WO2020230601A1 - Kit including primer dna set for detecting mitochondrial ribosomal rna mutation, nucleic acid for expressing mitochondrial ribosomal rna, lipid membrane structure obtained by encapsulating the nucleic acid, and uses of these - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a kit for detecting a point mutation of mitochondrial DNA or a corresponding point mutation of mitochondrial ribosomal RNA including a primer DNA set for wild type detection and a primer DNA set for mutant type detection, a mitochondria-targeted lipid membrane structure obtained by encapsulating a nucleic acid including a base sequence of mitochondrial ribosomal RNA or a base sequence complementary thereto, a pharmaceutical composition containing said nucleic acid as an active ingredient, and a method for producing a cell formulation for treating and/or preventing mitochondrial disease that includes introducing said nucleic acid in vitro into cells derived from a mitochondrial disease patient or a person at risk for developing mitochondrial disease.

Description

ミトコンドリアリボソームＲＮＡ変異検出用プライマーＤＮＡセットを含むキット、ミトコンドリアリボソームＲＮＡ発現用核酸、前記核酸を封入してなる脂質膜構造体及びそれらの利用Kit containing primer DNA set for mitochondrial ribosomal RNA mutation detection, nucleic acid for mitochondrial ribosomal RNA expression, lipid membrane structure comprising the nucleic acid, and utilization thereof
　本発明は、ミトコンドリアリボソームＲＮＡ（以下、ｍｔ－ｒＲＮＡと表す。）である１２ＳリボソームＲＮＡ（以下、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡと表す。）の点変異を検出するためのプライマーＤＮＡセットを含むキットに関する。本発明はまた、細胞内でＲＮＡを発現させるための核酸、これを封入（内包）してなる細胞導入用脂質膜構造体、および、前記核酸及び前記脂質膜構造体の医薬組成物における及び細胞製剤の製造における使用に関する。本発明はさらに、ミトコンドリア内でｍｔ－ｒＲＮＡを発現させるための核酸、これを封入してなるミトコンドリア指向性脂質膜構造体、並びに前記核酸及び前記脂質膜構造体の医薬組成物における及び細胞製剤の製造における使用に関する。 The present invention relates to a kit containing a primer DNA set for detecting point mutations in 12S ribosomal RNA (hereinafter referred to as mt-12S rRNA), which is mitochondrial ribosomal RNA (hereinafter referred to as mt-rRNA). The present invention also relates to a nucleic acid for expressing RNA in a cell, a lipid membrane structure for cell introduction formed by encapsulating (encapsulating) the nucleic acid, and the nucleic acid and the pharmaceutical composition of the lipid membrane structure and cells. Regarding use in the manufacture of formulations. The present invention further relates to a nucleic acid for expressing mt-rRNA in mitochondria, a mitochondrial-directed lipid membrane structure encapsulating the nucleic acid, and the nucleic acid and the pharmaceutical composition of the lipid membrane structure and a cell preparation. Regarding use in manufacturing.
　細胞のオルガネラの１つであるミトコンドリアは、細胞核内の染色体から独立したミトコンドリアゲノムＤＮＡ（以下、ｍｔ－ＤＮＡと表す）を持つ。ミトコンドリアは、核ゲノムＤＮＡから転写翻訳されてミトコンドリア内に移送されるミトコンドリアタンパク質（核ＤＮＡ由来ミトコンドリアタンパク質）、ｍｔ－ＤＮＡにコードされ、ミトコンドリア内で転写翻訳されるミトコンドリアタンパク質（ミトコンドリアＤＮＡ由来ミトコンドリアタンパク質）、ミトコンドリアｔ－ＲＮＡ（以下、ｍｔ－ｔＲＮＡと表す）及びｍｔ－ｒＲＮＡを含む。これらのタンパク質やＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡにおける変異と種々の疾患（脳筋症、神経変性疾患、癌、糖尿病、難聴等）との関連が多数報告されており、これらはミトコンドリア病と総称される。ミトコンドリア病に対する治療法はこれまでのところビタミン類などを補充する対症療法が主流であり、根本的治療法の開発が望まれている。以下、特に断らない限り、本発明はヒトのミトコンドリアを代表例として説明する。 Mitochondria, which is one of the organelles of cells, has mitochondrial genomic DNA (hereinafter referred to as mt-DNA) independent of chromosomes in the cell nucleus. Mitochondria are mitochondrial proteins (nuclear DNA-derived mitochondrial proteins) that are transcribed and translated from nuclear genomic DNA and transferred into mitochondria, and mitochondrial proteins that are encoded by mt-DNA and transcribed and translated in mitochondria (mitochondrial DNA-derived mitochondrial proteins). , Mitochondrial t-RNA (hereinafter referred to as mt-tRNA) and mt-rRNA. Many associations between mutations in genomic DNA encoding these proteins and RNAs and various diseases (encephalopathy, neurodegenerative diseases, cancer, diabetes, hearing loss, etc.) have been reported, and these are collectively referred to as mitochondrial diseases. .. So far, symptomatic treatments that supplement vitamins and the like have been the mainstream of treatments for mitochondrial diseases, and the development of fundamental treatments is desired. Hereinafter, unless otherwise specified, the present invention will be described with human mitochondria as a representative example.
　現在、研究開発が進められているミトコンドリア病の治療方法の１つは、治療効果が期待されるタンパク質、例えば変異したミトコンドリアタンパク質に対応する野生型タンパク質をミトコンドリア内に送り込むことを目的とした遺伝子治療である。遺伝子治療を実現するため、細胞核内で転写され、細胞質で翻訳された目的タンパク質をミトコンドリア内に移送させることができる外来遺伝子発現システムや、ミトコンドリア内で直接的に目的タンパク質を発現させることができる外来遺伝子発現システム等が提案されている。 One of the therapeutic methods for mitochondrial disease currently under research and development is gene therapy aimed at delivering a protein expected to have a therapeutic effect, for example, a wild-type protein corresponding to a mutated mitochondrial protein into mitochondria. Is. In order to realize gene therapy, a foreign gene expression system that can transfer the target protein transcribed in the cell nucleus and translated in the cytoplasm into the mitochondria, or a foreign gene that can directly express the target protein in the mitochondria. A gene expression system and the like have been proposed.
　細胞質で発現させた目的タンパク質のミトコンドリア内への移送に関連して、多種多様な発現ベクターが開発されている。その多くは、核ＤＮＡ由来ミトコンドリアタンパク質が有するミトコンドリア移行性シグナルペプチド（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ、ＭＴＳ）を利用している。具体的には、ＭＴＳを上流に有する目的タンパク質（ＭＴＳ付加タンパク質）をコードする発現ベクターを細胞核に送達し、細胞質においてＭＴＳ付加タンパク質を発現させ、ミトコンドリアに送達するというものである。 A wide variety of expression vectors have been developed in connection with the transfer of the target protein expressed in the cytoplasm into the mitochondria. Most of them utilize the mitochondrial translocation signal peptide (mitochondrial targeting signal peptide, MTS) possessed by the mitochondrial protein derived from nuclear DNA. Specifically, an expression vector encoding a target protein having MTS upstream (MTS-added protein) is delivered to the cell nucleus, the MTS-added protein is expressed in the cytoplasm, and the MTS-added protein is delivered to mitochondria.
　この方法はある種の目的タンパク質においては有用であり得るが、ミトコンドリアＤＮＡ由来ミトコンドリアタンパク質に対する適用性が低いという問題を有する。ミトコンドリアＤＮＡ由来ミトコンドリアタンパク質の多くは細胞質内で不溶性であるために、細胞質で発現されたミトコンドリアＤＮＡ由来ミトコンドリアタンパク質が凝集し、ミトコンドリアへの移行が不十分となるからである。 Although this method may be useful for certain target proteins, it has the problem of low applicability to mitochondrial DNA-derived mitochondrial proteins. This is because most of the mitochondrial DNA-derived mitochondrial proteins are insoluble in the cytoplasm, so that the mitochondrial DNA-derived mitochondrial proteins expressed in the cytoplasm aggregate and the transfer to mitochondria becomes insufficient.
　特許文献１は、水溶性を高めたＭＴＳと特定のミトコンドリアＤＮＡ由来ミトコンドリアタンパク質とからなるＭＴＳ付加タンパク質をコードする発現ベクターを用いて、目的タンパク質の細胞質での凝集を抑える方法を開示している。しかし、ミトコンドリアＤＮＡ由来ミトコンドリアタンパク質は、ミトコンドリア以外の細胞内オルガネラにあると細胞毒性を示すことが多いので、特許文献１に記載された方法が利用可能な目的タンパク質の範囲は制限される。 Patent Document 1 discloses a method of suppressing aggregation of a target protein in the cytoplasm by using an expression vector encoding an MTS-added protein composed of an MTS having increased water solubility and a mitochondrial protein derived from a specific mitochondrial DNA. However, since mitochondrial DNA-derived mitochondrial proteins often show cytotoxicity when they are present in intracellular organelles other than mitochondria, the range of target proteins for which the method described in Patent Document 1 can be used is limited.
　また、ＭＴＳ付加タンパク質を利用した上記方法は、本来のミトコンドリアタンパク質の細胞内輸送に干渉する又はこれと競合することで細胞に致死的ダメージを与える可能性があり、遺伝子治療のツールとしては懸念が残る。 In addition, the above method using MTS-added protein may cause fatal damage to cells by interfering with or competing with the intracellular transport of the original mitochondrial protein, and there is concern as a tool for gene therapy. Remain.
　一方、ミトコンドリア内で直接的に目的タンパク質を発現させることができる外来遺伝子発現システムの利用では、第一にミトコンドリア内における必要十分な量の目的タンパク質の転写発現が要求される。かかる目的に適合するように、ｍｔ－ＤＮＡに存在する遺伝子由来のプロモーター、例えばＨＳＰ（ｈｅａｖｙ　ｓｔｒａｎｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を選択し、その制御下に目的タンパク質をコードするＤＮＡを置いた発現ベクターが幾つか設計されている。この発現ベクターには、ｍｔ－ＤＮＡにおいて利用頻度の高いトリプレットコドンを使用するといった工夫も加えられている。しかし、これまでのところ、それら発現ベクターの発現レベルは疾患治療に必要十分な領域には達していない。 On the other hand, in the use of a foreign gene expression system capable of directly expressing a target protein in mitochondria, firstly, a necessary and sufficient amount of transcriptional expression of the target protein in mitochondria is required. In order to meet such a purpose, several expression vectors have been designed in which a promoter derived from a gene present in mt-DNA, for example, HSP (heavy strange promoter) is selected and a DNA encoding the target protein is placed under the control thereof. ing. This expression vector has been devised to use triplet codons, which are frequently used in mt-DNA. However, so far, the expression levels of these expression vectors have not reached the necessary and sufficient range for disease treatment.
　例えば、非特許文献１には、ＭＴＳを付加した人工ウイルスベクターの内部にＨＳＰ制御下にあるミトコンドリア内で転写誘導されるＤＮＡを封入し、ミトコンドリアに直接的にウイルスベクターを導入して目的タンパク質を発現させようとする方法が提唱されている。この方法は、導入されたウイルスベクターからの目的タンパク質の発現レベルが比較的高いという利点を有する一方、ウイルスベクターであることに起因する安全性の問題を伴うことに加え、目的タンパク質が期待通りにミトコンドリア内で発現しているかについての検証が完全にはなされていない。 For example, in Non-Patent Document 1, DNA that is transcriptionally induced in mitochondria under HSP control is encapsulated inside an artificial viral vector to which MTS is added, and the viral vector is directly introduced into mitochondria to obtain a target protein. A method for expressing it has been proposed. This method has the advantage that the expression level of the protein of interest from the introduced viral vector is relatively high, but in addition to the safety issues due to being a viral vector, the protein of interest is as expected. It has not been completely verified whether it is expressed in mitochondria.
　本発明者らは、ミトコンドリア内で直接的に目的タンパク質を発現させることができる外来遺伝子発現システムの一つとして、動物細胞の細胞核内で転写活性を示すプロモーター配列、及びトリプトファンに対応するコドンとして１つ又は複数のＴＧＡを含む目的タンパク質をコードするコーディング領域を前記プロモーター配列の制御下に有する組換え発現ベクターを提案した（特許文献２）。この発現ベクターをミトコンドリア指向性脂質膜構造体を利用してミトコンドリア内に送達することで、細胞質内での望ましくない目的タンパク質の翻訳を回避し、さらにミトコンドリア内での目的タンパク質の発現量をより高めることが可能となる。 As one of the foreign gene expression systems capable of directly expressing a target protein in mitochondria, the present inventors have a promoter sequence showing transcriptional activity in the cell nucleus of an animal cell, and a codon corresponding to tryptophan. We have proposed a recombinant expression vector having a coding region encoding a target protein containing one or more TGAs under the control of the promoter sequence (Patent Document 2). By delivering this expression vector into mitochondria using a mitochondrial directional lipid membrane structure, translation of an undesired target protein in the cytoplasm is avoided, and the expression level of the target protein in mitochondria is further increased. It becomes possible.
　上記の従来技術において、ミトコンドリア内に送達される核酸は専らＤＮＡであったが、近年のＲＮＡ合成技術の進歩に伴い、ＤＮＡに代えてＲＮＡを直接的にミトコンドリア内に送達することによる遺伝子治療戦略が提唱されている。これらの従来技術はいずれも、目的タンパク質の機能をミトコンドリア内で発揮させることを目的とした、当該タンパク質をコードする比較的短鎖の核酸をミトコンドリア内に送達する技術である。 In the above-mentioned conventional technique, the nucleic acid delivered into the mitochondria is exclusively DNA, but with the recent progress of RNA synthesis technology, a gene therapy strategy by delivering RNA directly into the mitochondria instead of DNA. Has been advocated. All of these conventional techniques are techniques for delivering a relatively short-chain nucleic acid encoding the protein into the mitochondria, with the aim of exerting the function of the target protein in the mitochondria.
　また、ミトコンドリア病であると適切に診断されず、有効な治療が施されないまま重症化する事例も存在しているなど、ミトコンドリア病の診断法の確立も重要な課題として残されている。例えば、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子をコードするｍｔ－ＤＮＡ塩基配列中に存在する点変異Ａ１５５５Ｇはミトコンドリア病の一種である薬剤性難聴の原因であるが、この点変異に対しては現在ＤＮＡ検査のみが実施されており、疾患の直接的原因となるｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの変異を対象とした検査技術は確立されていない。 In addition, the establishment of a diagnostic method for mitochondrial disease remains an important issue, as there are cases in which mitochondrial disease is not properly diagnosed and becomes severe without effective treatment. For example, the point mutation A1555G present in the mt-DNA base sequence encoding the mt-12S rRNA gene is the cause of drug-induced hearing loss, which is a type of mitochondrial disease, but currently only DNA tests are available for this point mutation. It has been carried out, and a testing technique for mutations in mt-12S rRNA, which directly causes the disease, has not been established.
ＵＳ２０１５／０２２５７４０US2015 / 0225740 ＷＯ２０１７／０９０７６３WO2017 / 090763
　本発明は、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの点変異を検出する方法を提供する。 The present invention provides a method for detecting a point mutation in mt-12S rRNA.
　本発明はまた、細胞内でＲＮＡを発現させるための核酸、これを封入（内包）してなる細胞導入用脂質膜構造体、および、前記核酸及び前記脂質膜構造体の医薬組成物における及び細胞製剤の製造における使用を提供する。 The present invention also relates to a nucleic acid for expressing RNA in a cell, a lipid membrane structure for cell introduction formed by encapsulating (encapsulating) the nucleic acid, and the nucleic acid and the pharmaceutical composition of the lipid membrane structure and cells. Provided for use in the manufacture of formulations.
　本発明はさらに、ミトコンドリア内でｍｔ－ｒＲＮＡを発現させるための核酸、これを封入してなるミトコンドリア指向性脂質膜構造体、並びに前記核酸及び前記脂質膜構造体の医薬組成物における及び細胞製剤の製造における使用を提供する。 The present invention further relates to a nucleic acid for expressing mt-rRNA in mitochondria, a mitochondrial-directed lipid membrane structure encapsulating the nucleic acid, and the nucleic acid and the pharmaceutical composition of the lipid membrane structure and a cell preparation. Provides use in manufacturing.
　本発明はさらにまた、ミトコンドリア内でミトコンドリアＲＮＡ（ｍｔＲＮＡ）、例えば、ｍｔ－ｒＲＮＡを効率的に発現させるためのＲＮＡ又はＤＮＡ、及びこれらをミトコンドリアへ導入する方法を提供する。 The present invention further provides mitochondrial RNA (mtRNA) in mitochondria, for example, RNA or DNA for efficiently expressing mt-rRNA, and a method for introducing these into mitochondria.
　本発明者らは、特定の塩基配列からなるプライマーＤＮＡセットを用いることでｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの点変異を検出及び定量することができることを見出した。本発明はまた、ＲＮＡをプロタミンと複合体化した後に、脂質ナノ粒子に内包させることによって、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされる１２Ｓ　ｒＲＮＡ（ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ）および１６Ｓ　ｒＲＮＡ（ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡ）などの巨大なＲＮＡであってもミトコンドリアに効果的に送達できることを見出した。 The present inventors have found that point mutations in mt-12S rRNA can be detected and quantified by using a primer DNA set consisting of a specific base sequence. The present invention also presents giant RNAs such as 12S rRNA (mt-12S rRNA) and 16S rRNA (mt-16S rRNA) encoded by mitochondrial DNA by complexing RNA with protamine and then encapsulating it in lipid nanoparticles. We have found that even RNA can be effectively delivered to mitochondria.
（１）配列番号１に示される塩基配列を含むフォワードプライマーＤＮＡと配列番号３又は４に示される塩基配列からなるリバースプライマーＤＮＡとの組み合わせを含む野生型検出用プライマーＤＮＡセットと、
配列番号１に示される塩基配列を含むフォワードプライマーＤＮＡと配列番号１６、１７又は２０に示される塩基配列からなるリバースプライマーＤＮＡとの組み合わせを含む変異型検出用プライマーＤＮＡセット
とを含む、ミトコンドリアＤＮＡの点変異Ａ１５５５Ｇ又はこれに対応するミトコンドリア１２ＳリボソームＲＮＡの点変異を検出するためのキット。
（２）配列番号１に示される塩基配列を含むフォワードプライマーＤＮＡが、配列番号１又は２に示される塩基配列からなるプライマーＤＮＡである、（１）に記載のキット。
（３）変異型検出用プライマーＤＮＡセットのリバースプライマーＤＮＡが、配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーＤＮＡである、（１）又は（２）に記載のキット。
（４）以下のａ）又はｂ）に示される核酸を封入してなるミトコンドリア指向性脂質膜構造体。
　ａ）第一のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列、ミトコンドリアリボソームＲＮＡの塩基配列及び第二のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列をこの順番で含むＲＮＡ
　ｂ）プロモーターの塩基配列及びａ）のＲＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡ
（５）前記ａ）におけるミトコンドリアリボソームＲＮＡの塩基配列及び２つのミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列が連続している、（４）に記載の脂質膜構造体。
（６）ミトコンドリアリボソームＲＮＡが野生型の１２ＳミトコンドリアリボソームＲＮＡである、（４）又は（５）に記載の脂質膜構造体。
（７）ジオレイルホスファチジルエタノールアミン及びスフィンゴミエリンを脂質膜の構成脂質として含有する、（４）から（６）のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
（８）膜透過性ペプチドを脂質膜表面に有する、（４）から（７）のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
（９）膜透過性ペプチドが連続した４～２０個のアルギニン残基からなるポリアルギニンペプチドである、（８）に記載の脂質膜構造体。
（１０）配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを脂質膜表面に有する、（４）から（９）のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
（１１）以下のａ）又はｂ）に示される核酸を有効成分として含有する、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
　ａ）第一のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列、ミトコンドリアリボソームＲＮＡの塩基配列及び第二のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列をこの順番で含むＲＮＡ
　ｂ）プロモーターの塩基配列及びａ）のＲＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡ
（１２）
　前記ａ）におけるミトコンドリアリボソームＲＮＡの塩基配列及び２つのミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列が連続している、（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）ミトコンドリアリボソームＲＮＡが野生型の１２ＳミトコンドリアリボソームＲＮＡである、（１１）又は（１２）に記載の医薬組成物。
（１４）核酸がミトコンドリア指向性脂質膜構造体に封入されている、（１１）から（１３）のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（１５）ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に由来する細胞に、以下のａ）又はｂ）に示される核酸をインビトロで導入することを含む、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防のための細胞製剤の製造方法。
　ａ）第一のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列、ミトコンドリアリボソームＲＮＡの塩基配列及び第二のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列をこの順番で含むＲＮＡ
　ｂ）プロモーターの塩基配列及びａ）のＲＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡ
（１６）　前記ａ）におけるミトコンドリアリボソームＲＮＡの塩基配列及び２つのミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列が連続している、（１５）に記載の製造方法。
（１７）ミトコンドリアリボソームＲＮＡが野生型の１２ＳミトコンドリアリボソームＲＮＡである、（１５）又は（１６）に記載の製造方法。
（１８）核酸がミトコンドリア指向性脂質膜構造体に封入されている、（１５）から（１７）のいずれか一項に記載の製造方法。 (1) A wild-type detection primer DNA set containing a combination of a forward primer DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4.
Mitochondrial DNA comprising a combination of a forward primer DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16, 17 or 20 and a primer DNA set for detecting a variant. A kit for detecting a point mutation in the point mutation A1555G or the corresponding mitochondrial 12S ribosomal RNA.
(2) The kit according to (1), wherein the forward primer DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
(3) The kit according to (1) or (2), wherein the reverse primer DNA of the mutant detection primer DNA set is a primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17.
(4) A mitochondrial directional lipid membrane structure in which the nucleic acid shown in the following a) or b) is encapsulated.
a) RNA containing the base sequence of the first mitochondrial tRNA, the base sequence of mitochondrial ribosomal RNA, and the base sequence of the second mitochondrial tRNA in this order.
b) DNA containing the promoter base sequence and the base sequence complementary to the RNA of a)
(5) The lipid membrane structure according to (4), wherein the base sequence of mitochondrial ribosomal RNA and the base sequences of two mitochondrial tRNAs in a) are continuous.
(6) The lipid membrane structure according to (4) or (5), wherein the mitochondrial ribosomal RNA is a wild-type 12S mitochondrial ribosomal RNA.
(7) The lipid membrane structure according to any one of (4) to (6), which contains dioleylphosphatidylethanolamine and sphingomyelin as constituent lipids of the lipid membrane.
