WO2020101352A1 - 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법, 자폐 스펙트럼 장애 모니터링용 마우스, 및 자폐 스펙트럼 장애 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

자폐 스펙트럼 장애의 치료방법, 자폐 스펙트럼 장애 모니터링용 마우스, 및 자폐 스펙트럼 장애 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법 Download PDF

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    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a method for treating autism spectrum disorder, a mouse for monitoring autism spectrum disorder, and a method for screening a candidate material for the prevention or treatment of autism spectrum disorder, among others, ventrolateral thalamus (VL) , A method of treating autism by inhibiting the collective output signal of the lateral lateral sagittal (laterodorsal thalamus, LD) or striatum neurons.
  • VL ventrolateral thalamus
  • Autism also called Autism Spectrum Disorder (ASD) is an overall developmental disorder (PDD), a disorder of social interaction, communication disorder, and neurodevelopmental disorder that exhibits repetitive and homologous behavior. to be.
  • PDD-NOS Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified
  • the PDD-NOS refers to a disorder that is close to autism, but does not meet the diagnostic criteria of the American Psychiatric Association's Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorder IV (DSM-IV). It refers to a case in which all the symptoms do not appear and some appear, and is defined as Atypical Autism disorder in the International Classification of Disease (ICD).
  • ICD International Classification of Disease
  • the basal ganglia of the brain, the cortex, and their associated structures are discussed as related brain regions, but their function is not clear.
  • Some studies have reported that the regulation of glutamate, GABA, dopamine, serotonin and oxytocin neurotransmitters produced in these brain regions is associated with autism. There is a lack of research on neural circuits and behavioral regulation.
  • DBS deep brain stimulation
  • optogenetics is a technology that combines optics and genetics, and is a biological technology that can control cells in biological tissues with light.
  • a typical example is the manipulation of nerve cells to express ion channels that respond to light.
  • photogenetics you can control and observe the activity of individual nerve cells in living tissues, even free-moving animals, and see in real time what effect the regulation of nerve activity causes.
  • channel-reactive proteins channelrhodopsin, halohodopsin, and arachidophorsin
  • calcium concentration changes are detected in order to record the neurological activity optically.
  • Photogenetic sensors such as GCaMP, synaptopHluorin, which senses the secretion of nerve vesicles, GluSnFRs, which detect neurotransmitters, and Arclightning (ASAP1), which detect cell membrane potential, are used.
  • the present inventors intend to define a brain region that can control the behavioral symptoms of autism, and propose that it can be used for diagnosis and treatment.
  • the present invention for solving the above problems is to suppress the collective output signal for a specific neuron in the brain, a method of treating autism spectrum disorder, a mouse for monitoring autism spectrum disorder, and a screening method for candidates for preventing or treating autism spectrum disorder It is intended to provide.
  • An embodiment of the present invention is a method of treating autism spectrum disorder comprising the step of suppressing the output signal of a ventrolateral thalamus (VL), a lateral rod thalamus (LD) or a striatum neuron. .
  • VL ventrolateral thalamus
  • LD lateral rod thalamus
  • striatum neuron a striatum neuron.
  • a halodopsin protein in the neurons of the ventral sagittal (VL), lateral lateral sagittal (LD) or striatum, a halodopsin protein, a polynucleotide encoding the halodopsin protein or a polynucleotide comprising the polynucleotide It is a mouse for autism spectrum disorder monitoring, in which a vector is introduced and expressed.
  • the step of injecting a candidate substance for preventing or treating autism spectrum disorder in the mouse for monitoring the autism spectrum disorder Irradiating light of a red light region to the mouse injected with the candidate substance; And comparing the behavior of the mouse irradiated with light to a control group.
  • a method for treating autism can be provided by suppressing a collective output signal of a ventral sagittal (VL), a lateral sagittal (LD), or a striatum (Striatum) neuron, which is a specific region of the brain.
  • VL ventral sagittal
  • LD lateral sagittal
  • striatum striatum
  • the present invention introduces a halodopsin protein into neurons of the axonal lateral sagittal (VL), lateral lateral sagittal (LD), or striatum (Striatum) of an individual with autism, and then irradiates light to overpolarize the halodopsin protein.
  • VL axonal lateral sagittal
  • LD lateral lateral sagittal
  • striatum Striatum
  • FIG. 1 is a schematic diagram for explaining a phototimulation experiment example of the ventral sagittal (VL)-striatum synapses (VL-Striatum synapses) in normal mice, according to an embodiment of the present invention.
  • the left side of FIG. 1 represents a repetitive behavior verification experiment for the verification of autism symptoms, and the right side of FIG. 1 expresses chanolodopsin 2 (hChR2) at the VAL (or AV) site, and then emits a blue light of 473 nm (an ancestral body ( Striatum) site.
  • hChR2 chanolodopsin 2
  • Figure 2 is a graph showing that the frequency (Digging frequency) and time (Digging time) of the buried action is increased when light is transmitted to the ventral sagittal (VL) region in the normal mouse according to the experimental example of FIG. 1 ( Blue rectangles: 10 Hz, 5 ms pulse width), it can be confirmed that autism symptoms occurred.
  • Figure 3 is a graph showing that the frequency (Digging frequency) and time (Digging time) of the buried action is increased when light is transmitted to the lateral ventral sagittal (LD) region in the normal mouse according to the experimental example of FIG. 1 ( Blue rectangles: 10 Hz, 5 ms pulse width), it can be confirmed that autism symptoms occurred.
  • FIG. 4 is a schematic diagram for explaining a phototimulation experiment example of the ventral sagittal (VL)-striatum synapses (VL-Striatum synapses) in autism mice, according to another embodiment of the present invention.
  • the left side of FIG. 4 is a repeat behavior verification experiment for autism symptoms, and the right side of FIG. 4 expresses halohodopsin in the VAL (or AV) region, and then emits red light of 630 nm (Striatum). ).
  • FIG. 5 is a graph showing that the frequency (Digging frequency) and the time (Digging time) of the buried action are reduced when light is transmitted to the VAL (or AV) site in the autistic mouse according to the experimental example of FIG. 4 (Red) rectangles: continous light), which confirms that the symptoms of autism are suppressed.
  • first and second may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. The terms are used only for the purpose of distinguishing one component from other components.
  • the two-step sequence can include the same rights as in an indirect time-series relationship where the time-series sequence can change.
  • the present invention provides a method of treating autism spectrum disorder, comprising the step of suppressing the output signal of the ventral sagittal (VL), lateral ventral sagittal (LD) or striatum neurons.
  • the output signal of the ventral sagittal (VL), lateral ventral sagittal (LD) or striatum neurons may be an individual or collective output signal of the ventral sagittal (VL), lateral sagittal (LD) or striatum (Striatum) neurons. It is also possible that it is a signal that is associated with or causes group excitation of the ventral sagittal (VL), lateral lateral sagittal (LD), or striatum neurons.
  • the output signal is meant to include population neuronal activity in the ventral sagittal (VL), lateral ventral sagittal (LD) or striatum region. That is, the present invention may include the step of inhibiting the group activity of dozens or hundreds of neurons present in the ventral sagittal (VL), lateral ventral sagittal (LD) or striatum region.
  • the output signal generated from the ventral sagittal (VL) neuron and / or the lateral ventral sagittal (LD) neuron may be induced by an input transmitted to the striatum, the ventral sagittal (VL), lateral sagittal (LD) ) And / or neurons in the striatum (Striatum) to suppress the output signal.
