WO2020158260A1 - Method and system for examining atrial arrhythmias - Google Patents

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哲郎 笹野
哲史 古川
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Abstract

The problem to be solved by the present invention is to provide a method for examining atrial arrhythmias for diagnosing atrial arrhythmias or predicting the onset thereof and an examination system therefor.　The method for examining atrial arrhythmias according to the present invention, which is for diagnosing atrial arrhythmias or predicting the onset thereof, is characterized by comprising a step for quantitating at least one microRNA (hereinafter referred to as "miRNA") which is selected from four miRNAs including miR-99a-5p, miR-192-5p, miR-214-3p and miR-342-5p, among miRNAs contained in a non-cellular biological liquid obtained from a subject, or at least one miRNA which has a base sequence wherein at least six bases are the same as the bases in the sequence consisting of seven bases at the 2nd to 8th positions in at least one of the aforesaid four miRNAs or which possesses the same target gene as at least one of the four miRNAs.

Description

心房性不整脈検査方法及び心房性不整脈検査システムAtrial arrhythmia inspection method and atrial arrhythmia inspection system
　本発明は、心房性不整脈検査方法及び心房性不整脈検査システムに関する。より詳しくは、心房性不整脈の診断又は発症を予測するための心房性不整脈検査方法及び検査システムに関する。 The present invention relates to an atrial arrhythmia examination method and an atrial arrhythmia examination system. More particularly, it relates to an atrial arrhythmia examination method and examination system for diagnosing or predicting the onset of atrial arrhythmia.
　心房性不整脈のうち、例えば心房細動は、患者数の多い持続性不整脈の一つであり、加齢に伴って発症頻度が高くなるため、社会の高齢化に伴って今後患者数はさらに増加すると考えられている。
　心房細動は発作性として始まり、徐々に慢性化するという経過をとる。心房細動の診断は心電図検査で可能であるが、発作性の場合は発作時の心電図が必要である。動悸などの自覚症状があったとしても、動悸発作時の心電図がなければ心房細動とは診断できない。
　また、心房細動の約３分の１は自覚症状がないと報告されており、この場合は、健康診断などの心電図検査で偶然発見される以外には診断されることはない。つまり、本当は心房細動を持っているのに、診断されてない人は相当数いると考えられている。 Of the atrial arrhythmias, for example, atrial fibrillation is one of the persistent arrhythmias with a large number of patients, and since the frequency of onset increases with age, the number of patients will further increase with the aging of society. Is believed to be.
Atrial fibrillation begins as paroxysmal and gradually becomes chronic. Atrial fibrillation can be diagnosed by electrocardiography, but if it is paroxysmal, an electrocardiogram at the time of the attack is required. Even if there are subjective symptoms such as palpitation, atrial fibrillation cannot be diagnosed without an electrocardiogram at the time of the palpitation attack.
In addition, about one-third of atrial fibrillation has been reported to have no subjective symptom, and in this case, it is not diagnosed except by accidental finding in electrocardiogram examination such as physical examination. In other words, it is believed that there are a considerable number of people who have atrial fibrillation but who have not been diagnosed.
　心房細動の重大な合併症として、心臓でできた血栓が脳に飛んでいき血管を閉塞する心原性脳梗塞がある。心原性脳梗塞は、重症例が多く、死亡あるいは重度の後遺症を残すことが多いと報告されている。心房細動と診断されると、脳梗塞のリスクを考えて脳梗塞の予防治療を行うが、心房細動と診断されていない人には当然ながら治療は行われず、脳梗塞を発症したのちに心房細動だったと判明することも珍しくはない。このため、発作中でなくても心房細動の有無を診断できるような簡便な検査が求められている。 A serious complication of atrial fibrillation is a cardiogenic cerebral infarction in which a blood clot formed by the heart flies to the brain and blocks blood vessels. It has been reported that cardiogenic cerebral infarction has many serious cases and often causes death or severe aftereffects. When atrial fibrillation is diagnosed, preventive treatment of cerebral infarction is performed considering the risk of cerebral infarction, but of course, those who have not been diagnosed with atrial fibrillation are not treated, and after the onset of cerebral infarction. It is not uncommon to find out that it was atrial fibrillation. Therefore, there is a demand for a simple test capable of diagnosing the presence or absence of atrial fibrillation even during a stroke.
　一方、体液中、例えば血中には、調節機能を有するマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ：以下において、「ｍｉＲＮＡ」とも略記する。）が、安定な状態で存在することが多数の研究で実証されており、これらの細胞外ｍｉＲＮＡの分布は癌を含む様々な病態に影響されることが示されている。 On the other hand, it has been proved in many studies that microRNA (microRNA: hereinafter also abbreviated as “miRNA”) having a regulatory function exists in a stable state in body fluids such as blood. The distribution of these extracellular miRNAs has been shown to be affected by various pathological conditions, including cancer.
　ｍｉＲＮＡは、塩基長１９－２５の短鎖の非翻訳性（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ）ＲＮＡであり、主として細胞質においてメッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ：「ｍＲＮＡ」とも略記する。）に結合して主にその翻訳を抑制することにより、標的タンパク（遺伝子）の発現量を調節することで生命活動に関与している。 miRNA is a short-chain non-coding RNA having a base length of 19 to 25, and mainly binds to messenger RNA (abbreviated as “mRNA”) in the cytoplasm to mainly perform its translation. By suppressing it, it regulates the expression level of the target protein (gene) and is involved in life activity.
　ｍｉＲＮＡは、エクソソームに含まれた状態あるいはタンパクやＨＤＬコレステロールと結合した状態で細胞外に放出され、血中でも安定した状態で循環することが知られている。すなわち、ｍｉＲＮＡは、細胞内のみならず多くの体液中に存在し、個体発生、細胞増殖・分化、アポトーシス、腫瘍化等に関与しており、したがって、細胞内で重要な調節機能を持ち、細胞外環境では安定であるため、特に血中の循環ｍｉＲＮＡ等の解析・応用は新規バイオマーカーや診断・治療法の開発につながると大いに期待されている。 It is known that miRNA is released extracellularly in a state of being contained in exosomes or bound to proteins and HDL cholesterol, and circulates in a stable state even in blood. That is, miRNA is present not only in cells but also in many body fluids, and is involved in ontogeny, cell proliferation/differentiation, apoptosis, tumorigenesis, etc., and thus has an important regulatory function in cells and Since it is stable in the external environment, it is highly expected that analysis and application of circulating miRNA and the like in blood will lead to the development of new biomarkers and diagnostic and therapeutic methods.
　近年、多くの疾患において、ｍｉＲＮＡが病態に深く関与していることが明らかにされており、心房細動とｍｉＲＮＡの関連についても、動物モデルを用いた検討や、血液中のｍｉＲＮＡをバイオマーカーとして心房細動との関連をみた検討などが行われている（例えば非特許文献１及び同文献中に紹介されている非特許文献２～６を参照。）。現在までに明らかになっている心房細動とｍｉＲＮＡの関連は、（１）ｍｉＲＮＡによるイオンチャネルの発現制御、及び（２）ｍｉＲＮＡによる線維化シグナルの制御、を中心に検討されている。例えば、ＩＫ１チャネルやギャップジャンクションチャネルを制御するｍｉＲ－１の減少（非特許文献２）、同様にＩＫ１チャネルを制御するｍｉＲ－２６の減少（非特許文献３）、ｍｉＲ－３２８の発現増強によるＬ型Ｃａチャネルの抑制（非特許文献４）などはｍｉＲＮＡによる電気生理学的変化を報告しており、コラーゲンやフィブリンを抑制するｍｉＲ－２９の発現低下や（非特許文献５）、イヌ心房細動モデルにおける線維化抑制ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－３０、１３３の発現低下（非特許文献６）などが報告されている。しかし、心房の炎症に焦点をあててマイクロＲＮＡの関与をみた研究は少ない。 Recently, it has been clarified that miRNAs are deeply involved in pathological conditions in many diseases, and the relationship between atrial fibrillation and miRNAs was examined using animal models and miRNAs in blood were used as biomarkers. Studies have been conducted in view of the relationship with atrial fibrillation (see, for example, Non-Patent Document 1 and Non-Patent Documents 2 to 6 introduced therein). The relationship between atrial fibrillation and miRNA, which has been clarified to date, has been studied mainly on (1) regulation of ion channel expression by miRNA and (2) regulation of fibrosis signal by miRNA. For example, reduction of miR-1 that controls I K1 channel and gap junction channel (Non-patent document 2), reduction of miR-26 that similarly controls I K1 channel (Non-patent document 3), and enhanced expression of miR-328. Inhibition of L-type Ca channel by Escherichia coli (Non-patent document 4) and the like have reported electrophysiological changes by miRNA, and decreased expression of miR-29 that suppresses collagen and fibrin (Non-patent document 5), and dog atrial thinning. It has been reported that the expression of miR-30, 133 which is a fibrosis-suppressing miRNA in a dynamic model is reduced (Non-patent document 6). However, few studies have focused on the inflammation of the atrium to see the involvement of microRNAs.
　また、ｍｉＲＮＡについては、これまでに数千種類のｍｉＲＮＡが存在すること等が報告されており、それらのうち、動物の実験モデルなどで心房性不整脈の病態に関係するｍｉＲＮＡの存在も発見或いは同定され、特許文献としても、若干報告がなされている（例えば特許文献１～３参照）。 With regard to miRNAs, it has been reported that thousands of types of miRNAs have existed so far, and among them, the presence or absence of miRNAs related to the pathological condition of atrial arrhythmia has been found or identified in experimental models of animals. As a patent document, some reports have been made (for example, see Patent Documents 1 to 3).
　しかしながら、実験的研究において同定されたｍｉＲＮＡのうち、どのようなｍｉＲＮＡが心房細動等の心房性不整脈の発症を予測するための診断的バイオマーカーとして有効に機能するかは未だ不明であった。
　したがって、上記のような状況を背景として、心房性不整脈、特に心房細動発症に関連するｍｉＲＮＡの同定と心房細動発症の予測方法の開発が強く望まれている。 However, of the miRNAs identified in the experimental studies, it was not yet clear what miRNA effectively functions as a diagnostic biomarker for predicting the onset of atrial arrhythmia such as atrial fibrillation.
Therefore, against the background of the above situation, there is a strong demand for the identification of miRNAs related to the development of atrial arrhythmia, particularly atrial fibrillation, and the development of a method for predicting the development of atrial fibrillation.
米国特許第２０１６/０１０８４３１号明細書U.S. Patent No. 2016/0108431 米国特許第２０１５/０２９９７０２号明細書U.S. Patent No. 2015/0299702 特表２０１５－５１６１５４号公報Japanese Patent Publication No. 2015-516154
　本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、心房性不整脈の診断又は発症を予測するための心房性不整脈検査方法及び検査システムを提供することである。 The present invention has been made in view of the above problems and circumstances, and a problem to be solved is to provide an atrial arrhythmia examination method and examination system for diagnosing or predicting the onset of atrial arrhythmia.
　本発明者は、上記課題を解決すべく、心房性不整脈の発症に関連するｍｉＲＮＡを発見・同定をすべく非常に数多くのｍｉＲＮＡを対象とするスクリーニングテストを行う過程において、心房性不整脈の発症に関連するｍｉＲＮＡを新たに見出したことにより本発明に至った。
　すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。 MEANS TO SOLVE THE PROBLEM In order to solve the said subject, in order to discover and identify miRNA relevant to onset of atrial arrhythmia, in the process of performing the screening test which targets many miRNAs, atrial arrhythmia is developed. The present invention has been accomplished by newly finding a related miRNA.
That is, the above-mentioned subject concerning the present invention is solved by the following means.
　１．心房性不整脈の診断又は発症を予測するための心房性不整脈検査方法であって、
　被験者から得られる非細胞性生体液中に含まれるマイクロＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」という。）のうちの、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、及びｍｉＲ－３４２－５ｐの４種のうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡを定量する工程を含む心房性不整脈検査方法。 1. An atrial arrhythmia test method for predicting the diagnosis or onset of atrial arrhythmia,
MiR-99a-5p, miR-192-5p, miR-214-3p, and miR-342 of microRNAs (hereinafter referred to as "miRNAs") contained in acellular biological fluid obtained from a subject A target gene which is the same as or more than 6 base sequences out of the 2nd to 8th 7 base sequences and at least one miRNA of at least one of 4 types of 5p or the same target gene A method for examining atrial arrhythmia, which comprises a step of quantifying at least one miRNA among the miRNAs that the miRNA has.
