WO2020001350A1 - Egfr抑制剂及其制备和应用 - Google Patents

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WO2020001350A1
WO2020001350A1 PCT/CN2019/091970 CN2019091970W WO2020001350A1 WO 2020001350 A1 WO2020001350 A1 WO 2020001350A1 CN 2019091970 W CN2019091970 W CN 2019091970W WO 2020001350 A1 WO2020001350 A1 WO 2020001350A1
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halogen
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cycloalkyl
cancer
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龚彦春
孟磊
郭其润
刘永强
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江苏威凯尔医药科技有限公司
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    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings

Definitions

  • the present application belongs to the technical field of medicine, and particularly relates to a 2-aminopyrimidine derivative and use thereof for preparing an antitumor drug.
  • Epidermal growth factor receptor (EpidermalRowthFactorReceptor, EGFR) is a transmembrane receptor protein with tyrosine kinase activity widely distributed on human tissue cell membranes, and is a member of the erbB receptor family of tyrosine kinases.
  • EGFR ligand epidermal growth factor
  • EGFR forms a homodimer on the cell membrane, or forms a heterodimer with other receptors in the family (such as erbB2, erbB3, or erbB4) to activate and cause Phosphorylation of key tyrosine residues in EGFR cells activates the kinase domain and further activates multiple downstream signaling pathways within the cell.
  • These intracellular signaling pathways play important roles in cell proliferation, survival, and anti-apoptosis.
  • the tyrosine kinase domain of EGFR can be mutated, resulting in the activation of constitutive signals. This active signaling pathway plays a vital role in the growth, survival and migration of tumor cells.
  • the most common activating mutations are an in-frame deletion mutation in exon 19 and a missense mutation in the 858 codon (L858R). Lung cancer with EGFR mutations is highly sensitive to EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) (Science [2004] No. 304, 1497-500).
  • tyrosine kinase inhibitors that target EGFR (such as Gefitinib, erlotinib) and other drugs have achieved great success in the clinical treatment of non-small cell lung cancer (New England Journal of Medicine [2004] No. 350, 2129-39; The Lancet Oncology [2012] No. 13 Volume 3, 239-46).
  • TKI inhibitors often face relapse problems due to the development of resistance.
  • the most common drug resistance mechanism is the second mutation of T790M in EGFR, which is present in about 50% of patients with drug-resistant tumors (PLOS Medicine [2005] No. 2, 1-11).
  • Second-generation EGFR irreversible inhibitors such as Canertinib and Afatinib can overcome drug resistance, but these molecules have poor selectivity for EGFR T790M mutants, and their inhibitory effect on wild-type EGFR is relatively low. Strong, lower tolerated doses in the body.
  • the object of the present invention is to provide a 2-aminopyrimidine EGFR inhibitor, which is highly selective and safer against EGFR mutations.
  • Another object of the present invention is to provide the use of the EGFR inhibitor in the preparation of a medicament for preventing or treating an epidermal growth factor receptor (EGFR) kinase-related disease.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • R 1 is selected from C 1 -C 8 alkyl or C 3 -C 8 cycloalkyl, optionally further selected from one or more selected from halogen, hydroxyl, C 1 -C 8 alkyl, C 1 -C 8 Alkoxy, halogen-substituted C 1 -C 8 alkoxy, C 3 -C 8 cycloalkyl or C 3 -C 8 cycloalkoxy substituted by a substituent;