(8) The lipid membrane structure according to any one of (4) to (7), which has a membrane-permeable peptide on the surface of the lipid membrane.
(9) The lipid membrane structure according to (8), wherein the membrane-permeable peptide is a polyarginine peptide consisting of 4 to 20 consecutive arginine residues.
(10) The lipid membrane structure according to any one of (4) to (9), which has a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 on the surface of the lipid membrane.
(11) A pharmaceutical composition for treating and / or preventing mitochondrial disease, which comprises the nucleic acid shown in the following a) or b) as an active ingredient.
a) RNA containing the base sequence of the first mitochondrial tRNA, the base sequence of mitochondrial ribosomal RNA, and the base sequence of the second mitochondrial tRNA in this order.
b) DNA containing the promoter base sequence and the base sequence complementary to the RNA of a)
(12)
The pharmaceutical composition according to (11), wherein the base sequence of mitochondrial ribosomal RNA and the base sequence of two mitochondrial tRNAs in a) are continuous.
(13) The pharmaceutical composition according to (11) or (12), wherein the mitochondrial ribosomal RNA is a wild-type 12S mitochondrial ribosomal RNA.
(14) The pharmaceutical composition according to any one of (11) to (13), wherein the nucleic acid is encapsulated in a mitochondrial directional lipid membrane structure.
(15) Treatment and / or prevention of mitochondrial disease, including in vitro introduction of the nucleic acid shown in a) or b) below into cells derived from a patient with mitochondrial disease or a person who may develop mitochondrial disease. A method for producing a cell preparation for.
a) RNA containing the base sequence of the first mitochondrial tRNA, the base sequence of mitochondrial ribosomal RNA, and the base sequence of the second mitochondrial tRNA in this order.
b) DNA containing the promoter base sequence and the base sequence complementary to the RNA of a)
(16) The production method according to (15), wherein the base sequence of the mitochondrial ribosomal RNA and the base sequences of the two mitochondrial tRNAs in a) are continuous.
(17) The production method according to (15) or (16), wherein the mitochondrial ribosomal RNA is a wild-type 12S mitochondrial ribosomal RNA.
(18) The production method according to any one of (15) to (17), wherein the nucleic acid is encapsulated in a mitochondrial directional lipid membrane structure.
（１Ａ）核酸とカチオン性ポリマーとを含むナノ粒子を内包した脂質膜構造体を含む組成物。
（２Ａ）核酸が、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされるＲＮＡである、（１Ａ）に記載の組成物。
（３Ａ）カチオン性ポリマーが、プロタミンである、（１Ａ）または（２Ａ）に記載の組成物。
（４Ａ）核酸が、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされるｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡおよび、ｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである、（１Ａ）から（３Ａ）のいずれかに記載の組成物。
（５Ａ）（１Ａ）から（４Ａ）のいずれかに記載の組成物を含む、医薬組成物。 (1A) A composition containing a lipid membrane structure containing nanoparticles containing a nucleic acid and a cationic polymer.
(2A) The composition according to (1A), wherein the nucleic acid is RNA encoded by mitochondrial DNA.
(3A) The composition according to (1A) or (2A), wherein the cationic polymer is protamine.
(4A) The composition according to any one of (1A) to (3A), wherein the nucleic acid is an RNA selected from the group consisting of mt-12S rRNA encoded by mitochondrial DNA and t-16S rRNA.
(5A) A pharmaceutical composition comprising the composition according to any one of (1A) to (4A).
　本発明のプライマーＤＮＡセットは、これを用いたＰＣＲを行うことにより、ｍｔ－ＤＮＡの点変異であるＡ１５５５Ｇ又はこれに対応するｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの点変異を簡便に検出及び定量することができる。また、ミトコンドリアにおいてコードされるＲＮＡをプロタミンと複合体化した後に、脂質ナノ粒子に内包させることによって、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡおよびｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡなどの巨大なＲＮＡであってもミトコンドリアに効果的に送達できる。さらに、本発明の脂質膜構造体及び核酸は、ミトコンドリアにおいてより効率的に、かつ選択的にｍｔ－ｒＲＮＡを送達又は発現させることができることから、より安全でかつ効果の優れたミトコンドリア病治療用の医薬として、又は細胞製剤の製造において利用することができる。 The primer DNA set of the present invention can easily detect and quantify a point mutation of A1555G, which is a point mutation of mt-DNA, or a point mutation of mt-12S rRNA corresponding thereto, by performing PCR using the primer DNA set. In addition, by complexing RNA encoded in mitochondria with protamine and then encapsulating it in lipid nanoparticles, even huge RNAs such as mt-12S rRNA and mt-16S rRNA are effectively delivered to mitochondria. it can. Furthermore, since the lipid membrane structure and nucleic acid of the present invention can deliver or express mt-rRNA more efficiently and selectively in mitochondria, they are safer and more effective for the treatment of mitochondrial diseases. It can be used as a medicine or in the production of cell preparations.
本発明の一態様であるｔＲＦ－ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ－ｔＲＶの構造及び対応するＤＮＡの塩基配列を表す図である。Is a diagram representing the architecture and the corresponding nucleotide sequence of the DNA of tR F -mt-12S rRNA-tR V which is one embodiment of the present invention. ミトコンドリアリボソームＲＮＡ遺伝子の点変異（Ａ１５５５Ｇ）を検出するために設計されたプライマーＤＮＡセットの１～１６について、横軸に変異率の理論値を、縦軸に定量的ＰＣＲで実測した測定値から算出した変異率をプロットした検量線である。For 1 to 16 of the primer DNA sets designed to detect point mutations (A1555G) in the mitochondrial ribosomal RNA gene, the horizontal axis is the theoretical mutation rate, and the vertical axis is the measured value measured by quantitative PCR. It is a calibration line which plotted the mutation rate. ミトコンドリアリボソームＲＮＡ遺伝子の点変異（Ａ１５５５Ｇ）を検出するために設計されたプライマーＤＮＡセットの１７～３２について、横軸に変異率の理論値を、縦軸に定量的ＰＣＲで実測した測定値から算出した変異率をプロットした検量線である。For 17 to 32 of the primer DNA sets designed to detect point mutations (A1555G) in the mitochondrial ribosomal RNA gene, the horizontal axis is the theoretical mutation rate, and the vertical axis is the measured value measured by quantitative PCR. It is a calibration line which plotted the mutation rate. ミトコンドリアリボソームＲＮＡ遺伝子の点変異（Ａ１５５５Ｇ）を検出するために設計されたプライマーＤＮＡセットの３３～４８について、横軸に変異率の理論値を、縦軸に定量的ＰＣＲで実測した測定値から算出した変異率をプロットした検量線である。For 33-48 of the primer DNA sets designed to detect point mutations (A1555G) in the mitochondrial ribosomal RNA gene, the horizontal axis is the theoretical mutation rate, and the vertical axis is the measured value measured by quantitative PCR. It is a calibration line which plotted the mutation rate. ミトコンドリアリボソームＲＮＡ遺伝子の点変異（Ａ１５５５Ｇ）を検出するために設計されたプライマーＤＮＡセットの４９～６４について、横軸に変異率の理論値を、縦軸に定量的ＰＣＲで実測した測定値から算出した変異率をプロットした検量線である。For 49 to 64 of the primer DNA sets designed to detect point mutations (A1555G) in the mitochondrial ribosomal RNA gene, the horizontal axis is the theoretical mutation rate, and the vertical axis is the measured value measured by quantitative PCR. It is a calibration line which plotted the mutation rate. ミトコンドリアリボソームＲＮＡ遺伝子の点変異（Ａ１５５５Ｇ）を検出するために設計されたプライマーＤＮＡセットの６５～８０について、横軸に変異率の理論値を、縦軸に定量的ＰＣＲで実測した測定値から算出した変異率をプロットした検量線である。For 65-80 of the primer DNA set designed to detect point mutations (A1555G) in the mitochondrial ribosomal RNA gene, the horizontal axis is the theoretical mutation rate, and the vertical axis is the measured value measured by quantitative PCR. It is a calibration line which plotted the mutation rate. ミトコンドリアリボソームＲＮＡ遺伝子の点変異（Ａ１５５５Ｇ）を検出するために設計されたプライマーＤＮＡセットの８１～９６について、横軸に変異率の理論値を、縦軸に定量的ＰＣＲで実測した測定値から算出した変異率をプロットした検量線である。For 81-96 of the primer DNA sets designed to detect point mutations (A1555G) in the mitochondrial ribosomal RNA gene, the horizontal axis is the theoretical mutation rate, and the vertical axis is the measured value measured by quantitative PCR. It is a calibration line which plotted the mutation rate. ミトコンドリアリボソームＲＮＡ遺伝子の点変異（Ａ１５５５Ｇ）を検出するために設計されたプライマーＤＮＡセットの９７～１０８について、横軸に変異率の理論値を、縦軸に定量的ＰＣＲで実測した測定値から算出した変異率をプロットした検量線である。For 97 to 108 of the primer DNA sets designed to detect point mutations (A1555G) in the mitochondrial ribosomal RNA gene, the horizontal axis is the theoretical mutation rate, and the vertical axis is the measured value measured by quantitative PCR. It is a calibration line which plotted the mutation rate. プライマーＤＮＡセット１４、２４及び６について、横軸に変異率の理論値を、縦軸に３～４回の定量的ＰＣＲで実測した測定値から算出した変異率の平均値をプロットした検量線である。For primer DNA sets 14, 24 and 6, the horizontal axis is the theoretical value of the mutation rate, and the vertical axis is the calibration curve plotting the average value of the mutation rate calculated from the measured values measured by 3 to 4 quantitative PCRs. is there. ミトコンドリア病患者由来の皮膚繊維芽細胞のミトコンドリアにｔＲＦ－ｒＲＮＡ－ｔＲＶ／ＭＩＴＯを導入したときの、及び市販のＲＮＡ導入試薬を用いてｔＲＦ－ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ－ｔＲＶを導入したときの、それぞれのｍｔ－ｒＲＮＡに相補的なｃＤＮＡにおけるＡ１５５５Ｇ変異率の変化を示すグラフである。When introduced tR F -rRNA-tR V / MITO mitochondria of skin fibroblasts from mitochondrial disease patients, and when introduced tR F -mt-12S rRNA-tR V by using a commercially available RNA transfection reagent It is a graph which shows the change of the A1555G mutation rate in the cDNA complementary to each mt-rRNA. ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯと培養液中で接触させたヒトＡ１５５５Ｇ変異細胞における脂質ナノ粒子の局在を示す蛍光顕微鏡写真である。3 is a fluorescence micrograph showing the localization of lipid nanoparticles in human A1555G mutant cells contacted with mt-12S rRNA / MITO in a culture medium. ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯと培養液中で接触させたヒトＡ１５５５Ｇ変異細胞における接触２４時間後、４８時間後および７２時間後のミトコンドリア中の変異ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの割合（変異型ｒＲＮＡ含有比率）とミトコンドリアの最大呼吸能の経時的変化を示す。ミトコンドリア最大呼吸能は接触前の最大呼吸能に対する割合（相対値）として示されている。Percentage of mutant mt-12S rRNA in mitochondria 24 hours, 48 hours, and 72 hours after contact in human A1555G mutant cells contacted with mt-12S rRNA / MITO in culture medium (mutant rRNA content ratio) It shows the time course of maximum mitochondrial respiration. The maximum mitochondrial respiration capacity is shown as a ratio (relative value) to the maximum respiration capacity before contact. ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯと培養液中で接触させたヒトＡ１５５５Ｇ変異細胞における接触７２時間後のミトコンドリア最大呼吸能を示す。空／ＭＩＴＯは、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡとカチオン性ポリマーを有しない脂質ナノ粒子であり、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡであり、酵母ｔＲＮＡ／ＭＩＴＯは酵母のｔＲＮＡを内包した脂質ナノ粒子であり、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＬＦＮは、１２Ｓ　ｒＲＮＡとリポフェクタミンとの複合体を示す。Shows the maximum mitochondrial respiration capacity 72 hours after contact in human A1555G mutant cells contacted with mt-12S rRNA / MITO in culture medium. Empty / MITO is a lipid nanoparticle having no mt-12S rRNA and a cationic polymer, and is mt-12S rRNA, and yeast tRNA / MITO is a lipid nanoparticles containing yeast tRNA, and is mt-12S rRNA. / LFN indicates a complex of 12S rRNA and lipofectamine. 実施例で用いたｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡ搭載遺伝子発現ベクターの内容を示す。The contents of the mt-16S rRNA-loaded gene expression vector used in the examples are shown. ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の環状ゲノムにおけるＳ１６ｒＲＮＡの遺伝子座の位置を示す。ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡ上で最大の遺伝子である。The position of the locus of S16rRNA in the circular genome of mitochondrial DNA (mtDNA) is shown. mt-16S rRNA is the largest gene on mitochondrial DNA. 得られたｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡを内包する脂質ナノ粒子の平均粒子径およびゼータ電位を示す。The average particle size and zeta potential of the obtained lipid nanoparticles containing mt-16S rRNA are shown. Ａ１５５５Ｇ変異細胞に対するｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡを内包する脂質ナノ粒子の導入スケジュールとその結果得られた細胞のミトコンドリア最大呼吸能を示す。ミトコンドリア最大呼吸能は接触前の最大呼吸能に対する割合（相対値）として示されている。The introduction schedule of lipid nanoparticles containing mt-16S rRNA into A1555G mutant cells and the resulting maximum mitochondrial respiration capacity of the cells are shown. The maximum mitochondrial respiration capacity is shown as a ratio (relative value) to the maximum respiration capacity before contact. 実施例で構築したｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡおよびｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡを搭載する遺伝子発現ベクターの内容を示す。The contents of the gene expression vector carrying mt-12S rRNA and mt-16S rRNA constructed in the examples are shown. 実施例で構築したｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡおよびｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡを搭載する遺伝子発現ベクターの内容を示す。The contents of the gene expression vector carrying mt-12S rRNA and mt-16S rRNA constructed in the examples are shown.
　本明細書では、「対象」とは、ヒトなどの霊長類、イヌ、ネコ、マウス、モルモット、ハムスター、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、およびヤギなどのほ乳類を意味する。本明細書では、「対象」は、好ましくはヒトである。 As used herein, the term "subject" means primates such as humans, and mammals such as dogs, cats, mice, guinea pigs, hamsters, horses, cows, sheep, pigs, and goats. As used herein, the "subject" is preferably a human.
　本明細書では、「処置」とは、治療的処置および予防的処置を含む。治療的処置とは、疾患の症状の進行を遅らせる、若しくは止める、または症状を緩和する、若しくは治癒することを意味し得る。予防的処置とは、疾患の症状の発症を遅らせる、または防ぐことを意味し得る。 As used herein, "treatment" includes therapeutic and prophylactic treatment. Therapeutic treatment can mean slowing or stopping the progression of symptoms of the disease, or alleviating or curing the symptoms. Prophylactic treatment can mean delaying or preventing the onset of symptoms of the disease.
　本明細書では、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔ－ＤＮＡ）の塩基配列及びその配列中の塩基の位置は、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：　ＮＣ＿０１２９２０．１に登録されている塩基配列とその塩基番号で表される。ミトコンドリアＤＮＡ上の塩基の変異は、ｘ１ｎｘ２で表され、ここでｎは、上記塩基配列上における塩基の位置を示し、ｘ１は、当該塩基の野生型の塩基を示し、ｘ２は、当該塩基の変異型の塩基を示す。例えば、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：　ＮＣ＿０１２９２０．１に登録されている塩基配列の１５５５番目の塩基またはこれに対応するミトコンドリアＤＮＡの塩基が野生型においてＡ（アデニン）であり、変異型においてＧ（グアニン）である場合、当該塩基のＧへの変異は、Ａ１５５５Ｇと表される。上記登録されている塩基配列中の特定の塩基が、別の塩基配列中のいずれの塩基と対応するかは、当業者であれば、上記登録されている塩基配列と別の塩基配列をアラインメントすることにより決定することができる。本明細書では、ミトコンドリアＤＮＡは、好ましくはヒトミトコンドリアＤＮＡであり、ミトコンドリアＲＮＡは、好ましくはヒトミトコンドリアＲＮＡである。 In the present specification, the base sequence of mitochondrial DNA (mt-DNA) and the position of the base in the sequence are represented by the base sequence registered in NCBI Reference Sequence: NC_012920.1 and its base number. Mutations of bases on mitochondrial DNA are represented by x 1 n x 2 , where n indicates the position of the base on the above base sequence, x 1 indicates the wild type base of the base, and x 2 indicates the wild type base of the base. , Indicates a mutant base of the base. For example, the base at position 1555 of the base sequence registered in NCBI Reference Sequence: NC_012920.1 or the base of the mitochondrial DNA corresponding thereto is A (adenine) in the wild type and G (guanine) in the mutant type. In this case, the mutation of the base to G is represented as A1555G. A person skilled in the art will align a base sequence different from the registered base sequence to determine which base in another base sequence corresponds to a specific base in the registered base sequence. It can be decided by. As used herein, the mitochondrial DNA is preferably human mitochondrial DNA, and the mitochondrial RNA is preferably human mitochondrial RNA.
点変異検出用プライマーＤＮＡセット
　本発明の第１の態様は、
配列番号１に示される塩基配列を含むフォワードプライマーＤＮＡと配列番号３又は４に示される塩基配列からなるリバースプライマーＤＮＡとの組み合わせを含む、または当該組み合わせからなる野生型検出用プライマーＤＮＡセットと、
配列番号１に示される塩基配列を含むフォワードプライマーＤＮＡと配列番号１６、１７又は２０に示される塩基配列からなるリバースプライマーＤＮＡとの組み合わせを含む、または当該組み合わせからなる変異型検出用プライマーＤＮＡセット
とを含む、ｍｔ－ＤＮＡの点変異Ａ１５５５Ｇ又はこれに対応するｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの点変異を検出するためのキットに関する。 Primer DNA set for point mutation detection The first aspect of the present invention is
A wild-type detection primer DNA set containing, or consisting of, a combination of a forward primer DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4.
A mutation type detection primer DNA set containing or consisting of a combination of a forward primer DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16, 17 or 20. The present invention relates to a kit for detecting a point mutation of mt-DNA A1555G or a corresponding point mutation of mt-12S rRNA.
　点変異Ａ１５５５Ｇは、ミトコンドリア病の一種である薬剤性難聴の原因とされる、ｍｔ－ＤＮＡ塩基配列の１５５５番目のアデニンがグアニンに置換された遺伝子変異で、この遺伝子変異を有する患者は、アミノグリコシド系薬物を投与した際の難聴リスクが顕著に高いことが知られている（Ｓｖｅｎ　Ｎ．　Ｈｏｂｂｉｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　２００８，　１０５，　５２，　２０８８８－２０８９３．；Ｎ．Ｒａｉｍｕｎｄｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ，　１４８，　４，　１７，　２０１２，　７１６－７２６）。したがって、この遺伝子変異又はこれに対応するｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ変異の検出は、アミノグリコシド系薬物投与による難聴発症リスクの判定に利用することができ、難聴の誘発又は重症化の抑制に寄与し得るものと期待される。特に、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ変異の検出は、疾患の直接的原因となる最終産物における変異の検出であることから、より精度の高い薬剤性難聴発症リスクの判定につながるものと期待される。 The point mutation A1555G is a gene mutation in which the adenin at position 1555 of the mt-DNA base sequence is replaced with guanine, which is a cause of drug-induced hearing loss, which is a type of mitochondrial disease. Patients with this gene mutation are aminoglycoside. It is known that the risk of hearing loss when a drug is administered is remarkably high (Sven N. Hobbie et al., Pro. Nat. Acad. Sci. USA, 2008, 105, 52, 20888-20893 .; N. Raimundo et al., Cell, 148, 4, 17, 2012, 716-726). Therefore, the detection of this gene mutation or the corresponding mt-12S rRNA mutation can be used to determine the risk of developing hearing loss due to the administration of aminoglycoside drugs, and can contribute to the induction or suppression of the aggravation of hearing loss. Be expected. In particular, the detection of mt-12S rRNA mutation is expected to lead to more accurate determination of the risk of developing drug-induced hearing loss because it is the detection of mutation in the final product that directly causes the disease.
　配列番号１に示される塩基配列を含むプライマーＤＮＡと配列番号３又は４に示される塩基配列からなるプライマーＤＮＡとの組み合わせを含む、または当該組み合わせからなる野生型検出用プライマーＤＮＡセットは、検出対象のｍｔ－ＤＮＡ、又はｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡからの逆転写反応生成物であるｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、１５５５番目の塩基がアデニンであるｍｔ－ＤＮＡ又はこれに対応するｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡを特異的に検出することができる。 A wild-type detection primer DNA set containing or consisting of a combination of a primer DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 is a detection target. By performing PCR using cDNA, which is a reverse transcription reaction product from mt-DNA or mt-12S rRNA, as a template, mt-DNA in which the 1555th base is adenine or the corresponding mt-12S rRNA can be obtained. It can be detected specifically.
　また、配列番号１に示される塩基配列を含むフォワードプライマーＤＮＡと配列番号１６、１７又は２０に示される塩基配列からなるリバースプライマーＤＮＡとの組み合わせを含む、または当該組み合わせからなる変異型検出用プライマーＤＮＡセットは、検出対象のｍｔ－ＤＮＡ、又はｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡからの逆転写反応生成物であるｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、１５５５番目の塩基がグアニンであるｍｔ－ＤＮＡ又はこれに対応するｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡを特異的に検出することができる。 Further, a primer DNA for detecting a variant containing or consisting of a combination of a forward primer DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16, 17 or 20 is included. The set is mt-DNA in which the 1555th base is guanine or corresponding to it by performing PCR using cDNA as a template, which is a reverse transcription reaction product from mt-DNA to be detected or mt-12S rRNA. The mt-12S rRNA to be used can be specifically detected.