  • the signal from the ventral sagittal (VL) and / or lateral sagittal (LD) to the striatum is blocked (when using halodopsin), enhanced or active ( It was assumed that this would be the case when channel dopsin was used, and it was confirmed that the autism behavior can be controlled by controlling the connection of the aforementioned signal.
  • ventral sagittal (VL) and lateral ventral sagittal (LD) are included in the ventral anterolateral thalamus (VAL), and the present inventors are largely ventral, VL and dorsal.
  • the experiment was performed by dividing it into LDs, and after confirming that autism can be treated when the population output signals of the ventricular sagittal (VL) and lateral sagittal (LD) neurons that are specific regions of the brain are suppressed, the present invention is completed Did.
  • the abdominal anterior ventral sagittal is used in the same or similar meaning as the anterior ventral thalamus (AV: anteroventral thalamus) and the anterior ventral thalamus (AVTh: anteroventral thalamic).
  • the present invention is to inject a drug capable of suppressing the output signal of the ventral sagittal (VL), lateral ventral sagittal (LD) or striatum neurons to suppress the output signal, or the ventral side It is possible to provide electrical stimulation to the sagittal (VL), lateral lateral sagittal (LD) or striatum neurons.
  • a substance that inhibits neuronal activity is injected, or the molecular mechanism associated with the ventral lateral sagittal (VL), lateral lateral sagittal (LD) or striatum neurons, or the ventral lateral thalamus (VL), the side dorsal thalamus (LD) or striatal cause a hyperpolarization (striatum) or neurons, Ca 2+ channels (Ca 2+ channel) blocker autism outer clothing thalamus (VL) of the object with a spectrum disorders, side Treatment may be performed on dorsal sagittal (LD) or striatum neurons, or by using DREADD (designer receptors exclusively activated by desiner drugs) method.
  • DREADD designer receptors exclusively activated by desiner drugs
  • the material that inhibits the neuronal activity may be Jaws, Arch, ArchT, NpHR, iCc ++ SwiChR ++, but is not limited thereto. Since the output signal of the ventral sagittal (VL), lateral ventral sagittal (LD), or striatum neurons is mediated by Ca 2+ channel activation, the Ca 2+ channel can be suppressed to suppress the output signal. It is also possible to introduce proteins that control the molecular mechanism or cause hyperpolarization into neurons of individuals with autism spectrum disorders.
  • a halodopsin protein, a polynucleotide encoding the halodopsin protein or the poly Vectors comprising nucleotides can be introduced into the ventral sagittal (VL), lateral lateral sagittal (LD), or striatum neurons of individuals with autism spectrum disorder.
  • the halodopsin protein refers to an ion pump that causes hyperpolarization by introducing chloride into cells in response to light, and the halodopsin protein may be composed of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • VL clothing lateral hypothalamus
  • LD dorsal thalamus
  • striatal striatal
  • Any protein capable of inhibiting the collective output signal of the ventral sagittal (VL), lateral lateral sagittal (LD), or striatum neurons in response to light may be used without limitation. Specifically, these proteins may be iC ++ or ArchT, but are not limited thereto.
  • the halodopsin protein may include a protein wild type having a chlorine ion pump activity, as well as a functional homologue having a amino acid homology of 90% or more and a chlorine ion pump activity.
  • the term "homology" in the present invention is intended to indicate a similar degree to the amino acid sequence of a wild type protein, wherein the halodopsin protein of the present invention is 70% or more, preferably with a wild type amino acid sequence defined by the sequence of SEQ ID NO: 1 90% or more, more preferably 95% or more of the same amino acid sequence.
  • the comparison of homology can be performed with the naked eye or using a comparison program that is easy to purchase. Homology between two or more sequences of commercially available computer programs can be calculated as a percentage (%), and homology (%) can be calculated for adjacent sequences.
  • the halodopsin protein may include amino acid sequence variants thereof as long as it retains the activity of a chlorine ion pump, wherein the variant is a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of a natural amino acid sequence and one or more amino acid residues, or a combination thereof.
  • the variant is a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of a natural amino acid sequence and one or more amino acid residues, or a combination thereof.
  • variants include functional homologs having substantially equivalent activity to wild-types or proteins with modifications that increase or decrease physicochemical properties.
  • the physicochemical properties of the protein are modified variants.
  • physical factors such as temperature, moisture, pH, electrolyte, reducing sugar, pressurization, drying, freezing, interfacial tension, light, repetition of freezing and thawing, and high concentration conditions
  • Structural stability against the external environment of chemical factors such as peracids, alkalis, neutral salts, organic solvents, metal ions, redox agents, proteases, etc. is a variant with increased activity. It may also be a variant with increased activity due to variation in amino acid sequence. .
  • the halodopsin protein may be prepared directly from an organism, chemically synthesized, or obtained using genetic recombination technology. In the case of direct separation from an organism, separation and purification of the halodopsin protein contained in cells can be carried out by a number of known methods. In the case of chemical synthesis, it can be obtained by using a polypeptide synthesis method well known in the art. Polypeptides can be prepared using conventional stepwise liquid or solid phase synthesis, fragment condensation, F-MOC or T-BOC chemistry.
  • the polynucleotide (nucleic acid) encoding the halodopsin protein is inserted into an appropriate expression vector, the vector is transformed into a host cell, and the host cell is cultured to express the halodopsin protein. It can be obtained by recovering the protein from the host cell. Proteins are expressed in selected host cells, followed by conventional biochemical separation techniques for separation and purification, for example, treatment with protein precipitants (salt-out method), centrifugation, sonication, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography Various types of chromatography such as (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. can be used, and these are usually used in combination to separate proteins having high purity.
  • the polynucleotide encoding the halodopsin protein may be composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but one or more nucleotide sequences may be substituted, deleted or inserted as long as it can encode the halodopsin protein showing activity.
  • the polynucleotide having one or more base sequences substituted, deleted, or inserted may have a homology of 70% or more, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more with the polynucleotide of SEQ ID NO: 2.
  • the vector containing the polynucleotide may have a replication origin, a promoter, a marker gene and a translation control element, and the vector may express a gene insert capable of expressing a target protein in a suitable host cell. It may be a gene construct comprising essential regulatory elements operably linked.
  • the vector containing the polynucleotide may be any one selected from the group consisting of linear DNA vectors, plasmid DNA vectors and recombinant viral vectors.
  • the recombinant virus vector may be any one selected from the group consisting of retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus and lentivirus.
  • the vector containing the polynucleotide is preferably an adeno-associated virus, but is not limited thereto.
  • the vector containing the polynucleotide is transfected, electroporation, transduction, microinjection, and ballistic introduction. It can be introduced into neurons of the ventral sagittal (VL), lateral lateral sagittal (LD), or striatum (Striatum) of the individual. It is most preferred to use transfection according to an embodiment of the present invention, but is not limited thereto. Does not.
  • the halodopsin protein, the polynucleotide encoding the halodopsin protein, or a vector incorporating the polynucleotide may further include irradiating light of a red light region.
  • the light in the red light region may have a wavelength of 580 to 670 nm, and preferably a wavelength of 600 to 650 nm. According to an embodiment of the present invention, the light in the red light region may have a wavelength of 630 nm. .
  • the step of irradiating the light may be to irradiate the ventral sagittal (VL), lateral ventral sagittal (LD), and / or striatum neurons.
