WO2020190071A1 - 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention comprises (a) afatinib (Afatinib) and (b) isolated NK (Natural killer) cells, cytokines promoting NK cells in the body, or a combination thereof, a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer And its use.
  • Cancer is one of the most fatal diseases in the world at present, and cancer incidence is expected to increase further as the age of cancer is gradually decreasing while the average lifespan is gradually extending.
  • Anticancer chemotherapy is a representative cancer treatment method, but it has a low target for cancer cells as it can damage not only cancer cells but also rapidly dividing and proliferating cells among normal cells.After chemotherapy, the number of anemia, white blood cells, and platelets decreases. , Vomiting, nausea, and diarrhea may occur.
  • afatinib and (b) isolated NK cells, cytokines that promote NK cells in the body, or combinations thereof
  • the present invention by confirming that the effect is significantly increased synergistically and that afatinib increases the expression of a ligand for NKG2D, an activating receptor important for anticancer activity of NK cells in cancer cells, thereby increasing the sensitivity of cancer cells to NK cells.
  • afatinib increases the expression of a ligand for NKG2D, an activating receptor important for anticancer activity of NK cells in cancer cells, thereby increasing the sensitivity of cancer cells to NK cells.
  • Patent Document 1 Korean Patent Publication No. 10-2015-0135796
  • An object of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising (a) afatinib and (b) isolated NK (Natural killer) cells, cytokines promoting NK cells in the body, or a combination thereof To provide.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for enhancing the sensitivity of cancer cells to NK cells, including afatinib.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for enhancing the binding of cancer cells and NK cells, including afatinib.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for preventing or treating cancer, comprising the pharmaceutical composition.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer, comprising administering the pharmaceutical composition to an individual.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object is (a) afatinib (Afatinib); And (b) isolated NK (Natural killer) cells, cytokines that promote NK cells in the body, or a combination thereof, to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • afatinib Afatinib
  • isolated NK Natural killer cells, cytokines that promote NK cells in the body, or a combination thereof, to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • Afatinib used in the present invention is a compound having the formula shown in Fig. 1 and is used as an anticancer agent.
  • the present inventors have identified for the first time that afatinib increases the expression of a ligand for NKG2D, an activating receptor important for anticancer activity of NK cells in cancer cells, thereby increasing the sensitivity of cancer cells to NK cells.
  • the present inventors have identified for the first time that the anticancer effect synergistically increases or decreases when the combination treatment of (a) afatinib and (b) isolated NK cells, cytokines that promote NK cells in the body, or a combination thereof I did.
  • the pharmaceutical composition of the present invention not only exhibits an anticancer effect by combining the cancer cell killing ability of afatinib and the cancer cell killing ability of NK cells, but also afatinib to increase the sensitivity of cancer cells to NK cells to NK It was found for the first time that the anticancer effect was significantly increased synergistically by remarkably increasing the killing capacity of cells.
  • composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable salt of afatinib instead of or with afatinib.
  • pharmaceutically acceptable means exhibiting properties that are not toxic to cells or humans exposed to the composition.
  • pharmaceutically acceptable salt refers to a salt in a form that can be used pharmaceutically among salts in which a cation and anion are bound by electrostatic attraction.
  • a metal salt or an organic base Salts salts with inorganic acids, salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like.
  • the metal salt may be an alkali metal salt (sodium salt, potassium salt, etc.), alkaline earth metal salt (calcium salt, magnesium salt, barium salt, etc.), aluminum salt, and the like;
  • Salts with organic bases include triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N,N-dibenzylethylenediamine May be salts with the like;
  • Salts with inorganic acids may be salts of hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like;
  • Salts with organic acids may be salts of formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, methanesulfonic acid, benzenes
  • composition of the present invention includes not only a pharmaceutically acceptable salt of afatinib, but also all possible solvates and hydrates that may be prepared therefrom, and may include all possible stereoisomers.
  • solvates, hydrates, and stereoisomers of afatinib can be prepared using conventional methods.
  • NK cells Natural killer cells
  • cytotoxic lymphocytes that play an important role in the body's immune system.
  • the NK cells may be isolated NK cells administered from outside the individual, but are not limited thereto.
  • NK cells can be obtained by conventional methods such as purchasing commercially available ones, separating them from individuals, or culturing them.