　配列番号１に示される塩基配列を含むプライマーＤＮＡは、例えば、配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーＤＮＡ、又は配列番号１に示される塩基配列の５’末端側及び／若しくは３’末端側に１若しくは複数個の塩基、例として１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個、特に１若しくは２個の塩基が付加された塩基配列からなるプライマーＤＮＡであることができる。付加される塩基の種類は、検出対象のｍｔ－ＤＮＡ又はｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡからのｃＤＮＡを特異的に検出できるかぎり制限はないが、ｍｔ－ＤＮＡ中の又はｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡからのｃＤＮＡ中の対応する位置の塩基と相補的な塩基であることが好ましい。配列番号１に示される塩基配列を含むプライマーＤＮＡは、好ましくは、配列番号１又は２に示される塩基配列からなるプライマーＤＮＡである。 The primer DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is, for example, the primer DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the 5'end side and / or 3'end side of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. A primer DNA consisting of a base sequence to which one or more bases, for example 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and particularly 1 or 2 bases are added. Can be done. The type of base to be added is not limited as long as the cDNA from the mt-DNA or mt-12S rRNA to be detected can be specifically detected, but the correspondence in the cDNA from the mt-DNA or mt-12S rRNA. It is preferable that the base is complementary to the base at the position where it is formed. The primer DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is preferably a primer DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
　変異型検出用プライマーＤＮＡセットに含まれるリバースプライマーＤＮＡは、配列番号１６、１７又は２０に示される塩基配列からなるプライマーＤＮＡであり、好ましくは配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーＤＮＡである。 The reverse primer DNA included in the mutant detection primer DNA set is a primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16, 17 or 20, preferably a primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17. ..
　好ましい実施形態において、キットは、配列番号１に示される塩基配列からなるフォワードプライマーＤＮＡと配列番号３又は４に示される塩基配列からなるリバースプライマーＤＮＡとの組み合わせからなる野生型検出用プライマーＤＮＡセットと、配列番号１に示される塩基配列からなるフォワードプライマーＤＮＡと配列番号１６、１７又は２０に示される塩基配列からなるリバースプライマーＤＮＡとの組み合わせからなる変異型検出用プライマーＤＮＡセットとを含む。 In a preferred embodiment, the kit comprises a wild-type detection primer DNA set consisting of a combination of a forward primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4. , Includes a variant detection primer DNA set consisting of a combination of a forward primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16, 17 or 20.
　より好ましい実施形態において、キットは、配列番号１に示される塩基配列からなるフォワードプライマーＤＮＡと配列番号３に示される塩基配列からなるリバースプライマーＤＮＡとの組み合わせからなる野生型検出用プライマーＤＮＡセットと、配列番号１に示される塩基配列からなるフォワードプライマーＤＮＡと配列番号１７に示される塩基配列からなるリバースプライマーＤＮＡとの組み合わせからなる変異型検出用プライマーＤＮＡセットとを含む。 In a more preferred embodiment, the kit comprises a wild-type detection primer DNA set consisting of a combination of a forward primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3. It includes a primer DNA set for variant detection consisting of a combination of a forward primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17.
　野生型検出用プライマーＤＮＡセット及び変異型検出用プライマーＤＮＡセットを用いて、ｍｔ－ＤＮＡ、又はｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡからの逆転写反応生成物であるｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、当該ｍｔ－ＤＮＡ又はｃＤＮＡ中に含まれる点変異Ａ１５５５Ｇを有する分子の割合、すなわち変異率を定量することができる。当業者は、点変異を有する分子を特異的に増幅し、検出することができるＰＣＲ条件を適宜設定することができる。ＰＣＲは、一般的に、約９５℃などの高温でＤＮＡ二本鎖を解離させ、その後、ＤＮＡの合成と一本鎖への解離のための温度サイクルを２０～４０回程度繰り返すことによってＤＮＡを増幅させる。一つの温度サイクルは、例えば、一本鎖ＤＮＡを鋳型としたＤＮＡの合成（例えば、約６０℃で約１分）と、合成されて形成されたＤＮＡ二本鎖の解離（例えば、約９５℃で約１５秒）を含み得る。ＤＮＡ合成酵素は、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼを適宜選択して用いることができる。ＰＣＲは、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘなどの市販のキットを用いて行ってもよい。当業者は、本発明のプライマーＤＮＡの塩基配列の情報からプライマーＤＮＡを適宜合成することができ、これらのプライマーＤＮＡを用いて、野生型と変異型を検出することができるＰＣＲ条件を設定することができるはずである。 Using the wild type detection primer DNA set and the mutant type detection primer DNA set, PCR using cDNA, which is a reverse transcription reaction product from mt-DNA or mt-12S rRNA, as a template is performed to obtain the mt. -The proportion of molecules having the point mutation A1555G contained in DNA or cDNA, that is, the mutation rate can be quantified. One of ordinary skill in the art can appropriately set PCR conditions capable of specifically amplifying and detecting a molecule having a point mutation. In general, PCR dissociates DNA double strands at a high temperature such as about 95 ° C., and then repeats a temperature cycle for DNA synthesis and dissociation into single strands about 20 to 40 times to obtain DNA. Amplify. One temperature cycle includes, for example, synthesis of DNA using a single-stranded DNA as a template (for example, about 1 minute at about 60 ° C.) and dissociation of the synthesized and formed double-stranded DNA (for example, about 95 ° C.). Approximately 15 seconds). As the DNA synthase, a DNA polymerase such as Taq DNA polymerase can be appropriately selected and used. PCR may be carried out using a commercially available kit such as SYBR Green Realtime PCR Master Mix. A person skilled in the art can appropriately synthesize primer DNA from the information of the base sequence of the primer DNA of the present invention, and set PCR conditions capable of detecting wild type and mutant type using these primer DNAs. Should be possible.
　本発明において変異率とは、ミトコンドリア病をもたらす変異ｍｔ－ＤＮＡから転写されるｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡについての、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ全分子中の変異型分子の割合を意味する。 In the present invention, the mutation rate means the ratio of the mutant molecule in all the mt-12S rRNA molecules to the mt-12S rRNA transcribed from the mutant mt-DNA that causes mitochondrial disease.
　変異率は、遺伝子変異の定量に用いることができる公知の方法、例えばアレル特異的ＰＣＲ法、インベーダー法、アレル特異的ハイブリダイゼーション法、次世代シーケンス法等を用いて定量することができる。これらの方法の中で好ましく用いられるものの１つは、定量的ＡＲＭＳ－ＰＣＲ法（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ＰＣＲ、例えばＮｅｗｔｏｎ，Ｃ．Ｒ．　ｅｔ　ａｌ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９８９，　１７，　２５０３－２５１６；Ｖ．　Ｖｅｎｅｇａｓ　ｅｔ　ａｌ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２０１２，　８３７，　３１３－３２６、これらの文献は、その全体が参照として本明細書に取り込まれる）である。この方法では、検出対象となる点変異の塩基とその前後の塩基配列を基に、野生型配列を増幅するためのプライマーＤＮＡセット（野生型検出用プライマーＤＮＡセット）と点変異を含む配列を増幅するためのプライマーＤＮＡセット（変異型検出用プライマーＤＮＡセット）とを設計し、各プライマーＤＮＡセットを用いて、測定対象のｍｔ－ｒＲＮＡの逆転写反応により得られたＤＮＡを鋳型とした定量的ＰＣＲを行う。定量的ＰＣＲにより決定された野生型検出用プライマーＤＮＡセットを用いた場合のＣＴ値（ＣＴｗｉｌｄ）及び変異型検出用プライマーＤＮＡセットを用いた場合のＣＴ値（ＣＴｍｕｔ）を、下記式にあてはめることで、変異率を算出することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 The mutation rate can be quantified by using a known method that can be used for quantification of gene mutation, for example, an allele-specific PCR method, an invader method, an allele-specific hybridization method, a next-generation sequencing method, or the like. One of these methods preferably used is the Quantitative ARMS-PCR Method (Amplification Refractory Mutation Systems PCR, eg Newton, CR et al, Nucleic Acids Res. 1989, 17, 2503-2516; V. Venegas et al, Methods Mol. Biol. 2012, 837, 313-326, these documents are incorporated herein by reference in their entirety). In this method, a primer DNA set for amplifying a wild-type sequence (primer DNA set for wild-type detection) and a sequence containing a point mutation are amplified based on the base of the point mutation to be detected and the base sequences before and after it. Quantitative PCR using the DNA obtained by the reverse transcription reaction of the mt-rRNA to be measured as a template, using each primer DNA set by designing a primer DNA set (primer DNA set for mutation detection). I do. C T value in the case of using the wild type detection primer DNA set determined by quantitative PCR (C Twild) and C T value in the case of using a mutant detection primer DNA set (C Tmut), the following formula By applying to this, the mutation rate can be calculated.
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　本態様のキットは、野生型検出用プライマーＤＮＡセット及び変異型検出用プライマーＤＮＡセットを含むものであればよいが、逆転写酵素、ＰＣＲ反応用の試薬、バッファー等をさらに含んでもよい。 The kit of this embodiment may include a primer DNA set for wild-type detection and a primer DNA set for mutant detection, but may further include reverse transcriptase, a reagent for PCR reaction, a buffer, and the like.
核酸及びこれを封入した脂質膜構造体
１）第一実施形態の脂質膜構造体
　本発明の別の態様は、核酸とカチオン性ポリマーとを含むナノ粒子を内包した脂質膜構造体（「第一実施形態の脂質膜構造体」という）に関する。
　本発明の核酸とカチオン性ポリマーとを含むナノ粒子を内包した脂質膜構造体は、サイズの大きな核酸を内包することができる。例えば、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされるＲＮＡにおいて最大のサイズを有するでさえも、本発明の上記脂質膜構造体に内包できる。
　ここで、「内包」とは、脂質膜構造体がナノ粒子を含むこと、好ましくは、ナノ粒子を脂質膜構造体が完全に包み込むことを意味する。 Nucleic acid and lipid membrane structure encapsulating it 1) Lipid membrane structure of the first embodiment Another aspect of the present invention is a lipid membrane structure containing nanoparticles containing nucleic acid and a cationic polymer (“first”. The lipid membrane structure of the embodiment ").
The lipid membrane structure containing nanoparticles containing the nucleic acid of the present invention and a cationic polymer can contain a large-sized nucleic acid. For example, even having the largest size of RNA encoded by mitochondrial DNA can be encapsulated in the lipid membrane structure of the present invention.
Here, "internal capsule" means that the lipid film structure contains nanoparticles, preferably the lipid film structure completely encloses the nanoparticles.
　第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡまたはこれらの核酸誘導体であり得る。核酸誘導体としては、例えば、架橋核酸（ＢＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、核酸がペプチド結合で連結した核酸であるペプチド核酸、およびモルフォリノ環骨格を有する核酸であるモルフォリノ核酸が挙げられる。核酸は、これらの核酸の複数種類を含むものであってもよい。 In the lipid membrane structure of the first embodiment, the nucleic acid can be DNA or RNA or a nucleic acid derivative thereof. Examples of the nucleic acid derivative include a cross-linked nucleic acid (BNA), a locked nucleic acid (LNA), a peptide nucleic acid in which the nucleic acid is linked by a peptide bond, and a morpholino nucleic acid in which the nucleic acid has a morpholino ring skeleton. The nucleic acid may include a plurality of types of these nucleic acids.
　第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸は、好ましい態様では、ＲＮＡであり得る。ＲＮＡとしては、特に限定されないが、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびｔＲＮＡが挙げられる。本発明によれば、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされるＲＮＡ（ｍｔ－ＲＮＡ）において最大のサイズを有するｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡおよびｍｔ－１２Ｓ　ＲＮＡでさえも、第一実施形態の脂質膜構造体に内包させることができた。したがって、核酸は、例えば、４０塩基長以上、５０塩基長以上、６０塩基長以上、７０塩基長以上、８０塩基長以上、９０塩基長以上、１００塩基長以上、１１０塩基長以上、１２０塩基長以上、１３０塩基長以上、１４０塩基長以上、１５０塩基長以上、１６０塩基長以上、１７０塩基長以上、１８０塩基長以上、１９０塩基長以上、２００塩基長以上、３００塩基長以上、４００塩基長以上、５００塩基長以上、６００塩基長以上、７００塩基長以上、８００塩基長以上、９００塩基長以上、１０００塩基長以上、１１００塩基長以上、１２００塩基長以上、１３００塩基長以上、１４００塩基長以上、または、１５００塩基長以上であり得る。 In the lipid membrane structure of the first embodiment, the nucleic acid can be RNA in a preferred embodiment. RNA includes, but is not limited to, mRNA, rRNA, and tRNA. According to the present invention, even mt-16S rRNA and mt-12S RNA having the largest size in RNA (mt-RNA) encoded by mitochondrial DNA are included in the lipid membrane structure of the first embodiment. Was made. Therefore, the nucleic acid is, for example, 40 base length or more, 50 base length or more, 60 base length or more, 70 base length or more, 80 base length or more, 90 base length or more, 100 base length or more, 110 base length or more, 120 base length or more. 130 base length or more, 140 base length or more, 150 base length or more, 160 base length or more, 170 base length or more, 180 base length or more, 190 base length or more, 200 base length or more, 300 base length or more, 400 base length or more 500 base length or more, 600 base length or more, 700 base length or more, 800 base length or more, 900 base length or more, 1000 base length or more, 1100 base length or more, 1200 base length or more, 1300 base length or more, 1400 base length or more Or more, or 1500 bases or more.
　第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸は、脂質膜構造体に内包される限り特に限定されないが例えば、２５００塩基長以下、２４００塩基長以下、２３００塩基長以下、２２００塩基長以下、２１００塩基長以下、２０００塩基長以下、１９００塩基以下、１８００塩基長以下、１７００塩基長以下、または１６００塩基長以下であり得る。 In the lipid membrane structure of the first embodiment, the nucleic acid is not particularly limited as long as it is included in the lipid membrane structure, but is, for example, 2500 base length or less, 2400 base length or less, 2300 base length or less, 2200 base length or less, 2100. It can be base length or less, 2000 base length or less, 1900 base length or less, 1800 base length or less, 1700 base length or less, or 1600 base length or less.
　第一実施形態の脂質膜構造体において、ＲＮＡは、一つの好ましい態様では、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡおよびｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡからなる群から選択されるｒＲＮＡであり得る。ミトコンドリアＤＮＡによりコードされるＲＮＡの中でｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡが最大のサイズを有する。したがって、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされる他のＲＮＡは、すべてｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡよりもサイズにおいて小さい。そして、本発明では、脂質膜構造体は、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされるいずれのＲＮＡを含むものであってもよい。すなわち、本発明では、脂質膜構造体は、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ、ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡ、ＮＤ１遺伝子によりコードされるＲＮＡ、ＮＤ２遺伝子によりコードされるＲＮＡ、ＣｏｘＩ遺伝子によりコードされるＲＮＡ、ＣｏｘＩＩ遺伝子によりコードされるＲＮＡ、ＡＴＰアーゼ６遺伝子によりコードされるＲＮＡ、ＡＴＰアーゼ８遺伝子によりコードされるＲＮＡ、ＣｏｘＩＩＩ遺伝子によりコードされるＲＮＡ、ＮＤ３遺伝子によりコードされるＲＮＡ、ＮＤ４Ｌ遺伝子によりコードされるＲＮＡ、ＮＤ４遺伝子によりコードされるＲＮＡ、ＮＤ５遺伝子によりコードされるＲＮＡ、ＮＤ６遺伝子によりコードされるＲＮＡ、Ｃｙｔｂ遺伝子および２２種類のｔＲＮＡ遺伝子によりコードされるＲＮＡからなる群から選択されるミトコンドリアＲＮＡを内包し得る。ＲＮＡがｍＲＮＡである場合には、トリプトファンのコドンとして１以上のＵＧＡを有していてもよい。本発明では、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡなどの特定の立体構造を形成して活性を発揮するタイプのＲＮＡであっても、細胞導入後に機能させることができる点で有利である。したがって、本発明のある好ましい態様では、ＲＮＡは、ｒＲＮＡおよびｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡであり得る。 In the lipid membrane structure of the first embodiment, the RNA can, in one preferred embodiment, be an rRNA selected from the group consisting of mt-12S rRNA and mt-16S rRNA. Among the RNAs encoded by mitochondrial DNA, mt-16S rRNA has the largest size. Therefore, all other RNAs encoded by mitochondrial DNA are smaller in size than mt-16S rRNA. Then, in the present invention, the lipid membrane structure may contain any RNA encoded by mitochondrial DNA. That is, in the present invention, the lipid membrane structure is encoded by mt-12S rRNA, mt-16S rRNA, RNA encoded by ND1 gene, RNA encoded by ND2 gene, RNA encoded by CoxI gene, and CoxII gene. RNA encoded by ATPase 6 gene, RNA encoded by ATPase 8 gene, RNA encoded by CoxIII gene, RNA encoded by ND3 gene, RNA encoded by ND4L gene, ND4 gene It may contain mitochondrial RNA selected from the group consisting of RNA encoded by, ND5 gene, RNA encoded by ND6 gene, Cytb gene and RNA encoded by 22 kinds of tRNA genes. When RNA is mRNA, it may have one or more UGA as a codon of tryptophan. In the present invention, even RNA of a type that exerts activity by forming a specific three-dimensional structure such as tRNA and rRNA is advantageous in that it can function after cell introduction. Thus, in certain preferred embodiments of the invention, the RNA can be RNA selected from the group consisting of rRNA and rRNA.
　第一実施形態の脂質膜構造体において、カチオン性ポリマーは、核酸と複合体形成をさせるために用いる。核酸は、ポリアニオンであるため、複合体形成には、ポリカチオンが適している。このように形成される粒子は、電気的に中和している必要が必ずしもないが、電気的に中和していてもよい。カチオン性ポリマーとしては、カチオン性アミノ酸を含むポリマー、例えば、カチオン性のタンパク質が挙げられる。カチオン性のタンパク質としては、例えば、プロタミンが挙げられる。プロタミンは、精子核のクロマチンの高度な凝集に必要なタンパク質であり、負電荷を帯びるＤＮＡと強く結合することが知られたタンパク質であり、本発明に好ましく用いられ得る。カチオン性ポリマーとして、カチオン性タンパク質を用いる場合には、Ｎ／Ｐ比が、例えば、０．５～１．０、または０．６～０．９となるように、タンパク質と核酸の混合比率を決定することができる。ここで、Ｎ／Ｐ比において、Ｎはタンパク質中の側鎖の窒素原子数を表し、Ｐは核酸中のリン原子数を表す。 In the lipid membrane structure of the first embodiment, the cationic polymer is used to form a complex with nucleic acid. Since the nucleic acid is a polyanion, a polycation is suitable for complex formation. The particles thus formed do not necessarily have to be electrically neutralized, but may be electrically neutralized. Examples of the cationic polymer include polymers containing cationic amino acids, for example, cationic proteins. Examples of cationic proteins include protamine. Protamine is a protein required for highly agglutination of chromatin in sperm nuclei, and is a protein known to strongly bind to negatively charged DNA, and can be preferably used in the present invention. When a cationic protein is used as the cationic polymer, the mixing ratio of the protein and the nucleic acid is adjusted so that the N / P ratio is, for example, 0.5 to 1.0 or 0.6 to 0.9. Can be decided. Here, in the N / P ratio, N represents the number of nitrogen atoms in the side chain in the protein, and P represents the number of phosphorus atoms in the nucleic acid.
　第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体は、核酸とカチオン性ポリマーとを溶液中で混合することによって溶液中で形成させることができる。上記混合に用いられる溶液としては、核酸とカチオン性ポリマーとが複合体を形成する限り特に限定されないが、例えば、中性の水溶液、例えば、ｐＨ７～８の水溶液、例えば、ｐＨ７．４の水溶液とすることがえきる。ｐＨの調整は、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤を用いて行うことができる。 In the lipid membrane structure of the first embodiment, the complex of nucleic acid and cationic polymer can be formed in solution by mixing nucleic acid and cationic polymer in solution. The solution used for the above mixing is not particularly limited as long as the nucleic acid and the cationic polymer form a complex, but for example, a neutral aqueous solution, for example, an aqueous solution of pH 7 to 8, for example, an aqueous solution of pH 7.4. I can do it. The pH can be adjusted using a buffer such as HEPES.
　第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を含む水溶液は、リン脂質を含むアルコール溶液と混合することによって、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質膜構造体が得られる。 In the lipid membrane structure of the first embodiment, the aqueous solution containing the complex of nucleic acid and the cationic polymer is a lipid containing the complex of nucleic acid and the cationic polymer by mixing with an alcohol solution containing phospholipid. A membrane structure is obtained.
　第一実施形態の脂質膜構造体において、リン脂質は、特に限定されないが例えば、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１、２－ジミリストイル－１、２－デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等であることができる。リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、スフィンゴミエリンであることが好ましく、より好ましくはジオレイルホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリンである。ある好ましい態様では、脂質膜構造体のミトコンドリアへの移行率を高める観点で、リン脂質は、ホスファチジン酸及びスフィンゴミエリンからなる群から選択される１以上のリン脂質と、ジオレイルホスファチジルエタノールアミンと、を含むものとすることができる。 In the lipid membrane structure of the first embodiment, the phospholipid is not particularly limited, but is, for example, phosphatidylcholine (for example, dioleoil phosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, etc.), phosphatidylglycerol, etc. (For example, dioreoil phosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylglycerol, dimyristoylphosphatidylglycerol, dipalmitoylphosphatidylglycerol, distearoylphosphatidylglycerol, etc.), phosphatidylethanolamine (for example, diolaylphosphatidylethanolamine, dilauroylphosphatidylethanolamine) , Dipalmitoylphosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, distearoylphosphatidylethanolamine, etc.), phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylic acid, cardiolipin, sphingomyelin, ceramide phosphorylethanolamine, ceramide phosphorylglycerol, ceramide phosphorylglycerol 1,2-Dipalmitoyl-1,2-deoxyphosphatidylcholine, plasmalogen, egg yolk lecithin, soybean lecithin, hydrogenated additives thereof and the like can be used. Phospholipids are preferably phosphatidylethanolamine (eg, diolaylphosphatidylethanolamine, dilauroylphosphatidylethanolamine, dimyristylphosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, distearoylphosphatidylethanolamine, etc.) and sphingomyelin. More preferably, diorail phosphatidylethanolamine and sphingomyelin. In one preferred embodiment, the phospholipids are composed of one or more phospholipids selected from the group consisting of phosphatidic acid and sphingomyelin, dioleylphosphatidylethanolamine, and diorail phosphatidylethanolamine, in view of increasing the transfer rate of the lipid membrane structure to mitochondria. Can be included.
　第一実施形態の脂質膜構造体において、アルコール溶液で用いられるアルコールは、特に制限はないが、例えば、エタノール、ｔ－ブタノール、１－プロパノール、２－プロパノール及び２－ブトキシエタノール等を挙げることができ、エタノールが好ましく用いられ得る。エタノールは、例えば、１００％エタノールであり得る。 In the lipid membrane structure of the first embodiment, the alcohol used in the alcohol solution is not particularly limited, and examples thereof include ethanol, t-butanol, 1-propanol, 2-propanol, and 2-butoxyethanol. Yes, ethanol can be preferably used. Ethanol can be, for example, 100% ethanol.
