WO2020013271A1 - 抗肥満物質のスクリーニング方法及び抗肥満物質のスクリーニング用キット - Google Patents

抗肥満物質のスクリーニング方法及び抗肥満物質のスクリーニング用キット Download PDF

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小林　正樹
匠 成田
加菜里 瀧
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening an anti-obesity substance and a kit for screening an anti-obesity substance.
  • Obesity is defined as an excess of body fat.
  • the main cause of obesity is an imbalance between calorie intake and calorie consumption.
  • calorie intake exceeds calorie consumption, surplus calories are accumulated in the body as fat, and eventually obesity occurs.
  • Obesity also causes lifestyle-related diseases such as diabetes, hypertension, and hyperlipidemia. For this reason, prevention and improvement of obesity are considered to be extremely important in reducing the risk of lifestyle-related diseases.
  • Non-Patent Document 1 reports that mitochondrial biosynthesis is enhanced via Pgc-1 ⁇ in a white adipose tissue-selective and Srebp-1c-dependent manner by calorie intake restriction (CR).
  • Non-Patent Document 2 reports that the expression of Mipep is enhanced by restriction of calorie intake (CR), and that Sip3 is processed by Mipep to become an active form.
  • CR calorie intake
  • the present invention has been proposed in view of the above, and has as its object to provide a method for screening an anti-obesity substance and a kit for screening an anti-obesity substance.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, have found that a substance that enhances the expression of both the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene is promising as an anti-obesity substance. It was completed. More specifically, the present invention is as follows.
  • a method for screening an anti-obesity substance comprising selecting a substance that enhances the expression of Pgc-1 ⁇ gene and Mipep gene.
  • ⁇ 2> a step of bringing a test substance into contact with cells expressing the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene; Selecting the test substance as an anti-obesity substance, when the expression levels of the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene in the cells are increased as compared with the case where the test substance is not contacted; ⁇ 1> The method for screening an anti-obesity substance according to ⁇ 1>.
  • ⁇ 3> As the cells, a cell having a Srebp-1c gene and a cell having no Srebp-1c gene are used, ⁇ 2> The method according to ⁇ 2>, wherein when the expression levels of the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene are increased only in cells having the Srebp-1c gene by contacting the test substance, the test substance is selected as an anti-obesity substance.
  • a screening method for anti-obesity substances A screening method for anti-obesity substances.
  • ⁇ 4> a first transformant having a first reporter gene operably linked downstream of a Pgc-1 ⁇ gene promoter, and a second reporter operably linked downstream of a Mipep gene promoter Contacting a test substance with a second transformant having the gene; Selecting the test substance as an anti-obesity substance, when the expression levels of the first reporter gene and the second reporter gene are increased as compared with the case where the test substance is not contacted; ⁇ 1> The method for screening an anti-obesity substance according to ⁇ 1>.
  • ⁇ 5> As each of the first transformant and the second transformant, a transformant having a Srebp-1c gene and a transformant having no Srebp-1c gene are used, When the expression levels of the first reporter gene and the second reporter gene are increased only in a transformant having the Srebp-1c gene by contacting the test substance, the test substance is used as an anti-obesity substance.
  • the method for screening an anti-obesity substance according to ⁇ 4> which is selected.
  • a kit for screening an anti-obesity substance comprising at least one selected from the following (a) to (c): (A) primers for amplifying each of the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene, (B) a probe for detecting each of the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene, (C) Antibodies to each of the Pgc-1 ⁇ protein and the Mipep protein.
  • a kit for screening an anti-obesity substance comprising at least one selected from the following (d) and (e): (D) a first vector having a promoter of the Pgc-1 ⁇ gene and a first reporter gene operably linked downstream of the promoter, and a promoter of the Mipep gene; A second vector having a ligated second reporter gene; (E) a first transformant having a first reporter gene operably linked downstream of the Pgc-1 ⁇ gene promoter, and a second reporter operably linked downstream of the Mipep gene promoter A second transformant having the gene.
  • a method for screening an anti-obesity substance and a kit for screening an anti-obesity substance can be provided.
  • FIG. 9 is a diagram showing the result of analyzing.
  • the Pgc-1 ⁇ OE strain overexpressing the Pgc-1 ⁇ gene
  • the Mipep OE strain overexpressing the Mipep gene
  • the Mock cell as a control
  • the method for screening an anti-obesity substance according to the present embodiment includes selecting a substance that enhances the expression of the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene. As shown in the examples described below, by increasing the expression of both the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene, the amount of accumulated lipid droplets in white adipocytes is significantly reduced. Therefore, a substance that enhances the expression of both the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene is considered to be promising as an anti-obesity substance.
  • the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene are both publicly known, and their nucleotide sequence information and amino acid sequence information can be obtained from the GenBank database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of human Pgc-1 ⁇ are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of human Mipep are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4.
  • the expression levels of the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene may be measured, or the expression levels of the reporter gene may be measured by a reporter assay.
  • the expression levels of the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene may be measured, or the expression levels of the reporter gene may be measured by a reporter assay.
  • the screening method includes a step of contacting a test substance with cells expressing the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene (hereinafter, also referred to as a “contact step”), as compared with a case where the test substance is not contacted. Selecting the test substance as an anti-obesity substance when the expression levels of the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene in the cell increase (hereinafter, also referred to as “selection step”).
  • a test substance is brought into contact with cells expressing the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene.
  • the cells to be contacted with the test substance are not particularly limited as long as they express the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene. As shown in Examples described later, the expression of Pgc-1 ⁇ gene and Mipep gene in white adipose tissue is controlled by Srebp-1c gene. For this reason, it is preferable that the cells to be contacted with the test substance are mammalian cells expressing the Srebp-1c gene in addition to the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene.
  • the method of bringing the test substance into contact with the cells is not particularly limited, and examples include a method of culturing the cells in a medium to which the test substance is added.
  • the test substance is selected as an anti-obesity substance.
  • the expression level at the transcription level (mRNA level) or the expression level at the translation level (protein level) may be measured. That is, the expression level of the gene includes both the level of the transcript and the level of the translation product.
  • the method for measuring the amount of mRNA is not particularly limited as long as it can measure the amount of mRNA of the target gene (Pgc-1 ⁇ gene or Mipep gene).
  • the target gene Pgc-1 ⁇ gene or Mipep gene.
  • RT-PCR quantitative PCR
  • Northern blot DNA A microarray method and the like can be mentioned.
  • the method for measuring the amount of protein is not particularly limited as long as it can specifically measure the protein encoded by the target gene (Pgc-1 ⁇ gene or Mipep gene), and examples thereof include Western blotting and enzyme immunoassay. No.
  • the test substance can be selected as an anti-obesity substance.
  • the expression of the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene in white adipose tissue is controlled by the Srebp-1c gene. Therefore, by using a cell having the Srebp-1c gene and a cell not having the Srebp-1c gene as the cells to be brought into contact with the test substance, by contacting the test substance, Pgc can be obtained only in the cells having the Srebp-1c gene.
  • the test substance may be selected as an anti-obesity substance. This makes it possible to obtain an anti-obesity substance having an action similar to the caloric intake restriction (CR).
  • the screening method comprises a first transformant having a first reporter gene operably linked downstream of a Pgc-1 ⁇ gene promoter, and a first transformant downstream of a Mipep gene promoter.
  • a step of contacting a test substance with a second transformant having a second reporter gene which is linked to the test substance (hereinafter, also referred to as a “contacting step”); Selecting the test substance as an anti-obesity substance when the expression levels of the first reporter gene and the second reporter gene increase (hereinafter, also referred to as “selection step”).
  • a test substance is brought into contact with a second transformant having two reporter genes.
  • the first transformant has a first reporter gene operably linked downstream of the Pgc-1 ⁇ gene promoter. Further, the second transformant has a second reporter gene operably linked downstream of the promoter of the Mipep gene.
  • “functionally linked” means that the reporter gene is expressed under the control of the promoter of the target gene in response to a molecule that naturally induces the expression of the target gene (Pgc-1 ⁇ gene or Mipep gene). Means that they are linked together.
  • the first reporter gene and the second reporter gene are not particularly limited, and any reporter gene known in the field of biotechnology can be used.
  • the reporter gene include a luciferase gene, a GFP (green fluorescent protein) gene, a GUS ( ⁇ -glucuronidase) gene, and a CAT (chloramphenicol acetyltransferase) gene.
  • the first transformant can be obtained by introducing a first vector having a Pgc-1 ⁇ gene promoter and a first reporter gene operably linked downstream of the promoter into a host cell. it can.
  • the second transformant can be obtained by introducing a second vector having a promoter of the Mipep gene and a second reporter gene operably linked downstream of the promoter into a host cell. it can.
  • the host cell is not particularly limited, but is preferably a mammalian cell expressing the Srebp-1c gene.
  • the first transformant and the second transformant are not limited to separate transformants, but may be single transformants.
  • a Pgc-1 ⁇ gene promoter, a first reporter gene operably linked downstream of the promoter, a Mipep gene promoter, and a second reporter gene operably linked downstream of the promoter By introducing a vector having the following into a host cell, a single transformant can be obtained.
  • the first transformant and the second transformant are a single transformant, identifiable heterologous genes are used as the first reporter gene and the second reporter gene.
