WO2020201603A2 - Pcr multiplex mejorada - Google Patents

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Anäis REDRUELLO ROMERO
Javier SALMERÓN ESCOBAR
Julián López-Viota Gallardo
Josefa LEÓN LÓPEZ
Sonia MORALES SANTANA
David López Pérez
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention is directed to an improved multiplex PCR method that allows eliminating the formation of primer polymers, allows increasing the number of different primers used in multiplex PCR, and even increasing their concentration and considerably decreasing the biases of amplification, allowing the number of PCR cycles to be increased and amplifications can be carried out on much smaller amounts of DNA.
  • multiplex PCR is widely used during the early stages of library manufacturing. Using multiplex PCR, a large number (can reach several hundred) of DNA molecules are simultaneously amplified for sequencing in different massive sequencing platforms.
  • the main drawback of multiplex PCR derives precisely from the simultaneous use of numerous primers at high concentrations (concentrations suitable for their operation in the PCR reaction).
  • the primers hybridize with each other and polymerize creating parasitic and unwanted DNA molecules that compete (for PCR resources) with the DNA molecules to be amplified.
  • the risk that the primers polymerize, as well as the intensity of the phenomenon, is all the higher the greater the number of different primers used.
  • “Parasitic” DNA molecules can increase in size with each PCR cycle.
  • a productive hybridization generates a parasitic molecule (primer dimer) with an unpublished 3 'end that in the next cycle (in a new productive hybridization) increases the size of the parasite molecule and produces a different 3' end.
  • the great variety of different sequences in the primers of a multiplex PCR favors the polymerization phenomenon. Furthermore, as PCR progresses, the concentration of amplicons (desired DNA molecules) increases. Primers and amplicons offer a wide variety of different sequences (at high concentration) that increase the probability of new productive hybridizations.
  • Primer polymerization in multiplex PCR has a strong stochastic component. It is mainly due to two reasons:
  • the present invention describes the use of at least one EGC (Expanded Genetic Codé) nucleotide in a PCR procedure to avoid the generation of unwanted parasitic DNA molecules.
  • EGC Exanded Genetic Codé
  • the proposed intervention on the 5 'end of the primer sequences can be used in isolation or in association with solutions to the polymerization of primers that are based on interventions on the 3' end of the primers.
  • the invention describes a method for performing multiplex PCR that does not generate unwanted parasitic DNA molecules that comprises incorporating at least one EGC (Expanded Genetic Code) nucleotide into the reaction.
  • EGC Extra Genetic Code
  • the present invention allows to considerably increase the efficiency of multiplex PCR:
  • PCR and amplifications can be performed on much smaller amounts of DNA.
  • FIG. 1 DESCRIPTION OF THE FIGURES Fig. 1.
  • Arrows represent oligonucleotides.
  • Small horizontal lines indicate hybridizations between homologous nucleotides from different strands.
  • the arrowheads represent the 3 'end of the oligonucleotide molecules.
  • A) Represents two examples of non-productive hybridization.
  • B) Represents two examples of productive hybridization.
  • Fig. 2 Image showing agarose gel electrophoresis of the result of three multiplex PCR replicates, carried out from 50 different primers for 30 cycles. The random component of the result (Random appearance of PCR artifacts) is highlighted. In addition, the performance offered is poor, only assumed with a large amount of initial DNA.
  • Fig. 3 Illustration of an example multiplex PCR of the invention, where the EGC nucleotides are incorporated.
  • A) represents an example of productive hybridization between primers that incorporate EGC nucleotides at their 5 'end.
  • B) represents the new molecule generated that will not have the possibility of generating more productive hybridizations.
  • Fig. 4. Multiplex PCR with no modifications in the primers compared to a multiplex PCR using the same primers modified at the 5 'end with two EGC nucleotides. DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • multiplex PCR Multiple Poiymerase Chain Reaction
  • primers The oligonucleotides used in the PCR reaction are called primers.
  • Multiplex PCR was first described in 1988 to detect deletions in the gene encoding dystrophin. Since then, multiplex PCR has had other applications, such as microsatellite analysis and genotyping of SNP (Single-Nucleotide Polymorphism) variants.
  • SNP Single-Nucleotide Polymorphism
  • DNA polymerase catalyzes the growth of DNA strands by incorporating (polymerizing) nucleotides on a complementary DNA strand and in an antiparallel orientation. Nucleotides (in triphosphate form) are incorporated releasing a pyrophosphate molecule.
  • DNA polymerase requires a previously hybridized 3 'end. During the PCR reaction, this end is initially given by the primers.
