WO2020242220A1 - Fusion protein containing protein having target cell or target protein binding ability of specifically binding to glutathione-s-transferase and vascular endothelial growth factor, vascular endothelial growth factor receptor, or tumor necrosis factor-alpha, and use thereof - Google Patents

Fusion protein containing protein having target cell or target protein binding ability of specifically binding to glutathione-s-transferase and vascular endothelial growth factor, vascular endothelial growth factor receptor, or tumor necrosis factor-alpha, and use thereof Download PDF

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울산과학기술원
주식회사 퓨전바이오텍
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Abstract

The present invention pertains to: a fusion protein containing a protein having a target cell or target protein binding ability of specifically binding to glutathione-S-transferase and a vascular endothelial growth factor, a vascular endothelial growth factor receptor, or tumor necrosis factor-alpha; and a use thereof as a drug delivery vehicle and a pharmaceutical composition. A fusion protein according to an aspect and a drug delivery vehicle containing same not only enable prolonged residence time in vivo, but also have an improved ability to target target cells, and can thus be effectively delivered to the target cells. Accordingly, there is the effect that the fusion protein can be advantageously used as a target therapeutic agent.

Description

글루타치온-Ｓ-전이효소 및 혈관 내피 성장인자, 혈관 내피 성장인자 수용체 또는 종양괴사인자-알파에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도Glutathione-S-transferase and vascular endothelial growth factor, vascular endothelial growth factor receptor, or a fusion protein containing a protein having a target cell or target protein binding ability that specifically binds to tumor necrosis factor-alpha, and uses thereof
글루타치온-Ｓ-전이효소 및 혈관 내피 성장인자, 혈관 내피 성장인자 수용체 또는 종양괴사인자-알파에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.Glutathione-S-transferase and vascular endothelial growth factor, vascular endothelial growth factor receptor or tumor necrosis factor-A fusion protein comprising a protein having a target cell or target protein binding ability that specifically binds to alpha, and uses thereof.
황반이란 망막의 중심부위를 말하는데, 나이관련황반변성은 황반의 망막색소상피와 부르크막 및 맥락막 모세혈관의 변성을 특징으로 하는 만성 질환이다. 해부학적으로 감각신경망막은 망막색소상피의 앞쪽에 위치하며 영양, 지지, 재순환 및 노폐물의 처리를 망막색소상피에 의존한다. 브루크막은 5층으로 된 구조물로 맥락막과 망막색소상피 사이에 끼어 있다. 가장 안쪽 층은 망막색소상피의 기저막이고 가장 바깥쪽은 맥락막 모세혈관 내피세포의 기저막이다. 즉, 망막색소상피와 부르크막 및 맥락막 모세혈관 복합체에 발생한 변성 질환이다.The macula refers to the central part of the retina. Age-related macular degeneration is a chronic disease characterized by degeneration of the retinal pigment epithelium of the macula, Burg's membrane and choroidal capillaries. Anatomically, the sensory nerve retina is located in front of the retinal pigment epithelium and depends on the retinal pigment epithelium for nutrition, support, recycling, and treatment of waste products. The Bruch's membrane is a five-layered structure sandwiched between the choroid and the retinal pigment epithelium. The innermost layer is the basement membrane of the retinal pigment epithelium and the outermost layer is the basement membrane of the choroidal capillary endothelial cells. That is, it is a degenerative disease that occurs in the retinal pigment epithelium, the Burg's membrane, and the choroidal capillary complex.
나이관련황반변성의 원인에 대해서는 아직 정확히 밝혀지지는 않았으나 위험인자로 알려져 있는 것은 나이(특히 75세 이후 가파른 증가를 보인다), 가장 주목받는 환경적 요인인 흡연 외에도 고혈압, 비만, 유전적 소인, 과도한 자외선 노출, 낮은 혈중 항산화제 농도 등이 있다. The cause of age-related macular degeneration has not been accurately identified, but known risk factors include age (especially after 75 years of age, showing a steep increase), high blood pressure, obesity, genetic predisposition, and excessive ultraviolet radiation in addition to smoking, the most notable environmental factor. These include exposure and low levels of antioxidants in the blood.
치료방법으로는 레이저 광응고술, 경동공 온열요법, 광역학요법, 유리체내 스테로이드 주입술, 외과적 수술 등으로 구분할 수 있다.Treatment methods can be classified into laser photocoagulation, transpupillary thermotherapy, photodynamic therapy, intravitreal steroid injection, and surgical surgery.
일반적인 레이저 광응고술은 병소부위 뿐만 아니라 병소 주변의 정상 신경망막에도 손상을 주므로 시력 상실을 초래할 수 있다. 광역학요법(photodynamic therapy)은 종양의 치료에 이용하다가 정상조직에는 영향을 주지 않고 병변이 있는 부위만 치료하는 특징을 가지고 있으므로 안과적으로는 중심와밑 맥락막신생혈관의 치료에 시도하고 있다. 광역학요법에 쓰인 광감작물질은 1세대 물질로 hematoporphyrin derivative와 purified hematoporphyrin derivative인 photofrin이 이용되었고 그 후 개발된 2세대 약물에 는 Tin-ethyletiopurpurine과 verteporfin이 있다.General laser photocoagulation damages not only the lesion, but also the normal nerve retina around the lesion, which can lead to vision loss. Photodynamic therapy is used for the treatment of tumors, but has the characteristic of treating only the lesioned area without affecting the normal tissues. Therefore, ophthalmically, it is attempting to treat the subcentric choroidal neovascularization. The photo-sensitizing materials used in photodynamic therapy were hematoporphyrin derivative and photofrin, a purified hematoporphyrin derivative, as the first-generation substance, and tin-ethyletiopurpurine and verteporfin were developed after that.
현재 가장 많이 사용되는 verteporfin의 치료는 광감작 물질을 정맥 주입하는 단계와 특정 파장의 비온열 레이저를 광감작된 병소에 조사하는 두 단계의 과정으로 이루어져 있다. 정맥 주사한 광감작물질은 혈액내에서 LDL (low density lipoprotein)과 결합하여 이 복합체가 빠르게 증식하는 세포, 즉 맥락막신생혈관의 혈관내피세포에 선택적으로 축적되고 이 때 비열성 레이저를 목표조직에 조사하면 광감작 물질은 ground singlet 상태에서 excited triplet 상태로 전환된다. 이 triplet은 광화학적 반응을 일으켜 직접적으로 free radicals을 만들거나 간접적으로 reactive singlet oxygen을 유리시킨다. 이들이 내피세포에 손상을 주어 혈관 기저막을 노출시키고 혈소판을 결합 및 응집시킨다. 활성화된 혈소판은 혈관활성매개체를 분비하고 혈전증, 혈관수축을 유발하여 결국 신생혈관을 폐쇄시킨다. 이러한 광학적 치료는 특정 조직에만 집중되고 빛의 조사범위를 조절할 수 있다는 장점이 있지만 시력의 회복은 불가능하고 완전히 방지효과가 있지 않아 새로운 치료방법이 계속해서 연구되고 있다.The treatment of verteporfin, which is currently the most widely used, consists of two steps: intravenous injection of a photosensitive material and irradiation of a non-thermal laser of a specific wavelength to the light-sensitized lesion. The photosensitizer injected intravenously binds to LDL (low density lipoprotein) in the blood, and this complex selectively accumulates in rapidly proliferating cells, that is, vascular endothelial cells of the choroidal neovascular system. Then the photosensitive material is converted from the ground singlet state to the excited triplet state. This triplet triggers a photochemical reaction, either directly producing free radicals or indirectly releasing reactive singlet oxygen. They damage endothelial cells, expose the blood vessel basement membrane, and bind and aggregate platelets. Activated platelets secrete vasoactive media and cause thrombosis and vasoconstriction, eventually closing new blood vessels. This optical treatment has the advantage of being able to focus only on specific tissues and control the range of light irradiation, but it is impossible to restore vision and does not have a completely preventive effect, so new treatment methods are continuously being studied.
일 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커를 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다. One aspect is glutathione-S-transferase (GST); It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), or tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability; And it is to provide a fusion protein comprising a linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having a target cell or target protein binding ability.
다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 약물을 함유하는 약물 전달체를 제공하는 것이다. Another aspect is glutathione-S-transferase (GST); It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), or tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability; A linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having the ability to bind to a target cell or a target protein; And it is to provide a drug delivery system containing a drug conjugated with the glutathione-S-transferase.
또 다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 황반 변성 치료제를 포함하는 황반 변성 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. Another aspect is glutathione-S-transferase (GST); It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), or tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability; A linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having the ability to bind to a target cell or a target protein; And it is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating macular degeneration comprising a therapeutic agent for macular degeneration combined with the glutathione-S-transferase.
또 다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 약물을 함유하는 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 약물을 전달하는 방법을 제공하는 것이다.Another aspect is glutathione-S-transferase (GST); It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), or tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability; A linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having the ability to bind to a target cell or a target protein; And administering a composition containing the drug conjugated with the glutathione-S-transferase to an individual in need thereof.
또 다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 약물을 함유하는 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 황반 변성을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하는 것이다.Another aspect is glutathione-S-transferase (GST); It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) or Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability; A linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having binding ability to a target cell or a target protein; And it is to provide a method for preventing or treating macular degeneration comprising administering a composition containing a drug conjugated with the glutathione-S-transferase to an individual in need thereof.
일 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. One aspect is glutathione-S-transferase (GST); It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), or tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability; And it provides a fusion protein comprising a linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having a target cell or target protein binding ability.