  • the method for contacting the test substance with the first transformant and the second transformant is not particularly limited.
  • the first transformant and the second transformant are cultured in a medium to which the test substance is added. Method.
  • the test substance is selected as an anti-obesity substance.
  • the expression levels of the first reporter gene and the second reporter gene can be measured by a method according to the type of the reporter gene. For example, if the reporter gene is a luciferase gene, the activity of the expression product, luciferase, can be detected by fluorescence. If the reporter gene is a GFP gene, GFP as an expression product can be detected with fluorescence. When the reporter gene is a GUS gene, the activity of GUS, which is an expression product, can be detected by coloring with glucuron or the like. If the reporter gene is a CAT gene, the activity of CAT, an expression product, can be detected by acetylation of chloramphenicol.
  • the test substance can be selected as an anti-obesity substance.
  • the expression of the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene in white adipose tissue is controlled by the Srebp-1c gene. Therefore, a transformant having the Srebp-1c gene and a transformant having no Srebp-1c gene are used as the first transformant and the second transformant, respectively, and the test substance is brought into contact therewith.
  • the test substance may be selected as an anti-obesity substance. This makes it possible to obtain an anti-obesity substance having an action similar to the caloric intake restriction (CR).
  • an in vivo assay may be performed. For example, by administering the obtained anti-obesity substance to a Pgc-1 ⁇ -deficient mouse and a Mipep-deficient mouse, and comparing its reactivity with a wild-type mouse, it is possible to evaluate the effectiveness of the anti-obesity substance at an animal level. it can.
  • the anti-obesity substance screening kit according to the present embodiment may be used when measuring the expression levels of the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene as in the screening method according to the first aspect described above. Like the screening method according to the second aspect described above, it may be used when measuring the expression level of a reporter gene by a reporter assay.
  • each embodiment will be described.
  • the screening kit according to the first aspect includes at least one selected from the following (a) to (c).
  • the primer in the above (a) can be designed based on each base sequence of the target gene (Pgc-1 ⁇ or Mipep), and can be prepared through each step of synthesis and purification.
  • the length (number of bases) of the primer is not particularly limited, but is preferably about 15 to 40 bases in order to enable specific annealing.
  • a polynucleotide comprising a continuous partial sequence of each nucleotide sequence of the target gene Pgc-1 ⁇ or Mipep
  • a polynucleotide comprising a continuous partial sequence of a complementary sequence to each nucleotide sequence of the target gene Nucleotides are used.
  • the length (number of bases) of the probe is not particularly limited, but is preferably 15 bases or more in order to enable specific hybridization.
  • These probes can be appropriately labeled using a labeling substance. Fluorescent dyes, radioisotopes, enzymes, avidin, biotin and the like can be used as the labeling substance.
  • the probe may be used by immobilizing it on a solid support such as a microarray.
  • the method for preparing the microarray is not particularly limited. For example, a method of directly synthesizing a probe on the surface of a solid support (on-chip method), a method of binding a previously prepared probe to the surface of a solid support, or the like may be employed. it can.
  • the antibody in the above (c) may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody, and may be an active fragment of the antibody. Active fragments include F (ab ') 2 , Fab', Fab, Fv, and the like. These antibodies can be appropriately labeled using a labeling substance. As a labeling substance, an enzyme, a radioisotope, a fluorescent dye, or the like can be used.
  • the screening kit according to the second aspect includes at least one selected from the following (d) and (e).
  • the first vector and the second vector may appropriately have an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, and the like.
  • the selection marker include an ampicillin resistance gene and a neomycin resistance gene.
  • the first vector and the second vector are not limited to separate vectors, and may be a single vector.
  • the first vector and the second vector include a Pgc-1 ⁇ gene promoter, a first reporter gene operably linked downstream of the promoter, a Mipep gene promoter, and a downstream of the promoter. It may be a single vector having a second reporter gene operably linked thereto.
  • the first transformant and the second transformant in the above (e) are not limited to separate transformants, and may be a single transformant.
  • a Pgc-1 ⁇ gene promoter, a first reporter gene operably linked downstream of the promoter, a Mipep gene promoter, and a second reporter gene operably linked downstream of the promoter By introducing a vector having the following into a host cell, a single transformant can be obtained.
  • ⁇ Test Example 1> (Production of model mouse and collection of white adipose tissue) From Srebp-1c +/ ⁇ (B6; 129S6-Srebf1 tm1Mbr ) mouse (G. Liang et al., J. Biol. Chem., 2002, 277, pp. 9520-9528 ) purchased from the Jackson Laboratory, USA. By crossing, Srebp-1c + / + mice (hereinafter, also referred to as “WT mice”) and Srebp-1c ⁇ / ⁇ mice (hereinafter, also referred to as “KO mice”) were produced.
  • WT mice Srebp-1c + / + mice
  • Srebp-1c ⁇ / ⁇ mice hereinafter, also referred to as “KO mice”.
  • the animals were bred for 12 hours in a light-dark cycle under the SPF environment in the animal experiment facility of Tokyo University of Science, and were fed a sufficient amount of CRF-1 (Oriental Yeast Kogyo Co., Ltd.) as a feed to the free-feeding group (AL group).
  • the food intake of the AL group was measured, and the calorie intake restricted group (CR group) was given 70% of the amount before turning off.
  • Caloric intake restriction (CR) was started at the age of 3 months, and a total of four groups, a WT-AL group, a WT-CR group, a KO-AL group, and a KO-CR group, were prepared.
  • the animals were euthanized by isoflurane overanaesthesia. After euthanasia, the white adipose tissue around the testis was collected, and the organ was frozen at -80 ° C after rapid freezing with liquid nitrogen.
  • the PCR product was separated by 2.4% agarose gel electrophoresis, treated with a 0.01% ethidium bromide solution for 15 minutes, and then a specific band was visualized using a lumino image analyzer LAS3000 (Fujifilm Corporation). .
  • the expression level of each mRNA was corrected based on the expression level of Tbp (TATA-binding protein).
  • the primers used are shown in Table 1 below.
  • FIG. 1A and FIG. 1B in the wild-type (WT) mouse, the mRNA expression level of Mipep and Pgc-1 ⁇ significantly increased due to restriction of caloric intake (CR).
  • Srebp-1c knockout (KO) mice mRNA expression levels of Mipep and Pgc-1 ⁇ did not increase even by restriction of caloric intake (CR).
  • the primers used for the amplification of the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene are as shown in Table 1 above.
  • the primers used for amplification of the Srebp-1c gene and the Rps18 gene are shown in Table 2 below.
  • FIG. 2 shows the mRNA expression levels of Pgc-1 ⁇ , Srebp-1c, and Mipep in wild-type MEF cells and MEF cells in which the Pgc-1 ⁇ gene was knocked out.
  • FIG. 2 shows the mRNA expression levels of Pgc-1 ⁇ , Srebp-1c, and Mipep in wild-type MEF cells and MEF cells in which the Pgc-1 ⁇ gene was knocked out.
  • Srebp-1c and Mipep mRNA between wild-type MEF cells and MEF cells in which the Pgc-1 ⁇ gene was knocked out. From these results and the results of Test Example 1, it was suggested that the enhancement of the expression of the Mipep gene and the Pgc-1 ⁇ gene due to intake calorie restriction (CR) is independent of each other.
  • CR intake calorie restriction
  • Mipep overexpression vector and Pgc-1 ⁇ overexpression vector Using cDNA of mouse white adipose tissue as a template, Mipep cDNA was amplified by PCR using the primers shown in Table 3 below and Primestar (Toyobo Co., Ltd.).
  • the pMXs-Mipep-Puro vector was prepared by cleaving the PCR product with EcoR I and Xho I and ligating it with the pMXs-AMNN-Puro vector that had been cut with EcoR I and Xho I.
  • the pcDNA-f Pgc-1 vector purchased from Addgene was cut with EcoR ⁇ V and Pme ⁇ I. The obtained DNA fragment was treated with EcoRII, blunted by Klenow treatment, and ligated with pMXs-Neo vector dephosphorylated by CIP treatment to prepare a pMXs-Pgc-1 ⁇ -Neo vector.
  • the Plat-E cells into which the pMXs-Mipep-Puro vector was introduced were cultured for 16 hours, replaced with a new medium, and further cultured for 2 days, after which the medium was collected.
  • the collected medium was filtered through a Millex-GV filter (Millipore), 4 ⁇ PEG (32% @ PEG6000, 0.4M NaCl, 40 mM @HEPES, pH 7.4) of 1/3 of the collected medium was added. Thereafter, the mixture was centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes, the supernatant was removed, and the mixture was further centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes.
  • OPTI-MEM Life Technologies Japan
  • OPTI-MEM Life Technologies Japan
  • the obtained suspension was added to the medium of 3T3-L1 cells, and the pMXs-Mipep-Puro vector was introduced into the 3T3-L1 cells by infecting with the retrovirus.
  • all the processes were performed on ice from the step of filtering the medium. From 24 hours after the infection, selection was performed for 5 to 7 days in a medium containing 2 ⁇ g / mL @ puromycin to produce 3T3-L1 cells overexpressing the Mipep gene (hereinafter, also referred to as “Mipep ® OE strain”). .
  • Plat-E cells into which the pMXs-Pgc-1 ⁇ -Neo vector had been introduced were cultured for 16 hours, replaced with a new medium, and further cultured for 2 days, after which the medium was recovered.
