WO2020179829A1 - アクチビンａ及び／又はｖｐａを含む、ｎｋｔ細胞培養のための添加剤、及びｎｋｔ細胞の培養方法 - Google Patents

アクチビンａ及び／又はｖｐａを含む、ｎｋｔ細胞培養のための添加剤、及びｎｋｔ細胞の培養方法 Download PDF

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    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]

Definitions

  • the present invention relates to an additive for culturing NKT cells, which contains activin A and/or VPA, and a method for culturing NKT cells.
  • Natural Killer T cells are present in only 0.01 to 0.1% of human peripheral blood T cells, and are extremely difficult to collect and culture.
  • Non-patent documents 1 and 2 It is known to add activin A for culturing T cells (Non-patent documents 1 and 2). It is known to add activin A for culturing mesenchymal cells such as preadipocytes and myocardial fibroblasts (Non-patent Documents 3 and 4). It is known to add activin A to induce the differentiation of hematopoietic progenitor cells from ES cells or iPS cells (Non-patent Documents 5 and 6). In addition, it is known to be used for inducing differentiation of ES cells into endoderm lineage (Non-patent document 7) and used for maintenance culture of ES cells (Non-patent document 8).
  • Non-Patent Document 9 About sodium valproate (VPA), it is generally known as an antiepileptic drug. In addition, it has recently been reported that it can be used to improve the efficiency of iPS cell establishment (Non-Patent Document 9).
  • the present invention is a method for culturing NKT cells, which has hitherto been recognized to be difficult to culture, and is preferably a method capable of proliferating for a long period of time and maintaining or enhancing activity.
  • the task is to search for.
  • activin A and/or VPA can be used as an additive for culturing NKT cells, and have completed the present invention.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • An additive for culturing NKT cells which comprises activin A and / or VPA.
  • a method for culturing NKT cells which comprises a step of culturing in a medium supplemented with activin A and / or VPA.
  • the culture method according to [3] above, wherein the NKT cells are NKT cells that have been isolated from peripheral blood or have been induced to differentiate from stem cells or progenitor cells.
  • the present invention provides a new use of activin A and/or VPA which has hitherto been unknown.
  • the culture additive according to the present invention has an excellent effect of allowing NKT cells to survive for a long period of time, allowing them to proliferate, and maintaining or enhancing the activity.
  • VPA also enhances interferon ⁇ (IFN ⁇ ) production in NKT cells, it can be expected to prolong the survival period of cancer patients administered with NKT cells cultured according to the present invention (Non-Patent Document 10).
  • FIG. 1 shows an embodiment of a scheme from the establishment of iPS cells to the purified culture of iPS-NKT cells.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of changes in cell number obtained by the method for culturing NKT cells according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of changes in cell number and IFN ⁇ production ability, which were obtained by the method for culturing NKT cells according to one embodiment of the present invention.
  • the present invention provides an additive for culturing NKT cells, which contains activin A and/or VPA, and a method for culturing NKT cells.
  • Activin A in the present invention is a cytokine classified into the TGF- ⁇ family, and refers to a homodimer in which two amino acid chains of 116 to 117 are bound.
  • VPA in the present invention refers to sodium valproate, but may be a free form or other salt.
  • the NKT cells in the present invention refer to natural killer T cells, particularly NKT cells isolated from peripheral blood or induced to differentiate from stem cells or progenitor cells.
  • Examples of NKT cells differentiated from stem cells include NKT cells differentiated from ES cells or iPS cells.
  • the present invention provides a method for culturing NKT cells, which comprises a step of culturing in a medium supplemented with activin A and/or VPA.
