WO2020182646A1 - Verarbeitungssystem und verarbeitungsverfahren für in form dreidimensionaler verbünde kultivierte zellen und computerprogramm - Google Patents

Verarbeitungssystem und verarbeitungsverfahren für in form dreidimensionaler verbünde kultivierte zellen und computerprogramm Download PDF

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WO2020182646A1
WO2020182646A1 PCT/EP2020/055984 EP2020055984W WO2020182646A1 WO 2020182646 A1 WO2020182646 A1 WO 2020182646A1 EP 2020055984 W EP2020055984 W EP 2020055984W WO 2020182646 A1 WO2020182646 A1 WO 2020182646A1
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medium
dimensional
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Werner Wittke
Nariman ANSARI
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Leica Microsystems CMS GmbH
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    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads or physically stretching molecules

Definitions

  • the present invention relates to a processing system and a
  • the cells are enabled to grow and interact in all spatial directions in vitro, and thus at least partially to grow and interact in vivo
  • Three-dimensional cell cultures are usually cultivated in bioreactors, small capsules in which the cells can grow into spheroids, or in the form of three-dimensional cell colonies. For example, a large number of corresponding spheroids can be cultivated in bioreactors.
  • Spheroids on the other hand, resemble in vivo tissue in terms of cellular
  • extracellular matrix allows toes to move in their spheroid, much like cells would move in living tissue.
  • three-dimensional cell cultures improved models for the Zehmigration that Differentiation of cells, cell survival and cell growth are created.
  • three-dimensional cell cultures reproduce the natural cell polarization better, since cells in two-dimensional cell cultures can only be partially polarized.
  • Cells cultivated in three dimensions can also have a different gene expression than cells cultivated in two dimensions.
  • the three-dimensional cultivation of cells can in principle be carried out using structural frameworks, for example using hydrogels
  • Cells are cultivated, for example, in the form of the spheroids already mentioned, i.e. essentially spherical aggregates.
  • spheroids for example, healthy cells and
  • Tumor cells were co-cultured to simulate how the tumor cells interact with the healthy cells.
  • Corresponding spheroids can be generated using different methods.
  • a common method which can also be used in particular in connection with the present invention, is the use of multi-chamber culture plates with low cell adhesion, typically in the known 96-well form, for the mass production of spheroid cultures in which the aggregates are typically rounded bottom of the chambers.
  • Spheroids can also be grown in pendent drops that hang from the surface of a culture plate.
  • Other methods include the use of rotating-walled bioreactors that rotate the cells in constant free fall and form layered aggregates.
  • Bioreactors used for three-dimensional cell cultures are typically designed in the form of small cylindrical plastic chambers. Here will be described
  • bioactive materials such as polyethylene terephthalate membranes are used to keep the spheroid cells in an environment that ensures a high nutrient content.
  • the chambers can be opened and closed so that the spheroids can be removed for testing.
  • the chambers are part of a larger arrangement that can be rotated to ensure even cell growth in every direction.
  • three-dimensional cell assemblies which are produced in vitro and at least partially living organs with regard to the tissue structure or morphology
  • Organoids Correspond to organisms. Organoids therefore have, in particular, a realistic micro-anatomy. Organoids are obtained from one or a few toes of tissue, from embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells, which can organize themselves in three-dimensional culture due to their ability to self-renew and differentiate.
  • the production of organoids typically involves the cultivation of
  • Stem or progenitor cells in a medium or a corresponding matrix can also be used to produce organoids.
  • the organoids can be produced by embedding stem cells in an appropriate matrix, using suitable inductors for differentiation.
  • Organoids can also be made using adult stem toes derived from the
  • Target organ can be extracted and cultured in a medium.
  • Hydrogels which do not necessarily have to have an organ-like microstructure, as well as organoids, are each cells that are or have been cultivated in the form of three-dimensional assemblies. Therefore, in the context of the present application, the collective term “in the form of three-dimensional
  • a composite can be a cell-cell composite in which the cells adhere to one another or have grown together, but also a composite provided by a framework such as a hydrogel.
  • the cells cultivated in the form of three-dimensional assemblies are arranged in aggregates, have several cell layers in each spatial direction, and the toes adhere to one another through mutual adhesion or through a natural or artificial matrix.
  • the present invention has in particular the task of handling cells cultivated in the form of three-dimensional assemblies, in particular cells
  • the present invention proposes to solve this problem
  • the generation of cells cultivated in three-dimensional networks is intended to mean, in particular, the formation of corresponding aggregates from one or more individual cells, in particular through aggregation of several cells or the division of one or more output lines, the daughter cells in
  • Cells cultivated in three-dimensional assemblies typically require an exchange, advantageously a continuous exchange, of a nutrient medium or a fluid in which the cells cultivated in three-dimensional assemblies grow, or one or more components thereof.
  • an exchange advantageously a continuous exchange, of a nutrient medium or a fluid in which the cells cultivated in three-dimensional assemblies grow, or one or more components thereof.
  • the staining of cells cultivated in three-dimensional assemblies is generally known, so that reference can be made to the corresponding specialist literature. It is carried out in particular by adding one or more dyes detectable in the visible, infrared or ultraviolet wavelength range, in particular also fluorescent dyes which emit light of a different wavelength when excited with light of one wavelength. Especially when using several dyes detectable in the visible, infrared or ultraviolet wavelength range, in particular also fluorescent dyes which emit light of a different wavelength when excited with light of one wavelength. Especially when using several
  • the stimulation carried out within the scope of the present invention can in particular be a mechanical chemical, temperature or radiation stimulation which causes a defined, known, unknown or to be examined reaction in the cells cultivated in three-dimensional networks, for example a release of certain signal substances, a certain gene expression , a division, a differentiation or the like.
  • the present invention proves to be particularly advantageous in connection with a chemical stimulation which is accompanied by the addition of one or more stimulation substances, since this no longer has to be carried out manually or no longer exclusively within the scope of the present invention.
  • Control unit be set up, for example to control one or more pumps for metering or feeding in one or more fluids for
  • Control of one or more heating or cooling devices for thermal stimulation for controlling one or more motors for positioning, for controlling one or more cameras and the like.
  • Cultivation, stimulation and sample preparation are conventionally carried out independently of one another and in separate manual steps.
  • the present invention integrates and automates at least some of these components
  • Steps in a processing system as proposed according to the invention and which is set up to carry out a corresponding method Steps in a processing system as proposed according to the invention and which is set up to carry out a corresponding method.
  • the present invention creates, in particular, a coherent workflow or work stream that is largely automated or can be performed without or without significant user intervention after the start.
  • the entire sequence of sample preprocessing and sample processing of thick, three-dimensional cellular samples such as tumor spheroids and organoids can be partially or completely automated.
  • the present invention proposes a processing system for toes cultivated in the form of three-dimensional composites (that is to say in particular the three-dimensional cell cultures and organoids explained).
  • a culture unit is provided, which can in particular be exchangeable and designed in the form of a culture plate.
  • the culture unit has a number of
  • Culture chambers which are designed as explained in detail below and are set up to accommodate the cells cultivated in the form of three-dimensional composites and a culture medium.
  • the culture chambers can in particular be present in a number and arrangement that corresponds to the number of so-called woes in known multi-well plates in order to ensure compatibility, for example, with commercially available multi-pipettes or pipetting devices and detectors such as fluorescence readers.
  • the processing system further comprises a microscope, wherein the culture unit is arranged or can be arranged in the processing system in such a way that the culture chambers and their contents can be viewed through a base of the culture unit.
  • Positioning means can be provided which
  • the processing system proposed according to the invention has a control unit, the control unit being set up to use the processing system for generating, processing, stimulating and / or documenting the shape of three-dimensional composites, cells cultivated under the microscope at least partially in accordance with a procedure made before the generation, processing, stimulation and / or documentation, for example by a user
  • control specification can take place, for example, in accordance with a predetermined processing protocol, with, for example, a time sequence or metering of
  • the metered addition can in particular also take place for differentiation, that is to say for example for the generation of organoids, or for stimulation. Also an automated or partially automated observation or documentation that takes place over time by means of the microscope in a predetermined sequence and / or using predetermined ones
  • Detection modalities can be the subject of the present invention.
  • the use of the present invention significantly simplifies the generation, processing and / or stimulation as well as the documentation of corresponding toes, in particular because there are no or a reduced number of toes
  • the present invention also creates a higher level of reproducibility and the method can be carried out in a skill-neutral manner.
  • the state of the art the state of the art
  • the present invention goes beyond pure automation, since with it the steps mentioned can be carried out in particular in a single structural unit and in particular there is also no need to replace the culture units used in this process and to change pipetting or the like.
  • the culture unit can in particular be designed as an exchangeable culture plate, the
  • Culture chambers are arranged side by side in the culture unit. In this way, by shifting in the horizontal plane, each of the
  • Culture chambers are brought into the observation beam path of the microscope and the contents can be observed in this way.
  • the culture unit as an exchangeable culture plate, it can after processing in the
  • Culture chambers in particular have a cell-repellent coating. In this way, any interaction between the surface of the
  • Coatings are known to the person skilled in the art and are commercially available.
  • the at least one culture chamber is connected to a supply channel for supplying one or more fluids into the at least one culture chamber and / or to a discharge channel for discharging one or more fluids from the at least one culture chamber fluidic coupling, but not necessarily a fixed mechanical connection, should be understood.
  • a supply channel for supplying one or more fluids into the at least one culture chamber and / or to a discharge channel for discharging one or more fluids from the at least one culture chamber fluidic coupling
  • Feed channel for feeding the fluid or fluids into the at least one culture chamber and / or the discharge channel can be used for discharging the fluid or fluids, for example by means of a corresponding mechanical or spatial arrangement.
  • a discharge channel can, for example, also be designed as an immersion tube which is merely immersed in the culture chamber and in this way can draw off medium from the floor of the culture chamber or near the floor.
  • a supply channel can be designed as a feed tube which opens into the culture chamber or above the culture chamber.
  • a system of supply and discharge channels can also be used as a exchangeable or movable unit are provided separately from the culture unit or a culture plate.
  • the cells cultivated in the form of three-dimensional composites can be left in the respective culture chambers, for example to induce differentiation into different cell types, for stimulation, coloring, lightening or the like, and a costly transfer is not required. In this way, the implementation of corresponding experiments is simplified.
  • the supply channels of several culture chambers are connected to a common feed line and / or the discharge channels of several culture chambers are connected to a common removal line.
  • the feed line can in particular be set up on a reservoir for the one or more fluids, it being possible to provide a pump by means of which, in particular according to the control device, the fluid or fluids can be conveyed.
  • the extraction line which can be connected to a waste container in particular via a corresponding controllable pump.
  • a single pump with different fluid channels for example a peristaltic pump, can also be used.
  • the supply channel (s) and / or the discharge channel (s) can be set up for a flow that is based on a physiological
  • Flow rate is, in particular, a rate at which a fluid exchange would also take place in vivo, at which certain components are converted, or the like.
  • the setting can take place within the scope of the present invention in particular by a corresponding design of the supply channel or channels and / or the discharge channel or channels or by suitable dimensioning and / or control of a pump.
  • At least one of the supply channels and / or the discharge channels can be designed as a microfluidic channel in order to enable particularly careful metering in this way. It can also corresponding microfluidic mixing or metering devices are provided in order to be able to mix or meter fluids in a targeted manner, for example.
