WO2020127899A1

WO2020127899A1 - Verwendung von zweiphotonen-photosensibilisatoren

Info

Publication number: WO2020127899A1
Application number: PCT/EP2019/086564
Authority: WO
Inventors: Markus LUNZER; Stefan Baudis; Aleksandr Ovsianikov; Robert Liska
Original assignee: Technische Universitaet Wien
Current assignee: Technische Universitaet Wien
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2020-06-25
Anticipated expiration: 2021-06-20
Also published as: AT522010A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Zweiphotonen-Photosensibilisatoren zum photochemischen Spalten von in einer festen oder halbfesten Matrix enthaltenen Disulfidbindungen, -S-S-, durch In-Kontakt-Bringen der Disulfidbindungen mit einem Zweiphotonen-Photosensibilisator und Bestrahlung des dadurch erhaltenen Reaktionsgemischs mit Licht mit einer geeigneten Wellenlänge, um Zweiphotonen-Absorption des Photosensibilisators zu ermöglichen, wonach der Photosensibilisator, ohne eine intramolekulare Spaltung zu erfahren, die aufgenommene Energie auf die Disulfidbindungen überträgt und dadurch deren Spaltung bewirkt.

Description

Verwendung von Zweiphotonen-Photosensibilisatoren

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Zweiphotonen-Photosensibili- satoren zum photochemischen Spalten von in einer festen oder halbfesten Matrix ent haltenen Bindungen.

STAND DER TECHNIK

Hydrogele sind stark hydratisierte Polymernetzwerke mit vielseitig steuerbaren Eigen schaften und werden derzeit in diversen Strategien für die Erforschung von Zellfunk tionen, Tissue Engineering, regenerative Medizin und Zellfreisetzung eingesetzt, da mit ihnen unter anderem die physikochemischen Eigenschaften der nativen extrazel lulären Matrix (EZM) von biologischem Weichgewebe nachgeahmt werden können (siehe z.B. Tibbitt et al., Biotechnol. Bioeng. 103, 655-663 (2009). Unter Einsatz von photosensitiven Hydrogelen können darüber hinaus die physikalischen und chemi schen Eigenschaften der Gele auf vergleichsweise einfache und saubere Weise durch den Einsatz von Licht dynamisch gesteuert werden.

Dabei erfolgt der Abbau der Hydrogele üblicherweise durch direkte Bestrahlung mittels UV/VIS-Licht oder -Lasern, wobei die Gele photolabile funktionelle Gruppen in der Hauptkette enthalten, die bei Bestrahlung mit Licht geeigneter Wellenlänge eine Spal tung erfahren, wodurch das Hydrogel abgebaut wird (siehe z.B. DeForest und Anseth, Nat. Chem. 3, 925-931 (201 1 ); Tibbitt et al., Soft Matter 6, 5100-5108 (2010); Griffin und Kasko, J. Am. Chem. Soc. 134, 13103-13107 (2012)).

Neben Cumarin-Derivate, Ruthenium-Komplexe oder 7-Nitroindolyl-Gruppierungen enthaltenden Gelen (siehe z.B. Azagarsamy et al., ACS Macro Lett. 3, 515-519 (2014); Lee und Kim, J. Appl. Polym. Sei. 124, 4339-4345 (2012); Wong et al., Macromolecules 43, 2824-2831 (2010); Theis et al., Angew. Chem. Int. Ed. 56, 15857-15860 (2017), und Angew. Chem. 129, 16071 -16075 (2017); Rapp et al., Chem. Eur. J. 24, 2328- 2333 (2018)), kommen dazu mitunter auch Gele zum Einsatz, die in die Ketten einge bettete o-Nitrobenzyl- (oNB-) Gruppierungen enthalten, da o-NB-Gruppierungen eben- falls mittels Bestrahlung spaltbar sind (siehe z.B. Zhao et al., Macromolecules 45, 1723-1736 (2012)), ihre Synthese und Handhabung sich aber einfacher gestaltet.

