、以前の研究（30）の結果と基本的に一致しており、ＡＤ患者のＣＳＦにおいてアディポネクチンレベルが著しく低下していることを示唆している。いくつかの非ＡＤ症例のアディポネクチン濃度は、非ＡＤ症例の平均よりも著しく低く、ＡＤ患者の平均レベルとほぼ等しい。

　しかしながら、ＡＤ患者の平均年齢（７８．５±０．９歳）は、非ＡＤ症例のそれ（８６．３±１．４歳以上）よりも有意に小さかった（対応のないＴ検定;「より大きい」を「等しい」と見做した場合ｐ＜０．０００１）（表Ｓ１を参照）。したがって、ＡＤの存在よりもむしろ年齢がＣＳＦアディポネクチンの濃度に影響を与えた可能性がある。この可能性を検討するために、表１の全症例から８１～８８歳の年齢の症例を選択し（ＡＤについてｎ＝６、平均年齢±ＳＥＭ＝８３．０±０．６歳；非ＡＤについてｎ＝５、平均年齢±ＳＥＭ ＝ ８５．２±１．２歳；年齢に対する対応のないＴ検定；ｐ＝０．１１）（表２）、それらのＣＳＦアディポネクチンレベルを比較した。その結果、アディポネクチンレベルがこの年齢集団においてもＡＤ患者のＣＳＦにおいて著しく下方調節されていることを見出した（ＡＤ、０．３０±０．０７ｎＭ；非ＡＤ、１．４１±０．１６ｎＭ；対応のないＴ検定、ｐ ＜０．０００１）（図１０ｃ、表２）。さらに、ＣＳＦアディポネクチンレベルが年齢と相関しているかどうかを、全被験者からのデータを用いて調べた。予想通り、年齢とＣＳＦアディポネクチン濃度との間に有意な相関はなかった（相関係数＝０．００５５）（図Ｓ５）。

［ヒューマニン／ＣＬＳＰ誘導性細胞内シグナル伝達経路の中心的エフェクターであるＳＨ３ＢＰ５はＡＤ患者のニューロンにおいて低下する］
　図１２の結果に基づいて、活性型ＣＬＳＰの量に相当するＣＬＳＰ ／アディポネクチン複合体の量は、ＡＤ患者の脳において、非ＡＤ症例のものよりも少ないことが示された。この実験事実の確認（裏）をとるために、ニューロン内ＳＨ３ＢＰ５のレベルを測定することにより、ニューロン内のＣＬＳＰ誘導性シグナル伝達の強度を定量化することを試みた。そのための方法として、ＳＨ３ＢＰ５を測定する根拠は、以前の研究により、ＳＨ３ＢＰ５はｈｔＨＮＲを介したヒューマニン／ＣＬＳＰ誘導性細胞内シグナル伝達の中心的なエフェクターであり、ヒューマニン／ＣＬＳＰがｈｔＨＮＲに結合すると発現レベルが上昇することが実証されている（24）からである。実際、同研究（24）において、ＣＬＳＰ／ヒューマニンがｈｔＨＮＲに結合すると、ＳＴＡＴ３を介してＳＨ３ＢＰ５の転写が活性化される。その結果、ＳＨ３ＢＰ５発現レベルが上昇し、高レベルとなったＳＨ３ＢＰ５は、ＪＮＫと直接複合体を形成してＪＮＫを阻害することによって、Ｖ６４２Ｉ－ＡＰＰ誘導性の死シグナルを阻害することが示されている。この目的で、まず、ＳＨ３ＢＰ５抗体を使用して、剖検ＡＤ患者および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者から得た脳の側頭葉または後頭葉（非運動ニューロン領域）を免疫組織化学的に染色した（表３および表Ｓ２）。ＡＬＳ患者の脳を陰性対照として使用したのは、ＡＬＳにおいては側頭葉の運動野における運動ニューロンにおいてのみ神経変性が起こり、側頭葉または後頭葉のニューロンには異常がないからである。この実験の結果として、ＡＬＳと比較してＡＤの皮質のニューロンにおいてＳＨ３ＢＰ５のレベルが低下していることを見出した（対応のないＴ検定、ｐ＝０．０２５６）（図１１ａ、ｂおよびｃ、表３）。ＡＤ患者の平均年齢がＡＬＳ患者の平均年齢より高いことを考慮して（７８歳対６９歳）、我々はまた、ＡＤの存在よりも年齢がＳＨ３ＢＰ５レベルの決定要因であるかどうかを検討したが、その結果、ＳＨ３ＢＰ５のレベルが高齢者（７１歳以上）の方が若年者（７１歳未満）よりも有意に低いわけではないことを見出した（対応のないＴ検定、ｐ＝０．６３３）（図Ｓ６）。

　また、ＳＨ３ＢＰ５　ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、剖検ＡＤ患者および非ＡＤ症例の側頭葉に由来する組織溶解物中のＳＨ３ＢＰ５レベルを測定した（表４および表Ｓ３）。その結果、ＡＤ患者の側頭葉におけるＳＨ３ＢＰ５レベルが非ＡＤ症例よりも有意に低下していることを見出した（対応のないT検定、ｐ＝０．００８４）（図１１ｄおよびｅ、表４）。

　さらなる展開として、ＣＬＳＰ誘導体であるＣＬＳＰ１－６１がＡｐｏＥ４と結合しないことを見出した（図Ｓ４ａおよびｂ）。しかも、ＥＨＲを含むためＣＬＳＰ活性を保持している可能性が高い。細胞死アッセイを用いて、その細胞死抑制活性を検討としたところ、最小細胞死抑制濃度は0.5nMであり（図Ｌ１）、野生型ＣＬＳＰとほぼ同じであった（図２）。さらに、ＣＬＳＰ１－６１の活性を３種類のＣＬＳＰ阻害物質が抑制できるか否か検討したところ、予想通り１０倍量のそれぞれの阻害物質（ＡｐｏＥ４、１４‐３‐３σ、カルレティキュリン）を入れてもＣＬＳＰ１－６１の活性を阻害できなかった（図Ｌ２）。従って、ＣＬＳＰ１－６１は阻害物質から阻害を受けず、しかも活性を維持したＣＬＳＰ誘導体であることが判明した。

　また、ＣＬＳＰはアディポネクチンのコラーゲン領域（ＡＤＮＣｏｌ）に結合することを見出した（図Ｓ４ｃ）。そこで、アディポネクチンのＣＬＳＰ活性増強効果はＡＤＮＣｏｌのみで十分かどうかを検討した。その結果、1 nMのＡＤＮＣｏｌは1 nMの野生型アディポネクチンと同じく、50 pMのＣＬＳＰの活性を増強させ、細胞死を完全に抑制させた（図Ｌ３）。さらに、 同じアッセイを駆使して ＡＤＮＣｏｌの量を増減させて検討を行い、50pMのＣＬＳＰに完全な細胞死抑制活性を付与する最小ＡＤＮＣｏｌ濃度を求めた。その結果、ＣＬＳＰ増強活性は野生型アディポネクチンのそれよりやや弱く、０.５nMの濃度あることが判明した（図Ｌ４）。従って、ＡＤＮＣｏｌは野生型アディポネクチンより活性は若干弱いが、ほぼ同じ働きを持つタンパク質であることが明らかとなった。