  • Culture chambers free of supply channels and / or discharge channels, so that in this way unimpeded observation through the microscope is made possible.
  • free of refers in particular to an arrangement in which the
  • the supply channel or channels of the at least one culture chamber, which has a supply channel is / are led laterally to the at least one culture chamber, the discharge channel or channels of the at least one culture chamber, which has a discharge channel, in particular opposite the supply channel or channels at least another of the culture chambers is or are brought in.
  • the discharge channels are advantageously each below the supply channels
  • a bottom of the at least one culture chamber has a thickness in a range from 5 to 300 ⁇ m, in particular in a range from 25 to 170 ⁇ m. In this way, sufficient stability can be achieved at the same time as low enough for higher magnifications
  • the bottom of the at least one culture chamber is advantageously designed to be transparent, with “transparent” being understood to mean a permeability for at least one wavelength of visible, infrared or ultraviolet light of at least 50%, 60%, 70%, 80% or 90%.
  • the transparency therefore does not have to be complete and for all wavelengths.
  • the bottom of the at least one culture chamber can in particular be made of glass, quartz or a cycloolefin copolymer.
  • Other alternatives are known and commercially available.
  • polytetrafluoroethylene materials in particular in transparent form, can be used.
  • Cells cultivated in three-dimensional assemblies are generated, processed, stimulated and / or documented in a culture unit which has a number of culture chambers in which the cells cultivated in the form of three-dimensional assemblies and a culture medium are accommodated.
  • the cells cultivated in the form of three-dimensional assemblies are stimulated under a microscope and, according to the invention, this is at least partially according to a prior to generation, processing, stimulation and / or
  • the method proposed according to the invention advantageously comprises an introduction or generation of the cells cultivated in the form of three-dimensional assemblies into at least one or one of the culture chambers.
  • the cells can therefore be cultivated there or introduced after cultivation.
  • Processing, stimulation and / or documentation can in particular
  • the cells can continuously receive the nutrients and nutrients required for growth
  • the at least one first medium can in particular have a growth medium which in particular contains one or more active ingredients, one or more dyes, one or more
  • At the second medium can in particular be used up, ie first medium changed due to the physiological activity of the cells.
  • the cells cultivated in the form of three-dimensional assemblies can advantageously remain permanently in the same culture chamber during processing, so that transfer is unnecessary.
  • the supply of the at least one first medium and / or the removal of the at least one first medium or the at least one second medium can, as mentioned,
  • the present invention also relates to a computer program that executes a method as explained above in any configurations when it is executed on a computer, in particular in a control unit of a processing system, as explained above in different configurations.
  • a hardware device such as a processor, a microprocessor, a
  • one or more of the most important method steps can be carried out by such a device.
  • Embodiments of the invention can be implemented in hardware or software.
  • the implementation can be carried out with a non-volatile storage medium such as a digital storage medium, for example a floppy disk, a DVD, a Blu-Ray, a CD, a ROM, a PROM and EPROM, an EEPROM or a FLASH memory, on which electronically readable
  • a non-volatile storage medium such as a digital storage medium, for example a floppy disk, a DVD, a Blu-Ray, a CD, a ROM, a PROM and EPROM, an EEPROM or a FLASH memory, on which electronically readable
  • Control signals are stored, which interact (or can interact) with a programmable computer system so that the respective method is carried out. Therefore, the digital storage medium can be computer readable.
  • Some exemplary embodiments according to the invention comprise a data carrier with electronically readable control signals, which with a programmable Computer system can interact so that one of the methods described herein is carried out.
  • exemplary embodiments of the present invention can be implemented as a computer program product with a program code, the program code being effective for executing one of the methods when the computer program product is running on a computer.
  • the program code can be stored, for example, on a machine-readable carrier.
  • machine-readable carrier is stored.
  • an embodiment of the invention is therefore a
  • Computer program with a program code for performing one of the methods described herein when the computer program runs on a computer is Another embodiment of the present invention.
  • a storage medium (or a data carrier or a computer-readable medium) having a computer program stored thereon for executing any of the herein
  • the data carrier, the digital storage medium or the recorded medium are usually tangible and / or not seamless.
  • Another embodiment of the present invention is an apparatus as described herein that includes a processor and the storage medium.
  • Another embodiment of the invention is a data stream or a
  • Signal sequence that represents the computer program for performing one of the methods described herein.
  • the data stream or the signal sequence can be configured in such a way that they are transmitted over a data communication connection, for example over the Internet.
  • Another embodiment comprises a processing means, for example a computer or a programmable logic device, which is configured or adapted to carry out one of the methods described herein.
  • a processing means for example a computer or a programmable logic device, which is configured or adapted to carry out one of the methods described herein.
  • Another embodiment of the present invention comprises a computer, on which the computer program for carrying out one of the methods described herein is installed.
  • Another embodiment according to the invention comprises an apparatus or a system that is configured to transmit (for example electronically or optically) a computer program for carrying out one of the methods described herein to a receiver.
  • the receiver can be, for example, a computer, a mobile device, a storage device, or the like.
  • the device or the system can for example comprise a file server for transmitting the computer program to the recipient.
  • a programmable logic device e.g., a field programmable gate array, FPGA
  • FPGA field programmable gate array
  • a field programmable gate arrangement can cooperate with a microprocessor to perform any of the methods described herein.
  • the methods are preferably performed by any hardware device.
  • Embodiments of the present invention can each also be used as an organoid
  • OMS Organoid Management System
  • organoid processing system contain an overall concept for the formation, staining, stimulation and the subsequent checking of three-dimensional cell cultures. This is achieved through the use of standardized and established consumables as well as already published and established protocols. Embodiments of the present invention reduce the effort for the individual manual
  • Steps during the work strand to a minimum and standardize the process. This primarily refers to the time-consuming sample transfer and pipetting steps that are affected by many sources of error. Failure to follow these steps not only reduces the workload but also leads to
  • One embodiment of the present invention is based on the use and modification of already existing multiwell plates (96 to 384 well format) WO 2020/182646 - 16 - PCT / EP2020 / 055984 a 25 to 170 mih thin base made of cycloolefin copolymer.
  • Multiwell plate formats are also possible.
  • the surface of the individual wells in the plate is cell-repellent due to chemical treatment or a corresponding coating and is both U-shaped and flat
  • the plate Due to its optical and chemical properties, the plate is resistant to organic solvents (e.g. BABB) and can also be used in fluorescence microscopy due to the low level of autofluorescence.
  • Organic solvents e.g. BABB
  • Media and chemicals for sample preparation are introduced into and removed from the multiwell plates via supply and discharge channels. These steps follow defined protocols that are stored in the system software and that control the procedure. This includes the feed and
  • the ID of the plate used can be recorded automatically (barcode, RFID or similar) and the data of the cells used can be saved and documented in the software together with the preparation protocol.
  • Embodiments of the present invention relate to the automation of an entire sample preparation work string of thick, three-dimensional cellular samples (cellular spheroids and organoids). There are widely published works for the individual steps in the sample preparation strand (see also Pubmed). This mainly affects the steps for that
  • Embodiments of the present invention also referred to as an organoid management system (OMS) or an organoid processing system, include a
  • One embodiment of the invention is based on a multiwell plate (96 to 384 well format) with a 25 to 170 ⁇ m thick base made of glass or cycloolefin copolymer.
  • Other multiwell plate formats are also possible.
  • the surface of the individual wells in the plate is cell-repellent due to chemical treatment or an appropriate coating and can be available in both a U-shape and a flat version. Due to its optical and chemical properties, the plate is suitable for microscopy as well as being resistant to organic solvents. Incoming and outgoing channels can enter the sample space
  • Media and chemicals for the preparation are supplied. These steps follow defined protocols that are stored in the system software and that control the procedure. This includes the supply and residence time of chemicals in the sample space for staining, blocking and washing steps.
  • the ID of the plate used is automatically recorded (barcode, RFID or similar) and the data of the cells used WO 2020/182646-18-PCT / EP2020 / 055984 are used, for example, in the software together with the
  • the first well has a supply channel for supplying media and a discharge channel for discharging media.
  • the bottom of the organoid processing system having a thickness in a range from 5 to 300 ⁇ m, preferably from 25 to 170 ⁇ m.
  • organoid processing system according to one of the preceding paragraphs A) to D), wherein at least one second well of the plurality of wells has a supply channel for supplying media and a discharge channel for discharging media, the supply channel of the first well with the supply channel of the second well is connected and wherein the discharge channel of the first well is connected to the discharge channel of the second well.
  • Feed channel of the first well is brought up.
  • organoid processing system wherein the organoid processing system is a multiwell plate.
  • a second medium is discharged through a discharge channel of the well in which the organoid is located.
  • FIG. 1 shows a processing system according to an embodiment of the present invention
  • FIGS. 2A to 2C illustrate a processing system according to an embodiment of the present invention in partial schematic representations
  • Figure 3 illustrates a method according to an embodiment of the invention in the form of a schematic flow chart.
  • elements that correspond to one another are possibly identical
  • FIG. 1 a processing system according to an embodiment of the present invention is schematically illustrated and illustrated overall at 100.
  • FIG. 2A shows a perspective view of part of the processing system 200
  • FIGS. 1 to 2B show an enlarged side view in a detail
  • FIG. 2A shows a perspective view of part of the processing system 200
  • FIGS. 1 to 2B show an enlarged side view in a detail
  • FIG. 2C is an enlarged plan view in detail. Figure 1 and Figures 2A to 2C are explained together below.
  • the culture unit 110 has a number of culture chambers 112 which are each set up to receive the cells 10 cultivated in the form of three-dimensional assemblies and a culture medium 20.
  • the culture chambers are arranged next to one another in the culture unit in the culture unit 110, which is in particular designed as an exchangeable culture plate.
  • a microscope 120 (shown greatly simplified and shown in Figure 2A as a block with a microscope objective 22) and a control unit 130 (shown in Figure 2A as a computer and otherwise very simplified) are also part of the processing system 100, the control unit 130 being set up to control the processing system 100 for generating, processing and / or stimulating the shape of three-dimensional assemblies cultivated cells 10 under the microscope 120 at least partially in accordance with a control specification made before the generation, processing and / or stimulation and without manual intervention.
  • wired or wireless communication links 132 are provided for the exchange between the control unit 130, which can also be integrated in other devices, and the rest of the processing system 100.
  • the microscope 120 can be an integral part of the system 100 or connected to the same.
  • the microscope 120 can be designed in particular to record images and is connected to the control unit 130, in particular designed as a computer system and described below as such.
  • the control unit 130 which, as mentioned, can in particular be designed as a computer system, is designed for
  • control unit 130 can execute a machine learning algorithm
  • the control unit 130 and the microscope 120 can be separate units, but can also be integrated together in a common housing.
  • the control unit 130 could be part of a central The processing system of the microscope 120 and / or the control unit 130 could be part of a subcomponent of the microscope 120, such as a sensor, an actuator, a camera or a lighting unit, etc. of the microscope 120.
  • the control unit 130 can be a local computer device (e.g. personal computer , Laptop, tablet computer or mobile phone) with one or more processors and one or more storage devices or can be a distributed
  • the controller 130 may include any circuit or combination of circuits.