Erst kürzlich haben auch die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes in Lunzer et al., "A Modular Approach to Sensitized Two-Photon Patterning of Photo- degradable Hydrogels", Angew. Chem. Int. Ed., DOI: 10.1002/anie.201808908 (veröf fentlicht am 6. September 2018), den photoinduzierten Abbau von auf oNB-Gruppie- rungen in der Hauptkette basierenden, photoabbaubaren Hydrogelsystemen auf Basis von Hyaluronsäure offenbart, allerdings unter Verwendung von Zweiphotonen-Photo- initiatoren als Sensibilisatoren, d. h. Energieüberträger auf die spaltbaren oNB-Grup- pen. Bei dem Gel handelte es sich um ein zytokompatibles Hydrogel aus mit Poly ethylenglykol (PEG) vernetzten Hyaluronsäureketten, die darüber hinaus o-Nitroben- zylester-Verbindungen zwischen den Hyaluronsäureketten aufweisen und selbst in Gegenwart lebender Zellen unter Einsatz des Zweiphotonen-Sensibilisators photo- degradierbar sind.

Gängige, in der Polymerchemie eingesetzte Photoinitiatoren absorbieren in der Regel ein einziges Photon, üblicherweise bei Wellenlängen im UV-Bereich, und erfahren da durch eine intramolekulare Spaltung einer oder mehrerer Bindungen unter Ausbildung von entweder ionischen Resten oder (zumeist) freien Radikalen, üblicherweise unter gleichzeitiger Isomerisierung und Abspaltung einer reaktiven Gruppe. Zweiphotonen initiatoren bzw. -Sensibilisatoren sind hingegen ebenfalls in der Polymerchemie ein gesetzte Photoinitiatoren mit Chromophoren Gruppierungen, bei denen erst nach Ab sorption zweier Photonen der ein reaktiver angeregter Zustand erreicht wird. Dies bie tet mehrere Vorteile: Zum einen kann im Bereich größerer Wellenlängen, z.B. im na hen Infrarotbereich (d.h. mit NIR-Lasern), und folglich bei niedrigeren Energieniveaus gearbeitet werden, wodurch höhere Eindringtiefen der zur Anregung eingesetzten Strahlung in das jeweilige Medium sowie eine räumlich enger begrenzte Fokussierung ermöglicht werden. Zum anderen kommt es zu keiner intramolekularen Spaltung des Initiators und somit nicht zur Teilnahme von Fragmenten des Initiators an den durch die Bestrahlung ausgelösten chemischen Reaktionen, z. B. Photopolymerisation, da der Zweiphotonen-Initiator die aufgenommene Energie mittels eines Elektronentrans- fers auf einen geeigneten Akzeptor, z. B. eine Doppelbindung eines photopolymerisier- baren Monomers, abgibt, das dabei gleichzeitig am Initiatormolekül entstehende Kat ion jedoch mesomeriestabilisiert wird (siehe z. B. Albota et al., Science 281 , 1653- 1656 (1998); Cumpston et al., Nature 398, 51 -54 (1999)).

Dadurch besteht selbst bei der Spaltung von lebende Zellen enthaltenden Hydrogelen keine Gefahr einer Schädigung der unmittelbar neben dem bestrahlten Bereich befind lichen Zellen während des Bestrahlungsvorgangs, da die Anregung wie erwähnt im nahen Infrarotbereich (NIR) erfolgt, wo Zellen und auch die Komponenten von Hydro gelen, die biologisches Weichgewebe nachahmen, praktisch keine Absorption zeigen. oNB-Derivate als photospaltbare Gruppierungen innerhalb der Ketten von Hydrogelen oder anderen festen oder halbfesten Matrices haben allerdings den Nachteil, dass ihre Synthese zwar einfacher als jene anderer Chromophore ist, sich aber dennoch weiter hin vergleichweise aufwändig gestaltet. Zudem sind oNB-Derivate, wie auch andere photospaltbare Gruppen, nur irreversibel photospaltbar und daher inherent lichtemp findlich, weshalb ihre Handhabung unter Lichtschutz zu erfolgen hat.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung vor diesem Hintergrund war die Entwicklung eines neuen Verfahrens zur photoinduzierten Spaltung spezifischer Bindungen in festen oder halbfesten Matrices, deren Synthese sich einfacher gestaltet als jene auf Basis konventioneller photospaltbarer Gruppen, wie z.B. o-Nitrobenzyl-Gruppierun- gen, und die geringere Lichtempfindlichkeit aufweisen.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Dieses Ziel erreicht die vorliegende Erfindung durch Bereitstellung der Verwendung von Zweiphotonen-Photosensibilisatoren zum photochemischen Spalten von in einer festen oder halbfesten Matrix enthaltenen Disulfidbindungen, -S-S-, durch In-Kontakt- Bringen der Disulfidbindungen mit einem Zweiphotonen-Photosensibilisator und Be strahlung des dadurch erhaltenen Reaktionsgemischs mit Licht mit einer geeigneten Wellenlänge, um Zweiphotonen-Absorption des Photosensibilisators zu ermöglichen, wonach der Photosensibilisator, ohne eine intramolekulare Spaltung zu erfahren, die aufgenommene Energie auf die Disulfidbindungen überträgt und dadurch deren Spal tung bewirkt.