  • Light may be irradiated to the ventral sagittal (VL), lateral ventral sagittal (LD), and striatum neurons at once or simultaneously, and the ventral sagittal (VL), lateral ventral sagittal (LD), or striatum ( Striatum) It is also possible to selectively select one of the neurons. You can selectively irradiate by adjusting the amount of light to be irradiated.
  • the present inventors selectively irradiated light only to the striatum in the experimental example to be described later, which is a striatum in which axons of neurons expressing the photogenetic protein of VAL (or AV) extend.
  • VAL photogenetic protein of VAL
  • the present inventors first adeno-associated virus (adeno-associated virus) comprising the channel dopsin-2 (channelrhodopsin-2, hChR2) gene in the thalamus of normal mice without autism AAV) After infecting the vector and irradiating blue light to the striatum neurons, it was confirmed that the frequency (Digging frequenc) and the time (Digging time) of buried behavior were significantly increased (see FIGS. 1 to 3).
  • adeno-associated virus comprising the channel dopsin-2 (channelrhodopsin-2, hChR2) gene in the thalamus of normal mice without autism AAV
  • the present inventors infect the adeno-associated virus (AAV) vector containing a halohodopsin gene in the thalamus of autistic mice, and striatum neurons As a result of irradiating red light, it was confirmed that the frequency (Digging frequenc) and the time (Digging time) of buried action are significantly reduced (see FIGS. 4 and 5).
  • AAV adeno-associated virus
  • a halodopsin protein, a polynucleotide encoding the halodopsin protein, or a vector comprising the nucleotide is present in neurons of an extralateral sagittal (VL), lateral lateral sagittal (LD) or striatum (Striatum) of an individual with autism spectrum disorder.
  • VL extralateral sagittal
  • LD lateral lateral sagittal
  • striatum Striatum
  • autism spectrum disorder refers to autism, autistic disorder, pervasive developmental disorder (PDD), social interaction disorder, communication disorder, repetitive homology, and Rett disorder (Rett's disorder), childhood disintegrative disorder, Asperger's syndrome, obsession disorder, obsessive compulsive disorder, and Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified; PDD-NOS) is meant to include one or more diseases selected from the group consisting of.
  • halodopsin protein of the present invention a polynucleotide encoding the halodopsin protein, a vector comprising the polynucleotide, or a Ca 2+ channel blocker is also a carrier, diluent, excipient, or combinations of two or more commonly used in biological agents. It may include.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is not particularly limited as long as the active ingredient is suitable for in vivo delivery, for example, compounds described in Merck Index, 13th ed, Merck & Co Inc, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, deck Strath solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components can be used in combination, and if necessary, other conventional additives such as antioxidants, buffers, bacteriostatic agents can be added.
  • diluents such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules, or tablets.
  • main-use formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules, or tablets.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into main-use formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules, or tablets.
  • main-use formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules, or tablets.
  • lubricants may be additionally added to formulate into main-use formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, pills, capsules, granules, or tablets.
  • it can be preferably formulated according to each disease or component by using a method suitable in the
  • halodopsin protein of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar function.
  • halodopsin protein of the present invention can be administered orally or parenterally, and parenteral administration is intracranial injection, intravenous Injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, and the like.
  • Suitable doses of the halodopsin protein of the present invention, the polynucleotide encoding the halodopsin protein, the vector comprising the polynucleotide, or the Ca 2+ channel blocker are formulation methods, mode of administration, age, weight, sex, pathology of the patient. It can be variously prescribed by factors such as condition, food, time of administration, route of administration, absorption of the active ingredient in the body, inactivation rate, drug used in combination, rate of excretion, and response sensitivity.
  • the dose of the halodopsin protein of the present invention, the polynucleotide encoding the halodopsin protein, the vector comprising the polynucleotide, or the Ca 2+ channel blocker is 00001 ng / kg (weight) to 200 per day. mg / kg (weight).
  • the halodopsin protein of the present invention can be easily carried out by a person skilled in the art to which the present invention pertains.
  • it may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient, or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of ex, powder, granule, tablet, or capsule, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • a halodopsin protein in the neurons of the ventral sagittal (VL), lateral lateral sagittal (LD) or striatum, a halodopsin protein, a polynucleotide encoding the halodopsin protein or a polynucleotide comprising the polynucleotide It is a mouse for autism spectrum disorder monitoring, in which a vector is introduced and expressed.
  • the halodopsin protein is expressed in neurons of the ventral sagittal (VL), lateral sagittal (LD) or striatum (Striatum), and the expressed halodopsin protein is recovered by light irradiation in the red light region. It is possible to suppress the output signal of the lateral sagittal (VL), lateral dorsal sagittal (LD) or striatum neurons.
  • the mouse for autism spectrum disorder monitoring of the present invention can be usefully used in a screening method for candidates for preventing or treating autism spectrum disorder.
  • the step of injecting a candidate substance for preventing or treating autism spectrum disorder in the mouse for monitoring the autism spectrum disorder Irradiating light of a red light region to the mouse injected with the candidate substance; And comparing the behavior of the mouse irradiated with light to a control group.
  • the candidate substance may be selected from the group consisting of natural compounds, synthetic compounds, RNA, DNA, polypeptides, enzymes, proteins, ligands, antibodies, antigens, metabolites of bacteria or fungi and bioactive molecules, etc. It is not limited.
  • the method for injecting the candidate substance may be administered, for example, by oral administration to a mouse or injection by injection.
  • the method of comparing the behavior of the mouse irradiated with the light to the control group can be compared by calculating the frequency or time of the buried behavior of a mouse injected with a candidate substance and a mouse not injected, for example. For example, if the frequency or time of the mice injected with the candidate substance has been reduced from the frequency or time of the mice without the injection, it is possible to select the candidate substance as useful for autism.
  • AAV Adeno-associated virus
  • ASD Autistic Spectrum Disorders
  • hChR2 channelrhodopsin-2
  • VL ventrolateral thalamus
  • VAL ventral anterolateral thalamus
  • AV anterior ventral thalamus
  • AAV adeno-associated virus
  • the hChR2 is involved in the light-activated cation channel.
  • the AAV vector includes AAV-CamKII-Cre virus and AAV2 / 1-EF1 ⁇ -DIO-hChR2 (H134R) -mCherry-WPRE; titer: 5.36 x 1012 gc / ml; Vector Core Facility at the University of Pennsylvanic, USA).
  • avertin 20 mg / ml of tribromoethanol, 20 mg / g injection peritoneal, i.p.
  • VL ventral sagittal
  • AP 1.0 mm anteroposterior
  • ML 1.0 mm mediolateral
  • LD lateral sagittal
  • AP 1.0 mm anteroposterior
  • LD lateral sagittal
  • opsin in VL or LD viruses prepared at the same dose according to the size of the target site were used at doses of 0.6 microliter and 0.5 microliter, respectively.
  • a fiberoptic probe with an external metal ferrule 200 mm diameter, 0.39 NA; Doric Lenses Inc., Canada was inserted into the striatum test and Super-Bond (Sun Medical) Co., Japan).
  • mice of the present invention used an autism animal model called CNTNAP2 produced according to the method described in Poliak S. et al ,, 2003.
  • the team used CNTNAP2 ASD mice produced by crossing heterozygote mice.
  • the CNTNAP2 ASD mouse prepared in Example 2 was injected with VL into a virus expressing halohodopsin (NpHR3.0), a light-dependent chloride pump, to prepare an ASD mouse expressing halodopsin. . That is, under the control of the CamKII promoter, adeno-associated virus (AAV) carrying the NpHR3.0 gene was infected with the VL region of the ASD mouse according to Example 2 of the present invention.