본 명세서에서 용어 혈관 내피 성장인자 "VEGF"는 혈관내피세포의 생장활성을 증진시키는 성장인자의 일종으로, 대시식세포, 평활근세포, 종양세포 등 여러 세포에 의하여 분비된다. 태생기 혈관 생성에 중요한 역할을 할 뿐 아니라 빠른 생장과 대사가 이루어지는 종양 조직에서 산소의 공급을 위하여, 혈관신생(angiogenesis)를 유도하는 역할을 한다. 구체적으로 또는 문맥상 달리 명시하지 않는 한, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-G 및 PLGF의 7종의 멤버를 포함하는 VEGF 패밀리의 임의의 천연, 변이체 또는 합성 VEGF 폴리펩타이드, 또는 이의 단편을 지칭하며, 모든 멤버는 각각의 단량체 내에 보존된 중심 4가닥의 β-시트의 일측 단부에 분자 사이 및 분자 내 이황화 결합에 관련된 8개의 불변 시스테인 잔지를 갖는 시스테인 매듭 (knot) 모티프로 구성되는 공통의 VEGF 상동 도메인을 가지며, 역평행의 나란한 (side-by-side) 배향으로 이합체화되고, 혈관생성에 참여한다. VEGF 패밀리 내의 각 멤버는 별개의 유전자에 의해 코딩된다; 그러나 각 멤버는 선택적인 스플라이싱 또는 단백질분해로 인해 다수의 상이한 이소폼을 포함할 수 있다.In the present specification, the term vascular endothelial growth factor "VEGF" is a kind of growth factor that enhances the growth activity of vascular endothelial cells, and is secreted by various cells such as dashed phagocytes, smooth muscle cells, and tumor cells. Not only does it play an important role in the formation of blood vessels in the embryonic stage, but also plays a role in inducing angiogenesis to supply oxygen in tumor tissues where rapid growth and metabolism occur. Any natural of the VEGF family, including 7 members of VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-G and PLGF, unless specifically or contextually indicated otherwise. , A variant or a synthetic VEGF polypeptide, or a fragment thereof, wherein all members have eight constant cysteine residues involved in intermolecular and intramolecular disulfide bonds at one end of a central 4-stranded β-sheet conserved in each monomer. It has a common VEGF homology domain composed of a cysteine knot motif, dimers in an antiparallel side-by-side orientation, and participates in angiogenesis. Each member in the VEGF family is encoded by a separate gene; However, each member may contain a number of different isoforms due to selective splicing or proteolysis.
본 명세서에서 용어 혈관 내피 성장인자 수용체 "VEGFR"는 VEGF에 대한 세포 리셉터, 통상적으로 혈관내피세포에서 발견되는 세포 표면 리셉터 및 hVEGF와 결합하는 능력을 가지는 이들의 변이체를 지칭한다. VEGF 리셉터의 일 예로는 티로신키나제 종류의 막투과 리셉터인 fms-유사 티로신 키나제(flt)가 있다. flt 리셉터는 세포외 도메인, 막투과 도메인 및 티로신 키나제 활성을 가지는 세포내 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 VEGF의 결합과 연관되어 있는 반면, 세포내 도메인은 시그널 형질도입(transduction)과 연관되어 있다. VEGF 리셉터의 다른 예로는 flk-1 리셉터(KDR로 지칭됨.)가 있다. VEGF가 flt 리셉터에 결합하면 2개 이상의 높은 분자량을 가지는 복합체가 생성되며 205,000 및 300,000 Dalton의 겉보기 분자량을 가지는, 300,000 Dalton의 복합체는 VEGF의 단일 분자에 결합된 2개의 리셉터 분자를 포함하는 다이머인 것으로 추정된다. VEGFR의 주요 하위유형은 VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3이 있다.As used herein, the term vascular endothelial growth factor receptor "VEGFR" refers to a cell receptor for VEGF, a cell surface receptor commonly found in vascular endothelial cells, and a variant thereof having the ability to bind hVEGF. An example of a VEGF receptor is an fms-like tyrosine kinase (flt), a transmembrane receptor of the tyrosine kinase type. The flt receptor includes an extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular domain having tyrosine kinase activity. The extracellular domain is involved in the binding of VEGF, while the intracellular domain is involved in signal transduction. Another example of a VEGF receptor is the flk-1 receptor (referred to as KDR.). When VEGF binds to the flt receptor, two or more high molecular weight complexes are created, and the 300,000 Dalton complex, which has an apparent molecular weight of 205,000 and 300,000 Dalton, is a dimer containing two receptor molecules bound to a single molecule of VEGF. Is estimated. The main subtypes of VEGFR are VEGFR1, VEGFR2 and VEGFR3.
본 명세서에서 용어 종양괴사인자-알파 "TNF-alpha"란 염증반응에 포함되고 급성기 반응(acute-phase protein)의 구성원인 사이토카인을 지칭한다. 종양 괴사 인자는 IL-8의 유도를 통하여 혈관 투과성을 증가시키고, 이로 인하여 감염 부위로 대식세포 및 호중구를 재소집한다. 일단 존재한다면, 활성화된 대식세포는 TNF-알파를 계속 생산하고, TNF-알파의 주요 역할은 면역 세포들의 조절이지만 그러나, TNF-알파는 세포 증식, 분화, 자가사멸, 지질 대사, 및 응고가 포함된 생물학적으로 광범위한 범위의 조절에 또한 관련된다. TNF-알파는 염증을 유도하고, 자가사멸적 세포 사멸을 유도하고, 종양발생을 억제시키고, 그리고 바이러스 복제를 억제시킬 수 있다. 또한, TNF-alpha가 NF-κB도 유도하는데, NF-κB를 저해하는 물질이 염증반응을 줄이고 섬유화도 경감시킴이 알려져 있다. In the present specification, the term tumor necrosis factor-alpha "TNF-alpha" refers to a cytokine that is included in the inflammatory response and is a member of an acute-phase protein. Tumor necrosis factor increases vascular permeability through induction of IL-8, thereby reconvening macrophages and neutrophils to the site of infection. Once present, activated macrophages continue to produce TNF-alpha, and the main role of TNF-alpha is the regulation of immune cells, however, TNF-alpha includes cell proliferation, differentiation, self-killing, lipid metabolism, and coagulation. It is also involved in a wide range of biologically controlled regulation. TNF-alpha can induce inflammation, induce apoptotic cell death, inhibit tumorigenesis, and inhibit viral replication. In addition, TNF-alpha also induces NF-κB, and it is known that substances that inhibit NF-κB reduce inflammatory reactions and reduce fibrosis.
본 명세서에서 용어 "표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질", "표적세포 인식능을 갖는 단백질", 또는 "표적 세포 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질"은 세포의 수용체 또는 표적 단백질을 특이적으로 인식하는 또는 세포의 수용체 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질을 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 세포의 수용체 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 단백질은 항체, 항원 결합 단편, 애피바디(affibody), 다이아바디(diabody) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다. 특히 본 명세서에서는 VEGF와 VEGFR 사이의 상호작용을 방해하는 단백질, 예를 들면, VEGF 또는 VEGFR에 결합하여 VEGF와 VEGFR 사이의 상호작용을 방지하거나 그렇지 않으면 저지하는 단백질을 포함한다. 또한, TNF-alpha에 결합하여 TNF-alpha 작용을 억제하는 단백질을 포함한다. In the present specification, the terms "a protein having a target cell or target protein binding ability", "a protein having a target cell recognition ability", or "a target cell or a protein that specifically binds to a target protein" refers to a receptor or a target protein of a cell. It may mean a protein that is specifically recognized or specifically binds to a receptor or a target protein of a cell. Specifically, the protein that specifically binds to the receptor or target protein of the cell is any one selected from the group consisting of an antibody, an antigen-binding fragment, an affibody, a diabody, and an aptamer. Can be. In particular, the present specification includes proteins that interfere with the interaction between VEGF and VEGFR, for example, proteins that bind to VEGF or VEGFR to prevent or otherwise block the interaction between VEGF and VEGFR. In addition, it contains a protein that binds to TNF-alpha and inhibits the action of TNF-alpha.
본 명세서에서 용어 "애피바디 분자(affibody molecule)"는 특정 타겟 단백질(수용체)에 결합할 수 있는, 항체 모사체를 의미할 수 있다. 일반적으로 애피바디 분자는 20 내지 150의 아미노산 잔기로 구성되며, 2 내지 10개의 알파 헬릭스로 구성된 것일 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 애피바디 분자는 항-VEGF 애피바디 분자, 항-VEGFR 애피바디 분자, 항-TNF-alpha 애피바디 분자 등을 포함할 수 있다. 또한, 이에 한정되지 않고, 세포의 특정 수용체 또는 표적 단백질을 인식할 수 있는 애피바디 분자를 모두 포함한다.As used herein, the term "affibody molecule" may refer to an antibody mimic capable of binding to a specific target protein (receptor). In general, the Affibody molecule is composed of 20 to 150 amino acid residues, and may be composed of 2 to 10 alpha helixes. In more detail, the Affibody molecule may include an anti-VEGF Affibody molecule, an anti-VEGFR Affibody molecule, an anti-TNF-alpha Affibody molecule, and the like. Further, the present invention is not limited thereto, and includes all affibody molecules capable of recognizing a specific receptor or target protein of a cell.