  • R 2 is selected from hydrogen, deuterium, halogen, cyano, nitro, C 1 -C 8 alkyl, C 1 -C 8 alkoxy, C 3 -C 8 cycloalkyl, C 2 -C 8 alkenyl, C 2 -C 8 alkynyl, trifluoromethyl, difluoromethyl or trifluoromethoxy;
  • R 3 is selected from hydrogen, deuterium, halogen, cyano, nitro, C 1 -C 8 alkyl, C 3 -C 8 cycloalkyl, C 2 -C 8 alkenyl, or C 2 -C 8 alkynyl, any Optionally further substituted with one or more members selected from halogen, C 1 -C 8 alkyl, C 1 -C 8 alkoxy, halogen substituted C 1 -C 8 alkoxy, C 3 -C 8 cycloalkyl, or C 3 -C 8 cycloalkoxy substituted;
  • R 4 is selected from hydrogen, halogen, cyano, nitro, C 1 -C 8 alkyl, halo C 1 -C 8 alkyl, -C (O) R 5 , -C (O) NR 5 R 6 , -OR 5 , -NR 5 R 6 , -NR 5 C (O) R 6 , -NR 7 (CH 2 ) m NR 5 R 6 , -NC (O) R 7 (CH 2 ) m NR 5 R 6 , -NR 7 (CH 2 ) m NR 5 C (O) R 6 , -NR 7 (CH 2 ) m OR 6 , -NC (O) R 7 (CH 2 ) m OR 6 , -O (CH 2 ) m NR 5 R 6 or -O (CH 2 ) m NR 5 C (O) R 6 ;
  • R 5 , R 6 and R 7 are each independently selected from hydrogen, C 1 -C 8 alkyl or C 3 -C 8 cycloalkyl, wherein C 1 -C 8 alkyl, C 3 -C 8 cycloalkyl are optionally Is further substituted with one or more selected from halogen, hydroxy, -NR 8 R 9 , C 1 -C 8 alkyl, C 1 -C 8 alkoxy, halogen substituted C 1 -C 8 alkoxy, C 3 -C 8 cycloalkyl or C 3 -C 8 cycloalkoxy substituents;
  • R 5 , R 6 , and R 7 may independently form a 4-10 membered heterocyclic group
  • n 1, 2, 3, 4;
  • R 8 and R 9 are each independently selected from hydrogen, C 1 -C 8 alkyl or C 3 -C 8 cycloalkyl.
  • R 2 is selected from hydrogen, deuterium, halogen or C 1-4 alkyl
  • R 3 is selected from hydrogen, deuterium, halogen, C 1 -C 8 alkyl or C 3 -C 8 cycloalkyl;
  • R 4 is selected from hydrogen, halogen, cyano, nitro, C 1 -C 8 alkyl, halo C 1 -C 8 alkyl, -NR 5 R 6 or -NR 7 (CH 2 ) m NR 5 R 6 ;
  • R 5 , R 6 and R 7 are each independently selected from hydrogen, C 1 -C 8 alkyl or C 3 -C 8 cycloalkyl;
  • R 5 , R 6 , and R 7 may independently form a 4-10 membered heterocyclic group
  • n 1, 2, 3 or 4.
  • R 2 is selected from hydrogen, deuterium, halogen or methyl
  • R 3 is selected from hydrogen, deuterium, halogen, C 1 -C 8 alkyl or C 3 -C 8 cycloalkyl;
  • R 4 is selected from -NR 5 R 6 or -NR 7 (CH 2 ) m NR 5 R 6 ;
  • R 5 , R 6 and R 7 are each independently selected from hydrogen or C 1 -C 4 alkyl
  • n 1, 2, 3 or 4.
  • the compound of formula (I) is characterized in that:
  • R 1 is selected from methyl, difluoromethyl, trifluoromethyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or trifluoroethyl;
  • R 2 is selected from hydrogen, deuterium, F, Cl, Br or methyl
  • R 3 is selected from hydrogen or deuterium
  • R 4 is -NR 7 (CH 2 ) m NR 5 R 6 ;
  • R 5 , R 6 and R 7 are each independently selected from hydrogen, methyl or ethyl
  • n 1, 2, 3 or 4.
  • a particularly preferred compound of the general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof includes the following:
  • Another aspect of the present invention provides a method for preparing a compound of formula (I), a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, comprising the following steps:
  • the aforementioned compound of formula (I), a stereoisomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or the aforementioned pharmaceutical composition is prepared for treating EGFR mutants, especially L858R EGFR mutants, T790M EGFR Mutants and deletion of exon 19 activate the use of mutants in the treatment of disease-mediated diseases.
  • the cancer is selected from the group consisting of ovarian cancer, cervical cancer, colorectal cancer, breast cancer, pancreatic cancer, glioma, glioblastoma, melanoma, prostate cancer, leukemia, lymphoma, and non-Hodgkin cancer.