　２．前記ｍｉＲＮＡを定量する工程において、前記４種のｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種を含む複数種のｍｉＲＮＡを定量する第１項に記載の心房性不整脈検査方法。 2. In the step of quantifying the miRNA, at least one of the four miRNAs or at least one miRNA of the four miRNAs is identical to the second to eighth seventh base sequences in 6 or more base sequences. The method for testing atrial arrhythmia according to item 1, wherein a plurality of miRNAs including at least one of the miRNAs having the same or the same target gene is quantified.
　３．前記ｍｉＲＮＡの定量を測定する工程において、前記４種のｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種を含む複数種のｍｉＲＮＡを組み合わせて構成される診断パネルに含まれる各ｍｉＲＮＡについて定量する第１項又は第２項に記載の心房性不整脈検査方法。 3. In the step of measuring the quantification of the miRNA, at least one of the four miRNAs or at least one miRNA of the four miRNAs and 6 or more nucleotide sequences of the second to eighth 7 nucleotide sequences are Item 3. The method according to item 1 or item 2, wherein quantification is performed for each miRNA included in a diagnostic panel configured by combining a plurality of types of miRNAs containing at least one type of miRNAs having the same or the same target gene. Atrial arrhythmia test method.
　４．前記非細胞性生体液が、血液である第１項から第３項までのいずれか一項に記載の心房性不整脈検査方法。 4. The atrial arrhythmia examination method according to any one of items 1 to 3, wherein the non-cellular biological fluid is blood.
　５．前記心房性不整脈が、心房細動である第１項から第４項までのいずれか一項に記載の心房性不整脈検査方法。 5. The atrial arrhythmia examination method according to any one of items 1 to 4, wherein the atrial arrhythmia is atrial fibrillation.
　６．少なくとも下記工程（１）～（４）を含む第１項から第５項までのいずれか一項に記載の心房性不整脈検査方法。
　（１）血液を採血し、血漿又は血清を分離して採取する工程
　（２）前記血漿又は前記血清からＲＮＡを分離・抽出する工程
　（３）前記分離・抽出された前記ＲＮＡのうち、前記４種のうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡを定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（以下、「定量的ＲＴ－ＰＣＲ法」という。）により測定をする工程
　（４）前記定量的ＲＴ－ＰＣＲ法による測定で得られたデータについて統計解析をする工程 6. 6. The atrial arrhythmia examination method according to any one of items 1 to 5, which includes at least the following steps (1) to (4).
(1) A step of collecting blood and separating and collecting plasma or serum (2) A step of separating/extracting RNA from the plasma or the serum (3) Of the separated/extracted RNA, the above-mentioned 4 Among miRNAs in which at least one of the four species or at least one of the four species is the same as or more than 6 nucleotide sequences of the 7th nucleotide sequence of the 2nd to 8th or having the same target gene Of at least one miRNA of (1) by a quantitative reverse transcription polymerase chain reaction method (hereinafter, referred to as “quantitative RT-PCR method”) (4) Obtained by the quantitative RT-PCR method Process of statistical analysis of data
　７．心房性不整脈の診断又は発症を予測するための心房性不整脈検査システムであって、
　少なくとも、被験者から得られる非細胞性生体液中に含まれるｍｉＲＮＡのうち、心房性不整脈に関連するｍｉＲＮＡの定量を含む測定データ及び解析データの入出力部と、
　入力された測定データの統計解析部と、を具備する
心房性不整脈検査システム。 7. An atrial arrhythmia test system for diagnosing or predicting atrial arrhythmia,
At least, an input/output unit of measurement data and analysis data including quantification of miRNA related to atrial arrhythmia among miRNAs contained in acellular biological fluid obtained from a subject,
An atrial arrhythmia examination system comprising: a statistical analysis unit of input measurement data.
　８．さらに、ｍｉＲＮＡの定量測定部を具備している第７項に記載の心房性不整脈検査システム。 8. Furthermore, the atrial arrhythmia test system according to Item 7, further comprising a quantitative measurement unit for miRNA.
　９．前記心房性不整脈に関連するｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、及びｍｉＲ－３４２－５ｐの４種のうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡである第７項又は第８項に記載の心房性不整脈検査システム。 9. The atrial arrhythmia-related miRNA is at least one of four types of miR-99a-5p, miR-192-5p, miR-214-3p, and miR-342-5p, or among the four types. Item 7 or 8 wherein at least one miRNA has the same 6-or more nucleotide sequence out of the 2nd to 8th 7-nucleotide sequences or is at least one miRNA among miRNAs having the same target gene Atrial arrhythmia examination system according to paragraph.
　１０．第１項から第６項までのいずれか一項に記載の心房性不整脈検査方法を実施するための検査システムである第７項から第９項までのいずれか一項に記載の心房性不整脈検査システム。 10. The atrial arrhythmia test according to any one of items 7 to 9, which is a test system for performing the atrial arrhythmia test method according to any one of items 1 to 6. system.
　本発明の手段により、心房性不整脈の診断又は発症を予測するための心房性不整脈検査方法及び心房性不整脈検査システムを提供することができる。
　本発明に係る４種のｍｉＲＮＡの発現機構又は作用機構については、十分には解明されていないが、本発明は下記のような広範なｍｉＲＮＡを対象とした本発明者等のスクリーニングテストの経緯及び結果を踏まえてなされたものである。 The means of the present invention can provide an atrial arrhythmia examination method and an atrial arrhythmia examination system for diagnosing or predicting the onset of atrial arrhythmia.
Although the expression mechanism or action mechanism of the four types of miRNA according to the present invention has not been sufficiently elucidated, the present invention provides the following background of the screening test conducted by the present inventors against a wide range of miRNAs. It was done based on the results.
　すなわち、１０名の心房細動患者（「ＡＦ患者」）と５名の非心房細動患者（健常者；「非ＡＦ患者」）の血清及び６例のＡＦモデルマウスと３例の対照マウスの心房組織を用いてそれぞれ７３３種類及び６７２種類のｍｉＲＮＡの網羅的解析を行い、ヒトとマウスの両者で発現が確認され、ＡＦ患者・ＡＦモデルマウスで発現が変化したｍｉＲＮＡを探索した。当該網羅的解析では、１１種の候補ｍｉＲＮＡが同定された。 That is, the sera of 10 atrial fibrillation patients (“AF patients”) and 5 non-atrial fibrillation patients (healthy subjects; “non-AF patients”) and 6 AF model mice and 3 control mice were used. 733 and 672 types of miRNAs were comprehensively analyzed using atrial tissue, and expression was confirmed in both humans and mice, and miRNAs with altered expression in AF patients and AF model mice were searched for. The comprehensive analysis identified 11 candidate miRNAs.
　次に、前記網羅的解析から得た候補ｍｉＲＮＡ及び先行研究でＡＦとの関連が報告された３種のｍｉＲＮＡについて、ＡＦ患者６０名（発作性ＡＦグループ・慢性ＡＦグループ各３０名）、非ＡＦ患者５５名（年齢適合対照グループ群３０名・若年健常者グループ各２５名）を対象に個別に定量的ＲＴ－ＰＣＲを行い、血清中のｍｉＲＮＡを定量した。
　このようなスクリーニングを経て、本発明に係るｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、及びｍｉＲ－３４２－５ｐの４種のｍｉＲＮＡが心房性不整脈のバイオマーカーとして有効であることを見出し、本発明に至った。 Next, with respect to the candidate miRNAs obtained from the comprehensive analysis and three miRNAs reported to be associated with AF in a previous study, 60 AF patients (30 in the seizure AF group and 30 in the chronic AF group), non-AF Quantitative RT-PCR was performed individually for 55 patients (30 in the age-matched control group, 25 in each group of healthy young people) to quantify the miRNA in serum.
Through such screening, four miRNAs of the present invention, miR-99a-5p, miR-192-5p, miR-214-3p, and miR-342-5p, are effective as biomarkers for atrial arrhythmia. It was found that there is, and the present invention has been completed.
　なお、スクリーニングテスト等の詳細については、本発明者及び共同研究者の研究報告（Ｎａｔｓｕｍｅ　Ｙ，　Ｏａｋｕ　Ｋ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｗ，Ｏｏｎｏ　Ａ，Ｈａｍａｄａ　Ｓ，Ｙａｍａｚｏｅ　Ｍ，Ｉｈａｒａ　Ｋ，ＳａｓａｋｉＴ，Ｇｏｙａ　Ｍ，　Ｈｉｒａｏ　Ｋ，Ｆｕｒｕｋａｗａ　Ｔ，Ｓａｓａｎｏ　Ｔ．
　Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｓａｍｐｌｅｓ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　Ｎｏｖｅｌ　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ　ａｓ　Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　Ａｔｒｉａｌ　Ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ．　Ｃｉｒｃ　Ｊ．　２０１８　Ｍａｒ　２３；８２（４）：９６５－９７３．；以下において「非特許文献７」と称する。）を参照。 For details of the screening test and the like, research reports by the present inventor and collaborators (Natsume Y, Oaku K, Takahashi K, Nakamura W, Oono A, Hamada S, Yamazoe M, Ihara K, Sasaki T, Gaki, Taki. Hirao K, Furukawa T, Sasano T.;
Combined Analysis of Human and Experimental Murine Samples Identified Novel Circulating MicroRNAs as Biomarkers for Atrial Fibration. Circ J. 2018 Mar 23;82(4):965-973. Hereinafter referred to as "Non-Patent Document 7". ).
心房性不整脈検査システムの全体構成の一例を示す図The figure which shows an example of the whole structure of the atrial arrhythmia inspection system. 心房性不整脈検査システムの細部の構成の一例を示す図The figure which shows an example of the detailed structure of the atrial arrhythmia inspection system. 心房細動患者（ＡＦ）グループと非心房細動患者（健常者；Ｎｏｎ－ＡＦ）グループにおいて検出されたｍｉＲＮＡの相対的定量結果の相違を示す図The figure which shows the difference in the relative quantification result of miRNA detected in the atrial fibrillation patient (AF) group and the non-atrial fibrillation patient (healthy person; Non-AF) group. 非ＡＦ患者である若年健常者（ＹＣグループ）及び年齢適合対照（ＡＣ）グループと、ＡＦ患者である発作性ＡＦ（ＰＡＦ）グループ及び慢性ＡＦグループ（ＣＡＦ）について本発明に係る４種のｍｉＲＮＡの量を比較した結果を示す図Of the four normal miRNAs according to the present invention for young healthy individuals (YC group) and age-matched control (AC) groups that are non-AF patients and paroxysmal AF (PAF) groups and chronic AF groups (CAF) that are AF patients Diagram showing the results of comparing amounts 本発明に係る４種のｍｉＲＮＡを組合わせで構成される診断パネルについてのＲＯＣ曲線解析結果を示す図The figure which shows the ROC curve analysis result about the diagnostic panel comprised by combining 4 types of miRNA concerning this invention. 本発明に係る２種のｍｉＲＮＡを組合わせで構成される診断パネルについてのＲＯＣ曲線解析結果を示す図The figure which shows the ROC curve analysis result about the diagnostic panel comprised by combining 2 types of miRNA which concerns on this invention.
　本発明の心房性不整脈検査方法は、心房性不整脈の診断又は発症を予測するための心房性不整脈検査方法であって、被験者から得られる非細胞性生体液中に含まれるマイクロＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」という。）のうちの、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、及びｍｉＲ－３４２－５ｐの４種のうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡを定量する工程を含むことを特徴とする。
　この特徴は、下記各実施形態に共通する又は対応する技術的特徴である。 The atrial arrhythmia examination method of the present invention is an atrial arrhythmia examination method for diagnosing or predicting the onset of atrial arrhythmia, wherein microRNA contained in a non-cellular biological fluid obtained from a subject (hereinafter, " miR-).), at least one of the four types of miR-99a-5p, miR-192-5p, miR-214-3p, and miR-342-5p, or at least one of the four types. The method comprises the step of quantifying at least one miRNA having an identical 6-base sequence or more among the 7-sequences of the second to eighth positions or having the same target gene as one miRNA. And
This feature is a technical feature common to or corresponding to each of the following embodiments.
