WO2020204086A1 - ２抗原を認識するｉＰＳ細胞由来キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞療法 - Google Patents

２抗原を認識するｉＰＳ細胞由来キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞療法 Download PDF

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安藤　純
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啓光 中内
山口　智之
素生 渡部
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Definitions

  • the present invention relates to a new chimeric antigen receptor expressing T cell (CAR-T cell) and a drug using the same.
  • Chimeric antigen receptor-expressing T cells are T cells into which a chimeric antigen receptor has been introduced, and are attracting attention as epoch-making therapeutic agents for cancer.
  • CAR-T cell therapy which is currently approved as a drug, introduces a chimeric antigen receptor into T cells induced from the peripheral blood of cancer patients to produce CAR-T cells, and autologous CAR-T cells to be administered to patients. It is a therapy and has the problem of being extremely expensive.
  • allogeneic CAR-T cell therapy has also been developed, which has the advantage of reducing the production cost, but has the problem of diminishing the antitumor effect due to immune rejection.
  • Non-patent Document 1 a technique has been developed for establishing T-iPS cells from antigen-specific cytotoxic T cells (CTLs) and inducing differentiation into functionally rejuvenated CTLs while maintaining antigen specificity.
  • CTLs antigen-specific cytotoxic T cells
  • Patent Documents 1. Non-patent document 1).
  • the present inventor can use antigen-specific cytotoxic T cells (CTL) as a raw material, use them as iPS cells, and then introduce a chimeric antigen receptor (CAR) to differentiate them into iPS cell-derived CTLs.
  • CTL cytotoxic T cells
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the present invention provides the following [1] to [8].
  • CTL antigen-specific cytotoxic T cell
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the drug containing the iPS cell according to any one of [1] to [3] as an active ingredient.
  • Antigen-specific cytotoxic T cells by introducing the Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-Myc and SV40 rage T antigen genes into tumor antigen or virus antigen-specific cytotoxic T cells (CTL).
  • CTL CTL -derived iPS cells
  • CAR chimeric antigen receptor
  • CTL antigen-specific cytotoxic T cell
  • CAR chimeric antigen receptor
  • Treatment of cancer or viral disease which comprises administering iPS cells derived from antigen-specific cytotoxic T cells (CTL) into which a chimeric antigen receptor (CAR) has been introduced to a necessary patient.
  • the CTL-derived iPS cells into which the CAR of the present invention has been introduced have an efficient CAR gene transfer efficiency of about 100%, and the antitumor effect is extremely high due to the synergistic effect of the antigen-specific cytotoxicity of CTL and the antitumor effect of CAR. It is expensive and survives in vivo for a long period of time, so it is useful as a therapeutic agent for cancer and viral infections.
  • the cytotoxicity of LMP1-CAR / LMP2-regT to the EB virus-related lymphoma cell line and the cytotoxicity of peripheral blood-derived LMP1-CAR are shown. It is a figure which shows the tumor growth inhibitory effect of LMP1-CAR / LMP2-regT on the EB virus-related lymphoma cell line. It is a figure which compared the survival rate of LMP1-CAR / LMP2-regT and LMP2-regT by a mouse model. It is a figure which shows the rate of apoptosis of LMP1-CAR / LMP2-regT by CID administration.
  • the cells of the present invention are virus-specific or tumor antigen-specific CTL-derived iPS cells into which CAR has been introduced.
  • the iPS cells are obtained by artificially reprogramming CTL to obtain TCR-carrying iPS cells, and then transfecting CAR into the iPS cells for differentiation. More specifically, CTL-derived iPS cells were obtained by introducing the genes of Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc and SV40 large T antigen into CTL clones, and CAR was introduced into the obtained T-iPS cells. , Obtained by differentiation.
  • the CTL used as a raw material is a T cell that is cytotoxic due to having antigen specificity.
  • viruses that are already infected by many adults are excellent as CTLs.
  • Epstein-Barr virus (Epstein Barr Virus) LMP1 antigen, LMP2 antigen, EBNA antigen, adenovirus antigen Penton antigen, hexone antigen, etc. Cytomegalovirus CMVpp65 antigen, IE1 antigen, IE2 antigen, varicella-zoster virus (VZV) IE61 antigen, IE62 antigen, IE63 antigen, ORF10 antigen, simple herpesvirus (HSV) antigen and the like.
  • Epstein-Barr virus Epstein Barr Virus
  • LMP1 antigen LMP2 antigen
  • EBNA antigen adenovirus antigen Penton antigen, hexone antigen, etc.
  • Cytomegalovirus CMVpp65 antigen IE1 antigen, IE2
  • virus-specific CTLs such as human papillomavirus (HPV) E6 antigen and E7 antigen, and HTLV-1 virus Tax antigen also target two antigens, iPSC-derived CAR-rejT (rejuvenated CTL).
  • HPV human papillomavirus
  • HTLV-1 virus Tax antigen also target two antigens, iPSC-derived CAR-rejT (rejuvenated CTL).
  • WT1 antigen WT1 antigen
  • NY-ESO-1 antigen NY-ESO-1 antigen
  • MAGE-1 antigen MAGE-1 antigen
  • tumor antigen such as MART-1 antigen.
  • the CTL used in the present invention is preferably a human CTL.
  • the human who is the origin of the T cells may be a healthy person or a person suffering from a viral infection.
  • a preferred human as the origin of T cells is a human having the same HLA type as a patient to whom the CAR-loaded iPS cells produced according to the present invention should be administered, and a human to which the CAR-loaded iPS cells are further administered.
  • the same person is preferred.
  • CTLs derived from human iPS cells whose HLA has been genome-edited can also be used as long as they have HLAs that match the HLA binding of CTL epitopes.
  • the virus is preferably, but not limited to, EB virus and cytomegalovirus, which infect most adults.
  • Such a CTL can be isolated from, for example, human tissue by a known method.
  • human tissues include tissues containing the T cells, such as peripheral blood, lymph nodes, bone marrow, thymus, spleen, cord blood, and lesion tissue.
  • peripheral blood is preferable from the viewpoint of low invasiveness to humans and easy preparation.
  • Known methods for isolating human T cells include, for example, magnetic selection using magnetic beads for cell separation, flow cytometry using an antibody against a cell surface marker such as CD4 or CD8, and a cell sorter, and anti-virus. Examples thereof include an activated T cell induction method using a CD3 antibody and an anti-CD28 antibody.
  • MHC major histocompatibility complex
  • a desired antigen for example, "MHC tetramer”
  • Pro 5 registered trademark MHC class I pentamer
  • the genes used to reprogram CTL are Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-Myc and SV40 large T antigen.
  • the method for introducing the gene into CTL is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected and used.
  • the nucleic acid encoding the gene for example, cDNA, RNA
  • the expression vector is introduced into cells by genome editing such as infection, lipofection method, electroporation method, calcium phosphate co-precipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, electroporation method, and CRISPR / Cas9. be able to.
  • a stealth-type RNA expression vector is a vector designed to prevent the vector from entering the chromosome and to express the gene continuously and stably in the cytoplasm rather than in the nucleus. Large genes of 13,000 base pairs or more can be introduced and 10 genes can be introduced at the same time. Stealth that does not damage cells, can be removed when the transgene is unnecessary, and cells cannot recognize the vector as a foreign substance. Have sex.