  • cytokine as used in the present invention is a protein secreted by immune cells, which controls and stimulates the body's defense system. In addition, it is known that cytokines can promote NK cells in the body (Oncotarget, 2017, 8(2), 2731-2744; Curr Opin Immunol., 2016, 44, 1-6 ).
  • the cytokine is not limited as long as it can promote NK cells in the body, but specifically IL (Interleukin)-2, IL-15, IL-21, M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), or a combination thereof. have.
  • IL Interleukin
  • IL-15 IL-15
  • IL-21 IL-21
  • M-CSF macrophage colony-stimulating factor
  • cytokines capable of promoting NK cells in the body are administered in combination with afatinib, thereby obtaining the effect of co-administration of afatinib and NK cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can increase the expression of ligands for NK cell activation receptors in cancer cells.
  • the activating receptor is a receptor related to NK cell activation and cytotoxicity, and may be specifically NKG2D, but is not limited thereto.
  • the ligand is not limited as long as it can bind to the activation receptor of NK cells, but may specifically be ULBP (UL16 binding protein) 1, ULBP2 or ULBP3.
  • afatinib and (b) isolated NK cells, cytokines that promote NK cells in the body, or a combination thereof may be administered simultaneously, sequentially, or in reverse order.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays cancer disease by administration of the pharmaceutical composition.
  • treatment refers to all actions in which symptoms of cancer disease are improved or cured by administration of the pharmaceutical composition.
  • the cancer is liver cancer, lung cancer, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or intraocular melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, gastric cancer, muscle cancer of the anus, colon cancer, breast cancer, fallopian tube Carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate Cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system (CNS) tumor, primary central nervous system lymphoma, spinal cord tumor, brain stem glioma, pituitary gland It may be a ship type, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions, and the carrier is a non-naturally occurring carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier excipient or diluent commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions
  • the carrier is a non-naturally occurring carrier.
  • the pharmaceutical compositions are formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions according to a conventional method, respectively.
  • the carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and these solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, or lactose. It is prepared by mixing (lactose) and gelatin.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used.
  • injectable ester such as ethyl oleate
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like may be used.
  • Another aspect of the present invention provides a composition for enhancing the sensitivity of cancer cells to NK cells, including afatinib.
  • afatinib NK cells and cancer are as described above.
  • enhancing sensitivity to NK cells refers to increasing the expression of ligands for activating receptors (eg, NKG2D), which are important for anticancer activity of NK cells, in cancer cells so that cytotoxicity of NK cells can be activated. It may mean to let, but is not limited thereto.
  • ligands for activating receptors eg, NKG2D
  • the ligand is not limited as long as it can bind to the activation receptor of NK cells, but may specifically be ULBP (UL16 binding protein) 1, ULBP2 or ULBP3.
  • sensitivity is used interchangeably with “sensitivity”.
  • Another aspect of the present invention provides a composition for enhancing the binding of cancer cells and NK cells, including afatinib.
  • afatinib NK cells and cancer are as described above.
  • enhancing the binding of cancer cells and NK cells means to enhance the binding of cancer cells and NK cells so that NK cells can exhibit cytotoxicity to cancer cells.
  • Another aspect of the present invention provides a kit for preventing or treating cancer, comprising the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition, cancer, prevention and treatment are as described above.
  • the type of the kit of the present invention is not particularly limited, and a kit of a type commonly used in the art may be used.
  • the kit of the present invention comprises (a) afatinib and (b) isolated NK cells, cytokines that promote NK cells in the body, or a combination thereof, each contained in a separate container, or divided into one or more compartments. It may be packaged in a form contained in a container, and the (a) component and (b) component may each be packaged in a unit dosage form of a single dose, but are not limited thereto.
  • components (a) and (b) in the kit may be separately administered in combination at an appropriate time depending on the health condition of the subject to be administered.
  • (a) component and (b) component may be administered in combination to an individual in simultaneous, sequential, or reverse order.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering the pharmaceutical composition to an individual.
  • the pharmaceutical composition, cancer, prevention and treatment are as described above.
  • the term "individual” refers to all animals such as mice, mice, livestock, including humans who have or may develop cancer. Specifically, it may be a mammal including a human, but is not limited thereto. In addition, in the present invention, the individual may be excluded from humans, but is not limited thereto.
  • administration means introducing a predetermined substance to a subject in an appropriate manner.