　本発明の実施形態としては、前記ｍｉＲＮＡを定量する工程において、前記４種のｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種を含む複数種のｍｉＲＮＡを定量することが、本発明の効果の有効性の観点から、好ましい。また、前記ｍｉＲＮＡを定量する工程において、前記４種のｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種を含む複数種のｍｉＲＮＡを組み合わせて構成される診断パネルに含まれる各ｍｉＲＮＡについて測定することが好ましい。 As an embodiment of the present invention, in the step of quantifying the miRNA, at least one of the four miRNAs or at least one miRNA of the four miRNAs and the second to eighth 7-nucleotide sequences From the viewpoint of the effectiveness of the effect of the present invention, it is preferable to quantify a plurality of miRNAs having at least one of the miRNAs having the same 6-base sequence or more or having the same target gene. Further, in the step of quantifying the miRNA, at least one kind of the four kinds of miRNA or at least one kind of miRNA of the four kinds, and a 6-base sequence or more of the second to eighth seventh base sequences are It is preferable to measure each miRNA included in a diagnostic panel configured by combining a plurality of types of miRNAs including at least one type of miRNAs having the same or the same target gene.
　本発明においては、診断及び予測の正確性の観点から、前記非細胞性生体液が、血液であることが好ましい。また、前記心房性不整脈が、心房細動であることが好ましい。
　実施形態としては、少なくとも前記工程（１）～（４）を含むことが好ましい。 In the present invention, the non-cellular biological fluid is preferably blood from the viewpoint of accuracy of diagnosis and prediction. Further, it is preferable that the atrial arrhythmia is atrial fibrillation.
It is preferable that the embodiment includes at least the steps (1) to (4).
　本発明の心房性不整脈検査システムは、心房性不整脈の診断又は発症を予測するための心房性不整脈検査システムであって、少なくとも、被験者から得られる非細胞性生体液中に含まれるｍｉＲＮＡのうち、心房性不整脈に関連するｍｉＲＮＡの定量を含む測定データ及び解析データの入出力部と、入力された測定データの統計解析部と、を具備することを特徴とする。さらに、簡便性の観点から、ｍｉＲＮＡの定量測定部を具備していることが好ましい。
　本発明の心房性不整脈検査システムは、本発明の前記検査方法の実施のために好適に用いることができる。　 The atrial arrhythmia test system of the present invention is an atrial arrhythmia test system for diagnosing or predicting atrial arrhythmia, and at least, among miRNAs contained in acellular biological fluid obtained from a subject, It is characterized by comprising an input/output unit of measurement data and analysis data including quantification of miRNA related to atrial arrhythmia, and a statistical analysis unit of the input measurement data. Further, from the viewpoint of simplicity, it is preferable to have a quantitative measurement unit for miRNA.
The atrial arrhythmia examination system of the present invention can be suitably used for carrying out the examination method of the present invention.
　以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための形態・態様について詳細な説明をする。なお、本願において、「～」は、その前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用する。 The following is a detailed description of the present invention, its constituent elements, and modes and modes for carrying out the present invention. In the present application, “to” is used to mean that the numerical values described before and after it are included as the lower limit value and the upper limit value.
　《１．心房性不整脈検査方法》
　本発明の心房性不整脈検査方法は、心房性不整脈の診断又は発症を予測するための心房性不整脈検査方法であって、被験者から得られる非細胞性生体液中に含まれるマイクロＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」という。）のうちの、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、及びｍｉＲ－３４２－５ｐの４種のうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡを定量する工程を含むことを特徴とする。 <<1. Atrial arrhythmia test method>>
The atrial arrhythmia examination method of the present invention is an atrial arrhythmia examination method for diagnosing or predicting the onset of atrial arrhythmia, wherein microRNA contained in a non-cellular biological fluid obtained from a subject (hereinafter, " miR-).), at least one of the four types of miR-99a-5p, miR-192-5p, miR-214-3p, and miR-342-5p, or at least one of the four types. The method comprises the step of quantifying at least one miRNA having an identical 6-base sequence or more among the 7-sequences of the second to eighth positions or having the same target gene as one miRNA. And
　ここで、「心房性不整脈」とは、心房細動、心房粗動、心房頻拍、異所性心房興奮、ペースメーカーシフト、心房静止等をいう。
　以下において、検査方法に係る各要素、工程、実施方法等について詳細な説明をする。 Here, "atrial arrhythmia" refers to atrial fibrillation, atrial flutter, atrial tachycardia, ectopic atrial excitement, pacemaker shift, atrial static, and the like.
In the following, a detailed description will be given of each element, process, and method of implementation related to the inspection method.
　（１）検体
　本発明においては、被験者から得られる非細胞性生体液を用いる。
　ここで、「非細胞性生体液」とは、血液（血漿及び血清を含むもの）、唾液、尿、羊水、母乳、気管支洗浄液、脳脊髄液、初乳、間質液、腹腔液、胸水、精液等の生体液であって、細胞が除去された体液をいう。ただし、ここに例示した生体液に限定されるものではない。特に好ましい非細胞性生体液は、血液であり、当該血液に含まれる血清又は血漿である。 (1) Specimen In the present invention, an acellular biological fluid obtained from a subject is used.
Here, “non-cellular biological fluid” means blood (including plasma and serum), saliva, urine, amniotic fluid, breast milk, bronchial lavage fluid, cerebrospinal fluid, colostrum, interstitial fluid, peritoneal fluid, pleural fluid, It is a biological fluid such as semen, in which cells have been removed. However, it is not limited to the biological fluids exemplified here. A particularly preferable non-cellular biological fluid is blood, and serum or plasma contained in the blood.
　（２）測定対象のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）
　本発明に係る測定対象のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、及びｍｉＲ－３４２－５ｐの４種のうちの少なくとも１種又は当該４種の少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡである。
　本発明においては、前記４種のうちの少なくとも１種又は当該４種の少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種含む複数種のｍｉＲＮＡを定量することが好ましい。 (2) Micro RNA (miRNA) to be measured
The microRNA (miRNA) to be measured according to the present invention is at least one of four types of miR-99a-5p, miR-192-5p, miR-214-3p, and miR-342-5p, or the relevant 4 It is at least one miRNA which is the same as at least one miRNA of the species and has 6 or more nucleotide sequences of the 7th nucleotide sequence from the 2nd to the 8th or has the same target gene.
In the present invention, at least one of the four types or at least one miRNA of the four types has the same or more than 6 base sequences out of the 7th base sequence from the second to the eighth, or the same target gene. It is preferable to quantify a plurality of types of miRNA including at least one of the miRNAs having
　ｍｉＲＮＡは、２２塩基程度（１９～２５塩基）の短いＲＮＡで、ターゲットとなる遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の主として３′側非翻訳領域（３′－ＵＴＲ）においてｍｉＲＮＡに相補的な配列に結合し、その発現を制御する。
　ｍｉＲＮＡは、核内で数百～数千塩基のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ　として生成される。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、核内でＤｒｏｓｈａにより切断され、ヘアピン構造を持つ小さな単鎖ＲＮＡとなる。これをｐｒｅ－ｍｉＲＮＡと呼ぶ。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは核外に輸送され、細胞質内でＤｉｃｅｒという酵素及び補因子によって両端が切断されて短い二本鎖ｍｉＲＮＡになる。この二本鎖ｍｉＲＮＡはその後解離してガイド鎖と呼ばれる一本だけが成熟し、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれる核酸とタンパクの複合体を形成し，ターゲット遺伝子のｍＲＮＡに結合する。 The miRNA is a short RNA of about 22 bases (19 to 25 bases) and binds to a sequence complementary to the miRNA mainly in the 3'untranslated region (3'-UTR) of the messenger RNA (mRNA) of the target gene. Control its expression.
miRNA is produced in the nucleus as pri-miRNA having several hundred to several thousand bases. The pri-miRNA is cleaved by Drosha in the nucleus to become a small single-stranded RNA having a hairpin structure. This is called pre-miRNA. The pre-miRNA is transported to the outside of the nucleus and is cleaved at both ends by an enzyme called Dicer and a cofactor in the cytoplasm to become a short double-stranded miRNA. This double-stranded miRNA then dissociates and matures only one strand called the guide strand, forms a nucleic acid-protein complex called RISC (RNA-induced silencing complex), and binds to the mRNA of the target gene.
　ｍｉＲＮＡがターゲットｍＲＮＡに結合すると、ｍＲＮＡの翻訳が抑制されることにより、蛋白の発現が低下する。また一部には、ｍＲＮＡそのものを分解することにより発現を阻害するメカニズムも報告されている。いずれの機序でもターゲット遺伝子に対しては抑制的に働くことが特徴である。このとき、２２塩基すべてが相補的に結合する必要はなく、ｍｉＲＮＡの２番目～７番目の塩基が相補的であることが重要である。この配列をシード配列（ｓｅｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と呼び、ターゲット認識の上で極めて重要な部位である。 When miRNA binds to the target mRNA, the translation of mRNA is suppressed and the expression of protein is reduced. In addition, a mechanism has been reported in part, in which expression is inhibited by degrading mRNA itself. Both mechanisms are characterized by a suppressive action on the target gene. At this time, it is not necessary for all 22 bases to bind complementarily, and it is important that the 2nd to 7th bases of the miRNA are complementary. This sequence is called a seed sequence and is an extremely important part for target recognition.
　（３）診断パネル
　本発明に係る「診断パネル」とは、心房性不整脈の発症に関係するｍｉＲＮＡであって、診断又は予測するための定量的測定に特に有効なｍｉＲＮＡを選んで複数組み合わせたバイオマーカーパネルをいう。
　本発明においては、ｍｉＲＮＡを定量する工程において、前記４種のうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種を含む複数種のｍｉＲＮＡを組み合わせて構成される診断パネルに含まれる各ｍｉＲＮＡについて測定することが好ましい。
　本発明においては、前記４種のｍｉＲＮＡのうち少なくとも２種以上を含む診断パネルとすることが好ましい。特に、診断又は予測の精度の観点から、前記４種を含む診断パネルとすることが好ましい。 (3) Diagnostic panel The "diagnostic panel" according to the present invention is a miRNA that is associated with the development of atrial arrhythmia, and is a combination of a plurality of miRNAs that are particularly effective for quantitative measurement for diagnosis or prediction. Refers to the marker panel.
In the present invention, in the step of quantifying miRNA, at least one of the four species or miRNA of at least one species of the four species and 6 or more nucleotide sequences of the second to eighth 7-nucleotide sequences are It is preferable to measure each miRNA included in a diagnostic panel configured by combining a plurality of types of miRNAs including at least one type of miRNAs having the same or the same target gene.
In the present invention, a diagnostic panel containing at least two or more of the above four types of miRNAs is preferable. In particular, from the viewpoint of the accuracy of diagnosis or prediction, it is preferable to use a diagnostic panel containing the above four types.
　（４）検査の工程
　本発明の心房性不整脈検査方法においては、種々の工程を含む構成にすることができるが、少なくとも下記工程〈１〉～〈４〉を含むことが好ましい。
　〈１〉血液を採血し、血漿又は血清を分離して採取する工程
　〈２〉前記血漿又は前記血清からＲＮＡを分離・抽出する工程
　〈３〉前記分離・抽出された前記ＲＮＡのうち、前記４種のうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡを定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（以下、「定量的ＲＴ－ＰＣＲ法」という。）により測定をする工程
　〈４〉前記定量的ＲＴ－ＰＣＲ法による測定で得られたデータについて統計解析をする工程
　以下においては、検体として血液、特に血清を対象とした場合について説明をする。
　なお、血清以外の体液を検体とする場合も、基本的には、下記工程と同様の工程を経ることにより検査を実施することができる。ただし、上記工程〈１〉～〈４〉は、それぞれ、下記〈４．１〉～〈４．４〉に個別に説明する。 (4) Inspection Step The atrial arrhythmia inspection method of the present invention can be configured to include various steps, but preferably includes at least the following steps <1> to <4>.