  • Such stealth RNA expression vectors include minus single-strand RNA (A) containing the following RNA sequences (1) to (8), single-strand RNA binding protein (B), and RNA-dependent RNA synthase. Examples include complexes that consist of and do not activate the innate immune structure. (1) RNA sequence for the gene, (2) Human mRNA-derived RNA sequences constituting non-coding regions, (3) Transcription initiation signal sequence recognized by the RNA-dependent RNA synthase, (4) Transcription termination signal sequence recognized by the RNA-dependent RNA synthase, (5) An RNA sequence containing an origin of replication recognized by the RNA-dependent RNA synthase.
  • RNA sequence encoding the RNA-dependent RNA synthase (7) An RNA sequence encoding a protein that regulates the activity of the RNA-dependent RNA synthase, (8) An RNA sequence encoding the single-stranded RNA-binding protein.
  • the CTL when establishing T-iPS cells, the CTL is subjected to interleukin-2 (IL-2), interleukin-7 (IL-7) or interleukin-15 (IL) before the introduction of the gene. It is preferable to stimulate and activate with anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody in the presence of -15), and phytohemaglutinin (PHA), interleukin-2 (IL-2), allogeneic antigen-expressing cells, anti-CD3 antibody. , Anti-CD28 antibody, CD3 agonist and CD28 agonist may be stimulated and activated by at least one substance selected from the group.
  • Such stimulation can be performed, for example, by adding PHA, IL-2, anti-CD3 antibody and / or anti-CD28 antibody or the like to a medium and culturing the T cells for a certain period of time.
  • the anti-CD3 antibody and / or the anti-CD28 antibody may be one to which magnetic beads or the like are bound, and instead of adding these antibodies to the medium, an anti-CD3 antibody and / or an anti-CD28 antibody is used.
  • Stimulation may be given by culturing the CTL for a certain period of time on a culture dish bound to the surface.
  • stimulation may be given by adding the antigen peptide recognized by the CTL to the medium together with the feeder cells.
  • the concentration of PHA added to the medium in order to give such stimulation to the CTL is not particularly limited, but is preferably 1 to 100 ⁇ g / mL.
  • the concentration of IL-2 added to the medium is not particularly limited, but is preferably 1 to 200 ng / mL.
  • the concentration of the anti-CD3 antibody and / or the anti-CD28 antibody added to the medium is not particularly limited, but is preferably 1 to 10 times the culture amount of the CTL.
  • the concentration of the anti-CD3 antibody and / or the anti-CD28 antibody bound on the surface of the culture dish in order to give such stimulation to the CTL is not particularly limited, but the concentration at the time of coating is the anti-CD3 antibody. It is preferably 0.1 to 100 ⁇ g / mL, preferably 1 to 100 ⁇ g / mL, and 0.1 to 10 ⁇ g / mL for anti-CD28 antibodies.
  • the culture period for performing such stimulation is particularly long as long as it is a period sufficient to give such stimulation to the CTL and the CTL can be grown to the number of cells required for the transfer of the gene.
  • it is usually 2 to 7 days, but from the viewpoint of gene transfer efficiency, it is preferably 3 to 5 days. From the viewpoint of infecting by mixing T cells and a vector in a 15 mL tube or increasing the gene transfer efficiency, it is preferable to culture on a culture dish coated with retronectin.
  • a medium for culturing the CTL and adding PHA, IL-2, anti-CD3 antibody and / or anti-CD28 antibody for example, a known medium suitable for culturing the CTL (more specifically, another medium). Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, AIM VTM medium, NS-A2 containing cytokines, human serum can be used.
  • the medium is PHA, IL-2, anti-CD3 antibody and / or anti.
  • amino acids eg, L-glutamine
  • antibiotics eg, streptomycin, penicillin
  • IL-7 is added to the medium instead of IL-2.
  • IL-15 are also preferably added. The concentration of IL-7 and IL-15 added is not particularly limited, but is preferably 1 to 100 ng / mL, respectively.
  • the conditions for introducing the gene into the CTL and thereafter are not particularly limited, but the CTL into which the gene has been introduced is preferably cultured under feeder-free conditions.
  • laminin 511E8 fragment iMatrix-511 solution or wells coated with vitronectin or matrigel can be mentioned. It can also be established by culturing under feeder cell conditions, and examples of feeder cells include mouse embryonic fibroblasts (MEFs), STO cells, and SNL cells whose cell division has been stopped by irradiation with radiation or treatment with antibiotics. ..
  • the iPS cell medium from the next day. After that, it is preferable to replace the medium by half every other day and gradually replace the CTL medium with the iPS medium.
  • a known medium suitable for culturing the CTL with a medium suitable for culturing the iPS cells in accordance with the transition from the CTL to the iPS cells.
  • a medium suitable for culturing such iPS cells a known medium can be appropriately selected and used. For example, in the case of iMatrix coating, StemFit AK03N, or in the case of coating with Vitronectin, Essential 8 Medium, Matrigel.
  • modified Dalveco eagle medium / F12 medium (human iPS) containing knockout serum substitute, L-glutamine, non-essential amino acids, 2-mercaptoethanol, b-FGF, etc. on feeder cells such as MEF cells.
  • feeder cells such as MEF cells.
  • Cell culture medium is desirable.
  • T-iPS cells can be performed by appropriately selecting a known method.
  • a known method for example, a method of observing and selecting the morphology of ES cells / iPS cell-like colonies under a microscope can be mentioned.
  • the properties are often similar, so a method in which all the established colonies are subcultured as they are without selecting each colony of T-iPS cells. There is also.
  • T-iPS cells can be determined, for example, by undifferentiated cell-specific markers (SSEA-4, Tra-1-60, and Tra-1-) in the selected cells. 81 etc.) can be detected by RT-PCR or the like, confirmed by ALP staining, or by transplanting selected cells into mice and observing their teratoma formation. Further, confirmation that the cells selected in this manner are derived from the CTL can be performed by detecting the state of TCR gene rearrangement by genomic PCR.
  • SSEA-4, Tra-1-60, and Tra-1- undifferentiated cell-specific markers
  • Tra-1-60 Tra-1-60
  • Tra-1- Tra-1-
  • the culture environment is preferably 5% CO 2 , 35 to 38 ° C, and more preferably 37 ° C.
  • a viral vector such as a lentiviral vector
  • genome editing such as CRISPR / Cas9
  • transposon a method using a transposon
  • CAR is a chimeric antigen receptor that has the specificity of tumor cells for surface antigens and the ability to activate T cells.
  • CAR-T therapy is a therapy in which a nucleic acid encoding this chimeric antigen receptor is introduced into T cells, and the obtained gene-introduced T cells are proliferated in vitro and infused.
  • CAR refers to a fusion protein containing an extracellular domain that binds to an antigen, a transmembrane domain derived from a polypeptide different from the extracellular domain, and at least one intracellular domain.
  • the "chimeric antigen receptor (CAR)” is sometimes referred to as the "chimeric receptor,” “T-body,” or “chimeric immunoreceptor (CIR).”
  • An "antigen-binding extracellular domain” refers to any oligopeptide or polypeptide that can bind to an antigen, and an "intracellular domain” is a signal that results in the activation or inhibition of biological processes within the cell. Means any oligopeptide or polypeptide known to function as a domain that transmits.
  • tumor antigen means an antigenic biomolecule whose expression is newly observed as cells become cancerous. Detection of tumor antigens, such as immunological detection, is useful in distinguishing between cancerous cells and their mother cells.
  • the tumor antigen in the present invention is a tumor-specific antigen (an antigen that exists only in tumor cells and is not found in other normal cells) or a tumor-related antigen (an antigen that is also present in other organs / tissues or heterologous normal cells). Antigens that develop, antigens that are expressed during development and differentiation) are included.