  • afatinib and (b) isolated NK cells, cytokines that promote NK cells in the body, or a combination thereof are simultaneously, sequentially, or reversely administered to an individual. It can be administered in combination.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent, and may be administered single or multiple. It is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the route of administration and the mode of administration for administering the composition of the present invention are not particularly limited, and any route and mode of administration may be followed as long as the composition comprising the composition can reach the desired site.
  • the composition may be administered through various routes of oral or parenteral, and non-limiting examples of the route of administration include oral, rectal, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdermal, non- And those administered through intralateral or inhalation.
  • cancer prevention or treatment method of the present invention may be used in combination with surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and methods using biological response modifiers.
  • Afatinib increases the sensitivity of cancer cells to NK cells, thereby increasing the cytotoxicity of NK cells to cancer cells
  • the composition of the present invention comprises (a) afatinib and (b) isolated NK cells, NK cells in the body.
  • a synergistic effect in which the anticancer effect is greatly increased is exhibited by the combination treatment of cytokines that promote cells or a combination thereof.
  • 1 is a diagram showing the structure of afatinib.
  • Figure 2 is a diagram showing that when NK cells and afatinib are co-treated, cytotoxicity to hepatic cancer cells (HepG2) is very significantly increased.
  • FIG. 3 is a diagram showing that when NK cells and afatinib are co-treated, cytotoxicity to lung cancer cells (A549) and pancreatic cancer cells (PC1) is greatly increased.
  • FIG. 4 is a diagram showing that the expression levels of ULBP1, ULBP2, and ULBP3, which are important factors for activation and cytotoxicity of NK cells in liver cancer cells, are increased by afatinib.
  • FIG. 5 is a diagram showing a mechanism of increasing anticancer activity by a combination treatment of afatinib and NK cells.
  • Example 1 Analysis of anticancer effect by combination treatment of isolated NK cells and afatinib
  • cytotoxicity of the isolated NK cells and the combined treatment of afatinib was analyzed. Specifically, 0.1 ⁇ M afatinib was treated on 5x10 4 HepG2 hepatic cancer cells per well of a 96 well plate, cultured for 2 days, and then the number of cells was counted. After treatment with 0.5:1 and 1:1 (number of NK cells: number of HepG2 cells), they were further cultured for 4 hours. Thereafter, cytotoxicity was measured by performing MTT assay on liver cancer cells.
  • NK cells and afatinib significantly increased the anticancer effect compared to the treatment of NK cells alone, IL-2 and IL-15, which increase NK cells or NK cells in the body.
  • IL-21, M-CSF, and other cytokines (cytokine) and afatinib treatment in combination with NK cells or afatinib alone treatment showed a very excellent anti-cancer effect.
  • Example 2 Analysis of the effect of combined treatment of NK cells and afatinib on various cancers
  • cytotoxicity of the combination treatment of NK cells and afatinib on various cancers was analyzed. Specifically, 5 ⁇ M afatinib was treated with 5x10 4 lung cancer cell lines per well of 96 well plate (A549) or 5x10 4 pancreatic cancer cell lines per well of 96 well plate (PC1) and cultured for 2 days, and then the number of cells was Counting, NK cells isolated from human blood were treated with cancer cells 1:1 on the surviving cancer cells, and then further cultured. Then, the cytotoxicity was measured by performing MTT assay on each cancer cell.
  • afatinib when afatinib is co-treated with cytokines such as IL-2, IL-15, IL-21, and M-CSF, which increase NK cells or NK cells in the body, a very excellent anticancer effect is obtained against various cancers. I could see that it was represented.
  • cytokines such as IL-2, IL-15, IL-21, and M-CSF
  • afatinib was treated with HepG2 hepatocellular carcinoma cells
  • the expression levels of ULBP1, ULBP2, and ULBP3, which are important factors for NK cell activation and cytotoxicity in hepatocellular carcinoma cells were measured using a real time PCR method.
  • the measurement method is as follows. First, HepG2 cells are treated with afatinib (1 ⁇ M) and then cultured for 1 or 2 days. Thereafter, total RNA was extracted using Trizol, cDNA was synthesized, and then real time PCR, a quantitative analysis using PCR probes specific to ULPB1, 2, and 3, was performed to measure the amount of ULBP1, ULBP2, and ULBP3. . Each of the measured expression levels was shown relative to the case where afatinib was not treated.