<1> A step of collecting blood and separating and collecting plasma or serum <2> A step of separating and extracting RNA from the plasma or the serum <3> Among the separated and extracted RNA, the above-mentioned 4 Among miRNAs in which at least one of the four species or at least one of the four species is the same as or more than 6 nucleotide sequences of the 7th nucleotide sequence of the 2nd to 8th or having the same target gene Of at least one miRNA of (1) by a quantitative reverse transcription polymerase chain reaction method (hereinafter, referred to as “quantitative RT-PCR method”) <4> Obtained by the quantitative RT-PCR method Step of Statistical Analysis of Data In the following, a case where blood, particularly serum, is used as a sample will be described.
When a body fluid other than serum is used as the sample, basically, the test can be carried out through the same steps as the following steps. However, the steps <1> to <4> will be individually described in the following <4.1> to <4.4>.
　〈４．１〉採血及び血清の分離
　血液を被験者の血管から採血し、その後、小形冷却遠心機を用いて、所定条件（例えば、温度４℃、回転数３０００ｒｐｍ、遠心加速度１６００×ｇ、及び１０分間）下で、遠心分離により、血清を得て、採取した血清からＲＮＡが分離されるまで低温（例えば－１００～－２０℃）で放置・保存する。 <4.1> Blood Collection and Separation of Serum Blood was collected from a blood vessel of a subject, and thereafter, using a small cooling centrifuge, predetermined conditions (for example, temperature 4° C., rotation speed 3000 rpm, centrifugal acceleration 1600×g, and 10 Serum is obtained by centrifugation for 10 min.) and left and stored at low temperature (eg -100 to -20°C) until RNA is separated from the collected serum.
　〈４．２〉全ＲＮＡの抽出
　上記工程で得た血清から全ＲＮＡ（「ｔｏｔａｌＲＮＡ」ともいう。）を、抽出用の試薬、例えば、ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ＰＡＲＩＳ（登録商標）ＲＮＡ抽出キット（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製；ＡＭＩ１５５６）を用い、機器としては、例えばＶｅｒｉｔｉサーマル・サイクラー（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製）を用いて、付属の使用説明書に従って抽出する。
　なお、コントロールとして、例えば、ｓｐｉｋｅ－ｉｎ　ＲＮＡ：Ａｔｈ－ｍｉＲ－１５９（ユーロフィンジェノミクス社製；７７９１６７２）等を使用する。　 <4.2> Extraction of Total RNA A reagent for extracting total RNA (also referred to as “total RNA”) from the serum obtained in the above step, for example, mirVana (registered trademark) PARIS (registered trademark) RNA extraction kit (thermo) • FI 1556) manufactured by Fisher Scientific Co., Ltd. is used, and for example, a Veriti Thermal Cycler (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co.) is used for extraction according to the attached instruction manual.
As a control, for example, spike-in RNA:Ath-miR-159 (manufactured by Eurofin Genomics Co., Ltd.; 7791672) or the like is used.
　〈４．３〉ｍｉＲＮＡの発現の定量的測定
　本発明においては、心房性不整脈、例えば心房細動、と関連深いｍｉＲＮＡの発現を定量的に計測する。
　当該定量測定には、従来使用されている種々の方法を採用できる。本発明では、特に、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ：「ＲＴ－ＰＣＲ」とも略記する。）法を用いて行うことが好ましい。 <4.3> Quantitative measurement of miRNA expression In the present invention, miRNA expression closely related to atrial arrhythmia, such as atrial fibrillation, is quantitatively measured.
For the quantitative measurement, various conventionally used methods can be adopted. In the present invention, it is particularly preferable to use the reverse transcription polymerase chain reaction (also abbreviated as “RT-PCR”) method.
　ここで、「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応」（「逆転写反応」又は「逆転写酵素反応」ともいう。）とは、ＲＮＡに依存してＤＮＡを合成する酵素である逆転写酵素（「リバーストランスクリプターゼ」又は「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」ともいう。）により媒介される反応をいう。
　すなわち、一本鎖ＲＮＡを鋳型としてこれと相補的なヌクレオチド配列をもつＤＮＡが合成される。逆転写反応は、その次にＰＣＲと組み合わされて、逆転写反応－ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）として汎用される。
　従って、ＲＴ－ＰＣＲは、逆転写酵素を用いてＲＮＡを鋳型としたＤＮＡ合成を行い、そのＤＮＡを今度は鋳型にしてＰＣＲ反応を行うことになる。すなわち、抽出された全ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡを鋳型に逆転写を行い、生成されたｃＤＮＡに対してＰＣＲ法を用いて定量を行う。 Here, the "reverse transcription polymerase chain reaction" (also referred to as "reverse transcription reaction" or "reverse transcriptase reaction") is a reverse transcriptase ("reverse transcriptase") that is an enzyme that synthesizes DNA depending on RNA. Zease" or "RNA-dependent DNA polymerase").
That is, a single-stranded RNA is used as a template to synthesize a DNA having a nucleotide sequence complementary thereto. The reverse transcription reaction is then combined with PCR and is commonly used as the reverse transcription reaction-polymerase chain reaction (RT-PCR).
Therefore, in RT-PCR, DNA is synthesized using RNA as a template using reverse transcriptase, and this DNA is used as a template to carry out PCR reaction. That is, the extracted total RNA sample is reverse-transcribed using RNA as a template, and the generated cDNA is quantified by the PCR method.
　ＰＣＲ法では、鋳型となるＤＮＡにプライマーを付着させ、ＤＮＡポリメラーゼによって目的のプライマー配列にはさまれるＤＮＡを特異的に検出する。ＰＣＲ法はＤＮＡの検出に用いることは可能であるが、ＲＮＡの検出をすることができない。そこで、ＲＮＡを逆転写によってｃＤＮＡに変換し、そのｃＤＮＡに対してＰＣＲ法を行う。 In the PCR method, a primer is attached to the template DNA, and the DNA sandwiched between the target primer sequences is specifically detected by DNA polymerase. Although the PCR method can be used for detecting DNA, it cannot detect RNA. Therefore, RNA is converted into cDNA by reverse transcription, and the cDNA is subjected to the PCR method.
　なお、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法とは、ゲノムＤＮＡなどをテンプレートにして、増幅したい領域の両端に相補的なプライマーと耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いてサイクル反応（プライマーとのアニーリング→伸長反応→二本鎖の解離）を行うことにより、目的とするＤＮＡ領域を増幅する方法をいう。 The PCR (polymerase chain reaction) method is a cycle reaction (annealing with primer → extension reaction → two-way reaction using primers such as genomic DNA, etc. This is a method of amplifying the target DNA region by carrying out the dissociation of single strands.
　以下において、ＲＴ－ＰＣＲ法の各工程について説明する。
　〈４．３．１〉ｃＤＮＡの合成
　ｃＤＮＡの合成は、例えば、試薬としてはＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｍｉＲＮＡ　ｃＤＮＡ合成キット（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製；Ａ２８００７）を用い、機器としてはＶｅｒｉｔｉサーマル・サイクラー（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製）を用いて行うことができる。 Each step of the RT-PCR method will be described below.
<4.3.1> Synthesis of cDNA For the synthesis of cDNA, for example, TaqMan (registered trademark) Advanced miRNA cDNA synthesis kit (Atherman Fischer Scientific; A28007) is used as a reagent, and Veriti is used as a device. It can be performed using a thermal cycler (made by Thermo Fisher Scientific Co.).
　〈４．３．２〉ｍｉＲＮＡの個別定量
　上記血清中の各ｍｉＲＮＡを、下記の方法により定量する。
　試薬としては、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製；４４４４５５７）と各ｍｉＲＮＡ用プローブ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製；Ａ２５５７６）を用い、機器としては、例えばＳｔｅｐＯｎｅ（登録商標）リアルタイム　ＰＣＲ用サーマル・サイクラー（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製）を用いて定量することができる。 <4.3.2> Individual quantification of miRNA Each miRNA in the above serum is quantified by the following method.
As the reagent, for example, TaqMan (registered trademark) Fast Advanced Master Mix (manufactured by Thermo Fisher Scientific, Inc.; 4444557) and each miRNA probe (manufactured by Thermo Fisher Scientific, Inc.; A25576) are used as an instrument. Can be quantified using, for example, a StepOne (registered trademark) thermal cycler for real-time PCR (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
　〈４．４〉統計解析（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）
　ｍｉＲＮＡの量の算出及び解析には、限定されないが、例えばＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ｄａｔａ（Ｓｐｅｅｄ　Ｔ．著、Ｃｈａｐｍａｎ　ａｎｄ　Ｈａｌｌ／ＣＲＣ）、及びＡ　ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ　ｇｕｉｄｅ　Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄａｔａ　ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｃａｕｓｔｏｎ　Ｈ．Ｃ．ら著、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）などに記載された統計学的処理を、本発明において利用できる。 <4.4> Statistical Analysis (Statistical Analysis)
The calculation and analysis of the amount of miRNA is not limited, but for example, Statistical analysis of gene expression microarray data (Speed T., Chapman and Caesares arrhena sr. C. et al., Blackwell publishing) and the like can be used in the present invention.
　本発明においては、測定のデータ解析は、以下のようにすることが好ましい。
　測定データは、特に指摘しない限り、平均±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）として表す。得られたデータの正規分布性については、シャピロ・ウィルク検定 (Shapiro-Wilk test)で行う。 In the present invention, the measurement data analysis is preferably performed as follows.
Measured data are expressed as mean±standard deviation (mean±SD) unless otherwise specified. For the normal distribution of the obtained data, the Shapiro-Wilk test is performed.
　連続変数に対しては、正規分布についてはスチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔ）等を用い、非正規分布に対しては、マン・ホイットニーのＵ検定（Ｍａｎｎ-Ｗｈｉｔｎｅｙ　Ｕ　ｔｅｓｔ）等を用いる。多数の標本の比較のためには、クラスカル・ウォリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ　ｔｅｓｔ）とそれに続けてスティールドゥワス検定（Ｓｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ　ｔｅｓｔ）を用いる。
　離散変数は、χ２検定（ｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅ　ｔｅｓｔ）の分割表（ｃｏｎｔｉｎｇｅｎｃｙ　ｔａｂｌｅ）の分析により比較する。 For continuous variables, Student's t-test is used for normal distribution, and for non-normal distribution, Mann-Whitney U test, etc. To use. For comparison of multiple samples, the Kruskal-Wallis test followed by the Steel-Dwas test is used.
Discrete variable is compared by analysis of chi 2 test (chi-square test) of contingency tables (contingency table).
　ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ－ｏｐｅｒａｔｉｎｇ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｃｕｒｖｅ）は、診断する心房細動のｍｉＲＮＡのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ：　ａｒｅａ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｕｒｖｅ）の値を算出するために用い、また、ヨーデンの指標（Ｙｏｕｄｅｎ’ｓ　ｉｎｄｅｘ）も算出される。二つの変数間の関係は、ピアソンの相関係数検定（Ｐｅａｒｓｏｎ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ）を用いて検討する。 The ROC curve (Receiver-operating characteristics curve) is used to calculate the area under the ROC curve (AUC: area under the curve) of the miRNA of the atrial fibrillation to be diagnosed, and the index of Youden (Youden's index). ) Is also calculated. The relationship between the two variables will be examined using the Pearson correlation test.
　統計解析は、統計分析ソフトウェア（例えば、ＪＭＰ　１１（商標）　ｓｏｆｔｗａｒｅ；ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ．製）を用いて行うことができる。なお、本発明においては、Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であるとする。 Statistical analysis can be performed using statistical analysis software (for example, JMP 11 (trademark) software; manufactured by SAS Institute Inc.). In the present invention, P<0.05 is considered to be statistically significant.