  • AAV adeno-associated virus
  • the virus used to inject the halodopsin was AAV-CamKII-CRE, AAV-DIO-NpHR3.0-EYFP; Vector Core Facility at the University of Pennsylvania, USA.
  • All mice were anesthetized with avertin and placed in a stereotaxic apparatus (David Kopf Instuments, USA). All of the virus infusions were delivered at a rate of 0.1 ml / min.
  • a total of 0.8 ml of the virus mixture was injected into VL.
  • the coordinates of the VL sagittal are 1.0 mm AP, 1.1 ML, 3.4 DV.
  • a fiberoptic probe with an external metal ferrule 200 mm diameter, 0.39 NA; Doric Lenses Inc., Canada was inserted into the striatum, and Super-Bond (Sun Medical Co.) ., Japan).
  • the axons of the VL and LD neurons were irradiated by irradiating blue light of 473 nm to the core region of the striatum of the mouse expressing the channel dopsin.
  • a diode-pumped solid-state laser (CrystaLaser, USA) device controlled by a pulse generator (Agilent, USA) was used for 473 nm light.
  • the frequency and time (Digging time) for the buried behavior of the mouse were calculated, and the results are shown in FIGS. 2 and 3.
  • autism symptoms were induced through blue light irradiation on WT mice to which dopsin was applied as a channel for enhancing or activating signals from AV to striatum.
  • the axons of VL and LD nerves were photostimulated by irradiating red light of 630 nm to the core region of the striatum of the ASD mouse expressing halodopsin.
  • a diode-pumped solid-state laser (CrystaLaser, USA) device controlled by a pulse generator (Agilent, USA) was used for 630 nm light.
  • the frequency (Digging frequency) and the time (Digging time) for the buried behavior of the mouse were calculated, and the results are shown in FIG. 5.

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Abstract

본 발명은 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법, 자폐 스펙트럼 장애 모니터링용 마우스, 및 자폐 스펙트럼 장애 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법에 대한 것으로, 구체적으로는 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum)의 뉴런에 할로로돕신 단백질을 도입한 후, 광을 조사해서 상기 할로로돕신 단백질의 과분극을 유도함으로서, 상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 신경 세포의 출력 신호(또는 집단성 흥분)를 억제할 수 있는 바, 자폐증을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있다.

Description

자폐 스펙트럼 장애의 치료방법, 자폐 스펙트럼 장애 모니터링용 마우스, 및 자폐 스펙트럼 장애 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법
본 발명은 자폐 스펙트럼 장애를 치료하는 방법, 자폐 스펙트럼 장애를 모니터링하기 위한 마우스, 및 자폐 스펙트럼 장애의 예방 또는 치료용 후보물질을 스크리닝하는 방법에 대한 것으로, 그 중에서도 복외측 시상(ventrolateral thalamus, VL), 측배측 시상(laterodorsal thalamus, LD) 또는 선조체(striatum) 신경 세포의 집단 출력 신호를 억제함으로서 자폐증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
자폐스펙트럼장애(Autism Spectrum Disorder; ASD)라고도 불리 우는 자폐증(autism)은 전반적인 발달장애(Pervasive Developmental Disorder; PDD)로서 사회적 상화작용의 장애, 의사소통의 장애, 반복적이고 상동증적인 행동을 보이는 신경발달장애이다.
자폐증은 다양한 형태로 나타나고 개인에 따라 심각한 정도가 다르며, 자폐증(autistic disorder), 레트장애(Rett’s disorder), 소아기 붕괴장애(childhood disintegrative disorder), 아스퍼거 증후군(Asperger’s syndrome), 강박증(obsession disorder), 강박장애(obsessive compulsive disorder), 특정불능의 전반적 발달장애(Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified; PDD-NOS)를 포함한다. 상기 PDD-NOS 란 자폐증에 가깝지만 미국정신의학회 진단기준인 정신장애 진단 및 통계편람(Diagnostic and Statistical Manual of Mental DisorderIV; DSM-IV)의 진단기준에는 적합하지 않는 장애를 말하는 것으로, 자폐증이 가지는 세가지 주된 증상이 모두 나타나지 않고 일부가 나타나는 경우를 말하는 것이며, WHO가 작성한 국제질병분류(International Classification of Disease;ICD)에서는 비정형 자폐증(Atypical Autism disorder)으로 정의된다.
자폐증의 대부분은 소아기 자폐로 10,000 명당 2∼5 명의 유병률을 보이고, 아스퍼거 증후군 등 전반적 발달장애를 포함하는 경우 10,000명당 20∼50 명까지 보이며, 남녀 성비는 약 4:1 로서 여자보다 남자에서 발생 빈도가 높게 나타난다.
자폐증은 그 병인이 정확히 밝혀져 있지 않고, 대다수의 연구들이 유전체 검사를 통한 관련된 유전자군들을 보고 하는데 집중되어 있다. 하지만, 치료법으로 직접 연결될 수 있는 신경 회로 수준의 연구는 미흡하다.
일부 환자의 이미징 연구들을 통해, 뇌의 기저핵(basal ganglia), 대뇌(cortex) 및 그와 연결된 구조들이 관련 뇌부위로 거론되고 있으나, 기능이 명확하지 않다. 일부 연구들에서는 이들 뇌부위에서 생성되는 글루타메이트(Glutamate), 가바(GABA), 도파민(Dopamine), 세로토닌(Serotonin) 및 옥시토신(Oxytocin) 신경 전달 물질들의 조절이 자폐증과 관련되어 있다고 보고 되고 있지만, 이들에 의한 신경 회로 및 행동 조절에 관한 연구가 부족하다.
자폐증은 뚜렷한 치료제가 없고, 대증적인 요법이 주로 사용된다. 그 중 가장 보편적으로 사용되는 약물은 Risperidone 등이 있다. 하지만, 이 약물에 의한 환자 반응성이 다양하고, 증가하는 부작용 때문에, 치료제 개발이 시급하다. 심각한 반복행동 및 사회성 결핍을 치료하기 위해서 일부 뇌심부 자극술(DBS)를 사용하는 시도가 증가하고 있으나, 타겟 뇌회로를 정의하기 어려운 문제가 있다.
이에 따라, 자폐증에 대한 효과적인 치료 개발을 위해서는 치료법으로 직접 연결될 수 있는 신경 회로 수준의 연구와 타겟 뇌회로에 대한 연구가 필요한 실정이지만, 이에 대한 연구는 찾아보기가 힘들다.
한편, 광유전학(optogenetics)은 광학과 유전학을 결합한 기술로 빛으로 생체 조직의 세포들을 조절할 수 있는 생물학적 기술이다. 신경 세포를 유전적으로 조작하여 빛에 반응하는 이온 채널을 발현시킨 것이 대표적 사례이다.
광유전학을 이용하면 생체 조직, 심지어 자유롭게 움직이는 동물에서 개별 신경 세포들의 활동을 조절하고 관찰할 수 있으며, 신경 활동의 조절이 어떠한 효과를 유발하는지 실시간으로 확인할 수 있다. 신경 활동의 조절을 위해서 빛에 반응하는 단백질인 채널로돕신(channelrhodopsin), 할로로돕신(halorhodopsin), 알키로돕신(archaerhodopsin)등을 사용하고 있고, 신경활동을 광시각적으로 기록하기 위해서 칼슘 농도 변화를 감지하는 GCaMP, 신경 소포체의 분비를 감지하는 synaptopHluorin, 신경전전달물질을 감지하는 GluSnFRs, 세포막전위를 감지하는 Arclightning(ASAP1)과 같은 광유전학적 센서가 사용되고 있다.