  • afatinib increased the expression of ligands (ULBP1, ULBP2, ULBP3) for NKG2D, an activating receptor important for anticancer activity of NK cells.
  • ligands ULBP1, ULBP2, ULBP3
  • cancer cells are susceptible to NK cells due to the increased ligand. It can be seen that the increase (Fig. 5).
  • the cytotoxicity of NK cells to cancer cells is increased, and the anticancer effect is significantly increased synergistically by the combination treatment of afatinib and NK cells. I could see that.

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Abstract

본 발명은 (a) 아파티닙 및 (b) 분리된 NK(Natural killer) 세포, 체내 NK 세포를 촉진하는 사이토카인, 또는 이들의 조합을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약적적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 아파티닙이 암세포의 NK 세포에 대한 감수성을 증가시켜, NK 세포의 암세포에 대한 세포독성이 증가하는 바, 본 발명의 조성물은 (a) 아파티닙과 (b) NK 세포, 체내 NK 세포를 촉진하는 사이토카인, 또는 이들의 조합의 병용 처리에 의해 항암 효과가 크게 증가하는 시너지 효과가 나타난다.

Description

암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 이의 용도
본 발명은 (a) 아파티닙(Afatinib) 및 (b) 분리된 NK(Natural killer) 세포, 체내 NK 세포를 촉진하는 사이토카인, 또는 이들의 조합을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
암은 현재 전세계적으로 가장 많은 사망자를 내는 질병 중 하나로서, 암 발생 연령은 점차 낮아지고 있는 반면 평균 수명은 점차 연장되어가고 있어 암 발생률은 더욱 증가할 것으로 전망되고 있다.
대표적인 암 치료 방법으로는 항암화학요법이 있으나, 이는 암세포뿐만 아니라 정상세포 중 빠르게 분열증식하는 세포에도 손상을 가할 수 있어 암세포에 대한 표적성이 낮고, 항암화학요법 후 빈혈, 백혈구 및 혈소판 수의 감소, 구토, 오심, 및 설사 등의 부작용이 발생할 수 있다.
따라서, 보다 적은 양으로도 항암 효과가 뛰어난 화학치료제에 대한 필요성이 대두되고 있다.
본 발명자들은 보다 항암 효과가 뛰어난 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, (a) 아파티닙 및 (b) 분리된 NK 세포, 체내 NK 세포를 촉진하는 사이토카인, 또는 이들의 조합의 병용 처리시 항암 효과가 시너지적으로 크게 증가하고, 아파티닙이 암세포에서 NK 세포의 항암활성에 중요한 활성화 수용체인 NKG2D에 대한 리간드의 발현을 증가시켜, 암세포의 NK 세포에 대한 감수성을 증가시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
(특허문헌1)한국 공개 특허 제10-2015-0135796호
본 발명의 목적은 (a) 아파티닙 및 (b) 분리된 NK(Natural killer) 세포, 체내 NK 세포를 촉진하는 사이토카인, 또는 이들의 조합을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 아파티닙을 포함하는, 암세포의 NK 세포에 대한 민감성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 아파티닙을 포함하는, 암세포 및 NK 세포의 결합 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약제학적 조성물을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 (a) 아파티닙(Afatinib); 및 (b) 분리된 NK(Natural killer) 세포, 체내 NK 세포를 촉진하는 사이토카인, 또는 이들의 조합을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "아파티닙(Afatinib)"은 도 1에 나타낸 화학식을 가지는 화합물로서, 항암제로서 사용된다. 그러나, 본 발명자들은 아파티닙이 암세포에서 NK 세포의 항암활성에 중요한 활성화 수용체인 NKG2D에 대한 리간드의 발현을 증가시켜, 암세포의 NK 세포에 대한 감수성을 증가시킴을 처음으로 규명하였다. 또한, 본 발명자들은 (a) 아파티닙 및 (b) 분리된 NK 세포, 체내 NK 세포를 촉진하는 사이토카인, 또는 이들의 조합의 병용 처리시 항암 효과가 시너지적으로 크게 증감함을 처음으로 규명하였다. 특히, 본 발명의 약제학적 조성물은 아파티닙의 암세포 살상능력과 NK 세포의 암세포 살상능력이 병합되어 항암 효과가 나타나는 것뿐만 아니라, 아파티닙이 암세포의 NK 세포에 대한 민 감성을 증진시켜 NK 세포의 살상능력을 현저히 증가시킴으로써 항암 효과가 시너지적으로 크게 증가함을 처음으로 규명하였다.