Die vorliegende Erfindung beruht dabei auf der überraschenden Erkenntnis der Erfin der, dass auch Disulfidbindungen durch Transfer eines Elektrons von einem im ange regten Zustand vorliegenden Zweiphotonen-Photosensibilisator photoinduziert spalt bar sind - und zwar, ohne dass das in der Chromophoren Gruppierung des Sensibili sators mesomeriestabilisierte Kation eine chemische Reaktion mit den Disulfidbindun gen oder deren Spaltprodukten eingeht. Diese Tatsache war umso überraschender, da aus der Fachliteratur (Zieger et al., Angew. Chem. Int. Ed. 56, 5625-5629 (2017)) bekannt war, dass Disulfidbindungen unter Anwendung von Zweiphotonen-Sensibili- sierung erzeugt werden können, anstatt sie zu spalten.

Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, nehmen die Erfinder an, dass es nach dem Elektronentransfer vom Photosensibilisator auf die Disulfidbindung zu einer Spal tung der Bindung unter Ausbildung eines freien Thiylradikals, -S-, und eines Thiolat- anions, -S , kommt, wobei Letzteres in wässrigen Systemen anzunehmenderweise unter Anlagerung eines H⁺-lons zu einem Thiol -SH weiterreagiert. Dass allerdings offenbar weder das Thiylradikal noch das Thiolatanion mit dem mesomeriestabilisier- ten Kation des Sensibilisators reagiert - was sich anhand des Umstands zeigt, dass es in den bestrahlten Gelen zu keinerlei Verfärbungen kam und folglich die Chromo phore Gruppierung des Sensibilisators keine Reaktion eingegangen sein konnte -, war dabei besonders überraschend. Die Aufklärung des genauen Reaktionsmechanismus ist Gegenstand derzeitiger Forschungen der Erfinder.

In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die zu spaltenden Disulfidbindungen in einer von einem Polymernetzwerk, noch bevorzugter einem über diese Disulfidbindungen vernetzten Polymernetzwerk, gebildeten Matrix enthalten, wo durch die Spaltung der Bindungen jeweils zu einer lokalen Erweiterung der Matrix führt.

Das Polymernetzwerk ist dabei vorzugsweise ein Gel, insbesondere ein Hydrogel, das unter anderem für die eingangs erwähnten Zwecke eingesetzt werden kann. Die Vermischung des Zweiphotonen-Photosensibilisators mit dem Gel erfolgt gemäß weiterer bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung auf einfache Weise, indem das Gel mit einer Lösung des Zweiphotonen-Photosensibilisators in einem geeigneten Lösungsmittel, bei Hydrogelen beispielsweise Wasser, gequollen wird, um den Zwei- photonen-Photosensibilisator möglichst gleichmäßig im Gel zu verteilen, bevor die Bestrahlung erfolgt.