  • the collected medium was filtered through a Millex-GV filter (Millipore), 4 ⁇ PEG (32% @ PEG6000, 0.4M NaCl, 40 mM @HEPES, pH 7.4) of 1/3 of the collected medium was added. Thereafter, the mixture was centrifuged at 3000 rpm for 30 minutes, the supernatant was removed, and the mixture was further centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes.
  • OPTI-MEM Life Technologies Japan
  • the obtained suspension was added to the medium of the Mipep @ OE strain, and the pMXs-Pgc-1 ⁇ -Neo vector was introduced into the Mipep @ OE strain by infecting with the retrovirus.
  • all the processes were performed on ice from the step of filtering the medium. From 24 hours after the infection, selection was performed for 5 to 7 days in a medium containing 1 mg / mL @ G418 (Cayman) and 0.4 ⁇ g / mL @ puromycin, whereby 3T3- overexpressing both the Miepep gene and the Pgc-1 ⁇ gene was performed.
  • L1 cells (hereinafter, also referred to as “DOE strain”) were prepared. After the selection, the cells were cultured and maintained in a medium containing 200 ⁇ g / mL @ G418 (Cayman) and 0.4 ⁇ g / mL @ puromycin.
  • 3T3-L1 cells overexpressing the Pgc-1 ⁇ gene (hereinafter, also referred to as "Pgc-1 ⁇ @ OE strain"), and 3T3-L1 cells into which empty vectors have been introduced ( Hereinafter, also referred to as “Mock cells”).
  • 3T3-L1 cells (DOE strain, Pgc-1 ⁇ OE strain, Mipep OE strain, and Mock cells) were seeded at a cell density of 1.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 and reached 100% confluence two days later. On day 0.
  • the cells were induced to adipocytes by culturing in a maintenance medium containing 500 ⁇ M 3-isobutyl-1-methylxanthine and 1 ⁇ M dexamethasone, and thereafter, every 2 days, 10 ⁇ g / mL insulin and 50 nM triiodosilo. It was induced to mature adipocytes by culturing in a maintenance medium containing nin. In the subsequent experiments, cells on day 12 after the start of differentiation induction were used.
  • ⁇ Test Example 4> (Analysis of protein expression levels of Pgc-1 ⁇ and Mipep in DOE strain, Pgc-1 ⁇ OE strain, Mipep OE strain, and Mock cells) From the cells (DOE strain, Pgc-1 ⁇ OE strain, Mipep OE strain, and Mock cells) on day 12 after the initiation of differentiation induction, SDS sample buffer (50 mM tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 3M urea, After extracting the protein using 6% glycerol), the protein concentration was measured using the BCA Protein Assay Kit (Thermo).
  • the protein concentration was adjusted to 1 ⁇ g / ⁇ L, and a mixed solution of 0.5% BPB and 100% 2-mercaptoethanol was added to 1/10 of the protein solution, followed by incubation at 95 ° C. for 5 minutes.
  • a mouse anti-PGC-1 ⁇ monoclonal antibody (Calbiochem) was used as a primary antibody, and an HRP-labeled goat anti-mouse IgG (H + L) antibody (Jackson Immunological Research) was used as a secondary antibody.
  • HRP-labeled goat anti-mouse IgG (H + L) antibody (Jackson Immunological Research) was used as a secondary antibody.
  • Mapep protein a rabbit anti-MIPEP polyclonal antibody (Santa @ Cruz) was used as a primary antibody, and an HRP-labeled goat anti-rabbit IgG (H + L) antibody (Jackson Immunological @ Research) was used as a secondary antibody.
  • a rabbit anti-COX4 polyclonal antibody (Cell @ Signaling) was used as a primary antibody
  • a rabbit anti-MDH2 polyclonal antibody Cell @ Signaling
  • a Sirt3 protein was used for detection of Cox4 protein
  • Rabbit anti-SIRT3 polyclonal antibody (Cell @ Signaling) was used as a primary antibody.
  • an HRP-labeled goat anti-rabbit IgG (H + L) antibody Jackson Immunological Research
  • Tfam protein is a transcription factor of mitochondrial DNA
  • Tom20 protein is a protein present on the outer membrane of mitochondria.
  • a rabbit anti-TFAM polyclonal antibody (Protein Tech) was used as a primary antibody, and an HRP-labeled goat anti-rabbit IgG (H + L) antibody (Jackson Immunological Research) was used as a secondary antibody.
  • HRP-labeled goat anti-rabbit IgG (H + L) antibody Jackson Immunological Research
  • Tom20 protein a mouse anti-TOM20 monoclonal antibody (Sigma) was used as a primary antibody, and an HRP-labeled goat anti-mouse IgG (H + L) antibody (Jackson Immunological Research) was used as a secondary antibody.
  • ⁇ Test Example 5> (Analysis of CS (citrate synthase) activity in DOE strain, Pgc-1 ⁇ OE strain, Mipep OE strain, and Mock cells) From the cells (DOE strain, Pgc-1 ⁇ OE strain, Mipep OE strain, and Mock cells) on day 12 after the initiation of differentiation induction, 200 ⁇ L of homogenization buffer (50 mM tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, Protein was extracted using a% phosphatase inhibitor cocktail, 5 mM EDTA, 1% protease inhibitor cocktail, 1% Triton X-100, 0.05% sodium deoxycholate). The sample solution after the extraction was diluted 1 / 16-fold by adding a homogenization buffer and used for measurement.
  • homogenization buffer 50 mM tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl
  • Protein was extracted using a% phosphatase inhibitor cocktail, 5 mM ED
  • reaction solution 0.1 mM @ 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid), 0.5 mM Acetyl CoA, 0.1% Triton X-100, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0)
  • the sample solution was added and incubated at 25 ° C. for 5 minutes. After the absorbance baseline was stabilized, 10 ⁇ L of 10 mM oxaloacetic acid was added, and the absorbance at 412 nm was measured at 30 ° C.
  • the time constant was determined from the slope of the linear portion of the graph with the time taken on the horizontal axis and the natural logarithm of the value obtained by subtracting the blank from the absorbance at each time taken on the vertical axis, and the value obtained by dividing the rate constant k by the amount of protein was used as the CS. Active.
  • FIG. 6 shows CS activities in the DOE strain, the Pgc-1 ⁇ OE strain, the Mipep OE strain, and the Mock cells. As shown in FIG. 6, the CS activity showed an increasing tendency in correlation with the overexpression of the Pgc-1 ⁇ gene.
  • FIG. 7A shows a microscopic image of DOE strain, Pgc-1 ⁇ @ OE strain, Mipep @ OE strain, and Mock cells stained with Oil Red @ O staining solution
  • the DOE strain, the Pgc-1 ⁇ OE strain, and the Mipep OE strain all significantly reduced the amount of accumulated lipid droplets, particularly the DOE strain. there were.
  • the DOE strain had the same level of mitochondrial-related protein expression (FIGS. 4A to 4C, 5A, and 5B) and CS activity (FIG.
  • the primers used for amplification of the Pgc-1 ⁇ gene, the Mipep gene, and the Rps18 gene are as shown in Tables 1 and 2 above.
  • the primers used for the amplification of the Perilipin gene, Ppar ⁇ gene, and Adipoq gene are shown in Table 4 below.
  • FIG. 8 shows the mRNA expression levels of Pgc-1 ⁇ , Mipep, Perilipin, Ppar ⁇ , and Adipoq in the DOE strain, the Pgc-1 ⁇ OE strain, the Mipep OE strain, and the Mock cells.
  • the mRNA expression levels of Perilipin, Ppar ⁇ , and Adipoq hardly changed in any of the cell lines. From these results and the results of Test Example 6, it was suggested that the decrease in the amount of accumulated lipid droplets in the DOE strain was not due to the decrease in the differentiation signal, but to the overexpression of the Pgc-1 ⁇ gene and the Mipep gene.
  • ⁇ Test Example 8> (Analysis of Perilipin protein expression level in DOE strain, Pgc-1 ⁇ OE strain, Mipep OE strain, and Mock cells) In the same manner as in Test Example 4, the protein expression level of Perilipin in the DOE strain, the Pgc-1 ⁇ OE strain, the Mipep OE strain, and the Mock cells was analyzed by Western blot. Perilipin protein is a protein present on the surface of lipid droplets. As a control, the protein expression level of Lamin B1 was also analyzed.
  • Perilipin protein a rabbit anti-Perilipin monoclonal antibody (Cell Signaling) was used as a primary antibody, and for detection of Lamin ⁇ B1 protein, a rabbit anti-Lamin ⁇ B1 polyclonal antibody (Medical & Biochemical Laboratories) was used as a primary antibody. did. In each case, an HRP-labeled goat anti-rabbit IgG (H + L) antibody (Jackson Immunological Research) was used as a secondary antibody.
  • H + L HRP-labeled goat anti-rabbit IgG
  • FIG. 9 shows the protein expression levels of Perilipin in the DOE strain, the Pgc-1 ⁇ OE strain, the Mipep OE strain, and the Mock cells. As shown in FIG. 9, in the DOE strain, the protein expression level of Perilipin was significantly reduced.