  • the controller 130 may include one or more processors, which may be of any type.
  • processor can mean any type of computing circuit such as, but not limited to, a microprocessor, a microcontroller, a complex instruction set microprocessor (CISC), a reduced instruction set microprocessor (RISC), a very long instruction word - (Very Long Instruction Word; VLIW) microprocessor, a graphics processor, a digital signal processor (DSP), a multi-core processor, a field-programmable gate array (FPGA), e.g. one
  • control unit 130 may be a custom built circuit, an application specific integrated circuit (ASIC), or the like, such as one or more circuits (e.g., a communication circuit) for use in wireless devices such as a wireless device .
  • ASIC application specific integrated circuit
  • the control unit 130 can comprise one or more storage devices, which can comprise one or more storage elements suitable for the respective application, such as, for example, a main memory in the
  • the control unit 130 can also comprise a display device, one or more loudspeakers, and a keyboard and / or controller that includes a mouse, trackball, touchscreen, May include voice recognition device or any other device that allows a system user to input information into and receive information from control unit 130.
  • several culture chambers 112 are connected to supply channels 114 for supplying one or more fluids into the at least one culture chamber 112 and to discharge channels 116 for discharging one or more fluids from the at least one culture chamber 112. As illustrated in particular in the side view of FIG. 2B, the discharge channels 116 are arranged below the supply channels 114 or dip into the culture chambers 112.
  • the supply channels 114 of several culture chambers 112 are connected to a common one
  • Feed line 115 and the discharge channels 116 of a plurality of culture chambers 112 are connected to a common extraction line 117.
  • the feed line 115 is in turn connected to a reservoir system 150 via a (peristaltic) pump 140, which can be controlled by means of the control device 130, or in the latter to a fluid reservoir 152.
  • the extraction line 117 is connected via the pump 140, which is controlled by means of the
  • Control device 130 is controllable to a waste container 154 in the
  • FIG. 3 a method is illustrated in the form of a simplified process flow diagram and denoted by 200, which method is partially configured in accordance with an embodiment of the present invention.
  • a user carries out preliminary work and fills, for example, a fluid reservoir, for example the fluid reservoir 152 of the system 100, with a desired solution,
  • a waste container for example the waste container 154
  • a pump 140 is connected.
  • the system 100 After switching on the control unit 130, starting appropriate software and selecting a desired protocol in the software, the system 100 for example three times with a suitable washing buffer such as
  • PBS phosphate buffered saline
  • a parallel or subsequent step 202 that is also not yet
  • Culture chambers 122 pipetted, for example centrifuged and in a
  • step 203 a method is carried out in accordance with an embodiment of the invention. If not already done, the samples are washed, for example, three times with PBS after the protocol selected and processed in step 201 and a corresponding exposure on the microscope. The can be preserved via a fixation protocol and used for further workflows (e.g. clearing).
  • step 204 which again is not part of the
  • the system 100 is dismantled, for example, hoses are removed, containers dismantled and autoclaved, and the software is ended and the pump 140 is stopped.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verarbeitungssystem (100) für in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierte Zellen (10), mit einer Kultureinheit (110), die eine Anzahl von Kulturkammern (112) aufweist, die zur Aufnahme der in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen (10) und eines Kulturmediums (20) eingerichtet sind, mit einem Mikroskop (120) und mit einer Steuereinheit (130), wobei die Steuereinheit (130) dazu eingerichtet ist, dass Verarbeitungssystem (100) zur Generierung, Verarbeitung und/oder Stimulation der Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen (10) unter dem Mikroskop (120) zumindest teilweise nach Maßgabe einer vor der Generierung, Verarbeitung und/oder Stimulation definierten Ansteuervorgabe und ohne manuellen Eingriff anzusteuern. Ein entsprechendes Verfahren (200) ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Description

Verarbeitungssystem und Verarbeitungsverfahren für in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierte Zellen und Computerprogramm
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verarbeitungssystem und ein
Verarbeitungsverfahren für in dreidimensionalen Verbünden kultivierte Zellen gemäß den jeweiligen Oberbegriffen der unabhängigen Patentansprüche sowie ein entsprechendes Computerprogramm.
In dreidimensionalen Zellkulturen (3D-Zellkulturen etc., engl. 3D Cell Cultures, auch 3DCC) wachsen und interagieren Zellen in artifiziellen Umgebungen in allen drei Raumrichtungen. Im Gegensatz zu zweidimensionalen Umgebungen wie
beispielsweise auf Petrischalen wird in dreidimensionalen Zellkulturen den Zellen also in vitro ein Wachstum und eine Interaktion in allen Raumrichtungen ermöglicht und damit das Wachstum und die Interaktion in vivo zumindest teilweise
nachgebildet. Dreidimensionale Zellkulturen werden normalerweise in Bioreaktoren, kleinen Kapseln, in denen die Zellen zu Sphäroiden wachsen können, oder in Form dreidimensionaler Zellkolonien kultiviert. Beispielsweise kann in Bioreaktoren eine Vielzahl entsprechender Sphäroide kultiviert werden.
In lebendem Gewebe existieren Zellen in dreidimensionalen Mikroumgebungen mit komplexen Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen und einer komplexen
Transportdynamik. Konventionelle zweidimensionale Zellkulturen bilden diese Bedingungen nur unzureichend ab, was häufig beispielsweise zu Einschränkungen bei der Zuverlässigkeit von in uifro-Wirksamkeits- und Toxizitätsprüfungen von Medikamenten oder Umweltchemikalien und bei deren Übertragbarkeit auf lebende Systeme führt. Dreidimensionale Zellkulturen, beispielsweise entsprechende
Sphäroide, ähneln dagegen in vivo -Gewebe in Bezug auf die zelluläre
Kommunikation und die Entwicklung der extrazellulären Matrix eher. Die
extrazelluläre Matrix erlaubt es Zehen, sich in ihrem Sphäroid bewegen zu können, ähnlich wie sich Zellen in lebendem Gewebe bewegen würden. Mit dreidimensionalen Zellkulturen können somit verbesserte Modelle für die Zehmigration, die Differenzierung von Zellen, das Überleben von Zellen und das Wachstum von Zellen geschaffen werden. Darüber hinaus bilden dreidimensionale Zellkulturen die natürliche Zellpolarisation besser ab, da Zellen in zweidimensionalen Zellkulturen nur teilweise polarisiert werden können. Dreidimensional kultivierte Zellen können außerdem eine andere Genexpression aufweisen als zweidimensional kultivierte.
Die dreidimensionale Kultivierung von Zellen kann grundsätzlich unter Verwendung von Strukturgerüsten, beispielsweise unter Verwendung von Hydrogelen
unterschiedlicher Art, aber auch ohne Verwendung von Strukturgerüsten erfolgen. In letzterem Fall, den die vorliegende Erfindung insbesondere betrifft, können die
Zellen beispielsweise in Form der bereits erwähnten Sphäroide, also im Wesentlichen kugelförmigen Aggregaten, kultiviert werden.
In entsprechenden Sphäroiden können beispielsweise gesunde Zellen und
Tumorzellen kokultiviert wurden, um zu simulieren, wie die Tumorzellen mit den gesunden Zellen interagieren. Entsprechende Sphäroide können unter Verwendung unterschiedlicher Verfahren generiert werden. Ein gängiges Verfahren, das auch insbesondere im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen kann, ist die Verwendung von Mehrkammer-Kulturplatten mit geringer Zelladhäsion, typischerweise in bekannter 96-Well-Form, zur Massenproduktion von Sphäroidkulturen, bei der sich die Aggregate im typischerweise abgerundeten Boden der Kammern bilden. Sphäroide können auch in hängenden Tropfen kultiviert werden, die von der Oberfläche einer Kulturplatte herabhängen. Weitere Verfahren umfassen die Verwendung von Bioreaktoren mit rotierenden Wänden, die die Zellen im ständigen freien Fall drehen und schichtweise Aggregate bilden.
Für dreidimensionale Zellkulturen verwendete Bioreaktoren sind typischerweise in Form kleiner zylindrischer Plastikkammern ausgebildet. Hierbei werden
insbesondere bioaktive Materialien wie Polyethylenterephthalat-Membranen eingesetzt, um die Sphäroidzellen in einer Umgebung zu halten, die einen hohen Nährstoffgehalt gewährleistet. Die Kammern lassen sich öffnen und schließen, so dass die Sphäroide zum Testen entnommen werden können. Die Kammern sind Teil einer größeren Anordnung, die in eine Drehbewegung versetzt werden kann, um ein gleichmäßiges Zellwachstum in jeder Richtung zu gewährleisten. Zu weiteren Details bezüglich dreidimensionaler Zellkulturtechniken sei auf Online- Nachschlagewerke und einschlägige Fachliteratur verwiesen.
Bei Organoiden handelt es sich um miniaturisierte und vereinfachte
dreidimensionale Zellverbünde, die in vitro hergesteht werden und zumindest zum Teil hinsichtlich der Gewebestruktur bzw. -morphologie Organen lebender
Organismen entsprechen. Organoide weisen also insbesondere eine realistische Mikroanatomie auf. Organoide werden aus einer oder wenigen Zehen eines Gewebes, aus embryonalen Stammzellen oder induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen, die sich aufgrund ihrer Selbst erneuerungs- und Differenzierungsfähigkeit in dreidimensionaler Kultur selbst organisieren können.
Die Herstellung von Organoiden umfasst typischerweise die Kultivierung von
Stamm- oder Vorläuferzellen in einem Medium bzw. einer entsprechenden Matrix. Insbesondere können auch zur Herstellung von Organoiden Strukturgerüste unter Verwendung von Hydrogelen eingesetzt werden. Die Organoide können durch Einbetten von Stammzellen in eine entsprechende Matrix erzeugt werden, wobei zur Differenzierung geeignete Induktoren verwendet werden. Organoide können auch unter Verwendung von adulten Stammzehen hergesteht werden, die aus dem
Zielorgan extrahiert und in einem Medium kultiviert werden.
Sowohl bei dreidimensionalen Zellkulturen in Form von Sphäroiden oder in
Hydrogelen, die nicht notwendigerweise eine organartige Mikrostruktur aufweisen müssen, als auch bei Organoiden handelt es sich jeweils um Zellen, die in Form dreidimensionaler Verbünde kultiviert werden bzw. wurden. Daher wird im Rahmen der vorliegenden Anmeldung der Sammelbegriff„in Form dreidimensionaler
Verbünde kultivierte Zellen“ verwendet. Ein Verbund kann dabei ein Zell-Zell- Verbund sein, in dem die Zellen aneinander anhaften oder miteinander verwachsen sind, aber auch ein durch ein Gerüst wie ein Hydrogel bereitgestellter Verbund. In jedem Fall sind die in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen dabei in Aggregaten angeordnet, in jeder Raumrichtung mehrere Zelllagen aufweisen, und die Zehen haften durch wechselseitige Adhäsion oder durch eine natürliche oder künstliche Matrix aneinander an. Dreidimensionale Zellkulturverfahren und Verfahren zur Herstellung von Organoiden, sowie Verfahren, bei denen entsprechende Zellkulturen oder Organoide eingesetzt werden, können Einschränkungen in der Skalierbarkeit,
Reproduzierbarkeit, Empfindlichkeit und Kompatibilität mit bekannten
Hochdurchsatz-Screening-Verfahren (engl. High Throughput Screening, HTS) aufweisen. Das Hochdurchsatz-Screening von Zellen beruht auf der schnellen
Bestimmung der zellulären Reaktion auf die Interaktion mit Chemikalien und die ggf. fehlende Kompatibilität beruht darauf, dass die verfügbaren Assays und
Untersuchungseinrichtungen nicht notwendigerweise für dreidimensionale
Zellkulturen optimiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt sich insbesondere die Aufgabe, die Handhabung von in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen, insbesondere von
dreidimensionalen Zellkulturen oder Organoiden, gegenüber dem Stand der Technik zu vereinfachen und routinefähig auszugestalten.
Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die vorliegende Erfindung ein
Verarbeitungssystem und ein Verarbeitungsverfahren für in dreidimensionalen Verbünden kultivierte Zellen gemäß den jeweiligen Oberbegriffen der unabhängigen Patentansprüche vor. Ein entsprechendes Computerprogramm ist ebenfalls
Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ausgestaltungen der vorliegenden
Erfindung sind jeweils Gegenstand der abhängigen Patentansprüche und der nachfolgenden Beschreibung. Wenn die nachfolgende Beschreibung auf ein Verarbeitungssystem Bezug nimmt, betreffen die entsprechenden Erläuterungen ein erfindungsgemäßes, insbesondere unter Verwendung eines entsprechenden Systems durchgeführtes, Verfahren und ein Computerprogramm in gleicher Weise. Entsprechend gelten auch die Erläuterungen bezüglich eines Verfahrens oder Computerprogramms für ein entsprechendes
System, das gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird.
Werden nachfolgend anstelle des allgemeineren Begriffs„in dreidimensionalen Verbünden kultivierte Zellen“, für den insbesondere die oben angegebene Definition gelten soll, die speziellere Begriffe„dreidimensionale Zellkulturen“ oder„Organoide“ verwendet, gelten diese Erläuterungen jeweils auch für den allgemeineren Begriff oder den jeweils anderen spezielleren Begriff.
Zwar existieren für die einzelnen Schritte im Probenvorbereitungsstrang für in dreidimensionalen Verbünden kultivierte Zellen eine Reihe von Fachpublikationen und Durchführungsanweisungen, insbesondere für die Schritte der Generierung, Färbung und Stimulation von großen dreidimensionalen Zellkulturen, es existiert jedoch derzeit keine technische Lösung, um den gesamten Ablauf der Probenvor- und Probenverarbereitung von dreidimensionalen Zellkulturen in einem bequem durch einen Nutzer handhabbaren und reproduzierbaren Verarbeitungsstrang
zusammenzufassen.
Unter der Generierung von in dreidimensionalen Verbünden kultivierten Zellen soll nachfolgend insbesondere die Bildung entsprechender Aggregate aus einer oder mehreren Einzelzellen, insbesondere durch Aggregation mehrerer Zellen oder die Teilung einer oder mehrerer Ausgangszeilen, wobei die Tochterzellen im
Aggregatverbund verbleiben, verstanden werden. Die Generierung von in
dreidimensionalen Verbünden kultivierten Zellen erfordert typischerweise einen Austausch, vorteilhafterweise einen kontinuierlichen Austausch, eines Nährmediums bzw. eines Fluids, in dem die in dreidimensionalen Verbünden kultivierten Zellen wachsen, oder einer oder mehrerer Komponenten hiervon. Die vorliegende
Erfindung erweist in diesem Zusammenhang als besonders vorteilhaft, da dieser Austausch im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht mehr oder nicht mehr ausschließlich manuell durchgeführt werden muss.
Die Färbung von in dreidimensionalen Verbünden kultivierten Zellen ist allgemein bekannt, so dass auf entsprechende Fachliteratur verwiesen werden kann. Sie erfolgt insbesondere durch Zugabe eines oder mehrerer im sichtbaren, infraroten oder ultravioletten Wellenlängenbereich detektierbarer Farbstoffe, insbesondere auch von Fluoreszenzfarbstoffen, die bei Anregung mit Licht einer Wellenlänge Licht einer anderen Wellenlänge emittieren. Insbesondere bei Verwendung mehrerer
unterschiedlicher Farbstoffe zur Gegenfärbung unterschiedlicher Gewebe oder Zellstrukturen sind rein manuell durchgeführte Färbeprotokolle häufig aufwendig, wobei die vorliegende Erfindung hier ebenfalls Abhilfe schafft. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgenommene Stimulation kann insbesondere eine mechanische chemische, Temperatur- oder Strahlungsstimulation sein, die eine definierte, bekannte, unbekannte oder zu untersuchende Reaktion in den in dreidimensionalen Verbünden kultivierten Zellen hervorruft, beispielsweise eine Ausschüttung von bestimmten Signalstoffen, eine bestimmte Genexpression, eine Teilung, eine Differenzierung oder dergleichen. Die vorliegende Erfindung erweist sich dabei insbesondere in Verbindung mit einer chemischen Stimulation, die durch Zugabe eines oder mehrerer Stimulationssubstanzen einhergeht, als besonders vorteilhaft, da diese im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht mehr oder nicht mehr ausschließlich manuell durchgeführt werden muss.
Für sämtliche der erläuterten Schritte bzw. deren Ansteuerung kann die
Steuereinheit eingerichtet sein, beispielsweise zur Ansteuerung einer oder mehrerer Pumpen zur Zudosierung bzw. Einspeisung eines oder mehrerer Fluide, zur
Ansteuerung einer oder mehrerer Lichtquelle zur optischen Stimulation, zur
Ansteuerung einer oder mehrerer Heiz- oder Kühlreinrichtungen zur thermischen Stimulation, zur Ansteuerung einer oder mehrerer Motoren zur Positionierung, zur Ansteuerung einer oder mehrerer Kameras und dergleichen mehr. Bei der Arbeit mit dreidimensionalen Zellkulturen ist es herkömmlicherweise erforderlich, je nach Bearbeitungsstufe unterschiedliche Zellkulturplatten zu verwenden. Dies erhöht den manuellen Aufwand beim ebenfalls typischerweise manuellen Pipettieren verschiedener Substanzen und dem Transfer der
dreidimensionalen Zellkulturen in andere Plattenformate. Auch existiert derzeit kein einheitliches Protokoll für die Färbung und Behandlung von dreidimensionalen
Zellkulturen, was zu unterschiedlichen und nicht robusten bzw. schwer reproduzier- und vergleichbaren Ergebnissen führt. Einzelne Schritte der Generierung,
Kultivierung, Stimulation und Probenpräparation werden herkömmlicherweise unabhängig voneinander und in separaten manuellen Schritten durchgeführt. Die vorliegende Erfindung integriert und automatisiert zumindest einen Teil dieser
Schritte in einem Verarbeitungssystem, wie es erfindungsgemäß vorgeschlagen wird, und das zur Durchführung eines entsprechenden Verfahrens eingerichtet ist.
Die vorliegende Erfindung schafft, mit anderen Worten, insbesondere einen zusammenhängenden Workflow bzw. Arbeitsstrang, der weitgehend automatisiert bzw. ohne oder ohne wesentlichen Benutzereingriff nach dem Start durchgeführt werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann der gesamte Ablauf der Probenvor- und Probenverarbeitung von dicken, dreidimensionalen zellulären Proben wie zum Beispiel von Tumorsphäroiden und Organoiden teilweise oder vollständig automatisiert werden.
Insgesamt schlägt die vorliegende Erfindung dabei ein Verarbeitungssystem für in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierte Zehen (also insbesondere die erläuterten dreidimensionale Zellkulturen und Organoide) vor. Hierbei wird eine Kultureinheit bereitgestellt, die insbesondere austauschbar und in Form einer Kulturplatte ausgebildet sein kann. Die Kultureinheit weist eine Anzahl von
Kulturkammern auf, die wie nachfolgend noch im Detail erläutert ausgebildet und zur Aufnahme der in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen und eines Kulturmediums eingerichtet sind. Die Kulturkammern können insbesondere in einer Anzahl und Anordnung vorhanden sein, die der Anzahl an sogenannten Wehs in bekannten Multi-Well-Platten entspricht, um eine Kompatibilität beispielsweise mit handelsüblichen Multipipetten oder Pipettiereinrichtungen sowie Detektoren wie Fluoreszenzreadern zu gewährleisten. Das Verarbeitungssystem umfasst ferner ein Mikroskop, wobei die Kultureinheit insbesondere derart in dem Verarbeitungssystem angeordnet oder anordenbar ist, dass die Kulturkammern und deren Inhalt durch einen Boden der Kultur einheit betrachtbar sind. Es können Positionierungsmittel bereitgestellt sein, die
insbesondere dafür eingerichtet sein können, die Kultureinheit und deren
Kulturkammern gegenüber einem Objektiv des Mikroskops in zwei oder drei
Raumrichtungen zu positionieren und auf diese Weise den Inhalt der
Kulturkammern betrachtbar und/oder elektronisch abbildbar zu machen, indem diese insbesondere in einen Strahlengang des Mikroskops eingebracht werden. Zu Details sei auf bekannte, insbesondere inverse, Mikroskope mit entsprechenden Plattenhaltern für Multi-Well-Platten ausdrücklich verwiesen, welche Teil des Verarbeitungssystems sein können.
Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verarbeitungssystem weist eine Steuereinheit auf, wobei die Steuereinheit dazu eingerichtet ist, das Verarbeitungssystem zur Generierung, Verarbeitung, Stimulation und/oder Dokumentation der Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen unter dem Mikroskop zumindest teilweise nach Maßgabe einer bereits vor der Generierung, Verarbeitung, Stimulation und/ oder Dokumentation, beispielsweise von einem Benutzer, getroffenen
Ansteuervorgabe und ohne manuellen Eingriff anzusteuern
Die Definition der Ansteuervorgabe kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung dabei beispielsweise nach Maßgabe eines vorgegebenen Bearbeitungsprotokolls erfolgen, wobei beispielsweise eine zeitliche Abfolge bzw. Zudosierung von
unterschiedlichen Substanzen erfolgt, gegenüber denen die in Form
dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen exponiert werden, oder die ein
Wachstum dieser Zellen sicherst eilen. Die Zudosierung kann insbesondere auch zur Differenzierung, also beispielsweise zur Generierung von Organoiden, oder zur Stimulation erfolgen. Auch eine im zeitlichen Verlauf erfolgende, auch automatisierte oder teilautomatisierte Beobachtung oder Dokumentation mittels des Mikroskops in vorbestimmter Reihenfolge und/ oder unter Verwendung von vorbestimmten
Detektionsmodalitäten kann Gegenstand der vorliegenden Erfindung sein.