Eine solche Lösung des Zweiphotonen-Photosensibilisators weist vorzugsweise eine relativ niedrige Konzentration von nur etwa 0,01 mM bis etwa 1 mM, noch bevorzugter von etwa 0,05 mM bis etwa 0,5 mM, insbesondere von etwa 0,1 mM, auf, um Kosten zu sparen, die Wechselwirkung mit etwaigen im Gel verkapselten lebenden Zellen ge ring zu halten und ein Übermaß an Spaltungsreaktionen - oder auch, in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Gels, etwaiger Nebenreaktionen - zu verhindern.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen können durch die Spaltung der Disulfid bindungen Spaltprodukte, vorzugsweise solche mit einer wünschenswerten chemi schen und/oder biologischen Aktivität, von der Matrix abgelöst werden. Auf diese Weise kann das die Disulfidbindungen enthaltende Gel oder Hydrogel beispielsweise zur Wirkstoff- oder Arzneimittelabgabe an biologische Systeme, wie z.B. lebende Zel len oder Gewebe, dienen. Dazu können beispielsweise Wirkstoffgruppierungen jeweils über eine - oder auch zwischen zwei - Disulfidbrücke(n) in das Gel eingebaut werden.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden durch die Spal tung der Disulfidbindungen sowie anschließendes Auswaschen des Photosensibilisa tors und zumindest eines Teils etwaiger Spaltprodukte aus der jeweils bestrahlten Stelle ein oder mehrere Kanäle in der Matrix ausgebildet. Dies wird dadurch ermög licht, dass aufgrund der Verwendung von Strahlung größerer Wellenlänge als im Falle von herkömmlichen Einphotonen-Initiatoren sowie der quadratischen Abhängigkeit der Zweiphotonen-Absorption von der Intensität des Lichts (im Gegensatz zur linearen Abhängigkeit im Falle herkömmlicher Einphotonen-Absorption) eine Beschränkung des anregungsaktiven Volumens des Lichtstrahls erfolgen kann, d.h. die Bindungs spaltung auf einen deutlich kleineren Bereich begrenzt werden kann, so dass bei ge- eigneter intermittierender Verlagerung des Strahlungsfokus innerhalb des Gels nach und nach ein der Bewegung des Fokussierungspunkts entsprechender Gang oder Kanal innerhalb des Gels, beispielsweise von einem äußeren Rand des Gels in dessen Inneres hinein, ausgebildet wird. Derartige mit Kanälen versehene Gele können vielerlei Anwendung finden, beispielsweise zur Vermehrung lebender Zellen innerhalb der Kanäle oder auch als Mikrofluidikvorrichtungen oder dergleichen.

Gemäß vorliegender Erfindung sind zwar prinzipiell alle bekannten Zweiphotonen- Photosensibilisatoren einsetzbar, allerdings wird vorzugsweise ein Photosensibilisator mit einem Zweiphotonen-Wirkungsquerschnitt 02p > 1 GM (Goeppert-Mayer) im ent sprechenden relevanten Spektralbereich eingesetzt, um keine übermäßig hohe Licht intensität und/oder lange Bestrahlungsdauer wählen zu müssen.

In diesem Zusammenhang sei zudem festgehalten, dass aufgrund der identischen Wir- kungsweise und folglich derselben Vorteile wie bei der Zweiphotonen-Absorption dem einschlägigen Fachmann bewusst ist, dass gemäß vorliegender Erfindung anstelle von Zweiphotonen- auch Drei- oder Mehrphotonen-Sensibilisatoren einsetzbar sein und zu vergleichbaren Ergebnissen führen sollten. Aufgrund des noch höheren Energie bedarfs als im Falle der Zweiphotonen-Absorption sind derartige Ausführungsformen jedoch nicht zu bevorzugen, weswegen hierin auch nicht näher darauf eingegangen wird.