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Abstract

Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現を亢進させる物質を選択することを含む抗肥満物質のスクリーニング方法、及びそのスクリーニング方法に用いられるスクリーニング用キットを提供する。スクリーニングに際しては、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量を測定してもよく、レポーターアッセイによりレポーター遺伝子の発現量を測定してもよい。

Description

抗肥満物質のスクリーニング方法及び抗肥満物質のスクリーニング用キット
　本発明は、抗肥満物質のスクリーニング方法及び抗肥満物質のスクリーニング用キットに関する。
　肥満は、体脂肪が過剰に蓄積した状態と定義されている。肥満の主な原因は、摂取カロリーと消費カロリーとのアンバランスにあり、摂取カロリーが消費カロリーを上回ると、余剰カロリーが脂肪となって体内に蓄積され、やがて肥満となる。肥満は、糖尿病、高血圧、高脂血症等の生活習慣病の原因ともなる。このため、肥満の予防及び改善は、生活習慣病のリスクを低減する上で極めて重要であると考えられる。
　ところで、近年、摂取カロリー制限（ｃａｌｏｒｉｃ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ；ＣＲ）により、エネルギー代謝に関係するミトコンドリアの生合成や機能が亢進することが報告されている。例えば、非特許文献１では、摂取カロリー制限（ＣＲ）により、白色脂肪組織選択的かつＳｒｅｂｐ－１ｃ依存的に、Ｐｇｃ－１αを介してミトコンドリア生合成が亢進することが報告されている。また、非特許文献２では、摂取カロリー制限（ＣＲ）によりＭｉｐｅｐの発現が亢進することや、ＭｉｐｅｐによりＳｉｒｔ３がプロセシングを受けて活性型となることが報告されている。
Ｎ．Ｆｕｊｉｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｇｉｎｇ　Ｃｅｌｌ，２０１７，１６（３），ｐｐ．５０８－５１７ Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１７，５９１（２４），ｐｐ．４０６７－４０７３
　摂取カロリー制限（ＣＲ）は、肥満の予防及び改善に有効であると考えられるが、継続的に摂取カロリー制限（ＣＲ）を行うことは一般に困難である。このため、摂取カロリー制限（ＣＲ）による表現型を模倣可能な抗肥満物質の探索が望まれる。
　本発明は、上記に鑑みて提案されたものであり、抗肥満物質のスクリーニング方法及び抗肥満物質のスクリーニング用キットを提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の両者の発現を亢進させる物質が抗肥満物質として有望であることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のとおりである。
＜１＞　Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現を亢進させる物質を選択することを含む抗肥満物質のスクリーニング方法。
＜２＞　Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子を発現する細胞に被験物質を接触させる工程と、
　前記被験物質を接触させない場合に比べて、前記細胞におけるＰｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が増加する場合に、該被験物質を抗肥満物質として選択する工程と、
を含む＜１＞に記載の抗肥満物質のスクリーニング方法。
＜３＞　前記細胞として、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有する細胞とＳｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有しない細胞とを使用し、
　前記被験物質を接触させることにより、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有する細胞においてのみＰｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が増加する場合に、該被験物質を抗肥満物質として選択する＜２＞に記載の抗肥満物質のスクリーニング方法。
＜４＞　Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子を有する第１の形質転換体、及びＭｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子を有する第２の形質転換体に、被験物質を接触させる工程と、
　前記被験物質を接触させない場合に比べて、前記第１のレポーター遺伝子及び前記第２のレポーター遺伝子の発現量が増加する場合に、該被験物質を抗肥満物質として選択する工程と、
を含む＜１＞に記載の抗肥満物質のスクリーニング方法。
＜５＞　前記第１の形質転換体及び前記第２の形質転換体のそれぞれとして、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有する形質転換体とＳｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有しない形質転換体とを使用し、
　前記被験物質を接触させることにより、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有する形質転換体においてのみ前記第１のレポーター遺伝子及び前記第２のレポーター遺伝子の発現量が増加する場合に、該被験物質を抗肥満物質として選択する＜４＞に記載の抗肥満物質のスクリーニング方法。
＜６＞　下記（ａ）～（ｃ）から選択される少なくとも１つを含む抗肥満物質のスクリーニング用キット：
（ａ）Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子のそれぞれを増幅するためのプライマー、
（ｂ）Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子のそれぞれを検出するためのプローブ、
（ｃ）Ｐｇｃ－１αタンパク質及びＭｉｐｅｐタンパク質のそれぞれに対する抗体。
＜７＞　下記（ｄ）及び（ｅ）から選択される少なくとも１つを含む抗肥満物質のスクリーニング用キット：
（ｄ）Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターと、該プロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子とを有する第１のベクター、及びＭｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターと、該プロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子とを有する第２のベクター、
（ｅ）Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子を有する第１の形質転換体、及びＭｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子を有する第２の形質転換体。
　本発明によれば、抗肥満物質のスクリーニング方法及び抗肥満物質のスクリーニング用キットを提供することができる。
野生型マウス（ＷＯマウス）及びＳｒｅｂｐ－１ｃノックアウトマウス（ＫＯマウス）のそれぞれの自由摂食群（ＡＬ群）及び摂取カロリー制限群（ＣＲ群）について、白色脂肪組織におけるＭｉｐｅｐのｍＲＮＡ発現量を解析した結果を示す図である。 野生型マウス（ＷＯマウス）及びＳｒｅｂｐ－１ｃノックアウトマウス（ＫＯマウス）のそれぞれの自由摂食群（ＡＬ群）及び摂取カロリー制限群（ＣＲ群）について、白色脂肪組織におけるＰｇｃ－１αのｍＲＮＡ発現量を解析した結果を示す図である。 野生型のＭＥＦ細胞及びＰｇｃ－１α遺伝子をノックアウトしたＭＥＦ細胞について、Ｐｇｃ－１α、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ、及びＭｉｐｅｐのｍＲＮＡ発現量を解析した結果を示す図である。 Ｍｉｐｅｐ遺伝子及びＰｇｃ－１α遺伝子の両者を過剰発現するＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α遺伝子を過剰発現するＰｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ遺伝子を過剰発現するＭｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びコントロールとしてのＭｏｃｋ細胞について、Ｐｇｃ－１αのタンパク質発現量を解析した結果を示す図である。 Ｍｉｐｅｐ遺伝子及びＰｇｃ－１α遺伝子の両者を過剰発現するＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α遺伝子を過剰発現するＰｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ遺伝子を過剰発現するＭｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びコントロールとしてのＭｏｃｋ細胞について、Ｍｉｐｅｐのタンパク質発現量を解析した結果を示す図である。 ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞について、Ｃｏｘ４のタンパク質発現量を解析した結果を示す図である。 ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞について、Ｍｄｈ２のタンパク質発現量を解析した結果を示す図である。 ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞について、Ｓｉｒｔ３のタンパク質発現量を解析した結果を示す図である。 ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞について、Ｔｆａｍのタンパク質発現量を解析した結果を示す図である。 ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞について、Ｔｏｍ２０のタンパク質発現量を解析した結果を示す図である。 ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＣＳ（ｃｉｔｒａｔｅ　ｓｙｎｔａｓｅ）活性を示す図である。 ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞をＯｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ染色液で染色したときの顕微鏡像を示す図である。 ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞をＯｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ染色液で染色したときの脂肪滴蓄積量の測定結果を示す図である。 ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞について、Ｐｇｃ－１α、Ｍｉｐｅｐ、Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ、Ｐｐａｒγ、及びＡｄｉｐｏｑのｍＲＮＡ発現量を解析した結果を示す図である。 ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞について、Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎのタンパク質発現量を解析した結果を示す図である。
＜抗肥満物質のスクリーニング方法＞
　本実施形態に係る抗肥満物質のスクリーニング方法は、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現を亢進させる物質を選択することを含む。後述する実施例に示すとおり、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の両者の発現を亢進させることにより、白色脂肪細胞における脂肪滴蓄積量が顕著に減少する。したがって、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の両者の発現を亢進させる物質は、抗肥満物質として有望であると考えられる。
　なお、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子はいずれも公知であり、それぞれの塩基配列情報及びアミノ酸配列情報は米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能である。一例として、ヒトＰｇｃ－１αの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号１、２に示す。また、ヒトＭｉｐｅｐの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号３、４に示す。