  • single chain antibody means a single chain polypeptide derived from an antibody that retains the ability to bind to an antigen.
  • an antibody polypeptide formed by recombinant DNA technology and in which the Fv region of an immunoglobulin heavy chain (H chain) and light chain (L chain) fragment is linked via a spacer sequence is exemplified.
  • Various methods for producing scFv are known, and US Pat. No. 4,649,778, Science, Vol. 242, pp. 423-442 (1988), Nature, Vol. 334, pp. 54454 (1989). , Science, Vol. 242, pp. 1038-1041 (1988).
  • domain means a region within a polypeptide that is folded (folded) into a specific structure independently of the other regions.
  • a typical CAR structure is composed of a single chain antibody (scFv) that recognizes a surface antigen of a tumor cell, a transmembrane domain, and an intracellular domain of a TCR complex CD3 ⁇ that activates T cells. .. CARs with such a configuration are called first-generation CARs.
  • the gene for the single chain antibody portion is isolated, for example, from a hybridoma that produces a monoclonal antibody that recognizes the target antigen.
  • T cells expressing CAR directly recognize the surface antigens of tumor cells independently of the expression of major histocompatibility complex class I on the tumor cells, and at the same time activate the T cells to efficiently kill the tumor cells. It is possible to do.
  • CD28 which is a T cell co-stimulator, or CD137 (4-1BB), which is a tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily
  • CD137 4-1BB
  • TNF tumor necrosis factor
  • the second generation CAR has been developed.
  • CAR incorporating the suicide gene immunological case-9 is also useful in order to induce cell death in CAR-T cells when side effects occur.
  • a means for introducing CAR there are a method of gene transfer using a viral vector such as lentivirus, a method of using a transposon such as piggy bac, or a method of genome editing using CRISPR / Cas9 or the like.
  • CAR-introduced cells can be transformed into CAR-regT cells into which CAR has been introduced by inducing differentiation.
  • CAR-T-iPS cells after introduction of the CAR gene are finely crushed and cultured on feeder cells for 2 weeks, and then cultured on feeder cells expressing Notch Ligand with cytokines for another 4 weeks and suspended after 4 weeks. Identify cells and stimulate T cell receptors (TCRs). Post-stimulation CAR gene transfer efficiency and antigen specificity will be confirmed by the methods described above.
  • the differentiation-induced CAR-regT has the CAR gene introduced into it and retains the original antigen specificity.
  • the final cell collection if there are few antigen-specific cells, bead selection or FACS sorting is performed on the antigen-specific cells using tetramer. If the CAR gene transfer efficiency is low, protein L staining is performed to sort CAR-positive cells. In addition, necessary cells such as a selection of CD8-positive cells can be selected and amplified.
  • the CAR-derived iPS cell-derived CTL cells produced by the method of the present invention target two antigens, the escape mechanism of tumor cells is difficult to work, and the cell-killing effect can be efficiently exerted. It is useful as a therapeutic agent for various malignant tumors and virus-related tumors.
  • Examples of therapeutic agents for malignant tumors include GD2-CAR, HER2-CAR, NY-ESO-1-CAR, MUC1-CAR, CD19 for tumor antigen-specific rejT such as Survivin, NY-ESO-1, WT-1, and MAGE3. -CAR etc. can be combined.
  • Examples of virus-related tumor therapeutic agents include EB virus-related lymphoma, which is an EB virus-related tumor, and LMP2-CAR / LMP2-regT or LMP2-CAR combined with LMP1-CAR / LMP2-regT for nasopharyngeal carcinoma.
  • LMP2-CAR / LMP1-regT LMP2-CAR / LMP1-regT
  • CD19-CAR / LMP1-regT for EB virus-positive B-cell lymphoma CD19-CAR / LMP2-regT
  • Tax-specific rejT for adult T-cell leukemia (ATL)
  • NY-ESO-1- Examples thereof include NY-ESO-1 / Tax-regT incorporating CAR, NY-ESO-1 / HBZ-regT incorporating NY-ESO-1-CAR into HBZ-specific rejT.
  • a combination of virus-specific regT and CAR which are said to have excellent durability in vivo, is also useful.
  • LMP2-specific rejT LMP1-specific rejT, CMV-specific rejT, adenovirus-specific rejT, VZV-specific rejT, HSV-specific rejT, etc.
  • GD2-CAR HER2-CAR
  • NY-ESO-1-CAR MUC1 -A method of combining CARs such as CAR and CD19-CAR is also useful.
  • the immuno-cell therapeutic agent of the present invention is not particularly limited, but is preferably parenterally administered, for example, intravenously, intraperitoneally, subcutaneously or intramuscularly, and more preferably intravenously. .. Alternatively, it can be locally administered to the affected area.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by formulating the T-iPS cells produced by the method of the present invention by a known pharmaceutical method.
  • it can be mainly used parenterally as a capsule, a liquid, a film coating, a suspension, an emulsion, an injection (intravenous injection, an infusion, etc.).
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles specifically sterile water or saline, vegetable oils, solvents, bases, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, vehicles, etc.
  • pharmacologically acceptable carriers or vehicles specifically sterile water or saline, vegetable oils, solvents, bases, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, vehicles, etc.
  • it may be used in combination with a known pharmaceutical composition or immunostimulant used for the treatment or prevention of the disease.
  • the dose thereof is appropriately selected according to the age, weight, symptom, health condition, type of composition (pharmaceutical product, food and drink, etc.) of the subject.
  • Example 1 Establishment of T-iPS cells from a human papillomavirus (HPV) -specific CTL clone using a Sendai virus vector.
  • Peripheral blood mononuclear cells were isolated from the peripheral blood of healthy subjects, and then dendritic cells were induced for the purpose of antigen presentation. After 7 days, HPV antigen peptide (HPV16-E6, A2402) was added to the induced dendritic cells, cultured in a CO 2 incubator for 15 minutes, and then co-cultured with peripheral blood mononuclear cells was started.
  • HPV antigen peptide HPV16-E6, A2402
  • the CTL clone was stimulated with CD3 / 28, and then the gene was introduced using the vector of A) below.
  • the CTL after gene transfer was transferred to a 6-well plate coated with iMatrix, and culturing was started in a CO 2 incubator using the CTL medium supplemented with IL-2 as a medium. (Fig. 1)
  • Example 2 Establishment of T-iPS cells from an Epstein-Barr virus (EBV) -specific CTL clone using a Sendai virus vector.
  • EBV LMP2 antigen peptide A2402 was added to the induced dendritic cells, cultured in a CO 2 incubator for 15 minutes, and then co-cultured with peripheral blood mononuclear cells was started.
  • the LMP2CTL clone was stimulated with CD3 / 28, and then the gene was introduced with MOI10 using a Sendai virus vector.
  • the CTL after gene transfer was transferred to a 6-well plate coated with iMatrix, and culturing was started in a CO 2 incubator using the CTL medium supplemented with IL-2 as a medium.
  • the LMP1-CAR vector derived from lentivirus was infected to prepare LMP1-CAR / LMP2-T-iPS, and then LMP1-CAR / LMP2-regT was induced to differentiate.
  • the LMP1-CAR expression rate of the differentiation-induced LMP1-CAR / LMP2-regT was as high as 100%.
  • Tumor cells could be efficiently eliminated by conducting cytotoxicity test and co-culture test.
  • FIG. 2 shows the results of tetramer staining of LMP2-CTL derived from peripheral blood and the established CTL clone.