  • the primers can hybridize to each other and, if the hybridization involves some of the 3 'ends, this can be elongated by DNA polymerase, thus creating an unwanted parasitic molecule.
  • This molecule is called a primer dimer (first dimer in English).
  • productive hybridization refers to the type of hybridization between primers that allows the elongation of a 3 'end and the generation of an unwanted parasitic DNA molecule.
  • Hybridization of the 3 'end of an oligonucleotide on another oligonucleotide molecule usually involves very few bases, so it is greatly disadvantaged at the temperatures used in PCR. However, the elevated The concentration at which the primers are found compensates for the low probability of elongation.
  • the authors of the present invention have acted on the design of the 5 'end of the primers, completely preventing the molecules resulting from a productive hybridization from having new elongation cycles.
  • the present invention describes the use of at least one EGC (Expanded Genetic Code) nucleotide in a PCR procedure to avoid the generation of unwanted parasitic DNA molecules.
  • EGC Exanded Genetic Code
  • EGC Extra Genetic Codé
  • EGC Extra Genetic Codé
  • the PCR method in which at least one EGC nucleotide is used is multiplex PCR.
  • the natural genetic code is made up of 4 bases: adenine (A), thymine (T), cytosine (C) and guanine (G) that hybridize in two pairs (A-T and C-G).
  • EGC nucleotides are an extension of the natural genetic code. They are synthetic pairs of nucleotides that hybridize with each other but not with the natural nucleotides. EGC nucleotides are incorporated into the DNA structure and are recognized and incorporated by DNA polymerase.
  • the diagram in Fig. 3 illustrates an example of the invention.
  • the primers incorporate two EGC nucleotides at their 5 'end (in the example iso-C, 5-Methyl-lsocytosine).
  • the PCR is performed with the 4 natural nucleotide monomers (ATP, TTP, CTP and GTP triphosphate nucleotides) plus a fifth EGC monomer in its triphosphate form and complementary to the EGCs at the 5 'end of the primers (in the example iso-dGTP , 2-Hydroxy-2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate).
  • the foundation of the invention is based on the fact that, after a productive hybridization between two primers, a DNA molecule is generated with a new 3 'end formed by EGC nucleotides.
  • consecuense In consecuense:
  • the generated molecule will not be able to hybridize its 3 'end productively and will not have the ability to polymerize. • The generated molecule will not compete for PCR resources (it will not be a parasitic DNA molecule).
  • Another object of this invention is a method for carrying out PCR, preferably multiplex PCR, which does not generate unwanted parasitic DNA molecules and which comprises incorporating at least one EGC nucleotide into the reaction as previously described.
  • one or more EGC (Expanded Genetic Codé) nucleotides are incorporated into the reaction at the 5 'end of the sequence of the primers.
  • the optimal number of EGC nucleotides added at 5 ' is 2, although only one or more than 2 can be incorporated, so preferably, two EGC nucleotides are incorporated into the reaction.
  • Fig. 4 shows an example of using the innovation. Multiplex PCR with no modifications in the primers compared to a multiplex PCR using the same primers modified at the 5 'end with two EGC nucleotides.
  • the example shows the amplification of the TCR antigen receptor (T Cell Pqqbr ⁇ o ⁇ , for whose amplification it is necessary to add primers for each of the V segments.
  • TCR antigen receptor T Cell Pqqbr ⁇ o ⁇

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Abstract

Se describe un procedimiento que permite eliminar la formación de polímeros de cebadores, permite incrementar el número de cebadores diferentes utilizados en la PCR multiplex, e incluso, incrementar la concentración de los mismos y disminuye considerablemente los sesgos de amplificación, permitiendo incrementar el número de ciclos de PCR y se pueden realizar amplificaciones sobre cantidades de DNA mucho más reducidas.

Description

PCR MULTIPLEX MEJORADA
La presente invención está dirigida a un método de PCR multiplex mejorado que permite eliminar la formación de polímeros de cebadores, permite incrementar el número de cebadores diferentes utilizados en la PCR multiplex, e incluso, incrementar la concentración de los mismos y disminuye considerablemente los sesgos de amplificación, permitiendo incrementar el número de ciclos de PCR y se pueden realizar amplificaciones sobre cantidades de DNA mucho más reducidas.