Durch den Einsatz der vorliegenden Erfindung erleichtert sich die Generierung, Verarbeitung und/oder Stimulation sowie die Dokumentation von entsprechenden Zehen signifikant, insbesondere weil keine oder eine reduzierte Anzahl an
aufwendigen manuellen Schritten erforderlich sind bzw. ist. Durch die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfolgende Reduktion von Benutzereingriffen bzw. die entsprechende Automatisierung schafft die vorliegende Erfindung ferner eine höhere Reproduzierbarkeit und das Verfahren wird geschicklichkeitsneutral durchführbar. Im Gegensatz zum Stand der Technik lassen sich durch den Einsatz des
erfmdungsgemäß vorgeschlagenen Verarbeitungssystems insbesondere an
unterschiedlichen Standorten bzw. von unterschiedlichen Bearbeitern erzielte Ergebnisse besser vergleichen. Die vorliegende Erfindung geht aber über eine reine Automatisierung hinaus, da mit ihr die genannten Schritte insbesondere in einer einzigen baulichen Einheit durchführbar sind und insbesondere auch ein Austausch der dabei verwendeten Kultureinheiten und ein Umpipettieren oder dergleichen wegfällt. Wie erwähnt, kann die im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Kultureinheit insbesondere als austauschbare Kulturplatte ausgebildet sein, wobei die
Kulturkammern nebeneinander in der Kultureinheit angeordnet sind. Auf diese Weise kann durch eine Verschiebung in der Horizontalebene jede der
Kulturkammern in den Beobachtungsstrahlengang des Mikroskops verbracht und auf diese Weise der Inhalt beobachtet werden. Durch eine Ausbildung der Kultureinheit als austauschbare Kulturplatte kann diese nach der Verarbeitung in dem
erfindungsgemäß vorgeschlagenen Bearbeitungssystem weiteren
Verarbeitungsschritten unterzogen werden, die zur Verarbeitung oder Lagerung entsprechend standardisierter Kulturplatten eingerichtet sind.
In dem erfindungsgemäßen Verarbeitungssystem kann zumindest eine der
Kulturkammern insbesondere eine zellabweisende Beschichtung aufweisen. Auf diese Weise kann vorteilhafterweise jede Interaktion zwischen der Oberfläche der
Kulturkammern und den in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen verhindert werden. Beispiele für solche unerwünschten Interaktionen sind ionische und kovalente Ankopplungen sowie die Bildung von Wasserstoffbrücken
zwischen Biomolekülen und der Oberfläche. Beispiele für zellabweisende
Beschichtungen sind dem Fachmann bekannt und kommerziell verfügbar.
Bei dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verarbeitungssystem ist die zumindest eine Kulturkammer an einen Zufuhrkanal zum Zuführen eines oder mehrerer Fluide in die zumindest eine Kulturkammer und/oder an einen Abfuhrkanal zur Ableitung eines oder mehrerer Fluide aus der zumindest einen Kulturkammer angebunden, wobei unter der„Anbindung“ eine fluidische Kopplung, nicht notwendigerweise aber eine feste mechanische Verbindung, verstanden werden soll. Für eine entsprechende Anbindung im hier verstandenen Sinnd ist lediglich erforderlich, dass der
Zufuhrkanal zum Zuführen des oder der Fluide in die zumindest eine Kulturkammer und/ oder der Abfuhrkanal zur Ableitung des oder der Fluide verwendet werden kann, beispielsweise durch eine entsprechende mechanische bzw. räumliche Anordnung. Ein Abfuhrkanal kann beispielsweise auch als Tauchröhrchen ausgebildet sein, das lediglich in die Kulturkammer eintaucht und auf diese Weise Medium vom Boden der Kulturkammer bzw. bodennah abziehen kann. Entsprechend kann ein Zufuhrkanal als Einspeiseröhrchen ausgebildet sein, das in die Kulturkammer oder oberhalb der Kulturkammer mündet. Ein System aus Zufuhr- und Abfuhrkanälen kann auch als austauschbare bzw. bewegliche Einheit separat zu der Kultureinheit bzw. einer Kulturplatte bereitgestellt werden.
Auf diese Weise können im Rahmen der vorliegenden Erfindung die in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen beispielsweise zur Induktion einer Differenzierung in unterschiedliche Zelltypen, zur Stimulation, Färbung, Aufhellung oder dergleichen in den jeweiligen Kulturkammern belassen werden und ein aufwendiger Transfer ist nicht erforderlich. Auf diese Weise vereinfacht sich die Durchführung entsprechender Experimente.
Vorteilhafterweise sind dabei die Zufuhrkanäle mehrerer Kulturkammern mit einer gemeinsamen Speiseleitung und/oder die Abfuhrkanäle mehrerer Kulturkammern mit einer gemeinsamen Entnahmeleitung verbunden. Die Speiseleitung kann dabei insbesondere an ein Reservoir für das eine oder die mehreren Fluide eingerichtet sein, wobei eine Pumpe bereitgestellt sein kann, mittels derer, insbesondere nach Maßgabe der Steuereinrichtung, das oder die Fluide gefördert werden kann bzw. können. Entsprechendes gilt für die Entnahmeleitung, die insbesondere über eine entsprechende ansteuerbare Pumpe an ein Abfallgefäß angeschlossen sein kann. Es kann auch beispielsweise eine einzige Pumpe mit unterschiedlichen Fluidkanälen, beispielsweise eine Peristaltikpumpe, eingesetzt werden.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung kann oder können der oder die Zufuhrkanäle und/ oder der oder die Abfuhrkanäle für eine Durchströmung eingerichtet sein, die auf Grundlage einer physiologischen
Durchflussgeschwindigkeit bestimmt wird. Bei dieser physiologischen
Durchflussgeschwindigkeit handelt es sich insbesondere um eine Geschwindigkeit, in der auch in vivo ein Fluidaustausch erfolgen würde, in der bestimmte Komponenten umgesetzt werden, oder dergleichen. Die Einstellung kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere durch eine entsprechende Ausbildung des oder der Zufuhrkanäle und/ oder des oder der Abfuhrkanäle oder durch eine geeignete Dimensionierung und/oder Ansteuerung einer Pumpe erfolgen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann zumindest einer der Zufuhrkanäle und/ oder der Abfuhrkanäle als ein Mikrofluidikkanal ausgebildet sein, um auf diese Weise eine besonders behutsame Dosierung zu ermöglichen. Es können auch entsprechende mikrofluidische Misch- oder Dosiereinrichtungen bereitgestellt werden, um beispielsweise Fluide gezielt mischen oder dosieren zu können.
In dem Verarbeitungssystem gemäß der vorliegenden Erfindung ist
vorteilhafterweise ein Boden zumindest eines überwiegenden Teils der
Kulturkammern frei von Zufuhrkanälen und/ oder Abfuhrkanälen, so dass auf diese Weise eine ungehinderte Beobachtung durch das Mikroskop ermöglicht wird. Der Begriff„frei von“ bezeichnet dabei insbesondere eine Anordnung, bei der die
Durchsicht durch den Boden durch Zufuhrkanäle und/oder Abfuhrkanäle nicht oder nicht wesentlich behindert wird.
Vorteilhafterweise ist bzw. sind der oder die Zufuhrkanäle der wenigstens einen Kulturkammer, die einen Zufuhrkanal aufweist, seitlich an die wenigstens eine Kulturkammer herangeführt, wobei der oder die Abfuhrkanäle der wenigstens einen Kulturkammer, die einen Abfuhrkanal aufweist, insbesondere gegenüber des oder der Zufuhrkanäle an wenigstens eine andere der Kulturkammern herangeführt ist oder sind. Auf diese Weise wird es ermöglicht, den Boden jeweils kanalfrei zu halten. Die Abfuhrkanäle sind vorteilhafterweise jeweils unterhalb der Zufuhrkanäle,
insbesondere bodennäher, angeordnet.
In dem erfindungsgemäßen Verarbeitungssystem weist ein Boden der zumindest einen Kulturkammer eine Dicke in einem Bereich von 5 bis 300 pm, insbesondere in einem Bereich von 25 bis 170 pm, auf. Auf diese Weise kann eine ausreichende Stabilität bei gleichzeitig auch für höhere Vergrößerungen gering genug
ausgebildeten Distanz zur Probe sichergestellt werden.
Vorteilhafterweise ist der Boden der zumindest einen Kulturkammer transparent ausgebildet, wobei unter„transparent“ eine Durchlässigkeit für wenigstens eine Wellenlänge sichtbaren, infraroten oder ultravioletten Lichts von wenigstens 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% verstanden wird. Die Transparenz muss also nicht vollständig und für alle Wellenlängen gegeben sein. Insbesondere kann durch
Verwendung von selektiv transparenten Materialien auch eine Filterwirkung bzw. ein Probenschutz gegenüber übermäßiger Lichtbelastung erzielt werden. Der Boden der zumindest einen Kulturkammer kann insbesondere aus Glas, Quarz oder einem Cycloolefin-Copolymer ausgebildet sein. Weitere Alternativen sind bekannt und kommerziell verfügbar. Beispielsweise können Polytetrafluorethylenmaterialen, insbesondere in transparenter Form, eingesetzt werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren, dessen Merkmale bereits teilweise im
Rahmen der Erläuterungen zu dem erfindungsgemäßen Verarbeitungssystem und seiner Ausgestaltungen beschrieben wurde, und das zur Verarbeitung in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierter Zellen dient, werden die in Form
dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen in einer Kultureinheit generiert, verarbeitet, stimuliert und/oder dokumentiert, die eine Anzahl von Kulturkammern aufweist, in der die in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen und ein Kulturmedium aufgenommen sind. Die Generierung, Verarbeitung und/ oder
Stimulation der in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen erfolgt unter einem Mikroskop und diese wird erfindungsgemäß zumindest teilweise nach Maßgabe einer vor der Generierung, Verarbeitung, Stimulation und/oder
Dokumentation, insbesondere durch einen Benutzer, definierten Ansteuervorgabe und ohne manuellen Eingriff durchgeführt.
Vorteilhafterweise umfasst das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren eine Einbringung oder Generierung der in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen in zumindest eine bzw. einer der Kulturkammern. Die Zellen können also in dort kultiviert oder nach Kultivierung eingebracht werden. Die Generierung,
Verarbeitung, Stimulation und/oder Dokumentation kann insbesondere das
Zuführen zumindest eines ersten Mediums durch einen Zufuhrkanal in die zumindest eine Kulturkammer und das Abführen des zumindest einen ersten Mediums oder zumindest eines zweiten Mediums durch einen Abfuhrkanal aus der zumindest einen Kulturkammer umfassen. Wie erwähnt, können auf diese Weise beispielsweise die Zellen kontinuierlich mit dem zum Wachstum benötigten Nährstoffen und
dergleichen, insbesondere in physiologischer Geschwindigkeit, versorgt oder mit entsprechenden Stimulanzien beaufschlagt werden.
Das zumindest eine erste Medium kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere ein Wachstumsmedium aufweisen, das insbesondere einen oder mehrere Wirkstoffe, einen oder mehrere Farbstoffe, eine oder mehrere
Aufhellungslösungen und/ oder ein oder mehrere andere Stimulantien aufweist. Bei dem zweiten Medium kann es sich insbesondere um verbrauchtes, d.h. aufgrund der physiologischen Aktivität der Zellen verändertes, erstes Medium handeln.
Die in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen können im Rahmen der vorliegenden Erfindung während der Verarbeitung vorteilhafterweise dauerhaft in derselben Kulturkammer verbleiben, so dass ein Transfer entfällt. Das Zuführen des zumindest einen ersten Mediums und/oder das Abführen des zumindest einen ersten Mediums oder des zumindest eines zweiten Mediums kann, wie erwähnt,
insbesondere nach Maßgabe einer Steuervorgabe einer Steuereinheit und
insbesondere nach physiologischen Anforderungen durchgeführt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Computerprogramm, das ein Verfahren wie zuvor erläutert in beliebigen Ausgestaltungen ausführt, wenn es auf einem Computer, insbesondere in einer Steuereinheit eines Verarbeitungssystems wie zuvor in unterschiedlichen Ausgestaltungen erläutert ausgeführt wird.