  • FIG. 3 shows the structure of the iC9-LMP1-CAR-T-iPSCs vector.
  • FIG. 4 shows the LMP1-CAR expression rate of LMP1-CAR-LMP2-T-iPS.
  • FIG. 5 shows the LMP1-CAR expression rate of LMP1-CAR / LMP2-regT.
  • Example 3 (Cytotoxicity test) 1) A 51 chromium release test was performed to compare the cytotoxicity of LMP1-CAR / LMP2-regT against EB virus-related lymphoma cell lines and the cytotoxicity of peripheral blood-derived LMP1-CART.
  • HLA-matched EB virus-related lymphoma cell line extranode NK / T cell lymphoma, nasal type; ENKL
  • ENKL a chromium-labeled target
  • the HLA-mismatched EB virus-infected tumor cell line (LCL) was co-cultured for 6 hours at an effector: target ratio of 5: 1 and 2.5: 1. 2) After co-culture, the culture supernatant was transferred to another counter plate, dried, and measured with a plate reader.
  • LMP1-CAR / LMP2-regT showed strong antigen-specific cytotoxicity against HLA-matched EB virus-related lymphoma cell lines (70-80%), but against control HLA-mismatched tumor cell lines. was less than 10% and showed no cytotoxicity.
  • Peripheral blood-derived LMP1-CART showed about 30 to 50% cytotoxicity to HLA-matched EB virus-related lymphoma cell lines. The cytotoxicity of LMP1-CAR / LMP2-regT was stronger than that of LMP1-CART (Fig. 6).
  • Example 4 (Co-culture test) 1) A co-culture test was conducted to compare the cytotoxicity of LMP1-CAR / LMP2-regT against EB virus-related lymphoma cell lines and the cytotoxicity of peripheral blood-derived LMP1-CART. LMP1-CAR / LMP2-regT was used as the effector, and rejT having other antigen specificity was used as the control effector instead of the EB virus. An HLA-matched EB virus-related lymphoma cell line (ENKL) was used as the target. The effector: target ratio was 5: 1 and co-cultured for 9 days. 2) The ratio of tumor cells to T cells after co-culture was analyzed by flow cytometry after staining with CD56 and CD3.
  • LMP1-CAR / LMP2-regT eliminated HLA-matched EB virus-related lymphoma cells on day 9, but the non-antigen-specific control rejT could not eliminate tumor cells, and the tumor's Proliferation was observed (Fig. 7).
  • Example 5 (Anti-cancer effect) Survival comparison test of LMP1-CAR / LMP2-regT and LMP2-regT using a mouse model After transplanting the EB virus-related lymphoma cell line (ENKL) into the abdominal cavity of immunodeficient mice, LMP1-CAR / LMP2-regT treatment group, LMP2 The survival rates of the mice divided into the -regT-treated group and the non-treatment-controlled group were compared. The results are shown in FIG.
  • ENKL EB virus-related lymphoma cell line
  • Example 6 (Apoptosis due to CID administration) The Annexin / 7-AAD positive rate 48 hours after administration of the dimerizer low molecular weight compound CID to LMP1-CAR / LMP2-regT was analyzed to determine the rate of apoptosis. The results are shown in FIG.

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Abstract

２つの抗原を認識することでより優れた抗腫瘍効果を奏し、生体内に長期生存し得るｉＰＳ技術を用いた免疫細胞療法を提供する。　キメラ抗原受容体が導入された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞。

Description

２抗原を認識するｉＰＳ細胞由来キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞療法
　本発明は、新たなキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）及びこれを用いる医薬に関する。
　キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、キメラ抗原受容体を導入したＴ細胞であり、画期的ながん治療薬として注目されている。現在医薬品承認されているＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、がん患者末梢血より誘導するＴ細胞にキメラ抗原受容体を導入してＣＡＲ－Ｔ細胞を作製し、患者に投与される自家ＣＡＲ－Ｔ細胞療法であり、極めて高額であるという問題がある。一方で臨床試験の段階であるが、他家ＣＡＲ－Ｔ細胞療法も開発されており、作製コストの軽減が利点であるが、免疫拒絶による抗腫瘍効果減弱の問題がある。
　一方、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）からＴ－ｉＰＳ細胞を樹立し、抗原特異性を維持したまま再び、機能的に若返ったＣＴＬに分化誘導する技術が開発されている（特許文献１、非特許文献１）。
特許第６１６４７４６号公報
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　２０１７，４７；　２－１２
　しかしながら、ＣＴＬ－ｉＰＳ細胞又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法の抗がん効果は抗原によっては、あるいはがん種によっては未だ十分でなく、更に効率よく増殖してより優れた抗腫瘍効果を奏し、生体内に長期生存し得る免疫細胞療法が望まれている。
　そこで本発明者は、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を原料とし、これをｉＰＳ細胞とし、次いでキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を導入して分化させれば、特にｉＰＳ細胞由来ＣＴＬとＣＡＲによる２つの抗原を認識することで、抗腫瘍効果が相乗的に増強され、かつ生体内に長期間生存するｉＰＳ細胞が得られることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔８〕を提供するものである。