In bevorzugten Ausführungsformen wird gemäß vorliegender Erfindung ein aus der Klasse der Benzyliden-Derivate ausgewählter Zweiphotonen-Photosensibilisator, vor- zugsweise einer der nachstehend dargestellten Benzylidenketon-Initiatoren P2CK, M2CMK, G2CK und E2CK, eingesetzt, wie er von den Erfindern bereits erfolgreich zur bekannten Spaltung von o-Nitrobenzyl-Gruppierungen enthaltenden Flydrogelen ein gesetzt wurde (siehe "Lunzer et al.", oben):

In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird gemäß vorliegender Erfindung der nachstehend dargestellte Benzyliden-Initiator R1 eingesetzt:

Und schießlich sieht die vorliegende Erfindung in bevorzugten Ausführungsformen vor, dass die Spaltung der Disulfidbindungen im Verlauf eines 3D-Druckverfahrens oder im Anschluss daran durchgeführt wird, was speziell im Falle der gewünschten Erzeugung von Kanälen in den Matrices eine exakte Programmierung der Verlagerung des Strah lungsfokus innerhalb der jeweiligen Matrix sowie eine rasche Anfertigung der Kanäle ermöglicht. KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand von nichteinschränkenden Bei spielen sowie unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher beschrie ben, die Folgendes darstellen: Fig. 1 zeigt Lichtmikroskop-Aufnahmen bei 10facher Vergrößerung von in Vergleichs beispiel 1 und Beispiel 1 bestrahlten Hydrogelen.

Fig. 2 zeigt Lichtmikroskop-Aufnahmen bei 10facher Vergrößerung von in Vergleichs beispiel 2, Beispiel 2 und Beispiel 3 bestrahlten Organogelen. BEISPIELE

Die in den nachfolgenden Beispielen eingesetzten Chemikalien, so auch die Sensibi lisatoren, wurden aus kommerziellen Quellen bezogen und, sofern nicht Gegenteiliges angegeben ist, ohne weitere Reinigung in den beschriebenen Reaktionen eingesetzt. Als Ausgangsprodukt zur Herstellung der Solvogele wurde das nachstehend darge stellte Tetraol 4arm-PEG5k-SH, ein sternförmig verzweigtes Polyethylenglykolthiol auf Basis von PEGyliertem Pentaerythrit mit einem mittleren zahlenmäßigen Molekularge wicht von etwa 5.000 eingesetzt, das von Sigma Aldrich unter der Katalognr. JKA7002 erhältlich ist:

4arm-PEG5k-SH Svnthesebeispiel 1 - Herstellung von Hvdroqelen

Zu einer Lösung von 4arm-PEG5k-SH (10 Gew.-%) in deionisiertem Wasser wurden Nal und 30%iges Wasserstoffperoxid in solchen Mengen zugesetzt, dass die Endkon zentration von Nal 1 mM und jene von H2O2 1 Gew.-% betrug. Von der so erhaltenen Makromer-Lösung wurden 27 pl in zylindrische Silikon-Formen (von Sigma Aldrich) auf Hochpräzisions-Glasträgern (erhältlich von Ibidi) pipettiert und mit Octadecyl-modifi- zierten Deckplättchen (von Carl Roth) abgedeckt. Die Reaktionsgemische wurden zu mindest 1 h lang bei Raumtemperatur umgesetzt, um über Disulfidbindungen vernetzte Hydrogele zu erhalten, die danach mit deionisiertem Wasser gewaschen und über Nacht bei Raumtemperatur in deionisiertem Wasser gequollen wurden.

Zur Herstellung Sensibilisator-hältiger Hydrogele wurden die über Nacht in Wasser gequollenen Gele jeweils unmittelbar vor ihrer Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren zumindest 1 h lang in einer 0,1 mM wässrigen Sensibilisator-Lösung ge quollen. Danach wurde die jeweilige zylindrische Gelprobe mit einem Skalpell in gera der Linie durchtrennt, um eine glatte Kante zu erhalten.

Svnthesebeispiel 2 - Herstellung von Organogelen auf Acetonitril-Basis

Die Synthese dieser Organogele erfolgte in analoger Weise zu Synthesebeispiel 1 , wobei anstelle von deionisiertem Wasser Acetonitril als Lösungs- und Quellmittel ein gesetzt wurde und die Reaktionsdauer zumindest 1 ,5 h betrug.