　本発明のある好ましい態様では、脂質膜構造体に膜透過性を付与するために、当該脂質膜構造体は、細胞膜透過性ペプチドなどのカチオン性のポリマー（例えば、カチオン性アミノ酸のポリマー、例えば、ポリアルギニンまたはポリリジン）を表出していてもよい。このようにすることによって、脂質膜構造体を細胞内への導入を促進することができる。細胞内に導入された脂質膜構造体は、細胞質で核酸を機能させるか、または、脂質膜構造体がミトコンドリア指向性ペプチドを表出する場合には、ミトコンドリアで核酸を機能させることができる。このように、本発明では、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡなどの特定の立体構造を形成して活性を発揮するタイプのＲＮＡであっても、細胞導入後に機能させることができる点で有利である。カチオン性のポリマーを脂質膜構造体に表出させるためには、カチオン性のポリマーと脂質（特に限定されないが例えば、ミリストイル基）とのコンジュゲートを作製し、当該コンジュゲートの脂質部分で脂質膜構造体にアンカーさせることによって、カチオン性ポリマーを安定的に脂質膜構造体に表出させることができる。膜透過性ペプチドとしては、ｔａｔペプチド（ヒト免疫不全ウイルスのｔａｔタンパク質のＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＡＦ３５３６２．１のアミノ酸配列の４８～６０位に対応するペプチド配列を有する）、オリゴアルギニン（Ｒ９）、オリゴリジン（Ｋ１０）などの塩基性アミノ酸に富むペプチド、ペネトラチンなどの塩基性部分と疎水性部分とを有する両親媒性ペプチド、トランスポーチン、ＴＰ１０などのペプチドが挙げられる。膜透過性ペプチドであって、ミトコンドリア指向性を有するペプチドとしては、オクタアルギニン（Ｒ８）、親油性トリフェニルホスホニウムカチオン（Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ　ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ　ｃａｔｉｏｎ；ＴＰＰ）若しくはローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）１２３などの脂溶性カチオン物質、ミトコンドリア標的配列（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＭＴＳ）ペプチド（Ｋｏｎｇ，ＢＷ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　２００３，１６２５，ｐｐ．９８－１０８）若しくはＳ２ペプチド（Ｓｚｅｔｏ，Ｈ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．　２０１１，２８，ｐｐ．２６６９－２６７９）などのポリペプチドが挙げられる。ここでＳ２ペプチドとしては、Ｄｍｔ－Ｄ－Ａｒｇ－ＦＫ－Ｄｍｔ－Ｄ－Ａｒｇ－ＦＫ－ＮＨ２｛ここで、Ｄｍｔは、２，６－ジメチルチロシンであり、Ｄ－ＡｒｇはＤ体のアルギニンであり、Ｆは、Ｌ体のフェニルアラニンであり、Ｋは、Ｌ体のリジンである｝が挙げられる。ある態様では、脂質膜構造体（または脂質ナノ粒子）のゼータ電位が５ｍＶ以上、１０ｍＶ以上、１５ｍＶ以上、１６ｍＶ以上、１７ｍＶ以上、１８ｍＶ以上、１９ｍＶ以上、または２０ｍＶ以上、例えば、約２０ｍＶであり得る。 In one preferred embodiment of the invention, in order to impart membrane permeability to the lipid membrane structure, the lipid membrane structure is a cationic polymer such as a cell membrane penetrating peptide (eg, a polymer of cationic amino acids, eg, a polymer of cationic amino acids, eg. Polyarginine or polylysine) may be expressed. By doing so, the introduction of the lipid membrane structure into the cell can be promoted. The lipid membrane structure introduced into the cell can function the nucleic acid in the cytoplasm, or if the lipid membrane structure expresses a mitochondrial directional peptide, the nucleic acid can function in the mitochondria. As described above, the present invention is advantageous in that even RNA of a type that exhibits activity by forming a specific three-dimensional structure such as tRNA and rRNA can be made to function after cell introduction. In order to express the cationic polymer on the lipid membrane structure, a conjugate of the cationic polymer and a lipid (for example, a myristol group) is prepared, and the lipid membrane is formed on the lipid portion of the conjugate. By anchoring to the structure, the cationic polymer can be stably expressed on the lipid membrane structure. The membrane-permeable peptides include tat peptide (having a peptide sequence corresponding to the 48-60 position of the amino acid sequence of AAF35362.1., GenBank registration number of tat protein of human immunodeficiency virus), oligoarginine (R9), oligolysine. Examples thereof include peptides rich in basic amino acids such as (K10), amphipathic peptides having a basic portion and a hydrophobic portion such as penetratin, and peptides such as transportin and TP10. Membrane-permeable peptides having mitochondrial orientation include lipophilic cations such as octaarginine (R8), lipophilic triphenylphosphonium cation (TPP) or rhodamine 123, and mitochondria. Target sequence (Mitochondrial Targeting Sequence; MTS) Peptide (Kong, BW. Et al., Biochimica et Biophysica Acta 2003, 1625, pp. 98-108) or S2 peptide (Szeto, H. R. 2011, 28, pp. 2669-2679) and the like. Here, as the S2 peptide, Dmt-D-Arg-FK-Dmt-D-Arg-FK-NH 2 {Here, Dmt is 2,6-dimethyltyrosine, and D-Arg is D-form arginine. Yes, F is L-form phenylalanine and K is L-form lysine}. In some embodiments, the zeta potential of the lipid membrane structure (or lipid nanoparticles) can be 5 mV or higher, 10 mV or higher, 15 mV or higher, 16 mV or higher, 17 mV or higher, 18 mV or higher, 19 mV or higher, or 20 mV or higher, for example, about 20 mV. ..
　第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質膜構造体は、動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定した平均粒径（数平均粒径）が、２００ｎｍ以下、１９０ｎｍ以下、１８０ｎｍ以下、１７０ｎｍ以下、１６０ｎｍ以下、または、１５０ｎｍ以下であり得る。平均粒径が小さいことは細胞への取込み効率を高める観点で好ましい。第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質膜構造体は、動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定した平均粒径が、例えば、２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、４０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、６０ｎｍ以上、７０ｎｍ以上、８０ｎｍ以上、９０ｎｍ以上、または１００ｎｍ以上であり得る。第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質膜構造体は、動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定した平均粒径が、例えば、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下、５０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下、または１００ｎｍ以上１５０ｎｍ以下であり得る。この態様において、核酸は、１０００塩基長未満であってもよいが、好ましくは、核酸は、１０００塩基長以上であり得る。 In the lipid membrane structure of the first embodiment, the lipid membrane structure containing a complex of nucleic acid and a cationic polymer has an average particle size (number average particle size) measured by a dynamic light scattering method (DLS method). However, it can be 200 nm or less, 190 nm or less, 180 nm or less, 170 nm or less, 160 nm or less, or 150 nm or less. A small average particle size is preferable from the viewpoint of increasing the efficiency of uptake into cells. In the lipid membrane structure of the first embodiment, the lipid membrane structure containing a complex of nucleic acid and a cationic polymer has an average particle size of, for example, 20 nm or more measured by a dynamic light scattering method (DLS method). , 30 nm or more, 40 nm or more, 50 nm or more, 60 nm or more, 70 nm or more, 80 nm or more, 90 nm or more, or 100 nm or more. In the lipid membrane structure of the first embodiment, the lipid membrane structure containing a complex of nucleic acid and a cationic polymer has an average particle size of, for example, 20 nm or more measured by a dynamic light scattering method (DLS method). It can be 200 nm or less, 50 nm or more and 150 nm or less, or 100 nm or more and 150 nm or less. In this embodiment, the nucleic acid may be less than 1000 bases long, but preferably the nucleic acid may be more than 1000 bases long.
　第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質膜構造体は、動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定した多分散性指数（ＰＤＩ）は、例えば、０．４以下、０．３５以下、または０．３以下であり得る。上記多分散性指数は、例えば、０．１以上、０．１５以上、または０．２以上であり得る。この態様において、核酸は、１０００塩基長未満であってもよいが、好ましくは、核酸は、１０００塩基長以上であり得る。 In the lipid membrane structure of the first embodiment, the lipid membrane structure containing a complex of nucleic acid and a cationic polymer has a polydispersity index (PDI) measured by a dynamic light scattering method (DLS method). For example, it can be 0.4 or less, 0.35 or less, or 0.3 or less. The polydispersity index can be, for example, 0.1 or more, 0.15 or more, or 0.2 or more. In this embodiment, the nucleic acid may be less than 1000 bases long, but preferably the nucleic acid may be more than 1000 bases long.
　第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質膜構造体は、動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定した平均粒径が、例えば、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下かつＰＤＩが０．４以下、平均粒径が５０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下かつＰＤＩが、０．４以下、または平均粒径が１００ｎｍ以上１５０ｎｍ以下かつＰＤＩが、０．４以下であり得る。第一実施形態の脂質膜構造体において、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を内包した脂質膜構造体は、動的光散乱法（ＤＬＳ法）により測定した平均粒径が、例えば、２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下かつＰＤＩが０．３以下、平均粒径が５０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下かつＰＤＩが、０．３以下、または平均粒径が１００ｎｍ以上１５０ｎｍ以下かつＰＤＩが、０．３以下であり得る。この態様において、核酸は、１０００塩基長未満であってもよいが、好ましくは、核酸は、１０００塩基長以上であり得る。 In the lipid membrane structure of the first embodiment, the lipid membrane structure containing a complex of nucleic acid and a cationic polymer has an average particle size of, for example, 20 nm or more measured by a dynamic light scattering method (DLS method). It can be 200 nm or less and PDI 0.4 or less, average particle size 50 nm or more and 150 nm or less and PDI 0.4 or less, or average particle size 100 nm or more and 150 nm or less and PDI 0.4 or less. In the lipid membrane structure of the first embodiment, the lipid membrane structure containing a complex of nucleic acid and a cationic polymer has an average particle size of, for example, 20 nm or more measured by a dynamic light scattering method (DLS method). It can be 200 nm or less and PDI 0.3 or less, average particle size 50 nm or more and 150 nm or less and PDI 0.3 or less, or average particle size 100 nm or more and 150 nm or less and PDI 0.3 or less. In this embodiment, the nucleic acid may be less than 1000 bases long, but preferably the nucleic acid may be more than 1000 bases long.
２）第二実施形態の脂質膜構造体
　本発明の別の態様は、以下のａ）又はｂ）に示される核酸、及びこれを封入してなるミトコンドリア指向性脂質膜構造体（「第二実施形態の脂質膜構造体」という）に関する；
　ａ）第一のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列、ｍｔ－ｒＲＮＡの塩基配列及び第二のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列をこの順番で含むＲＮＡ
　ｂ）プロモーターの塩基配列及びａ）のＲＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡ 2) Lipid membrane structure of the second embodiment Another aspect of the present invention is the nucleic acid shown in a) or b) below, and a mitochondrial-oriented lipid membrane structure comprising the nucleic acid shown in the following a) or b) (“Second embodiment). Regarding the morphological lipid membrane structure ");
a) RNA containing the base sequence of the first mitochondrial tRNA, the base sequence of mt-rRNA and the base sequence of the second mitochondrial tRNA in this order.
b) DNA containing the promoter base sequence and the base sequence complementary to the RNA of a)
　第二実施形態の脂質膜構造体において、ａ）のＲＮＡは、第一のミトコンドリアｔＲＮＡ（以下、ｍｔ－ｔＲＮＡと表す）の塩基配列、ｍｔ－ｒＲＮＡの塩基配列及び第二のｍｔ－ｔＲＮＡの塩基配列をこの順番で含む。 In the lipid membrane structure of the second embodiment, the RNA of a) is the base sequence of the first mitochondrial tRNA (hereinafter referred to as mt-tRNA), the base sequence of mt-rRNA, and the base of the second mt-tRNA. Contains sequences in this order.
　第二実施形態の脂質膜構造体のａ）のＲＮＡにおいて、ｍｔ－ｔＲＮＡの塩基配列は、ミトコンドリアゲノムに含まれるヒトでは計２２種類のｍｔ－ｔＲＮＡ遺伝子の塩基配列から任意に選択して使用することができる。また、第一及び第二のｍｔ－ｔＲＮＡの塩基配列は、互いに異なったものでもよく、また同じものでもよい。 In the RNA of the lipid membrane structure a) of the second embodiment, the base sequence of mt-tRNA is arbitrarily selected and used from the base sequences of a total of 22 types of mt-tRNA genes in humans contained in the mitochondrial genome. be able to. Further, the base sequences of the first and second mt-tRNAs may be different from each other or may be the same.
　第二実施形態の脂質膜構造体のａ）のＲＮＡにおいて、ｍｔ－ｒＲＮＡは、ミトコンドリア内で発現させる、言い換えればその機能を発揮させることが望まれるｍｔ－ｒＲＮＡであればよく、ミトコンドリア病の治療に有効であると期待されるｍｔ－ｒＲＮＡの他に、ミトコンドリア内で発現させることに学術的な関心が持たれるｍｔ－ｒＲＮＡ等を挙げることができる。本発明においてｍｔ－ｒＲＮＡは、野生型の１２ＳリボソームＲＮＡ（ｍｔ－１２ＳｒＲＮＡ）であることが好ましい。ｍｔ－１２ＳｒＲＮＡは、ミトコンドリア翻訳に必須であり、ｍｔ－１２ＳｒＲＮＡの機能不全は細胞機能を低下させ、難聴を発症させるものと考えられている。 In the RNA of a) of the lipid membrane structure of the second embodiment, the mt-rRNA may be any mt-rRNA expressed in mitochondria, in other words, mt-rRNA desired to exert its function, and is used for treating mitochondrial disease. In addition to mt-rRNA which is expected to be effective for mitochondria, mt-rRNA and the like which have academic interest in expression in mitochondria can be mentioned. In the present invention, the mt-rRNA is preferably a wild-type 12S ribosomal RNA (mt-12S rRNA). mt-12SrRNA is essential for mitochondrial translation, and dysfunction of mt-12SrRNA is thought to reduce cell function and cause hearing loss.
　第二実施形態の脂質膜構造体のａ）のＲＮＡにおいて、第一のｍｔ－ｔＲＮＡの塩基配列、ｍｔ－ｒＲＮＡの塩基配列及び第二のｍｔ－ｔＲＮＡの塩基配列は、介在配列、例えばミトコンドリアゲノムにおける各々の５’末端側及び３’末端側のフランキング配列等を介して連結されていてもよいが、介在配列が存在せずに直接的に連結されていること、すなわちｍｔ－ｒＲＮＡの塩基配列及び２つのｍｔ－ｔＲＮＡの塩基配列が連続していることが好ましい。介在配列が存在する場合、その長さは、１～１０塩基程度、例えば１～６塩基、好ましくは１～３塩基である。また、ａ）のＲＮＡは、第一のｍｔ－ｔＲＮＡの塩基配列の５’末端側及び第二のｍｔ－ｔＲＮＡの塩基配列の３’末端側に、上記のフランキング配列等を１～１０塩基程度、例えば１～６塩基、好ましくは１～３塩基、さらに有していてもよい。 In the RNA of the lipid membrane structure a) of the second embodiment, the base sequence of the first mt-tRNA, the base sequence of mt-rRNA and the base sequence of the second mt-tRNA are intervening sequences, for example, the mitochondrial genome. It may be linked via the flanking sequences on the 5'end side and the 3'end side of each of the above, but it is directly linked without the presence of an intervening sequence, that is, the base of mt-rRNA. It is preferable that the sequence and the base sequences of the two mt-tRNAs are continuous. When an intervening sequence is present, its length is about 1 to 10 bases, for example 1 to 6 bases, preferably 1 to 3 bases. Further, the RNA of a) has 1 to 10 bases of the above flank sequence or the like on the 5'end side of the base sequence of the first mt-tRNA and the 3'end side of the base sequence of the second mt-tRNA. It may have a degree, for example, 1 to 6 bases, preferably 1 to 3 bases, and further.
　なお、第二実施形態の脂質膜構造体において、ａ）のＲＮＡは、ｍｔ－ｒＲＮＡの塩基配列を複数個含み、かつ前記ｍｔ－ｒＲＮＡの塩基配列の各々がその５’末端側及び３’末端側にミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列を有するＲＮＡであってもよい。かかるＲＮＡは、例えばｍｔ－ｒＲＮＡの塩基配列を２個含む場合、「第一のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列、第一のｍｔ－ｒＲＮＡの塩基配列、第二のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列、第二のｍｔ－ｒＲＮＡの塩基配列及び第三のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列をこの順番で含むＲＮＡと表すことができる。かかるＲＮＡの詳細は、ａ）のＲＮＡについて上で説明したとおりであり、含まれる複数個のｍｔ－ｒＲＮＡの塩基配列、及び複数個のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列は、互いに異なったものであっても同じものであってもよい。 In the lipid membrane structure of the second embodiment, the RNA of a) contains a plurality of base sequences of mt-rRNA, and each of the base sequences of the mt-rRNA is 5'end and 3'end. It may be RNA having a base sequence of mitochondrial tRNA on the side. When such RNA contains, for example, two base sequences of mt-rRNA, "the base sequence of the first mitochondrial tRNA, the base sequence of the first mt-rRNA, the base sequence of the second mitochondrial tRNA, the second mt The base sequence of -rRNA and the base sequence of the third mitochondrial tRNA can be expressed as RNA containing in this order. The details of such RNA are as described above for the RNA of a), and a plurality of RNAs contained therein. The base sequence of mt-rRNA and the base sequence of a plurality of mitochondrial tRNAs may be different from each other or the same.
　ｂ）のＤＮＡは、プロモーターの塩基配列及びａ）のＲＮＡすなわち前記ａ）のＲＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡである。具体的には、ｂ）のＤＮＡは、プロモーターの塩基配列、第一のｍｔ－ｔＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列、ｍｔ－ｒＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列及び第二のｍｔ－ｔＲＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列をこの順番で含むＤＮＡである。ここで、第一及び第二のｍｔ－ｔＲＮＡの塩基配列、ｍｔ－ｒＲＮＡの塩基配列の各特徴は、ａ）のＲＮＡについて説明したとおりである。 The DNA of b) is a DNA containing the base sequence of the promoter and the RNA of a), that is, the base sequence complementary to the RNA of a). Specifically, the DNA of b) includes the base sequence of the promoter, the base sequence complementary to the base sequence of the first mt-tRNA, the base sequence complementary to the base sequence of mt-rRNA, and the second mt-. It is a DNA containing a base sequence complementary to the base sequence of tRNA in this order. Here, the characteristics of the first and second mt-tRNA base sequences and the mt-rRNA base sequences are as described for the RNA of a).
　プロモーター配列は、ａ）のＲＮＡに相補的な塩基配列をその制御下に有する。プロモーター配列の制御下に有するとは、ａ）のＲＮＡに相補的な塩基配列がプロモーター配列に転写可能に連結されていること、すなわちプロモーター配列の転写活性によって転写が開始される範囲内にａ）のＲＮＡに相補的な塩基配列が存在することを意味する。例としては、プロモーター配列の３’末端から概ね１～２００塩基の範囲内に第一のｍｔ－ｔＲＮＡがある場合を挙げることができるが、そのような範囲はプロモーター配列の種類によって変化し、当業者によって適宜調節することができる。 The promoter sequence has a base sequence complementary to the RNA of a) under its control. Having under the control of the promoter sequence means that the base sequence complementary to the RNA of a) is transcribeably linked to the promoter sequence, that is, within the range in which transcription is initiated by the transcriptional activity of the promoter sequence a). It means that there is a base sequence complementary to the RNA of. An example may be the case where the first mt-tRNA is within a range of approximately 1 to 200 bases from the 3'end of the promoter sequence, but such a range varies depending on the type of promoter sequence. It can be adjusted as appropriate by a person skilled in the art.
　プロモーターは、転写活性すなわちｍｔ－ｒＲＮＡの転写誘導能を示すものであれば特に制限はないが、ミトコンドリアに送達された際により効率的かつ選択的なｍｔ－ｒＲＮＡを発現させるためには、特許文献ＷＯ２０１７／０９０７６３及びＵＳ２０１８／０３６２９９９（これらの文献は、その全体が参照として本明細書に取り込まれる）に記載されるように、哺乳動物の細胞核内で転写活性を示すプロモーターが好ましい。哺乳動物の細胞核内で転写活性を示すプロモーターの例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（ＳＶ）４０プロモーター、ラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、βアクチンプロモーター及びＴ７プロモーター等を挙げることができ、ＣＭＶプロモーター又はＲＳＶプロモーターの利用が好ましい。またこれらは、転写活性が損なわれない限り、塩基配列に置換その他の変異が加わったものであってもよい。 The promoter is not particularly limited as long as it exhibits transcriptional activity, that is, the ability to induce transcription of mt-rRNA, but in order to express more efficiently and selectively mt-rRNA when delivered to mitochondria, Patent Documents Promoters that exhibit transcriptional activity in the cell nucleus of mammals are preferred, as described in WO2017 / 090763 and US2018 / 0362999 (these documents are incorporated herein by reference in their entirety). Examples of promoters that exhibit transcriptional activity in the cell nucleus of mammals include cytomegalovirus (CMV) promoter, Simianvirus (SV) 40 promoter, Raus sarcomavirus (RSV) promoter, EF1α promoter, β-actin promoter and T7 promoter. Etc., and it is preferable to use a CMV promoter or an RSV promoter. Further, these may be those in which substitution or other mutation is added to the base sequence as long as the transcriptional activity is not impaired.
　ｂ）のＤＮＡは一本鎖の形態にあってもよく、又はこれに相補する塩基配列からなるＤＮＡとの二本鎖の形態にあってもよい。 The DNA of b) may be in a single-stranded form, or may be in a double-stranded form with a DNA having a base sequence complementary thereto.
　ｂ）のＤＮＡがミトコンドリアに送達されることにより、前記プロモーターが機能してａ）のＲＮＡがミトコンドリア内で転写合成されｍｔ－ｒＲＮＡが合成される。 When the DNA of b) is delivered to the mitochondria, the promoter functions and the RNA of a) is transcribed and synthesized in the mitochondria to synthesize mt-rRNA.