［ＣＬＳＰ１－６１とアディポネクチンのコラーゲン相同領域からなる融合ポリペプチドは強力なＡＤ保護活性を有する］
　次に、ＣＬＳＰ１－６１とアディポネクチンのコラーゲン相同領域、および野生型ＣＬＳＰとアディポネクチンのコラーゲン相同領域からなる、２つのハイブリッドポリペプチド（夫々、「ＣＬＳＰＣＯＬ」と「ｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬ」という）を調製し、それらがＣＬＳＰとアディポネクチンの両方の活性を保持するかどうかを調べた。該ハイブリッドポリペプチドの両方の領域は、ＭｙｃタグおよびＨｉｓＧタグ（６ｘヒスチジンおよびグリシンからなる）をコードするペプチドによって連結されている。ＣＬＳＰＣＯＬおよびｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬは、ＣＬＳＰ１－６１および野生型ＣＬＳＰ（図Ｌ１）と比較して、より強力なＣＬＳＰ活性を有する（神経細胞死を完全に抑制する両方のペプチドの最小濃度は約１００ｐＭである：図Ｌ５）。この結果は、ＣＬＳＰ１－６１および野生型ＣＬＳＰの機能がアディポネクチンのコラーゲン相同領域のＣ末端結合によって破壊されず、逆に、アディポネクチンのコラーゲン相同領域がＣＬＳＰ１－６１及び野生型ＣＬＳＰの機能を増強したことを示している。したがって、アディポネクチンのコラーゲン相同領域の機能はＣＬＳＰ１－６１のＮ末端結合によって破壊されないと考えられる。

［ＣＬＳＰＣＯＬは血液脳関門を効率的に通過する］
　マウスでは５ｎｍｏｌのＣＬＳＰの腹腔内注射後１時間で、脳脊髄液および血清中のＣＬＳＰの濃度は約５ｎＭおよび５００ｎＭであった（5）。一方、ヒト脳脊髄液中のアディポネクチン濃度は、ヒト血清中のアディポネクチン濃度の１/１０００である（30）。そこで、ＣＬＳＰＣＯＬとｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬがマウスの野生型ＣＬＳＰと同等の速度で血液脳関門を通過するかどうかを調べた。血清および間質液（ＩＳＦ）含有脳溶解物中のＣＬＳＰＣＯＬの濃度は、１０ｎｍｏｌのＣＬＳＰＣＯＬの腹腔内注射後１時間で約３０５ｎＭおよび７２ｎＭであった（図Ｌ６および表１）。一方、注射後１時間の血清および間質液含有脳溶解物中のｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬの推定濃度は、約５３ｎＭおよび２．１ｎＭであった。ＩＳＦ含有脳溶解物中のｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬの濃度は用いたＥＬＩＳＡアッセイの最低検出限界（４．５ｎＭ）未満であったので、暫定濃度２．１ｎＭは正確ではないかもしれないが、その濃度は４．５ｎＭ未満であることは確実である。脳溶解物中のＣＬＳＰＣＯＬの濃度は血清中の濃度の約１／４～１／５であると推定され、一方、ｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬの濃度は血清中のそれらの１／１０未満であると推定される。したがって、ＣＬＳＰＣＯＬの中枢神経系移行はｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬのそれよりも効率的である。また、公表された結果における血清から脳脊髄液へのＣＬＳＰの移行効率を考慮すると（5）、血液脳関門を通過するＣＬＳＰＣＯＬの移行はｗｔ－ＣＬＳＰよりはるかに効率的であると考えられる。

［ＣＬＳＰＣＯＬはＡｐｏＥ３と１４‐３‐３σにより阻害されないがカルレティキュリンにより軽度に阻害される］
ＣＬＳＰＣＯＬが3種類の阻害剤により阻害されるか否か検討したところ、１０倍濃度の高いＡｐｏＥ３と１４‐３‐３σには阻害されなかったが、予想外にも１０倍濃度の高いカルレティキュリンにより軽度に阻害される事が判明した（図Ｘ１）。一方、ｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬはすべての阻害剤により阻害されなかった（図Ｘ２）。添加するカルレティキュリンの濃度を変えて細かく検討したところ、１００ｐＭのＣＬＳＰＣＯＬに対して、カルレティキュリンは１ｎＭの濃度から阻害活性を示し始めることが判明した（図Ｘ２）。

［考察］
　ＡＤを含む神経変性疾患において、増加した神経毒性物質或いは神経障害機序により神経変性が引き起こされるという考え方が一般的に広く受け入れられている。ＡＤにおいては、２０年以上にわたり、Ａβ（老人斑中の凝集した原線維型のＡβおよび/または可溶性Ａβオリゴマー）レベルの上昇が主要な傷害の原因と見なされてきた（2）。加えて、過リン酸化タウ、ならびにＡβレベル上昇と直接関係のない、アミロイドβ前駆体タンパク質およびプレセニリンに関連する神経障害機序が毒性として関与する可能性も示されてきた。また、先行研究や本研究により、周知のこれらの神経障害メカニズムに加えて、ＡＤ保護因子の低下・減弱がＡＤの進展に寄与する可能性が提示された。中でも、ＣＬＳＰは該ＡＤ保護 (防御)因子として中心的な役割を果たす可能性が高いと推定されている（6）。

　ヒューマニンおよびＣＬＳＰは、インビトロでＡＤに関連する神経細胞死を阻害する（5、6）。また、ＣＬＳＰは、ＡＤモデルマウスにおいて、Ａβの調節とは無関係に、シナプス消失および記憶障害を抑制する（8）。後者の結果は、一連の先行研究（25‐27）によっても支持されている。すなわち、ｈｔＨＮＲの別のアゴニストである、ヒューマニンの強力な誘導体がＡＤモデルマウスにおける記憶障害を抑制したという研究である。これらの結果に基づいて、本発明者は２つの事象、即ち、ＡＤ関連神経毒性の増加およびＡＤ保護活性の減少の二つがＡＤの発症に必要であるという、ＡＤの病因についての仮説を提案してきた。この仮説が正しいと考えると、十分な濃度の活性ＣＬＳＰの存在下では、たとえＡＤ関連神経毒性が十分に増強されていても、神経細胞死（および機能不全）を引き起こすことができないため、ＡＤは発症しない。また、十分なＡＤ関連神経毒性がない場合には、ＣＬＳＰ効果が低下していても神経細胞死（および機能不全）を引き起こすことはない（すなわちＡＤは発症しない）。本検討で示されたデータの中で、殆ど全てのＡＤ症例に加えて何例かの「非ＡＤ」対照のＣＮＳにおけるアディポネクチンおよびＳＨ３ＢＰ５レベルが低下している（図１０および１１）という実験結果は、これらの考え方が極めて妥当であることを支持する。

　ＣＬＳＰは、ヘテロ三量体ヒューマニン受容体に結合し、ＳＴＡＴ３誘導性生存シグナル伝達経路を活性化する中心的なＡＤ保護因子であると考えられ（5、6、および8）、その異常な調節はＡＤの病因に寄与する可能性が高い。本発明で確認された複数のＣＬＳＰ阻害物質のうち、濃度と活性を考慮するとＡｐｏＥが中心的な阻害物質であると思われる（図２）。ヒトＣＮＳにおけて、総ＡｐｏＥの濃度は、ＣＬＳＰの濃度よりも圧倒的に高い（18‐20）と推定されている（14）。したがって、ＣＬＳＰと非常に大量のＣＬＳＰ阻害剤のみからなるインビボＣＬＳＰ活性調節モデルが正しければ、ＡＤ保護活性はインビボでほぼゼロになる可能性が高い。

　しかしながら、本発明によって示されたように、アディポネクチンがＣＬＳＰの内因性ヒューマニン相同領域（ＥＨＲ）に結合することによってＣＬＳＰ活性を増強し、そしてＣＬＳＰをＣＬＳＰ阻害剤から優位な形式で保護する（図５～７）のであれば、いかに高濃度の阻害物質が存在していてもインビボでのＣＬＳＰ活性が担保される。０．２‐０．２５ｎＭのアディポネクチンは、はるかに高濃度のＣＬＳＰ阻害剤の存在下においてもＣＬＳＰ（１ｎＭ）活性を完全に維持することが可能である（図５および７）。非ＡＤの場合、ＣＳＦ中のアディポネクチン濃度は０．９６±０．１９ｎＭであり（図１０および表１）、その結果ＣＬＳＰ活性が維持されている可能性が高い。