본 발명의 조성물은 아파티닙 대신 또는 아파티닙과 함께 아파티닙의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하는데, 통상적으로 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기 염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다.
본 발명의 조성물은 아파티닙의 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물 및 수화물을 모두 포함하고, 가능한 모든 입체이성체도 포함할 수 있다. 또한 상기 아파티닙의 용매화물, 수화물 및 입체이성체는 통상적인 방법들을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "NK(Natural killer) 세포"는 체내 면역 시스템에 중요한 역할을 하는 세포독성 림프구(cytotoxic lymphocyte)를 의미한다. 본 발명의 목적상 NK 세포는 개체 외부에서 투여되는 분리된 NK 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, NK 세포는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 개체로부터 분리하거나, 배양하는 등의 통상적적인 방법에 따라 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "사이토카인(Cytokine)"은 면역 세포가 분비하는 단백질로서, 체내의 방어체계를 제어하고 자극한다. 또한, 사이토카인은 체내 NK 세포를 촉진할 수 있는 것으로 알려져 있다(Oncotarget,　2017, 8(2), 2731-2744; Curr Opin Immunol.,　2016, 44, 1-6　).
상기 사이토카인은 체내 NK 세포를 촉진할 수 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로 IL(Interleukin)-2, IL-15, IL-21, M-CSF(macrophage colony-stimulating factor) 또는 이들의 조합일 수 있다. 본 발명에서 분리된 NK 세포 대신 체내 NK 세포를 촉진할 수 있는 사이토카인을 아파티닙과 병용 투여하여, 아파티닙과 NK 세포의 병용 투여 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 암세포에서 NK 세포의 활성화 수용체에 대한 리간드의 발현을 증가시킬 수 있다. 상기 활성화 수용체는 NK 세포의 활성화 및 세포독성과 관련된 수용체로서, 구체적으로 NKG2D일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 리간드는 NK 세포의 활성화 수용체와 결합할 수 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로 ULBP(UL16 binding protein)1,ULBP2 또는 ULBP3일 수 있다.
본 발명의 목적상 (a) 아파티닙과 (b) 분리된 NK 세포, 체내 NK 세포를 촉진하는 사이토카인, 또는 이들의 조합은 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 약학적 조성물의 투여로 암 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 약학적 조성물의 투여로 암 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
상기 암은 간암, 폐암, 췌장암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 약제학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 아파티닙을 포함하는, 암세포의 NK 세포에 대한 민감성 증진용 조성물을 제공한다.
상기 아파티닙, NK 세포 및 암은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 사용되는 용어 "NK 세포에 대한 민감성 증진"이란 암세포의 민감성을 증진시키는 것을 의미한다. 구체적으로, "NK 세포에 대한 민감성 증진"이란 암세포에 대한 NK 세포의 세포독성을 활성화시킬 수 있도록, NK 세포의 항암활성에 중요한 활성화 수용체(예들 들어, NKG2D)에 대한 리간드의 발현을 암세포에서 증가시키는 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 리간드는 NK 세포의 활성화 수용체와 결합할 수 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로 ULBP(UL16 binding protein)1,ULBP2 또는 ULBP3일 수 있다.
본 발명에서 "민감성"은 "감수성"과 혼용된다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 아파티닙을 포함하는, 암세포 및 NK 세포의 결합 증진용 조성물을 제공한다.
상기 아파티닙, NK 세포 및 암은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 사용되는 용어 "암세포 및 NK 세포의 결합 증진"이란 암세포에 대해 NK 세포가 세포독성을 나타낼 수 있도록, 암세포와 NK 세포의 결합을 증진시키는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 약제학적 조성물을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
상기 약제학적 조성물, 암, 예방 및 치료는 전술한 바와 같다.
본 발명의 키트는 그 종류가 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 형태의 키트를 사용할 수 있다.