Zur Herstellung Sensibilisator-hältiger Organogele wurden die über Nacht in Acetonitril gequollenen Gele jeweils unmittelbar vor ihrer Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren zumindest 1 ,5 h lang in einer 0,5 mM Sensibilisator-Lösung in Acetonitril gequollen und danach wie in Synthesebeispiel 1 geschnitten.

Vergleichsbeispiele 1 und 2, Beispiele 1 bis 3

Die in den Synthesebeispielen hergestellten Solvogele wurden zunächst ohne und an schließend gemäß vorliegender Erfindung mit Photosensibilisator mit Zweiphotonen- Strahlung unter Verwendung eines gepulsten Lasers entsprechender Wellenlänge ge- maß einem vorprogrammierten Schema bestrahlt, um darin nach Möglichkeit Kanäle auszubilden.

Das von den Erfindern bereits früher beschriebene Setup (Ovsianikov et al., "Laser Photofabrication of Cell-Containing Hydrogel Constructs", Langmuir 30, 3787-3794, (2014); doi:10.1021 /la402346z) basiert auf einem Femtosekunden-gepulstem Laser (MaiTai DeepSee, Spectra Physics) mit einer Wellenlänge von 800 nm und einer Puls dauer von 70 fs hinter dem Objektiv (C-Achroplan 32x/0,85 W, ZEISS). Dabei sollten in einer Höhe von etwa 150 pm über dem Glasboden von der glatten Schnittkante weg parallele Kanäle mit rechteckigen Querschnitten (Breite: 0,1 pm, Höhe: 0,5 pm) mit einer konstanten Schreibgeschwindigkeit von 200 mm/s in den Gelproben fabriziert werden.

Die Laserleistung wurde dabei zwischen 10 mW und 100 mW (in Schritten von 10 mW) variiert, wobei für jeden Leistungswert ein eigener Kanal an einer unterschiedlichen Position entlang der Schnittkante des Gels geschnitten werden sollte, um zu überprü fen, ab welcher Laserleistung es - wenn überhaupt - zur Ausbildung eines geeigneten Kanals kommen würde.

Anschließend wurden die bestrahlten Proben mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und über Nacht bei Raumtemperatur in PBS bzw. Acetonitril ge quollen. Die Kanäle wurden danach mittels Lichtmikroskopie bei 10facher Vergröße rung analysiert (AxioObserver Z1 , ZEISS).

Vergleichsbeispiel 1 - Hydrogel ohne Sensibilisator

Zunächst wurde das in Synthesebeispiel 1 erhaltene Hydrogel ohne Quellung in einer Sensibilisatorlösung wie oben beschrieben bestrahlt, wobei es dennoch zur Spaltung von Disulfidbindungen und somit zur Ausbildung von kanalförmigen Strukturen kam. Eine Lichtmikroskop-Aufnahme des dabei erhaltenen Musters ist in Fig. 1 , linkes Bild, dargestellt, wobei die Laserleistung hier - wie in allen anderen Fällen auch - von unten nach oben, beginnend mit 10 mW in Schritten von jeweils 10 mW bis zu 100 mW erhöht wurde. - Hydrogel mit P2CK als Photosensibilisator

Das über Nacht in Wasser gequollene Hydrogel wurde vor der Bestrahlung in einer 0,1 mM wässrigen Lösung des nachstehend dargestellten Photosensibilisators P2CK gequollen und anschließend wie oben beschrieben mit einem Skalpell geschnitten und analog zu Vergleichsbeispiel 1 bestrahlt. Eine Lichtmikroskop-Aufnahme des dabei er haltenen Musters ist in Fig. 1 , rechtes Bild, dargestellt.

Diskussion der Ergebnisse von Vergleichsbeispiel 1 und Beispiel 1

Im linken Bild von Fig. 1 ist zu erkennen, dass es in Vergleichsbeispiel 1 in Abwesen heit von Sensibilisator erst ab einer Leistung von 50 mW überhaupt Strukturen im Hydrogel auszumachen sind. Diese sind jedoch selbst bei der maximalen Leistung von 100 mW recht schwach und diffus, so dass eine deutlich höhere Laserleistung erfor derlich wäre, um einigermaßen klar ausgeprägte Kanäle in das Gel zu "schreiben", was jedoch die Gefahr von Schäden in den Bereichen um den Kanal herum mit sich bringen würde - speziell in Fällen, in denen die Hydrogele lebende Zellen beherber gen.