  • iPS-NKT cells are obtained by primary induction from iPS cells to hematopoietic stem cells, secondary induction to iPS-NKT cells, and then purification culture of iPS-NKT cells.
  • the concentration of Activin A added to the medium may be 5 ng to 100 ng/ml, preferably 10 ng to 50 ng/ml.
  • the concentration at which VPA is added to the medium may be 3.9 to 250 ⁇ M, preferably 15.6 to 250 ⁇ M.
  • activin A may be continuously present in the medium from the first day of the purification culture of iPS-NKT cells to the end of the purification culture.
  • activin A may be continuously present in the medium from the first day of the culture for the second induction of iPS-NKT cells to the end of the purification culture.
  • VPA may be present in the medium from the first day of the purified culture of iPS-NKT cells to the end of the purified culture, preferably from the 7th day of the purified culture to the end of the purified culture.
  • VPA may be allowed to be present in the medium from the first day of the culture for the second induction of iPS-NKT cells to the end of the purification culture.
  • activin A or VPA may be added alone, both may be added simultaneously, or activin A may be added first and then VPA may be added. Activin A may be added after adding VPA. Since VPA enhances IFN ⁇ production, it is preferable to add activin A first and then add VPA.
  • NKT cells by pretreating or culturing NKT cells with VPA, NKT cells can be activated in the body of a patient in need of activating NKT cells, for example, a cancer patient.
  • Example 1 Establishment of iPS-NKT cells iPS-NKT cells were established by the method described in the literature (Non-patent document 11: Yamada et al., Stem cell, 34: 2852-2860, 2016). The scheme from the establishment of iPS cells to the purified culture of iPS-NKT cells is shown in FIG. Specifically, as shown in FIG. 1, iPS cells were allowed to form colonies (day -8 to -5), and primary induction into hematopoietic stem cells (day 0 to 13) was performed. Secondary induction into cells (day 13-33) and purified culture of iPS-NKT cells (day 33-40 or 54).
  • composition of basic medium Using a 12-well culture plate, the culture was started (day 0) at an initial seeding amount of 2.5 ⁇ 10 5 /ml/well. 0.5 ml of medium was added on the 3rd and 5th days from the start of the culture, and 1 ml was added on the 7th and 10th days. From the 12th day, 1 ml of the medium was replaced every 2 days, and the culture was continued until the 21st day.
  • a basic medium was prepared by adding human IL7 (final 5 ng/ml) and IL15 (final 10 ng/ml) to ⁇ MEM supplemented with 20% bovine serum.
  • Example 2 Purified culture of iPS-NKT cells in culture medium supplemented with various concentrations of activin A (1 to 100 ng/ml) To the basal medium prepared in Example 1, 1 to 100 ng of activin A was added, and the iPS-NKT cells prepared in Example 1 were purified and cultured. Activin A was added to the purified culture on the first day (33 days after the induction of hematopoietic stem cells) and then for 2 weeks (up to 54 days after the induction of hematopoietic stem cells) (37° C., 5% carbon dioxide) to determine the cell number. The changes were recorded over time. The results are shown in Figure 2.
  • Example 3 Purified culture of iPS-NKT cells in culture medium supplemented with various concentrations of VPA (3.9 to 1000 ⁇ M) 3.9 to 1000 ⁇ M VPA was added to the basal medium prepared in Example 1, and the iPS-NKT cells prepared in Example 1 were purified and cultured. VPA was cultured for 1 week (up to 40 days after induction of hematopoietic stem cells) on the first day of purification culture (33 days after induction of hematopoietic stem cells), and the number of cells changed. And the IFN ⁇ productivity was recorded. The results are shown in Fig. 3. From the results, it was confirmed that the addition of VPA increases the number of iPS-NKT cells from the first day of the purification culture to more than 1 week.
  • VPA 3.9 to 1000 ⁇ M