상기 GST 및 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 링커를 통해 연결되어 있을 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는, 1 내지 400개, 1 내지 200개, 또는 2 내지 200개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 또한 기능적 일부분 사이의 적절한 분리를 달성하기 위하여 또는 필수적인 내부-일부분(inter-moiety)의 상호작용을 유지하기 위한　링커의 최적화를 고려하여 카피 수 "n"을 조절할 수 있다. 해당 기술분야에서 다른 가요성　링커들이 알려져 있는데, 예를 들어 수용성을 향상시키기 위하여 극성 아미노산 잔기를 추가하는 것뿐만 아니라 유연성을 유지하기 위하여 T 및 A와 같은 아미노산 잔기를 추가한 G 및 S　링커가 있을 수 있다. 따라서 일 구체예에 있어서, 상기　링커는 G, S, 및/또는 T 잔기를 포함하는 유연성　링커일 수 있다. 상기　링커는 (GpSs)n 및 (SpGs)n으로부터 선택되는 일반식을 가질 수 있고, 이 경우, 독립적으로, p는 1 내지 10의 정수이고, s = 0 내지 10의 0 또는 정수이고, p + s는 20 이하의 정수이고, 및 n은 1 내지 20의 정수이다. 더욱 구체적으로 링커의 예는 (GGGGS)n (서열번호 2), (SGGGG)n　(서열번호 3), (SRSSG)n (서열번호 4), (SGSSC)n (서열번호 5), (GKSSGSGSESKS)n (서열번호 6), (RPPPPC)n (서열번호 7), (SSPPPPC)n (서열번호 8),　 (GSTSGSGKSSEGKG)n (서열번호 9), (GSTSGSGKSSEGSGSTKG)n (서열번호 10),　(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)n　(서열번호 11), 또는 (EGKSSGSGSESKEF)n (서열번호 12)이고, 상기 n은 1 내지 20, 또는 1 내지 10의 정수이다. The GST and the target cell or a protein having a target protein binding ability may be linked through a linker. For example, the linker may be a polypeptide consisting of 1 to 400, 1 to 200, or 2 to 200 arbitrary amino acids. The peptide linker may include Gly, Asn and Ser residues, and neutral amino acids such as Thr and Ala may also be included. Amino acid sequences suitable for peptide linkers are known in the art. It is also possible to adjust the copy number "n" by taking into account the optimization of the linker to achieve adequate separation between functional moieties or to maintain the necessary inter-moiety interactions. Other flexible linkers are known in the art, for example, G and S linkers with addition of amino acid residues such as T and A to maintain flexibility as well as adding polar amino acid residues to improve water solubility. I can. Thus, in one embodiment, the linker may be a flexible linker including G, S, and/or T residues. The linker may have a general formula selected from (G p S s ) n and (S p G s ) n , in which case, independently, p is an integer of 1 to 10, and s = 0 of 0 to 10 Or an integer, p + s is an integer of 20 or less, and n is an integer of 1 to 20. More specifically, examples of linkers include (GGGGS) n (SEQ ID NO: 2), (SGGGG) n (SEQ ID NO: 3), (SRSSG) n (SEQ ID NO: 4), (SGSSC) n (SEQ ID NO: 5), (GKSSGSGSESKS) n (SEQ ID NO: 6), (RPPPPC) n (SEQ ID NO: 7), (SSPPPPC) n (SEQ ID NO: 8), (GSTSGSGKSSEGKG) n (SEQ ID NO: 9), (GSTSGSGKSSEGSGSTKG) n (SEQ ID NO: 10), (GSTSGSGKPGSGEGSTKG) n (SEQ ID NO: 11), or (EGKSSGSGSESKEF) n (SEQ ID NO: 12), wherein n is an integer of 1 to 20, or 1 to 10.
또 다른 양상은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. Another aspect provides a polynucleotide encoding the fusion protein.
용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 의미한다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 자연의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 당 또는 염기 부위가 변형된 그의 유사체(analogue)도 포함한다. 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 단쇄 폴리뉴클레오티드이다.The term "polynucleotide" refers to a deoxyribonucleotide or a polymer of ribonucleotides present in a single-stranded or double-stranded form. It encompasses RNA genomic sequences, DNA (gDNA and cDNA) and RNA sequences transcribed therefrom, and unless specifically stated otherwise, includes natural polynucleotides as well as their analogs with modified sugar or base sites. In one embodiment, the polynucleotide is a single chain polynucleotide.
또 다른 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. Another aspect provides a vector comprising the polynucleotide.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 지칭한다. 일 실시예에 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 및/또는 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있으며, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 상기 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 벡터를 함유 하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우, 복제 기원을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 도입될 수 있으며, 상기 벡터는 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 배시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. As used herein, the term "vector" refers to a vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, and refers to a genetic construct comprising a regulatory element operably linked to express a gene insert. The vector according to an embodiment may include an expression control element such as a promoter, an operator, an initiation codon, a stop codon, a polyadenylation signal, and/or an enhancer, and the promoter of the vector may be constitutive or inducible. Further, the vector may be an expression vector capable of stably expressing the fusion protein in a host cell. The expression vector may be a conventional one used in the art to express foreign proteins in plants, animals or microorganisms. The recombinant vector can be constructed through various methods known in the art. For example, the vector may include a selectable marker for selecting a host cell containing the vector, and in the case of a replicable vector, may include an origin of replication. In addition, the vector can be self-replicating or introduced into the host DNA, and the vector is selected from the group consisting of plasmid, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus, retrovirus, herpes simplex virus, and basinia virus. Can be.
상기 벡터는 동물세포, 예를 들어, 포유동물 세포에서 작동가능한 프로모터를 포함한다. 일 실시예에 따라 적합한 프로모터는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (Cytomegalovirus) 프로모터, U6 프로모터 및 H1 프로모터, MLV(Murine Leukemia Virus) LTR(Long terminal repeat) 프로모터, 아데노바이러스 초기 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 마우스 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터 및 설바이빈 (Survivin) 프로모터를 포함할 수 있다. The vector includes a promoter operable in animal cells, for example, mammalian cells. Suitable promoters according to an embodiment include promoters derived from mammalian virus and promoters derived from the genome of mammalian cells, such as CMV (Cytomegalovirus) promoter, U6 promoter and H1 promoter, MLV (Murine Leukemia Virus) LTR (Long terminal repeat) promoter, adenovirus early promoter, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, HSV tk promoter, RSV promoter, EF1 alpha promoter, metallotionine promoter, beta-actin promoter, Promoter of human IL-2 gene, promoter of human IFN gene, promoter of human IL-4 gene, promoter of human lymphotoxin gene, promoter of human GM-CSF gene, human phosphoglycerate kinase (PGK) promoter, mouse force Phoglycerate kinase (PGK) promoter and sulvivin promoter.
또한, 상기 벡터에서, 전술한 융합 단백질은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.In addition, in the vector, the above-described fusion protein may be operably linked to a promoter. As used herein, the term "operably linked" refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter, a signal sequence, or an array of transcriptional regulatory factor binding sites) and another nucleic acid sequence, thereby The regulatory sequence controls the transcription and/or translation of the other nucleic acid sequence.
또 다른 양상은 상기 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터를 포함하는, 숙주 세포를 제공한다. Another aspect provides a host cell comprising the fusion protein, polynucleotide, or vector.
상기 세포, 예를 들면, 진핵 세포는 효모, 곰팡이, 원생동물 (protozoa), 식물, 고등 식물 및 곤충, 또는 양서류의 세포, 또는 CHO, HeLa, HEK293, 및 COS-1과 같은 포유 동물의 세포일 수 있고, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 사용되는, 배양된 세포 (인 비트로), 이식된 세포 (graft cell) 및 일차 세포 배양 (인 비트로 및 엑스 비보(ex vivo)), 및 인 비보 (in vivo) 세포, 및 또한 인간을 포함하는 포유동물의 세포 (mammalian cell)일 수 있다. 또한, 상기 유기체는 효모, 곰팡이, 원생동물, 식물, 고등 식물 및 곤충, 양서류, 또는 포유 동물일 수 있다. 또한, 상기 세포는 동물 세포 또는 식물세포일 수 있다.Such cells, e.g., eukaryotic cells, are yeast, fungi, protozoa, plants, higher plants and insects, or cells of amphibians, or cells of mammals such as CHO, HeLa, HEK293, and COS-1. Can be, for example, cultured cells (in vitro), transplanted cells and primary cell cultures (in vitro and ex vivo), and in vivo ( in vivo) cells, and also mammalian cells, including humans. In addition, the organism may be yeast, fungi, protozoa, plants, higher plants and insects, amphibians, or mammals. In addition, the cells may be animal cells or plant cells.
또 다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 약물을 함유하는 약물 전달체를 제공한다.Another aspect is glutathione-S-transferase (GST); It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) or Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability; A linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having binding ability to a target cell or a target protein; And it provides a drug delivery system containing a drug conjugated to the glutathione-S-transferase.
또 다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 약물을 함유하는 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 약물을 전달하는 방법을 제공한다.Another aspect is glutathione-S-transferase (GST); It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) or Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability; A linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having binding ability to a target cell or a target protein; And it provides a method of delivering a drug in an individual comprising administering a composition containing the drug conjugated with the glutathione-S-transferase to an individual in need thereof.
일 구체예에 있어서, 상기 글루타치온-S-전이효소와 약물의 결합은 GSH(Glutathione)에 의한 것일 수 있다. 즉, 상기 약물은 GSH(Glutathione)가 결합된 약물일 수 있다. 상기 GSH는 글루타치온-S-전이효소의 결합 부위로 작용하여 약물과 글루타치온-S-전이효소를 연결할 수 있다. In one embodiment, the binding of the glutathione-S-transferase and the drug may be caused by GSH (Glutathione). That is, the drug may be a drug to which GSH (Glutathione) is bound. The GSH may act as a binding site of glutathione-S-transferase to link the drug and glutathione-S-transferase.