Einige oder alle Verfahrensschritte können im Rahmen der vorliegenden Erfindung dabei durch (oder unter Verwendung) einer Hardwarevorrichtung ausgeführt werden, wie beispielsweise einem Prozessor, einem Mikroprozessor, einem
programmierbaren Computer oder einer elektronischen Schaltung. In einigen
Ausführungsbeispielen können ein oder mehrere der wichtigsten Verfahrensschritte durch eine solche Vorrichtung ausgeführt werden.
Abhängig von bestimmten Implementierungsanforderungen können
Ausführungsbeispiele der Erfindung in Hardware oder Software implementiert werden. Die Implementierung kann mit einem nicht-flüchtigen Speichermedium wie einem digitalen Speichermedium, beispielsweise einer Diskette, einer DVD, einem Blu-Ray, einer CD, einem ROM, einem PROM und EPROM, einem EEPROM oder einem FLASH-Speicher, durchgeführt werden, auf dem elektronisch lesbare
Steuersignale gespeichert sind, die mit einem programmierbaren Computersystem so Zusammenwirken (oder Zusammenwirken können), dass das jeweilige Verfahren durchgeführt wird. Daher kann das digitale Speichermedium computerlesbar sein. Einige Ausführungsbeispiele gemäß der Erfindung umfassen einen Datenträger mit elektronisch lesbaren Steuersignalen, die mit einem programmierbaren Computersystem Zusammenwirken können, so dass eines der hierin beschriebenen Verfahren durchgeführt wird.
Im Allgemeinen können Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung als Computerprogrammprodukt mit einem Programmcode implementiert werden, wobei der Programmcode für die Ausführung eines der Verfahren wirksam ist, wenn das Computerprogrammprodukt auf einem Computer läuft. Der Programmcode kann beispielsweise auf einem maschinenlesbaren Träger gespeichert werden.
Weitere Ausführungsbeispiele der Erfindung umfassen das Computerprogramm zur Durchführung eines der hierin beschriebenen Verfahren, das auf einem
maschinenlesbaren Träger gespeichert ist.
Mit anderen Worten ist ein Ausführungsbeispiel der Erfindung daher ein
Computerprogramm mit einem Programmcode zur Durchführung eines der hierin beschriebenen Verfahren, wenn das Computerprogramm auf einem Computer läuft. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist ein
Speichermedium (oder ein Datenträger oder ein computerlesbares Medium), das ein darauf gespeichertes Computerprogramm zum Ausführen eines der hierin
beschriebenen Verfahren umfasst, wenn es von einem Prozessor ausgeführt wird. Der Datenträger, das digitale Speichermedium oder das aufgezeichnete Medium sind in der Regel greifbar und/oder nicht übergangslos. Eine weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung, wie hierin beschrieben, die einen Prozessor und das Speichermedium umfasst. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist ein Datenstrom oder eine
Signalfolge, die das Computerprogramm zur Durchführung eines der hierin beschriebenen Verfahren darstellt. Der Datenstrom oder die Signalfolge kann so konfiguriert werden, dass sie über eine Datenkommunikationsverbindung, beispielsweise über das Internet, übertragen werden.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel umfasst ein Verarbeitungsmittel, zum Beispiel einen Computer oder eine programmierbare Logikvorrichtung, das konfiguriert oder angepasst ist, um eines der hierin beschriebenen Verfahren auszuführen. Ein weiteres Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung umfasst einen Computer, auf dem das Computerprogramm zum Ausführen eines der hierin beschriebenen Verfahren installiert ist.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel gemäß der Erfindung umfasst eine Vorrichtung oder ein System, das konfiguriert ist, um (zum Beispiel elektronisch oder optisch) ein Computerprogramm zum Ausführen eines der hierin beschriebenen Verfahren an einen Empfänger zu übertragen. Der Empfänger kann beispielsweise ein Computer, eine mobile Vorrichtung, eine Speichervorrichtung oder dergleichen sein. Die
Vorrichtung oder das System kann beispielsweise einen Dateiserver zum Übertragen des Computerprogramms an den Empfänger umfassen.
In Ausführungsbeispielen kann eine programmierbare logische Vorrichtung (z.B. eine feldprogrammierbare Gatteranordnung, FPGA) verwendet werden, um einige oder alle Funktionalitäten der hierin beschriebenen Verfahren auszuführen. In einigen Ausführungsbeispielen kann eine feldprogrammierbare Gatteranordnung mit einem Mikroprozessor Zusammenarbeiten, um eines der hierin beschriebenen Verfahren durchzuführen. Im Allgemeinen werden die Verfahren vorzugsweise von jedem Hardwaregerät durchgeführt. Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung können jeweils auch als Organoid
Management System (OMS) oder Organoidverarbeitungssystem bezeichnet werden und beinhalten ein Gesamtkonzept für die Formierung, Färbung, Stimulation und der anschließenden Überprüfung von dreidimensionalen Zellkulturen. Dies wird erreicht durch die Verwendung von standardisierten und etablierten Verbrauchsmaterialien sowie von bereits publizierten und etablierten Protokollen. Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung reduzieren den Aufwand für die einzelnen manuellen
Schritte während des Arbeitsstranges auf ein Minimum und standardisieren den Prozess. Hierbei sind vor allem die zeitaufwendigen und mit vielen Fehlerquellen betroffenen Probentransfer- und Pipettierschritte gemeint. Das Ausbleiben dieser Schritte führt neben der Reduktion des Arbeitsaufwandes auch zur
Kostenreduktionreduktion für die Forschung an dreidimensionalen Zellkulturen und liefert zudem reproduzierbarere und robustere Ergebnisse.
Ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung basiert auf die Verwendung und Modifikation bereits existierender Multiwellplatten (96- bis 384-Well-Format) mit WO 2020/182646 - l6 - PCT/EP2020/055984 einem 25 bis 170 mih dünnen Boden aus Cycloolefin-Copolymer. Andere
Multiwellplattenformate sind auch möglich. Die Oberfläche der einzelnen Wells in der Platte ist durch chemische Behandlung oder entsprechende Beschichtung zellabweisend und ist sowohl in U-Form als auch in einer flachen Variante
kommerziell erhältlich. Aufgrund der optischen und chemischen Eigenschaften ist die Platte sowohl gegen organische Lösungsstoffe (z.B. BABB) resistent und kann zudem aufgrund der niedrigen Autofluoreszenz in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden. Über zuführende und abführende Kanäle werden Medien und Chemikalien für die Probenpräparation in die Multiwellplatten ein- bzw. abgeführt. Diese Schritte folgen festgelegten Protokollen, die in der Software des Systems hinterlegt sind und die Prozedur steuern. Dies beinhaltet die Zufuhr und
Verweildauer von Chemikalien im Probenraum für Färbe-, Blocking- und
Waschschritte. Die ID der verwendeten Platte kann automatisch erfasst (Barcode, RFID o.ä.) und die Daten der verwendeten Zellen können in der Software zusammen mit dem Präparationsprotokoll abgespeichert und dokumentiert werden.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend nochmals mit anderen Worten beschrieben, wobei die nachfolgenden Erläuterungen jedoch vollumfänglich den obigen Erläuterungen entsprechen bzw. in deren Rahmen liegen und umgekehrt.
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung betreffen die Automatisierung eines gesamten Probenvorbereitungs-Arbeitsstranges von dicken, dreidimensionalen zellulären Proben (zelluläre Sphäroide und Organoide). Es gibt für die einzelnen Schritte im Probenvorbereitungsstrang vielfach publizierte Arbeiten (siehe auch Pubmed). Dies betrifft vor allem die Schritte für die
Formierung, Färbung und Stimulation von großen 3DCC (dreidimensionalen
Zellkulturen). Es gibt jedoch keine Lösung, um den gesamten
Probenvorbereitungsstrang von 3DCC zusammenzufassen.
Bei der Arbeit mit 3DCC muss man aktuell verschiedene Zellkulturplatten für die einzelnen Schritte im Probenvorbereitungsstrang verwenden. Dies erhöht den manuellen Aufwand bei der Überführung der 3DCC-Proben in den Platten. Auch gibt es kein einheitliches Protokoll für die Färbung und Behandlung von 3DCC- Protokollen, was zu uneinheitlichen und nicht robusten Ergebnissen führt. Einzelne Schritte der Formierung, Kultivierung und der Probenpräparation werden unabhängig voneinander und in separaten manuellen Schritten durchgeführt.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Konzept zu schaffen, welches die Automatisierung eines gesamten Probenvorbereitungs-Arbeitsstranges von dicken, dreidimensionalen zellulären Proben wie zum Beispiel von Tumorsphäroiden und Organoiden ermöglicht. Diese Aufgabe wird von Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung gelöst. Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung, auch als Organoid Management System (OMS) oder Organoidverarbeitungssystem bezeichnet, beinhalten ein
Gesamtkonzept für die Formierung, Färbung, Stimulation und der anschließenden Zellcheck-Überprüfung von dreidimensionalen Zellkulturen (3DCC). Dies wird erreicht durch die Verwendung eines einheitlichen Verbrauchsmaterials und angepasster Protokolle. Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung reduzieren den Aufwand für die einzelnen manuellen Schritte während des Arbeitsstranges auf ein Minimum und standardisieren den Prozess. Hierbei sind vor allem die
zeitaufwendigen und mit vielen Fehlerquellen betroffenen, Probentransferschritte gemeint. Das Ausbleiben dieser Schritte führt zu einer signifikanten Reduktion des Arbeitsaufwandes und der Kosten für die Forschung an 3DCC und liefert zudem reproduzierbarere, robustere und verlässlichere Ergebnisse.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung basiert auf einer Multiwellplatte (96- bis 384- Well-Format) mit einem 25 bis 170 pm dünnen Boden aus Glas oder Cycloolefin- Copolymer. Andere Multiwellplattenformate sind auch möglich. Die Oberfläche der einzelnen Wells in der Platte ist durch chemische Behandlung oder entsprechende Beschichtung zellabweisend und kann sowohl als U-Form als auch als flache Variante verfügbar sein. Aufgrund der optischen und chemischen Eigenschaften ist die Platte sowohl für die Mikroskopie geeignet als auch gegen organische Lösungsstoffe resistent. In den Probenraum können über zuführende und abführende Kanäle
Medien und Chemikalien für die Präparation zugeführt werden. Diese Schritte folgen festgelegten Protokollen, die in der Software des Systems hinterlegt sind und die Prozedur steuern. Dies beinhaltet die Zufuhr und Verweildauer von Chemikalien im Probenraum für Färbe, Blocking und Waschschritte. Die ID der verwendeten Platte wird automatisch erfasst (Barcode, RFID o.ä.) und die Daten der verwendeten Zellen WO 2020/182646 - l8 - PCT/EP2020/055984 werden beispielsweise in der Software zusammen mit dem verwendeten
Präparationsprotokoll hinterlegt.
Ausgestaltungen der nachfolgenden Erfindung können auch mit den folgenden, mit A) bis B) bezeichneten Absätzen, die jedoch keine Patentansprüche darstellen, zusammengefasst werden.