〔１〕キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）由来のｉＰＳ細胞。
〔２〕抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の抗原が、ウイルス抗原又は腫瘍抗原である〔１〕記載のｉＰＳ細胞。
〔３〕キメラ抗原受容体が、腫瘍表面抗原を認識するＣＡＲである〔１〕又は〔２〕記載のｉＰＳ細胞。
〔４〕〔１〕～〔３〕から選ばれるいずれかに記載のｉＰＳ細胞を有効成分とする医薬。
〔５〕腫瘍抗原又はウイルス抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ及びＳＶ４０　ｌａｒｇｅ　Ｔ抗原の遺伝子を導入して抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）由来ｉＰＳ細胞を得（Ｔ－ｉＰＳＣ）、得られたＴ－ｉＰＳＣにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を導入して分化誘導することを特徴とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）由来のｉＰＳ細胞の製造法。
〔６〕がん又はウイルス感染疾患を治療するための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）由来のｉＰＳ細胞。
〔７〕がん又はウイルス感染疾患の治療薬製造のための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）由来のｉＰＳ細胞の使用。
〔８〕キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）由来のｉＰＳ細胞を、必要な患者に投与することを特徴とする、がん又はウイルス疾患の治療方法。
　本発明のＣＡＲが導入されたＣＴＬ由来ｉＰＳ細胞は、ＣＡＲ遺伝子の導入効率が約１００％と効率よく、またＣＴＬの抗原特異的細胞傷害とＣＡＲによる抗腫瘍効果の相乗効果により抗腫瘍効果が極めて高く、かつ生体内に長期間生存するためがん及びウイルス感染疾患の治療薬として有用である。
誘導したＣＴＬから樹立ＣＴＬクローンまでのテトラマー解析を示す図である。 誘導したＣＴＬから樹立ＣＴＬクローンまでのテトラマー解析を示す図である。 ＬＭＰ１－ＣＡＲのベクター構造を示す図である。 ＬＭＰ１－ＣＡＲ－ＬＭＰ２－Ｔ－ｉＰＳのＬＭＰ１－ＣＡＲ発現率を示す図である。 ＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴのＬＭＰ１－ＣＡＲ発現率を示す図である。 ＥＢウイルス関連リンパ腫細胞株に対するＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴの細胞傷害性と末梢血由来ＬＭＰ１－ＣＡＲの細胞傷害性を示す。 ＥＢウイルス関連リンパ腫細胞株に対するＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴの腫瘍増殖抑制効果を示す図である。 マウスモデルによるＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴとＬＭＰ２－ｒｅｊＴの生存率を比較した図である。 ＣＩＤ投与によるＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴのアポトーシスの割合を示す図である。
　本発明の細胞は、ＣＡＲが導入されたウイルス特異的もしくは腫瘍抗原特異的ＣＴＬ由来のｉＰＳ細胞である。当該ｉＰＳ細胞は、ＣＴＬを人工的に初期化してＴＣＲを保持したｉＰＳ細胞とし、次いでこれにＣＡＲを遺伝子導入し分化させることにより得られる。より具体的には、ＣＴＬクローンにＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ及びＳＶ４０　ｌａｒｇｅ　Ｔ抗原の遺伝子を導入してＣＴＬ由来ｉＰＳ細胞を得、得られたＴ－ｉＰＳ細胞にＣＡＲを導入し、分化することにより得られる。
　原料として用いられるＣＴＬは、抗原特異性を有することにより細胞傷害性を生じているＴ細胞である。特に多くの成人が既感染であるウイルスはＣＴＬとして優れている。エプスタイン　バール　ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ）のＬＭＰ1抗原、ＬＭＰ２抗原、ＥＢＮＡ抗原など、アデノウイルス抗原のペントン抗原、ヘキソン抗原など、サイトメガロウイルスのＣＭＶｐｐ65抗原、ＩＥ１抗原、ＩＥ２抗原、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）のＩＥ６１抗原、ＩＥ６２抗原、ＩＥ６３抗原、ＯＲＦ１０抗原、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の抗原などがあげられる。また、ウイルス関連腫瘍に関するウイルスとして、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のＥ６抗原、Ｅ７抗原など、ＨＴＬＶ－１ウイルスのＴａｘ抗原などのウイルス特異的ＣＴＬも２抗原を標的とするｉＰＳＣ由来ＣＡＲ－ｒｅｊＴ（ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｄ　ＣＴＬ）を作製するのに優れている。しかしウイルス抗原のみならずＷＴ1抗原、ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原、ＭＡＧＥ－１抗原、ＭＡＲＴ－１抗原などの腫瘍抗原など他の抗原特異的ＣＴＬからも作成可能である。
　本発明に用いられるＣＴＬは、ヒトＣＴＬが好ましい。このＴ細胞の起源であるヒトとしては、健常人であっても、ウイルス感染症を患っているヒトであってもよい。また、Ｔ細胞の起源として好ましいヒトは、本発明によって製造されたＣＡＲ搭載ｉＰＳ細胞を投与されるべき患者とＨＬＡの型が一致しているヒトであり、さらにＣＡＲ搭載ｉＰＳ細胞が投与されるヒトと同一人が好ましい。他家細胞を用いる場合は、ＣＴＬエピトープのＨＬＡ拘束性が一致するＨＬＡを持っていれば、ＨＬＡをゲノム編集したヒトｉＰＳ細胞より誘導されたＣＴＬも使用することができる。ウイルスとしては、ほとんどの成人が感染しているＥＢウイルス、サイトメガロウイルスが好ましいが、それに限らない。
　このようなＣＴＬは、例えばヒトの組織から公知の手法により単離することができる。ヒトの組織としては、前記Ｔ細胞を含む組織、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血が好ましい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、細胞分離用磁気ビーズなどを用いる磁気セレクション、ＣＤ４又はＣＤ８等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリー、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体を用いる活性化Ｔ細胞誘導法などが挙げられる。抗原特異性を有するＴ細胞を含むヒトの組織より単離する場合には、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を多量体化させたもの（例えば、「ＭＨＣテトラマー」、「プロ５（登録商標）ＭＨＣ　クラスＩペンタマー」）を用いて、ヒトの組織より所望の抗原特異性を有するＴ細胞を精製することができる。
　ＣＴＬを初期化するために用いられる遺伝子は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ及びＳＶ４０　ｌａｒｇｅ　Ｔ抗原である。
　本発明において、ＣＴＬに前記遺伝子を導入する方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。例えば、前記遺伝子をコードする核酸の形態にて前記ＣＴＬに導入する場合においては、前記遺伝子をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）を、Ｔ細胞で機能するプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集にて細胞に導入することができる。
　このような発現ベクターのうち、前記遺伝子を含むステルス型ＲＮＡ発現ベクターを用いるのが、がん化の危険性の低減、導入効率の点から、より好ましい。
　ステルス型ＲＮＡ発現ベクターとは、ベクターが染色体に入ることを回避し、核内ではなく細胞質内で、持続的で安定して遺伝子が発現するように設計されたベクターである。１万３０００塩基対以上の大きな遺伝子の導入や、１０個の遺伝子の同時導入もでき、細胞に傷害を与えず、導入遺伝子が不要な時には除去が可能で、細胞がベクターを異物として認識できないステルス性を持っている。
　このようなステルス型ＲＮＡ発現ベクターとしては、下記（１）～（８）のＲＮＡ配列を含むマイナス一本鎖ＲＮＡ（Ａ）と、一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質（Ｂ）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素からなり、自然免疫構造を活性化させない複合体が挙げられる。
（１）前記遺伝子に対するＲＮＡ配列、