일 구체예에 있어서, 상기 약물은 PEG화(Pegylation) 또는 글리코실화(Glycosylation) 된 것일 수 있다.In one embodiment, the drug may be PEGylated or glycosylated.
본 명세서에서 용어 "PEG화(Pegylation)"은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 고분자 사슬을 약물, 치료 단백질 또는 소포와 같은 분자 및 거대 구조체로 공유 결합 및 비공유 결합 또는 융합시키는 과정이다. PEG 고분자는 선형, 가지형 등의 형태로 합성할 수 있으며, 말단을 하이드록시 또는 메톡시 그룹으로 합성 가능하며, 상업적으로는 50kDa까지 약물 개질화에 사용되고 있다. 대표적으로 N-말단 아민기 또는 라이신 잔기의 아민기가 친핵체로 작용하여 활성화된 PEG 고분자와 알킬화 또는 아크릴화 반응이 일어나 펩타이드 및 단백질의 개질화가 이루어지게 된다. 본 명세서에서는 VEGF, VEGFR 또는 TNF-alpha를 타겟하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합된 융합 단백질에, 선형 또는 가지형의 PEG 고분자를 glutathione(GSH)에 연결시킨 후 기질-효소간(enzyme-substrate)특이적 반응 결합을 이용하면, 비공유결합 방식으로 화학적 공정이 없이, 단백질 약물의 개질화가 가능하게 된다. As used herein, the term "pegylation" is a process of covalently and non-covalently bonding or fusing polyethylene glycol (PEG) polymer chains into molecules and macrostructures such as drugs, therapeutic proteins or vesicles. PEG polymers can be synthesized in the form of linear, branched, etc., and can be synthesized with a hydroxy or methoxy group at the end, and are commercially used for drug modification up to 50 kDa. Typically, the N-terminal amine group or the amine group of the lysine residue acts as a nucleophile, and an alkylation or acrylate reaction occurs with the activated PEG polymer, thereby modifying the peptide and protein. In the present specification, after linking a linear or branched PEG polymer to glutathione (GSH) to a target cell targeting VEGF, VEGFR or TNF-alpha or a fusion protein to which a protein having target protein binding ability is bound, the matrix-enzyme ( When enzyme-substrate) specific reaction binding is used, it is possible to modify protein drugs in a non-covalent binding method without chemical processes.
본 명세서에서 용어 "글리코실화(Glycosylation)은 글리코실기를 단백질 이나 다른 유기 분자에 부착시키는 효소 과정을 의미한다. 본 명세서에서는 VEGF, VEGFR 또는 TNF-alpha를 타겟하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질이 결합된 융합 단백질에, glutathione(GSH)에 연결된 Dextran, Hyaluronic acid, Polysialic acid를 기질-효소간특이적 반응 결합을 이용하여, 글리코실화된 단백질 약물을 제조한다. In the present specification, the term "Glycosylation" refers to an enzymatic process that attaches a glycosyl group to a protein or other organic molecule. In the present specification, a target cell targeting VEGF, VEGFR or TNF-alpha, or a protein having a target protein binding ability To this bound fusion protein, a glycosylated protein drug is prepared by using Dextran, Hyaluronic acid, and Polysialic acid linked to glutathione (GSH) using a substrate-enzyme specific reaction bond.
상기 PEG화 또는 글리코실화를 통하여 바이오약물의 반감기를 증가시키고, 병변근처에서 약효를 지속할 수 있게 하여, 약물 투여횟수를 줄이면서, 치료 비용절감과 치료 효과 증대시킬 수 있다.　 Through the PEGylation or glycosylation, the half-life of the biopharmaceutical can be increased and the drug effect can be sustained near the lesion, thereby reducing the number of drug administrations and increasing the treatment cost and treatment effect.
약물 전달체를 사용하여 개체 내로 전달할 수 있는 약학적 활성 성분의 종류는 항암제, 조영제(염료), 호르몬제, 항호르몬제, 비타민제, 칼슘제, 무기질 제제, 당류제, 유기산 제제, 단백질 아미노산 제제, 해독제, 효소 제제, 대사성 제제, 당뇨 병용제, 조직 부활 용약, 클로로필 제제, 색소제제, 종양 용약, 종양 치료제, 방사성 의약품, 조직 세포 진단제, 조직 세포 치료제, 항생 물질 제제, 항바이러스제, 복합항생물질제제, 화학요법제, 백신, 독소, 톡소이드, 항독소, 렙토스피라혈청, 혈액 제제, 생물학적 제제, 진통제, 면역원성 분자, 항히스타민제, 알레르기 용약, 비특이성 면역원 제제, 마취제, 각성제, 정신 신경 용제, 저분자 화합물, 핵산, 앱타머, 안티센스 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, siRNA 및 마이크로 RNA 등을 포함할 수 있다. Types of active pharmaceutical ingredients that can be delivered into an individual using a drug delivery system include anticancer agents, contrast agents (dyes), hormones, anti-hormones, vitamins, calcium agents, inorganic agents, saccharides, organic acids, protein amino acids, antidote, Enzyme preparations, metabolic preparations, diabetes combination preparations, tissue revitalization preparations, chlorophyll preparations, pigment preparations, tumor preparations, tumor treatments, radioactive medicines, tissue cell diagnostics, tissue cell treatments, antibiotic preparations, antiviral preparations, complex antibiotic preparations, Chemotherapeutic agents, vaccines, toxins, toxoids, antitoxins, leptospira serum, blood products, biological agents, analgesics, immunogenic molecules, antihistamines, drugs for allergies, nonspecific immunogenic agents, anesthetics, stimulants, psychotropic agents, small molecule compounds, nucleic acids , Aptamers, antisense nucleic acids, oligonucleotides, peptides, siRNAs and micro RNAs.
일 구체예에 있어서, 상기 약물은 황반 변성 치료제인 것일 수 있다.In one embodiment, the drug may be a treatment for macular degeneration.
또 다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 황반 변성 치료제를 포함하는 황반 변성 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Another aspect is glutathione-S-transferase (GST); It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), or tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability; A linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having the ability to bind to a target cell or a target protein; And it provides a pharmaceutical composition for preventing or treating macular degeneration comprising a therapeutic agent for macular degeneration combined with the glutathione-S-transferase.
또 다른 양상은 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 약물을 함유하는 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 황반 변성을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.Another aspect is glutathione-S-transferase (GST); It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) or Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability; A linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having binding ability to a target cell or a target protein; And it provides a method for preventing or treating macular degeneration comprising administering a composition containing a drug conjugated with glutathione-S-transferase to an individual in need thereof.
상기 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST), 혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 포함하는 융합 단백질, 및 상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커에 대해서는 상기한 바와 같다. Glutathione-S-transferase (GST), Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) or tumor necrosis factor-alpha (Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha) a fusion protein comprising a protein having a target cell or target protein-binding ability that specifically binds to, and a protein having the glutathione-S-transferase and target cell or target protein-binding ability The linker connecting to is as described above.
일 구체예에 있어서, 상기 황반 변성 치료제는 단백질 PEG화(Pegylation) 또는 글리코실화(Glycosylation) 된 것일 수 있다. 이에 대해서는 상기한 바와 같다.In one embodiment, the therapeutic agent for macular degeneration may be protein PEGylated or glycosylated. This is as described above.
일 구체예에 있어서, 상기 글루타치온-S-전이효소와 황반 변성 치료제의 결합은 GSH(Glutathione)에 의한 것일 수 있다. 즉, 상기 황반 변성 치료제는 GSH(Glutathione)가 결합된 것일 수 있다. 상기 GSH는 글루타치온-S-전이효소의 결합 부위로 작용하여 황반 변성 치료제와 글루타치온-S-전이효소를 연결할 수 있다. In one embodiment, the binding of the glutathione-S-transferase and the therapeutic agent for macular degeneration may be caused by GSH (Glutathione). That is, the macular degeneration therapeutic agent may be a combination of GSH (Glutathione). The GSH may act as a binding site of glutathione-S-transferase to link macular degeneration therapeutics and glutathione-S-transferase.
일 구체예에 있어서, 상기 황반 변성 치료제는 항섬유화(anti-fibrosis) 효과를 가지는 것일 수 있다.In one embodiment, the macular degeneration therapeutic agent may have an anti-fibrosis effect.
본 명세서에서 용어 "황반"은 망막의 중심부의 명칭으로, 주변부 시각과 대비적으로 중심부 시각을 담당한다. "황반 변성"은 노화-관련된 황반 변성 (AMD), 습성 AMD 또는 건성 AMD, 당뇨병성 황반 부종, 낭포성 황반 부종, 황반 원공, 황반 모세관확장증 등이 있다.In the present specification, the term "macular" is the name of the central part of the retina, and is responsible for central vision in contrast to peripheral vision. “Macular degeneration” includes age-related macular degeneration (AMD), wet AMD or dry AMD, diabetic macular edema, cystic macular edema, macular hole, macular telangiectasia, and the like.