광유전학을 이용한 신경 세포 활동의 조절이 가능해짐에 따라 신경 질환의 메커니즘 파악 또는 신경 질환의 치료법 개발에 적용되고 있다.
따라서, 본 발명자들은 자폐증의 행동 증상을 조절할 수 있는 뇌부위를 정의하고, 이를 진단 및 치료에 활용할 수 있음을 제안하고자 한다.
상기한 문제점을 해결하기 위한 본 발명은 뇌의 특정 뉴런에 대한 집단 출력 신호를 억제하는, 자폐 스펙트럼 장애의 치료 방법, 자폐 스펙트럼 장애 모니터링용 마우스, 및 자폐 스펙트럼 장애 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일 실시형태는, 복외측 시상(ventrolateral thalamus, VL), 측배측 시상(laterodorsal thalamus, LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런의 출력 신호를 억제하는 단계를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법이다.
본 발명의 다른 실시형태는, 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum)의 뉴런에, 할로로돕신 단백질, 상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입되어 발현된, 자폐 스펙트럼 장애 모니터링용 마우스이다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 상기한 자폐 스펙트럼 장애 모니터링용 마우스에 자폐 스펙트럼 장애 예방 또는 치료용 후보물질을 주입하는 단계; 상기 후보물질이 주입된 마우스에 적색 광 영역의 빛을 조사하는 단계; 및 상기 빛이 조사된 마우스의 행동을 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법이다.
상기한 본 발명에 의하면 뇌의 특정 부위인 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 신경 세포의 집단 출력 신호를 억제함으로서, 자폐증을 치료하는 방법을 제공할 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 자폐증을 가진 개체의 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum)의 뉴런에 할로로돕신 단백질을 도입한 후, 광을 조사해서 상기 할로로돕신 단백질의 과분극을 유도함으로서, 상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 신경 세포의 출력 신호(또는 집단성 흥분)를 억제할 수 있는바, 자폐증을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, 정상 생쥐에서 복외측 시상(VL)-선조체 시냅스(VL-Striatum synapses)의 광자극(photostimulation) 실험예를 설명하기 위한 모식도이다. 도 1의 좌측은 자폐증 증상 검증을 위한 반복행동 검증 실험을 나타내고, 도 1의 우측은 VAL (혹은 AV) 부위에 채놀로돕신2(hChR2)를 발현시킨 후, 473nm 의 청색(blue) 빛을 선조체(Striatum) 부위에 조사한 것을 나타내고 있다.
도 2는 도 1의 실험예에 따라 정상 생쥐에서 복외측 시상(VL) 부위에 빛을 전달하였을 때, 파묻는 행동의 빈도수 (Digging frequency)와 시간 (Digging time)이 증가된 것으로 나타난 그래프이고(Blue rectangles: 10 Hz, 5 ms pulse width), 이를 통하여 자폐증 증상이 생긴 것을 확인할 수 있다.
도 3은 도 1의 실험예에 따라 정상 생쥐에서 측배측 시상(LD) 부위에 빛을 전달하였을 때, 파묻는 행동의 빈도수 (Digging frequency)와 시간 (Digging time)이 증가된 것으로 나타난 그래프이고(Blue rectangles: 10 Hz, 5 ms pulse width), 이를 통하여 자폐증 증상이 생긴 것을 확인할 수 있다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따라, 자폐증 생쥐에서 복외측 시상(VL)-선조체 시냅스(VL-Striatum synapses)의 광자극(photostimulation) 실험예를 설명하기 위한 모식도이다. 도 4의 좌측은 자폐증 증상 극븍을 위한 반복행동 검증 실험 그림이고, 도 4의 우측은 VAL (혹은 AV) 부위에 할로로돕신(halorhodopsin)을 발현시킨 후, 630nm 의 적색(red) 빛을 선조체(Striatum) 부위에 조사한 것을 나타내고 있다.
도 5는 도 4의 실험예에 따라 자폐증 생쥐에서 VAL (혹은 AV) 부위에 빛을 전달하였을 때, 파묻는 행동의 빈도수 (Digging frequency)와 시간 (Digging time)이 감소된 것으로 나타난 그래프이고(Red rectangles: continous light), 이를 통하여 자폐증 증상이 억제되는 것을 확인할 수 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 단계가 다른 단계와 “상에” 또는 “전에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 단계가 다른 단계와 직접적 시계열적인 관계에 있는 경우뿐만 아니라, 각 단계 후의 혼합하는 단계와 같이 두 단계의 순서에 시계열적 순서가 바뀔 수 있는 간접적 시계열적 관계에 있는 경우와 동일한 권리를 포함할 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 뉴런의 출력 신호를 억제하는 단계를 포함하는, 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법을 제공한다.
상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 뉴런의 출력 신호는 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 뉴런의 개별 또는 집단 출력 신호일 수 있고, 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 신경 세포의 집단 흥분과 관련되거나 집단 흥분을 일으키는 신호인 것도 가능하다. 또한, 상기 출력 신호는 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 부위의 집단 활성(population neuronal activity)을 포함하는 의미이다. 즉, 본 발명은 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 부위에 존재하는 수십 혹은 수백 개의 신경 세포가 가지는 집단 활성을 억제하는 단계를 포함할 수도 있다.
복외측 시상(VL) 뉴런 및/또는 측배측 시상(LD) 뉴런에서 발생되는 출력 신호는 선조체(Striatum)로 전달된 입력에 의해 유도될 수 있는데, 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 및/또는 선조체(Striatum)의 뉴런을 광억제하여 출력 신호를 억제할 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 빛을 선조체에 조사하면, 복외측 시상(VL) 및/또는 측배측 시상(LD)에서 선조체로 가는 신호가 차단(할로로돕신을 사용한 경우) 되거나, 강화되거나 혹은 활성(채널로돕신을 사용한 경우)될 것이라 추측하였고, 상기한 신호의 연결을 제어하여 자폐 행동을 조절할 수 있음을 확인하였다.
상기 복외측 시상(VL) 및 측배측 시상(LD)은 복부 전외측 시상(VAL: ventral anterolateral thalamus)에 포함되는 것으로, 본 발명자들은 크게 복부측(ventral) 부위인 VL과 등쪽(dorsal) 부위인 LD로 구분해서 실험을 하였고, 뇌의 특정 부위인 복외측 시상(VL) 및 측배측 시상(LD) 신경 세포의 집단 출력 신호를 억제하는 경우, 자폐증을 치료할 수 있다는 것을 확인한 후, 본 발명을 완성하였다. 본 명세서에서 상기 복부 전외측 시상(VAL)은 전배측 시상(AV: anteroventral thalamus) 및 전배측 시상(AVTh: anteroventral thalamic)과 동일하거나 유사한 의미로 사용된다.
본 발명에서는 상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 뉴런의 출력 신호를 억제할 수 있는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 상기 출력 신호를 억제하기 위해 상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런의 출력 신호를 억제할 수 있는 약물을 주입하거나, 상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런에 전기 자극을 제공하는 것이 가능하다.