（２）非コード領域を構成するヒトｍＲＮＡ由来ＲＮＡ配列、
（３）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写開始シグナル配列、
（４）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する転写終結シグナル配列、
（５）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素が認識する複製起点を含むＲＮＡ配列、
（６）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素をコードするＲＮＡ配列、
（７）前記ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素の活性を調節するタンパク質をコードするＲＮＡ配列、
（８）前記一本鎖ＲＮＡ結合タンパク質をコードするＲＮＡ配列。
　また、Ｔ－ｉＰＳ細胞を樹立する際には、前記ＣＴＬは、前記遺伝子の導入前に、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）又はインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下にて抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体によって刺激して活性化することが好ましく、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、同種抗原発現細胞、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストからなる群から選択される少なくとも１の物質によって刺激して活性化してもよい。かかる刺激は、例えば、培地中に、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体等を添加して前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって行うことができる。また、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、さらにこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記ＣＴＬを一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。さらにまた、前記ＣＴＬが認識する抗原ペプチドをフィーダー細胞とともに培地中に添加することによって刺激を与えても良い。
　かかる刺激を前記ＣＴＬに与えるために、培地中に添加するＰＨＡの濃度としては特に制限はないが、１～１００μｇ／ｍＬであることが好ましい。また、培地中に添加するＩＬ－２の濃度としては特に制限はないが、１～２００ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。さらに、培地中に添加する抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、前記ＣＴＬの培養量の１～１０倍量であることが好ましい。また、かかる刺激を前記ＣＴＬに与えるために、培養ディッシュの表面上に結合させた抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体の濃度としては特に制限はないが、コーティングの際の濃度は抗ＣＤ３抗体では０．１～１００μｇ／ｍＬ、好ましくは１～１００μｇ／ｍＬ、抗ＣＤ２８抗体では０．１～１０μｇ／ｍＬであることが好ましい。
　また、かかる刺激を行うための培養期間は、前記ＣＴＬに対してかかる刺激を与えるのに十分な期間であって、前記遺伝子の導入に必要な細胞数までＣＴＬを増殖しうる期間であれば特に制限はないが、通常２～７日間であるが、遺伝子導入効率の観点から、好ましくは３～５日間である。１５ｍＬチューブ内でＴ細胞とベクターを混合することにより感染させる、もしくは遺伝子導入効率を上げるという観点から、レトロネクチンがコートしてある培養ディッシュ上にて培養することが好ましい。
　前記ＣＴＬを培養し、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体等を添加する培地としては、例えば、前記ＣＴＬの培養に適した公知の培地（より具体的には、他のサイトカイン類、ヒト血清を含む、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地、ＡＩＭ　ＶTM　ｍｅｄｉｕｍ、ＮＳ－Ａ２を用いることができる。培地には、ＰＨＡ、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体以外にも、培養に必要なアミノ酸（例えば、Ｌ－グルタミン）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン）が添加してあっても良い。また、ＩＬ－２のかわりに培地にＩＬ－７及びＩＬ－１５を添加することも好ましい。ＩＬ－７及びＩＬ－１５の添加濃度としては特に制限はないが、それぞれ１～１００ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。
　また、前記ＣＴＬに前記遺伝子を導入する際、又はその後の条件としては特に制限はないが、前記遺伝子を導入した前記ＣＴＬは、フィーダーフリー条件下で培養するのが好ましい。例えば、ラミニン５１１Ｅ８断片であるｉＭａｔｒｉｘ－５１１溶液又はビトロネクチンもしくはマトリジェルでコーティングされたウェルが挙げられる。フィーダー細胞条件下での培養でも樹立可能であり、フィーダー細胞としては例えば、放射線の照射や抗生物質処理により細胞分裂を停止させたマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞が挙げられる。
　さらに、前記ＣＴＬからＴ－ｉＰＳ細胞に誘導する過程において、翌日からｉＰＳ細胞の培地を添加しておくことが好ましい。その後は１日おきに半量ずつ培地交換を行い、徐々にＣＴＬ培地からｉＰＳ培地に置換するのが好ましい。
　また、前記ＣＴＬからｉＰＳ細胞への移行に合わせて、前記ＣＴＬの培養に適した公知の培地から、ｉＰＳ細胞の培養に適した培地に徐々に置換していきながら培養することが好ましい。かかるｉＰＳ細胞の培養に適した培地としては、公知の培地を適宜選択して用いることができ、例えば、ｉＭａｔｒｉｘコーティングした場合にはＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０３Ｎもしくはビトロネクチンでコーティングした場合にはＥｓｓｅｎｔｉａｌ　８　Ｍｅｄｉｕｍ、マトリジェルの場合はｍＴｅＳＲ、ＭＥＦ細胞などのフィーダー細胞上ではノックアウト血清代替物、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、２－メルカプトエタノール、及びｂ－ＦＧＦ等を含有する、ダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２培地（ヒトｉＰＳ細胞培地）が望ましい。
　このようにしてＴ－ｉＰＳ細胞の選択は、公知の手法を適宜選択することによって行うことができる。かかる公知の手法としては、例えば、ＥＳ細胞／ｉＰＳ細胞様コロニーの形態を顕微鏡下にて観察して選択する方法が挙げられる。一方でシングルセルであるＣＴＬクローンから樹立したＴ－ｉＰＳの場合、性質が似ていることが多いため、Ｔ－ｉＰＳ細胞の各コロニーを選択せず、樹立できたコロニーを全てそのまま継代する方法もある。
　このようにして選択された細胞がＴ－ｉＰＳ細胞であるということの確認は、例えば、選択された細胞における未分化細胞特異的マーカー（ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、及びＴｒａ－１－８１等）の発現をＲＴ－ＰＣＲ等によって検出する方法やＡＬＰ染色で確認する方法、選択された細胞をマウスに移植して、そのテラトーマ形成を観察する方法により行うことができる。また、このようにして選択された細胞が前記ＣＴＬ由来であることの確認は、ＴＣＲ遺伝子再構成の状態をゲノムＰＣＲによって検出することにより行うことができる。
　これらの細胞を選択して回収する時期は、コロニーの生育状態を観察しながら、またセンダイウイルス前記因子ベクターにＧＦＰなどの標識が入っている場合は、ＧＦＰが消失したことを蛍光顕微鏡で確認できた頃に回収するのが好ましい。概ね、前記遺伝子を前記Ｔ細胞に導入してから１０～４０日、好ましくは１４日～２８日である。培養環境としては、上記にて特に断りのない限り、好ましくは、５％ＣＯ2、３５～３８℃、より好ましくは３７℃の条件である。
　得られたＣＴＬ由来ｉＰＳ細胞にＣＡＲを導入するには、レンチウイルスベクターなどウイルスベクターを用いる方法、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集、トランスポゾンを用いる方法などがある。
　ＣＡＲは、腫瘍細胞の表面抗原への特異性とＴ細胞の活性化能を有するキメラ抗原受容体である。ＣＡＲ－Ｔ療法とは、このキメラ抗原受容体をコードする核酸をＴ細胞に導入し、得られた遺伝子導入Ｔ細胞を体外で増殖させて輸注する療法である。