AMD는 2가지 형태가 있는데, 건성 AMD는 망막과 맥락막(망막 아래 위치한 눈의 층) 사이의 세포 찌꺼기(드루젠)의 축적에 의해 야기되어, 광수용체 세포의 위축을 초래한다. 또다른 형태의 AMD는 습성 AMD로 맥락막 내 혈관의 비정상적인 성장에서 기인한다. 이와 같은 혈관은 누수되어 맥락막과 망막을 손상시킬 수 있다. AMD와 관련된 또 다른 용어에는 맥락막 신생혈관, 망막하 신생혈관, 삼출성 형태(exudative form) 및 원판상 변성이 포함된다. There are two forms of AMD, dry AMD is caused by the accumulation of debris (drusen) between the retina and the choroid (the layer of the eye located under the retina), resulting in atrophy of photoreceptor cells. Another form of AMD is wet AMD, which results from abnormal growth of blood vessels in the choroid. These blood vessels can leak and damage the choroid and retina. Other terms related to AMD include choroidal neovascularization, subretinal neovascularization, exudative form, and discotic degeneration.
본 명세서에서 용어 "항섬유화"는 섬유화, 즉 장기 또는 조직에 과도한 섬유 결합 조직이 형성되는 것을 억제하는 것을 의미한다. 이는 과도한 세포외 기질의 생성과 소멸이 조절되지 못하여 비이상적으로 쌓이게 되는 것으로써, 다양한 만성질환에서 나타나는 특징이다.As used herein, the term "antifibrotic" means to inhibit fibrosis, that is, the formation of excessive fibrous connective tissue in an organ or tissue. This is a characteristic that appears in various chronic diseases, as excessive generation and destruction of extracellular matrix is uncontrolled, resulting in abnormal accumulation.
일 구체예에 있어서, 상기 황반 변성 치료제는 MEK 저해제(Mitogen-activated protein kinase kinase inhibitor: MEK inhibitor), TGF-beta 저해제(Transforming growth factor beta inhibitor: TGF-beta inhibitor) 또는 ERK 저해제 (extracellular signal-regulated kinase inhibitor: ERK inhibitor)인 것일 수 있다.In one embodiment, the macular degeneration therapeutic agent is a MEK inhibitor (Mitogen-activated protein kinase kinase inhibitor: MEK inhibitor), a TGF-beta inhibitor (Transforming growth factor beta inhibitor: TGF-beta inhibitor), or an ERK inhibitor (extracellular signal-regulated). kinase inhibitor: ERK inhibitor).
또한, 상기 황반 변성 치료제는 라니비주맙(Ranibizumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 비니메티닙(Binimetinib), 셀루메티닙(Selumetinib), 갈루니서팁(Galunisertib), SB-431542, AG-126, 울릭서티닙 (Ulixertinib), DEL-22379, SC-1 (Pluripotin), VRT752271, FR180204, XMD8-92, XMD17-109, VX-11e 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.In addition, the treatment for macular degeneration is Ranibizumab, Bevacizumab, Binimetinib, Celumetinib, Galunisertib, SB-431542, AG-126, Ulixertinib, DEL-22379, SC-1 (Pluripotin), VRT752271, FR180204, XMD8-92, XMD17-109, VX-11e, and any one or more selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts thereof Can be.
본 명세서에서 용어 "MEK 저해제"는 mitogen-activated protein kinase kinase 효소인 MEK1 및 / 또는 MEK2 를 억제하는 화학 물질 또는 약물을 의미한다. NF-κB는 pro-inflammatory cytokines, chemokines, adhesion molecules, growth factors, acute phase proteins 등 염증 관련 유전자의 발현을 조절함으로써 염증 시그널 유지에 주요 역할을 하기 때문에, NF-κB를 저해하는 물질은 염증반응을 줄이고 섬유화도 경감시킨다. 따라서 이를 타켓팅하는 MEK 저해제를 의미할 수 있다. In the present specification, the term "MEK inhibitor" refers to a chemical substance or drug that inhibits MEK1 and/or MEK2, which are mitogen-activated protein kinase kinase enzymes. Because NF-κB plays a major role in maintaining inflammatory signals by regulating the expression of inflammation-related genes such as pro-inflammatory cytokines, chemokines, adhesion molecules, growth factors, and acute phase proteins, substances that inhibit NF-κB can cause inflammatory reactions. And reduce fibrosis. Therefore, it may mean a targeting MEK inhibitor.
용어 "TGF-beta 저해제"는 Transforming growth factor beta(TGF-beta)를 억제하는 화학 물질 또는 약물을 의미한다. TGF-beta는 손상된 조직의 복구를 시작하고 종결 시키는 핵심적인 cytokine으로서, 이 TGF-beta 발현이 조절되지 못하고 계속적으로 생산되면 조직의 과섬유화가 초래된다. 따라서 TGF-beta를 타겟팅하는 TGF-beta 저해제를 의미할 수 있다. The term "TGF-beta inhibitor" refers to a chemical or drug that inhibits Transforming growth factor beta (TGF-beta). TGF-beta is a key cytokine that starts and terminates the repair of damaged tissue. If the expression of TGF-beta is not regulated and it is continuously produced, tissue hyperfibrosis is caused. Therefore, it may mean a TGF-beta inhibitor targeting TGF-beta.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 포유동물은 쥣과, 원숭이, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 애완동물을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 생체내에서 수득되거나 시험관내에서 배양된 생물학적 엔티티(entity)의 조직, 세포 및 그들의 자손도 또한 포함된다.The terms “subject”, “individual” and “patient” are used interchangeably herein to refer to a vertebrate, preferably a mammal, more preferably a human. Mammals include, but are not limited to, murines, monkeys, humans, farm animals, sports animals and pets. Tissues, cells and their progeny of biological entities obtained in vivo or cultured in vitro are also included.
용어 "치료제" 또는 "약학적 조성물"는, 대상체로의 투여 시에 몇몇 유리한 효과를 부여하는 분자 또는 화합물을 지칭한다. 유리한 효과는 진단적 결정을 가능하게 하는 것; 질병, 증상, 장애 또는 병태의 개선; 질병, 증상, 장애 또는 질환의 발병의 감소 또는 예방; 및 일반적으로 질병, 증상, 장애 또는 병태의 대응을 포함한다. The term “therapeutic agent” or “pharmaceutical composition” refers to a molecule or compound that imparts several beneficial effects upon administration to a subject. The beneficial effect is to enable diagnostic decisions; Improvement of a disease, symptom, disorder or condition; Reducing or preventing the onset of a disease, symptom, disorder or condition; And the response of a disease, symptom, disorder or condition in general.
본원에 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화하는" 또는 "개선하는"은 상호교환가능하게 사용된다. 이들 용어는 치료 이익 및/또는 예방 이익을 포함하나 이들에 한정되지 않는 유리한 또는 요망되는 결과를 수득하는 방법을 지칭한다. 치료 이익은 치료 하의 하나 이상의 질병, 질환 또는 증상의 임의의 치료적으로 유의미한 개선 또는 그에 대한 효과를 의미한다. 예방 이익에 있어서, 조성물은 특정 질병, 질환 또는 증상이 발생할 위험이 있는 대상체에게 또는 질병, 질환 또는 증상이 아직 나타나지 않을지라도, 질병의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상체에게 투여될 수 있다.As used herein, “treatment” or “treating” or “relaxing” or “improving” are used interchangeably. These terms refer to methods of obtaining beneficial or desired results, including, but not limited to, therapeutic benefits and/or prophylactic benefits. A therapeutic benefit refers to any therapeutically significant improvement or effect thereon of one or more diseases, disorders or symptoms under treatment. In a prophylactic benefit, the composition may be administered to a subject at risk of developing a particular disease, condition or symptom, or to a subject reporting one or more physiological symptoms of the disease, even if the disease, condition or symptom is not yet present.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 유리한 또는 요망되는 결과를 야기하기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 치료되는 대상체 및 병태, 대상체의 체중 및 연령, 병태의 중증도, 투여 방식 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 상기 용어는 본원에 기술된 영상화 방법 중 임의의 것에 의한 검출을 위한 이미지를 제공할 용량에 적용된다. 특정 용량은 선택된 특정 작용제, 뒤따르는 투여 요법, 그것이 다른 화합물과 병용하여 투여되는지 여부, 투여 시기, 영상화되는 조직 및 그것을 운반하는 신체 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.The term “effective amount” or “therapeutically effective amount” refers to an amount of an agent sufficient to produce an advantageous or desired result. The therapeutically effective amount may vary according to one or more of the subject and condition to be treated, the weight and age of the subject, the severity of the condition, the mode of administration, and the like, which can be easily determined by those skilled in the art. Further, the term applies to the capacity to provide an image for detection by any of the imaging methods described herein. The specific dosage may vary depending on one or more of the particular agent selected, the dosage regimen that follows, whether it is administered in combination with other compounds, the timing of administration, the tissue being imaged, and the body delivery system carrying it.
상기 약학적 조성물은 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(Nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.The pharmaceutical composition can be administered parenterally during clinical administration and can be used in the form of a general pharmaceutical formulation. Parenteral administration may mean administration through a route other than oral administration such as rectal, intravenous, peritoneal, muscle, arterial, transdermal, nasal, inhalation, ocular and subcutaneous. When using the pharmaceutical composition of the present invention as a pharmaceutical, it may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions.
상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. When formulating the pharmaceutical composition, it is prepared by using a diluent or excipient such as a commonly used filler, extender, binder, wetting agent, disintegrant, and surfactant. Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories. As the non-aqueous solvent and the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used. As a base for the suppository, Witepsol, Macrogol, Tween 61, cacao butter, liurinji, glycerogelatin, and the like may be used.