　第二実施形態の脂質膜構造体におけるミトコンドリア指向性脂質膜構造体は、脂質膜の構成脂質としてスフィンゴミエリン（ＳＭ）を、好ましくはジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とＳＭとを含む。その他、第二実施形態の脂質膜構造体では、脂質膜の構成脂質として、第一実施形態で用いられ得るリン脂質を適宜用いることができる。 The mitochondrial-directed lipid membrane structure in the lipid membrane structure of the second embodiment contains sphingomyelin (SM), preferably dioleylphosphatidylethanolamine (DOPE) and SM as constituent lipids of the lipid membrane. In addition, in the lipid membrane structure of the second embodiment, the phospholipid that can be used in the first embodiment can be appropriately used as the constituent lipid of the lipid membrane.
　第二実施形態の脂質膜構造体において、ミトコンドリア指向性脂質膜構造体は、膜透過性ペプチドで修飾されていることが好ましい。膜透過性ペプチドとしては、ポリアルギニン、Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＡＴ；例えばＨ．　Ｎａｇａｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔ．　Ｍｅｄ．　４　（１９９８）　１４４９－１４５２及びＶ．　Ｐ．　Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．　Ｓ．　Ａ．　９８　（２００１）　８７８６－８７９１を参照されたい。これらの文献は、その全体が参照として本明細書に取り込まれる）を挙げることができる。ポリアルギニンは、連続した４～２０個のアルギニン残基からなるポリアルギニンペプチドであることが好ましく、オクタアルギニンであることが特に好ましい。 In the lipid membrane structure of the second embodiment, the mitochondrial-directed lipid membrane structure is preferably modified with a membrane-permeable peptide. Membrane-permeable peptides include polyarginine, Trans-Activator of Transcription Protein (TAT; for example, H. Nagahara et al., Nat. Med. 4 (1998) 1449-1452 and V. P. Torchilin et al. See Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2001) 8786-8791. These documents are incorporated herein by reference in their entirety). The polyarginine is preferably a polyarginine peptide consisting of 4 to 20 consecutive arginine residues, and particularly preferably octaarginine.
　第二実施形態の脂質膜構造体においては、加えて、ミトコンドリア指向性脂質膜構造体は、ミトコンドリア指向性分子で修飾されていることが好ましい。ミトコンドリア指向性分子としては、例えばＭＴＳペプチド（Ｋｏｎｇ，ＢＷ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　２００３，　１６２５，　ｐ．９８－１０８）又はＳ２ペプチド（Ｓｚｅｔｏ，Ｈ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．　２０１１，　２８，　ｐ．２６６９－２６７９）を挙げることができる。その他、第二実施形態の脂質膜構造体は、第一実施形態で用いられる細胞膜透過性ペプチドおよび／またはミトコンドリア指向性を有するペプチドで修飾されたものとしてもよい。 In the lipid membrane structure of the second embodiment, it is preferable that the mitochondrial directional lipid membrane structure is modified with a mitochondrial directional molecule. Examples of the mitochondrial directional molecule include an MTS peptide (Kong, BW. Et al., Biochimica et Biophysica Acta 2003, 1625, p. 98-108) or an S2 peptide (Szeto, HH et al., Pharm. Res). . 2011, 28, p. 2669-2679) can be mentioned. In addition, the lipid membrane structure of the second embodiment may be modified with the cell membrane penetrating peptide and / or the peptide having mitochondrial directivity used in the first embodiment.
　また、第二実施形態の脂質膜構造体において、ミトコンドリア指向性脂質膜構造体は、脂質膜表面に配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、ＫＡＬＡペプチドと表す）を有することも好ましい。ＫＡＬＡペプチドは、Ｓｈａｈｅｅｎら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，　２０１１，　３２：　６３４２－６３５０）において、脂質膜同士の膜融合を促進する機能を有する脂質膜融合性ペプチドとして記載されている。ＫＡＬＡペプチドは、脂質膜構造体の表面に置かれることで脂質膜構造体を細胞内オルガネラであるミトコンドリアに選択的に送達させる能力を有する。 Further, in the lipid membrane structure of the second embodiment, it is also preferable that the mitochondrial directional lipid membrane structure has a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 (hereinafter referred to as KALA peptide) on the surface of the lipid membrane. .. The KALA peptide is described in Shaheen et al. (Biometricals, 2011, 32: 6342-6350) as a lipid membrane-fusing peptide having a function of promoting membrane fusion between lipid membranes. The KALA peptide has the ability to selectively deliver the lipid membrane structure to mitochondria, which are organelles, by being placed on the surface of the lipid membrane structure.
　第二実施形態の脂質膜構造体におけるミトコンドリア指向性脂質膜構造体の好ましい具体例は、ＤＯＰＥとＳＭとを脂質膜の構成脂質として含み、かつ脂質膜表面がオクタアルギニンペプチド、ＭＴＳペプチド及びＳ２ペプチドのうちの少なくとも１つで修飾された脂質膜構造体ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（特許第５０６７７３３号；ＷＯ２００６／０９５８３７；Ｙａｍａｄａ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ．　２００８，　１７７８，　ｐ．４２３－４３２）及び多重型脂質膜構造体ＤＦ－ＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒ（Ｙａｍａｄａ，Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，　２０１１，　１９，　ｐ．１４４９－１４５６；　Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ　２０１３，　１３，　ｐ．６１０－６１４）、並びにＷＯ２０１７／０９０７６３及びＵＳ２０１８／０３６２９９９にその製造方法と共に詳細に記載された脂質膜構造体において、ＤＯＰＥとＳＭとを脂質膜の構成脂質として含み、かつ脂質膜表面がＫＡＬＡペプチドで修飾された脂質膜構造体等を挙げることができる。これらの文献は、その全体が参照として本明細書に取り込まれる。 A preferable specific example of the mitochondrial directional lipid membrane structure in the lipid membrane structure of the second embodiment is that DOPE and SM are contained as constituent lipids of the lipid membrane, and the surface of the lipid membrane is an octaarginine peptide, an MTS peptide and an S2 peptide. Lipid bilayer structure MITO-Porter (Patent No. 5067733; WO2006 / 095833; Yamada Y. et al., Biochim Biophys Acta. 2008, 1778, p.423-432) and multiplex modified with at least one of them. Type lipid membrane structure DF-MITO-Porter (Yamada, Y. et al., Mol. Ther., 2011, 19, p. 1449-1456; Kawamura, E. et al., Mitochondron 2013, 13, p.610 -614), and in the lipid membrane structure described in detail in WO2017 / 090763 and US2018 / 0362999 together with the method for producing the same, DOPE and SM are contained as constituent lipids of the lipid membrane, and the surface of the lipid membrane is modified with KALA peptide. Examples thereof include the obtained lipid membrane structure. These documents are incorporated herein by reference in their entirety.
　本態様において最も好ましい脂質膜構造体は、前記ａ）又はｂ）の核酸が封入され、脂質膜の構成脂質としてＤＯＰＥとＳＭとを含み、かつ脂質膜の表面にＫＡＬＡペプチドを有する脂質膜構造体である。この脂質膜構造体は、ＷＯ２０１７／０９０７６３及びＵＳ２０１８／０３６２９９９に記載された、ＫＡＬＡペプチドで修飾されＤＮＡを封入した脂質膜構造体の製造法に準じて、ＤＮＡを前記ａ）又はｂ）の核酸にそれぞれ置き換えることで製造することができる。 The most preferable lipid membrane structure in this embodiment is a lipid membrane structure in which the nucleic acid of the above a) or b) is encapsulated, contains DOPE and SM as constituent lipids of the lipid membrane, and has a KALA peptide on the surface of the lipid membrane. Is. This lipid membrane structure can be made into the nucleic acid of a) or b) above according to the method for producing a lipid membrane structure modified with KALA peptide and encapsulated with DNA described in WO2017 / 090763 and US2018 / 0362999. It can be manufactured by replacing each of them.
　第二の実施形態において、核酸は、第一実施形態の脂質膜構造体におけるのと同様に、カチオン性ポリマーとの複合体として脂質膜構造体に含まれていてもよい。 In the second embodiment, the nucleic acid may be contained in the lipid membrane structure as a complex with the cationic polymer, as in the lipid membrane structure of the first embodiment.
医薬組成物
　本発明では、第一実施形態の脂質膜構造体を含む医薬組成物が提供される。本発明では、第二実施形態の脂質膜構造体を含む医薬組成物が提供される。本発明の医薬組成物では、核酸は、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされるＲＮＡであり得る。ミトコンドリアＤＮＡによりコードされるＲＮＡとしては、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｒＲＮＡが挙げられ、いずれも本発明の医薬組成物の核酸として用いることができる。本発明の医薬組成物は、核酸が、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡおよびｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡからなる群から選択されるｒＲＮＡを含むものであってもよい。 Pharmaceutical Composition The present invention provides a pharmaceutical composition comprising the lipid membrane structure of the first embodiment. The present invention provides a pharmaceutical composition comprising the lipid membrane structure of the second embodiment. In the pharmaceutical composition of the present invention, the nucleic acid can be RNA encoded by mitochondrial DNA. Examples of RNA encoded by mitochondrial DNA include mRNA, tRNA, and rRNA, all of which can be used as nucleic acids of the pharmaceutical composition of the present invention. The pharmaceutical composition of the present invention may include a nucleic acid containing an rRNA selected from the group consisting of mt-12S rRNA and mt-16S rRNA.
　ある態様では、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡを含む脂質膜構造体を含む本発明の医薬組成物は、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに変異を有する対象（例えば、Ａ１５５５Ｇ変異を有する対象）に投与することができる。 In some embodiments, the pharmaceutical composition of the invention comprising a lipid membrane structure containing mt-12S rRNA is administered to a subject having a mutation in the DNA encoding mt-12S rRNA (eg, a subject having an A1555G mutation). Can be done.
　ある態様では、ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡを含む脂質膜構造体を含む本発明の医薬組成物は、ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに変異を有する対象に投与することができる。 In some embodiments, the pharmaceutical composition of the present invention comprising a lipid membrane structure comprising mt-16S rRNA can be administered to a subject having a mutation in the DNA encoding mt-16S rRNA.
　細胞は、複数のミトコンドリアを有し、ミトコンドリアは、複数のミトコンドリアＤＮＡを有する。ミトコンドリア病の対象において、細胞は、正常なミトコンドリアＤＮＡと変異を有するミトコンドリアＤＮＡの両方を含み得る。この場合、変異を有するミトコンドリアＤＮＡが増加するとミトコンドリア病が発症する、またはその症状が重くなることが知られている。 A cell has a plurality of mitochondria, and a mitochondria has a plurality of mitochondrial DNAs. In subjects with mitochondrial disease, cells can contain both normal mitochondrial DNA and mutated mitochondrial DNA. In this case, it is known that when the amount of mutated mitochondrial DNA increases, mitochondrial disease develops or its symptoms become more severe.
　ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡを含む脂質膜構造体を含む本発明の医薬組成物を、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに変異を有する対象に投与することによって、当該対象の細胞内のｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの変異率は減少し、ミトコンドリア病の発症を遅らせる、または症状を軽減することが期待され、したがって、当該対象は、本発明の医薬組成物を投与される医学的メリットを有する。これは、アミノグリコシド系薬物存在下では顕著であり得る。 By administering the pharmaceutical composition of the present invention containing a lipid membrane structure containing mt-12S rRNA to a subject having a mutation in the DNA encoding mt-12S rRNA, the mt-12S rRNA in the cells of the subject is administered. Mutation rates are expected to decrease, delaying the onset of mitochondrial disease, or alleviating symptoms, and thus the subject has the medical benefit of being administered the pharmaceutical composition of the invention. This can be noticeable in the presence of aminoglycoside drugs.
　また、ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡを含む脂質膜構造体を含む本発明の医薬組成物を、ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡをコードするＤＮＡに変異を有する対象に投与することによって、当該対象の細胞内のｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡの変異率は減少し、ミトコンドリア病の発症を遅らせる、または症状を軽減することが期待され、したがって、当該対象は、本発明の医薬組成物を投与される医学的メリットを有する。 In addition, by administering the pharmaceutical composition of the present invention containing a lipid membrane structure containing mt-16S rRNA to a subject having a mutation in the DNA encoding mt-16S rRNA, mt-16S in the cells of the subject is administered. The mutation rate of rRNA is expected to be reduced, delaying the onset of mitochondrial disease, or alleviating symptoms, and thus the subject has the medical benefit of being administered the pharmaceutical composition of the invention.
　本発明は、上記において説明したとおりの特徴を有するａ）又はｂ）に示される核酸を有効成分として含有する、ｍｔ－ｒＲＮＡの変異を原因とするミトコンドリア病（以下、特に断らない限り、単にミトコンドリア病と表す。）、特にｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの変異を原因とする薬剤性難聴の治療及び／又は予防のための医薬組成物を、さらなる態様として提供する。かかる医薬組成物は、上記において説明したとおりの特徴を有する第二実施形態の脂質膜構造体におけるａ）又はｂ）に示される核酸をそのまま含むものであってもよいが、上記ミトコンドリア指向性脂質膜構造体の形態にある核酸を有効成分として含む医薬組成物であることが特に好ましい。
　本発明は、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの変異を原因とする薬剤性難聴の処置のための医薬組成物であって、正常なｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡを含む第一実施形態の脂質膜構造体または第二実施形態の脂質膜構造体を含む医薬組成物を提供し得る。 The present invention is a mitochondrial disease caused by a mutation in mt-rRNA containing the nucleic acid shown in a) or b) having the characteristics as described above as an active ingredient (hereinafter, unless otherwise specified, simply mitochondrial disease). A pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of drug-induced hearing loss caused by mutations in mt-12S rRNA, in particular, is provided as a further embodiment. Such a pharmaceutical composition may contain the nucleic acid shown in a) or b) in the lipid membrane structure of the second embodiment having the characteristics as described above as it is, but the mitochondrial directional lipid may be contained as it is. It is particularly preferable that the pharmaceutical composition contains a nucleic acid in the form of a membrane structure as an active ingredient.
The present invention is a pharmaceutical composition for the treatment of drug-induced hearing loss caused by a mutation in mt-12S rRNA, the lipid membrane structure of the first embodiment or the second embodiment containing normal mt-12S rRNA. Pharmaceutical compositions comprising a form of lipid membrane structure can be provided.
　本態様の医薬組成物は、注射剤、点滴剤等の非経口製剤の形態で用いられることができる。また、このような非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール等を含む等張液といった水性担体が挙げられる。 The pharmaceutical composition of this embodiment can be used in the form of a parenteral preparation such as an injection or an infusion. Examples of carriers that can be used for such parenteral preparations include aqueous carriers such as physiological saline and isotonic solutions containing glucose, D-sorbitol, and the like.
　本態様の医薬組成物は、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の添加剤といった成分を含んでもよい。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十七改訂日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。 The pharmaceutical composition of this embodiment may contain components such as pharmaceutically acceptable buffers, stabilizers, preservatives and other additives. Pharmaceutically acceptable ingredients are well known to those skilled in the art, and those skilled in the art can use the ingredients described in the 17th revised Japanese Pharmacopoeia and other standards within the range of normal practicability, depending on the form of the formulation. Can be appropriately selected and used.
　本態様の医薬組成物の投与方法は特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば点耳、鼓室内投与等の内耳投与、血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与等を挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の治療剤は、点耳又は鼓室内投与により生体に投与される。 The administration method of the pharmaceutical composition of this embodiment is not particularly limited, but in the case of a parenteral preparation, for example, inner ear administration such as ear instillation and intratympanic administration, intravascular administration (preferably intravenous administration), intraperitoneal administration, Intestinal administration, subcutaneous administration and the like can be mentioned. In one of the preferred embodiments, the therapeutic agent of the present invention is administered to the living body by ear drops or intratympanic administration.
　本態様の医薬組成物は、ミトコンドリア病の原因となるｍｔ－ｒＲＮＡの遺伝子異常に対応した野生型のｍｔ－ｒＲＮＡをミトコンドリア内に供給することにより、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防効果を示すものと期待される。 The pharmaceutical composition of this embodiment exhibits a therapeutic and / or preventive effect on mitochondrial disease by supplying a wild-type mt-rRNA corresponding to a genetic abnormality of mt-rRNA that causes mitochondrial disease into mitochondria. Is expected.
　本発明の医薬組成物は、ミトコンドリアＤＮＡによってコードされるＲＮＡに変異を有する対象に対して投与することができる。この場合、医薬組成物は、当該変異を有するＲＮＡに対する正常なカウンターパートであるＲＮＡ（例えば、野生型のＲＮＡなどの機能的なＲＮＡ）を含む脂質膜構造体を含むものであり得る。対象は、ミトコンドリア病を発症している対象であるか、またはミトコンドリア病を発症するリスクを有する対象であり得る。ミトコンドリア病の発症においては、異常なＲＮＡの正常なカウンターパートに対する比率が高まることが原因となり得る。したがって、本発明の医薬組成物は、異常なＲＮＡの正常なカウンターパートに対する比率が十分に低くなる程度に、対象に投与することができる。 The pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject having a mutation in RNA encoded by mitochondrial DNA. In this case, the pharmaceutical composition may comprise a lipid membrane structure comprising RNA that is a normal counterpart to RNA having the mutation (eg, a functional RNA such as wild-type RNA). The subject may be a subject who develops mitochondrial disease or is at risk of developing mitochondrial disease. The development of mitochondrial disease can be due to an increased proportion of abnormal RNA to the normal counterpart. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject to such an extent that the ratio of abnormal RNA to the normal counterpart is sufficiently low.
　例えば、本発明の医薬組成物は、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡをコードする遺伝子、ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡをコードする遺伝子、ＮＤ１遺伝子、ＮＤ２遺伝子、ＣｏｘＩ遺伝子、ＣｏｘＩＩ遺伝子、ＡＴＰアーゼ６遺伝子、ＡＴＰアーゼ８遺伝子、ＣｏｘＩＩＩ遺伝子、ＮＤ３遺伝子、ＮＤ４Ｌ遺伝子、ＮＤ４遺伝子、ＮＤ５遺伝子、ＮＤ６遺伝子、Ｃｙｔｂ遺伝子および２２種類のｔＲＮＡ遺伝子からなる群から選択される遺伝子に変異を有する対象に対して投与され得、当該医薬組成物は、変異を有する前記遺伝子によりコードされるＲＮＡの正常なカウンターパートを内包した脂質膜構造体を含み得る。 For example, the pharmaceutical composition of the present invention includes a gene encoding mt-12S rRNA, a gene encoding mt-16S rRNA, an ND1 gene, an ND2 gene, a CoxI gene, a CoxII gene, an ATPase 6 gene, and an ATPase 8 gene. The pharmaceutical composition can be administered to a subject having a mutation in a gene selected from the group consisting of CoxIII gene, ND3 gene, ND4L gene, ND4 gene, ND5 gene, ND6 gene, Cytb gene and 22 kinds of tRNA genes. May include a lipid membrane structure containing a normal counterpart of the RNA encoded by the mutated gene.
　例えば、ｔＲＮＡ　Ｌｅｕを含む脂質膜構造体を含む本発明の医薬組成物は、ＭＥＬＡＳ患者に投与され得る。ｔＲＮＡ　Ｌｅｕを含む脂質膜構造体を含む本発明の医薬組成物は、ＭＥＬＡＳ患者において、ＭＥＬＡＳを処置することに用いられ得る。「ＭＥＬＡＳ」とは、ミトコンドリア病の一種であり、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作症候群（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｍｙｏｐａｔｈｙ，　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄｏｓｉｓ，　ａｎｄ　ｓｔｒｏｋｅ－ｌｉｋｅ　ｅｐｉｓｏｄｅｓ）を意味する。ＭＥＬＡＳの患者では、反復する脳卒中様発作が生じることが知られている。ＭＥＬＡＳに罹患した患者の８０％は、３２４３番目の塩基アデニンに対応する塩基配列がグアニンに変異している。３２４３番目の塩基アデニンは、ミトコンドリアのｍｔ－ｔＲＮＡ　Ｌｅｕ中に含まれる塩基であり、このアデニンのグアニンへの変異は、当該ｍｔ－ｔＲＮＡ　Ｌｅｕの機能を低下させ、これにより、ミトコンドリアによる呼吸およびＡＴＰ産生が不全になる。ＭＥＬＡＳの重篤度には、３２４３番目のアデニンのグアニンへの変異を有する変異型ｍｔ－ｔＲＮＡ　Ｌｅｕの全ｍｔ－ｔＲＮＡ　Ｌｅｕに占める割合が関与すると考えられている。 For example, the pharmaceutical composition of the present invention containing a lipid membrane structure containing tRNA Leu can be administered to a MELAS patient. The pharmaceutical composition of the present invention comprising a lipid membrane structure containing tRNA Leu can be used to treat MELAS in MELAS patients. "MELAS" is a kind of mitochondrial disease, and means mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like attack syndrome (mitochondrial myopathy, encephalopacy, lactic acidosis, and stroke-like episodes). Patients with MELAS are known to have recurrent stroke-like seizures. In 80% of patients suffering from MELAS, the base sequence corresponding to the base adenine at position 3243 is mutated to guanine. The 3243th base adenine is a base contained in mitochondrial mt-tRNA Leu, and mutation of this adenine to guanine reduces the function of the mt-tRNA Leu, whereby respiration and ATP production by mitochondria. Becomes incomplete. It is believed that the severity of MELAS is associated with the proportion of mutant mt-tRNA Leu with a mutation at position 3243 adenine to guanine in the total mt-tRNA Leu.
　また例えば、ＮＤ４をコードするｍＲＮＡを含む脂質膜構造体を含む本発明の医薬組成物は、ＬＨＯＮ患者に投与され得る。ＮＤ４をコードするｍＲＮＡを含む脂質膜構造体を含む本発明の医薬組成物は、ＬＨＯＮ患者においてＬＨＯＮを処置することに用いられ得る。「ＬＨＯＮ」とは、レーベル遺伝性視神経症を意味する。ＬＨＯＮは、例えば、Ｇ１１７７８Ａ変異を有する対象において発症し、この変異は、ＮＤ４をコードする遺伝子上に存在する。したがって、正常なＮＤ４をコードするｍＲＮＡを細胞に導入することによってＬＨＯＮの症状はその進行が遅延する、または症状が軽減されると期待される。 Also, for example, the pharmaceutical composition of the present invention containing a lipid membrane structure containing mRNA encoding ND4 can be administered to an LHON patient. The pharmaceutical compositions of the present invention comprising a lipid membrane structure containing mRNA encoding ND4 can be used to treat LHON in LHON patients. "LHON" means Leber's hereditary optic neuropathy. LHON develops, for example, in subjects with the G11778A mutation, which mutation is present on the gene encoding ND4. Therefore, it is expected that the progression of LHON symptoms will be delayed or alleviated by introducing mRNA encoding normal ND4 into cells.