　〈４．５〉ｍｉＲＮＡ診断スコアの算出
　本発明の検査方法の工程には、診断スコアの算出をする工程、すなわち、各ｍｉＲＮＡのカットオフ値より得られたスコアを合計して、ｍｉＲＮＡ診断スコアを算出する工程を含むことも好ましい態様である。
　ここで、カットオフ値（ｃｕｔｏｆｆ ｖａｌｕｅ: 「病態識別値」ともいう。）とは、検査や測定結果の陽性・陰性を識別する数値のことであり、検査や測定の感度と特異度の関係を表したＲＯＣ曲線を作成することで求めることができる。病態を識別するための検査・測定に用いられ，基準範囲を基本として正常とみなす範囲を決めるとき、その範囲を区切る値のことを意味する。すなわち，特定の疾患に罹患した、又は罹患するリスクがあるということを分ける値である。
　例えば、ある被験者の心房性不整脈の発症リスクが高いか低いかを評価する場合、発症リスクが高いとされるカットオフ値が示されているバランステストを用いて評価を行い、測定値とカットオフ値を比較することが挙げられる。 <4.5> Calculation of miRNA diagnostic score In the step of the test method of the present invention, the step of calculating a diagnostic score, that is, the scores obtained from the cut-off values of each miRNA are summed to obtain a miRNA diagnostic score. It is also a preferred embodiment to include a step of calculating.
Here, the cutoff value (also referred to as “pathological condition discriminating value”) is a numerical value for discriminating between positive and negative test and measurement results, and shows the relationship between the sensitivity and specificity of the test and measurement. It can be determined by creating the ROC curve shown. It is used for tests/measurements to identify the pathological condition, and means the value that delimits the normal range when determining the normal range. In other words, it is a value that separates the fact that a person has or is at risk of getting a particular disease.
For example, when assessing whether a subject's risk of developing atrial arrhythmia is high or low, a balance test that shows a cut-off value that is said to be at high risk of development is used for evaluation, and the measured value and cut-off One example is comparing the values.
　《２．心房性不整脈検査システム》
　本発明の「心房性不整脈検査システム」とは、心房性不整脈検査の各工程で必要な手段要素として所定の機能を有する機器又は装置及び試薬等で構成され、全体として、心房性不整脈検査の機能を果たす集合体をいう。なお、各手段要素は、それぞれ離れた異なる場所に個別に配置しても、一つの装置として一定の空間に集めて配置して一体としてシステム装置としてもよい。 <<2. Atrial Arrhythmia Test System>>
The "atrial arrhythmia examination system" of the present invention is constituted by a device or a device having a predetermined function as a necessary element in each step of the atrial arrhythmia examination, a reagent, etc., and the function of the atrial arrhythmia examination as a whole. A collective that fulfills the above. It should be noted that the respective means elements may be individually arranged in different places separated from each other, or may be collected and arranged as a single device in a certain space to be integrated into a system device.
　本発明の心房性不整脈検査システムは、心房性不整脈の診断又は発症を予測するための心房性不整脈検査システムであって、少なくとも、被験者から得られる非細胞性生体液中に含まれるｍｉＲＮＡのうち、心房性不整脈に関連するｍｉＲＮＡの定量を含む測定データ及び解析データの入出力部と、入力された測定データの統計解析部と、を具備することを特徴とする。
　本発明においては、さらに、ｍｉＲＮＡの定量計測部を具備していることが好ましい形態である。 The atrial arrhythmia test system of the present invention is an atrial arrhythmia test system for diagnosing or predicting atrial arrhythmia, and at least, among miRNAs contained in acellular biological fluid obtained from a subject, It is characterized by comprising an input/output unit of measurement data and analysis data including quantification of miRNA related to atrial arrhythmia, and a statistical analysis unit of the input measurement data.
In the present invention, it is a preferable mode to further include a miRNA quantitative measurement unit.
　また、当該心房性不整脈検査システムは、心房性不整脈に関連するｍｉＲＮＡである、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、及びｍｉＲ－３４２－５ｐの４種のうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡの定量等に好ましく適用できる。したがって、当該心房性不整脈検査システムは、本発明の前記心房性不整脈検査方法を実施のために好適に用いることができる。 In addition, the atrial arrhythmia examination system is one of four miR-99a-5p, miR-192-5p, miR-214-3p, and miR-342-5p, which are miRNAs associated with atrial arrhythmia. At least one kind of miRNA having at least one kind or at least one kind of the four kinds of miRNA, and having 6 or more nucleotide sequences of the second to eighth 7-nucleotide sequences being the same or having the same target gene Can be preferably applied to quantification of miRNA of Therefore, the atrial arrhythmia examination system can be suitably used for carrying out the atrial arrhythmia examination method of the present invention.
　（心房性不整脈検査システムの構成）
　図１に、本発明の心房性不整脈検査システム１００の好ましい典型的例の全体構成の一例を示す。心房性不整脈検査システム１００は、測定対象のｍｉＲＮＡの定量測定データとその解析結果に基づき、心房細動の状態の診断又は発症を予測に資するための検査システムである。 (Configuration of atrial arrhythmia examination system)
FIG. 1 shows an example of the overall configuration of a preferred typical example of the atrial arrhythmia examination system 100 of the present invention. The atrial arrhythmia examination system 100 is an examination system for contributing to diagnosis or prediction of atrial fibrillation state based on the quantitative measurement data of miRNA to be measured and the analysis result thereof.
　心房性不整脈検査システム１００は、図１に示すように、ｍｉＲＮＡの定量を含む測定データ及び解析データの入出力部１０２に、ｍｉＲＮＡの定量計測部１０１と入力された測定データの統計解析部１０３とがデータの入出力（送受信）可能に接続されて構成されている。
　なお、前記各部間の接続方式は、特に限定されない。例えば、ＬＡＮ（ｌｏｃａｌ　ａｒｅａ　ｎｅｔｗｏｒｋ）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。また、定量計測部１０１による測定データは、外部のサーバー等に保存されるものとし、ＨＤＤ、ＣＤ、ＤＶＤ等のストレージを用いて統計解析部１０３に入力される構成としてもよい。さらに、統計解析部１０３は、統計解析を行う機能として、定量測定部１０１内に組み込まれているものとしてもよい。なお、統計解析を行う機能とは、統計解析部１０３のプログラム上に組み込まれているものや統計解析部のコンピューター上で動作する独立プログラム等を意味する。 As shown in FIG. 1, the atrial arrhythmia examination system 100 includes an input/output unit 102 for measurement data and analysis data including quantification of miRNA, a quantitative measurement unit 101 for miRNA, and a statistical analysis unit 103 for input measurement data. Is connected so that data can be input/output (transmitted/received).
It should be noted that the connection method between the respective units is not particularly limited. For example, the connection may be made by a LAN (local area network) or may be made by wireless connection. Further, the measurement data by the quantitative measurement unit 101 may be stored in an external server or the like, and may be input to the statistical analysis unit 103 using a storage such as HDD, CD, DVD. Furthermore, the statistical analysis unit 103 may be incorporated in the quantitative measurement unit 101 as a function of performing statistical analysis. The function of performing statistical analysis means a function incorporated in the program of the statistical analysis unit 103, an independent program operating on the computer of the statistical analysis unit, or the like.
　定量計測部１０１は、測定対象としてのｍｉＲＮＡを定量するためのシステム要素部（「モジュール」ともいう。）であり、例えば定量的ＲＴ－ＰＣＲ法による測定のためのサーモ・サイクラーや検出器を備えている。さらに血液から血清等を分離する機器を備えていることも好ましい形態である。 The quantitative measurement unit 101 is a system element unit (also referred to as “module”) for quantifying miRNA as a measurement target, and includes, for example, a thermocycler and a detector for measurement by the quantitative RT-PCR method. ing. Further, it is also a preferable form to have a device for separating serum or the like from blood.
　データの入出力部（「データ入出力部」ともいう。）１０２は、定量計測部１０１及び統計解析部１０３をはじめとする外部装置・機器等との間でデータ送受信を行うためのインターフェースの機能を有する。
　データ入出力部１０２は、一体でも別体で構成されていてもよい。別体で構成されている場合は、入力部と出力部が分かれていてもよいし、入力部が複数あり、一方の入力部により測定データを入力し、他方の入力部により解析データを入力する形態であってもよい。
　その他、データ入出力部１０２は、ＬＡＮアダプターやルーター等を備え、ＬＡＮ等の通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。　統計解析部１０３は、ｍｉＲＮＡの定量測定データを用いて、心房性不整脈の発症との関連性を評価するための解析データを作成する機能を有するシステム要素部である。 A data input/output unit (also referred to as “data input/output unit”) 102 has a function of an interface for transmitting and receiving data to/from external devices/devices such as the quantitative measurement unit 101 and the statistical analysis unit 103. Have.
The data input/output unit 102 may be configured integrally or separately. When configured separately, the input unit and the output unit may be separated, or there are multiple input units, one of which inputs measurement data and the other input of analysis data. It may be in the form.
In addition, the data input/output unit 102 may include a LAN adapter, a router, and the like, and may be connected to an external device via a communication network such as a LAN. The statistical analysis unit 103 is a system element unit having a function of creating analysis data for evaluating the relationship with the onset of atrial arrhythmia by using quantitative measurement data of miRNA.
　当該統計解析部１０３又はデータ入出力部１０２には、さらに、図２に示すように、それらを構成する細部として、制御部１０４、操作部１０５、表示部１０６及び記憶部１０７を備えることも好ましい。
　制御部１０４は、ＣＰＵ（ｃｅｎｔｒａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｕｎｉｔ）、ＲＡＭ（ｒａｎｄｏｍ　ａｃｃｅｓｓ　ｍｅｍｏｒｙ）等を備えて構成され、記憶部１０７に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、統計解析部の動作を統括的に制御する。例えば、制御部１０４は、記憶部１０７に記憶されているプログラムとの協働により、統計解析を実行する実行部としての機能を実現する。 As shown in FIG. 2, the statistical analysis unit 103 or the data input/output unit 102 preferably further includes a control unit 104, an operation unit 105, a display unit 106, and a storage unit 107 as the details constituting them. ..
The control unit 104 is configured to include a CPU (central processing unit), a RAM (random access memory), and the like, executes various processes in cooperation with various programs stored in the storage unit 107, and is included in the statistical analysis unit. The operation is controlled comprehensively. For example, the control unit 104 realizes a function as an execution unit that executes statistical analysis by cooperating with a program stored in the storage unit 107.
　操作部１０５は、文字入力キー、数字入力キー、及び各種機能キー等を備えたキーボードと、マウス等のポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスによる操作信号とを、入力信号として制御部１０４に出力する。 The operation unit 105 is configured to include a keyboard having character input keys, number input keys, various function keys, and the like, and a pointing device such as a mouse. And are output to the control unit 104 as input signals.
　表示部１０６は、例えば、ＣＲＴ（ｃａｔｈｏｄｅ　ｒａｙ　ｔｕｂｅ）やＬＣＤ（ｌｉｑｕｉｄ　ｃｒｙｓｔａｌ　ｄｉｓｐｌａｙ）等のモニターを備えて構成されており、制御部１０４から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する。 The display unit 106 includes a monitor such as a CRT (cathode ray tube) or LCD (liquid crystal display), for example, and displays various screens in accordance with an instruction of a display signal input from the control unit 104.
　記憶部１０７は、例えばＨＤＤ（ｈａｒｄ　ｄｉｓｋ　ｄｒｉｖｅ）や半導体の不揮発性メモリー等で構成されている。記憶部１０７には、前述のように統計解析を実行するためのプログラムを含む各種プログラムや、各種データ等が記憶されている。
　以上から分かるように、本発明の心房性不整脈検査システム１００は、本発明の前記心房性不整脈検査方法を実施するために好適に用いることができる。 The storage unit 107 includes, for example, an HDD (hard disk drive), a semiconductor non-volatile memory, or the like. The storage unit 107 stores various programs including a program for executing the statistical analysis as described above, various data, and the like.
As can be seen from the above, the atrial arrhythmia examination system 100 of the present invention can be suitably used for carrying out the atrial arrhythmia examination method of the present invention.