In dem in Beispiel 1 angefertigten rechten Bild sind hingegen bereits bei der niedrigsten Laserleistung von 10 mW (wenn auch noch sehr schwache) Kanäle zu erkennen, die bei 20 mW ähnlich ausgeprägt waren wie bei 100 mW im Hydrogel ohne Sensibilisator. Ab 40 mW Laserleistung sind die Kanäle klar und scharf ausgebildet. Außerdem waren im Gel keinerlei Verfärbungen erkennbar. Gemäß vorliegender Erfindung bestrahlte Hydrogele sind daher für eine praktische Anwendung, z.B. zur Nachahmung von bio logischem Weichgewebe, sehr gut geeignet, und ihre Herstellung erfordert weder kom plexe organische Synthesen noch eine unangemessen hohe Laserleistung, da bereits 40 mW ausreichend sind. Veraleichsbeispiel 2 - Organogel ohne Sensibilisator

In Analogie zu Vergleichsbeispiel 1 wurde auch ein in Synthesebeispiel 2 hergestelltes Organogel auf Basis von Acetonitril ohne Zusatz eines Sensibilisators wie oben be schrieben bestrahlt. Eine Lichtmikroskop-Aufnahme des dabei erhaltenen Musters ist in Fig. 2, linkes Bild, dargestellt.

Beispiel 2 - Organogel mit M2CMK als Sensibilisator

Das über Nacht in Acetonitril gequollene Hydrogel wurde vor der Bestrahlung in einer 0,5 mM Lösung des nachstehend dargestellten Benzylidenketon-Photosensibilisators M2CMK in Acetonitril gequollen und anschließend wie oben beschrieben mit einem Skalpell geschnitten und analog zu Vergleichsbeispiel 2 bestrahlt. Eine Lichtmikro- skop-Aufnahme des dabei erhaltenen Musters ist in Fig. 2, mittleres Bild, dargestellt.

M2CMK

Beispiel 3 - Organogel mit R1 als Sensibilisator

Das über Nacht in Acetonitril gequollene Hydrogel wurde vor der Bestrahlung in einer 0,5 mM Lösung des nachstehend dargestellten Benzyliden-Photosensibilisators R1 in Acetonitril gequollen und anschließend wie oben beschrieben mit einem Skalpell ge- schnitten und analog zu Vergleichsbeispiel 2 bestrahlt. Eine Lichtmikroskop-Aufnahme des dabei erhaltenen Musters ist in Fig. 2, rechtes Bild, dargestellt.

R1 Diskussion der Ergebnisse von Vergleichsbeispiel 2, Beispiel 2 und Beispiel 3

Im linken Bild von Fig. 2 ist zu erkennen, dass es in Vergleichsbeispiel 2 ohne Sensibi lisator selbst bei der höchsten Laserleistung kaum zur Ausbildung von Strukturen ge kommen war. Im Gegensatz dazu sind in den Beispielen 2 und 3 unter Verwendung der Sensibilisatoren M2CMK (mittleres Bild) und R1 (rechtes Bild) praktisch über das gesamte Leistungsspektrum, jedenfalls aber ab 20 mW Leistung, Kanäle klar und scharf ausgebildet worden. Erneut waren in den Gelen keinerlei Verfärbungen erkenn bar. Gemäß vorliegender Erfindung erhaltene Organogele sind daher für praktische Anwendungen besonders gut geeignet, und ihre Herstellung erfordert weder komplexe organische Synthesen noch eine unangemessen hohe Energiezufuhr, da bereits eine minimale Laserleistung von 10 mW bzw. 20 mW ausreicht.