　アディポネクチンは、末梢組織においてグルコースおよび脂質代謝を含む様々な代謝機能を発揮する（28）。それは、おそらく細胞膜上の２つの通常のアディポネクチン受容体を介して、インスリンシグナル伝達、抗炎症性、抗酸化性、および抗アテローム発生性機能を増加させる。血液脳関門を通過するアディポネクチンの移動は非常に限られていると思われる。ＣＳＦ中のアディポネクチンの濃度は血清中の濃度よりもほぼ１０^３倍低い（29、30）。ＣＮＳに通常のアディポネクチン受容体が存在することを考えると、アディポネクチンは、ＣＮＳにおいてグルコース代謝の調節因子、神経新生促進剤として機能し、そして例えば虚血性脳損傷に対する保護因子として機能すると仮定されている（31）。多くの研究が、アディポネクチンの欠乏またはアディポネクチンシグナル伝達の異常な調節がＡＤの発症と関連しているという証拠を提供してきた（31）。血清アディポネクチンレベルの上昇（29、30）は、ＡＤの独立した危険因子である可能性がある（32）。一方で、ある研究では、ＡＤ様病状が低血清アディポネクチン濃度を有するＩＩ型糖尿病患者において有意に多く発症したことを示した（33）。アディポネクチンレベルは、ＡＤ患者のＣＳＦにおいて下方制御されており、Ａβレベルの増加と逆相関している（30）。アディポネクチンノックアウトマウスはＡＤ様の病状を示す（34）。

　本発明に於いて、アディポネクチン濃度がＡＤ患者のＣＳＦにおいて低下していることを示した（図１０）。この結果は前回の報告と一致している（30）。 ＣＳＦ中のタンパク質の濃度が脳の間質液中の濃度と相関関係にあること（36）を考慮すると、これらの結果は、ＡＤ脳の間質液中でアディポネクチン濃度が低下していて、ＣＬＳＰ活性を維持できない可能性を示唆する。実際のデータとして、ＡＤ患者におけるＣＳＦアディポネクチンの平均±ＳＥＭ濃度は０．３１±０．１３ｎＭであったが、非ＡＤ症例におけるそれは０．９６±０．１９ｎＭであった（対応のないＴ検定、ｐ＝０．００６５）（図１０および表１）。図５および７に示されるように、ＣＬＳＰ活性を完全に保つために必要とされる神経周囲局所のアディポネクチンの最低濃度は０．２０～０．２５ｎＭであると推定され、これは低下したＡＤ患者の平均ＣＳＦアディポネクチン濃度に近い。非ＡＤの神経周囲局所では十分量のアディポネクチン量が存在するが、ＡＤでは同部位のアディポネクチン量が十分ではない可能性を示唆している。この考え方を支持するさらなるデータとして、ニューロン内においてヒューマニン／ＣＬＳＰシグナルの主要なメディエーターであるＳＨ３ＢＰ５レベルがＡＤ皮質において低下している（図１１）ことを発見した。類似のデータとして、先行研究により既に、ヒューマニン／ＣＬＳＰシグナルによって活性化されたＳＴＡＴ３の活性型である、リン酸化された７０５番目のチロシンを有するＳＴＡＴ３のレベルが、ＡＤ患者の海馬ニューロンにおいて低下していることが示されている（35）。なお、ヒューマニンおよびＣＬＳＰはｈｔＨＮＲに結合し、そしてＳＴＡＴ３（6）およびＳＨ３ＢＰ５（24）によって媒介されるニューロン内シグナル伝達を活性化することによって、ＡＤ保護因子として機能することが示されている。

　先行研究においても、アディポネクチンは、ＡＤ患者の血清中で上昇している一方（29、30）、ＡＤ脳内で低下しているデータが示されている（図１０、ならびに表１および表２）（30）。この所見の解釈の一つは、アディポネクチンレベルは中枢神経系に起こる一つあるいはいくつかのＡＤ関連異常によって低下し、そしてその欠乏を回復させるために脂肪組織におけるアディポネクチンの産生は二次的に上昇し、その結果として血清中で上昇するという考え方である。実際、以前の研究では、アディポネクチンが高リン酸化タウを含む神経内神経原線維の凝集体中に固定化されているため、ＡＤ患者の中枢神経系においてアディポネクチンが低下するという可能性が示唆されていた（30）。この考えが正しければ、Ａβの上昇およびその下流の標的である過リン酸化タウの蓄積が、ＡＤにおけるアディポネクチンレベル低下の主原因ということになる。一方では、中枢神経系におけるアディポネクチンレベル低下はＡＤにおいてアディポネクチンの血液脳関門輸送が損なわれることに起因するという考え方もある。現在まで、ＡＤの脳では血液脳関門の機能が損なわれていることを示す数多くの証拠が提示されている（37）が、アディポネクチンの血液脳関門輸送に関するデータはまだ存在しないため、いずれの考え方が正しいかは現時点で不明である。

　ＡｐｏＥ4は主要なＡＤの発症危険因子である。これまで、多くの研究により、ＡｐｏＥ４によるＡＤ発症増加のメカニズムは広く研究されてきた。ＡｐｏＥ４は、Ａβ依存性および非依存性の両方の様式において、複数の機能獲得および機能喪失メカニズムによって神経毒性を発揮するとされている（38）。中でも、Ａβの産生、Ａβの中枢神経からのクリアランス、およびＡβの凝集形成がＡｐｏＥ受容体を介する細胞内情報により影響を受けていて、ＡｐｏＥ４保持者ではこれらの現象がＡＤ発症の方に傾くという研究はよく知られている。

　本発明に於いて、ＡｐｏＥ４がＡｐｏＥ３よりもわずかに強いＣＬＳＰの阻害物質であることを示した（図２ｂおよびｃ）。ＣＬＳＰの濃度と比較してＣＮＳにおける非常に高いＡｐｏＥの濃度を考慮すると、僅かな違いは意味を持たずＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４は同様にＣＬＳＰ活性を低下させる可能性が高い。しかしながら、脂質化されていない（または高密度リポタンパク質様脂質粒子に動員されていない）遊離型ＡｐｏＥのみがＣＬＳＰを抑制できる前提で考えると、仮に脂質化されていないＡｐｏＥの濃度がＣＬＳＰの濃度と同程度のレベルである場合、アディポネクチンのレベルが低下した状態（ＡＤ罹患者）では、ＡｐｏＥのＣＬＳＰ阻害効果の僅かの違いが発症を左右させる決定要因となり得る。この場合、ＡｐｏＥ４はＣＬＳＰ活性をより強く抑制するので（図２ｂおよびｃ）、ＡｐｏＥ４遺伝子保有者は非ＡｐｏＥ４保有者よりもＡＤ傷害を受けやすくなる。残念ながら、この考えの妥当性を検討するために行うべき、非脂質化ＡｐｏＥの量を定量する具体的な方法は現在まで見つかっていない。

　本発明では、ＡＤ患者のＣＳＦではアディポネクチンレベルが低下していて、しかもそのレベルが、ＣＬＳＰを保護することが可能なギリギリのレベルに近い（0.3 nM）という知見（図１０ならびに表１および表２）、およびＳＨ３ＢＰ５および活性化されたＳＴＡＴ３のレベルがＡＤ脳で低下している（図１１）（35）という知見によって、ニューロン内ＣＬＳＰシグナル伝達がＡＤ脳で低下していると推測した。

　但し、本発明に於いては、ＡＤ脳神経細胞周辺の間質液におけるアディポネクチン濃度を測定することは技術的にほぼ不可能であるため、濃度的に近いＣＳＦにおける濃度を測定し、それを元に間質液内の事象を議論している。