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Abstract

本発明は、アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを含む、ＮＫＴ細胞培養のための添加剤を提供する。本発明は、アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを添加した培地で培養する工程を含む、ＮＫＴ細胞の培養方法も提供する。

Description

アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを含む、ＮＫＴ細胞培養のための添加剤、及びＮＫＴ細胞の培養方法
　本発明は、アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを含む、ＮＫＴ細胞培養のための添加剤、及びＮＫＴ細胞の培養方法に関する。
　ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）細胞は、ヒト末梢血Ｔ細胞のうち０．０１～０．１％しか存在せず、採取・培養が極めて困難な細胞である。
　アクチビンＡをＴ細胞の培養のために添加することは知られている（非特許文献１及び２）。アクチビンＡを脂肪前駆細胞や心筋線維芽細胞といった間葉系細胞の培養のために添加することは知られている（非特許文献３及び４）。ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から血球系前駆細胞を分化誘導するためにアクチビンＡを添加することは知られている（非特許文献５および６）。その他、ＥＳ細胞から内胚葉系へ分化誘導する際に使用することや（非特許文献７）、ＥＳ細胞を維持培養する際に使用することが知られている（非特許文献８）。
　バルプロ酸ナトリウム（ＶＰＡ）については、一般的には、抗てんかん薬として知られる。また、最近ｉＰＳ細胞樹立効率の向上のために使用できることが報告されている（非特許文献９）。
　よって、アクチビンＡについても、ＶＰＡについても、ＮＫＴ細胞の機能修飾のために細胞培養培地へ添加することは知られていない。
Huber et al., The Journal of Immunology, 182: 4633-4640, 2009 Locci et al., Nature Immunology, 17: 976-986, 2016 Zagarosi et al., Diabetes, 59: 2513-2521, 2010 Hu et al., European Journal of Pharmacology, 789: 319-327, 2016 Kennedy et al., Cell Reports, 2: 1722-1735, 2012 Cerdan et al., Stem Cells and development, 21: 2866-2877, 2012 Wang et al., Biotechnol Lett, 37: 1711-1717, 2015 Beattie et al., Stem Cell, 23: 489-195, 2005 Huangfu et al., Nature Biotechnology, 26: 1269-1275, 2008 Fujii et al., Front Immunol, 4: 409, 2013 Yamada et al., Stem cell, 34: 2852-2860, 2016
　本発明は、従来、培養が困難であると認識されていた、ＮＫＴ細胞を培養するための方法であって、好ましくは長期間、増殖させることができ、活性を維持又は増強することができる方法を探索することを課題とする。
　本発明者らは鋭意研究の末、アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを、ＮＫＴ細胞培養のための添加剤として使用することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明の要旨は、以下である。
［１］アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを含む、ＮＫＴ細胞培養のための添加剤。
［２］ＮＫＴ細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞である、上記［１］記載の添加剤。
［３］アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを添加した培地で培養する工程を含む、ＮＫＴ細胞の培養方法。
［４］ＮＫＴ細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞である、上記［３］記載の培養方法。
［５］培地におけるアクチビンＡの濃度が、５～１００ｎｇ／ｍｌである、上記［４］記載の培養方法。
［６］培地におけるＶＰＡの濃度が、３．９～２５０μＭである、上記［４］記載の培養方法。
　本発明により、従来には知られていなかった、アクチビンＡ及び／又はＶＰＡの新たな用途が提供される。本発明による培養添加剤は、ＮＫＴ細胞を、長期間、生存させることができ、また増殖させ、活性を維持又は増強させるという、優れた効果を有する。特に、ＶＰＡはＮＫＴ細胞のインターフェロンγ（ＩＦＮγ）産生も増強することから、本発明により培養されたＮＫＴ細胞を投与されたガン患者の生存期間を延長することが期待できる（非特許文献１０）。
図１は、ｉＰＳ細胞の樹立から、ｉＰＳ－ＮＫＴ細胞の純化培養までのスキームの一実施態様を示す。 図２は、本発明の一実施態様であるＮＫＴ細胞の培養方法により得られた、細胞数の変化の結果を示す図である。 図３は、本発明の一実施態様であるＮＫＴ細胞の培養方法により得られた、細胞数の変化とＩＦＮγの産生能の結果を示す図である。
　本発明は、アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを含む、ＮＫＴ細胞培養のための添加剤、及びＮＫＴ細胞の培養方法を提供する。
　本発明におけるアクチビンＡとは、ＴＧＦ－βファミリーに分類されるサイトカインであって、１１６～１１７のアミノ酸鎖が２本結合したホモダイマーをいう。
　本発明におけるＶＰＡとは、バルプロ酸ナトリウムをいうが、遊離体及びその他の塩であってもよい。