또한, 상기 약학적 조성물은 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(Carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(Ascorbic acid) 또는 글루타치온(Glutathione)과 같은 항산화제(Antioxidants), 킬레이트화제(Chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(Stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition may be used by mixing with various carriers (Carriers) allowed as drugs such as physiological saline or organic solvents, and carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, ascorbic acid in order to increase stability or absorption. Antioxidants such as (Ascorbic acid) or glutathione, chelating agents, small molecule proteins or other stabilizers can be used as drugs.
상기 약학적 조성물의 유효용량은 0.01 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.The effective dose of the pharmaceutical composition is 0.01 to 100 mg/kg, preferably 0.1 to 10 mg/kg, and may be administered once to three times a day.
일 양상에 따른 융합 단백질 및 그를 포함하는 약물 전달체에 의하면, 생체 내 잔존 시간을 지속시킬 수 있을 뿐 아니라, 표적 세포로의 표적능이 향상되어 타겟으로 하는 세포로 효과적으로 전달될 수 있으므로, 표적 치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다. According to the fusion protein and the drug delivery system comprising the same according to an aspect, not only can the remaining time in the living body be sustained, but also the targeting ability to the target cell is improved and can be effectively delivered to the target cell, so it is useful as a target therapeutic agent. There is an effect that can be used in a way.
도 1은 VEGFR2, VEGF-A 또는 TNF-alpha 표적 아피바디와 글루타치온-S-전이효소(GST)가 결합된 항체모방 재조합 융합 단백질 약물 구조를 나타낸다. 1 shows the drug structure of an antibody-mimicking recombinant fusion protein in which VEGFR2, VEGF-A or TNF-alpha target afibody and glutathione-S-transferase (GST) are bound.
도 2는 VEGF 항체모방 재조합 융합 단백질 약물의 구조 및 이 약물이 VEGF를 저해하여 신혈관생성 활성화를 억제함으로써 황반변성 병변을 완화하는 약물기전 모식도를 나타낸다. Fig. 2 shows a schematic diagram of the structure of a VEGF antibody-mimicking recombinant fusion protein drug and a drug mechanism that alleviates macular degenerative lesions by inhibiting VEGF and inhibiting the activation of neovascularization.
도 3은 VEGFR 항체모방 재조합 융합 단백질 약물의 구조 및 이 약물이 VEGFR에 결합하여 신혈관생성 활성화를 억제함으로써 황반변성 병변을 완화하는 약물기전 모식도를 나타낸다. FIG. 3 shows a schematic diagram of the structure of a VEGFR antibody-mimicking recombinant fusion protein drug and a drug mechanism that mitigates macular degenerative lesions by binding to VEGFR and inhibiting the activation of neovascularization.
도 4는 GST-VEGFR2 Afb를 합성한 후 컬럼 크로마토그래피 및 SDS-PAGE 분석을 통해 확인한 결과이다.4 is a result of synthesizing GST-VEGFR2 Afb and confirmed through column chromatography and SDS-PAGE analysis.
도 5는 GST-VEGF-A Afb를 합성한 후 컬럼 크로마토그래피 및 SDS-PAGE 분석을 통해 확인한 결과이다.5 is a result of synthesizing GST-VEGF-A Afb and confirmed through column chromatography and SDS-PAGE analysis.
도 6는 GST-TNF-alpha Afb를 합성한 후 컬럼 크로마토그래피 및 SDS-PAGE 분석을 통해 확인한 결과이다.6 is a result of synthesizing GST-TNF-alpha Afb and confirmed through column chromatography and SDS-PAGE analysis.
도 7은 GST-VEGFR2 Afb 또는 GST-TNF-alpha Afb을 2 μg/μl 처리한 경우 맥락막신생혈관 생성 저해 효과를 확인한 이미지이다.7 is an image confirming the effect of inhibiting choroidal neovascularization when 2 μg/μl of GST-VEGFR2 Afb or GST-TNF-alpha Afb is treated.
도 8은 GST-VEGFR2 Afb 또는 GST-TNF-alpha Afb를 2 μg/μl 처리한 경우 맥락막신생혈관 부피를 나타낸 그래프이다.8 is a graph showing the volume of choroidal neovascularization when 2 μg/μl of GST-VEGFR2 Afb or GST-TNF-alpha Afb is treated.
도 9는 GST-VEGF-A Afb를 2 μg/μl 또는 20 μg/μl 처리한 경우 맥락막신생혈관 생성 저해 효과를 확인한 이미지이다.9 is an image confirming the effect of inhibiting choroidal neovascularization when 2 μg/μl or 20 μg/μl of GST-VEGF-A Afb is treated.
도 10은 GST-VEGF-A Afb를 2 μg/μl 또는 20 μg/μl 처리한 경우 맥락막신생혈관 부피를 나타낸 그래프이다.10 is a graph showing the volume of choroidal neovascularization when 2 μg/μl or 20 μg/μl of GST-VEGF-A Afb is treated.
도 11은 GST-TNF-alpha Afb 또는 GST-VEGFR2 Afb를 20 μg/μl 처리한 경우 맥락막신생혈관 생성 저해 효과를 확인한 이미지이다.11 is an image confirming the effect of inhibiting choroidal neovascularization when 20 μg/μl of GST-TNF-alpha Afb or GST-VEGFR2 Afb is treated.
도 12는 GST-TNF-alpha Afb 또는 GST-VEGFR2 Afb를 20 μg/μl 처리한 경우 맥락막신생혈관 부피를 나타낸 그래프이다.12 is a graph showing the volume of choroidal neovascularization when 20 μg/μl of GST-TNF-alpha Afb or GST-VEGFR2 Afb is treated.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are for illustrative purposes only, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.
실시예 1. 혈관 내피 성장인자 A(Vascular endothelial growth factor A: VEGF-A), 혈관 내피 성장인자 수용체 2(Vascular endothelial growth factor receptor 2: VEGFR2) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 애피바디(affibody) 및 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST) 융합 단백질의 제조Example 1. Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A), vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or tumor necrosis factor-alpha (Tumor necrosis factor-alpha: Preparation of affibody and glutathione-S-transferase (GST) fusion protein that specifically binds to TNF-alpha)
본 발명에서는 혈관 내피 성장인자 A(Vascular endothelial growth factor A: VEGF-A), 혈관 내피 성장인자 수용체 2(Vascular endothelial growth factor receptor 2: VEGFR2) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 융합 단백질을 제조하고자 하였다. 융합 단백질은 VEGFR2, VEGF-A, TNF-alpha에 특이적으로 결합할 수 있는 애피바디(affibody, Afb)와 GST가 결합된 형태가 되도록 발현하였다.In the present invention, Vascular endothelial growth factor A (VEGF-A), Vascular endothelial growth factor receptor 2: VEGFR2 or tumor necrosis factor-alpha (Tumor necrosis factor-alpha: TNF -alpha) specifically binding to target cells or fusion proteins having target protein binding ability. The fusion protein was expressed so that an affibody (Afb) capable of specifically binding to VEGFR2, VEGF-A, and TNF-alpha and GST were combined.
구체적으로, 본 발명에서는 Afb로서 VEGFR2 에 특이적으로 결합하는 VEGFR2 Afb, VEGF-A 에 특이적으로 결합하는 VEGF-A Afb 및 TNF-alpha 에 특이적으로 결합하는 TNF-alpha Afb 를 사용하였다. 여기서 VEGFR2 Afb는 서열번호 13으로 이루어진 펩티드, VEGF-A Afb는 서열번호 14로 이루어진 펩티드, TNF-alpha Afb는 서열번호 15로 이루어진 펩티드를 사용하였다. 각각의 VEGFR2 Afb, VEGF-A Afb 또는 TNF-alpha Afb를 암호화하는 유전자의 말단에 추가 링커 도메인(서열번호 1: SGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGG)을 암호화하는 유전자를 결합시킨 다음, pBT7플라스미드에 삽입하였다. 또한, GST 과발현을 위해서 GST의 N-말단에 6×His 태그가 연결되도록 디자인한 GST 암호화 유전자를 상기 pBT7 플라스미드에 삽입하여, Afb와 GST가 링커로 연결된 융합 단백질(GST-Afb)의 과발현을 위한 플라스미드를 구축하였다. 구축된 플라스미드에서 PCR 및 DNA 서열분석을 통해 GST-Afb 암호화 서열이 정상적으로 삽입되었는지 확인하였다. 그런 다음, 구축된 플라스미드를 E. coli BL21(DE3) 균주에 삽입하여 배양한 다음, IPTG를 처리하고 30 ℃에서 16 시간 동안 배양하여 GST-Afb의 과발현을 유도하였다. 과발현 유도된 E. coli 세포는 5000×g로 4 ℃에서 10 분간 원심분리하여 침전된 세포를 수득하고, 인산염 완충용액(50 mM 인산 나트륨 및 100 mM 염화 나트륨, pH 6.5)에 세포를 현탁하였다. 세포 현탁액에 리소자임(lysozyme)을 처리하고 20 분간 실온에서 배양한 다음, 30 초 파쇄 및 1 분 간격으로 총 10 분가 초음파 파쇄하였다. 파쇄 후, 12000×g로 4℃에서 1 시간 동안 원심분리하여 상층액을 GST-Afb 포함 분획으로서 수득하였다. 상층액은 FPLC를 이용한 금속이온 친화 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography; 1mL HisTrap FF 컬럼, GE HealthCare)로 정제하여 GST-Afb을 분리하였다. 분리한 GST-Afb는 PBS(pH 7.4)에서 밤새도록 투석하여 농축하였다. 농축한 GST-VEGFR2 Afb, GST-VEGF-A Afb 및 GST-TNF-alpha Afb는, SDS-PAGE 분석 통해 분리한 단백질의 순도 및 분자량을 분석하였다.Specifically, in the present invention, as Afb, VEGFR2 Afb that specifically binds to VEGFR2, VEGF-A Afb that specifically binds to VEGF-A, and TNF-alpha Afb that specifically binds to TNF-alpha were used. Here, VEGFR2 Afb is a peptide consisting of SEQ ID NO: 13, VEGF-A Afb is a peptide consisting of SEQ ID NO: 14, and TNF-alpha Afb is a peptide consisting of SEQ ID NO: 15. A gene encoding an additional linker domain (SEQ ID NO: 1: SGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGG) was coupled to the end of the gene encoding each VEGFR2 Afb, VEGF-A Afb or TNF-alpha Afb, and then inserted into the pBT7 plasmid. In addition, for GST overexpression, a GST-encoding gene designed to connect a 6×His tag to the N-terminus of GST was inserted into the pBT7 plasmid, so that Afb and GST were linked by a linker for overexpression of Construct a plasmid. It was confirmed whether the GST-Afb coding sequence was inserted normally through PCR and DNA sequencing in the constructed plasmid. Then, the constructed plasmid was inserted into the E. coli BL21 (DE3) strain and cultured, and then treated with IPTG and cultured at 30° C. for 16 hours to induce overexpression of GST-Afb. The overexpression-induced E. coli cells were centrifuged at 5000×g at 4° C. for 10 minutes to obtain precipitated cells, and the cells were suspended in a phosphate buffer solution (50 mM sodium phosphate and 100 mM sodium chloride, pH 6.5). The cell suspension was treated with lysozyme and incubated for 20 minutes at room temperature, followed by disruption for 30 seconds and ultrasonic disruption for a total of 10 minutes at 1 minute intervals. After crushing, centrifugation was performed at 12000×g at 4° C. for 1 hour to obtain a supernatant as a GST-Afb-containing fraction. The supernatant was purified by immobilized metal affinity chromatography (1mL HisTrap FF column, GE HealthCare) using FPLC to separate GST-Afb. The isolated GST-Afb was concentrated by dialysis in PBS (pH 7.4) overnight. Concentrated GST-VEGFR2 Afb, GST-VEGF-A Afb, and GST-TNF-alpha Afb were analyzed for purity and molecular weight of the separated protein through SDS-PAGE analysis.