A) Organoidverarbeitungssystem mit folgenden Merkmalen:
a) einer Mehrzahl von Wells zur Aufnahme von dicken Proben;
b) wobei mindestens ein erstes Well der Mehrzahl von Wells eine zellabweisende Beschichtung aufweist; und
c) wobei das erste Well einen Zufuhrkanal zum Zuführen von Medien und einen Abfuhrkanal zur Abfuhr von Medien aufweist. B) Organoidverarbeitungssystem gemäß dem vorstehenden Absatz A), wobei der Boden des Organoidverarbeitungssystem eine Dicke in einem Bereich von 5 bis 300 pm, bevorzugt von 25 bis 170 pm aufweist.
C) Organoidverarbeitungssystem gemäß einem der vorstehenden Absätze A) oder B), wobei der Boden des Organoidverarbeitungssystem transparent ist.
D) Organoidverarbeitungssystem gemäß einem der vorstehenden Absätze A) bis C), wobei der Boden des Organoidverarbeitungssystem Glas oder Cycloolefin-Copolymer aufweist.
E) Organoidverarbeitungssystem gemäß einem der vorstehenden Absätze A) bis D), wobei mindesten ein zweites Well der Mehrzahl von Wells einen Zufuhrkanal zum Zuführen von Medien und einen Abfuhrkanal zur Abfuhr von Medien aufweist, wobei der Zufuhrkanal des ersten Wells mit dem Zufuhrkanal des zweiten Wells verbunden ist und wobei der Abfuhrkanal des ersten Wells mit dem Abfuhrkanal des zweiten Wells verbunden ist.
F) Organoidverarbeitungssystem gemäß einem der vorstehenden Absätze A) bis E), wobei der Zufuhrkanal und der Abfuhrkanal Mikrofluidikkanäle sind. G) Organoidverarbeitungssystem gemäß einem der vorstehenden Absätze A) bis F), wobei der Boden des Organoidverarbeitungssystem zumindest im Bereich der Mehrzahl von Wells frei von Zufuhrkanälen und Abfuhrkanälen ist. H) Organoidverarbeitungssystem gemäß einem der vorstehenden Absätze A) bis G), wobei der Zufuhrkanal seitlich an das erste Well herangeführt ist.
I) Organoidverarbeitungssystem gemäß einem der vorstehenden Absätze A) bis H), wobei der Abfuhrkanal seitlich an das erste Weh und gegenüberliegend dem
Zufuhrkanal des ersten Wells herangeführt ist.
J) Organoidverarbeitungssystem gemäß einem der vorstehenden Absätze A) bis I), a) wobei alle Wells der Mehrzahl von Wells gleich dem ersten Well ausgebildet sind, alle Zufuhrkanäle zu den Wehs der Mehrzahl von Wehs miteinander verbunden sind und wobei alle Abfuhrkanäle von den Wells der Mehrzahl von Wehs miteinander verbunden sind.
K) Organoidverarbeitungssystem, wobei die Mehrzahl von Wells mindestens 96 Wehs aufweist.
L) Organoidverarbeitungssystem, wobei das Organoidverarbeitungssystem eine Multiwellplatte ist.
M) Verfahren zur Verarbeitung eines Organoids mit folgenden Schritten:
a) Einfüllen oder Formieren des Organoids in einem Weh einer Multiwellplatte, b) Zuführen eines ersten Mediums durch einen Zufuhrkanal in das Well in dem sich das Organoid befindet;
c) Abführen eines zweiten Mediums durch einen Abfuhrkanal des Wells in dem sich das Organoid befindet.
N) Verfahren zur Verarbeitung eines Organoids gemäß dem vorstehenden Absatz M), wobei das erste Medium ein Wachstumsmedium bevorzugt mit Wirkstoffen,
Farbstoffen, Aufhellungslösung oder anderen Stimulantien ist. O) Verfahren zur Verarbeitung eines Organoids gemäß dem vorstehenden Absatz M) oder N), wobei das zweite Medium das verbrauchte Medium ist.
P) Verfahren zur Verarbeitung eines Organoids gemäß einem der vorstehenden Absätze M) bis O), wobei sich das Organoid während der Verarbeitung dauerhaft in demselben Well derselben Multiwellplatte befindet.
Die Erfindung und weitere Ausgestaltungen der Erfindung werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert, wobei
Figur l ein Verarbeitungssystem gemäß einer Ausgestaltung der vorliegenden
Erfindung schematisch veranschaulicht,
Figuren 2A bis 2C ein Verarbeitungssystem gemäß einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung in schematischen Teildarstellungen veranschaulichen, und
Figur 3 ein Verfahren gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung in Form eines schematischen Ablaufplans veranschaulicht. In den Figuren sind einander entsprechende Elemente ggf. mit identischen
Bezugszeichen angegeben und werden lediglich der Übersichtlichkeit halber nicht wiederholt erläutert. Es versteht sich, dass vorstehend erläuterte und nachfolgend beschriebene Merkmale jeweils nicht nur in der angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendet werden können, ohne den Umfang der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
In Figur 1 ist ein Verarbeitungssystem gemäß einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung schematisch veranschaulicht und insgesamt mit 100 veranschaulicht. Die Figur 2A zeigt eine perspektivische Ansicht eines Teils des Verarbeitungssystems 200, Figur bis 2B eine vergrößerte Seitenansicht in Ausschnittsdarstellung und Figur
2C eine vergrößerte Draufsicht in Ausschnittsdarstellung. Die Figur 1 sowie die Figuren 2A bis 2C werden nachfolgend gemeinsam erläutert.
Teil des Verarbeitungssystems 100, das zur Untersuchung in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierter Zellen 10 eingerichtet ist (letztere nur teilweise bezeichnet), weist eine Kultureinheit 110 in Form einer Kulturplatte auf, die in Figur l in
Seitenansicht, in Figur 2A in perspektivischer Schrägansicht, in Figur 2B wieder in Seitenansicht und in Figur 2C in Draufsicht dargestellt ist. Wie ersichtlich, weist die Kultureinheit 110 eine Anzahl von Kulturkammern 112 auf, die jeweils zur Aufnahme der in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen 10 und eines Kulturmediums 20 eingerichtet sind. Wie ersichtlich, sind in der als insbesondere austauschbare Kulturplatte ausgebildeten Kultureinheit 110 die Kulturkammern nebeneinander in der Kultureinheit angeordnet.
Ein Mikroskop 120 (stark vereinfacht gezeigt und in Figur 2A als Block mit einem Mikroskopobjektiv 22 dargestellt) und eine Steuereinheit 130 (in Figur 2A als Computer und ansonsten stark vereinfacht dargestellt) sind ebenfalls Teil des Verarbeitungssystems 100, wobei die Steuereinheit 130 dazu eingerichtet ist, das Verarbeitungssystem 100 zur Generierung, Verarbeitung und/oder Stimulation der Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen 10 unter dem Mikroskop 120 zumindest teilweise nach Maßgabe einer vor der Generierung, Verarbeitung und/ oder Stimulation getroffenen Ansteuervorgabe und ohne manuellen Eingriff anzusteuern. Hierbei sind zum Austausch zwischen der Steuereinheit 130, die auch in anderen Einrichtungen integriert sein kann, und dem Rest des Verarbeitungssystems 100 drahtgebundene oder drahtlose Kommunikationsstrecken 132 vorgesehen.
Einige Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf das Mikroskop 120 bzw. das Verarbeitungssystem 100, das das Mikroskop 120 umfasst, wie in Verbindung mit den Figuren 1, 2A und 2B. Das Mikroskop 120 kann integraler Teil des Systems 100 oder mit demselben verbunden sein. Das Mikroskop 120 kann insbesondere zum Aufnehmen von Bildern ausgebildet sein und ist mit der insbesondere als Computersystem ausgebildeten und nachfolgend als solches beschriebenen Steuereinheit 130 verbunden. Die Steuereinheit 130, die, wie erwähnt, insbesondere als Computersystem ausgebildet sein kann, ist ausgebildet zum
Ausführen von zumindest einem Teil eines hierin beschriebenen Verfahrens. Die Steuereinheit 130 kann zum Ausführen eines Maschinenlern- Algorithmus
ausgebildet sein. Die Steuereinheit 130 und das Mikroskop 120 können getrennte Einheiten sein, können aber auch zusammen in einem gemeinsamen Gehäuse integriert sein. Die Steuereinheit 130 könnte Teil eines zentralen Verarbeitungssystems des Mikroskops 120 sein und/oder das die Steuereinheit 130 könnte Teil einer Teilkomponente des Mikroskops 120 sein, wie eines Sensors, eines Aktuators, einer Kamera oder einer Beleuchtungseinheit, usw. des Mikroskops 120. Die Steuereinheit 130 kann eine lokale Computervorrichtung (z.B. Personalcomputer, Laptop, Tablet-Computer oder Mobiltelefon) mit einem oder mehreren Prozessoren und einer oder mehreren Speichervorrichtungen oder kann ein verteiltes
Computersystem (z.B. ein Cloud-Computing-System mit einem oder mehreren Prozessoren oder einer oder mehreren Speichervorrichtungen, die an verschiedenen Stellen verteilt sind, zum Beispiel an einem lokalen Client und/oder einer oder mehreren Remote-Server-Farms und/oder Datenzentren) sein. Die Steuereinheit 130 kann irgendeine Schaltung oder Kombination von Schaltungen umfassen. Bei einem Ausführungsbeispiel kann die Steuereinheit 130 einen oder mehrere Prozessoren umfassen, die von irgendeinem Typ sein können. Nach hiesigem Gebrauch kann Prozessor irgendein Typ von Rechenschaltung bedeuten, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, ein Mikroprozessor, ein Mikro Controller, ein Mikroprozessor mit komplexem Befehlssatz (CISC), ein Mikroprozessor mit reduziertem Befehlssatz (RISC), ein Sehr-langes-Anweisungswort- (Very Long Instruction Word; VLIW) Mikroprozessor, ein Graphikprozessor, ein digitaler Signalprozessor (DSP), ein Multi-Core-Prozessor, ein feld-programmierbares Gate-Array (FPGA), z.B. eines
Mikroskops oder einer Mikroskopkomponente (z. B. Kamera) oder irgendein anderer Typ von Prozessor oder Verarbeitungsschaltung. Andere Typen von Schaltungen, die in der Steuereinheit 130 umfasst sein können, können eine speziell angefertigte Schaltung, eine anwendungsspezifische integrierte Schaltung (ASIC) oder Ähnliches, wie eine oder mehrere Schaltungen (z. B. eine Kommunikationsschaltung) zur Verwendung bei drahtlosen Vorrichtungen wie z. B. Mobiltelefonen, Tablet- Computern, Laptop-Computern, Funksprechgeräten und ähnlichen elektronischen Systemen sein. Die Steuereinheit 130 kann eine oder mehrere Speichervorrichtungen umfassen, die ein oder mehrere Speicherelemente umfassen können, die für die jeweilige Anwendung geeignet sind, wie beispielsweise einen Hauptspeicher in der
Form eines Random Access Speicher (RAM), eine oder mehrere Festplatten und/oder ein oder mehrere Laufwerke, die entfernbare Medien, wie beispielsweise CDs, Flash- Speicherkarten, DVD und Ähnliches handhaben. Die Steuereinheit 130 kann auch eine Anzeigevorrichtung, einen oder mehrere Lautsprecher, und eine Tastatur und/ oder Steuerung umfassen, die eine Maus, Trackball, Touchscreen, Stimmerkennungsvorrichtung oder irgendeine andere Vorrichtung umfassen kann, die es einem Systemnutzer erlaubt, Information in die Steuereinheit 130 einzugeben und Information von derselben zu empfangen. Mehrere Kulturkammern 112 sind in der hier veranschaulichten Ausgestaltung an Zufuhrkanäle 114 zum Zuführen eines oder mehrerer Fluide in die zumindest eine Kulturkammer 112 und an Abfuhrkanäle 116 zur Ableitung eines oder mehrerer Fluide aus der zumindest einen Kulturkammer 112 angebunden. Wie insbesondere in der Seitenansicht der Figur 2B veranschaulicht, sind die Abfuhrkanäle 116 unterhalb der Zufuhrkanäle 114 angeordnet bzw. tauchen in die Kulturkammern 112 ein. Die Zufuhrkanäle 114 mehrerer Kulturkammern 112 sind mit einer gemeinsamen
Speiseleitung 115 und die Abfuhrkanäle 116 mehrerer Kulturkammern 112 mit einer gemeinsamen Entnahmeleitung 117 verbunden. Die Speiseleitung 115 ist wiederum über eine (Peristaltik-)Pumpe 140, die mittels der Steuereinrichtung 130 ansteuerbar ist, an ein Reservoirsystem 150 angebunden, bzw. in letzterem an ein Fluidreservoir 152. Die Entnahmeleitung 117 ist über die Pumpe 140, die mittels der
Steuereinrichtung 130 ansteuerbar ist, an einen Abfallbehälter 154 in dem
Reservoirsystem 150 angebunden. In Figur 3 ist ein Verfahren in Form eines vereinfachten Prozessflussdiagramms veranschaulicht und mit 200 bezeichnet, das teilweise gemäß einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ausgestaltet ist. Wenngleich die nachfolgenden
Erläuterungen teilweise auf Elemente der Figuren 1 und 2Abis 2C und damit das System 100 Bezug nehmen, sei ausdrücklich betont, dass diese sich auch auf andersartig ausgebildete Systeme und Elemente beziehen können.