  • heterocyclyl refers to a saturated or partially unsaturated monocyclic or polycyclic cyclic hydrocarbon substituent, wherein one or more ring atoms are selected from nitrogen, oxygen, or S (O) r (where r is an integer of 0, Heteroatoms of 1, 2), but excluding the ring part of -OO-, -OS- or -SS-, the remaining ring atoms are carbon.
  • S (O) r where r is an integer of 0, Heteroatoms of 1, 2
  • 4-10 membered heterocyclyl refers to a cyclic group containing 4 to 10 ring atoms.
  • alkenyl refers to an alkyl group as defined above, which is composed of at least two carbon atoms and at least one carbon-carbon double bond
  • C 2 -C 8 alkenyl refers to a straight chain containing 2 to 8 carbons. Or containing branched alkenyl. Examples are vinyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-, 2- or 3-butenyl, and the like.
  • alkynyl refers to an alkyl group as defined above composed of at least two carbon atoms and at least one carbon-carbon triple bond
  • C 2 -C 8 alkynyl refers to a straight-chain or Contains branched alkynyl. For example, ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl, 1-, 2- or 3-butynyl and the like.
  • alkoxy means -O- (alkyl), wherein alkyl is as defined above.
  • C 3 -C 8 alkoxy refers to an alkyloxy group containing 1 to 8 carbons. Non-limiting examples include methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, and the like.
  • cycloalkoxy refers to -O- (unsubstituted cycloalkyl), wherein the definition of cycloalkyl is as described above.
  • C 3 -C 8 cycloalkoxy refers to a cycloalkyloxy group containing 3-8 carbons. Non-limiting examples include cyclopropoxy, cyclobutoxy, cyclopentyloxy, cyclohexyloxy Wait.
  • “Pharmaceutical composition” means a mixture containing one or more of the compounds described herein or a physiologically pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof with other chemical components, as well as other components such as physiologically pharmaceutically acceptable carriers and excipients. ⁇ ⁇ Shape agent.
  • the purpose of the pharmaceutical composition is to promote the administration to the organism, which is beneficial to the absorption of the active ingredient and then exerts the biological activity.
  • Step 4 Synthesis of N- (6-bromo-2-methoxy-5-nitro-pyridin-3-yl) acetamide
  • N- (6-bromo-2-methoxy-5-nitro-pyridin-3-yl) acetamide (5.60 g, 19.30 mmol), N, N, N ' -Trimethylethylenediamine (2.96g, 28.96mmol), acetonitrile (168ml), warmed to 80 ° C, and the reaction was terminated in 1h.
  • the solvent was distilled off under reduced pressure at 50 ° C, EA (70 ml) was slurried, suction filtered, washed with EA (20 ml), and the filter cake was dried to obtain 5.40 g of a yellow powder with a yield of 72%.
  • Step 6 N 2 - (2- (dimethylamino) ethyl) -6-methoxy-2 -N - Synthesis of methyl 3-nitropyridine-2,5-diamine
  • Step 7 Synthesis of 2-chloro-5-fluoro-N- (naphthalene-2-yl) pyrimidin-4-amine
  • Step 8 N 2- (6-((2- (dimethylamino) ethyl) (methyl) amino) -2-methoxy-5-nitropyridin-3-yl) -5-fluoro- N 4- (naphthalene-2-yl) pyrimidine-2,4-diamine)
  • Step 9 N 2 - (2- (dimethylamino) ethyl) -N 5 - (5- fluoro-4- (naphthalen-2-ylamino) pyrimidin-2-yl) -6-methoxy - Synthesis of N 2 -methylpyridine-2,3,5-triamine
  • N 2- (6-((2- (dimethylamino) ethyl) (methyl) amino) -2-methoxy-5-nitropyridine-3- Group) -5-fluoro-N 4- (naphthalene-2-yl) pyrimidine-2,4-diamine) (1.42 g, 28.03 mmol), iron powder (0.78 g, 140.16 mmol), ammonium chloride (0.75 g , 140.16 mmol), ethanol (28 ml), water (14 ml), nitrogen protection, warmed to 75 ° C, the reaction was terminated in 2 h. The reaction solution was filtered by adding celite, and the filtrate was concentrated. Crude column chromatography gave 0.65 g of a yellow solid with a yield of 48.7%.