　更に、本発明に於いては、ニューロン内ＣＬＳＰ誘導性シグナルがＡＤ脳において低下していることを直接に示すことは技術的に不可能なため、間接的に示している。ＳＨ３ＢＰ５およびＳＴＡＴ３は、様々なサイトカインを中心とした生理活性物質により惹起されたシグナル伝達経路によって同時に調節されるので、ＳＨ３ＢＰ５レベルの低下およびＳＴＡＴ３の不活性化はＣＬＳＰ誘導シグナル伝達の減少なしに起こり得る。したがって、両者の低下を持ってＣＬＳＰ誘導性シグナルが低下していると断定できない。しかしながら、一般に、ＡＤのＣＮＳでは炎症が生じていて、その結果、種々の炎症性サイトカインが産生されていることがよく知られている。そして、上昇した種々の炎症性サイトカインはニューロン内の活性化ＳＴＡＴ３およびＳＨ３ＢＰ５（ＳＴＡＴ３の下流の標的）レベルを上昇させる方向に働く。従って、ＡＤのニューロン内において活性化ＳＴＡＴ３およびＳＨ３ＢＰ５レベルが正常より低下している場合、周りに放出された種々の炎症性サイトカインによる上昇機転があることを考慮すると、活性化ＳＴＡＴ３およびＳＨ３ＢＰ５の低下はＣＬＳＰ誘導性シグナルが低下していることを示すと考えるのが妥当であると思われる。

［ＣＬＳＰＣＯＬ］
　ＣＬＳＰＣＯＬはＣＬＳＰ阻害剤による抑制を受けず、強力なＡＤ保護活性を有している（図Ｌ５）。更に、アディポネクチンのコラーゲン相同領域（ＣＯＬ）は内因性の野生型ＣＬＳＰを増強および保護する活性を保持している。さらに、ＣＬＳＰＣＯＬは血液脳関門を効率的に貫通する（図Ｌ６）。従って、ＣＬＳＰＣＯＬ等の本発明の融合タンパク質は、現在明らかな弱点がなく、末梢経路によって送達され得るＡＤ薬候補であり得る。

　しかしながら、ＣＬＳＰＣＯＬがｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬおよびＣＬＳＰよりも効率的に血液脳関門を通過するメカニズム未だ十分には解明されていない。ＣＬＳＰＣＯＬとｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬとの間に効率に明らかな違いがあるので（図Ｌ６および表Ｌ１）、ＣＬＳＰのＣ末端ドメイン（アミノ酸６２－１４６）の欠失が効率を促進した可能性が高い。即ち、ＣＬＳＰのＣ末端側半分は、血液脳関門移行を阻害する領域を含み得る。又、アディポネクチンのコラーゲン相同領域の付着によって効率が高められている可能性もある。

　ＣＬＳＰＣＯＬは阻害物質のうちカルレティキュリンに対してのみ軽度に阻害された（図Ｘ１、Ｘ２）。その具体的なメカニズムは不明だが、おそらく、人工的に作成された融合部分を含む領域がカルレティキュリンに対して親和性を生じていると推定される。しかし、その阻害効果は弱く、しかも、カルレティキュリンの中枢神経系内濃度は阻害効果を示すより低いこと（１ｎＭ未満）が予想されるため、実際の臨床応用に関しては支障にならないと考えられる。

　以上の実施例で使用された材料及び方法は以下の通りである。尚、特に記載がない場合には、当業者に公知の適当な方法・手段で実施した。

［遺伝子とベクター］
　ヒトＣＬＳＰをｐｃＤＮＡ３．１－ＭｙｃＨｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に挿入して、ＭｙｃＨｉｓでＣ末端にタグ付けされたヒトＣＬＳＰ－ＭｙｃＨｉｓ（ＣＬＳＰ－ＭｙｃＨｉｓ）を哺乳動物細胞において発現させた（5）。ヒトアポリポタンパク質Ｅ３、Ｅ４、アディポネクチン、アネキシンＩＩ、およびアネキシンＶのｃＤＮＡを、Ｃ末端ヘマグルチニンＡ（ＨＡ）タグを有するＣＭＶプロモーター駆動発現ベクターであるｐＨＡベクターに挿入した。ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクターに挿入されたマウスＶ６４２Ｉ－ＡＰＰ ｃＤＮＡは先行文献に記載されている（5）。アポリポタンパク質Ｅ３、Ｅ４およびアディポネクチンｃＤＮＡをｐＦＬＡＧベクターに挿入して、Ｃ末端ＦＬＡＧタグ化タンパク質発現ベクターとして用いた。

　日本住血吸虫グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付き組換えタンパク質を、文献に記載されているように（5）、ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて細菌中で生成した。Ｃ末端ＨｉＢｉＴタグＣＬＳＰの生成には、ＨｉＢｉＴアミノ酸配列（VSGWRLFKKIS）をコードするオリゴヌクレオチド、センス（配列番号４）： 
（5'-CCCGGGGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCTGAGAATTC-3'）、及び
アンチセンス（配列番号５）：
（5'-CCCGGGGTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGCTGAGAATTC-3'）、
をインビトロでアニーリングし、ｐＧＥＸ‐２Ｔ‐ＣＬＳＰプラスミドのＳｍａＩ－ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。

　ｐＣＭＶ－ＳＰＯＲＴ６ベクター中の全長ヒトアディポネクチンｃＤＮＡはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した（カタログ番号：6192794、CA）。Ｃ末端にＭｙｃＨｉｓＧでタグ付けされた組換えＮ末端ＧＳＴタグ付きタンパク質を作製するために、以下の突然変異誘発プライマーを用いたＫＯＤ－Ｐｌｕｓ突然変異誘発キット（SMK-101東京、日本東洋紡、カタログ番号）を使用して、ｐＧＥＸ２Ｔ－ＭｙｃＨｉｓベクターの配列を変異させてグリシン残基のＣ末端付加を生じさせた。
センスプライマー（配列番号６）：
（5'-GGTTGAGAATTCATCGTGACTGACTGACGATCTGCCTCGCGCG-3'）、及び
アンチセンスプライマー（配列番号７）： 
（5'-ATGATGATGATGATGATGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTG-3'）。

　ヒトアディポネクチンのコラーゲン相同領域のｃＤＮＡをＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ（KOD-101、東京、日本TOYOBO、カタログ番号）によって増幅した。
センスプライマー（配列番号８）：
（5'- GGATCCATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGGTCC-3'）、及び
アンチセンスプライマー（配列番号９）：
（5'- GAATTCTCAAGGTTCTCCTTTCCTGCCTTGGATTCCCGGAAAGC-3'）。
　増幅したｃＤＮＡをＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩ部位でｐＱＥ３０ベクター（QIAGEN、東京、日本）にサブクローニングした。

　Ｎ末端ＭｙｃＨｉｓＧタグを有するアディポネクチンのコラーゲン相同領域のｃＤＮＡをＬＡ　Ｔａｑポリメラーゼ（TaKaRa社、カタログ番号RR002A、東京、日本）によって増幅した。
センスプライマー（配列番号１０）：
（5'-AAGCTTGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCATCATCATCATCATCATGGTATGGGGCATCCGGGCCATAATGGGGCCCCAGGCC-3'）及び、
アンチセンスプライマー（配列番号１１）：
（5'-GAATTCTCAAGGTTCTCCTTTCCTGCCTTGGATTCCCGGAAAGCC-3'）。
　増幅したｃＤＮＡをｐＧＥＸ－２Ｔ－ＣＬＳＰおよび－ＣＬＳＰ（１－６１）プラスミドにサブクローニングして、夫々、ＣＬＳＰ－ＭｙｃＨｉｓＧ－アディポネクチンのコラーゲン相同領域、およびＣＬＳＰ（１－６１）－ＭｙｃＨｉｓＧ－アディポネクチンのコラーゲン相同領域からなる、ｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬおよびＣＬＳＰＣＯＬを得た。