　スクリーニングに際しては、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量を測定してもよく、レポーターアッセイによりレポーター遺伝子の発現量を測定してもよい。以下、それぞれの態様について説明する。
　第１の態様に係るスクリーニング方法は、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子を発現する細胞に被験物質を接触させる工程（以下、「接触工程」ともいう。）と、被験物質を接触させない場合に比べて、細胞におけるＰｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が増加する場合に、該被験物質を抗肥満物質として選択する工程（以下、「選択工程」ともいう。）と、を含む。
　まず、接触工程では、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子を発現する細胞に被験物質を接触させる。
　被験物質を接触させる細胞としては、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子を発現するものであれば特に制限されない。後述する実施例に示すとおり、白色脂肪組織におけるＰｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現は、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子の制御を受けている。このため、被験物質を接触させる細胞としては、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子のほかにＳｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を発現する哺乳動物由来の細胞であることが好ましい。
　細胞に被験物質を接触させる方法は特に制限されず、例えば、被験物質を添加した培地で細胞を培養する方法が挙げられる。
　次いで、選択工程では、被験物質を接触させない場合に比べて、細胞におけるＰｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が増加する場合に、該被験物質を抗肥満物質として選択する。
　Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量を測定する際には、転写レベルの発現量（ｍＲＮＡ量）を測定してもよく、翻訳レベルの発現量（タンパク質量）を測定してもよい。すなわち、遺伝子の発現量には、転写産物の量と翻訳産物の量との両方が含まれる。
　ｍＲＮＡ量の測定方法としては、対象遺伝子（Ｐｇｃ－１α遺伝子又はＭｉｐｅｐ遺伝子）のｍＲＮＡ量を測定できる方法であれば特に制限されず、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ法、定量ＰＣＲ法、ノーザンブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法等が挙げられる。
　タンパク質量の測定方法としては、対象遺伝子（Ｐｇｃ－１α遺伝子又はＭｉｐｅｐ遺伝子）がコードするタンパク質を特異的に測定できる方法であれば特に制限されず、例えば、ウェスタンブロット法、酵素免疫測定法等が挙げられる。
　上記のようにＰｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量を測定した結果、被験物質を接触させない場合に比べて、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が有意に増加している場合には、該被験物質を抗肥満物質として選択することができる。
　なお、上記のとおり、白色脂肪組織におけるＰｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現は、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子の制御を受けている。このため、被験物質を接触させる細胞として、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有する細胞とＳｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有しない細胞とを使用し、被験物質を接触させることにより、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有する細胞においてのみＰｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が増加する場合に、該被験物質を抗肥満物質として選択するようにしてもよい。これにより、摂取カロリー制限（ＣＲ）に近似した作用を有する抗肥満物質を得ることが可能となる。
　一方、第２の態様に係るスクリーニング方法は、Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子を有する第１の形質転換体、及びＭｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子を有する第２の形質転換体に、被験物質を接触させる工程（以下、「接触工程」ともいう。）と、被験物質を接触させない場合に比べて、第１のレポーター遺伝子及び第２のレポーター遺伝子の発現量が増加する場合に、該被験物質を抗肥満物質として選択する工程（以下、「選択工程」ともいう。）と、を含む。
　まず、接触工程では、Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子を有する第１の形質転換体、及びＭｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子を有する第２の形質転換体に、被験物質を接触させる。
　第１の形質転換体は、Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子を有する。また、第２の形質転換体は、Ｍｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子を有する。
　ここで、「機能的に連結された」とは、天然において対象遺伝子（Ｐｇｃ－１α遺伝子又はＭｉｐｅｐ遺伝子）の発現を誘導する分子に応答して、対象遺伝子のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子が発現するように連結されていることを意味する。
　第１のレポーター遺伝子及び第２のレポーター遺伝子としては、特に制限されず、生命工学分野で知られている任意のレポーター遺伝子を使用することができる。レポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ＧＵＳ（β－グルクロニダーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
　第１の形質転換体は、Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターと、該プロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子とを有する第１のベクターを宿主細胞に導入することによって得ることができる。また、第２の形質転換体は、Ｍｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターと、該プロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子とを有する第２のベクターを宿主細胞に導入することによって得ることができる。
　宿主細胞としては特に制限されないが、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を発現する哺乳動物由来の細胞であることが好ましい。
　なお、第１の形質転換体及び第２の形質転換体は、別個の形質転換体に限定されるものではなく、単一の形質転換体であってもよい。例えば、Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターと、該プロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子と、Ｍｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターと、該プロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子とを有するベクターを宿主細胞に導入することによって、単一の形質転換体を得ることができる。第１の形質転換体及び第２の形質転換体を単一の形質転換体とする場合、第１のレポーター遺伝子及び第２のレポーター遺伝子としては、識別可能な異種の遺伝子が使用される。
　第１の形質転換体及び第２の形質転換体に被験物質を接触させる方法は特に制限されず、例えば、被験物質を添加した培地で第１の形質転換体及び第２の形質転換体を培養する方法が挙げられる。
　次いで、選択工程では、被験物質を接触させない場合に比べて、第１のレポーター遺伝子及び第２のレポーター遺伝子の発現量が増加する場合に、該被験物質を抗肥満物質として選択する。
　第１のレポーター遺伝子及び第２のレポーター遺伝子の発現量は、レポーター遺伝子の種類に応じた方法で測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子であれば、発現産物であるルシフェラーゼの活性を、蛍光をもって検出することができる。レポーター遺伝子がＧＦＰ遺伝子であれば、発現産物であるＧＦＰを、蛍光をもって検出することができる。レポーター遺伝子がＧＵＳ遺伝子であれば、発現産物であるＧＵＳの活性を、グルクロン等の発色をもって検出することができる。レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子であれば、発現産物であるＣＡＴの活性を、クロラムフェニコールのアセチル化をもって検出することができる。
　上記のように第１のレポーター遺伝子及び第２のレポーター遺伝子の発現量を測定した結果、被験物質を接触させない場合に比べて、第１のレポーター遺伝子及び第２のレポーター遺伝子の発現量が有意に増加している場合には、該被験物質を抗肥満物質として選択することができる。
　なお、上記のとおり、白色脂肪組織におけるＰｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現は、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子の制御を受けている。このため、第１の形質転換体及び第２の形質転換体のそれぞれとして、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有する形質転換体とＳｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有しない形質転換体とを使用し、被験物質を接触させることにより、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有する形質転換体においてのみ第１のレポーター遺伝子及び第２のレポーター遺伝子の発現量が増加する場合に、該被験物質を抗肥満物質として選択するようにしてもよい。これにより、摂取カロリー制限（ＣＲ）に近似した作用を有する抗肥満物質を得ることが可能となる。
　以上のようにして、細胞レベルでＰｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現を亢進する抗肥満物質が得られた後には、ｉｎ　ｖｉｖｏでのアッセイを行ってもよい。例えば、得られた抗肥満物質をＰｇｃ－１α欠損マウス及びＭｉｐｅｐ欠損マウスに投与し、その反応性を野生型マウスと比較することにより、該抗肥満物質の有効性を動物レベルで評価することができる。
＜抗肥満物質のスクリーニング用キット＞
　本実施形態に係る抗肥満物質のスクリーニング用キットは、上述した第１の態様に係るスクリーニング方法のように、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量を測定する際に使用してもよく、上述した第２の態様に係るスクリーニング方法のように、レポーターアッセイによりレポーター遺伝子の発現量を測定する際に使用してもよい。以下、それぞれの態様について説明する。
　第１の態様に係るスクリーニング用キットは、下記（ａ）～（ｃ）から選択される少なくとも１つを含む。
（ａ）Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子のそれぞれを増幅するためのプライマー。
（ｂ）Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子のそれぞれを検出するためのプローブ。
（ｃ）Ｐｇｃ－１αタンパク質及びＭｉｐｅｐタンパク質のそれぞれに対する抗体。
　上記（ａ）におけるプライマーは、対象遺伝子（Ｐｇｃ－１α又はＭｉｐｅｐ）の各塩基配列に基づき設計し、合成及び精製の各工程を経て調製することができる。プライマーの長さ（塩基数）は特に制限されないが、特異的なアニーリングを可能とするため、１５～４０塩基程度とすることが好ましい。
　上記（ｂ）におけるプローブとしては、対象遺伝子（Ｐｇｃ－１α又はＭｉｐｅｐ）の各塩基配列の連続する部分配列からなるポリヌクレオチド、又は対象遺伝子の各塩基配列に対する相補配列の連続する部分配列からなるポリヌクレオチドが用いられる。プローブの長さ（塩基数）は特に制限されないが、特異的なハイブリッド形成を可能とするため、１５塩基以上とすることが好ましい。これらのプローブは、標識物質を用いて適宜標識することができる。標識物質としては、蛍光色素、放射性同位体、酵素、アビジン、ビオチン等を用いることができる。