ESTADO DEL ARTE
En la actualidad, debido al desarrollo de la secuenciación paralela masiva, la PCR multiplex es ampliamente utilizada durante las fases iniciales de la fabricación de librerías. Mediante PCR multiplex se amplifica simultáneamente un número elevado (puede llegar a varias centenas) de moléculas de DNA para su secuenciación en diferentes plataformas de secuenciación masiva.
El principal inconveniente de la PCR multiplex deriva precisamente de la utilización simultánea de numerosos cebadores a concentraciones elevadas (concentraciones adecuadas para su funcionamiento en la reacción de PCR). Los cebadores hibridan entre ellos y polimerizan creando moléculas de DNA parásitas y no deseadas que compiten (por los recursos de la PCR) con las moléculas de DNA que se desea amplificar. El riesgo de que polimericen los cebadores, así como la intensidad del fenómeno, es tanto más elevado cuanto mayor es el número de cebadores diferentes utilizados.
En resumen, la competencia con los polímeros de cebadores:
• Puede impedir la amplificación de la totalidad o de algunas de las moléculas de DNA deseadas.
• Puede introducir sesgos de amplificación (a veces muy grandes) que modifican la eficiencia con la que se amplifican las diferentes moléculas de DNA deseadas.
Las moléculas de DNA“parásitas” pueden incrementar su tamaño en cada ciclo de PCR.
Una hibridación productiva genera una molécula parásita (dímero de cebador) con un extremo 3’ inédito que en el siguiente ciclo (en una nueva hibridación productiva) incrementa el tamaño de la molécula parásita y produce un extremo 3’ diferente. La gran variedad de secuencias diferentes en los cebadores de una PCR multiplex favorece el fenómeno de polimerización. Además, conforme avanza la PCR, se incrementa la concentración de amplicones (moléculas de DNA deseadas). Cebadores y amplicones ofrecen una amplia variedad de secuencias diferentes (a elevada concentración) que incrementan la probabilidad de realizar nuevas hibridaciones productivas.
A su vez, la variedad de secuencias plantilla incrementa la variedad de extremos 3’ generados mediante hibridaciones productivas. A lo que hay que añadir las adeninas adicionales incorporadas al extremo 3’ por algunas DNA polimerasas (como la Taq polimerasa). Estas adeninas se añaden en una probabilidad variable.
Tras 20 o 30 ciclos de amplificación se pueden producir moléculas parásitas de DNA de varios miles de pares de bases.
La polimerización de cebadores en PCR multiplex tiene un fuerte componente estocástico. Es debido, principalmente, a dos razones:
1. La aparición de determinados eventos de baja probabilidad (estos eventos son las hibridaciones productivas iniciales) modifica la probabilidad de los eventos siguientes (grados de libertad) dependiendo de las secuencias en los nuevos extremos 3’ producidos.
2. Debido a la naturaleza de crecimiento logarítmico de la PCR, la repercusión de un evento depende del ciclo en el que aparezca. Cuanto antes aparezca el evento, más ciclos de crecimiento logarítmico tendrá para incrementar su efecto.
Soluciones técnicas a la polimerización de cebadores.
Se han diseñado varios métodos para minimizar el impacto de la polimerización de cebadores. Todos ellos se basan en intervenir sobre el extremo 3’ de las moléculas de cebadores:
• Mediante un cuidadoso diseño de las secuencias de los cebadores.
• Especialmente, mediante modificaciones químicas del extremo 3’ de las moléculas de cebadores que disminuyen la probabilidad de un evento de hibridación productiva entre cebadores.
Se ha conseguido minimizar considerablemente el impacto de la polimerización de cebadores y, en consecuencia, incrementar el número de cebadores diferentes que pueden incluirse en la PCR multiplex. Sin embargo, las soluciones técnicas no son infalibles. La reducción de la probabilidad de un evento de hibridación productiva entre cebadores no impide que este se produzca. Y, cuando este evento aparece, se produce una molécula parásita de DNA con un nuevo extremo 3’ sin modificaciones químicas. Nuevamente, existe un fuerte componente estocástico. Cuanto antes aparezca el evento de hibridación productiva inicial, más repercusión tendrá.
Como se ha indicado, los métodos actuales han conseguido incrementar el número de cebadores empleados en la PCR multiplex, pero para minimizar el riesgo de polimerización (aleatoria) de cebadores se recomiendan cantidades elevadas de DNA inicial y un número reducido de ciclos (habitualmente no más de 15 ciclos). Estas recomendaciones disminuyen la eficiencia de la PCR multiplex.