　以下に実施例を示し本発明の詳細な説明を行うが、本発明はこれにより限定されるものではない。
　１．被験対象等について
　以下において説明する実験は、被験者として、ＡＦ患者６０名（発作性ＡＦグループ・慢性ＡＦグループ各３０名）、非ＡＦ患者５５名（年齢適合対照グループ群３０名・若年健常者グループ各２５名）を対象に、個別に定量的ＲＴ－ＰＣＲを行い、血清中のｍｉＲＮＡを定量した。定量測定するｍｉＲＮＡとしては、主に、前記４種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、及びｍｉＲ－３４２－５ｐ）を対象とした（なお、主に前記４種のｍｉＲＮＡを測定対象とした詳細な事由については、本発明者及び共同研究者による研究報告書(前記非特許文献７を参照。）。
　本明細書では、本願発明に直接関係する主に前記４種のｍｉＲＮＡについての実験方法及びその結果について説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
1. About subjects to be tested In the experiments described below, as subjects, 60 AF patients (30 in each of the paroxysmal AF group and the chronic AF group), 55 non-AF patients (30 in the age-matched control group group, the young healthy group) Each 25 people) was subjected to individual quantitative RT-PCR to quantify miRNA in serum. The miRNAs to be quantitatively measured were mainly the above-mentioned four types of miRNAs (miR-99a-5p, miR-192-5p, miR-214-3p, and miR-342-5p) (mainly, mainly). For the detailed reasons why the above-mentioned four types of miRNAs are used as measurement targets, a research report by the present inventor and co-workers (see Non-Patent Document 7).
In the present specification, an experimental method and results thereof mainly relating to the above-mentioned four types of miRNAs, which are directly related to the present invention, will be described.
　２．実験方法
　（１）採血及び血清の分離
　血液を被験者の血管から採血用針（セーフタッチ（登録商標）ＰＳＶセット；ニプロ社製）を用いて真空採血管に採血し、その後、小形冷却遠心機（ｈｉｍａｃ　ＣＦ７Ｄ２；ＨＩＴＡＣＨＩ社製）を用いて、所定条件（温度４℃、回転数３０００ｒｐｍ、遠心加速度１６００×ｇ、及び１０分間）下で、遠心分離により、血清を得て、採取した血清（各６００μＬ）からＲＮＡが分離されるまで－８０℃で放置した。 2. Experimental Method (1) Blood Collection and Separation of Serum Blood was collected from a subject's blood vessel into a vacuum blood collection tube using a blood collection needle (SafeTouch (registered trademark) PSV set; manufactured by Nipro), and then a small cooling centrifuge ( Serum was obtained by centrifugation using himac CF7D2; manufactured by HITACHI, under predetermined conditions (temperature 4° C., rotation speed 3000 rpm, centrifugal acceleration 1600×g, and 10 minutes), and collected serum (600 μL each). ) Was left at -80°C until RNA was isolated.
　（２）全ＲＮＡの抽出　上記工程で得た血清から全ＲＮＡを、試薬としてはｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ＰＡＲＩＳ（登録商標）ＲＮＡ抽出キット（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製；ＡＭＩ１５５６）を用い、機器としてはＶｅｒｉｔｉサーマル・サイクラー（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製）を付属の使用説明書に従って抽出した。
　なお、コントロールとして、ｓｐｉｋｅ－ｉｎ　ＲＮＡ：Ａｔｈ－ｍｉＲ－１５９（ユーロフィンジェノミクス社製；７７９１６７２，０．２μｍｏｌ）を最終的に２ｎＭとして使用した。 (2) Extraction of total RNA Total RNA was extracted from the serum obtained in the above step, and mirVana (registered trademark) PARIS (registered trademark) RNA extraction kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co.; AMI1556) was used as a reagent. As a device, a Veriti thermal cycler (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co.) was extracted according to the attached instruction manual.
As a control, spike-in RNA:Ath-miR-159 (manufactured by Eurofin Genomics; 7791622, 0.2 μmol) was finally used at 2 nM.
　具体的には、下記の手順に従って全ＲＮＡの抽出を行った。なお、準備として、サーマル・サイクラーのヒート・ブロックを予め９５℃にしておくとともに、遠心加速度を、下記ステップ[５]を除き、１００００×ｇに固定した。
　また、変性溶液（２Ｘ　ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は３７℃恒温槽で１０分ほど予熱して沈殿を溶かしておいた。
　このような準備をした後に、次の手順（ステップ）[１]～[１４]に従って実施した。 Specifically, total RNA was extracted according to the following procedure. As a preparation, the heat block of the thermal cycler was preheated to 95° C., and the centrifugal acceleration was fixed at 10000×g except for the step [5] below.
Further, the denaturing solution (2X denaturing solution) was preheated in a 37° C. thermostat for about 10 minutes to dissolve the precipitate.
After such preparations, the steps (1) to [14] below were performed.
　[１]保存した血清から５００μＬをエッペンドルフチューブに取り、前記変性溶液を５００μＬ加えて、よく混ぜて、氷上で５分間、恒温放置（ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。
　[２]上記混合物に、Ａｔｈ－ｍｉＲ１５９（２ｎＭ）を１２μＬ加える。
　[３] Ａｃｉｄ－Ｐｈｅｎｏｌ：Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（下の層）を６００μＬ、水層が混じらないようにして加える。
　[４]次に、６０秒間旋回撹拌（ｖｏｒｔｅｘ）をする。
　[５]室温で、遠心分離を５分間、最大スピード（例えば、１６０００ｒｐｍ）で行う。
　[６]上部の水層をとり、別のエッペンドルフチューブに移すとともに、中間層（白い層）を取らないように注意して６００μＬ取る。６００μＬない場合は大体の容積のサンプルを測る。
　[７]サンプルの１．２５倍の１００％エタノールを加えて、よく混ぜる。通常は７５０μＬを加えて、総量を１３５０μＬとする。 [1] 500 μL of the stored serum was placed in an Eppendorf tube, 500 μL of the denaturing solution was added, mixed well, and incubated on ice for 5 minutes.
[2] Add 12 μL of Ath-miR159 (2 nM) to the above mixture.
[3] Add 600 μL of Acid-Phenol: Chloroform (lower layer) so that the aqueous layer is not mixed.
[4] Next, swirling and stirring (vortex) for 60 seconds.
[5] Centrifuge at room temperature for 5 minutes at maximum speed (eg 16000 rpm).
[6] Take the upper aqueous layer, transfer it to another Eppendorf tube, and take 600 μL while taking care not to take the intermediate layer (white layer). If there is no 600 μL, measure a large volume of sample.
[7] Add 1.25 times as much 100% ethanol as the sample and mix well. Usually, 750 μL is added to make the total volume 1350 μL.
　[８]フィルター・カートリッジをコレクション・チューブにセットし、フィルター・カートリッジ上に７００μＬずつ混合溶液を加えて、遠心分離を３０秒間行い、フィルター・カートリッジを通過した画分（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）を廃棄する。
　[９]ｍｉＲＮＡ洗浄液１（ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を７００μＬ加えて、フィルター・カートリッジを通過した画分（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）を廃棄する。
　[１０]　次に、フィルター・カートリッジ上に洗浄液２／３を５００μＬ加えて、遠心分離を３０秒間行い、フィルター・カートリッジを通過した画分を廃棄する。
　[１１]次に前記ステップ１０を繰り返す。
　[１２]何も加えずに、フィルター・カートリッジを乾燥するため、１分間遠心する。
　[１３]新しいコレクション・チューブに前記フィルター・カートレッジを移す。次に、予め加熱したＲＮａｓｅフリー水５０μＬを加えて、遠心分離を３０秒間行い、ＲＮＡ抽出溶液を得る。
　[１４]上記手順により得られたＲＮＡ抽出溶液は、－２０℃以下で保存する。 [8] Set the filter cartridge in the collection tube, add 700 μL of mixed solution to the filter cartridge, centrifuge for 30 seconds, and discard the fraction (flow-through) that has passed through the filter cartridge. ..
[9] Add 700 μL of miRNA Wash Solution 1 (wash solution), and discard the fraction (flow-through) that has passed through the filter cartridge.
[10] Next, add 500 μL of the washing liquid 2/3 to the filter cartridge and centrifuge for 30 seconds to discard the fraction that has passed through the filter cartridge.
[11] Next, step 10 is repeated.
[12] Centrifuge for 1 minute to dry the filter cartridge without adding anything.
[13] Transfer the filter cartridge to a new collection tube. Next, 50 μL of preheated RNase-free water is added and centrifugation is performed for 30 seconds to obtain an RNA extraction solution.
[14] The RNA extraction solution obtained by the above procedure is stored at -20°C or lower.
　（３）ｃＤＮＡの合成
　ｃＤＮＡの合成は、試薬としてはＴａｑＭａｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｍｉＲＮＡ　ｃＤＮＡ合成キット（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製；Ａ２８００７）を用い、機器としてはＶｅｒｉｔｉサーマル・サイクラー（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製）を用いて、付属の使用説明書に従って行った。具体的には下記手順に従って行った。 (3) Synthesis of cDNA For the synthesis of cDNA, a TaqMan (registered trademark) Advanced miRNA cDNA synthesis kit (Thermo Fisher Scientific Co.; A28007) was used as a reagent, and a Veriti Thermal Cycler (Thermo Fischer Scientific Co., Ltd.) was used according to the attached instruction manual. Specifically, the procedure was as follows.
　準備として、予め、ＲＮＡサンプルとｃＤＮＡ合成キットを氷上で溶かし、軽く旋回撹拌（ｖｏｒｔｅｘ）しておく。また、５０％　ＰＥＧ８０００を室温で溶かしておく。
　次に、以下の手順に従って行った。 As a preparation, the RNA sample and the cDNA synthesis kit are melted in advance on ice and gently swirled (vortex). In addition, 50% PEG8000 is melted at room temperature.
Next, the following procedure was performed.
　Ａ．Ｐｏｌｙ　Ａ　テーリング反応（ｔａｉｌｉｎｇ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）
　[１]下記試薬を含む反応液を入れたＰＣＲチューブを用意する。
　　　　１０Ｘ　Ｐｏｌｙ（Ａ）緩衝液　　　　　　　　　　　５．０μＬ
　　　　アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）　　　　　　　　　　　０．５μＬ
　　　　Ｐｏｌｙ（Ａ）酵素　　　　　　　　　　　　　　　　０．３μＬ
　　　　ＲＮａｓｅ－フリー水　　　　　　　　　　　　　　　１．７μＬ
　　　　全反応混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．０μＬ
　[２]上記反応混合液を軽く旋回撹拌（ｖｏｒｔｅｘ）する。
　[３]各チューブに２μＬのＲＮＡサンプルを加える。全容積を５μＬにする。
　[４]軽く旋回撹拌（ｖｏｒｔｅｘ）させる。
　[５]前記ＰＣＲチューブをサーマル・サイクラーに入れる。なお、反応容積（ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｖｏｌｕｍｅ）は、１０μＬを選ぶ。次に、下記のように所定の温度・時間で反応させる。
　３７℃で４５分、６５℃で１０分間、その後４℃で保持（ｈｏｌｄ）する。 A. Poly A tailing reaction
[1] Prepare a PCR tube containing a reaction solution containing the following reagents.
10X Poly(A) buffer 5.0 μL
Adenosine triphosphate (ATP) 0.5 μL
Poly(A) enzyme 0.3 μL
RNase-free water 1.7 μL
All reaction mixture 3.0 μL
[2] The reaction mixture is gently swirled (vortex).
[3] Add 2 μL of RNA sample to each tube. Bring the total volume to 5 μL.
[4] Gently vortex.
[5] Place the PCR tube in a thermal cycler. The reaction volume is selected to be 10 μL. Next, the reaction is performed at a predetermined temperature and time as described below.
Hold at 37° C. for 45 minutes, 65° C. for 10 minutes, then 4° C.