　また例えば、ＮＤ３をコードするｍＲＮＡを含む脂質膜構造体を含む本発明の医薬組成物は、Ｌｅｉｇｈ患者に投与され得る。ＮＤ３をコードするｍＲＮＡを含む脂質膜構造体を含む本発明の医薬組成物は、Ｌｅｉｇｈ患者においてＬｅｉｇｈ脳症を処置することに用いられ得る。Ｌｅｉｇｈ脳症は、例えば、Ｔ１０１５８Ｃ変異を有する対象において発症し、この変異は、ＮＤ３をコードする遺伝子上に存在する。したがって、正常なＮＤ３をコードするｍＲＮＡを細胞に導入することによってＬｅｉｇｈ脳症の症状はその進行が遅延する、または症状が軽減されると期待される。 Also, for example, the pharmaceutical composition of the present invention containing a lipid membrane structure containing mRNA encoding ND3 can be administered to a Light patient. The pharmaceutical composition of the present invention comprising a lipid membrane structure containing mRNA encoding ND3 can be used to treat Leigh encephalopathy in Leigh patients. Leigh encephalopathy develops, for example, in subjects with the T10158C mutation, which mutation is present on the gene encoding ND3. Therefore, it is expected that the progression of Leigh's encephalopathy symptoms will be delayed or alleviated by introducing mRNA encoding normal ND3 into cells.
　本明細書において用いられる治療及び／又は予防は、疾患の治癒、一時的寛解又は予防等を目的とする医学的に許容される全てのタイプの治療的及び／又は予防的介入を包含する。すなわちミトコンドリア病の治療及び／又は予防は、ミトコンドリア病の進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、発症の予防又は再発の防止等を含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。 Treatment and / or prevention as used herein includes all types of medically acceptable therapeutic and / or prophylactic interventions aimed at the cure, temporary remission or prevention of a disease, etc. That is, treatment and / or prevention of mitochondrial disease includes medically acceptable interventions for various purposes, including delaying or stopping the progression of mitochondrial disease, retraction or disappearance of lesions, prevention of onset or prevention of recurrence, etc. To do.
　本態様の医薬組成物は、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防に用いることができる。したがって本態様の医薬組成物の使用は、当該組成物を用いてミトコンドリア病を治療及び／又は予防する方法として表すこともでき、本発明はそのような方法の発明も提供する。 The pharmaceutical composition of this embodiment can be used for the treatment and / or prevention of mitochondrial disease. Therefore, the use of the pharmaceutical composition of this embodiment can also be expressed as a method of treating and / or preventing mitochondrial disease using the composition, and the present invention also provides an invention of such a method.
　さらに、本態様の医薬組成物をミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に投与することにより、ミトコンドリア病を治療及び／又は予防することができることが期待される。このように、本発明は、本態様の医薬組成物の有効量をミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に投与することによる、ミトコンドリア病を治療及び／又は予防する方法も提供する。ここで「有効量」とは、ミトコンドリア病を治療及び／又は予防するのに効果的な量を意味し、かかる量はミトコンドリア病の症状の程度その他の医学的要因によって適宜調節される。 Furthermore, it is expected that mitochondrial disease can be treated and / or prevented by administering the pharmaceutical composition of this embodiment to a patient with mitochondrial disease or a person who may develop mitochondrial disease. As described above, the present invention also provides a method for treating and / or preventing mitochondrial disease by administering an effective amount of the pharmaceutical composition of the present embodiment to a mitochondrial disease patient or a person who may develop mitochondrial disease. .. Here, the "effective amount" means an amount effective for treating and / or preventing mitochondrial disease, and such an amount is appropriately adjusted depending on the degree of symptoms of mitochondrial disease and other medical factors.
　本発明によれば、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされるＲＮＡに変異を有するミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に投与するための医薬組成物の製造における、当該変異を有するＲＮＡの正常なカウンターパートを含む第一実施形態の脂質膜構造体または第二実施形態の脂質膜構造体の使用が提供される。 According to the present invention, in the production of a pharmaceutical composition for administration to a mitochondrial disease patient or a person who may develop mitochondrial disease having a mutation in RNA encoded by mitochondrial DNA, normal RNA having the mutation is produced. The use of the lipid membrane structure of the first embodiment or the lipid membrane structure of the second embodiment including the counterpart is provided.
細胞製剤の製造方法
　本発明は、ミトコンドリアＤＮＡによってコードされるＲＮＡに変異を有する細胞に、当該ＲＮＡの正常なカウンターパートであるＲＮＡ（例えば、野生型のＲＮＡなどの機能的なＲＮＡ）を含む第一実施形態の脂質膜構造体をインビトロ（「エクスビボ」ともいう）で導入することを含む、細胞の加工方法または細胞の製造方法を提供する。本発明はまた、ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に由来する細胞に、第二実施形態の脂質膜構造体をインビトロ（「エクスビボ」ともいう）で導入することを含む、細胞の製造方法または細胞製剤の製造方法を提供する。 Method for Producing Cellular Preparation The present invention comprises a cell having a mutation in RNA encoded by mitochondrial DNA, which comprises RNA which is a normal counterpart of the RNA (for example, functional RNA such as wild RNA). Provided are a method for processing a cell or a method for producing a cell, which comprises introducing the lipid membrane structure of one embodiment in vitro (also referred to as “exvivo”). The present invention also comprises introducing the lipid membrane structure of the second embodiment into a cell derived from a mitochondrial disease patient or a person who is at risk of developing mitochondrial disease in vitro (also referred to as "exvivo"). A method for producing a cell preparation or a method for producing a cell preparation.
　本発明は、ミトコンドリアＤＮＡによってコードされるＲＮＡに変異を有する細胞に、当該ＲＮＡの正常なカウンターパートであるＲＮＡ（例えば、野生型のＲＮＡなどの機能的なＲＮＡ）を含む第二実施形態の脂質膜構造体をインビトロ（「エクスビボ」ともいう）で導入することを含む、細胞の加工方法または細胞の製造方法を提供する。本発明はまた、ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に由来する細胞に、第二実施形態の脂質膜構造体をインビトロ（「エクスビボ」ともいう）で導入することを含む、細胞の製造方法または細胞製剤の製造方法を提供する。 In the present invention, a cell having a mutation in RNA encoded by mitochondrial DNA contains an RNA that is a normal counterpart of the RNA (for example, a functional RNA such as wild RNA). Provided are a method for processing a cell or a method for producing a cell, which comprises introducing a membrane structure in vitro (also referred to as “exvivo”). The present invention also comprises introducing the lipid membrane structure of the second embodiment into a cell derived from a mitochondrial disease patient or a person who is at risk of developing mitochondrial disease in vitro (also referred to as "exvivo"). A method for producing a cell preparation or a method for producing a cell preparation.
　上記において、細胞は、ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある対象に由来する細胞であり得る。 In the above, the cell can be a cell derived from a mitochondrial disease patient or a subject who may develop mitochondrial disease.
　例えば、本発明の細胞または細胞製剤は、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡをコードする遺伝子、ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡをコードする遺伝子、ＮＤ１遺伝子、ＮＤ２遺伝子、ＣｏｘＩ遺伝子、ＣｏｘＩＩ遺伝子、ＡＴＰアーゼ６遺伝子、ＡＴＰアーゼ８遺伝子、ＣｏｘＩＩＩ遺伝子、ＮＤ３遺伝子、ＮＤ４Ｌ遺伝子、ＮＤ４遺伝子、ＮＤ５遺伝子、ＮＤ６遺伝子、Ｃｙｔｂ遺伝子および２２種類のｔＲＮＡ遺伝子からなる群から選択される遺伝子に変異を有する細胞に対して、上記変異した遺伝子によりコードされるＲＮＡの正常なカウンターパートを内包した脂質膜構造体を導入することによって作成され得る。そして、本発明の細胞または細胞製剤は、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡをコードする遺伝子、ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡをコードする遺伝子、ＮＤ１遺伝子、ＮＤ２遺伝子、ＣｏｘＩ遺伝子、ＣｏｘＩＩ遺伝子、ＡＴＰアーゼ６遺伝子、ＡＴＰアーゼ８遺伝子、ＣｏｘＩＩＩ遺伝子、ＮＤ３遺伝子、ＮＤ４Ｌ遺伝子、ＮＤ４遺伝子、ＮＤ５遺伝子、ＮＤ６遺伝子、Ｃｙｔｂ遺伝子および２２種類のｔＲＮＡ遺伝子からなる群から選択される遺伝子に変異を有する対象に対して投与され得る。 For example, the cell or cell preparation of the present invention includes a gene encoding mt-12S rRNA, a gene encoding mt-16S rRNA, an ND1 gene, an ND2 gene, a CoxI gene, a CoxII gene, an ATPase 6 gene, and an ATPase 8 gene. , CoxIII gene, ND3 gene, ND4L gene, ND4 gene, ND5 gene, ND6 gene, Cytb gene and 22 kinds of tRNA genes coded by the above-mentioned mutated gene for cells having a mutation in a gene selected from the group. It can be created by introducing a lipid membrane structure that contains the normal counterpart of the resulting RNA. The cell or cell preparation of the present invention comprises a gene encoding mt-12S rRNA, a gene encoding mt-16S rRNA, an ND1 gene, an ND2 gene, a CoxI gene, a CoxII gene, an ATPase 6 gene, and an ATPase 8 gene. , CoxIII gene, ND3 gene, ND4L gene, ND4 gene, ND5 gene, ND6 gene, Cytb gene and 22 kinds of tRNA genes can be administered to a subject having a mutation in a gene selected from the group.
　細胞または細胞製剤は、ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に由来する細胞において機能欠損している、または欠乏しているＲＮＡ（特に、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡから選択されるＲＮＡ）を当該細胞に導入することによって調製される。一例として、ミトコンドリアＤＮＡにおいて１２Ｓ　ｒＲＮＡに変異（例えば、Ａ１５５５Ｇ変異）を有する細胞に、１２Ｓ　ｒＲＮＡを含む本発明の脂質膜構造体を導入することが挙げられる。得られた細胞は、１２Ｓ　ｒＲＮＡに変異を有する対象に投与され得る。 The cell or cell preparation refers to RNA (particularly RNA selected from tRNA and rRNA) that is deficient or deficient in cells derived from patients with mitochondrial disease or those who are at risk of developing mitochondrial disease. Prepared by introduction into cells. As an example, the lipid membrane structure of the present invention containing 12S rRNA may be introduced into a cell having a mutation in 12S rRNA (for example, A1555G mutation) in mitochondrial DNA. The obtained cells can be administered to a subject having a mutation in 12S rRNA.
　また、ある態様では、ミトコンドリアＤＮＡにおいて１６Ｓ　ｒＲＮＡに変異を有する細胞に、１６Ｓ　ｒＲＮＡを含む本発明の脂質膜構造体を導入することが挙げられる。得られた細胞は、１６Ｓ　ｒＲＮＡに変異を有する対象に投与され得る。 Further, in one embodiment, the lipid membrane structure of the present invention containing 16S rRNA may be introduced into a cell having a mutation in 16S rRNA in mitochondrial DNA. The obtained cells can be administered to a subject having a mutation in 16S rRNA.
　また、ある態様では、ミトコンドリアＤＮＡにおいてｔＲＮＡ　Ｌｅｕに変異（例えば、Ａ３２４３Ｇ変異）を有する細胞に、ｔＲＮＡ　Ｌｅｕを含む本発明の脂質膜構造体を導入することが挙げられる。得られた細胞は、ｔＲＮＡ　Ｌｅｕに変異（例えば、Ａ３２４３Ｇ変異）を有する対象に投与され得る。 Further, in one embodiment, the lipid membrane structure of the present invention containing tRNA Leu may be introduced into a cell having a mutation (for example, A3243G mutation) in tRNA Leu in mitochondrial DNA. The obtained cells can be administered to a subject having a mutation in tRNA Leu (for example, A3243G mutation).
　また、ある態様では、ミトコンドリアＤＮＡにおいてＮＤ４をコードする遺伝子に変異（例えば、Ｇ１１７７８Ａ変異）を有する細胞に、ＮＤ４をコードするｍＲＮＡを含む本発明の脂質構造体を導入することが挙げられる。得られた細胞は、ＮＤ４をコードする遺伝子に変異（例えば、Ｇ１１７７８Ａ変異）を有する対象に投与され得る。 Further, in one embodiment, the lipid structure of the present invention containing mRNA encoding ND4 may be introduced into a cell having a mutation (for example, G11778A mutation) in a gene encoding ND4 in mitochondrial DNA. The resulting cells can be administered to a subject having a mutation in the gene encoding ND4 (eg, the G11778A mutation).
　また、ある態様では、ミトコンドリアＤＮＡにおいてＮＤ３をコードする遺伝子に変異（例えば、Ｔ１０１５８Ｃ変異）を有する細胞に、ＮＤ３をコードするｍＲＮＡを含む本発明の脂質構造体を導入することが挙げられる。得られた細胞は、ＮＤ３をコードする遺伝子に変異（例えば、Ｔ１０１５８Ｃ変異）を有する対象に投与され得る。 Further, in one embodiment, the lipid structure of the present invention containing mRNA encoding ND3 may be introduced into a cell having a mutation (for example, T10158C mutation) in a gene encoding ND3 in mitochondrial DNA. The resulting cells can be administered to a subject having a mutation in the gene encoding ND3 (eg, T10158C mutation).
　このように、ミトコンドリアＤＮＡによってコードされるＲＮＡを含む脂質膜構造体を含む本発明の細胞製剤は、当該ＲＮＡに変異を有する対象に対して投与することができる。 As described above, the cell preparation of the present invention containing the lipid membrane structure containing RNA encoded by mitochondrial DNA can be administered to a subject having a mutation in the RNA.
　本発明は、ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に由来する細胞に、上記において説明したとおりの特徴を有するａ）又はｂ）に示される核酸をインビトロで導入することを含む、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防のための細胞製剤の製造方法を、さらなる別の態様として提供する。
　本発明は、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされるＲＮＡに変異を有するミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある対象に由来する細胞に、当該変異を有するＲＮＡの正常なカウンターパートを含む脂質膜構造体を含む第一実施形態の脂質膜構造体または第二実施形態の脂質膜構造体をインビトロで導入することを含む、当該患者又は対象を処置することに用いるための細胞製剤の製造方法を提供し得る。 The present invention comprises introducing the nucleic acid shown in a) or b) having the characteristics as described above into cells derived from a mitochondrial disease patient or a person who is at risk of developing mitochondrial disease in vitro. A method for producing a cell preparation for the treatment and / or prevention of mitochondrial disease is provided as yet another aspect.
The present invention is a lipid membrane structure comprising a normal counterpart of an RNA having the mutation in cells derived from a mitochondrial disease patient or a subject who may develop mitochondrial disease having a mutation in the RNA encoded by the mitochondrial DNA. Provided is a method for producing a cell preparation for use in treating the patient or subject, which comprises introducing the lipid membrane structure of the first embodiment or the lipid membrane structure of the second embodiment in vitro. obtain.
　核酸を導入しようとするミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者由来の細胞は、ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者から採取された体細胞であることが好ましい。このような体細胞としては、例えば、これらの者の心臓、脳、骨格筋、皮膚その他のミトコンドリア病によって障害を受けた若しくは受けるおそれがある組織から分離された細胞、又はかかる組織を構成する細胞に分化する能力を持つ細胞が挙げられる。 The cells derived from mitochondrial disease patients or persons who may develop mitochondrial disease to which nucleic acid is to be introduced are preferably somatic cells collected from mitochondrial disease patients or persons who may develop mitochondrial disease. Such somatic cells include, for example, cells isolated from tissues damaged or at risk of being damaged or at risk of suffering from mitochondrial diseases such as the heart, brain, skeletal muscle, skin and other of these persons, or cells constituting such tissues. Examples include cells capable of differentiating into.
　ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者由来の細胞に導入される核酸は、そのままの形態であってもよいが、導入効率の観点から、上記のミトコンドリア指向性脂質膜構造体の形態にあることが好ましい。 The nucleic acid introduced into cells derived from patients with mitochondrial disease or those who may develop mitochondrial disease may be in the same form as it is, but from the viewpoint of introduction efficiency, the form of the above-mentioned mitochondrial-directed lipid membrane structure It is preferable to be in.
　上記において説明したとおりの特徴を有するａ）又はｂ）に示される核酸を、ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者由来の細胞にインビトロで導入することで、ミトコンドリア病をもたらすｍｔ－ｒＲＮＡにおける変異率が低下した体細胞を製造することができる。当該細胞は、ミトコンドリア病を治療及び／又は予防するための細胞製剤として、又はかかる細胞製剤を製造するために利用することができる。変異率及びその測定方法は、第１の態様において説明した通りである。 By introducing the nucleic acid shown in a) or b) having the characteristics as described above into cells derived from mitochondrial disease patients or those who are at risk of developing mitochondrial disease, mt- that causes mitochondrial disease is introduced. It is possible to produce somatic cells having a reduced mutation rate in rRNA. The cells can be used as a cell preparation for treating and / or preventing mitochondrial disease, or for producing such cell preparations. The mutation rate and the method for measuring the mutation rate are as described in the first aspect.
　本発明によれば、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされるＲＮＡに変異を有するミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある対象に投与するための医薬組成物の製造における、当該変異を有するＲＮＡの正常なカウンターパートを含む当該患者または対象の細胞の使用が提供される。 According to the present invention, in the production of a pharmaceutical composition for administration to a mitochondrial disease patient or a subject who may develop mitochondrial disease, which has a mutation in RNA encoded by mitochondrial DNA, the RNA having the mutation is normal. Use of the patient's or subject's cells, including the counterpart, is provided.
　以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１．ミトコンドリアＲＮＡにおける点変異定量プロトコルの確立
１）ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの作製
　制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶで開環したプラスミドｐＵＣ５７－Ａｍｐに、以下の２種類の塩基配列の両端にＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶサイトを付加したインサートをそれぞれ組み込んで、Ｔ７プロモーターによってｍｔ－ｒＲＮＡが転写されるプラスミドであるｐＴ７－１２Ｓ　ｒＲＮＡ（ＷＴ）及びｐＴ７－１２Ｓ　ｒＲＮＡ（ＭＴ）を作製した。
ｐＴ７－１２Ｓ　ｒＲＮＡ（ＷＴ）：
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ　（＋）　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　由来のＴ７プロモーター２０ｂｐと、ヒトｍｔ－ＤＮＡの５７７－１６７０番目の領域１０９４ｂｐ（ミトコンドリアｔＲＮＡＰｈｅ、正常１２ＳｒＲＮＡ及びミトコンドリアｔＲＮＡＶａｌに対応する）とが連結された塩基配列（配列番号２４）を有する。
ｐＴ７－１２Ｓ　ｒＲＮＡ（ＭＴ）：
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ　（＋）　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　由来のＴ７プロモーター２０ｂｐと、１５５５番目のアラニンをグリシンに置き換えたヒトｍｔ－ＤＮＡの５７７－１６７０番目の領域１０９４ｂｐ（ミトコンドリアｔＲＮＡＰｈｅ、変異１２ＳｒＲＮＡ及びミトコンドリアｔＲＮＡＶａｌに対応する）とが連結された塩基配列（配列番号２５）を有する。 Example 1. Establishment of point mutation quantification protocol for mitochondrial RNA
1) Preparation of DNA encoding mt-12S rRNA Inserts with EcoRI and EcoRV sites added to both ends of the following two types of nucleotide sequences were incorporated into the plasmid pUC57-Amp opened with the restriction enzymes EcoRI and EcoRV, respectively. PT7-12S rRNA (WT) and pT7-12S rRNA (MT), which are plasmids to which mt-rRNA is transcribed by the T7 promoter, were prepared.
pT7-12S rRNA (WT):
A base sequence in which a T7 promoter 20 bp derived from pBluescript II SK (+) (Stratagene) and a region 1094 bp of the 577-1670th region of human mt-DNA (corresponding to mitochondrial tRNA Phe , normal 12S rRNA and mitochondrial tRNA Val ) are linked. (SEQ ID NO: 24).
pT7-12S rRNA (MT):
pBluescript II SK (+) (Stratagene ) and T7 promoter 20bp from, 1555 th 577-1670 th region 1094bp alanine human mt-DNA is replaced with glycine (mitochondrial tRNA Phe, corresponding to mutated 12SrRNA and mitochondrial tRNA Val It has a base sequence (SEQ ID NO: 25) linked to the above.
２）プライマー設計
　表１に示される塩基配列からなるプライマーＤＮＡをそれぞれ化学合成した。共通フォワードプライマーはｍｔ－ＤＮＡの１４５０又は１４５１番目から１４７０番目までの領域に、野生型リバースプライマー及び変異型リバースプライマーはｍｔ－ＤＮＡの１５５５番目から１５７４、１５７５、１５７６、１５７７又は１５７８番目までの領域に結合するように設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 2) Primer design Primer DNA consisting of the nucleotide sequences shown in Table 1 was chemically synthesized. The common forward primer is in the region from 1450 or 1451 to 1470 of mt-DNA, and the wild-type reverse primer and mutant reverse primer are in the region from 1555 to 1574, 1575, 1576, 1577 or 1578 of mt-DNA. Designed to combine with.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
３）定量的ＰＣＲ
　ｐＴ７－１２Ｓ　ｒＲＮＡ（ＷＴ）及びｐＴ７－１２Ｓ　ｒＲＮＡ（ＭＴ）を定められた比で混合したＤＮＡ混合溶液を鋳型とし、表２に示される組み合わせからなるプライマーＤＮＡ（表中、数字は図２～８中のグラフ番号を示し、（★）は共通フォワードプライマーとしてＦｌ１を使用したこと、（★）が付いていないものは共通フォワードプライマーとしてＦを使用したことを示す。）及びＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて定量的ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は９５℃／１分　→　｛９５℃／１５秒　→　６０℃／１分｝の反応を４０サイクル行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 3) Quantitative PCR
Primer DNA consisting of the combinations shown in Table 2 using a DNA mixed solution obtained by mixing pT7-12S rRNA (WT) and pT7-12S rRNA (MT) in a predetermined ratio as a template (in the table, the numbers are shown in FIGS. 2 to 8). The graph numbers in the medium are shown, and (★) indicates that Fl1 was used as the common forward primer, and those without (★) indicate that F was used as the common forward primer.) And SYBR Green Realtime PCR Master Mix. Quantitative PCR was performed using (TOYOBO). The PCR conditions were 95 ° C / 1 minute → {95 ° C / 15 seconds → 60 ° C / 1 minute} for 40 cycles.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　野生型検出用リバースプライマーを含むプライマーＤＮＡセットを用いたＰＣＲで得られたＣＴ値（ＣＴｗｉｌｄ）及び変異型検出用リバースプライマーを含むプライマーＤＮＡセットを用いたＰＣＲで得られたＣＴ値（ＣＴｍｕｔ）を下記式にあてはめて、各ＤＮＡ混合溶液における変異率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
 Wild type C T values obtained by PCR using a primer DNA set including detecting reverse primer (C Twild) and mutant detection C T values obtained by PCR using a primer DNA set comprising reverse primer ( C Tmut ) was applied to the following formula to calculate the mutation rate in each DNA mixed solution.