Sería, por tanto, deseable impedir completamente que las moléculas resultantes de una hibridación productiva tengan nuevos ciclos de elongación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención describe el uso de al menos un nucleótido EGC ( Expanded Genetic Codé) en un procedimiento PCR para evitar la generación de moléculas de DNA parásita no deseadas.
La intervención propuesta sobre el extremo 5’ de las secuencias de cebadores puede ser utilizada de forma aislada o en asociación con las soluciones a la polimerización de cebadores que se basan en intervenciones sobre el extremo 3’ de los cebadores.
En un segundo aspecto, la invención describe un método para realizar PCR multiplex que no genere moléculas de DNA parásita no deseadas que comprende incorporar a la reacción al menos un nucleótido EGC ( Expanded Genetic Codé).
En combinación con las técnicas que disminuyen la probabilidad de hibridación efectiva de cebadores, la presente invención permite incrementar considerablemente la eficiencia de la PCR multiplex:
• Elimina completamente la formación de polímeros de cebadores (más allá de una dimerización inicial de baja probabilidad).
Reduce considerablemente el componente estocástico de la PCR multiplex. • Permite incrementar el número de cebadores diferentes utilizados en la PCR multiplex, e incluso, incrementar la concentración de los mismos.
• Disminuye considerablemente los sesgos de amplificación.
• Permite focalizar los recursos de la PCR en la amplificación de las moléculas de DNA deseadas. En consecuencia, se puede incrementar el número de ciclos de
PCR y se pueden realizar amplificaciones sobre cantidades de DNA mucho más reducidas.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1. Esquema que ilustra la hibridación entre cebadores durante una PCR. Las flechas representan los oligonucleótidos. Las pequeñas líneas horizontales indican hibridaciones entre nucleótidos homólogos de hebras diferentes. La punta de las flechas representa el extremo 3’ de las moléculas de oligonucleótidos. A) Representa dos ejemplos de hibridación no productiva. B) Representa dos ejemplos de hibridación productiva.
Fig. 2. Imagen que muestra una electroforesis en gel de agarosa del resultado de tres réplicas de PCR multiplex, realizadas a partir de 50 cebadores diferentes durante 30 ciclos. Se destaca el componente aleatorio del resultado (Aparición aleatoria de artefactos PCR). Además, el rendimiento ofrecido es escaso, sólo asumióle con una gran cantidad de ADN inicial.
Fig. 3. Ilustración de una PCR multiplex ejemplo de la invención, donde se incorporan los nucleótidos EGC. A) representa un ejemplo de hibridación productiva entre cebadores que incorporan nucleótidos EGC en su extremo 5’. B) representa la nueva molécula generada que no tendrá posibilidad de generar más hibridaciones productivas. Fig. 4. PCR multiplex sin modificaciones en los cebadores comparada con una PCR multiplex que utiliza los mismos cebadores modificados en el extremo 5’ con dos nucleótidos EGC. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Definiciones
El término PCR multiplex ( Multiplex Poiymerase Chain Reaction en inglés) se refiere al uso de la PCR para la amplificación simultánea y específica de varias moléculas de DNA. La principal diferencia entre la PCR clásica y la PCR multiplex es que la primera utiliza dos oligonucleótidos diferentes, mientras que la segunda utiliza más de dos. Los oligonucleótidos usados en la reacción de PCR se denominan cebadores ( primers en inglés).
La PCR multiplex se describió por primera vez en 1988 para detectar delecciones en el gen codificante de la distrofina. Desde entonces, la PCR multiplex ha tenido otras aplicaciones, como el análisis de microsatélites y el genotipado de variantes SNP ( Single-Nucleotide Polymorphism en inglés).
Conceptos básicos de la reacción catalizada por las DNA polimerasas:
• La DNA polimerasa cataliza el crecimiento de hebras de DNA incorporando (polimerizando) nucleótidos sobre una hebra de DNA complementaria y en orientación antiparalela. Los nucleótidos (en forma trifosfato) se incorporan liberando una molécula de pirofosfato.
• El crecimiento de una molécula de DNA se realiza en dirección 5’ 3’.
• La DNA polimerasa requiere de un extremo 3’ previamente hibridado. Durante la reacción de PCR, este extremo es otorgado inicialmente por los cebadores.
Los cebadores pueden hibridar entre ellos y, si la hibridación implica algunos de los extremos 3’, este puede ser elongado mediante la DNA polimerasa, creando de esta forma una molécula parásita no deseada. Esta molécula es denominada dímero de cebador (primer di mer en inglés).
El término“hibridación productiva" alude al tipo de hibridación entre cebadores que permite la elongación de un extremo 3’ y la generación de una molécula de DNA parásita no deseada.