또한, 상기 출력 신호를 억제하기 위해 신경 활성을 억제하는 물질을 주입하거나, 상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런과 관련된 분자기전을 조절하거나, 상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런에 과분극을 일으키거나, Ca2+ 채널(Ca2+ channel) 차단제를 자폐 스펙트럼 장애를 가진 개체의 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런에 처리하거나, 약물을 통한 선택적인 수용기 활성화(DREADD : designer receptors exclusively activated by desiner drugs) 방법을 이용하는 것일 수 있다. 상기 신경 활성을 억제하는 물질은 Jaws, Arch, ArchT, NpHR, iCc++ SwiChR++ 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런의 출력 신호는 Ca2+ 채널 활성화에 의해 매개되므로 Ca2+ 채널을 억제하여 상기 출력 신호를 억제할 수 있다. 또한, 상기 분자기전을 제어하거나 과분극을 일으키는 단백질을 자폐 스펙트럼 장애를 가진 개체의 뉴런에 도입하는 것도 가능하다.
그 중에서도, 본 발명에서는 상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 뉴런의 출력 신호를 억제하기 위해, 할로로돕신 단백질, 상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 자폐 스펙트럼 장애를 가진 개체의 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum)의 뉴런에 도입할 수 있다.
상기 할로로돕신 단백질은 광에 반응하여 염소 이온(chloride)을 세포 안으로 유입시켜 과분극을 일으키는 이온 펌프를 의미하며, 상기 할로로돕신 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
상기 할로로돕신 단백질은 빛에 반응하여 chloride ion(Cl-)을 세포 안으로 유입시키고 과분극을 일으켜 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 뉴런의 집단 출력 신호를 억제시키는 것이 바람직하다. 빛에 반응하여 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 뉴런의 집단 출력 신호를 억제시킬 수 있는 단백질이라면, 제한없이 사용될 수 있다. 구체적으로 이들 단백질은 iC++ 또는 ArchT 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 할로로돕신 단백질은 염소 이온 펌프의 활성을 가지는 단백질 야생형(wild type) 뿐만 아니라 90% 이상의 아미노산 상동성을 가지고 염소 이온 펌프의 활성을 가지는 기능적 상동체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "상동성"이란 야생형 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 할로로돕신 단백질은 서열번호 1의 서열로 정의되는 야생형 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
상기 할로로돕신 단백질은 염소 이온 펌프의 활성을 보유하는 한 이들의 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다 여기서 변이체란 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다.
이러한 변이체는 야생형과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 상동체 또는 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가지는 단백질을 포함한다. 바람직하게는 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체이다 예를 들어, 온도, 수분, pH, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선, 동결과 해동의 반복, 고농도 조건 등의 물리적 요인과 산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제, 프로티아제 등의 화학적 요인의 외부 환경에 대한 구조적 안정성이 증대된 변이체이다 또한 아미노산 서열상의 변이로 활성이 증대된 변이체일 수 있다.
상기 할로로돕신 단백질은 생물체로부터 직접 분리하여 제조하거나, 화학적으로 합성하거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수도 있다. 생물체로부터 직접 분리하여 제조하는 경우, 세포에 함유된 상기 할로로돕신 단백질의 분리 및 정제는 많은 공지 방법에 의해 실시할 수 있다. 화학적으로 합성할 경우, 당 분야에 널리 공지된 폴리펩티드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 폴리펩티드는 통상의 단계적인 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을 이용하여 제조할 수 있다. 유전자 재조합 기술로 제조할 경우, 상기 할로로돕신 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(핵산)를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 상기 할로로돕신 단백질이 발현되도록 숙주세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 상기 단백질을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현신킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.
상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것일 수 있으나, 활성을 나타내는 할로로돕신 단백질을 암호화 할 수 있는 한 하나 이상의 염기서열이 치환, 결실 또는 삽입된 폴리뉴클레오티드일 수 있다 상기 하나 이상의 염기서열이 치환, 결실 또는 삽입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것일 수 있으며, 상기 벡터는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 선형 DNA 벡터, 플라스미드 DNA 벡터 및 재조합 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 재조합 바이러스 벡터는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 및 렌티바이러스(lentivirus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 형질주입(transfection), 전기천공(electrophoresis), 형질도입(transduction), 미세주입(microinjection) 및 총알식 도입(ballistic introduction)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 한 방법을 사용하여 상기 개체의 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum)의 뉴런에 도입될 수 있다 본 발명의 실시예에 의하면 형질주입(transfection)을 사용하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예는, 상기 할로로돕신 단백질, 상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된 개체에 적색 광 영역의 빛을 조사하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 적색 광 영역의 빛은 580 내지 670 nm의 파장일 수 있고, 바람직하게는 600 내지 650 nm의 파장일 수 있다 본 발명의 실시예에 의하면, 상기 적색광 영역의 빛은 630 nm의 파장일 수 있다.
상기 빛을 조사하는 단계는 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 및/또는 선조체(Striatum) 뉴런에 조사하는 것일 수 있다. 빛을 상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 및 선조체(Striatum) 뉴런에 공통적으로 한번에 또는 동시에 조사할 수도 있고, 상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 뉴런 중 하나를 선별해서 선택적으로 조사하는 것도 가능하다. 조사하는 빛의 양을 조절해서 선택적으로 조사할 수 있다. 그 중에서도, 본 발명자들은 후술하는 실험예에서 빛을 선조체(Striatum)에만 선택적으로 조사하였는데, 이는 VAL(혹은 AV)의 광유전학 단백질을 발현하는 신경 세포의 엑손(axon)이 뻗어나간 선조체(striatum) 부위에만 빛을 줌으로써, VAL과 연결된 다른 뇌부위의 관련성을 배제할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자들은 먼저 자폐증을 갖지 않은 정상 생쥐의 시상(thalamus)에 채널로돕신-2(channelrhodopsin-2, hChR2) 유전자를 포함하는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터를 감염시키고, 선조체(Striatum) 뉴런에 청색 광을 조사한 결과, 파묻는 행동의 빈도수(Digging frequenc)와 시간 (Digging time)이 현저히 증가되는 것을 확인하였다(도 1 내지 도 3 참조).
이어서, 본 발명의 구체적인 다른 실시예에서, 본 발명자들은 자폐증을 갖는 생쥐의 시상(thalamus)에 할로로돕신(halorhodopsin) 유전자를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 감염시키고, 선조체(Striatum) 뉴런에 적색 광을 조사한 결과, 파묻는 행동의 빈도수(Digging frequenc)와 시간 (Digging time)이 현저히 감소되는 것을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조).
따라서, 자폐 스펙트럼 장애를 가진 개체의 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum)의 뉴런에 할로로돕신 단백질, 상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 투여한 후, 빛을 조사하여 상기 할로로돕신을 발현시키면 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 뉴런의 집단 출력 신호를 억제할 수 있으며, 이를 통해 자폐 스펙트럼 장애를 치료 또는 예방할 수 있다.
본 명세서에서, 자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 자폐증(autism), 자폐장애(autistic disorder), 전반적인 발달장애(Pervasive Developmental Disorder; PDD), 사회적 상화작용의 장애, 의사소통의 장애, 반복적 상동증, 레트장애(Rett’s disorder), 소아기 붕괴장애(childhood disintegrative disorder), 아스퍼거 증후군(Asperger’s syndrome), 강박증(obsession disorder), 강박장애(obsessive compulsive disorder), 및 특정불능의 전반적 발달장애(Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified; PDD-NOS)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환을 포함하는 의미이다.