　本発明におけるＮＫＴ細胞とは、ナチュラルキラーＴ細胞をいい、特には末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞をいう。幹細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞としては、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞が挙げられる。
　本発明は、アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを添加した培地で培養する工程を含む、ＮＫＴ細胞の培養方法を提供する。
　典型的には、ｉＰＳ－ＮＫＴ細胞は、ｉＰＳ細胞から造血幹細胞へ１次誘導させたのち、ｉＰＳ－ＮＫＴ細胞へ２次誘導させ、そののちｉＰＳ－ＮＫＴ細胞を純化培養することにより、得られる。
　アクチビンＡを培地に添加する濃度は、５ｎｇ～１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ～５０ｎｇ／ｍｌであればよい。
　ＶＰＡを培地に添加する濃度は、３．９～２５０μＭ、好ましくは１５．６～２５０μＭであればよい。
　本発明によるＮＫＴ細胞の培養方法では、アクチビンＡはｉＰＳ－ＮＫＴ細胞の純化培養の初日～純化培養終了まで培地に継続的に存在すればよい。
　本発明によるＮＫＴ細胞の培養方法では、アクチビンＡをｉＰＳ－ＮＫＴ細胞への２次誘導の培養初日～純化培養終了まで継続的に培地に存在させてもよい。
　本発明によるＮＫＴ細胞の培養方法では、ＶＰＡをｉＰＳ－ＮＫＴ細胞の純化培養の初日～純化培養終了まで、好ましくは純化培養の７日目～純化培養終了まで培地に存在させればよい。
　本発明によるＮＫＴ細胞の培養方法では、ＶＰＡをｉＰＳ－ＮＫＴ細胞への２次誘導の培養初日～純化培養終了まで培地に存在させてもよい。
　本発明によるＮＫＴ細胞の培養方法では、アクチビンＡ又はＶＰＡを単独で添加してもよく、両者を同時に添加してもよく、アクチビンＡを先に添加したのちにＶＰＡを添加してもよく、またＶＰＡを添加したのちにアクチビンＡを添加してもよい。ＶＰＡはＩＦＮγの産生を増強することから、アクチビンＡを先に添加したのちにＶＰＡを添加することが、好ましい。
　本発明によれば、ＶＰＡでＮＫＴ細胞を前処理又は培養することにより、ＮＫＴ細胞を活性化することを必要とする患者、例えばガン患者の体内においてＮＫＴ細胞を活性化できる。
実施例１　ｉＰＳ－ＮＫＴ細胞の樹立
　ｉＰＳ－ＮＫＴ細胞は文献（非特許文献１１：Yamada et al., Stem cell, 34: 2852-2860, 2016）に記載される方法により樹立した。ｉＰＳ細胞の樹立からｉＰＳ－ＮＫＴ細胞の純化培養までのスキームを、図１に示す。
　具体的には、図１に示されるように、ｉＰＳ細胞にコロニーを形成させ（－８～－５日目）、造血幹細胞への１次誘導をし（０～１３日目）、ｉＰＳ－ＮＫＴ細胞への２次誘導をし（１３～３３日目）、そしてｉＰＳ－ＮＫＴ細胞の純化培養をした（３３～４０又は５４日目）。
（基本培地の組成）
　１２ウェルの培養プレートを用い、初期播種量２．５×１０５／１ｍｌ／ウェルで培養開始（０日目）した。培養開始から３日目および５日目に培地０．５ｍｌを追加し、７日目および１０日目に１ｍｌを追加した。１２日目からは培地１ｍｌを２日ごとに交換し、２１日目まで培養を継続した。２０％ウシ血清添加αＭＥＭにヒトＩＬ７ (最終５ｎｇ／ｍｌ) およびＩＬ１５(最終１０ｎｇ／ｍｌ) を添加したものを基本培地とした。
実施例２　様々な濃度のアクチビンＡを添加した培養液におけるｉＰＳ－ＮＫＴ細胞の純化培養（１～１００ｎｇ／ｍｌ）
　実施例１で調製した基本培地に対して、１～１００ｎｇのアクチビンＡを添加し、実施例１で調製したｉＰＳ－ＮＫＴ細胞を純化培養した。
　アクチビンＡは、純化培養の初日（造血幹細胞の誘導から３３日目）に加え、その後２週間（造血幹細胞の誘導から５４日目まで）培養し（３７℃・５％炭酸ガス）、細胞数の変化を経時的に記録した。結果を、図２に示す。
　結果から、アクチビンＡの添加により、純化培養の初日から２週間を超えるまで、ｉＰＳ－ＮＫＴ細胞の数は増大し続けることが確認された。
　また、アクチビンＡの添加量が、培養液に対して５ｎｇ／ｍｌ以上である場合に、特には１０ｎｇ～５０ｎｇ／ｍｌである場合に、細胞増殖の効果は、格別に優れていることが確認された。
　本実施例で増殖したｉＰＳ－ＮＫＴ細胞は、その標的細胞傷害活性を維持していた。
実施例３　様々な濃度のＶＰＡを添加した培養液におけるｉＰＳ－ＮＫＴ細胞の純化培養（３．９～１０００μＭ）
　実施例１で調整した基本培地に対して、３．９～１０００μＭのＶＰＡを添加し、実施例１で調製したｉＰＳ－ＮＫＴ細胞を純化培養した。
　ＶＰＡは、純化培養の初日（造血幹細胞の誘導から３３日目）に加え、その後１週間（造血幹細胞の誘導から４０日目まで）培養し（３７℃・５％炭酸ガス）、細胞数の変化とＩＦＮγの産生能を記録した。結果を、図３に示す。
　結果から、ＶＰＡの添加により、純化培養の初日から１週間を超えるまで、ｉＰＳ－ＮＫＴ細胞の数を増大させることが確認された。また、比較的高濃度のＶＰＡの添加により、ＩＦＮγの産生能が上昇することが確認された。
　ＶＰＡの添加量が、培養液に対して３．９μＭ～２５０μＭである場合に、細胞増殖の効果は格別に優れていることが確認され、培養液に対して１５．６μＭ～２５０μＭである場合に、ＩＦＮγの産生能が格別に優れていることが確認された。

Claims (6)

  1. 　アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを含む、ＮＫＴ細胞培養のための添加剤。
  2. 　ＮＫＴ細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞である、請求項１記載の添加剤。
  3. 　アクチビンＡ及び／又はＶＰＡを添加した培地で培養する工程を含む、ＮＫＴ細胞の培養方法。
  4. 　ＮＫＴ細胞が、末梢血から分離されるか、幹細胞又は前駆細胞から分化誘導されたＮＫＴ細胞である、請求項３記載の培養方法。
  5. 　培地におけるアクチビンＡの濃度が、５～１００ｎｇ／ｍｌである、請求項４記載の培養方法。
  6. 　培地におけるＶＰＡの濃度が、３．９～２５０μＭである、請求項４記載の培養方法。
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