［組み換えタンパク質］
Ｃ末端がＭｙｃＨｉｓでタグ付けされたＧＳＴ－ヒトＣＬＳＰ（ＧＳＴ－ＣＬＳＰ－ＭｙｃＨｉｓ）を、１ｍＭのイソプロピル－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド中、３７℃で６時間、大腸菌ＢＬ－２１中で発現させた。ＧＳＴ－ＣＬＳＰ－ＭｙｃＨｉｓをグルタチオンセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させ、文献（14）に示されているように、ＣＬＳＰ‐ＭｙｃＨｉｓ部分をトロンビン（１単位／ｍｌ）を含有するＰＢＳ中での同時インキュベーションによりグルタチオンセファロースから、２５℃で一晩、遊離させた（カタログ番号：Ｔ６６３４－１００ＵＮ、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｉｓ、ＭＯ）。ＭｙｃＨｉｓでＣ末端標識された組換えＣＬＳＰ欠失変異体（5）、およびＧＳＴ－ＣＬＳＰ-ＨｉＢｉＴを同じ方法で作製した。細菌中で産生されたＧＳＴ－アネキシンＩＩ、アネキシンＶ、およびＳＨ３ＢＰ５から、組換えアネキシンＩＩ、Ｖ、およびＳＨ３ＢＰ５タンパク質も同様に作製した。組換えＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓおよびＧＳＴ－ヒト１４－３－３σを、１ｍＭ　イソプロピル－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド中、３７℃で６時間、大腸菌ＢＬ－２１中で発現させ、グルタチオンセファロースに結合させ、５０ｍＭグルタチオンの存在下での共インキュベーションによってグルタチオンセファロースから遊離させ、ＰＢＳ中で透析した。アディポネクチンのＮ末端６ｘＨｉｓＧタグ付きコラーゲン相同領域を、１ｍＭ　イソプロピル－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド中、３７℃で４時間、大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］（Ｑｉａｇｅｎ）中で発現させ、Ｔａｌｏｎ Ｍｅｔａｌ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）に結合させ、製造者の指示に従って精製した。溶出した組換え６×Ｈｉｓタンパク質をＺｅｂａ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって脱塩し、次いで１／１０容量の１０×ＰＢＳを脱塩タンパク質溶液に添加した。

　組換えヒトアポＥ３およびアポＥ４はＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ　Ｈｉｌｌ、ＮＪ）から購入した（カタログ番号：３５０-０２および３５０-０４）。 ヒトアディポネクチンおよび三量体アディポネクチンは、ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ（Ｃｚｅｃｋ　Ｒｅｐｕｂｌｉｃ）から購入した（カタログ番号：ＲＤ１７２０２９１００およびＲＤ１７２０２３１００）。

［細胞死アッセイ］
　ＡＤに関連する神経細胞死アッセイはＹａｍａｔｓｕｊｉ　ｅｔ　ａｌによって最初に行われた（39）。ＳＨ-ＳＹ５Ｙ細胞を１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２混合物（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）中で増殖させた。ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞を６ウェルプレートに２ｘ１０^５/ウェルで１２～１６時間播種し、血清の非存在下で指示されたベクターで３時間トランスフェクションし、次にＣＬＳＰおよび/またはＣＬＳＰ修飾物質（ＣＬＳＰに作用する物質）を含む/含まないＤＭＥＭ/Ｆ１２‐１０％ＦＢＳで培養した。トランスフェクションの２４時間後、培地を、ＣＬＳＰおよび/またはＣＬＳＰ修飾物質を含む/含まない、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含有するＤＭＥＭ/Ｆ１２と交換した。トランスフェクション開始の４８時間後、細胞を回収してＷＳＴ‐８細胞死アッセイキット（同仁堂、熊本、日本）を用いる細胞生存（率）アッセイまたはカルセインＡＭ（同仁堂、熊本、日本）を用いる染色、およびトリパンブルー排除細胞死アッセイを行った。ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞におけるトランスフェクション効率は約８０％であった。 全ての細胞死実験はＮ＝３で行った。

［抗体］
　キーホールリンペットヘモシアニンと複合体化させたヒトＣＬＳＰのＮ末端ペプチド１６アミノ酸のペプチドに対してウサギポリクローナル抗体を産生させ、免疫ペプチドでアフィニティー精製した（ｈＣＬＳＰ-Ｎ抗体）。ＧＳＴ-ＣＬＳＰ-ＭｙｃＨｉｓに対するウサギポリクローナル抗体は、細菌中で産生された組換えＧＳＴ-ＣＬＳＰ-ＭｙｃＨｉｓ（ＧＳＴ-ＣＬＳＰ抗体）（5）で免疫することによって生成された。さらに組換えＣＬＳＰ-ＭｙｃＨｉｓを用いた粗血清から抗体をアフィニティー精製した。１４-３-３σを用いてアフィニティー精製した。シグマ－Ｃ抗体は、ウサギをヒト１４-３-３σのＣ－末端１６アミノ酸ペプチドで免疫することによって産生し、更にアフィニティー精製した。ＳＨ３ＢＰ５に対するポリクローナル抗体（「ＳＨ３ＢＰ５抗体」と命名）をウサギにおいて産生し、そしてＧＳＴ－１４－３－３σおよびＧＳＴ－ＳＨ３ＢＰ５を使用してアフィニティー精製し、更にＧＳＴ-ＳＨ３ＢＰ５を使用してアフィニティー精製した。

　本発明で使用したペプチドおよびタンパク質に対する既製の抗体は、次の会社から購入した：西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ＦＬＡＧエピトープ（クローン　Ｍ２、カタログ番号１５８５９２-１ＭＧ）、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ；ＡＰＰ（２２Ｃ１１、カタログ番号ＭＡＢ３４８（登録商標））、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）； Ｍｙｃエピトープ（カタログ番号Ｒ９５０-２５）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）；ペルオキシダーゼ結合ＨＡ（ヘマグルチニンＡ）エピトープ（クローン３Ｆ１０、カタログ番号２０１３８１９）、Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）；ＳＨ３ＢＰ５抗体（Ｓａｂ；カタログ番号ｓｃ-１３５６１７）、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ、ＣＡ）；ＳＨ３ＢＰ５モノクローナル抗体（クローン１Ｄ５、カタログ番号Ｈ００００９４６７-Ｍ０２）、Ａｂｎｏｂａ、（台北、台湾）； ＨｉｓＧモノクローナル抗体（カタログ番号Ｒ９４０-２５）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。

［イムノブロット分析］
　細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＮＰ－４０、およびプロテアーゼインヒビターカクテルコンプリート（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）に懸濁した。２回凍結融解した後、細胞溶解物を４℃で１０分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清およびプルダウン沈殿物を標準的またはトリス-トリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）による分析、およびイムノブロット分析にかけた。１レーンあたり１０μｇの細胞溶解物を直接イムノブロット分析に使用した（5）。外因的に発現されたＶ６４２Ｉ-ＡＰＰを検出するためにＡＰＰ抗体を使用するイムノブロット分析によって、様々な長さを有する内因性野生型ＡＰＰが同時に検出された。様々な長さを有する内因性野生型ＡＰＰの検出は、未知の理由のために異なる実験間で均一ではなかったことに留意すべきである。

［プルダウン分析］
　臭化シアン活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂへの組換えタンパク質の結合は、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）の説明書に従って行った。簡単に説明すると、５ｍｇの組換えタンパク質をカップリング緩衝液（０．５ＭのＮａＣｌを含有する０．１ＭのＮａＨＣＯ_３、ｐＨ８．３）中で３ｍｌの臭化シアン活性化セファロース４Ｂと共に回転させながら４℃で一晩インキュベートした。次に、組換えタンパク質結合セファロースをブロッキング緩衝液（０．２Ｍグリシン、ｐＨ８．０）中、室温で２時間インキュベートして、非特異的結合を排除した。ブロッキング後、セファロースをカップリング緩衝液、および０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）で洗浄した。結合セファロース４Ｂを４℃でカップリング緩衝液中に保存した。