그 결과, 도 4 내지 도 6에서 나타난 바와 같이 GST-VEGFR2 Afb, GST-VEGF-A Afb 및 GST-TNF-alpha Afb를 발현하고 이의 분자량을 확인하였다. 금속이온 친화 크로마토그래피로 분리한 분획층을 SDS 분석하였을 때 GST-VEGFR2 Afb, GST-VEGF-A Afb 및 GST-TNF-alpha Afb 을 각각 99.0% 이상의 순도로 정제할 수 있음을 확인하였으며, 이의 분자량 분석을 하였을 때 GST-VEGFR2 Afb 및 GST-VEGF-A Afb는 약 33.7 kD이고 GST-TNF-alpha Afb는 약 35 kD임을 확인하였다 (도 4 내지 도 6).As a result, as shown in Figs. 4 to 6, GST-VEGFR2 Afb, GST-VEGF-A Afb, and GST-TNF-alpha Afb were expressed and their molecular weight was confirmed. When the fractionation layer separated by metal ion affinity chromatography was analyzed by SDS, it was confirmed that GST-VEGFR2 Afb, GST-VEGF-A Afb, and GST-TNF-alpha Afb can be purified with a purity of 99.0% or more, respectively, and their molecular weight When analyzed, it was confirmed that GST-VEGFR2 Afb and GST-VEGF-A Afb were about 33.7 kD and GST-TNF-alpha Afb was about 35 kD (FIGS. 4 to 6).
도 4는 GST-VEGFR2 Afb를 합성한 후 컬럼 크로마토그래피 및 SDS-PAGE 분석을 통해 확인한 결과이다.4 is a result of synthesizing GST-VEGFR2 Afb and confirmed through column chromatography and SDS-PAGE analysis.
도 5는 GST-VEGF-A Afb를 합성한 후 컬럼 크로마토그래피 및 SDS-PAGE 분석을 통해 확인한 결과이다.5 is a result of synthesizing GST-VEGF-A Afb and confirmed through column chromatography and SDS-PAGE analysis.
도 6는 GST-TNF-alpha Afb를 합성한 후 컬럼 크로마토그래피 및 SDS-PAGE 분석을 통해 확인한 결과이다.6 is a result of synthesizing GST-TNF-alpha Afb and confirmed through column chromatography and SDS-PAGE analysis.
실시예 2. 융합 단백질 GST-VEGFR2 Afb, GST-VEGF-A Afb 및 GST-TNF-alpha Afb의 맥락막신생혈관 생성 저해 효과 확인Example 2. Confirmation of the inhibitory effect of fusion proteins GST-VEGFR2 Afb, GST-VEGF-A Afb and GST-TNF-alpha Afb on choroidal neovascularization
9 주령의 C57BL/6N 마우스를 마취시키고 국소 마취 및 동공 확장을 위해 국소 0.5 % 프로파라카인 및 트로페린을 각각 눈에 떨어뜨린 다음, 마우스에 레이저 광 응고술을 적용하였다. 레이저 광 응고기가 장착된 슬릿 램프 전달 시스템(532 nm 레이저, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany)은 200mW, 0.1 초 지속 시간 및 50μm 스팟 크기 설정으로 사용되었다. 콘택트 렌즈로서 사용되는 직경 12 mm의 커버 슬립을 갖는 각각의 윤활된 (하이프로멜로오스를 갖는) 눈에서 시신경 헤드 주위에 3 개의 레이저 스팟을 만들었다. 기체 기포는 Bruch 막의 파괴를 확인시켜 주었으며, 기포를 생성한 레이저 스팟만 연구에 포함되었다. 비히클, Eylea 또는 GST-VEGFR2 Afb, GST-VEGF-A Afb 및 GST-TNF-alpha Afb (2 ~ 20 ng/㎕)의 유리체내 주사는 레이저 처리 직후에 수행되었다.Nine-week-old C57BL/6N mice were anesthetized, and local 0.5% proparacaine and troperin were respectively dropped into the eyes for local anesthesia and pupil dilation, and then laser light coagulation was applied to the mice. A slit lamp delivery system (532 nm laser, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany) equipped with laser light coagulation was used with 200 mW, 0.1 second duration and 50 μm spot size settings. Three laser spots were made around the optic nerve head in each lubricated (with hypromellose) eye with a 12 mm diameter cover slip used as a contact lens. The gas bubbles confirmed the destruction of the Bruch membrane, and only the laser spots that generated the bubbles were included in the study. Intravitreal injection of vehicle, Eylea or GST-VEGFR2 Afb, GST-VEGF-A Afb and GST-TNF-alpha Afb (2-20 ng/µl) was performed immediately after laser treatment.
형광 혈관 조영 이미지는 HRA2 (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)로 레이저 처리한 후 7 일에 촬영되었다. 10 % 플루오레세인 나트륨 (Alcon)을 복강 (5 ml/kg)에 주사한 후 5 분 후에, 후기 FA 이미지를 캡처하였다. FITC-덱스트란 (5 mg/kg)을 형광 표지를 위해 정맥 주사하였다. 3 분 후, 마우스를 안락사시키고, 눈을 추출하였다. 안구 및 신경 망막의 전방 세그먼트는 RPE/맥락막 조직으로부터 즉시 분리되었다. RPE/맥락막 조직을 4 % PFA로 30 분 동안 고정시키고 PBS로 3 회 세척하였다. RPE/맥락막 조직을 4 개의 완화 방사형 절개 (relaxing radial incisions)로 절단하고 아쿠아 폴리/마운트 (# 18606-20, Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA)에 평평하게 고정시켰다. 공 초점 레이저 스캐닝 현미경 (FluoView 1000; Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 Z-섹션 이미지를 캡처하였다. z-섹션된 이미지는 이미지 분석 소프트웨어 (Metamorph; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 재구성되고 정량화되었다.Fluorescent angiographic images were taken 7 days after laser treatment with HRA2 (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany). 5 minutes after injection of 10% sodium fluorescein (Alcon) into the peritoneal cavity (5 ml/kg), late FA images were captured. FITC-dextran (5 mg/kg) was injected intravenously for fluorescent labeling. After 3 minutes, the mice were euthanized and the eyes were extracted. The anterior segment of the eye and neural retina was immediately separated from the RPE/choroid tissue. RPE/choroid tissue was fixed with 4% PFA for 30 minutes and washed 3 times with PBS. RPE/choroid tissue was cut into four relaxing radial incisions and fixed flat on Aqua Poly/Mount (#18606-20, Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA). Z-section images were captured using a confocal laser scanning microscope (FluoView 1000; Olympus, Tokyo, Japan). The z-sectioned images were reconstructed and quantified using image analysis software (Metamorph; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
그 결과, 맥락막신생혈관의 부피를 비교해 보았을 때, GST-TNF-alpha Afb을 2 μg/μl 처리한 경우 맥락막신생혈관생성 억제 효과는 Eylea를 2 μg/μl 처리한 경우와 유사한 유효성을 나타냈고, GST-VEGFR2 Afb를 2 μg/μl 처리한 경우에는 Eylea를 대비 약 2배 더 효과적임을 나타냈다 (도 7 및 도 8). 또한 GST-VEGF-A Afb를 2 μg/μl 또는 20 μg/μl 처리한 경우에는 Eylea를 2 μg/μl 처리한 경우와 유사한 유효성을 나타냈고 (도 9 및 도 10), GST-TNF-alpha Afb을 20 μg/μl 처리한 경우 및 GST-VEGFR2 Afb를 20 μg/μl 처리한 경우에는 Eylea를 처리한 경우와 유사한 유효성을 나타냈다 (도 11 및 도 12).As a result, when comparing the volume of choroidal neovascularization, when 2 μg/μl of GST-TNF-alpha Afb was treated, the inhibitory effect on choroidal neovascularization was similar to that of 2 μg/μl of Eylea. When 2 μg/μl of GST-VEGFR2 Afb was treated, it was shown to be about 2 times more effective than Eylea (FIGS. 7 and 8 ). In addition, when GST-VEGF-A Afb was treated with 2 μg/μl or 20 μg/μl, the efficacy was similar to that of Eylea treated with 2 μg/μl (FIGS. 9 and 10 ), and GST-TNF-alpha Afb When treated with 20 μg/μl and 20 μg/μl of GST-VEGFR2 Afb showed similar efficacy to the case of Eylea treatment (FIGS. 11 and 12 ).