　本明細書において「ＣＡＲ」とは、抗原に結合する細胞外ドメイン、前記細胞外ドメインとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質を示す。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、「キメラ受容体」、「Ｔ－ｂｏｄｙ」、「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ）」と呼ばれることがある。「抗原に結合する細胞外ドメイン」は、ある抗原に結合することができる任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを示し、「細胞内ドメイン」は細胞内で生物学的プロセスの活性化又は阻害をもたらすシグナルを伝達するドメインとして機能することが知られている任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。
　本明細書において「腫瘍抗原」とは、細胞のがん化に伴って新たに発現が認められるようになる、抗原性を有する生体分子を意味する。腫瘍抗原の検出、例えば免疫学的な検出は、がん化した細胞とその母細胞の区別に有用である。本発明における腫瘍抗原は、腫瘍特異抗原（腫瘍細胞のみに存在し、他の正常細胞には見られない抗原）、又は腫瘍関連抗原（他の臓器・組織又は異種異系の正常細胞にも存在する抗原、発生・分化の途上において発現する抗原）を含む。
　本明細書において「単鎖抗体（ｓｃＦｖ）」とは、抗原との結合能力を保持した、抗体由来の一本鎖ポリペプチドを意味する。例えば組換えＤＮＡ技術により形成され、スペーサー配列を介して免疫グロブリン重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）フラグメントのＦｖ領域を連結した抗体ポリペプチドが例示される。ｓｃＦｖの各種作製方法が公知であり、米国特許第４６９４７７８号公報、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４２巻、第４２３－４４２頁（１９８８）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３３４巻、第５４４５４頁（１９８９）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４２巻、第１０３８－１０４１頁（１９８８）に記載されている方法が挙げられる。
　本明細書において「ドメイン」とは、ポリペプチド内の一領域であって、他の領域とは独立して特定の構造に折りたたまれる（フォールディングされる）領域を意味する。
　代表的なＣＡＲの構造は、腫瘍細胞の表面抗原を認識する単鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ：ｓｃＦｖ）、膜貫通ドメインとＴ細胞を活性化させるＴＣＲ複合体ＣＤ３ζの細胞内ドメインから構成される。このような構成のＣＡＲは第一世代ＣＡＲと呼ばれている。単鎖抗体部分の遺伝子は、例えば標的とする抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから単離される。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、腫瘍細胞上の主要組織適合抗原クラスＩの発現とは無関係に腫瘍細胞の表面抗原を直接認識し、同時にＴ細胞を活性化することで、効率よく腫瘍細胞を殺傷することが可能である。
　第一世代ＣＡＲのＴ細胞活性化能を増強する目的で、Ｔ細胞の共刺激分子であるＣＤ２８もしくは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーであるＣＤ１３７（４－１ＢＢ）の細胞内ドメインを連結した第二世代ＣＡＲが開発されている。さらなる改良型として、ＣＤ２８、４－１ＢＢ又はＣＤ１３４（ＯＸ４０）のうち２つの共刺激分子をタンデムに連結した第三世代ＣＡＲの開発も進んでいる（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１，ｐ２１５－２２３（２００９）。また、安全システムとして副作用発現時にＣＡＲ－Ｔ細胞に細胞死を誘導できるようにするために、自殺遺伝子ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｃａｓｐａｓｅ－９を組み入れたＣＡＲも有用である。
　ＣＡＲの導入手段は、具体的には、レンチウイルスなどのウイルスベクターにより遺伝子導入を行う、またはｐｉｇｇｙ　ｂａｃなどのトランスポゾンを用いる、またはＣＲＩＳＲ／Ｃａｓ９などを用いたゲノム編集の方法がある。
　ＣＡＲが導入された細胞の確認は、ｓｃＦｖと結合するプロテインＬを染色することによりＣＡＲ遺伝子導入効率をフローサイトメトリーで解析する。
　ＣＡＲが導入された細胞は、分化誘導することにより、ＣＡＲが導入されたＣＡＲ－ｒｅｊＴ細胞にすることができる。分化誘導手段は、ＣＡＲ遺伝子導入後のＣＡＲ－Ｔ－ｉＰＳ細胞を細かく砕きフィーダー細胞上で２週間培養し、その後Ｎｏｔｃｈ　Ｌｉｇａｎｄが発現するフィーダー細胞上で更に４週間サイトカインと共に培養し、４週間後浮遊細胞を確認しＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激する。刺激後ＣＡＲ遺伝子導入効率と抗原特異性を前述の方法で確認する。分化誘導されたＣＡＲ－ｒｅｊＴはＣＡＲ遺伝子が導入されており、更にもとの抗原特異性を保持している。
　最終細胞の採取は、抗原特異性のある細胞が少ない場合は抗原特異性のある細胞をテトラマーを用いてビーズセレクション、もしくはＦＡＣＳソートを行う。ＣＡＲ遺伝子導入効率が少ない場合はプロテインＬ染色を行い、ＣＡＲ陽性細胞をソートする。その他ＣＤ８陽性細胞のセレクションなど必要な細胞を選別し、増幅させることができる。
　本発明の方法により製造されるＣＡＲが導入されたｉＰＳ細胞由来のＣＴＬ細胞は、２つの抗原を標的とするため、腫瘍細胞の逃避機構が働きにくく、効率よく殺細胞効果が発揮できる。各種の悪性腫瘍、ウイルス関連腫瘍の治療薬として有用である。
　悪性腫瘍治療薬の例としてはＳｕｒｖｉｖｉｎ，ＮＹ－ＥＳＯ－１，ＷＴ－１，ＭＡＧＥ３などの腫瘍抗原特異的ｒｅｊＴにＧＤ２－ＣＡＲ，ＨＥＲ２－ＣＡＲ，ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＣＡＲ，ＭＵＣ１－ＣＡＲ，ＣＤ１９－ＣＡＲなどを組み合わせることができる。
　ウイルス関連腫瘍治療薬の例としては、ＥＢウイルス関連腫瘍であるＥＢウイルス関連リンパ腫、上咽頭がんに対するＬＭＰ２特異的ｒｅｊＴにＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴもしくはＬＭＰ１特異的ｒｅｊＴにＬＭＰ２－ＣＡＲを組み合わせたＬＭＰ２－ＣＡＲ／ＬＭＰ１－ｒｅｊＴ，ＥＢウイルス陽性Ｂ細胞リンパ腫に対するＣＤ１９－ＣＡＲ／ＬＭＰ１－ｒｅｊＴ，ＣＤ１９－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴ，成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）に対するＴａｘ特異的ｒｅｊＴにＮＹ－ＥＳＯ－１－ＣＡＲを組み込んだＮＹ－ＥＳＯ－１／Ｔａｘ－ｒｅｊＴ，ＨＢＺ特異的ｒｅｊＴにＮＹ－ＥＳＯ－１－ＣＡＲを組み込んだＮＹ－ＥＳＯ－１／ＨＢＺ－ｒｅｊＴなどが挙げられる。
　また、生体内での耐久性に優れているとされるウイルス特異的ｒｅｊＴとＣＡＲとの組み合わせも有用である。例えばＬＭＰ２特異的ｒｅｊＴ、ＬＭＰ１特異的ｒｅｊＴ、ＣＭＶ特異的ｒｅｊＴ、アデノウイルス特異的ｒｅｊＴ、ＶＺＶ特異的ｒｅｊＴ、ＨＳＶ特異的ｒｅｊＴなどにＧＤ２－ＣＡＲ, ＨＥＲ２－ＣＡＲ，ＮＹ－ＥＳＯ－１－ＣＡＲ，ＭＵＣ１－ＣＡＲ，ＣＤ１９－ＣＡＲなどのＣＡＲを組み合わせる方法も有用である。
　本発明の免疫細胞治療薬は、特に限定されないが、好ましくは、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内投与することができ、より好ましくは、静脈内投与することができる。あるいは、患部に局所投与することもできる。
　本発明の医薬組成物は、本発明の方法によって製造したＴ－ｉＰＳ細胞を、公知の製剤学的方法により製剤化することにより調製することができる。例えば、カプセル剤、液剤、フィルムコーティング剤、懸濁剤、乳剤、注射剤（静脈注射剤、点滴注射剤等）、などとして、主に非経口的に使用することができる。
　これら製剤化においては、薬理学上許容される担体又は媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。また、前記疾患の治療又は予防に用いられる公知の医薬組成物や免疫賦活剤等と併用してもよい。
　本発明の医薬組成物を投与する場合、その投与量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品等）等に応じて、適宜選択される。
　以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１　ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）特異的ＣＴＬクローンよりセンダイウイルスベクターを用いてＴ－ｉＰＳ細胞の樹立。