　様々なタンパク質を過剰発現している細胞からの溶解物をＧＳＴ-ＭｙｃＨｉｓまたはＣＬＳＰ-ＭｙｃＨｉｓ結合セファロース４Ｂと４℃で一晩混合し、続いて徹底的に洗浄した。 次いで、プルダウンした沈殿物および細胞溶解物をＳＤＳ-ＰＡＧＥおよびイムノブロット分析または銀染色（和光純薬、東京、日本）にかけて、ＣＬＳＰとタンパク質との間の結合を調べた。

　実験では、ＭｙｃＨｉｓでＣ末端にタグ付けされた、組換えＣＬＳＰ、その欠失変異体（ΔＮ１、ΔＮ２、ΔＣ１、およびＥＨＲ）の1つを細菌中で産生させ、精製した。 それらをＦＬＡＧでＣ末端にタグ付けされたアポリポタンパク質Ｅ４またはアディポネクチンを含むＦ１１細胞由来の溶解物と、４℃で一晩混合し、続いて徹底的に洗浄した。 洗浄したプルダウン沈殿物および細胞溶解物を次いでＳＤＳ-ＰＡＧＥ展開し、イムノブロット分析にかけた。

［組換えタンパク質の腹腔内注射後の間質液含有脳試料としてのマウスからの脳溶解物の調製］
　全ての実験手順は東京医科大学の動物実験地域委員会によって承認された。オリエンタルイースト社（東京、日本）から購入したオスのＩＣＲマウス（８週齢）に、ＰＢＳ中の、ネガティブコントロールとして１０ｎｍｏｌのＧＳＴ －ＭｙｃＨｉｓＧタンパク質、ＣＬＳＰＣＯＬ、またはｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬを腹腔内注射した。注射の１時間後マウスをジエチルエーテル（和光純薬、東京、日本）で麻酔した。その後、血液を心臓から吸引し、４℃で１０分間４０００×gで遠心分離した。氷の入った２０ｍｌの乳酸リンゲル液（大塚製薬、東京、日本）を用いて、心臓の左心室を通して脳の血管空間を灌流させて血液を除去した。次にマウスを断頭し脳を摘出した。ＣＳＦの汚染を洗浄するために、全脳を乳酸リンゲル液で一度洗浄した。次いで２倍重量の食塩水の存在下で均質化した。該溶解物を４℃で４０００×gで１０分間遠心分離した後、上清を間質液含有脳試料として回収した（36）。

［ヒト脳脊髄液および側頭葉サンプル］
　ＡＤ患者および対照からの死後ＣＳＦおよび側頭葉サンプルは、デューク大学医療センター、神経内科のキャスリーンプライスブライアン脳バンクから得た（表１および３）。病理学的病期分類は、老人斑および神経炎性斑については「ＡＤ登録のためのコンソーシアム」（ＣＥＲＡＤ）病期分類システム（40）、神経原線維変化についてはＢｒａａｋ病期分類システム（41）の下で行われた。 ＣＥＲＡＤ病期分類によってpossibleＡＤとみなされた症例は全てＡＤ症例として数えた。この研究は、デューク大学医療センターのキャスリーンプライスブライアン脳バンクおよび東京医科大学の倫理委員会によって承認された。

［解離定数の測定］
　アポＥ４（またはアディポネクチン）とＣＬＳＰとの間の結合についての解離定数を、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ　ＨｉＢｉＴ細胞外検出システム（Ｐｒｏｍｅｇa、カタログ番号：Ｎ２４２０）を用いて、説明書に従って測定した。組換えアポＥ４またはアディポネクチンのコーティングのために、２０ｐＭのアポＥ４またはアディポネクチンを含有する１００μｌの５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を９６ウェルプレートのウェル中で４℃で一晩インキュベートした（蛍光用ブラック型プレートＨ　カタログ番号：ＭＳ－８５９６ＫＺ、住友ベークライト、東京、日本）。タンパク質被覆プレートを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。次に、１％スキムミルクを含む１５０μlのＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を各ウェルに加えた。それらを振盪せずに室温で１時間インキュベートした。プレートを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ中の１００μｌの濃度のＣＬＳＰ－ＨｉＢｉＴを各ウェルに加えた。プレートをさらに振盪せずに４℃で一晩インキュベートし、次いで０．１％ＮＰ-４０を含有するＰＢＳで５回洗浄し、続いて１００μｌのＰＢＳを添加した。その後、キット中のＨｉＢｉＴ用の基質を各ウェルに添加した。得られた化学発光を、Ｗａｌｌａｃ　ＡＲＶＯ^ＴＭ　Ｘ　５（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を用いて各ウェルについて測定した。ＣＬＳＰ-ＨｉＢｉＴの濃度は、段階的に増加する濃度のＣＬＳＰ-ＨｉＢｉＴを含む100μLのＰＢＳで満たしたウェルの化学発光を測定することによって同時に作成された標準線を参照して、各ウェルについて推定した。この実験はＮ＝２で行った。

［ＥＬＩＳＡ］
　既製のヒトアディポネクチンＥＬＩＳＡキットを積水メディカル株式会社（カタログ番号３７６４０５、東京、日本）から購入し、製造業者の指示に従ってＣＳＦアディポネクチン濃度の測定に使用した。１４－３－３σ　ＥＬＩＳＡおよびＳＨ３ＢＰ５の場合、０．６μｇ/ｍｌのＧＳＴシグマ抗体または１μｇ/ｍｌのＳＨ３ＢＰ５モノクローナル抗体（クローン１Ｄ５、カタログ番号Ｈ００００９４６７－Ｍ０２、Ａｎｏｂａ、台北、台湾））を含む５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）１００μＬを９６ウェルプレート（ＥＬＩＳＡプレートＨ、カタログ番号ＭＳ－８８９６ＦＺ、住友ベークライト、東京、日本）中、４℃で一晩インキュベートした。この捕捉抗体被覆プレートを各ウェル中で４００μｌの洗浄緩衝液（０．１％ＮＰ４０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、そして３００μｌのＰＶＤＦブロッキング試薬（ＴＯＹＯＢＯカタログ番号ＮＹＰＢＲ０１、東京、日本）を、振盪せずに室温で１時間満たした。３００μlの洗浄緩衝液で３回洗浄した後、プレートを１００μｌの段階的に増加する濃度の組み換え１４-３-３σまたはＳＨ３ＢＰ５のＰＢＳ溶液（標準曲線の測定用）で満たした。ヒトＣＳＦ試料またはヒト側頭葉の溶解物を、２５０ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベートした。その後、プレートを３００μｌの洗浄緩衝液で洗浄した。検出抗体として、Ａｂ－１０ Ｒａｐｉｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（同仁堂、カタログ番号ＬＫ３３、熊本、日本）またはＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｉｎｇ Ｋｉｔ－ＨＮ_２（同仁堂、タログ番号ＬＫ１１、熊本、）を用いて、夫々、ペルオキシダーゼ標識シグマ－Ｃ抗体またはＳＨ３ＢＰ５抗体を調製した。Ｃａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　２（ＴＯＹＯＢＯカタログ番号ＮＫＢ―３０１）中の１．０μg/ ml検出抗体１００μlを各ウェルに添加し、プレートを振盪（２５０ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。３００μlの洗浄バッファーで５回洗浄した後、 Ｒ＆Ｄ ＴＭＢ基質溶液（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＤＹ９９９）をウェルに添加し、そしてプレートを室温で１０分間インキュベートした。５０μｌのＨ_２ＳＯ_４を添加することによって反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をＷａｌｌａｃ ＡＲＶＯ^ＴＭ Ｘ５（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって測定した。