본 발명의 키트는 (a) 아파티닙 및 (b) 분리된 NK 세포, 체내 NK 세포를 촉진하는 사이토카인, 또는 이들의 조합이 각각 개별 용기에 담긴 형태, 또는 하나 이상의 구획으로 나누어진 한 개의 용기 내에 담긴 형태로 포장되어 있을 수 있으며, 상기 (a) 성분 및 (b) 성분은 각각 1회 투여 용량의 단위 용량 형태로 포장되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 키트 내의 (a) 성분 및 (b) 성분은 투여 대상 개체의 건강 상태 등에 따라 적절한 시기에 개별적으로 병용 투여될 수 있다. 또한, (a) 성분 및 (b) 성분은 동시, 순차적, 또는 역순으로 개체에게 병용 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 약제학적 조성물, 암, 예방 및 치료는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "개체"란, 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적으로 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에서 개체는 인간이 제외될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 약제학적 조성물을 이용하여 (a) 아파티닙 및 (b) 분리된 NK 세포, 체내 NK 세포를 촉진하는 사이토카인, 또는 이들의 조합이 동시, 순차적, 또는 역순으로 개체에게 병용 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물을 투여하는 투여 경로 및 투여 방식은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 해당 부위에 상기 조성물을 포함하는 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그 투여 경로의 비제한적인 예로는, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내 또는 흡입 등을 통하여 투여되는 것을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 암 예방 또는 치료 방법은 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용될 수 있다.
아파티닙이 암세포의 NK 세포에 대한 감수성을 증가시켜, NK 세포의 암세포에 대한 세포독성이 증가하는바, 본 발명의 조성물은 (a) 아파티닙과 (b) 분리된 NK 세포, 체내 NK 세포를 촉진하는 사이토카인, 또는 이들의 조합의 병용 처리에 의해 항암 효과가 크게 증가하는 시너지 효과가 나타난다.
도 1은 아파티닙(Afatinib)의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 NK 세포와 아파티닙을 병용 처리한 경우 간암세포(HepG2)에 대한 세포독성이 매우 크게 증가하는 것을 보여주는 도이다.
도 3은 NK 세포와 아파티닙을 병용 처리한 경우 폐암세포(A549) 및 췌장암세포(PC1)에 대한 세포독성이 매우 크게 증가하는 것을 보여주는 도이다.
도 4는 아파티닙에 의해 간암세포에서 NK 세포의 활성화 및 세포독성에 있어 중요한 인자들인 ULBP1, ULBP2, ULBP3의 발현량이 증가하는 것을 보여주는 도이다.
도 5는 아파티닙과 NK 세포의 병용 처리에 의해 항암 활성이 증가하는 기작을 보여주는 도이다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 분리된 NK 세포와 아파티닙의 병용 처리에 의한 항암 효과 분석
NK 세포와 아파티닙의 병용 처리에 의한 항암 효과를 확인하기 위해, 분리된 NK 세포와 아파티닙의 병용 처리에 따른 암세포에 대한 세포독성을 분석하였다. 구체적으로, 0.1 μM 아파티닙을 96 well plate의 well당 5x10 4개의 HepG2 간암세포에 처리하여 2일 동안 배양한 후 세포수를 계수하여, 살아 남은 HepG2 간암세포에 인간 혈액에서 분리한 NK 세포를 0.5:1과 1:1(NK 세포수:HepG2 세포수)로 처리한 다음 4시간 동안 추가 배양하였다. 그 후 간암세포에 대해 MTT 분석법을 수행하여 세포독성을 측정하였다.
그 결과, NK 세포와 아파티닙을 병용 처리한 경우 NK 세포만을 처리한 경우보다 간암세포에 대한 세포독성이 약 150 ~ 200% 가량으로 매우 크게 증가함을 확인하였다(도 2). 또한, 아파티닙과 병용 처리되는 NK 세포의 양이 증가할수록 간암세포에 대한 세포독성이 증가함을 확인하였다(도 2).