본 발명의 할로로돕신 단백질, 상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 Ca2+ 채널 차단제는 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 유효 성분을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed, Merck & Co Inc 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 할로로돕신 단백질, 상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 Ca2+ 채널 차단제에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 할로로돕신 단백질, 상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 Ca2+ 채널 차단제는 경구 또는 비경구 투여 모두 가능하며, 비경구 투여는 두개강 내 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 포함한다.
본 발명의 할로로돕신 단백질, 상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 Ca2+ 채널 차단제의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 병용되는 약물, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 할로로돕신 단백질, 상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 Ca2+ 채널 차단제의 투여량은 1일 당 00001 ng/kg(체중) 내지 200 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 할로로돕신 단백질, 상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 Ca2+ 채널 차단제는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는, 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum)의 뉴런에, 할로로돕신 단백질, 상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입되어 발현된, 자폐 스펙트럼 장애 모니터링용 마우스이다.
일 구현예에서, 상기 할로로돕신 단백질이 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum)의 뉴런에서 발현되고, 상기 발현된 할로로돕신 단백질은 적색 광 영역의 빛 조사에 의해 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum) 뉴런의 출력 신호를 억제하는 것이 가능하다.
본 발명의 자폐 스펙트럼 장애 모니터링용 마우스는 자폐 스펙트럼 장애 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는, 상기한 자폐 스펙트럼 장애 모니터링용 마우스에 자폐 스펙트럼 장애 예방 또는 치료용 후보물질을 주입하는 단계; 상기 후보물질이 주입된 마우스에 적색 광 영역의 빛을 조사하는 단계; 및 상기 빛이 조사된 마우스의 행동을 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법이다.
또한, 상기 후보물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 후보물질을 주입하는 방법은 예를 들어 마우스에 경구투여 하거나 주사제로 주입해서 투여할 수 있다.
또한, 상기 빛이 조사된 마우스의 행동을 대조군과 비교하는 방법은, 예를 들어 후보물질을 주입한 마우스와 주입하지 않은 마우스의 파묻은 행동의 빈도수 또는 시간을 계산해서 비교할 수 있다. 예를 들어서, 후보물질을 주입한 마우스의 빈도수 또는 시간이 주입하지 않은 마우스의 빈도수 또는 시간보다 줄어들었다면, 상기 후보물질은 자폐증에 유용한 것으로 선별하는 것이 가능하다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 및 약어들은 하기와 같은 의미를 갖는다. 약어가 정의되지 않은 경우, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미로 해석될 수 있다.
AAV: 아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus)
ASD: 자폐 스펙트럼 장애(Autistic Spectrum Disorders)
hChR2: 채널로돕신-2(channelrhodopsin-2)
VL: 복외측 시상(ventrolateral thalamus)
LD: 측배측 시상(laterodorsal thalamus)
WT: 야생형(wild type)
VAL: 복부 전외측 시상(ventral anterolateral thalamus)
AV: 전배측 시상(anteroventral thalamus)
AVTh: 전배측 시상(anteroventral thalamic)
<실시예>
<실시예 1> 채널로돕신(hChR2)이 발현된 WT 마우스 제작
5주 이상된 마우스 WT (C57BL/6J)을 사용하였다. Animal care and handling은 한국과학기술원(KIST, Korea) 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 수행하였다. 다음으로, 마우스의 복외측 시상(ventrolateral thalmus, VL) 신경 또는 측배측 시상(laterodorsal thalmus, LD) 뉴런에 CamKII 프로모터의 제어 하에 channelrhodopsin-2(hChR2) 유전자를 보유한 adeno-associated virus(AAV) 벡터(vector)를 이용하여 감염시켰다(도 1).
상기 hChR2는 light-activated cation channel에 관여한다. 상기 AAV 벡터는 AAV-CamKII-Cre 바이러스와 AAV2/1-EF1α-DIO-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE; titer: 5.36×1012 gc/ml; Vector Core Facility at the University of Pennsylvanic, USA)를 1:1로 섞어 이용하였다. 상기 바이러스 주입을 위해, 모든 마우스를 avertin(20 mg/ml of tribromoethanol, 20 mg/g 복강주사(injection peritoneal, i.p.))으로 마취시키고 정위 장치(Sterotaxic apparatus; David Kopf Instuments, USA)에 넣었다. 상기 모든 바이러스 주입은 0.1 ml/min의 속도로 전달하였다. 바이러스 혼합물 1.0 ml를 복외측 시상(VL; 1.0 mm anteroposterior[AP]; 1.0 mm mediolateral[ML]; 3.4 mm dorsoventral[DV]) 또는 측배측 시상(LD; 1.22 mm anteroposterior[AP]; 1.25 mm mediolateral[ML]; 2.6 mm dorsoventral[DV])에 주입하였다. VL 또는 LD에서 옵신의 발현을 위해, 표적 부위의 크기에 따라 동일한 용량으로 준비한 바이러스를 각각 0.6 microliter, 0.5 microliter 의 용량으로 달리 사용하였다.
상기 바이러스 혼합물을 주사한 뒤에, external metal ferrule(200 mm diameter, 0.39 NA; Doric Lenses Inc., Canada)이 달린 광섬유 탐침(fiberoptic probe)을 선조체 (striautm) 시상에 삽입하고, Super-Bond(Sun Medical Co., Japan)로 두개골(skull)에 고정시켰다.
<실시예 2> ASD 마우스 제작
본 발명의 ASD(자폐 스펙트럼 장애) 마우스는 Poliak S. et al,, 2003 에 기재된 방법에 따라 제작된 CNTNAP2라는 자폐 동물 모델을 사용하였다. 본 연구팀은 heterozygote mice 교배해서 만든 CNTNAP2 ASD 마우스를 사용하였다.
<실시예 3> 할로로돕신(NpHR3.0)이 발현된 ASD 마우스 제작
실시예 2에서 제작한 CNTNAP2 ASD 마우스에 광 의존적 염소 펌프(light-dependent chloride pump)인 할로로돕신(halorhodopsin; NpHR3.0)을 발현하는 바이러스를 VL 주입하여, 할로로돕신이 발현된 ASD 마우스를 제작하였다. 즉, CamKII 프로모터 제어 하에 NpHR3.0 유전자를 보유한 adeno-associated virus(AAV)를 본 발명의 실시예2에 따른 ASD 마우스의 VL 부위에 감염시켰다.
상기 할로로돕신을 주입하기 위해 사용된 바이러스는 AAV-CamKII-CRE , AAV-DIO-NpHR3.0-EYFP; Vector Core Facility at the University of Pennsylvania, USA)이다. 상기 바이러스 주입을 위해, 모든 생쥐는 avertin으로 마취시키고 정위 장치(Sterotaxic apparatus; David Kopf Instuments, USA)에 두었다. 상기 모든 바이러스 주입은 0.1 ml/min의 속도로 전달하였다. 제한된 표적 영역에서 옵신(Opsins)의 발현을 위해, 총 0.8 ml의 바이러스 혼합물을 VL에 주입하였다. VL 시상의 좌표(coordinates)는 1.0 mm AP, 1.1 ML, 3.4 DV 이다.
상기 바이러스 혼합물을 주입한 뒤에, external metal ferrule(200 mm diameter, 0.39 NA; Doric Lenses Inc., Canada)이 달린 광섬유 탐침(fiberoptic probe)을 선조체 (striatum)에 삽입하고, Super-Bond(Sun Medical Co., Japan)로 두개골(skull)에 고정시켰다.