　製造業者の説明書に従ってビオチン標識抗ＨｉｓＧ抗体をビオチン標識Ｋｉｔ－ＮＨ_２（同仁堂、カタログ番号：ＬＫ０３、熊本、日本）を用いて調製した。 CLSPCOLおよびwt-CLSPCOL（結合ペプチドとしてＭｙｃおよびＨｉｓＧタグを直列に含む）のＥＬＩＳＡの場合、２５μｇ/ｍｌのＣＬＳＰ‐Ｎ抗体（捕捉抗体）を含む１００μｌの５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を９６ウェルプレート（ＥＬＩＳＡプレートＨ、カタログ番号ＭＳ－８８９６ＦＺ、住友ベークライト、東京、日本）中、４℃で一晩インキュベートした。捕捉抗体被覆プレートを各ウェル４００μｌの洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、そして３００μｌのＰＶＤＦブロッキング試薬（ＴＯＹＯＢＯカタログ番号ＮＹＰＢＲ０１、東京、日本）で満たし、振盪せずに室温で１時間保持した。 ３００μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓ、ＣＬＳＰＣＯＬおよびｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬを段階的に増加する濃度で含むＰＢＳ（標準曲線の測定用）１００μｌ、又はマウス脳溶解物でプレートを満たし、室温で２時間インキュベートした。 ３００μlの洗浄緩衝液で洗浄した後、Ｃａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　１（ＴＯＹＯＢＯカタログ番号：ＮＫＢ－２０１）中の１０００倍希釈のビオチン結合抗ＨｉｓＧ抗体１００μlでプレートを満たし、インキュベートした。室温で１時間インキュベートした。次にプレートを３００μlの洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、それらをＣａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　２（ＴＯＹＯＢＯカタログ番号：ＮＫＢ－３０１）中の２０００倍希釈したストレプトアビジン結合ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μlで満たし、室温で1時間インキュベートした。 ３００μlの洗浄緩衝液で５回洗浄した後、プレートに１００μLのＲ＆Ｄ　ＴＭ　Ｂ　Ｓｕｂｓｔｒａｔe溶液（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＤＹ９９９）を充填し、室温で３分間インキュベートした。 ５０μｌのＨ_２ＳＯ_４を添加することによって反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度をＷａｌｌａｃ ＡＲＶＯＴＭ Ｘ５（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって測定した。

［ヒト試料の免疫組織化学的分析］
　この研究は東京医科大学の倫理委員会によって承認された。各患者の家族からインフォームドコンセントを得た後、組織学的脳サンプルを確立された手順の下で群馬老人医学研究病院において得た。臨床基準により患者はＡＤと診断され、診断は剖検での神経病理学的分析により確認された。剖検時に、脳をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）で固定し、パラフィン中に包埋し、次いで神経病理学的検査に供した。この研究で使用された大脳皮質と海馬は６人の散発性ＡＤ患者と、代表的な運動ニューロン特異的な神経変性疾患である、散発性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の５人の患者のサンプルから得られた。

　スライスした切片を脱パラフィン処理し、ＰＢＳに再水和し、そしてＡＮＴＩＧＥＮ　ＵＮＭＡＳＫＩＮＧ　ＳＯＬＵＴＩＯＮ（カリフォルニア州バーリンゲームのＶｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で１５分間、マスクを外した。 続いて、切片をヤギ正常血清およびＴＢＳ中０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を含むブロッキング溶液中で室温で２０分間インキュベートし、次いで、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中、陰性対照として５μg/ mlのマウスＩｇＧ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＭＡＢ００２、ミネソタ州ミネアポリス）またはＳＨ３ＢＰ５（Ｓａｂ）モノクローナル抗体クローンＰＬ－Ａ２３（サンタクルーズバイオテクノロジー、カタログ番号ｓｃ－１３５６１７、サンタクルーズ、カリフォルニア）と共に、４℃で３晩インキュベートした。免疫反応性は、ＴＳＡ（Ｔｙｒａｍｉｄｅ　Ｓｉｇｎａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）-プラスフルオレセインシステム（Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）（Ｔｙｒａｍｉｄｅ―Ｒｅｄ法）を用いて可視化した。蛍光標識試料を蛍光顕微鏡（Ｂｉｏｚｅｒｏ、ＫＥＹＥＮＣＥ、大阪、日本）で観察した。 蛍光画像はＮＩＨ　Ｉｍａｇｅ　Ｊ１．３７ｖにより分析した。

［ニューロンにおけるＳＨ３ＢＰ５免疫蛍光強度の定量］
　ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．３７ｖを使用して、ＳＨ３ＢＰ５免疫蛍光強度および選択されたニューロンの面積を定量した。ニューロンの１μｍ^２（a）あたりの平均ＳＨ３ＢＰ５免疫蛍光強度を計算した。ニューロン周囲のニューロピル１μｍ^２あたりの平均免疫蛍光強度も同時にバックグラウンド免疫蛍光として定量した（b）。 差し引かれた平均免疫蛍光強度（ａ-ｂ）は、ニューロンの平均ＳＨ３ＢＰ５免疫蛍光強度として用いた。次いで、ａ-ｂ値にニューロン面積を掛けて、ニューロンにおけるＳＨ３ＢＰ５発現のレベルを推定した。無作為に１０個のニューロンを選択し、試料あたり１０個のニューロンにおける平均免疫蛍光強度を各試料について計算した。

［統計分析］
　すべてのデータは、Ｍａｃ　ＯＳＸソフトウェア用のＰｒｉｓｍ７（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を用いて分析した。 細胞死実験におけるデータは平均値±標準偏差で示した。 他の全てのデータは平均値±ＳＥＭで示した。対応のないＴ検定（両側）を、組織学的実験およびＥＬＩＳＡ実験から得られたデータの分析に使用した。

　ＰＭＤ; 剖検されるまでの死後時間
　*年齢の前の「より大きい（＞）」を「等しい」と見做した場合、ｐ＜０．８７６。表Ｓ３の「年齢」を参照
　ｐ値が０．０５より小さい（０．０３２）ため、年齢の分析の為に、ウェルチの修正を伴う対応のないＴ検定が採用された。

　　ＡｐｏＥ：２つのアポリポタンパク質Ｅ対立遺伝子名が数字で示されている。
　ＰＭＤ： 剖検までの死後時間、Ｂ＆Ｂステージ： Ｂｒａａｋ＆Ｂｒａａｋステージ。
　２つのpossible ＡＤ症例はＡＤ症例としてカウントされた。
　全ＡＤ症例および非ＡＤ症例の平均±ＳＥＭ年齢は、それぞれ７８．５±０．９歳および８６．３±１．４歳より大であった（対応のないＴ検定、年齢の前の「より大きい」を「等しい」と見做した場合はｐ＜０．０００１）。全ＡＤ症例および非ＡＤ症例の平均±ＳＥＭ　ＰＭＤは、それぞれ、１１．７±１．８時間および１１．５±２．１時間であった（対応のないＴ検定、ｐ＝０．９６）。

　側頭葉または後頭葉の外側錐体層の切片は、剖検されたＡＤおよびＡＬＳ患者から得た。ＣＤＲ：臨床的認知症評価、ＮＥ：検査されていない。
　全ＡＬＳ患者およびＡＤ患者の平均±ＳＥＭ年齢は、それぞれ６６．７±２．８および７５．９±５．１歳であった（対応のないＴ検定、ｐ＝０．１５８）。

　ＡｐｏＥ：２つのアポリポタンパク質Ｅ対立遺伝子名が数字で示されている。
　ＰＭＤ： 剖検されるまでの死後時間、Ｂ＆Ｂステージ： Ｂｒａａｋ＆Ｂｒａａｋステージ。
　全ＡＤ症例および非ＡＤ症例の平均±ＳＥＭ年齢は、それぞれ７９．９±２．９歳および７９．４±１．３歳より大であった（対応のないＴ検定、年齢の前の「より大きい」を「等しい」と見做した場合はｐ＜０．８７６）。全ＡＤ症例および非ＡＤ症例の平均±ＳＥＭ　ＰＭＤは、それぞれ１２．７±３．０時間および１６．７±３．１時間であった（対応のないＴ検定、ｐ＝０．３６８）。