이를 통해, NK 세포와 아파티닙을 병용 처리하는 경우 NK 세포 단독 처리하는 경우에 비해 항암 효과가 매우 크게 증가함을 확인하였는 바, NK 세포 또는 체내 NK 세포를 증가시키는 IL-2, IL-15, IL-21, M-CSF 등의 사이토카인(cytokine)과 함께 아파티닙을 병용 처리하는 경우 NK 세포 또는 아파티닙을 단독 처리하는 경우보다 매우 우수한 항암 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2. 다양한 암에 대한 NK 세포와 아파티닙의 병용 처리 효과 분석
다양한 암에 대한 NK 세포와 아파티닙의 병용 처리에 따른 항암 효과를 확인하기 위해, 다양한 암에 대한 NK 세포와 아파티닙의 병용 처리에 따른 세포독성을 분석하였다. 구체적으로, 5 μM 아파티닙을 96 well plate의 well당 5x10 4개의 폐암세포주(A549) 혹은 96 well plate의 well당 5x10 4개의 췌장암세포주(PC1)에 처리하여 2일 동안 배양한 후 세포수를 계수하여, 살아남은 암세포에 인간 혈액에서 분리한 NK 세포를 암세포와 1:1로 처리한 다음 추가 배양하였다. 그 후 각 암세포에 대해 MTT 분석법을 수행하여 세포독성을 측정하였다.
그 결과, 폐암세포 및 췌장암세포 모두에서 NK 세포와 아파티닙을 병용 처리한 경우 NK 세포만을 처리한 경우보다 암세포에 대한 세포독성이 매우 크게 증가함을 확인하였다(도 3).
이를 통해, NK 세포 또는 체내 NK 세포를 증가시키는 IL-2, IL-15, IL-21, M-CSF 등의 사이토카인과 함께 아파티닙을 병용 처리하는 경우 다양한 암에 대해 매우 우수한 항암 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 3. 아파티닙과 NK 세포의 병용 처리에 의해 항암 활성 증가 기작 확인
아파티닙을 HepG2 간암세포에 처리한 후 간암세포에서 NK 세포의 활성화 및 세포독성에 있어 중요한 인자들인 ULBP1, ULBP2, ULBP3의 발현량을 real time PCR방법을 활용하여 측정하였다. 측정방법은 다음과 같다. 먼저, HepG2 세포에 아파티닙(1 μM)을 처리한 후 1일간 혹은 2일간 배양한다. 그 후 total RNA를 Trizol을 사용하여 추출한 후 cDNA를 합성한 다음, ULPB1,2,3에 각각 특이적인 PCR probe를 이용한 정량적인 분석인 real time PCR을 수행하여 ULBP1, ULBP2, ULBP3의 양을 측정하였다. 측정된 각각의 발현량을 아파티닙을 처리하지 않은 경우를 기준으로 상대적으로 나타내었다.
그 결과, 아파티닙의 처리에 따라 간암세포에서 ULBP1, ULBP2, ULBP3의 발현이 매우 크게 증가하는 것을 확인하였다(도 4).
이를 통해, 암세포에서 아파티닙이 NK 세포의 항암활성에 중요한 활성화 수용체인 NKG2D에 대한 리간드(ULBP1, ULBP2, ULBP3)의 발현을 증가시킨 결과, 암세포는 증가된 리간드로 인해 NK 세포에 대한 감수성이 증가됨을 알 수 있었다(도 5). 즉, 아파티닙이 암세포의 NK 세포에 대한 감수성을 증가시킨 결과, NK 세포의 암세포에 대한 세포독성이 증가하는 바, 아파티닙과 NK 세포의 병용 처리에 의해 항암 효과가 시너지적으로 크게 증가함을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. (a) 아파티닙(Afatinib); 및
    (b) 분리된 NK(Natural killer) 세포, 체내 NK 세포를 촉진하는 사이토카인, 또는 이들의 조합;을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 사이토카인은 IL(Interleukin)-2, IL-15, IL-21, M-CSF(macrophage colony-stimulating factor) 또는 이들의 조합인 것인, 약제학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 암세포에서 NK 세포의 NKG2D 수용체에 대한 리간드의 발현을 증가시키는 것인, 약제학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 (a)성분 및 (b)성분이 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
  5. 아파티닙을 포함하는, 암세포의 NK 세포에 대한 민감성 증진용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 조성물은 암세포에서 NK 세포의 NKG2D 수용체에 대한 리간드의 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  7. 아파티닙을 포함하는, 암세포 및 NK 세포의 결합 증진용 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 조성물은 NK 세포의 살상능력을 증진시키는 것인, 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 4항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 키트.
  10. 제 1항 내지 제 4항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 암 예방 또는 치료 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 투여하는 단계는 (a) 아파티닙; 및 (b) 분리된 NK 세포, 체내 NK 세포를 촉진하는 사이토카인, 또는 이들의 조합;을 동시, 순차적, 또는 역순으로 병용 투여하는 것인, 방법.
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