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　横軸に変異率の理論値（正常型ＤＮＡ及び変異型ＤＮＡの混合割合）、縦軸にＣＴ値から算出した変異率をプロットした（図２～８）。その結果、いくつかのプライマーＤＮＡセットについて、理論値と実測値との相関性が高いことが確認された。 The horizontal axis theoretical value of mutation rate (mixing ratio of normal-type DNA and mutant DNA), were plotted mutation rate calculated from C T value on the vertical axis (FIG. 2-8). As a result, it was confirmed that there is a high correlation between the theoretical value and the measured value for some primer DNA sets.
　相関性の高かったプライマーＤＮＡセットのうち、以下の３つのプライマーＤＮＡセットについて３又は４回反復して試験を行ったところ、いずれも再現性の高い結果が得られた（図９）。特にプライマーＤＮＡセット１４はすべての変異率において理論値と実測値との相関性が高く、再現性も良好であった。これらのプライマーＤＮＡセットは、検量線を用いることなくＡ１５５５Ｇ変異率の定量に用いることが可能であることが確認された。 Among the highly correlated primer DNA sets, the following three primer DNA sets were repeatedly tested 3 or 4 times, and all of them gave highly reproducible results (Fig. 9). In particular, the primer DNA set 14 had a high correlation between the theoretical value and the measured value at all mutation rates, and the reproducibility was also good. It was confirmed that these primer DNA sets can be used to quantify the A1555G mutation rate without using a calibration curve.
プライマーＤＮＡセット１４
　野生型検出用セット：フォワードプライマー　Ｆ（配列番号１）
　　　　　　　　　　　リバースプライマー　　ＷＴ１（配列番号３）
　変異型検出用セット：フォワードプライマー　Ｆ（配列番号１）
　　　　　　　　　　　リバースプライマー　　ＭＴ１－ｓ２（配列番号１７）
プライマーＤＮＡセット２４
　野生型検出用セット：フォワードプライマー　Ｆ（配列番号１）
　　　　　　　　　　　リバースプライマー　　ＷＴ１－ｌ１（配列番号４）
　変異型検出用セット：フォワードプライマー　Ｆ（配列番号１）
　　　　　　　　　　　リバースプライマー　　ＭＴ１－ｓ１（配列番号１６）
プライマーＤＮＡセット６
　野生型検出用セット：フォワードプライマー　Ｆ（配列番号１）
　　　　　　　　　　　リバースプライマー　　ＷＴ１（配列番号３）
　変異型検出用セット：フォワードプライマー　Ｆ（配列番号１）
　　　　　　　　　　　リバースプライマー　　ＭＴ２－ｌ２（配列番号２０） Primer DNA set 14
Wild-type detection set: Forward primer F (SEQ ID NO: 1)
Reverse primer WT1 (SEQ ID NO: 3)
Mutant detection set: Forward primer F (SEQ ID NO: 1)
Reverse primer MT1-s2 (SEQ ID NO: 17)
Primer DNA set 24
Wild-type detection set: Forward primer F (SEQ ID NO: 1)
Reverse primer WT1-l1 (SEQ ID NO: 4)
Mutant detection set: Forward primer F (SEQ ID NO: 1)
Reverse primer MT1-s1 (SEQ ID NO: 16)
Primer DNA set 6
Wild-type detection set: Forward primer F (SEQ ID NO: 1)
Reverse primer WT1 (SEQ ID NO: 3)
Mutant detection set: Forward primer F (SEQ ID NO: 1)
Reverse primer MT2-l2 (SEQ ID NO: 20)
実施例２．ミトコンドリア病患者由来細胞のＡ１５５５Ｇ変異率の定量
１）ミトコンドリア病患者由来細胞の調製
　健常人（コントロール１）、ＮＤ３遺伝子の点変異（Ｔ１０１５８Ｃ）を有するミトコンドリア病（Ｌｅｉｇｈ脳症）患者（コントロール２）及びｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の点変異（Ａ１５５５Ｇ）を有する難聴を発症したミトコンドリア病患者の各皮膚生検より繊維芽細胞を分離し、継代培養した後に凍結保存して、セルストックを調製した。 Example 2. Quantification of A1555G mutation rate in cells derived from mitochondrial disease patients
1) Preparation of cells derived from mitochondrial disease patients Healthy subjects (control 1), mitochondrial disease (Leigh encephalopathy) patients with point mutation (T10158C) of ND3 gene (control 2), and point mutation of mt-12S rRNA gene (A1555G). Fibroblasts were isolated from each skin biopsy of patients with mitochondrial disease who developed hearing loss, subcultured, and cryopreserved to prepare cell stock.
　セルストック１ｍＬを３７℃の水浴で溶解させ、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）９　ｍＬを加え、遠心分離（１６０　ｇ，　４℃，　３　ｍｉｎ）した。上清を除去し、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）１０　ｍＬを加え細胞を懸濁させ、全量を１０　ｃｍ　ｄｉｓｈに移し、インキュベーション（３７℃，　５％ＣＯ２）して培養を行った。継代は８０～９０％コンフルエントになった際に行った。ＤｉｓｈをＰＢＳ（－）５　ｍＬで洗浄後、０．０５％トリプシン溶液を加え１０　ｍｉｎインキュベーション（３７℃，　５％ＣＯ２）し、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）９　ｍＬを加え、遠心分離（１６０ｇ，　４℃，　３　ｍｉｎ）した。セルカウント後１０　ｃｍ　ｄｉｓｈに適当な濃度で播種した。 1 mL of cell stock was dissolved in a water bath at 37 ° C., 9 mL of DMEM (FBS +) was added, and the mixture was centrifuged (160 g, 4 ° C., 3 min). The supernatant was removed, 10 mL of DMEM (FBS +) was added to suspend the cells, the whole volume was transferred to a 10 cm dish, and the cells were incubated (37 ° C., 5% CO 2 ) for culturing. Subculture was done when 80-90% confluence was reached. After washing the dish with 5 mL of PBS (-), add 0.05% trypsin solution, incubate for 10 min (37 ° C, 5% CO 2 ), add 9 mL of DMEM (FBS +), and centrifuge (160 g, 4 ° C). , 3 min). After the cell count, the seeds were seeded at an appropriate concentration on a 10 cm dish.
２）ミトコンドリア画分及び定量用ＤＮＡの調製
　皮膚繊維芽細胞（２×１０６　ｃｅｌｌｓ程度）をＣｅｌｌ　Ｓｃｒｕｂ　ｂｕｆｆｅｒ　２００μＬに懸濁し、４℃で１５　ｍｉｎ振とう後、遠心分離（７００　ｇ，　４℃，　３　ｍｉｎ）した。上清を除去後、ＭＩＢ（ＥＤＴＡ＋）５００μＬに懸濁した。シリンジ針（２７Ｇ）により細胞を破砕したのち遠心分離（７００　ｇ，　４℃，　１０　ｍｉｎ）して上清を回収し、０．１　ｍｇ／ｍＬ　ＲＮａｓｅ溶液を０．４５μＬ添加して２５℃で１０　ｍｉｎインキュベーションした。遠心分離（７００　ｇ，　４℃，　１０　ｍｉｎ）し上清を回収し、６０％　ｐｅｒｃｏｌｌ　ｓｏｌｕｔｉｏｎの上に添加して遠心分離（２０，４００　ｇ，　４℃，　１０　ｍｉｎ）し、境界面の溶液を２００μＬ回収した。遠心分離（２０，４００　ｇ，　４℃，　１５　ｍｉｎ）して上清を除去後、ＭＩＢ（－）５００μＬを加えた。再度遠心分離（２０，４００　ｇ，　４℃，　１５　ｍｉｎ）して上清を除去し、ミトコンドリア画分を得た。 2) Preparation of mitochondrial fraction and DNA for quantification Skin fibroblasts (about 2 × 10 6 cells) were suspended in 200 μL of Cell Scrub buffer, shaken at 4 ° C for 15 min, and then centrifuged (700 g, 4 ° C, 3 min). After removing the supernatant, it was suspended in 500 μL of MIB (EDTA +). After crushing the cells with a syringe needle (27 G), centrifuge (700 g, 4 ° C, 10 min) to collect the supernatant, add 0.45 μL of 0.1 mg / mL RNase solution, and add 10 at 25 ° C. It was incubated for min. Centrifuge (700 g, 4 ° C., 10 min) to collect the supernatant, add on top of a 60% Percoll solution and centrifuge (20,400 g, 4 ° C., 10 min) to add the solution at the interface. 200 μL was recovered. After centrifuging (20,400 g, 4 ° C., 15 min) to remove the supernatant, 500 μL of MIB (−) was added. Centrifugation (20,400 g, 4 ° C., 15 min) was performed again to remove the supernatant, and a mitochondrial fraction was obtained.
　ミトコンドリア画分から、ＲＮａｓｅ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ　Ｎ．Ｖ）、ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ　ＤＮａｓｅ　Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ　Ｎ．Ｖ）を用いてＲＮＡを抽出し、さらにＨｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ　Ｋｉｔ（ＡＢＩ）を用いてＲＮＡの逆転写反応を行うことで、定量用ｃＤＮＡを調製した。 RNA was extracted from the mitochondrial fraction using RNase mini kit (QIAGEN NV) and RNase-Free DNase Set (QIAGEN NV), and RNA was further extracted using High Capacity RNA-to- cDNA Kit (ABI). Quantitative cDNA was prepared by performing a reverse transcription reaction.
３）変異率の定量
　実施例１のプライマーＤＮＡセット１４を用いて各皮膚繊維芽細胞の１２Ｓ　ｒＲＮＡに相補的なｃＤＮＡにおけるＡ１５５５Ｇの変異率を定量した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 3) Quantification of mutation rate The mutation rate of A1555G in cDNA complementary to 12S rRNA of each skin fibroblast was quantified using the primer DNA set 14 of Example 1. The results are shown in Table 3.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Ａ１５５５Ｇを有しないコントロール１及び２では、０．０７％及び１．１６％と実質的に０％であったことから、プライマーＤＮＡセット１４を用いたＡ１５５５Ｇ定量系は正常に機能していることが確認された。 In Controls 1 and 2 without A1555G, 0.07% and 1.16% were substantially 0%, indicating that the A1555G quantitative system using the primer DNA set 14 is functioning normally. confirmed.
実施例３．ミトコンドリア病患者由来細胞への正常ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの導入
１）ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの調製
　ｐＴ７－１２Ｓ　ｒＲＮＡ（ＷＴ）を制限酵素Ｅｃｏ　ＲＶで処理して直線化したプラスミドＤＮＡを用意し、ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）Ｌａｒｇｅ　Ｓｃａｌｅ　ＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ－Ｔ７（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応によって、Ｔ７プロモーターによって転写されるＲＮＡを合成し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ　ＲＮＡ　ｃｌｅａｎ－ｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＮＡ　ＸＳ　ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ　ＢＩＯ）を用いて精製した。 Example 3. Introduction of normal mt-12S rRNA into cells derived from patients with mitochondrial disease
1) Preparation of mt-12S rRNA Prepared a linearized plasmid DNA by treating pT7-12S rRNA (WT) with the restriction enzyme Eco RV, and used RiboMAX ™ Large Scale RNA Production Systems-T7 (PROMEGA). RNA transcribed by the T7 promoter was synthesized by the in vitro transcription reaction and purified using the Nucleospin RNA clean-up and councilation of RNA XS kit (TAKARA BIO).
２）ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡを封入したＭＩＴＯ－Ｐｏｒｔｅｒの調製
　０．１２　ｍｇ／ｍＬのプロタミン（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ）／ＨＥＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）溶液に０．３　ｍｇ／ｍＬの精製ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＨＥＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ溶液の等量をボルテックスしながら添加し、核酸ナノ粒子溶液（Ｎ／Ｐ比０．６）を調製した｛ここで、Ｎはタンパク質中の正電荷を有する窒素原子数を表し、Ｐは核酸中の負電荷に起因するリン原子数を表す｝。脂質溶液（ＤＯＰＥ：ＳＭ：ＳＴＲ－Ｒ８＝９：２：１、ＤＯＰＥ　１８μＬ、ＳＭ　８μＬ、ＳＴＲ－Ｒ８　２０μＬ、ＥｔＯＨ　６２μＬ）に核酸ナノ粒子溶液６５μＬをボルテックスしながら添加して、懸濁液を調製した。５　ｍＬチューブ中のＨＥＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ　６３０μＬに懸濁液をボルテックスしながら添加した後、これをＡｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－４中のＨＥＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ　４　ｍＬに加え、遠心処理（１０００　ｇ、２５℃、８　ｍｉｎ）した。さらにＨＥＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ　４　ｍＬを加えて再度遠心処理（１０００　ｇ、２５℃、１２　ｍｉｎ）して、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡが封入されたリポソーム（ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯ）を回収した。リポソームの粒子径及びゼータ電位（表面電位）を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 2) Preparation of MIT -Porter encapsulated with mt-12S rRNA 0.3 mg / mL purified mt-12S rRNA / HEPES Buffer in 0.12 mg / mL protamine / HEPES Buffer (pH 7.4) solution. Equal amounts of the solution were vortexed to prepare a nucleic acid nanoparticle solution (N / P ratio 0.6) {where N represents the number of positively charged nitrogen atoms in the protein and P is in the nucleic acid. Represents the number of phosphorus atoms due to the negative charge of}. A suspension is prepared by adding 65 μL of nucleic acid nanoparticle solution to a lipid solution (DOPE: SM: STR-R8 = 9: 2: 1, DOPE 18 μL, SM 8 μL, STR-R8 20 μL, EtOH 62 μL) while vortexing. did. After adding the suspension to 630 μL of HEPES Buffer in a 5 mL tube while vortexing, it was added to 4 mL of HEPES Buffer in Amicon Ultra-4 and centrifuged (1000 g, 25 ° C., 8 min). Further, 4 mL of HEPES Buffer was added and centrifuged again (1000 g, 25 ° C., 12 min) to recover liposomes (mt-12S rRNA / MITO) encapsulating mt-12S rRNA. The particle size and zeta potential (surface potential) of the liposome are shown in Table 4.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
３）ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの導入
　６　ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに２　ｍＬ／ｗｅｌｌのＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）で２４時間程度前培養したミトコンドリア病患者由来の皮膚繊維芽細胞又はヒト正常皮膚繊維芽ＮＢ１ＲＧＢ細胞（１×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に、ＲＮＡ量換算で１．２、１２、１２０、２４０ｎｇ／ｄｉｓｈとなるようにｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯをそれぞれ添加して３時間インキュベートした後、培地交換してさらに４８時間インキュベートした。インキュベート終了後、実施例２と同様の操作を行って皮膚繊維芽細胞のミトコンドリア画分から定量用ｃＤＮＡを調製し、プライマーＤＮＡセット１４を用いた定量的ＰＣＲを行って、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡに相補的なｃＤＮＡにおけるＡ１５５５Ｇ変異率の変化を測定した。また、ＲＮＡ量換算で同量のｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡを市販の核酸導入試薬であるリポフェクタミン　ｉ　ＭＡＸ（ＬＦＮ　ｉＭＡＸ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて皮膚繊維芽細胞に導入して、上記と同様にして変異率の変化を測定した。 3) Introduction of mt-12S rRNA Skin fibroblasts derived from mitochondrial disease patients or human normal skin fibroblasts NB1RGB cells (1 × 10 5 ) precultured in 2 mL / well DMEM (FBS +) for about 24 hours in 6-well plate. Add mt-12S rRNA / MITO to cells / well) so that the RNA amount is 1.2, 12, 120, 240 ng / dish, respectively, and incubate for 3 hours, then change the medium and incubate for another 48 hours. did. After completion of the incubation, the same procedure as in Example 2 was carried out to prepare quantitative cDNA from the mitochondrial fraction of skin fibroblasts, and quantitative PCR was performed using the primer DNA set 14, which was complementary to mt-12S rRNA. Changes in A1555G mutation rate in common cDNA were measured. In addition, the same amount of mt-12S rRNA in terms of RNA amount was introduced into skin fibroblasts using a commercially available nucleic acid transfer reagent, lipofectamine iMAX (LFN iMAX, Thermo Fisher Scientific), and the mutation rate was the same as above. The change in was measured.
　市販の核酸導入試薬を用いてｍｔ－ｒＲＮＡを導入した場合の変異率と比較して、本発明の脂質膜構造体を用いてｍｔ－ｒＲＮＡを導入することで変異率が約１５％まで大幅に低下することが確認された（表５、図１０）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 Compared with the mutation rate when mt-rRNA is introduced using a commercially available nucleic acid introduction reagent, the mutation rate is significantly increased to about 15% by introducing mt-rRNA using the lipid membrane structure of the present invention. It was confirmed that it decreased (Table 5, FIG. 10).
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
４）ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの細胞内局在の観察
　０．５モル％ＤｉＩ（赤色蛍光色素）修飾したｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯと空のリポソーム（空／ＭＩＴＯ）を調製した。Ａ１５５５Ｇ細胞（０．５×１０５細胞／ディッシュ）を３．５ｃｍ　ガラス底ディッシュ（ＡＧＣ　ＴＥＣＨＮＯ　ＧＬＡＳＳ　ＣＯ．，ＬＴＤ，　Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）に播種し、２４時間インキュベーションした（５％ＣＯ２，３７℃）。細胞をＰＢＳ（－）で洗浄後、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯ溶液５０μＬをＤＭＥＭ　ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ　（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，　Ｋｙｏｔｏ，　Ｊａｐａｎ）ＦＢＳ（－）９５０μＬに混合したものを、ディッシュに添加し１時間インキュベーションした。その後、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ含有）に培地を交換し、１時間４０分間インキュベーションした（５％ＣＯ２，３７℃）。ミトコンドリア染色試薬Ｍｉｔｏ　Ｔｒａｃｋｅｒ　Ｄｅｅｐ　Ｒｅｄ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．，　Ｅｘ／Ｅｍ　６４４／６６５）を含んだＤＭＥＭ（＋）に培地を交換し（脂質終濃度１０ｎＭ）、２０分間インキュベーションした（５％ＣＯ２，３７℃）。ＤＭＥＭ（＋）で洗浄後、ＦＶ１０ｉ－ＬＩＶ（Ｏｌｙｍｐｕｓ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いて観察を行った。条件は以下の通りとした。
励起光：５５９　ｎｍ　光、６３５　ｎｍ　ＬＤレーザー
レンズ：水浸対物レンズ　（ＵＰｌａｎＳＡｐｏ　６０ｘ／ＮＡ．　１．２），　ダイクロイックミラー　（ＤＭ４０５／４７３／５５９／６３５）．
フィルター：Ｃｈ１：　５７０／５０ 4) Observation of intracellular localization of mt-12S rRNA 0.5 mol% DiI (red fluorescent dye) -modified mt-12S rRNA / MITO and empty liposome (empty / MITO) were prepared. A1555G cells (0.5 × 10 5 cells / dish) and 3.5cm glass bottom dish (AGC TECHNO GLASS CO., LTD , Shizuoka, Japan) were seeded into, and incubated for 24 hours (5% CO 2, 37 ℃ ) .. After washing the cells with PBS (−), 50 μL of mt-12S rRNA / MITO solution was mixed with DMEM high glucose (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) FBS (−) 950 μL, and the mixture was added to the dish and incubated for 1 hour. Then, the medium was replaced with DMEM (containing FBS) and incubated for 1 hour and 40 minutes (5% CO 2 , 37 ° C.). The medium was replaced with DMEM (+) containing the mitochondrial staining reagent Mito Tracker Deep Red (Thermo Fisher Scientific Inc., Ex / Em 644/665) (final lipid concentration 10 nM) and incubated for 20 minutes (5% CO 2 , 37 ° C.). After washing with DMEM (+), observation was performed using FV10i-LIV (Olympus, Tokyo, Japan). The conditions were as follows.
Excitation light: 559 nm light, 635 nm LD laser lens: water immersion objective lens (UPlanSApo 60x / NA. 1.2), dichroic mirror (DM405 / 473/559/635).
Filter: Ch1: 570/50
　結果は、図１１に示される通りであった。図１１に示されるように、ミトコンドリアは、細胞内に導入され、かつ、その一部はミトコンドリアの染色と共局在した。この結果は、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯと空／ＭＩＴＯとで相違することはなかった。 The results were as shown in FIG. As shown in FIG. 11, mitochondria were introduced into cells and part of them co-localized with mitochondrial staining. This result was not different between mt-12S rRNA / MITO and empty / MITO.
　この結果から、本願発明では、ミトコンドリアＲＮＡの中で最も大きなサイズを有するＲＮＡの一つである１２Ｓ　ｒＲＮＡを細胞外部から細胞内、特にミトコンドリアに導入する送達法が確立できたことが明らかである。 From this result, it is clear that in the present invention, a delivery method for introducing 12S rRNA, which is one of the largest size RNAs among mitochondrial RNAs, from outside the cell into the cell, particularly into the mitochondria, has been established.
５）ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ導入細胞のミトコンドリアにおける変異ｒＲＮＡと正常ｒＲＮＡの割合の評価
　実施例１に記載の方法に従い、プライマーＤＮＡセット１４を用いて、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ導入Ａ１５５５Ｇ細胞における、変異ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの比率を求めた。変異ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの比率を低下させることは、ミトコンドリア病の抑制に繋がると考えられるからである。
　上記の通りにｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯを導入したＡ１５５５Ｇ細胞に対して、導入２４時間後、４８時間後および７２時間後にそれぞれ変異ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの比率を求めた。結果は、図１２に示される通りであった。
　図１２に示されるように、変異ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの比率は、未処理（ＮＴ）では８０％以上であるのに対して、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯを導入したＡ１５５５Ｇ細胞では、導入２４時間後には約２０％であり、４８時間後には約１５％であり、７２時間には約６０％であった。このように、導入されたｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡは、変異ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの比率を顕著に低下させることができた。 5) Evaluation of the ratio of mutant rRNA to normal rRNA in mitochondria of mt-12S rRNA-introduced cells According to the method described in Example 1, the mutant mt-12S in mt-12S rRNA-introduced A1555G cells was used using the primer DNA set 14. The ratio of rRNA was determined. This is because lowering the ratio of mutant mt-12S rRNA is considered to lead to suppression of mitochondrial disease.