　段階的に増加する濃度の組換えタンパク質を測定（Ｎ＝３）することによって標準的な用量反応線を作成した。ＩＳＦ含有脳溶解液および血清中のＣＬＳＰＣＯＬまたはｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬ濃度の測定には、１０μＬの間質液含有脳溶解液を含む９０μＬのＰＢＳ（ｘ１０　ＩＳＦ溶解液）または２μＬの血清を含む９８μＬのＰＢＳ（血清×５０）をＥＬＩＳＡにかけた（Ｎ＝３）。段階的に増加する濃度の標準組換えタンパク質（ＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓＧ、ｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬ、およびＣＬＳＰＣＯＬ；濃度０．１５～１０ｎＭ）、×１０ ＩＳＦ溶解物、及び、×５０血清についての実測の数値をＡｂｓ ４５０カラムに示した。次に、３つの数値の平均を計算し、平均Ａｂｓ４５０列に示した。各平均数から生理食塩水の平均数を差し引くことによってＤｅｌ平均数を得た。×１０ ＩＳＦ溶解物および×５０血清のＤｅｌ　ＧＳＴ数は、ＣＬＳＰＣＯＬまたはｗｔ－ＣＬＳＰＣＯＬのＤｅｌ平均数からＧＳＴ－ＭｙｃＨｉｓＧ（陰性対照）のＤｅｌ平均数を引くことによって得た。次に、ＩＳＦ含有脳溶解物および血清中の組換えタンパク質の濃度を、標準的な用量反応線を用いて推定した（図６ａ）。

　本発明に係る、ＣＬＳＰ誘導体、ポリペプチド、増強又は保護剤、及び、融合タンパク質は、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制するための医薬組成物、例えば、アルツハイマー病に関連する記憶傷害又は神経変性を伴う疾病の予防または治療に用いられる医薬組成物の有効成分として有用である。

本明細書中で引用された文献のリストを以下に示す。
［引用文献リスト］
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Claims (20)

1. カルモジュリン様皮膚タンパク質（Calmodulin-like skin Protein：ＣＬＳＰ）の誘導体（変異体）であって、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性（ＣＬＳＰ活性）中心である内因性ヒューマニン相同領域（ＥＨＲ）を含み、該ＣＬＳＰ活性の阻害剤が結合する領域を含まないことを特徴とする、前記誘導体。
2. ＥＨＲがアミノ酸配列（Ｉ）：
   ＴＧＫＮＬＳＥＡＱＬＲＫＬＩＳＥＶＤＳ(あるいはＧ)ＤＧＤ（アミノ酸一文字表記）（Ｉ）
   から成る、請求項１記載の誘導体。
3. 阻害剤が結合する領域がＣＬＳＰ（配列番号１）のＣ末端領域のアミノ酸配列（アミノ酸６２～１４６）である、請求項１又は２に記載の誘導体。
4. 以下のアミノ酸配列：
   （１）ＣＬＳＰのＮ末端領域のアミノ酸配列（アミノ酸１～６１）；
   （２）上記（１）のアミノ酸配列に於いて、該アミノ酸配列に含まれるＥＨＲ以外のアミノ酸配列中に一個又は数個（例えば、２～５個程度）のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列； 又は
   （３）上記（１）のアミノ酸配列に於いて、該アミノ酸配列に含まれるＥＨＲ以外のアミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
   から成るポリペプチドである、態様１～３のいずれかに記載の誘導体。
5. 阻害剤によるＣＬＳＰ活性の阻害又は抑制作用を受けない、請求項１～４のいずれか一項に記載の誘導体。
6. 阻害剤が、アポリポタンパク質Ｅ、１４‐３‐３タンパク質、およびカルレティキュリンから成る群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の誘導体。
7. 以下のアミノ酸配列：
   （１）配列番号２に示されるアミノ酸配列（ＡＤＮＣｏｌ）；
   （２）上記（１）のアミノ酸配列（ＡＤＮＣｏｌ）を含むアミノ酸配列；
   （３）配列番号３に示されるアディポネクチンのアミノ酸配列に於いて、該アミノ酸配列に含まれるＡＤＮＣｏｌ以外のアミノ酸配列中に一個又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は挿入されたアミノ酸配列； 又は
   （４）配列番号３に示されるアディポネクチンのアミノ酸配列に於いて、該アミノ酸配列に含まれるＡＤＮＣｏｌ以外のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；
   から成るポリペプチド。
8. 請求項７に記載のポリペプチドから成る、ＣＬＳＰ又は請求項１に記載のＣＬＳＰ誘導体の有するＣＬＳＰ活性の増強又は保護剤。
9. 阻害剤によるＣＬＳＰ活性の阻害又は抑制作用から該ＣＬＳＰを保護し、又は、阻害剤の該作用を無効化することを特徴とする、請求項８に記載の増強又は保護剤。
10. 前記ポリペプチドがアディポネクチンである、請求項８又は９記載の増強又は保護剤。
11. 阻害剤が、アポリポタンパク質Ｅ、１４‐３‐３タンパク質、およびカルレティキュリンから成る群から選択される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の増強又は保護剤。
12. ＣＬＳＰ又は請求項１に記載のＣＬＳＰ誘導体と、態様７に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
13. ＣＬＳＰのＮ末端領域のアミノ酸配列（アミノ酸１～６１）とＡＤＮＣｏｌから成る、請求項１２に記載の融合タンパク質。
14. 阻害剤によるＣＬＳＰ活性の阻害又は抑制作用を受けない、請求項１２または１３に記載の融合タンパク質。
15. 請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＬＳＰ誘導体、請求項７に記載のポリペプチド、請求項８～１１のいずれか一項に記載の増強又は保護剤、又は、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制するための医薬組成物。
16. アルツハイマー病に関連する記憶傷害又は神経変性を伴う疾病の予防または治療に用いられる、請求項１５記載の医薬組成物。
17. 請求項１５又は１６に記載の医薬組成物を、神経細胞の細胞機能障害若しくは神経細胞死を伴う疾患、又は、記憶傷害若しくは神経変性を伴う疾病に罹患した又はその疑いのある個体に投与する段階を含む、該疾患又は疾病を治療する方法。
18. 疾患又は疾病がアルツハイマー病である、請求項１７記載の方法。
19. 請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＬＳＰ誘導体、請求項７に記載のポリペプチド、請求項８～１１のいずれか一項に記載の増強又は保護剤、又は、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質（本発明ポリペプチド）による、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性を検出する方法であって、（ａ）ＣＬＳＰの阻害剤の存在／非存在下、及び、本発明ポリペプチドの存在／非存在下に於いて、神経細胞の機能障害又は神経細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の機能障害又は神経細胞死を検出する工程、及び（ｃ）本発明ポリペプチドの存在／非存在下に於ける神経細胞の機能障害又は神経細胞死を比較する工程、を含む前記方法。
20. 請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＬＳＰ誘導体、請求項７に記載のポリペプチド、請求項８～１１のいずれか一項に記載の増強又は保護剤、若しくは、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質（本発明ポリペプチド）又はＣＬＳＰによる、アルツハイマー病に関連する神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）本発明ポリペプチド又はＣＬＳＰの存在下、被検物質の有無で神経細胞の機能障害又は神経細胞死を誘導する工程、（ｂ）神経細胞の機能障害又は神経細胞死を検出する工程、および（ｃ）本発明ポリペプチド又はＣＬＳＰによる神経細胞の機能障害又は神経細胞死を抑制する活性を調節する物質を選択する工程、を含む前記方法。

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