In einem Schritt 201, der notwendigerweise selbst Teil der Erfindung sein muss, trifft ein Benutzer Vorarbeiten und füllt beispielsweise ein Fluidreservoir, beispielsweise das Fluidreservoir 152 des Systems 100 mit einer gewünschten Lösung,
beispielsweise mit Wachstumsmedium, Färbelösung, Waschpuffer oder
Wirkstofflösung. Es versteht sich, dass auch, wenn mehrere Reservoire vorhanden sind, diese entsprechend gefüllt werden können. Ferner wird ein Abfallbehälter, beispielsweise der Abfallbehälter 154, angeschlossen, und eine Pumpe 140 wird angebunden. Nach Einschalten der Steuereinheit 130, Start einer entsprechenden Software und Auswahl eines gewünschten Protokolls in der Software wird das System 100 beispielsweise drei mal mit einem geeigneten Waschpuffer wie
phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen.
Ein paralleler oder nachfolgender Schritt 202, der ebenfalls noch nicht
notwendigerweise selbst Teil der Erfindung sein muss, werden die in Form
dreidimensionaler Verbünde zu kultivierenden Zellen aufgeteilt, in die
Kulturkammern 122 pipettiert, beispielsweise zentrifugiert und in eine
Probenhalterung am Mikroskop 120 eingelegt. In Schritt 203 erfolgt die Durchführung eines Verfahrens gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung. Sofern nicht bereits erfolgt, werden die Proben nach Ablauf des in Schritt 201 gewählten und abgearbeiteten Protokolls und einer entsprechenden Aufnahme am Mikroskop beispielsweise drei mal mit PBS gewaschen. Über ein Fixierungsprotokoll können die konserviert und für weitere Workflows (z.B. Clearing) verwendet werden. In einem Schritt 204, der wiederum nicht Teil des
erfindungsgemäßen Verfahrens sein muss, wird das System 100 abgebaut, wobei beispielsweise Schläuche abgezogen, Behälter abgebaut und autoklaviert sowie die Software beendet und die Pumpe 140 gestoppt werden.

Claims

2020-03-06 Patentansprüche
1. Verarbeitungssystem (100) für in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierte Zellen (10), mit einer Kultureinheit (110), die eine Anzahl von
Kulturkammern (112) aufweist, die zur Aufnahme der in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen (10) und eines Kulturmediums (20) eingerichtet sind, mit einem Mikroskop (120) und mit einer Steuereinheit (130), wobei die
Steuereinheit (130) dazu eingerichtet ist, das Verarbeitungssystem (100) zur
Generierung, Verarbeitung, Stimulation und/oder Dokumentation der Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen (10) unter dem Mikroskop (120) zumindest teilweise nach Maßgabe einer vor der Generierung, Verarbeitung,
Stimulation und/ oder Dokumentation getroffenen Ansteuervorgabe und ohne manuellen Eingriff anzusteuern.
2. Verarbeitungssystem (100) nach Anspruch 1, bei der die Kultureinheit (110) als austauschbare Kulturplatte ausgebildet ist, wobei die Kulturkammern (112) nebeneinander in der Kultureinheit (110) angeordnet sind.
3. Verarbeitungssystem (100) nach Anspruch 1 oder 2, wobei zumindest eine der Kulturkammern (112) eine zellabweisende Beschichtung aufweist.
4. Verarbeitungssystem (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die zumindest eine Kulturkammer (112) an einen Zufuhrkanal (114) zum Zuführen eines oder mehrerer Fluide in die zumindest eine Kulturkammer (112) und/ oder an einen Abfuhrkanal (116) zur Ableitung eines oder mehrerer Fluide aus der zumindest einen Kulturkammer (112) angebunden ist.
5. Verarbeitungssystem (100) nach Anspruch 4, bei dem die Zufuhrkanäle (114) mehrerer Kulturkammern (112) mit einer gemeinsamen Speiseleitung (115) und/ oder die Abfuhrkanäle (116) mehrerer Kulturkammern (112) mit einer gemeinsamen Entnahmeleitung (117) verbunden sind.
6. Verarbeitungssystem (100) nach Anspruch 4 oder 5, wobei der oder die Zufuhrkanäle (114) und/oder der oder die Abfuhrkanäle (117) für eine
Durchströmung eingerichtet ist oder sind, die auf Grundlage einer physiologischen Durchflussgeschwindigkeit bestimmt wird.
7. Verarbeitungssystem (100) nach einem der Ansprüche 4 bis 6, bei dem zumindest einer der Zufuhrkanäle (114) und/ oder der Abfuhrkanäle (117) als ein Mikrofluidikkanal ausgebildet ist.
8. Verarbeitungssystem (100) nach einem der Ansprüche 4 bis 7, bei dem ein Boden (111) zumindest eines überwiegenden Teils der Kulturkammern (112) frei von Zufuhrkanälen (114) und/ oder Abfuhrkanälen (117) ist.
9. Verarbeitungssystem (100) nach einem der Ansprüche 4 bis 8, bei dem der oder die Zufuhrkanäle (114) der wenigstens einen Kulturkammer (112), die einen Zufuhrkanal (112) aufweist, seitlich an die wenigstens eine Kulturkammer (112) herangeführt ist oder sind, wobei der oder die Abfuhrkanäle (116) der wenigstens einen Kulturkammer (112), die einen Abfuhrkanal (116) aufweist, insbesondere gegenüber des oder der Zufuhrkanäle (114) an wenigstens eine andere der
Kulturkammern (112) herangeführt ist oder sind.
10. Verarbeitungssystem (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem ein Boden der zumindest einen Kulturkammer (112) eine Dicke in einem Bereich von 5 bis 300 pm, insbesondere in einem Bereich von 25 bis 170 pm, aufweist.
11. Verarbeitungssystem (100) nach Anspruch 10, bei dem der Boden der zumindest einen Kulturkammer (112) transparent ausgebildet ist.
12. Verarbeitungssystem (100) nach Anspruch 10 oder 11, bei dem der Boden der zumindest einen Kulturkammer (112) Glas oder ein Cycloolefin-Copolymer aufweist.
13. Verfahren (200) zur Verarbeitung in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierter Zellen (10), bei dem die in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen (10) in einer Kultureinheit (110) generiert, verarbeitet, stimuliert und/oder dokumentiert werden, die eine Anzahl von Kulturkammern (112) aufweist, in der die in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen (10) und ein Kulturmedium (20) aufgenommen sind, und bei dem die Generierung, Verarbeitung und/oder Stimulation der in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen (10) unter einem Mikroskop (120) zumindest teilweise nach Maßgabe einer vor der
Generierung, Verarbeitung, Stimulation und/oder Dokumentation definierten Ansteuervorgabe und ohne manuellen Eingriff durchgeführt wird.
14. Verfahren (200) nach Anspruch 13, das eine Einbringung oder Generierung der in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen (10) in zumindest eine der Kulturkammern (122) umfasst, wobei die Generierung, Verarbeitung, Stimulation und/oder Dokumentation der in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen (10) ferner das Zuführen zumindest eines ersten Mediums durch einen
Zufuhrkanal (124) in die zumindest eine Kulturkammer (122) und das Abführen des zumindest einen ersten Mediums oder zumindest eines zweiten Mediums durch einen Abfuhrkanal (122) aus der zumindest einen Kulturkammer (122) umfasst.
15. Verfahren (200) nach Anspruch 14, wobei als das zumindest erste Medium ein Wachstumsmedium aufweist, das insbesondere einen oder mehrere Wirkstoffe, einen oder mehrere Farbstoffe, eine oder mehrere Aufhellungslösungen und/ oder ein oder mehrere andere Stimulantien aufweist.
16. Verfahren (200) nach Anspruch 14 oder 15 wobei das zweite Medium verbrauchtes erstes Medium ist.
17. Verfahren (200) nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei sich die in Form dreidimensionaler Verbünde kultivierten Zellen (10) während der Verarbeitung dauerhaft in derselben Kulturkammer (122) befinden.
18. Verfahren (200) nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei das Zuführen des zumindest einen ersten Mediums und/oder das Abführen des zumindest einen ersten Mediums oder des zumindest eines zweiten Mediums nach Maßgabe einer
Steuervorgabe einer Steuereinheit (130) durchgeführt wird.
19. Computerprogramm, das ein Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18 ausführt, wenn es auf einem Computer, insbesondere in einer Steuereinheit (130) eines Verarbeitungssystems (100) ausgeführt wird.
PCT/EP2020/055984 2019-03-08 2020-03-06 Verarbeitungssystem und verarbeitungsverfahren für in form dreidimensionaler verbünde kultivierte zellen und computerprogramm Ceased WO2020182646A1 (de)

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EP19161697.8 2019-03-08
EP19161697 2019-03-08

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PCT/EP2020/055984 Ceased WO2020182646A1 (de) 2019-03-08 2020-03-06 Verarbeitungssystem und verarbeitungsverfahren für in form dreidimensionaler verbünde kultivierte zellen und computerprogramm

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