La hibridación del extremo 3’ de un oligonucleótido sobre otra molécula de oligonucleótido implica habitualmente muy pocas bases, por lo que está muy desfavorecida a las temperaturas utilizadas en PCR. Sin embargo, la elevada concentración a la que se encuentran los cebadores compensa la baja probabilidad de elongación.
Los autores de la presente invención han actuado sobre el diseño del extremo 5’ de los cebadores, impidiendo completamente que las moléculas resultantes de una hibridación productiva tengan nuevos ciclos de elongación.
Así, en su aspecto más general, la presente invención describe el uso de al menos un nucleótido EGC ( Expanded Genetic Codé) en un procedimiento PCR para evitar la generación de moléculas de DNA parásita no deseadas.
En particular, propone incorporar uno o más nucleótidos EGC ( Expanded Genetic Codé) en el extremo 5’ de la secuencia de los cebadores. El número óptimo de nucleótidos EGC añadidos en 5’ es de 2, aunque pueden incorporarse sólo uno o más de 2.
De forma preferente, se incorporan dos nucleótidos EGC ( Expanded Genetic Codé).
De forma preferente, el procedimiento PCR en el que se usa al menos un nucleótido EGC, es PCR multiplex.
El código genético natural está formado por 4 bases: adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G) que hibridan en dos parejas (A-T y C-G). Los nucleótidos EGC suponen una extensión del código genético natural. Son parejas sintéticas de nucleótidos que hibridan entre ellos pero no con los nucleótidos naturales. Los nucleótidos EGC se incorporan en la estructura del DNA y son reconocidos e incorporados por la DNA polimerasa.
El esquema de la Fig. 3 ilustra un ejemplo de la invención. Los cebadores incorporan en su extremo 5’ dos nucleótidos EGC (en el ejemplo iso-C, 5-Methyl-lsocytosine). La PCR es realizada con los 4 monómeros naturales de nucleótidos (nucleótidos trifosfato ATP, TTP, CTP y GTP) más un quinto monómero EGC en su forma trifosfato y complementario de los EGC del extremo 5’ de los cebadores (en el ejemplo iso-dGTP, 2-Hydroxy-2’-deoxyadenosine-5’-triphosphate).
El fundamento de la invención se basa en que, tras una hibridación productiva entre dos cebadores, se genera una molécula de DNA con un nuevo extremo 3’ formado por nucleótidos EGC. En consecuencia:
• La molécula generada no podrá hibridar su extremo 3’ de forma productiva y no tendrá capacidad de polimerización. • La molécula generada no competirá por los recursos de la PCR (no será una molécula de DNA parásita).
También es objeto de esta invención un método para realizar PCR, preferentemente PCR multiplex, que no genere moléculas de DNA parásita no deseadas y que comprende incorporar a la reacción al menos un nucleótido EGC tal y como se ha descrito previamente.
En una realización particular, se incorporan a la reacción uno o más nucleótidos EGC ( Expanded Genetic Codé) en el extremo 5’ de la secuencia de los cebadores.
El número óptimo de nucleótidos EGC añadidos en 5’ es de 2, aunque pueden incorporarse sólo uno o más de 2, por lo que de forma preferente, se incorporan dos nucleótidos EGC a la reacción.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
La Fig. 4 muestra un ejemplo de utilización de la innovación. PCR multiplex sin modificaciones en los cebadores comparada con una PCR multiplex que utiliza los mismos cebadores modificados en el extremo 5’ con dos nucleótidos EGC. El ejemplo muestra la amplificación del receptor de antígeno TCR ( T Cell Pqqbrίoή para cuya amplificación es necesario añadir cebadores para cada uno de los segmentos V. Como se observa, la invención permite focalizar los recursos de la PCR sobre la amplificación de la molécula de DNA deseada.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Uso de al menos un nucleótido EGC ( Expanded Genetic Codé) en un procedimiento PCR para evitar la generación de moléculas de DNA parásita no deseadas.
2.- El uso según la reivindicación anterior donde el al menos un nucleótido EGC
( Expanded Genetic Codé) se incorpora en el extremo 5’ de la secuencia de los cebadores.
3.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde se incorporan dos nucleótidos EGC (Expanded Genetic Codé).
4 - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la PCR es una PCR multiplex.
5.- Un método para realizar PCR multiplex que no genere moléculas de DNA parásita no deseadas que comprende incorporar a la reacción al menos un nucleótido EGC ( Expanded Genetic Codé) según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
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