이와 같이 융합 단백질을 처리한 그룹에서 음성 대조군 대비 통계적으로 유의하게 맥락막신생혈관의 부피가 현저하게 감소한 것이 관찰되어, 융합 단백질이 효과적으로 맥락막신생혈관 생성을 저해함을 나타낸다.As such, it was observed that the volume of choroidal neovascularization was significantly decreased statistically significantly compared to the negative control group in the group treated with the fusion protein, indicating that the fusion protein effectively inhibited the production of choroidal neovascularization.
도 7은 GST-VEGFR2 Afb 또는 GST-TNF-alpha Afb을 2 μg/μl 처리한 경우 맥락막신생혈관 생성 저해 효과를 확인한 이미지이다.7 is an image confirming the effect of inhibiting choroidal neovascularization when 2 μg/μl of GST-VEGFR2 Afb or GST-TNF-alpha Afb is treated.
도 8은 GST-VEGFR2 Afb 또는 GST-TNF-alpha Afb를 2 μg/μl 처리한 경우 맥락막신생혈관 부피를 나타낸 그래프이다.8 is a graph showing the volume of choroidal neovascularization when 2 μg/μl of GST-VEGFR2 Afb or GST-TNF-alpha Afb is treated.
도 9는 GST-VEGF-A Afb를 2 μg/μl 또는 20 μg/μl 처리한 경우 맥락막신생혈관 생성 저해 효과를 확인한 이미지이다.9 is an image confirming the effect of inhibiting choroidal neovascularization when 2 μg/μl or 20 μg/μl of GST-VEGF-A Afb is treated.
도 10은 GST-VEGF-A Afb를 2 μg/μl 또는 20 μg/μl 처리한 경우 맥락막신생혈관 부피를 나타낸 그래프이다.10 is a graph showing the volume of choroidal neovascularization when 2 μg/μl or 20 μg/μl of GST-VEGF-A Afb is treated.
도 11은 GST-TNF-alpha Afb 또는 GST-VEGFR2 Afb를 20 μg/μl 처리한 경우 맥락막신생혈관 생성 저해 효과를 확인한 이미지이다.11 is an image confirming the effect of inhibiting choroidal neovascularization when 20 μg/μl of GST-TNF-alpha Afb or GST-VEGFR2 Afb is treated.
도 12는 GST-TNF-alpha Afb 또는 GST-VEGFR2 Afb를 20 μg/μl 처리한 경우 맥락막신생혈관 부피를 나타낸 그래프이다.12 is a graph showing the volume of choroidal neovascularization when 20 μg/μl of GST-TNF-alpha Afb or GST-VEGFR2 Afb is treated.

Claims (14)

  1. 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); Glutathione-S-transferase (GST);
    혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; 및 It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), or tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability; And
    상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커를 포함하는 융합 단백질. A fusion protein comprising a linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having a target cell or target protein binding ability.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질은 항체, 항원 결합 단편, 애피바디(affibody), 다이아바디(diabody) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 융합 단백질. The method according to claim 1, wherein the target cell or protein having a target protein binding ability is any one selected from the group consisting of an antibody, an antigen-binding fragment, an affibody, a diabody, and an aptamer. Fusion protein.
  3. 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); Glutathione-S-transferase (GST);
    혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), or tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability;
    상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및 A linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having the ability to bind to a target cell or a target protein; And
    상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 약물을 함유하는 약물 전달체. A drug delivery system containing a drug conjugated to the glutathione-S-transferase.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 글루타치온-S-전이효소와 약물의 결합은 GSH(Glutathione)에 의한 것인 약물 전달체. The drug delivery system according to claim 3, wherein the binding of the glutathione-S-transferase and the drug is by GSH (Glutathione).
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 약물은 PEG화(Pegylation) 또는 글리코실화(Glycosylation) 된 것인 융합 단백질.The fusion protein of claim 3, wherein the drug is PEGylated or glycosylated.
  6. 청구항 3에 있어서, 상기 약물은 황반 변성 치료제인 것인 약물 전달체. The drug delivery system according to claim 3, wherein the drug is a therapeutic agent for macular degeneration.
  7. 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); Glutathione-S-transferase (GST);
    혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), or tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability;
    상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; 및 A linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having the ability to bind to a target cell or a target protein; And
    상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 황반 변성 치료제를 포함하는 황반 변성 예방 또는 치료용 약학적 조성물. A pharmaceutical composition for preventing or treating macular degeneration comprising a therapeutic agent for macular degeneration combined with the glutathione-S-transferase.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 글루타치온-S-전이효소와 황반 변성 치료제의 결합은 GSH(Glutathione)에 의한 것인 황반 변성 예방 또는 치료용 약학적 조성물.The pharmaceutical composition for preventing or treating macular degeneration according to claim 7, wherein the binding of the glutathione-S-transferase and the therapeutic agent for macular degeneration is by GSH (Glutathione).
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 황반 변성 치료제는 단백질 PEG화(Pegylation) 또는 글리코실화(Glycosylation) 된 것인 융합 단백질.The fusion protein of claim 7, wherein the macular degeneration therapeutic agent is protein PEGylated or glycosylated.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 황반 변성 치료제는 항섬유화(anti-fibrosis) 효과를 가지는 것인 황반 변성 예방 또는 치료용 약학적 조성물.The pharmaceutical composition for preventing or treating macular degeneration according to claim 7, wherein the macular degeneration therapeutic agent has an anti-fibrosis effect.
  11. 청구항 7에 있어서, 상기 황반 변성 치료제는 MEK 저해제(Mitogen-activated protein kinase kinase inhibitor: MEK inhibitor), TGF-beta 저해제(Transforming growth factor beta inhibitor: TGF-beta inhibitor) 또는 ERK 저해제 (extracellular signal-regulated kinase inhibitor: ERK inhibitor)인 것인 황반 변성 예방 또는 치료용 약학적 조성물.The method of claim 7, wherein the macular degeneration therapeutic agent is a MEK inhibitor (Mitogen-activated protein kinase kinase inhibitor: MEK inhibitor), a TGF-beta inhibitor (Transforming growth factor beta inhibitor: TGF-beta inhibitor), or an ERK inhibitor (extracellular signal-regulated kinase). inhibitor: ERK inhibitor) is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of macular degeneration.
  12. 청구항 7에 있어서, 상기 황반 변성 치료제는 라니비주맙(Ranibizumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 비니메티닙(Binimetinib), 셀루메티닙(Selumetinib), 갈루니서팁(Galunisertib), SB-431542, AG-126, 울릭서티닙 (Ulixertinib), DEL-22379, SC-1 (Pluripotin), VRT752271, FR180204, XMD8-92, XMD17-109, VX-11e 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인 황반 변성 예방 또는 치료용 약학적 조성물.The method of claim 7, wherein the macular degeneration therapeutic agent is Ranibizumab, Bevacizumab, Binimetinib, Celumetinib, Galunisertib, SB-431542, AG -126, Ulixertinib, DEL-22379, SC-1 (Pluripotin), VRT752271, FR180204, XMD8-92, XMD17-109, VX-11e and selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts thereof Any one or more of a pharmaceutical composition for preventing or treating macular degeneration.
  13. 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); Glutathione-S-transferase (GST);
    혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), or tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability;
    상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; A linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having binding ability to a target cell or a target protein;
    및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 약물을 함유하는 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 약물을 전달하는 방법.And administering a composition containing the drug conjugated with the glutathione-S-transferase to an individual in need thereof.
  14. 글루타치온-S-전이효소(glutathione-S-transferase, GST); Glutathione-S-transferase (GST);
    혈관 내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF), 혈관 내피 성장인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR) 또는 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha: TNF-alpha)에 특이적으로 결합하는 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질; It specifically binds to Vascular endothelial growth factor (VEGF), Vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), or tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha). A protein having a target cell or target protein binding ability;
    상기 글루타치온-S-전이효소와 표적 세포 또는 표적 단백질 결합능을 갖는 단백질을 연결하는 링커; A linker connecting the glutathione-S-transferase and a protein having binding ability to a target cell or a target protein;
    및 상기 글루타치온-S-전이효소와 결합된 약물을 함유하는 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 황반 변성을 예방하거나 치료하는 방법.And administering a composition containing a drug conjugated to glutathione-S-transferase to a subject in need thereof.
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