　プローブは、マイクロアレイ等の固相担体に固定化して用いてもよい。マイクロアレイの作製方法は特に制限されず、例えば、固相担体表面で直接プローブを合成する方法（オン・チップ法）や、予め調製したプローブを固相担体表面に結合する方法等を採用することができる。
　上記（ｃ）における抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれであってもよく、抗体の活性フラグメントであってもよい。活性フラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ等が挙げられる。これらの抗体は、標識物質を用いて適宜標識することができる。標識物質としては、酵素、放射性同位体、蛍光色素等を用いることができる。
　一方、第２の態様に係るスクリーニング用キットは、下記（ｄ）及び（ｅ）から選択される少なくとも１つを含む。
（ｄ）Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターと、該プロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子とを有する第１のベクター、及びＭｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターと、該プロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子とを有する第２のベクター。
（ｅ）Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子を有する第１の形質転換体、及びＭｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子を有する第２の形質転換体。
　上記（ｄ）における第１のレポーター遺伝子及び第２のレポーター遺伝子については上述したとおりであるため、詳細な説明を省略する。第１のベクター及び第２のベクターは、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー等を適宜有していてもよい。選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　第１のベクター及び第２のベクターは、別個のベクターに限定されるものではなく、単一のベクターであってもよい。例えば、第１のベクター及び第２のベクターは、Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターと、該プロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子と、Ｍｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターと、該プロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子とを有する単一のベクターであってもよい。
　上記（ｅ）における第１の形質転換体及び第２の形質転換体は、別個の形質転換体に限定されるものではなく、単一の形質転換体であってもよい。例えば、Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターと、該プロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子と、Ｍｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターと、該プロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子とを有するベクターを宿主細胞に導入することによって、単一の形質転換体を得ることができる。
　以下、本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、有意差検定は、試験例１、２ではスチューデントのｔ検定により行い、試験例４～６ではテューキーのｔ検定により行った（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
＜試験例１＞
（モデルマウスの作製及び白色脂肪組織の採取）
　米国のジャクソン研究所より購入したＳｒｅｂｐ－１ｃ＋／－（Ｂ６；１２９Ｓ６－Ｓｒｅｂｆ１ｔｍ１Ｍｂｒ）マウス（Ｇ．Ｌｉａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７，ｐｐ．９５２０－９５２８）から、交配によりＳｒｅｂｐ－１ｃ＋／＋マウス（以下、「ＷＴマウス」ともいう。）及びＳｒｅｂｐ－１ｃ－／－マウス（以下、「ＫＯマウス」ともいう。）を作製した。東京理科大学薬学部動物実験施設内のＳＰＦ環境下、明暗サイクル１２時間で飼育し、自由摂食群（ＡＬ群）には飼料としてＣＲＦ－１（オリエンタル酵母工業（株））を十分量与えた。ＡＬ群の摂食量を測定し、摂取カロリー制限群（ＣＲ群）にはその７０％量を消灯前に与えた。３ヶ月齢より摂取カロリー制限（ＣＲ）を開始し、ＷＴ－ＡＬ群、ＷＴ－ＣＲ群、ＫＯ－ＡＬ群、及びＫＯ－ＣＲ群の計４群を作製した。８．５ヶ月齢から１０ヶ月齢において体重を測定後、イソフルランによる過麻酔で安楽死させた。安楽死後、精巣周囲の白色脂肪組織を採取し、臓器は液体窒素による急速凍結後、－８０℃で保存した。
（Ｍｉｐｅｐ及びＰｇｃ－１αのｍＲＮＡ発現量の解析）
　－８０℃で凍結保存していた白色脂肪組織からＩＳＯＧＥＮ　ＩＩ（（株）ニッポンジーン）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ（タカラバイオ（株））を用いて全ＲＮＡの逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。その後、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（東洋紡（株））及びＢｌｅｎｄ　Ｔａｑ　Ｐｌｕｓ（東洋紡（株））を用いたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより目的遺伝子（Ｍｉｐｅｐ又はＰｇｃ－１α）を増幅させた。ＰＣＲ産物は２．４％アガロースゲル電気泳動により分離し、０．０１％エチジウムブロマイド溶液で１５分間処理した後に、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ３０００（富士フイルム（株））を用いて特異的バンドを可視化した。なお、各ｍＲＮＡ発現量は、Ｔｂｐ（ＴＡＴＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）のｍＲＮＡ発現量により補正した。使用したプライマーを下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＷＴ－ＡＬ群、ＷＴ－ＣＲ群、ＫＯ－ＡＬ群、及びＫＯ－ＣＲ群の白色脂肪組織におけるＭｉｐｅｐ及びＰｇｃ－１αのｍＲＮＡ発現量を図１Ａ、図１Ｂに示す（ｎ＝３～５）。図１Ａ、図１Ｂに示すとおり、野生型（ＷＴ）マウスにおいては、摂取カロリー制限（ＣＲ）によって、Ｍｉｐｅｐ及びＰｇｃ－１αのｍＲＮＡ発現量が有意に増加した。一方、Ｓｒｅｂｐ－１ｃノックアウト（ＫＯ）マウスにおいては、摂取カロリー制限（ＣＲ）によっても、Ｍｉｐｅｐ及びＰｇｃ－１αのｍＲＮＡ発現量は増加しなかった。この結果から、摂取カロリー制限（ＣＲ）によるＭｉｐｅｐ遺伝子及びＰｇｃ－１α遺伝子の発現亢進は、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ依存的であることが示唆された。
＜試験例２＞
（Ｐｇｃ－１α遺伝子をノックアウトしたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）の作製）
　米国のジャクソン研究所より購入したＰｇｃ－１α＋／ｆｌｏｘ（Ｂ６Ｎ；１２９（ＦＶＢ）－ＰＰＡＲＧＣ１ａｔｍ２．１Ｂｒａｐ）マウス（Ｊ．Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００４，１１９，ｐｐ．１２１－１３５）とＣＡＧ－ＣＲＥマウスとの交配によりＰｇｃ－１α＋／－マウスを得た。Ｐｇｃ－１α＋／－マウス同士を交配させ、妊娠後１３．５日～１５．５日のマウスの子宮から胎児を取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、頭、尾、手足、臓器を取り除き、０．０５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを含有するＰＢＳを用いて３７℃で１０分間消化した。その後、７０μｍセルストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で余分な細胞を除くことにより、Ｐｇｃ－１α遺伝子をノックアウトしたＭＥＦ細胞を作製した。
（野生型のＭＥＦ細胞及びＰｇｃ－１α遺伝子をノックアウトしたＭＥＦ細胞におけるＰｇｃ－１α、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ、及びＭｉｐｅｐのｍＲＮＡ発現量の解析）
　野生型のＭＥＦ細胞及びＰｇｃ－１α遺伝子をノックアウトしたＭＥＦ細胞から全ＲＮＡを抽出し、試験例１と同様にして、Ｐｇｃ－１α、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ、及びＭｉｐｅｐ遺伝子のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより確認した。なお、各ｍＲＮＡ発現量は、Ｒｐｓ１８（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ１８）のｍＲＮＡ発現量により補正した。Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の増幅に使用したプライマーは上記表１のとおりである。Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子及びＲｐｓ１８遺伝子の増幅に使用したプライマーを下記表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　野生型のＭＥＦ細胞及びＰｇｃ－１α遺伝子をノックアウトしたＭＥＦ細胞におけるＰｇｃ－１α、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ、及びＭｉｐｅｐのｍＲＮＡ発現量を図２に示す。図２に示すとおり、野生型のＭＥＦ細胞とＰｇｃ－１α遺伝子をノックアウトしたＭＥＦ細胞とで、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ及びＭｉｐｅｐのｍＲＮＡ発現量に差は認められなかった。この結果及び試験例１の結果から、摂取カロリー制限（ＣＲ）によるＭｉｐｅｐ遺伝子及びＰｇｃ－１α遺伝子の発現亢進は、互いに非依存的であることが示唆された。
＜試験例３＞
（Ｍｉｐｅｐ過剰発現用ベクター及びＰｇｃ－１α過剰発現用ベクターの作製）
　マウス白色脂肪組織のｃＤＮＡを鋳型とし、下記表３に示すプライマー及びＰｒｉｍｅ　ｓｔａｒ（東洋紡（株））を用いたＰＣＲによりＭｉｐｅｐのｃＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲ　Ｉ及びＸｈｏ　Ｉで切断し、ＥｃｏＲ　Ｉ及びＸｈｏ　Ｉで切断済みのｐＭＸｓ－ＡＭＮＮ－Ｐｕｒｏベクターとライゲーションすることにより、ｐＭＸｓ－Ｍｉｐｅｐ－Ｐｕｒｏベクターを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、Ａｄｄｇｅｎｅより購入したｐｃＤＮＡ－ｆ：Ｐｇｃ－１ベクターをＥｃｏＲ　Ｖ及びＰｍｅ　Ｉで切断した。得られたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲ　Ｉ処理後にＫｌｅｎｏｗ処理により平滑化し、ＣＩＰ処理により脱リン酸化したｐＭＸｓ－Ｎｅｏベクターとライゲーションすることにより、ｐＭＸｓ－Ｐｇｃ－１α－Ｎｅｏベクターを作製した。
（Ｍｉｐｅｐ過剰発現用ベクター及びＰｇｃ－１α過剰発現用ベクターのマウス白色脂肪前駆細胞株３Ｔ３－Ｌ１へのトランスフェクション）
　１４．５μｇ／ｍＬのベクター（ｐＭＸｓ－Ｍｉｐｅｐ－Ｐｕｒｏベクター又はｐＭＸｓ－Ｐｇｃ－１α－Ｎｅｏベクター）を含む０．２５Ｍ　ＣａＣｌ２溶液と、１．５ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４を含む２×ＨＢＳ（２８０ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１）とを等量で少しずつ混合し、その後すぐにボルテックスミキサーで１５秒間撹拌し、続いて室温で１５～３０分間放置した。得られた反応液でレトロウイルスパッケージング細胞Ｐｌａｔ－Ｅを処理することにより、Ｐｌａｔ－Ｅ細胞にベクターを導入した。