　Ｂ．アダプター・ライゲーション反応（Ａｄａｐｔｏｒ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）
　[１]下記試薬を含む反応液を入れたＰＣＲチューブを用意する。
　　　　５Ｘ　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　緩衝液　　　　　　　　３．０μＬ
　　　　５０％　ポリエチレングリコール（ＰＥＧ　８０００）４．５μＬ
　　　　２５Ｘ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ａｄａｐｔｏｒ　　　　　０．６μＬ
　　　　ＲＮＡ　ｌｉｇａｓｅ　　　　　　　　　　　　　　　１．５μＬ
　　　　ＲＮａｓｅ－フリー水　　　　　　　　　　　　　　　０．４μＬ
　　　　全反応混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０μＬ
　[２]上記反応混合液を軽く旋回撹拌（ｖｏｒｔｅｘ）する。
　[３]各チューブに５μＬのＰｏｌｙ（Ａ）テーリングサンプル全量を加える。全容積を１５μＬにする。
　[４]短時間、しっかりと、旋回撹拌（ｖｏｒｔｅｘ）してＰＥＧを混ぜる。
　[５]次にサーマル・サイクラーに入れて、反応を１６℃で６０分間、さらに４℃で保持して行う。 B. Adapter ligation reaction
[1] Prepare a PCR tube containing a reaction solution containing the following reagents.
5X DNA Ligase Buffer 3.0 μL
50% Polyethylene glycol (PEG 8000) 4.5 μL
25X Ligation adaptor 0.6 μL
RNA ligase 1.5 μL
RNase-free water 0.4 μL
Total reaction mixture 10.0 μL
[2] The reaction mixture is gently swirled (vortex).
[3] Add 5 μL of total Poly(A) tailing sample to each tube. Bring the total volume to 15 μL.
[4] Mix PEG by swirling and stirring (vortex) for a short time.
[5] Then put in a thermal cycler and carry out the reaction at 16° C. for 60 minutes and hold at 4° C.
　Ｃ．ＲＴ反応
　[１]下記試薬を含む反応液を入れたＰＣＲチューブを用意する。
　　　　５Ｘ　ＲＴ　緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　６．０μＬ
　　　　ｄＮＴＰ　ミックス　　　　　　　　　　　　　　　　１．２μＬ
　　　　２０Ｘ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＲＴ　プライマー　　　１．５μＬ
　　　　１０Ｘ　ＲＴ　酵素　ミックス　　　　　　　　　　　３．０μＬ
　　　　ＲＮａｓｅ－フリー水　　　　　　　　　　　　　　　３．３μＬ
　　　　全反応混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５．０μＬ
　[２]上記反応混合液を軽く旋回撹拌（ｖｏｒｔｅｘ）する。
　[３]各チューブに１５μＬのアダプター・ライゲーション反応サンプルを加える。
　　全容積は、３０μＬにする。
　[４]短時間、しっかりと、旋回撹拌（ｖｏｒｔｅｘ）する。
　[５]前記ＰＣＲチューブをサーマル・サイクラーに入れる。次に、下記のように所定の温度・時間で反応させる。
　すなわち、反応を、４２℃で１５分、８５℃で１０分間、更に４℃で４分間保持（ｈｏｌｄ）する。　 C. RT reaction [1] Prepare a PCR tube containing a reaction solution containing the following reagents.
5X RT buffer 6.0 μL
dNTP mix 1.2 μL
20X Universal RT Primer 1.5 μL
10X RT Enzyme Mix 3.0 μL
RNase-free water 3.3 μL
All reaction mixture 15.0 μL
[2] The reaction mixture is gently swirled (vortex).
[3] Add 15 μL of adapter ligation reaction sample to each tube.
The total volume is 30 μL.
[4] Firmly swirl and stir for a short time.
[5] Place the PCR tube in a thermal cycler. Next, the reaction is performed at a predetermined temperature and time as described below.
That is, the reaction is held at 42° C. for 15 minutes, 85° C. for 10 minutes, and further 4° C. for 4 minutes.
　Ｄ．ｍｉＲＮＡ－増幅反応
　[１]下記試薬を含む反応液を入れたＰＣＲチューブを用意する。
　　　　２Ｘ　ｍｉＲ－Ａｍｐ　Ｍａｓｔｅｒ　ｍｉｘ　　　２５．０μＬ
　　　　２０Ｘ　ｍｉＲ－Ａｍｐ　Ｐｒｉｍｅｒ　ｍｉｘ　　　２．５μＬ
　　　　ＲＮａｓｅ－フリー水　　　　　　　　　　　　　　１７．５μＬ
　　　　全反応混合液　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５．０μＬ
　[２]軽くＶｏｒｔｅｘする。
　[３]各チューブに５μＬのＲＴ反応サンプルを加える。全容積は５０μＬとする。
　[４]短時間、しっかりと、旋回撹拌（ｖｏｒｔｅｘ）する。
　[５]前記ＰＣＲチューブをサーマル・サイクラーに入れる。次に、下記のように所定の温度・時間で反応させる。
　反応は、９５℃で５分間、９５℃で３秒間、６０℃で、３０秒間（この９５－６０℃を１４サイクル）、９９℃で１０分間、その後４℃で保持（ｈｏｌｄ）した。 D. miRNA-amplification reaction [1] Prepare a PCR tube containing a reaction solution containing the following reagents.
2X miR-Amp Master mix 25.0 μL
20X miR-Amp Primer mix 2.5 μL
RNase-free water 17.5 μL
All reaction mixture 45.0 μL
[2] Vortex lightly.
[3] Add 5 μL of RT reaction sample to each tube. The total volume is 50 μL.
[4] Firmly swirl and stir for a short time.
[5] Place the PCR tube in a thermal cycler. Next, the reaction is performed at a predetermined temperature and time as described below.
The reaction was held at 95° C. for 5 minutes, 95° C. for 3 seconds, 60° C. for 30 seconds (this 95-60° C. for 14 cycles), 99° C. for 10 minutes, and then held at 4° C.
　（４）ｍｉＲＮＡの個別定量（ＱＰＣＲ）
　上記血清中の各ｍｉＲＮＡを、下記の方法により定量した。
　試薬としては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製；４４４４５５７）と各ｍｉＲＮＡ用プローブ（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製；Ａ２５５７６）を用い、機器としては、ＳｔｅｐＯｎｅ（登録商標）リアルタイム　ＰＣＲ用サーマル・サイクラー（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製）を用いて、付属の使用説明書に従って定量した。
　なお、ａｔｈ－ｍｉＲ－１５９ａのサイクル値（Ｃｔ値）を標準化のために用いた。相対的量は、比較Ｃｔ法（２－ΔΔＣｔ法）を用いて計算した。 (4) Individual quantification of miRNA (QPCR)
Each miRNA in the above serum was quantified by the following method.
As a reagent, TaqMan (registered trademark) Fast Advanced Master Mix (manufactured by Thermo Fisher Scientific, Inc.; 4444557) and each miRNA probe (manufactured by Thermo Fisher Scientific, Inc.; A25576) were used, and the instrument was used. , StepOne (registered trademark) using a thermal cycler for real-time PCR (manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) according to the attached instruction manual.
The cycle value (Ct value) of ath-miR-159a was used for standardization. Relative amounts were calculated using the comparative Ct method (2-ΔΔCt method).
　具体的には、下記手順に従って行った。
　[１]ｍｉＲ－増幅生成物（ａｍｐ　ｐｒｏｄｕｃｔ）をＲＮａｓｅ－フリー水で１：１０に希釈する。
　[２]混合ＱＰＣＲ溶液（ｍｉｘ　ＱＰＣＲ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を下記試薬を用いて、反応数＋１で調製し、１９μｌずつ分注する。
　　　　２Ｘ　Ｔａｑｍａｎ　Ｆａｓｔ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｍａｓｔｅｒ　ｍｉｘ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０μＬ
　　　　ｍｉＲ－増幅生成物　　　　　　　　　　　　　　　　０．５μＬ
　　　　ＲＮａｓｅ－フリー水　　　　　　　　　　　　　　　８．５μＬ
　[３]ＴａｑＭａｎ　プローブを１μＬずつ加える。
　[４]ＰＣＲの手順は、次のようにする。
　すなわち、９５℃で２０秒間、９５℃で１秒間、及び、６０℃で２０秒間（この９５℃―６０℃を４０サイクル）。 Specifically, the procedure was as follows.
[1] Dilute the miR-amplification product (amp product) 1:10 with RNase-free water.
[2] A mixed QPCR solution (mix QPCR solution) is prepared using the following reagents in a reaction number of +1 and dispensed in 19 μl portions.
2X Taqman Fast Advanced master mix 10 μL
miR-amplification product 0.5 μL
RNase-free water 8.5 μL
[3] Add 1 μL each of TaqMan probe.
[4] The PCR procedure is as follows.
That is, 95° C. for 20 seconds, 95° C. for 1 second, and 60° C. for 20 seconds (95° C.-60° C. for 40 cycles).
　ｍｉＲＮＡ濃度の測定は、上記リアルタイムＰＣＲ法にて、測定対象であるｍｉＲＮＡの増幅による蛍光強度が所定の値を超えるまでに要したＰＣＲ反応のサイクル数を計測し、コントロールとの差を算出することによって行なった。 The miRNA concentration is measured by measuring the number of cycles of the PCR reaction required until the fluorescence intensity due to amplification of the miRNA to be measured exceeds a predetermined value by the real-time PCR method, and calculating the difference from the control. Done by.
　（５）統計解析
　上記測定で得られたデータについては、特に指摘しない限り、平均±標準偏差（ｍｅａｎ±ＳＤ）として表した。得られたデータの正規分布性については、シャピロ・ウィルク検定を行った。
　連続変数に対しては、正規分布する変数間の比較についてはスチューデントのｔ検定を用い、異常分布に対しては、マン・ホイットニーのＵ検定を用いた。非正規分布する多数の標本の比較のためには、クラスカル・ウォリス検定とそれに続けてスティールドゥワス検定を用いた。
　離散変数は、χ２検定（カイ二乗検定）の分割表の分析により比較した。
　ＲＯＣ曲線は、診断する心房細動のｍｉＲＮＡのＲＯＣ曲線下面積の値を算出するために用い、また、ヨーデンの指標も算出した。二つの変数間の関係は、ピアソンの相関係数検定を用いて検討した。
　上記統計解析は、統計分析ソフトウェア（ＪＭＰ　１１（登録商標）　ｓｏｆｔｗａｒｅ；ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ．製）を用いて行った。なお、Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であるとした。 (5) Statistical analysis The data obtained by the above measurement are expressed as mean±standard deviation (mean±SD) unless otherwise specified. The Shapiro-Wilk test was performed for the normal distribution of the obtained data.
For continuous variables, Student's t-test was used for comparisons between normally distributed variables, and for abnormal distributions, Mann-Whitney U-test was used. The Kruskal-Wallis test followed by the Steel Dewas test was used for comparison of a large number of non-normally distributed samples.
Discrete variables were compared by analysis of a contingency table of the χ 2 test (chi-square test).
The ROC curve was used to calculate the value of the area under the ROC curve of the atrial fibrillation miRNA to be diagnosed, and also the index of iodine was calculated. The relationship between the two variables was examined using the Pearson's correlation coefficient test.
The statistical analysis was performed using statistical analysis software (JMP 11 (registered trademark) software; manufactured by SAS Institute Inc.). In addition, P<0.05 was considered to be statistically significant.
３．解析結果
　（１）個別ｍｉＲＮＡの定量解析
　図３に、ＡＦ心房細動患者（ＡＦ）グループと非心房細動患者（健常者；Ｎｏｎ－ＡＦ）グループにおいて検出されたｍｉＲＮＡの相対的量を示した。
　図３に示した結果から明らかなように、ＡＦグループにおいては、ｍｉＲＮＡのうち、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、及びｍｉＲ－３４２－５ｐの量の増加が顕著であるが、Ｎｏｎ－ＡＦグループではそのような増加は認められない（ただし、ｐ＜０．０５）。 3. Analysis results (1) Quantitative analysis of individual miRNAs Fig. 3 shows the relative amounts of miRNAs detected in the AF atrial fibrillation patient (AF) group and the non-atrial fibrillation patient (healthy person; Non-AF) group. ..
As is clear from the results shown in FIG. 3, in the AF group, the amount of miR-99a-5p, miR-192-5p, miR-214-3p, and miR-342-5p among the miRNAs increased. Significantly, no such increase was observed in the Non-AF group (however p<0.05).