<실험예>
<실험예 1> 선조체에 청색광 자극을 통한 WT 마우스로부터 자폐 동물 모델 유도 확인
본 발명의 실시예 1에 따른 채널로돕신이 발현된 WT 마우스에 대하여 광자극을 통한 자폐 동물모델 유도를 확인하고자 하였다.
상기 채널로돕신이 발현된 마우스의 선조체(Striatum) 핵심 영역에 473 nm의 청색 광을 조사하여 VL 및 LD 신경 각각의 축삭을 광자극하였다. Optogenetic 자극 실험을 위해 473 nm 빛은 pulse generator(Agilent, USA)에 의해 제어되는 diode-pumped solid-state laser(CrystaLaser, USA) 기기를 이용하였다. 청색 광 자극 후에, 마우스의 파묻는 행동에 대한 빈도수(Digging frequency) 및 시간(Digging time)을 계산하였고, 그 결과는 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 도 1의 실험예에 따라 채널로돕신이 발현된 WT 마우스에서 복외측 시상(VL) 부위에 빛을 전달하였을 때, 마우스의 앞다리(Forelimb) 및 뒷다리(Hindlimb) 모두 파묻는 행동의 빈도수 (Digging frequency)와 시간 (Digging time)이 유의하게 증가된 것을 확인하였다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 도 1의 실험예에 따라 채널로돕신이 발현된 WT 마우스에서 측배측 시상(LD) 부위에 빛을 전달하였을 때, 마우스의 앞다리(Forelimb) 및 뒷다리(Hindlimb) 모두 파묻는 행동의 빈도수 (Digging frequency)와 시간 (Digging time)이 유의하게 증가된 것을 확인하였다.
상기한 결과에 따라, AV에서 선조체로 가는 신호를 강화 혹은 활성화 시키는 채널로돕신을 적용시킨 WT 마우스에 청색 광 조사를 통하여 자폐증 증상이 유도된 것을 확인하였다.
<실험예 2> 선조체에 적색광 자극을 통한 자폐 동물 모델의 자폐 증상 완화 확인
본 실험예에서는 상기 실시예2를 통하여 할로로돕신(NpHR3.0)이 발현된 마우스의 선조체(Striatum) 부위에 적색 광(630 nm)을 이용한 빛을 사용하여, VL 및 LD 입력을 광억제하고 자폐증 증상이 억제되는지 확인하였다. 마우스의 파묻는 행동에 대한 빈도수(Digging frequency) 및 시간(Digging time)을 계산하여 그 효과를 판단하였다(도 4).
상기 할로로돕신이 발현된 ASD 마우스의 선조체(Striatum) 핵심 영역을 630 nm의 적색 광을 조사하여 VL 및 LD 신경의 축삭(axon)을 광자극하였다. Optogenetic 자극 실험을 위해 630 nm 빛은 pulse generator(Agilent, USA)에 의해 제어되는 diode-pumped solid-state laser(CrystaLaser, USA) 기기를 이용하였다. 적색 광 자극 후에, 마우스의 파묻는 행동에 대한 빈도수(Digging frequency) 및 시간(Digging time)을 계산하였고, 그 결과는 도 5에 나타낸 바와 같다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 도 4의 실험예에 따라 자폐증 생쥐에서 VAL (혹은 AV) 부위에 빛을 전달하였을 때, 마우스의 앞다리(Forelimb) 및 뒷다리(Hindlimb) 모두 파묻는 행동의 빈도수 (Digging frequency)와 시간 (Digging time)이 유의하게 감소된 것을 확인하였다.
따라서, 상기한 결과로부터 AV에서 선조체로 가는 신호를 차단시키는 할로로돕신을 적용시킨 ASD 마우스에 적색 광 조사를 통하여 자폐증 증상이 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다.
상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

Claims (15)

  1. 복외측 시상(ventrolateral thalamus, VL), 측배측 시상(laterodorsal thalamus, LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런의 출력 신호를 억제하는 단계를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애(Autism Spectrum Disorder; ASD)의 치료방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런의 출력 신호를 억제하기 위해,
    상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런의 출력 신호를 억제할 수 있는 약물을 주입하거나, 상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런에 전기 자극을 제공하는 것인, 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런의 출력 신호를 억제하기 위해,
    신경 활성을 억제하는 물질을 주입하거나, 상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런과 관련된 분자기전을 조절하거나, 상기 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런에 과분극을 일으키거나, Ca2+ 채널(Ca2+ channel) 차단제를 자폐 스펙트럼 장애를 가진 개체의 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(striatum) 뉴런에 처리하거나, 약물을 통한 선택적인 수용기 활성화(DREADD : designer receptors exclusively activated by desiner drugs) 방법을 이용하는 것인, 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 복외측 시상(VL) 뉴런 또는 측배측 시상(LD) 뉴런의 출력 신호를 억제하기 위해, 할로로돕신 단백질, 상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 자폐 스펙트럼 장애를 가진 개체의 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum)의 뉴런에 도입되는 것인, 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 할로로돕신 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것인, 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것인, 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법.
  7. 제 4 항에 있어서,
    상기 벡터는 선형 DNA 벡터, 플라스미드 DNA 벡터 및 재조합 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 재조합 바이러스 벡터는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 및 렌티바이러스(lentivirus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법.
  9. 제 4 항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 형질주입(transfection), 전기천공(electroporation), 형질도입(transfection), 미세주입(microinjection) 및 총알식 도입(ballistic introduction)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 한 방법을 사용하여 상기 개체의 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum)의 뉴런에 도입되는 것인, 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법.
  10. 제 4 항에 있어서,
    상기 할로로돕신 단백질, 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된 개체에 적색 광 영역의 빛을 조사하는 단계를 더 포함하는, 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 빛을 조사하는 단계는 복외측 시상(VL), 측배측 시상 또는 선조체 뉴런에 조사하는 것인, 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 자폐증(autism), 자폐장애(autistic disorder), 전반적인 발달장애(Pervasive Developmental Disorder; PDD), 사회적 상화작용의 장애, 의사소통의 장애, 반복적 상동증, 레트장애(Rett’s disorder), 소아기 붕괴장애(childhood disintegrative disorder), 아스퍼거 증후군(Asperger’s syndrome), 강박증(obsession disorder), 강박장애(obsessive compulsive disorder), 및 특정불능의 전반적 발달장애(Pervasive Developmental Disorder Not Otherwise Specified; PDD-NOS)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 질환인 것인, 자폐 스펙트럼 장애의 치료방법.
  13. 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum)의 뉴런에, 할로로돕신 단백질, 상기 할로로돕신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입되어 발현된, 자폐 스펙트럼 장애 모니터링용 마우스.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 할로로돕신 단백질이 복외측 시상(VL), 측배측 시상(LD) 또는 선조체(Striatum)의 뉴런에서 발현되고,
    상기 발현된 할로로돕신 단백질은 적색 광 영역의 빛 조사에 의해 복외측 시상(VL) 또는 측배측 시상(LD) 뉴런의 출력 신호를 억제하는, 자폐 스펙트럼 장애 모니터링용 마우스.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항의 마우스에 자폐 스펙트럼 장애 예방 또는 치료용 후보물질을 주입하는 단계;
    상기 후보물질이 주입된 마우스에 적색 광 영역의 빛을 조사하는 단계; 및
    상기 빛이 조사된 마우스의 행동을 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애 예방 또는 치료용 후보물질의 스크리닝 방법.
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