The ratio of the mutant mt-12S rRNA was determined 24 hours, 48 hours, and 72 hours after the introduction into A1555G cells into which mt-12S rRNA / MITO was introduced as described above. The results were as shown in FIG.
As shown in FIG. 12, the ratio of mutant mt-12S rRNA is 80% or more in untreated (NT), whereas in A1555G cells introduced with mt-12S rRNA / MITO, 24 hours after introduction. Was about 20%, about 15% after 48 hours, and about 60% at 72 hours. Thus, the introduced mt-12S rRNA was able to significantly reduce the proportion of mutant mt-12S rRNA.
６）ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ導入細胞のミトコンドリアにおける最大呼吸能の評価
　ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯを導入したＡ１５５５Ｇ細胞において導入２４時間後、４８時間後、７２時間後、および９６時間後にミトコンドリアの最大呼吸能を評価した。 6) Evaluation of maximum respiration capacity in mitochondria of mt-12S rRNA-introduced cells In A1555G cells introduced with mt-12S rRNA / MITO, maximum respiration capacity of mitochondria 24 hours, 48 hours, 72 hours, and 96 hours after introduction. Was evaluated.
　上記の通りにｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯを導入したＡ１５５５Ｇ細胞に対して、測定の２４±３時間前にＡｇｉｌｅｎｔ　Ｓｅａｈｏｒｓｅ　ＸＦｐ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｉｎｉｐｌａｔｅｓ　（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）に播種した（１０，０００細胞／ウェル程度）。ＸＦ　ＤＭＥＭ　Ｍｅｄｉｕｍ　（Ａｇｉｌｅｎｔ）にあらかじめ１．０Ｍグルコース溶液，２００ｍＭグルタミン溶液（Ａｇｉｌｅｎｔ）を加えて２４．７５ｍＭグルコース，４ｍＭグルタミンを含むランニング培地を調製した。測定１時間前から細胞をランニング培地を用いて細胞を培養し（ＣＯ２　ｆｒｅｅ，　３７℃）、細胞の酸素消費量とミトコンドリア機能をＡｇｉｌｅｎｔ　Ｓｅａｈｏｒｓｅ　ＸＦｐ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｆｌｕｘ　ａｎａｌｙｚｅｒ　（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）を用いて測定した。ＸＦｐ　Ｃｅｌｌ　Ｍｉｔｏ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｔｅｓｔ　Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、１μＭオリゴマイシン（電子伝達系　呼吸鎖複合体ＶのＡＴＰ合成酵素阻害剤），　１μＭ　ＦＣＣＰ　（脱共役剤），　１μＭロテノン＋１μＭアンチマイシンＡ（電子伝達系　呼吸鎖複合体ＩおよびＩＩＩ阻害剤）インジェクション時の酸素消費量も測定した。測定後の細胞について、ＰｉｅｒｃｅＴＭ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ　（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　Ｉｎｃ．）を用いて定量した細胞タンパク濃度によって結果を補正した（ｎ＝３）。
　結果は、図１２に示される通りであった。図１２に示されるように、Ａ１５５５Ｇ細胞のミトコンドリアの最大呼吸能は、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯを導入した４８時間後および７２時間後において、２４時間後よりも最大呼吸能が増大し、９６時間後には最大呼吸能の増大幅が減少した。 A1555G cells introduced with mt-12S rRNA / MITO as described above were seeded with Agilent Technologies XFp Cell Culture Miniplates (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 24 ± 3 hours before measurement. 000 cells / well). A running medium containing 24.75 mM glucose and 4 mM glutamine was prepared by adding 1.0 M glucose solution and 200 mM glutamine solution (Aginent) to XF DMEM Medium (Agient) in advance. From 1 hour before the measurement, the cells were cultured in a running medium (CO 2 free, 37 ° C.), and the oxygen consumption and mitochondrial function of the cells were examined. ) Was used for measurement. Using XFp Cell Mito Stress Test Kit (Agilent), 1 μM oligomycin (ATP synthase inhibitor of electron transport chain respiratory chain complex V), 1 μM FCCP (deconjugating agent), 1 μM rotenone + 1 μM antimycin A (electron transport chain) Rotenone complex I and III inhibitors) Oxygen consumption during injection was also measured. For the measured cells, the results were corrected by the cell protein concentration quantified using the Pierce TM BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Inc.) (n = 3).
The results were as shown in FIG. As shown in FIG. 12, the maximum mitochondrial respiration capacity of A1555G cells was increased at 48 hours and 72 hours after the introduction of mt-12S rRNA / MITO than after 24 hours, and was 96 hours. Later, the rate of increase in maximum respiratory capacity decreased.
　また、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡを未封入で、リポフェクタミンで、またはｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯとしてＡ１５５５Ｇ細胞に導入し、導入したＡ１５５５Ｇ細胞の最大呼吸能に対する効果を調べた。具体的には、１２０　ｎｇ／ｍＬ　ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡとなるようｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯ、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡ　ｉＭＡＸまたは同脂質量の空／ＭＩＴＯをＡ１５５５Ｇ細胞に投与し、その最大呼吸能を導入７２時間後に上記と同様にして測定した。その結果、図１３に示されるように、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯをＡ１５５５Ｇ細胞に接触させた場合にのみ、ミトコンドリアの最大呼吸能の改善効果が確認された。 In addition, mt-12S rRNA was unencapsulated and introduced into A1555G cells with lipofectamine or as mt-12S rRNA / MITO, and the effect of the introduced A1555G cells on the maximum respiratory capacity was examined. Specifically, mt-12S rRNA / MITO or Lipofectamine RNA iMAX or empty / MITO having the same amount of lipid was administered to A1555G cells so as to be 120 ng / mL mt-12S rRNA, and the maximum respiratory capacity was introduced 72 hours. Later, it was measured in the same manner as above. As a result, as shown in FIG. 13, the effect of improving the maximum respiration ability of mitochondria was confirmed only when mt-12S rRNA / MITO was brought into contact with A1555G cells.
７）ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯの調製とその細胞への導入
　ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡの代わりに、ミトコンドリア１６Ｓ　ｒＲＮＡ（ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡ）を用いて、ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯを作製した（図１４参照）。ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯは、ｒＲＮＡ／プロタミン複合体調製時のＮ／Ｐ比を０．９に変更した以外は、ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯと同様に調製した。なお、ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡとしては、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿０１２９２０．１に登録されたｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡ（１６７１～３２２９番目のヌクレオチド）を用いた。 7) Preparation of mt-16S rRNA / MITO and its introduction into cells Using mitochondrial 16S rRNA (mt-16S rRNA) instead of mt-12S rRNA, mt-16S rRNA / MITO was prepared (see FIG. 14). ). The mt-16S rRNA / MITO was prepared in the same manner as the mt-12S rRNA / MITO except that the N / P ratio at the time of preparing the rRNA / protamine complex was changed to 0.9. As the mt-16S rRNA, mt-16S rRNA (Nucleotides 1671 to 3229) registered in NCBI Reference Sequence: NC_012920.1 was used.
　作製したｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯについて、動的光散乱法により平均粒径を分析すると、Ｎ／Ｐ比が０．６～０．９において１４０ｎｍ～１６０ｎｍ程度のナノ粒子が得られることが分かった（図１５Ｂの上パネル）。ゼータサイザーを用いて作製したｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯのゼータ電位を測定すると、Ｎ／Ｐ比が０．６～１．０において－２５ｍＶ以下の良好なゼータ電位を示すナノ粒子が得られた（図１５Ｂのしたパネル）。この結果から、以後の実験では、Ｎ／Ｐ比を０．９として、ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯを調製した。 When the average particle size of the produced mt-16S rRNA / MITO was analyzed by a dynamic light scattering method, it was found that nanoparticles having an N / P ratio of 0.6 to 0.9 and having a nanoparticle size of about 140 nm to 160 nm could be obtained. (Upper panel of FIG. 15B). When the zeta potential of mt-16S rRNA / MITO prepared using a zeta potential was measured, nanoparticles showing a good zeta potential of -25 mV or less at an N / P ratio of 0.6 to 1.0 were obtained (). The panel shown in FIG. 15B). From this result, in the subsequent experiments, mt-16S rRNA / MITO was prepared with the N / P ratio set to 0.9.
　１２０　ｎｇ／ｍＬ　ｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡとなるよう得られたｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡ／ＭＩＴＯをＡ１５５５Ｇ細胞と図１６の上段に記載の導入スケジュールにしたがって接触させ、培養して、細胞内に導入した。結果は、図１６に示される通りであった。図１６に示されるように、最初の導入から７２時間後にミトコンドリアの最大呼吸能は大きく改善した。 The mt-16S rRNA / MITO obtained to be 120 ng / mL mt-16S rRNA was contacted with A1555G cells according to the introduction schedule described in the upper part of FIG. 16, cultured, and introduced into the cells. The results were as shown in FIG. As shown in FIG. 16, the maximum mitochondrial respiration capacity improved significantly 72 hours after the initial introduction.
　このように、ｒＲＮＡのような機能に高次構造を必要とするＲＮＡを本発明の脂質ナノ粒子は、細胞に導入することができ、また、ミトコンドリアに導入することもでき、かつ、ミトコンドリア内で機能させることができた。 As described above, the lipid nanoparticles of the present invention can introduce RNA that requires a higher-order structure for function such as rRNA into cells, can also be introduced into mitochondria, and can be introduced into mitochondria. I was able to make it work.
８）ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡとｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡを搭載した遺伝子発現ベクターの構築
　ｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡとｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡを搭載した遺伝子発現ベクターを構築した。ミトコンドリアＤＮＡのｔＲＮＡＦからｔＲＮＡＬまでの領域をＴ７プロモーターに作動可能に連結させ、ｐＵＣ５７－Ａｍｐベクターに導入した（図１７および１８参照）。得られたｍｔ－１２Ｓ　ｒＲＮＡとｍｔ－１６Ｓ　ｒＲＮＡを上記の通り精製し、上記の通りに脂質ナノ粒子を作製した。当該脂質ナノ粒子をＡ１５５５Ｇ変異細胞に導入し、当該細胞のミトコンドリア最大呼吸能の改善を観察することができる。 8) Construction of a gene expression vector carrying mt-12S rRNA and mt-16S rRNA A gene expression vector carrying mt-12S rRNA and mt-16S rRNA was constructed. The region of mitochondrial DNA from tRNAF to tRNAL was operably linked to the T7 promoter and introduced into the pUC57-Amp vector (see FIGS. 17 and 18). The obtained mt-12S rRNA and mt-16S rRNA were purified as described above to prepare lipid nanoparticles as described above. The lipid nanoparticles can be introduced into A1555G mutant cells and an improvement in the maximum mitochondrial respiration capacity of the cells can be observed.
　配列番号１：フォワードプライマーＦ
　配列番号２：フォワードプライマーＦｌ１
　配列番号３：野生型リバースプライマーＷＴ１
　配列番号４：野生型リバースプライマーＷＴ１－ｌ１
　配列番号５：野生型リバースプライマーＷＴ１－ｌ２
　配列番号６：野生型リバースプライマーＷＴ１－ｓ１
　配列番号７：野生型リバースプライマーＷＴ１－ｓ２
　配列番号８：野生型リバースプライマーＷＴ２
　配列番号９：野生型リバースプライマーＷＴ２－ｌ１
　配列番号１０：野生型リバースプライマーＷＴ２－ｌ２
　配列番号１１：野生型リバースプライマーＷＴ２－ｓ１
　配列番号１２：野生型リバースプライマーＷＴ２－ｓ２
　配列番号１３：変異型リバースプライマーＭＴ１
　配列番号１４：変異型リバースプライマーＭＴ１－ｌ１
　配列番号１５：変異型リバースプライマーＭＴ１－ｌ２
　配列番号１６：変異型リバースプライマーＭＴ１－ｓ１
　配列番号１７：変異型リバースプライマーＭＴ１－ｓ２
　配列番号１８：変異型リバースプライマーＭＴ２
　配列番号１９：変異型リバースプライマーＭＴ２－ｌ１
　配列番号２０：変異型リバースプライマーＭＴ２－ｌ２
　配列番号２１：変異型リバースプライマーＭＴ２－ｓ１
　配列番号２２：変異型リバースプライマーＭＴ２－ｓ２
　配列番号２３：ＫＡＬＡペプチド
　配列番号２４：ｔＲＦ－ｒＲＮＡ－ｔＲＶ配列
　配列番号２５：Ａ１５５５Ｇ変異を有するｔＲＦ－ｒＲＮＡ－ｔＲＶ配列 SEQ ID NO: 1: Forward primer F
SEQ ID NO: 2: Forward primer Fl1
SEQ ID NO: 3: Wild-type reverse primer WT1
SEQ ID NO: 4: Wild-type reverse primer WT1-l1
SEQ ID NO: 5: Wild-type reverse primer WT1-l2
SEQ ID NO: 6: Wild-type reverse primer WT1-s1
SEQ ID NO: 7: Wild-type reverse primer WT1-s2
SEQ ID NO: 8: Wild-type reverse primer WT2
SEQ ID NO: 9: Wild-type reverse primer WT2-l1
SEQ ID NO: 10: Wild-type reverse primer WT2-l2
SEQ ID NO: 11: Wild-type reverse primer WT2-s1
SEQ ID NO: 12: Wild-type reverse primer WT2-s2
SEQ ID NO: 13: Mutant reverse primer MT1
SEQ ID NO: 14: Mutant reverse primer MT1-l1
SEQ ID NO: 15: Mutant reverse primer MT1-l2
SEQ ID NO: 16: Mutant reverse primer MT1-s1
SEQ ID NO: 17: Mutant reverse primer MT1-s2
SEQ ID NO: 18: Mutant reverse primer MT2
SEQ ID NO: 19: Mutant reverse primer MT2-l1
SEQ ID NO: 20: Mutant reverse primer MT2-l2
SEQ ID NO: 21: Mutant reverse primer MT2-s1
SEQ ID NO: 22: Mutant reverse primer MT2-s2
SEQ ID NO: 23: KALA peptide SEQ ID NO: 24: tR F- rRNA-tR V sequence SEQ ID NO: 25: tR F- rRNA-tR V sequence with A1555G mutation

Claims (23)

  1. 　核酸とカチオン性ポリマーとを含むナノ粒子を内包した脂質膜構造体を含む組成物。 A composition containing a lipid membrane structure containing nanoparticles containing nucleic acid and a cationic polymer.
  2. 　核酸が、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされるＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the nucleic acid is RNA encoded by mitochondrial DNA.
  3. 　カチオン性ポリマーが、プロタミンである、請求項１または２に記載の組成物。 The composition according to claim 1 or 2, wherein the cationic polymer is protamine.
  4. 　核酸が、ミトコンドリアＤＮＡによりコードされる１２Ｓ　ｒＲＮＡおよび１６Ｓ　ｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。 The composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the nucleic acid is RNA selected from the group consisting of 12S rRNA encoded by mitochondrial DNA and 16S rRNA.
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物を含む、医薬組成物。 A pharmaceutical composition containing the composition according to any one of claims 1 to 4.
  6. 　配列番号１に示される塩基配列を含むフォワードプライマーＤＮＡと配列番号３又は４に示される塩基配列からなるリバースプライマーＤＮＡとの組み合わせからなる野生型検出用プライマーＤＮＡセットと、
    配列番号１に示される塩基配列を含むフォワードプライマーＤＮＡと配列番号１６、１７又は２０に示される塩基配列からなるリバースプライマーＤＮＡとの組み合わせからなる変異型検出用プライマーＤＮＡセット
    とを含む、ミトコンドリアＤＮＡの点変異Ａ１５５５Ｇ又はこれに対応するミトコンドリア１２ＳリボソームＲＮＡの点変異を検出するためのキット。     A wild-type detection primer DNA set consisting of a combination of a forward primer DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4.
    A mitochondrial DNA containing a mutant detection primer DNA set consisting of a combination of a forward primer DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a reverse primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16, 17 or 20. A kit for detecting a point mutation in the point mutation A1555G or the corresponding mitochondrial 12S ribosomal RNA.
  7. 　配列番号１に示される塩基配列を含むフォワードプライマーＤＮＡが、配列番号１又は２に示される塩基配列からなるプライマーＤＮＡである、請求項６に記載のキット。 The kit according to claim 6, wherein the forward primer DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a primer DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
  8. 　変異型検出用プライマーＤＮＡセットのリバースプライマーＤＮＡが、配列番号１７に示される塩基配列からなるプライマーＤＮＡである、請求項６又は７に記載のキット。 The kit according to claim 6 or 7, wherein the reverse primer DNA of the mutant detection primer DNA set is a primer DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17.
  9. 　以下のａ）又はｂ）に示される核酸を封入してなるミトコンドリア指向性脂質膜構造体。
    　ａ）第一のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列、ミトコンドリアリボソームＲＮＡの塩基配列及び第二のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列をこの順番で含むＲＮＡ
    　ｂ）プロモーターの塩基配列及びａ）のＲＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡ     A mitochondrial directional lipid membrane structure in which the nucleic acid shown in a) or b) below is encapsulated.
    a) RNA containing the base sequence of the first mitochondrial tRNA, the base sequence of mitochondrial ribosomal RNA, and the base sequence of the second mitochondrial tRNA in this order.
    b) DNA containing the promoter base sequence and the base sequence complementary to the RNA of a)
  10. 　前記ａ）におけるミトコンドリアリボソームＲＮＡの塩基配列及び２つのミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列が連続している、請求項９に記載の脂質膜構造体。 The lipid membrane structure according to claim 9, wherein the base sequence of mitochondrial ribosomal RNA and the base sequence of two mitochondrial tRNAs in a) above are continuous.
  11. 　ミトコンドリアリボソームＲＮＡが野生型の１２ＳミトコンドリアリボソームＲＮＡである、請求項９又は１０に記載の脂質膜構造体。 The lipid membrane structure according to claim 9 or 10, wherein the mitochondrial ribosomal RNA is a wild-type 12S mitochondrial ribosomal RNA.
  12. 　ジオレイルホスファチジルエタノールアミン及びスフィンゴミエリンを脂質膜の構成脂質として含有する、請求項９から１１のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。 The lipid membrane structure according to any one of claims 9 to 11, which contains diorail phosphatidylethanolamine and sphingomyelin as constituent lipids of the lipid membrane.
  13. 　膜透過性ペプチドを脂質膜表面に有する、請求項９から１２のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。 The lipid membrane structure according to any one of claims 9 to 12, which has a membrane-permeable peptide on the surface of the lipid membrane.
  14. 　膜透過性ペプチドが連続した４～２０個のアルギニン残基からなるポリアルギニンペプチドである、請求項１３に記載の脂質膜構造体。 The lipid membrane structure according to claim 13, wherein the membrane-permeable peptide is a polyarginine peptide consisting of 4 to 20 consecutive arginine residues.
  15. 　配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを脂質膜表面に有する、請求項９から１４のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。 The lipid membrane structure according to any one of claims 9 to 14, which has a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 on the surface of the lipid membrane.
  16. 　以下のａ）又はｂ）に示される核酸を有効成分として含有する、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
    　ａ）第一のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列、ミトコンドリアリボソームＲＮＡの塩基配列及び第二のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列をこの順番で含むＲＮＡ
    　ｂ）プロモーターの塩基配列及びａ）のＲＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡ     A pharmaceutical composition for treating and / or preventing mitochondrial disease, which comprises the nucleic acid shown in a) or b) below as an active ingredient.
    a) RNA containing the base sequence of the first mitochondrial tRNA, the base sequence of mitochondrial ribosomal RNA, and the base sequence of the second mitochondrial tRNA in this order.
    b) DNA containing the promoter base sequence and the base sequence complementary to the RNA of a)
  17. 　前記ａ）におけるミトコンドリアリボソームＲＮＡの塩基配列及び２つのミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列が連続している、請求項１６に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 16, wherein the base sequence of mitochondrial ribosomal RNA and the base sequence of two mitochondrial tRNAs in a) are continuous.
  18. 　ミトコンドリアリボソームＲＮＡが野生型の１２ＳミトコンドリアリボソームＲＮＡである、請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 16 or 17, wherein the mitochondrial ribosomal RNA is a wild-type 12S mitochondrial ribosomal RNA.
  19. 　核酸がミトコンドリア指向性脂質膜構造体に封入されている、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to any one of claims 16 to 18, wherein the nucleic acid is encapsulated in a mitochondrial directional lipid membrane structure.
  20. 　ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に由来する細胞に、以下のａ）又はｂ）に示される核酸をインビトロで導入することを含む、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防のための細胞製剤の製造方法。
    　ａ）第一のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列、ミトコンドリアリボソームＲＮＡの塩基配列及び第二のミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列をこの順番で含むＲＮＡ
    　ｂ）プロモーターの塩基配列及びａ）のＲＮＡに相補的な塩基配列を含むＤＮＡ     For the treatment and / or prevention of mitochondrial disease, which comprises introducing the nucleic acids shown in a) or b) below into cells derived from mitochondrial disease patients or those who are at risk of developing mitochondrial disease. Method for producing cell preparation.
    a) RNA containing the base sequence of the first mitochondrial tRNA, the base sequence of mitochondrial ribosomal RNA, and the base sequence of the second mitochondrial tRNA in this order.
    b) DNA containing the promoter base sequence and the base sequence complementary to the RNA of a)
  21. 　前記ａ）におけるミトコンドリアリボソームＲＮＡの塩基配列及び２つのミトコンドリアｔＲＮＡの塩基配列が連続している、請求項２０に記載の製造方法。 The production method according to claim 20, wherein the base sequence of mitochondrial ribosomal RNA and the base sequence of two mitochondrial tRNAs in a) are continuous.
  22. 　ミトコンドリアリボソームＲＮＡが野生型の１２ＳミトコンドリアリボソームＲＮＡである、請求項２０又は２１に記載の製造方法。 The production method according to claim 20 or 21, wherein the mitochondrial ribosomal RNA is a wild-type 12S mitochondrial ribosomal RNA.
  23. 　核酸がミトコンドリア指向性脂質膜構造体に封入されている、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の製造方法。

          The production method according to any one of claims 20 to 22, wherein the nucleic acid is encapsulated in a mitochondrial directional lipid membrane structure.
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