Verqleichsbeispiel 3

Um zu untersuchen, ob der Zweiphotonen-Photosensibilisator P2CK auch als Einpho- tonen-Sensibilisator einsetzbar ist, wurde ein zu Beispiel 1 analoger Versuch mit einem in Synthesebeispiel 1 erhaltenen Hydrogel durchgeführt, wobei die Bestrahlung jedoch mit einer Wellenlänge im sichtbaren Bereich, nämlich von 460 nm erfolgte. Dazu wurde das Hydrogel mit Aluminiumfolie zur Hälfte abgedeckt und 15 min lang mit einer 460- nm-LED bestrahlt (OmniCure® LX400 LED UV Spot Curing System mit 460 nm LED- Kopf (Excelitas Technologies), Modus: 100%). Der Abstand von der LED betrug 5 cm, was einer Lichtstärke von 6 mW/cm² entspricht.

Anschließend konnte keine Veränderung der bestrahlten Fläche beobachtet werden - und zwar weder mit freiem Auge noch mittels Lichtmikroskopie bei 2,5facher Vergröße rung). Das mit P2CK-gequollene Hydrogel wurde daher auch mit einem Laser-Scan- ning-Mikroskop (ZEISS LSM700) bei 20facher Vergrößerung bei 488 nm (Z-Stack) ab gerastert. Unter dem Mikroskop konnte keine Veränderung des so gescannten Be reichs beobachtet werden. P2CK ist folglich nicht als Einphotonen-Sensibilisator ge eignet, was sehr überraschend war - vor allem, weil es sich bei P2CK um eine intensiv rot gefärbte Verbindung handelt, die im Bereich um 500 nm ein Absorptionsmaximum aufweist.

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1 . Verwendung von Zweiphotonen-Photosensibilisatoren zum photochemischen Spalten von in einer festen oder halbfesten Matrix enthaltenen Disulfidbindungen, -S-S-, durch In-Kontakt-Bringen der Disulfidbindungen mit einem Zweiphotonen- Photosensibilisator und Bestrahlung des dadurch erhaltenen Reaktionsgemischs mit Licht mit einer geeigneten Wellenlänge, um Zweiphotonen-Absorption des Photosen sibilisators zu ermöglichen, wonach der Photosensibilisator, ohne eine intramolekulare Spaltung zu erfahren, die aufgenommene Energie auf die Disulfidbindungen überträgt und dadurch deren Spaltung bewirkt.

2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die zu spalten den Disulfidbindungen in einer von einem Polymernetzwerk, vorzugsweise einem über diese Disulfidbindungen vernetzten Polymernetzwerk, gebildeten Matrix enthalten sind.

3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer netzwerk ein Gel, vorzugsweise ein Hydrogel, ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel mit einer Lösung des Zweiphotonen-Photosensibilisators in einem geeigneten Lösungsmittel gequollen wird, um den Zweiphotonen-Photosensibilisator im Gel zu verteilen, bevor die Bestrahlung erfolgt.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Lösung des Zweiphotonen-Photosensibilisators mit einer Konzentration von etwa 0,01 mM bis etwa 1 mM, vorzugsweise von etwa 0,05 mM bis etwa 0,5 mM, insbesondere von etwa 0,1 mM, eingesetzt wird.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Spaltung der Disulfidbindungen Spaltprodukte, vorzugsweise solche mit einer wünschenswerten chemischen und/oder biologischen Aktivität, von der Matrix abgelöst werden.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Spaltung der Disulfidbindungen sowie anschließendes Auswaschen des

Photosensibilisators und zumindest eines Teils etwaiger Spaltprodukte aus der jeweils bestrahlten Stelle ein oder mehrere Kanäle in der Matrix ausgebildet werden.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein Zweiphotonen-Photosensibilisator mit einem Zweiphotonen-Wirkungsquerschnitt

> 1 GM im entsprechenden relevanten Spektralbereich eingesetzt wird.

9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein aus der Klas se der Benzyliden-Derivate ausgewählter Zweiphotonen-Photosensibilisator, vorzugs- weise einer der nachstehend dargestellten Benzylidenketon-Initiatoren P2CK, M2CMK, G2CK und E2CK oder der nachstehend dargestellte Benzyliden-Initiator R1 , einge setzt wird:

R1

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltung der Disulfidbindungen im Verlauf eines 3D-Druckverfahrens oder im Anschluss daran durchgeführt wird.