　次に、図４に示すように、非ＡＦ患者である若年健常者（ＹＣグループ）及び年齢適合対照（ＡＣ）グループと、ＡＦ患者である発作性ＡＦ（ＰＡＦ）グループ及び慢性ＡＦグループ（ＣＡＦ）について上記４種のｍｉＲＮＡの量を比較した。
　クラスカル-ウォリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ　ｔｅｓｔ）では、前記４グループの間で前記４種のｍｉＲＮＡの量が顕著に相違していた（ただし、それぞれ、ｐ＜０．０５）。 Next, as shown in FIG. 4, non-AF patients, young healthy people (YC group) and age-matched control (AC) group, and AF patients, paroxysmal AF (PAF) group and chronic AF group (CAF). The amounts of the above-mentioned four types of miRNAs were compared.
In the Kruskal-Wallis test, the amounts of the four miRNAs were significantly different among the four groups (however, p<0.05, respectively).
　スティールドゥワス（Ｓｔｅｅｌ－Ｄｗａｓｓ法による多重比較では、ＹＣ及びＡＣグループに比して、ＰＡＦグループにおいて、ｍｉＲ－２１４－３ｐ及びｍｉＲ－３４２－５ｐの量が増加していた。また、ＣＡＦグループにおいても、ＹＣ及びＡＣグループに対して顕著に増加していることが認められた（ただし、ｐ＜０．０５）。
　しかしながら、ＰＡＦ及びＣＡＦグループ間の比較では、前記４種のｍｉＲＮＡにおいて有意の相違は認められなかった。
　これらの知見は、ｍｉＲ－２１４－３ｐ及びｍｉＲ－３４２－５ｐの２種のｍｉＲＮＡは、被験者の年齢に依存しない、心房細動を予想するために有効なバイオマーカーとなり得ることを示していると考えられる。 In the multiple comparison by the Steel-Dwas method, the amount of miR-214-3p and miR-342-5p was increased in the PAF group as compared with the YC and AC groups, and in the CAF group. Was also observed to be significantly increased for the YC and AC groups (however, p<0.05).
However, in the comparison between the PAF and CAF groups, no significant difference was observed in the four miRNAs.
These findings indicate that the two miRNAs, miR-214-3p and miR-342-5p, could be effective biomarkers for predicting atrial fibrillation, independent of the subject's age. Conceivable.
　（２）ＲＯＣ曲線の解析
　上記の４種のｍｉＲＮＡの定量により心房細動の発症の予想をすることができるかどうかを明確にするため、ＲＯＣ曲線の解析を行った。その結果を図５及び図６、並びに表Ｉ及び表IIに示す。
　図５において、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、及びｍｉＲ－３４２－５ｐについて、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ：ａｒｅａ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｕｒｖｅ）は、それぞれ、０．６７、０．７３、０．７８及び０．７９であった。また、ヨーデン指数（Ｙｏｕｄｅｎ‘ｓ　ｉｎｄｉｃｅｓ）は、それぞれ、０．３８、０．４４、０．５０及び０．５０であった。 (2) Analysis of ROC curve In order to clarify whether or not the onset of atrial fibrillation can be predicted by quantifying the above-mentioned four types of miRNAs, the ROC curve was analyzed. The results are shown in FIGS. 5 and 6 and Tables I and II.
In FIG. 5, the area under the ROC curve (AUC: area under the curve) for miR-99a-5p, miR-192-5p, miR-214-3p, and miR-342-5p is 0.67, respectively. It was 0.73, 0.78 and 0.79. In addition, the Youden's indices were 0.38, 0.44, 0.50 and 0.50, respectively.
　次に、表Ｉ、表II及び図６に示すように、前記４種全て又は２種（ｍｉＲ－２１４－３ｐ、及びｍｉＲ－３４２－５ｐ）のｍｉＲＮＡを組合わせで構成される診断パネルとしての有効性を確かめた。すなわち、個々のＲＯＣ曲線解析に従って各ｍｉＲＮＡのカットオフ値より得られるスコア（０又は１）を設定、合計して、診断パネルのスコアを算出した。その結果として、前記診断パネルにおいては、ヨーデン指数が、４種のｍｉＲＮＡについては０．５６、２種のｍｉＲＮＡについては０．５０になり、幾らか改善されることが確かめられた。 Next, as shown in Tables I and II and FIG. 6, as a diagnostic panel composed of a combination of all four types or two types (miR-214-3p and miR-342-5p) of miRNAs. I confirmed the effectiveness. That is, the score (0 or 1) obtained from the cut-off value of each miRNA was set according to individual ROC curve analysis, and the scores were summed to calculate the score of the diagnostic panel. As a result, in the diagnostic panel, it was confirmed that the Yoden index was 0.56 for 4 types of miRNAs and 0.50 for 2 types of miRNAs, and was slightly improved.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
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　（３）結論
　以上の結果に基づき、新たな前記４種のｍｉＲＮＡが心房細動のバイオマーカーになり得ることが示めされた。
　したがって、本発明により、心房性不整脈の診断又は発症を予測するための心房性不整脈検査方法及び検査システムを提供することができる。すなわち、簡易かつ安価な方法で、心房性不整脈、特に心房細動に関連して発現するｍｉＲＮＡを効果的に検出することができるため、心房性不整脈の早期発見、診断及び治療が可能になる。また、本発明の方法により、患者血液を用いて心房性不整脈を低侵襲的に検出できるため、心房性不整脈を簡便かつ迅速に検出することが可能になる。 (3) Conclusion Based on the above results, it was shown that the above-mentioned four new miRNAs can be biomarkers for atrial fibrillation.
Therefore, the present invention can provide an atrial arrhythmia examination method and examination system for diagnosing or predicting the onset of atrial arrhythmia. That is, atrial arrhythmia, particularly miRNA expressed in association with atrial fibrillation, can be effectively detected by a simple and inexpensive method, which enables early detection, diagnosis, and treatment of atrial arrhythmia. Further, according to the method of the present invention, atrial arrhythmia can be detected in a minimally invasive manner using patient blood, so that atrial arrhythmia can be detected simply and quickly.
　本発明は、医療の分野において利用することができる。 The present invention can be used in the medical field.
　１００　心房性不整脈検査システム
　１０１　定量測定部
　１０２　データ入出力部
　１０３　統計解析部
　１０４　制御部
　１０５　操作部
　１０６　表示部
　１０７　記憶部 100 atrial arrhythmia examination system 101 quantitative measurement unit 102 data input/output unit 103 statistical analysis unit 104 control unit 105 operation unit 106 display unit 107 storage unit

Claims (10)

  1. 　心房性不整脈の診断又は発症を予測するための心房性不整脈検査方法であって、
    　被験者から得られる非細胞性生体液中に含まれるマイクロＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」という。）のうちの、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、及びｍｉＲ－３４２－５ｐの４種のうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡを定量する工程を含む心房性不整脈検査方法。     An atrial arrhythmia test method for predicting the diagnosis or onset of atrial arrhythmia,
    MiR-99a-5p, miR-192-5p, miR-214-3p, and miR-342 of microRNAs (hereinafter referred to as "miRNAs") contained in acellular biological fluid obtained from a subject A target gene which is the same as or more than 6 base sequences out of the 2nd to 8th 7 base sequences and at least one miRNA of at least one of 4 types of 5p or the same target gene A method for examining atrial arrhythmia, which comprises a step of quantifying at least one miRNA among the miRNAs that the miRNA has.
  2. 　前記ｍｉＲＮＡを定量する工程において、前記４種のｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種を含む複数種のｍｉＲＮＡを定量する請求項１に記載の心房性不整脈検査方法。 In the step of quantifying the miRNA, at least one of the four miRNAs or at least one miRNA of the four miRNAs is identical to the second to eighth 7-nucleotide sequences in 6 or more nucleotide sequences. The atrial arrhythmia test method according to claim 1, wherein a plurality of miRNAs including at least one of the miRNAs having the same or the same target gene is quantified.
  3. 　前記ｍｉＲＮＡの定量を測定する工程において、前記４種のｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種を含む複数種のｍｉＲＮＡを組み合わせて構成される診断パネルに含まれる各ｍｉＲＮＡについて定量する請求項１又は請求項２に記載の心房性不整脈検査方法。 In the step of measuring the quantification of the miRNA, at least one of the four miRNAs or at least one miRNA of the four miRNAs and 6 or more nucleotide sequences of the second to eighth 7 nucleotide sequences are The quantification for each miRNA included in a diagnostic panel configured by combining a plurality of types of miRNA including at least one type of miRNA having the same or the same target gene is determined for each miRNA. Atrial arrhythmia test method.
  4. 　前記非細胞性生体液が、血液である請求項１から請求項３までのいずれか一項に記載の心房性不整脈検査方法。 The atrial arrhythmia examination method according to any one of claims 1 to 3, wherein the non-cellular biological fluid is blood.
  5. 　前記心房性不整脈が、心房細動である請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の心房性不整脈検査方法。 The atrial arrhythmia examination method according to any one of claims 1 to 4, wherein the atrial arrhythmia is atrial fibrillation.
  6. 　少なくとも下記工程（１）～（４）を含む請求項１から請求項５までのいずれか一項に記載の心房性不整脈検査方法。
    　（１）血液を採血し、血漿又は血清を分離して採取する工程
    　（２）前記血漿又は前記血清からＲＮＡを分離・抽出する工程
    　（３）前記分離・抽出された前記ＲＮＡのうち、前記４種のうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡを定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（以下、「定量的ＲＴ－ＰＣＲ法」という。）により測定をする工程
    　（４）前記定量的ＲＴ－ＰＣＲ法による測定で得られたデータについて統計解析をする工程     The atrial arrhythmia examination method according to any one of claims 1 to 5, which includes at least the following steps (1) to (4).
    (1) A step of collecting blood and separating and collecting plasma or serum (2) A step of separating/extracting RNA from the plasma or the serum (3) Of the separated/extracted RNA, the above-mentioned 4 Among miRNAs in which at least one of the four species or at least one of the four species is the same as or more than 6 nucleotide sequences of the 7th nucleotide sequence of the 2nd to 8th or having the same target gene Of at least one miRNA of (1) by a quantitative reverse transcription polymerase chain reaction method (hereinafter, referred to as “quantitative RT-PCR method”) (4) Obtained by the quantitative RT-PCR method Process of statistical analysis of data
  7. 　心房性不整脈の診断又は発症を予測するための心房性不整脈検査システムであって、
    　少なくとも、被験者から得られる非細胞性生体液中に含まれるｍｉＲＮＡのうち、心房性不整脈に関連するｍｉＲＮＡの定量を含む測定データ及び解析データの入出力部と、
    　入力された測定データの統計解析部と、を具備する心房性不整脈検査システム。     An atrial arrhythmia test system for diagnosing or predicting atrial arrhythmia,
    At least, an input/output unit of measurement data and analysis data including quantification of miRNA related to atrial arrhythmia among miRNAs contained in acellular biological fluid obtained from a subject,
    An atrial arrhythmia examination system comprising: a statistical analysis unit of input measurement data.
  8. 　さらに、ｍｉＲＮＡの定量測定部を具備している請求項７に記載の心房性不整脈検査システム。 The atrial arrhythmia test system according to claim 7, further comprising a miRNA quantitative measurement unit.
  9. 前記心房性不整脈に関連するｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１９２－５ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、及びｍｉＲ－３４２－５ｐの４種のうちの少なくとも１種又は当該４種のうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡと２番目～８番目の７塩基配列のうち６塩基配列以上が同一であるか又は同一の標的遺伝子を有するｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種のｍｉＲＮＡである請求項７又は請求項８に記載の心房性不整脈検査システム。 The atrial arrhythmia-related miRNA is at least one of four types of miR-99a-5p, miR-192-5p, miR-214-3p, and miR-342-5p, or among the four types. 8. The at least one miRNA and at least one miRNA having the same 6-base sequence or more among the second to eighth 7-base sequences, or at least one miRNA having the same target gene. 8. The atrial arrhythmia examination system according to 8.
  10. 　請求項１から請求項６までのいずれか一項に記載の心房性不整脈検査方法を実施するための検査システムである請求項７から請求項９までのいずれか一項に記載の心房性不整脈検査システム。 The atrial arrhythmia test according to any one of claims 7 to 9, which is an inspection system for carrying out the atrial arrhythmia inspection method according to any one of claims 1 to 6. system.
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