　次いで、ｐＭＸｓ－Ｍｉｐｅｐ－Ｐｕｒｏベクターを導入したＰｌａｔ－Ｅ細胞を１６時間培養した後、新しい培地に交換し、さらに２日間培養した後、培地を回収した。回収した培地をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて濾過した後、回収した培地の１／３量の４×ＰＥＧ（３２％　ＰＥＧ６０００、０．４Ｍ　ＮａＣｌ、４０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を加えた。その後、３０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清を除去した後、さらに３０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清をできるだけ除去した後、沈殿物にＯＰＴＩ－ＭＥＭ（ライフテクノロジーズジャパン（株））を加えて懸濁した。得られた懸濁液を３Ｔ３－Ｌ１細胞の培地に加え、レトロウイルスを感染させることにより、ｐＭＸｓ－Ｍｉｐｅｐ－Ｐｕｒｏベクターを３Ｔ３－Ｌ１細胞に導入した。なお、培地をフィルター濾過する工程からは全て氷上にて行った。感染の２４時間後から２μｇ／ｍＬ　ピューロマイシンを含む培地で５～７日間セレクションを行うことにより、Ｍｉｐｅｐ遺伝子を過剰発現する３Ｔ３－Ｌ１細胞（以下、「Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株」ともいう。）を作製した。
　次いで、ｐＭＸｓ－Ｐｇｃ－１α－Ｎｅｏベクターを導入したＰｌａｔ－Ｅ細胞を１６時間培養した後、新しい培地に交換し、さらに２日間培養した後、培地を回収した。回収した培地をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて濾過した後、回収した培地の１／３量の４×ＰＥＧ（３２％　ＰＥＧ６０００、０．４Ｍ　ＮａＣｌ、４０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を加えた。その後、３０００ｒｐｍで３０分間遠心し、上清を除去した後、さらに３０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清をできるだけ除去した後、沈殿物にＯＰＴＩ－ＭＥＭ（ライフテクノロジーズジャパン（株））を加えて懸濁した。得られた懸濁液をＭｉｐｅｐ　ＯＥ株の培地に加え、レトロウイルスを感染させることにより、ｐＭＸｓ－Ｐｇｃ－１α－ＮｅｏベクターをＭｉｐｅｐ　ＯＥ株に導入した。なお、培地をフィルター濾過する工程からは全て氷上にて行った。感染の２４時間後から１ｍｇ／ｍＬ　Ｇ４１８（Ｃａｙｍａｎ）及び０．４μｇ／ｍＬ　ピューロマイシンを含む培地で５～７日間セレクションを行うことにより、Ｍｉｐｅｐ遺伝子及びＰｇｃ－１α遺伝子の両者を過剰発現する３Ｔ３－Ｌ１細胞（以下、「ＤＯＥ株」ともいう。）を作製した。セレクション後は、２００μｇ／ｍＬ　Ｇ４１８（Ｃａｙｍａｎ）及び０．４μｇ／ｍＬ　ピューロマイシンを含む培地で培養、維持した。
　また、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株及びＤＯＥ株の他に、Ｐｇｃ－１α遺伝子を過剰発現する３Ｔ３－Ｌ１細胞（以下、「Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株」ともいう。）、及び空ベクターを導入した３Ｔ３－Ｌ１細胞（以下、「Ｍｏｃｋ細胞」ともいう。）を作製した。
（ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞の成熟白色脂肪細胞への分化誘導）
　３Ｔ３－Ｌ１細胞（ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞）を１．５×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で播種し、２日後に１００％コンフルエントに達した時点を０日目とした。０日目から２日間は５００μＭ　３－イソブチル－１－メチルキサンチン及び１μＭ　デキサメタゾンを含む維持培地で培養することにより脂肪細胞へと誘導し、その後は２日おきに１０μｇ／ｍＬ　インスリン及び５０ｎＭ　トリヨードサイロニンを含む維持培地で培養することにより成熟脂肪細胞へと誘導した。以降の実験では、分化誘導開始後１２日目の細胞を使用した。
＜試験例４＞
（ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＰｇｃ－１α及びＭｉｐｅｐのタンパク質発現量の解析）
　分化誘導開始後１２日目の細胞（ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞）から、ＳＤＳサンプルバッファー（５０ｍＭ　ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％　ＳＤＳ、３Ｍ　尿素、６％　グリセロール）を用いてタンパク質を抽出した後、ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）によりタンパク質濃度を測定した。タンパク質濃度が１μｇ／μＬになるように調節し、０．５％　ＢＰＢ及び１００％　２－メルカプトエタノールの等量混合溶液をタンパク質溶液の１／１０量加えた後、９５℃で５分間インキュベートしてサンプルを調製した。調製したサンプルは、８％又は１０％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンをブロッキング溶液（２．５％　スキムミルク及び０．２５％　ＢＳＡをＴＴＢＳで溶解）中で１時間、室温でインキュベートした。その後、一次抗体反応液（Ｉｍｍｕｎｏ　ｓｈｏｔ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｉ（コスモ・バイオ（株））：ブロッキング溶液＝２：１）中で一晩、４℃で反応させた。反応後、メンブレンを十分量のＴＴＢＳで５分×２回、１０分×２回洗浄し、二次抗体反応液（Ｉｍｍｕｎｏ　ｓｈｏｔ　ｒｅａｇｅｎｔ　ＩＩ（コスモ・バイオ（株））：ブロッキング溶液＝２：１）中で１時間、室温で反応させた。反応後、再びＴＴＢＳでメンブレンを洗浄し、ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ　ＬＤ（富士フイルム和光純薬（株））を用いた発光をＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＭＰ（Ｂｉｏ－ｒａｄ）にて検出した。検出したタンパク質量は、ＣＢＢ染色の結果により補正した。
　なお、Ｐｇｃ－１αタンパク質の検出には、一次抗体としてマウス抗ＰＧＣ－１αモノクローナル抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。また、Ｍｉｐｅｐタンパク質の検出には、一次抗体としてウサギ抗ＭＩＰＥＰポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ）を使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。
　ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＰｇｃ－１α及びＭｉｐｅｐのタンパク質発現量を図３Ａ、図３Ｂに示す（ｎ＝４）。図３Ａ、図３Ｂに示すとおり、ＤＯＥ株においては、Ｐｇｃ－１αタンパク質及びＭｉｐｅｐタンパク質の過剰発現が確認された。
（ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＣｏｘ４、Ｍｄｈ２、及びＳｉｒｔ３のタンパク質発現量の解析）
　上記と同様にして、ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＣｏｘ４、Ｍｄｈ２、及びＳｉｒｔ３のタンパク質発現量を、ウェスタンブロットにより解析した。Ｃｏｘ４タンパク質、Ｍｄｈ２タンパク質、及びＳｉｒｔ３タンパク質はいずれも、Ｍｉｐｅｐタンパク質の基質である。
　なお、Ｃｏｘ４タンパク質の検出には、一次抗体としてウサギ抗ＣＯＸ４ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用し、Ｍｄｈ２タンパク質の検出には、一次抗体としてウサギ抗ＭＤＨ２ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用し、Ｓｉｒｔ３タンパク質の検出には、一次抗体としてウサギ抗ＳＩＲＴ３ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用した。いずれも二次抗体としてはＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。
　ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＣｏｘ４、Ｍｄｈ２、及びＳｉｒｔ３のタンパク質発現量を図４Ａ～図４Ｃに示す（ｎ＝４）。図４Ａ～図４Ｃに示すとおり、Ｓｉｒｔ３のタンパク質発現量はＰｇｃ－１α遺伝子の過剰発現に相関して有意に増加したが、Ｃｏｘ４及びＭｄｈ２のタンパク質発現量はいずれの細胞株においても殆ど変化していなかった。
（ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＴｆａｍ及びＴｏｍ２０のタンパク質発現量の解析）
　上記と同様にして、ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＴｆａｍ及びＴｏｍ２０のタンパク質発現量を、ウェスタンブロットにより解析した。Ｔｆａｍタンパク質はミトコンドリアＤＮＡの転写因子であり、Ｔｏｍ２０タンパク質はミトコンドリアの外膜に存在するタンパク質である。
　なお、Ｔｆａｍタンパク質の検出には、一次抗体としてウサギ抗ＴＦＡＭポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈ）を使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。また、Ｔｏｍ２０タンパク質の検出には、一次抗体としてマウス抗ＴＯＭ２０モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。
　ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＴｆａｍ及びＴｏｍ２０のタンパク質発現量を図５Ａ、図５Ｂに示す（ｎ＝４）。図５Ａ、図５Ｂに示すとおり、Ｔｆａｍのタンパク質発現量はＰｇｃ－１α遺伝子の過剰発現に相関して増加傾向を示したが、Ｔｏｍ２０のタンパク質発現量はいずれの細胞株においても殆ど変化していなかった。
＜試験例５＞
（ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＣＳ（ｃｉｔｒａｔｅ　ｓｙｎｔａｓｅ）活性の解析）
　分化誘導開始後１２日目の細胞（ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞）から、２００μＬのホモゲナイゼーションバッファー（５０ｍＭ　ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％　ホスファターゼ阻害剤カクテル、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％　プロテアーゼ阻害剤カクテル、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、０．０５％　デオキシコール酸ナトリウム）を用いてタンパク質を抽出した。抽出後のサンプル溶液は、ホモゲナイゼーションバッファーを加えて１／１６倍に希釈し、測定に用いた。
　１８０μＬの反応液（０．１ｍＭ　５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）、０．５ｍＭ　アセチルＣｏＡ、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に１０μＬのサンプル溶液を加え、２５℃で５分間インキュベートした。吸光度のベースラインを安定させた後、１０ｍＭ　オキサロ酢酸を１０μＬ加え、３０℃で波長４１２ｎｍにおける吸光度測定を行った。時間を横軸とし、各時間の吸光度からブランクを引いた値の自然対数を縦軸としたグラフの直線部分の傾きから速度定数ｋを求め、その速度定数ｋをタンパク質量で割った値をＣＳ活性とした。
　ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＣＳ活性を図６に示す。図６に示すとおり、Ｐｇｃ－１α遺伝子の過剰発現に相関してＣＳ活性は増加傾向を示した。
＜試験例６＞
（ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞における脂肪滴蓄積の解析）
　９０ｍｇのＯｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ（Ｓｉｇｍａ）を３０ｍＬの１００％　イソプロパノールに溶解した。この溶液を超純水で６０％に希釈した後、Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて濾過し、Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ染色液とした。分化誘導開始後１２日目の細胞（ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞）をＰＢＳで洗浄した後、１０％　ホルマリンを含むＰＢＳを用いて１０分間固定した。超純水で洗浄し、６０％　イソプロパノールで１分間処理した後、Ｏｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ染色液で２０分間染色した。超純水で３回洗浄し、撮影用のサンプルとした。さらに、超純水を除去して完全に乾燥させた後、１００％　イソプロパノール中で１時間振盪し、脂肪滴を染色したＯｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏを全て抽出した。抽出溶液を適宜希釈した後、波長４９０ｎｍの吸光度を測定し、脂肪滴量の指標とした。
　ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞をＯｉｌ　Ｒｅｄ　Ｏ染色液で染色したときの顕微鏡像を図７Ａに示し、脂肪滴蓄積量の測定結果を図７Ｂに示す（ｎ＝３）。図７Ａ、図７Ｂに示すとおり、Ｍｏｃｋ細胞と比較して、ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、及びＭｉｐｅｐ　ＯＥ株の全てで脂肪滴蓄積量が有意に減少し、特にＤＯＥ株における減少が顕著であった。ＤＯＥ株は、ミトコンドリア関連タンパク質の発現量（図４Ａ～図４Ｃ、図５Ａ、図５Ｂ）やＣＳ活性（図６）がＰｇｃ－１α　ＯＥ株と同程度であったにも関わらず、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株に比べて脂肪滴蓄積量が有意に減少していた。この結果から、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の両者の発現を亢進させる物質が抗肥満物質になり得ることが示唆された。
＜試験例７＞
（ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞の分化の確認）
　分化誘導開始後１２日目の細胞（ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞）から全ＲＮＡを抽出し、試験例１と同様にして、Ｐｇｃ－１α、Ｍｉｐｅｐ、Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ、Ｐｐａｒγ、及びＡｄｉｐｏｑのｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより確認した。なお、各ｍＲＮＡ発現量は、Ｒｐｓ１８のｍＲＮＡ発現量により補正した。Ｐｇｃ－１α遺伝子、Ｍｉｐｅｐ遺伝子、及びＲｐｓ１８遺伝子の増幅に使用したプライマーは上記表１及び表２のとおりである。Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ遺伝子、Ｐｐａｒγ遺伝子、及びＡｄｉｐｏｑ遺伝子の増幅に使用したプライマーを下記表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＰｇｃ－１α、Ｍｉｐｅｐ、Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ、Ｐｐａｒγ、及びＡｄｉｐｏｑのｍＲＮＡ発現量を図８に示す。図８に示すとおり、Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ、Ｐｐａｒγ、及びＡｄｉｐｏｑのｍＲＮＡ発現量はいずれの細胞株においても殆ど変化していなかった。この結果及び試験例６の結果から、ＤＯＥ株における脂肪滴蓄積量の減少は、分化シグナルの低下によるものではなく、Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の過剰発現によるものであることが示唆された。
＜試験例８＞
（ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＰｅｒｉｌｉｐｉｎのタンパク質発現量の解析）
　試験例４と同様にして、ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＰｅｒｉｌｉｐｉｎのタンパク質発現量を、ウェスタンブロットにより解析した。Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎタンパク質は脂肪滴表面に存在するタンパク質である。コントロールとして、Ｌａｍｉｎ　Ｂ１のタンパク質発現量も解析した。
　なお、Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎタンパク質の検出には、一次抗体としてウサギ抗Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用し、Ｌａｍｉｎ　Ｂ１タンパク質の検出には、一次抗体としてウサギ抗Ｌａｍｉｎ　Ｂ１ポリクローナル抗体（Ｍｅｄｉｃａｌ　＆　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。いずれも、二次抗体としてはＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。
　ＤＯＥ株、Ｐｇｃ－１α　ＯＥ株、Ｍｉｐｅｐ　ＯＥ株、及びＭｏｃｋ細胞におけるＰｅｒｉｌｉｐｉｎのタンパク質発現量を図９に示す。図９に示すとおり、ＤＯＥ株においては、Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎのタンパク質発現量が顕著に減少していた。

Claims (7)

  1. 　Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現を亢進させる物質を選択することを含む抗肥満物質のスクリーニング方法。
  2. 　Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子を発現する細胞に被験物質を接触させる工程と、
    　前記被験物質を接触させない場合に比べて、前記細胞におけるＰｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が増加する場合に、該被験物質を抗肥満物質として選択する工程と、
    を含む請求項１に記載の抗肥満物質のスクリーニング方法。
  3. 　前記細胞として、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有する細胞とＳｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有しない細胞とを使用し、
    　前記被験物質を接触させることにより、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有する細胞においてのみＰｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が増加する場合に、該被験物質を抗肥満物質として選択する請求項２に記載の抗肥満物質のスクリーニング方法。
  4. 　Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子を有する第１の形質転換体、及びＭｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子を有する第２の形質転換体に、被験物質を接触させる工程と、
    　前記被験物質を接触させない場合に比べて、前記第１のレポーター遺伝子及び前記第２のレポーター遺伝子の発現量が増加する場合に、該被験物質を抗肥満物質として選択する工程と、
    を含む請求項１に記載の抗肥満物質のスクリーニング方法。
  5. 　前記第１の形質転換体及び前記第２の形質転換体のそれぞれとして、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有する形質転換体とＳｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有しない形質転換体とを使用し、
    　前記被験物質を接触させることにより、Ｓｒｅｂｐ－１ｃ遺伝子を有する形質転換体においてのみ前記第１のレポーター遺伝子及び前記第２のレポーター遺伝子の発現量が増加する場合に、該被験物質を抗肥満物質として選択する請求項４に記載の抗肥満物質のスクリーニング方法。
  6. 　下記（ａ）～（ｃ）から選択される少なくとも１つを含む抗肥満物質のスクリーニング用キット：
    （ａ）Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子のそれぞれを増幅するためのプライマー、
    （ｂ）Ｐｇｃ－１α遺伝子及びＭｉｐｅｐ遺伝子のそれぞれを検出するためのプローブ、
    （ｃ）Ｐｇｃ－１αタンパク質及びＭｉｐｅｐタンパク質のそれぞれに対する抗体。
  7. 　下記（ｄ）及び（ｅ）から選択される少なくとも１つを含む抗肥満物質のスクリーニング用キット：
    （ｄ）Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターと、該プロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子とを有する第１のベクター、及びＭｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターと、該プロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子とを有する第２のベクター、
    （ｅ）Ｐｇｃ－１α遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第１のレポーター遺伝子を有する第１の形質転換体、及びＭｉｐｅｐ遺伝子のプロモーターの下流に機能的に連結された第２のレポーター遺伝子を有する第２の形質転換体。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011036223A (ja) * 2009-08-18 2011-02-24 Nagasaki Univ カロリー制限模倣物のスクリーニング方法
WO2017052340A1 (ko) * 2015-09-25 2017-03-30 고려대학교 산학협력단 운동유사효과 유도용 약학 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011036223A (ja) * 2009-08-18 2011-02-24 Nagasaki Univ カロリー制限模倣物のスクリーニング方法
WO2017052340A1 (ko) * 2015-09-25 2017-03-30 고려대학교 산학협력단 운동유사효과 유도용 약학 조성물

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDERSON, R. M. ET AL.: "Dynamic regulation of PGC-1 a localization and turnover implicates mitochondrial adaptation in calorie restriction and the stress response", AGING CELL, vol. 7, 2008, pages 101 - 111, XP055675620 *
FUJII, N. ET AL.: "Sterol regulatory element- binding protein-lc orchestrates metabolic remodeling of white adipose tissue by caloric restriction", AGING CELL, vol. 16, 2017, pages 508 - 517, XP055675618 *
HIGAMI, YOSHIKAZU: "Comprehensive mitochondrial quality control and its collapse in metabolic diseases", GRANTS-ON-AID FOR SCIENTIFIC RESEARCH, FINAL RESEARCH REPORTON GRANTS-IN-AID FOR SCIENTIFIC RESEARCH, 6 June 2016 (2016-06-06), pages 1 - 4, Retrieved from the Internet <URL:http://kaken.nii.ac.jp/ja/file/KAKENHI-PROJECT-26670193/26670193seika.pdf> [retrieved on 20190926] *
KOBAYASHI, M. ET AL.: "Mitochondrial intermediate peptidase is a novel regulator of sirtuin-3 activation by caloric restriction", FEBS LETTERS, vol. 591, 28 November 2017 (2017-11-28), pages 4067 - 4073, XP055675616 *
MARTIN-MONTALVO, ALEJANDRO ET AL.: "Mitochondrial Metabolic Reprogramming Induced by Calorie Restriction", ANTIOXIDANTS & REDOX SIGNALING, vol. 19, no. 3, 2013, pages 310 - 320, XP055675624 *

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