１）健常人末梢血より末梢血単核球を分離後、抗原提示目的に樹状細胞を誘導した。７日後、誘導した樹状細胞にＨＰＶ抗原ペプチド（ＨＰＶ１６－Ｅ６，Ａ２４０２）を添加し１５分間ＣＯ2インキュベーターで培養後、末梢血単核球と共培養開始した。更に樹状細胞との共培養を繰り返し、約８～１０日後にＨＰＶ特異的ＣＴＬ検出のため、ＣＴＬをＭＨＣテトラマーで染色後、フローサイトメトリーにてテトラマー陽性率を確認した。ＨＰＶ特異的ＣＴＬを確認後、シングルセルソートもしくはテトラマー／ＰＥビーズセレクション後限界希釈法を行い、５０ＧｙのＸ線照射後のＰＢＭＣとＩＬ２、ＰＨＡを加えて刺激した。
２）約３～６週間後立ち上がったコロニーのテトラマー染色を行い、フローサイトメトリーでＣＴＬクローン樹立の確認をした。樹立確認後ＣＴＬクローンをＣＤ３／２８刺激後、以下のＡ）のベクターを用い遺伝子導入した。ｉＭａｔｒｉｘでコートした６ｗｅｌｌプレートに遺伝子導入後のＣＴＬを移動し、ＩＬ－２を加えたＣＴＬメディウムを培地としてＣＯ2インキュベーターで培養開始した。（図１）
　Ａ）ＳｅＶ４因子ベクター　＋　ＳＶ４０　ｌａｒｇｅ　Ｔ抗原
３）ＳｅＶ遺伝子導入翌日、ｉＰＳメディウム（ＳｔｅｍＦｉｔＡＫ０３Ｎ）を等量加え、その後は１日おきに半量ずつＳｔｅｍ　ＦｉｔＡＫ０３Ｎに置換した。
４）７日後にＴ－ｉＰＳ細胞のコロニーが観察でき、その後コロニーピックアップを行った。
実施例２　エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）特異的ＣＴＬクローンよりセンダイウイルスベクターを用いてＴ－ｉＰＳ細胞の樹立。
１）健常人末梢血より末梢血単核球を分離後、抗原提示目的に樹状細胞を誘導した。７日後、誘導した樹状細胞にＥＢＶ　ＬＭＰ２抗原ペプチド（Ａ２４０２）を添加し１５分間ＣＯ2インキュベーターで培養後、末梢血単核球と共培養開始した。更に樹状細胞との共培養を繰り返し、約８～１０日後にＬＭＰ２特異的ＣＴＬ検出のため、ＣＴＬをＭＨＣテトラマーで染色後、フローサイトメトリーにてテトラマー陽性率を確認した。ＬＭＰ２特異的ＣＴＬを確認後、シングルセルソートもしくはテトラマー／ＰＥビーズセレクション後限界希釈法を行い、５０ＧｙのＸ線照射後のＰＢＭＣとＩＬ２、ＰＨＡを加えて刺激した。
２）約３～６週間後立ち上がったクローンのテトラマー染色を行い、フローサイトメトリーでＬＭＰ２ＣＴＬクローン樹立の確認をした。樹立確認後ＬＭＰ２ＣＴＬクローンをＣＤ３／２８刺激後、センダイウイルスベクターを用い、ＭＯＩ１０で遺伝子導入した。ｉＭａｔｒｉｘでコートした６ｗｅｌｌプレートに遺伝子導入後のＣＴＬを移動し、ＩＬ－２を加えたＣＴＬメディウムを培地としてＣＯ2インキュベーターで培養開始した。
３）約２週間後にＬＭＰ２ＣＴＬ由来Ｔ－ｉＰＳコロニーが多数樹立でき、コロニーピックアップして拡大培養を行なった。その後レンチウイルス由来ＬＭＰ１－ＣＡＲベクターを感染させＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－Ｔ－ｉＰＳを作成後ＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴを分化誘導した。
４）分化誘導したＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴのＬＭＰ１－ＣＡＲ発現率は１００％と非常に高かった。
５）細胞傷害性試験、共培養試験を行うと効率よく腫瘍細胞を排除することができた。
　図２に末梢血から誘導したＬＭＰ２－ＣＴＬと樹立したＣＴＬクローンのテトラマー染色結果を示す。
　図３にｉＣ９－ＬＭＰ１－ＣＡＲ－Ｔ－ｉＰＳＣｓのベクターの構造を示す。
　図４にＬＭＰ１－ＣＡＲ－ＬＭＰ２－Ｔ－ｉＰＳのＬＭＰ１－ＣＡＲ発現率を示す。
　図５にＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴのＬＭＰ１－ＣＡＲ発現率を示す。
実施例３
（細胞傷害性試験）
１）ＥＢウイルス関連リンパ腫細胞株に対するＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴの細胞傷害性と末梢血由来ＬＭＰ１－ＣＡＲＴの細胞傷害性細胞傷害性を比較するために５１クロム放出試験を行った。エフェクターとしてＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴもしくは末梢血由来ＬＭＰ１－ＣＡＲＴ、クロムでラベルしたターゲットであるＨＬＡ一致ＥＢウイルス関連リンパ腫細胞株（節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫，鼻型；ＥＮＫＬ）、コントロールターゲットであるＨＬＡ不一致ＥＢウイルス感染腫瘍細胞株（ＬＣＬ）をエフェクター：ターゲット比を５：１と２．５：１で６時間共培養した。
２）共培養後培養上清を別のカウンター用のプレートに移し、乾燥後プレートリーダーで測定した。
３）ＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴはＨＬＡ一致のＥＢウイルス関連リンパ腫細胞株に対して強い抗原特異的細胞傷害性を示したが（７０－８０％）、コントロールのＨＬＡ不一致腫瘍細胞株に対しては１０％以下と細胞傷害性を示さなかった。末梢血由来ＬＭＰ１－ＣＡＲＴはＨＬＡ一致のＥＢウイルス関連リンパ腫細胞株に対して３０から５０％程度の細胞傷害性を示した。ＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴの細胞傷害性はＬＭＰ１－ＣＡＲＴより強力であった（図６）。
実施例４
（共培養試験）
１）ＥＢウイルス関連リンパ腫細胞株に対するＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴの細胞傷害性と末梢血由来ＬＭＰ１－ＣＡＲＴの細胞傷害性細胞傷害性を比較するために共培養試験を行った。エフェクターとしてＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴ、コントロールエフェクターとしてＥＢウイルスではなく他の抗原特異性を持つｒｅｊＴを用いた。ターゲットとしてＨＬＡ一致ＥＢウイルス関連リンパ腫細胞株（ＥＮＫＬ）を用いた。エフェクター：ターゲット比を５：１で９日間共培養した。
２）共培養後腫瘍細胞とＴ細胞の比率をＣＤ５６，ＣＤ３染色後フローサイトメトリーで解析した。
３）ＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴはＨＬＡ一致のＥＢウイルス関連リンパ腫細胞を９日目には排除したが、抗原特異性を持たないコントロールのｒｅｊＴでは腫瘍細胞を排除することができず、腫瘍の増殖を認めた（図７）。
実施例５
（抗がん効果）
　マウスモデルによるＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴとＬＭＰ２－ｒｅｊＴの生存率比較試験
　ＥＢウイルス関連リンパ腫細胞株（ＥＮＫＬ）を免疫不全マウスの腹腔内に移植後、ＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴ治療群、ＬＭＰ２－ｒｅｊＴ治療群、無治療コントロールの３群に分けたマウスの生存率を比較した。
　結果を図８に示す。
実施例６
（ＣＩＤ投与によるアポトーシス）
　ＬＭＰ１－ＣＡＲ／ＬＭＰ２－ｒｅｊＴにダイマライザーである低分子化合薬ＣＩＤを投与した４８時間後のＡｎｎｅｘｉｎ／７－ＡＡＤ陽性率を解析し、アポトーシスの割合を調べた。
　結果を図９に示す。

Claims (8)

  1. 　キメラ抗原受容体が導入された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞。
  2. 　抗原特異的細胞障害性Ｔ細胞の抗原が、ウイルス抗原又は腫瘍抗原である請求項１記載のｉＰＳ細胞。
  3. 　キメラ抗原受容体が、腫瘍表面抗原を認識するＣＡＲである請求項１又は２記載のｉＰＳ細胞。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項記載のｉＰＳ細胞を有効成分とする医薬。
  5. 　腫瘍抗原又はウイルス抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ及びＳＶ４０　ｌａｒｇｅ　Ｔ抗原の遺伝子を導入して抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）由来ｉＰＳ細胞を得（Ｔ－ｉＰＳＣ）、得られたＴ－ｉＰＳＣにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を導入して分化誘導することを特徴とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）由来のｉＰＳ細胞の製造法。
  6. 　がん又はウイルス感染疾患を治療するための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）由来のｉＰＳ細胞。
  7. 　がん又はウイルス感染疾患の治療薬製造のための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）由来のｉＰＳ細胞の使用。
  8. 　キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が導入された抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）由来のｉＰＳ細胞を、必要な患者に投与することを特徴とする、がん又はウイルス疾患の治療方法。
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