  • Step 10 N- (2-((2- (dimethylamino) ethyl) (methyl) amino) -5-((5-fluoro-4- (naphth-2-ylamino) pyrimidine-2- Of Amino) amino) -6-methoxypyridin-3-yl) acrylamide
  • N- (2-((2- (dimethylamino) ethyl) (methyl) amino) -5-((5-fluoro-4- (naphth-2-ylamino) pyrimidin-2-yl) amino ) -6- (2,2,2-trifluoroethoxy) pyridin-3-yl) acrylamide is prepared in a similar manner to Example 1.
  • N- (2-((2- (dimethylamino) ethyl) (methyl) amino) -5-((5-fluoro-4- (naphth-2-ylamino) pyrimidin-2-yl) amino ) -6-isopropylpyridin-3-yl) acrylamide is prepared in a similar manner to Example 1.
  • N- (5-((5-chloro-4- (naphthalen-2-ylamino) pyrimidin-2-yl) amino) -2-((2- (dimethylamino) ethyl) (methyl) amino ) -6-methoxypyridine-3-yl) acrylamide is prepared in a similar manner to Example 1.
  • N- (5-((5-chloro-4- (naphthalen-2-ylamino) pyrimidin-2-yl) amino) -2-((2- (dimethylamino) ethyl) (methyl) amino ) -6- (2,2,2-trifluoroethoxy) pyridin-3-yl) acrylamide is prepared in a similar manner to Example 1.
  • N- (5-((5-chloro-4- (naphthalen-2-ylamino) pyrimidin-2-yl) amino) -2-((2- (dimethylamino) ethyl) (methyl) amino ) -6-isopropylpyridin-3-yl) acrylamide is prepared in a similar manner to Example 1.
  • the compound was dissolved to a specific concentration with 100% DMSO, and then it was gradient diluted to a different concentration of the test sample (DMSO solution) using an automatic sampling device.
  • the reaction solution was subjected to ion exchange filtration system to remove unreacted ATP and ADP plasma generated by the reaction, and then measured the 33 P isotope radiation in the substrate.
  • the inhibitory effect of different concentrations of compounds on kinase activity was calculated based on the amount of kinase added to the inhibitor system at different concentrations, and the IC 50 was inhibited by graphpad prism fitting.
  • the compound of the present invention has better EGFR (L858R / T790M) mutant kinase inhibitory activity.
  • Some compounds have significant IGF1R kinase selective advantages compared to the compound 41 of Example WOCC082713 (CCB120067) and can prevent Off-target has side effects of elevated blood sugar.
  • Hcc827 cell line was cultured under the condition of RPMI-1640 + 10% FBS.
  • a 96-well cell culture plate was inoculated with 100 ⁇ L of a suspension of Hcc827 cells in logarithmic growth phase with a density of 5 ⁇ 10 4 / ml.
  • the culture plate was cultured in an incubator for 24 hours to attach the cells (37 ° C, 5% CO 2 ).
  • Each compound has been dissolved in DMSO to prepare a 10 mM stock solution, which is diluted 400 times the target concentration with DMSO and diluted to 2 times the target concentration with serum-free medium to maintain the DMSO concentration in the drug solution at 0.5. %.
  • DMSO fetal sulfate
  • 100 ⁇ L / well of each concentration of drug solution was sequentially added. Three replicates were set for each concentration, and a blank control and a negative control were set. The culture was continued at 37 ° C and 5% CO 2 for 72 hours.
  • the MTT method was used to test the cell activity of the compound on NCI-H1975, and the IC 50 value of the half-inhibition concentration of the compound to inhibit cell proliferation activity was obtained.
  • NCI-H1975 cell line was cultured under the condition of RPMI-1640 + 10% FBS, and 100 ⁇ L of NCI-H1975 cell suspension in logarithmic growth phase was inoculated in a 96-well cell culture plate with a density of 5X 10 4 / ml, the culture plate was cultured in an incubator for 24 hours to make the cells adhere (37 ° C, 5% CO 2 ).
  • MTT method used in this experiment action of test compounds active in A431 cells and derived compounds inhibit cell proliferation half maximal inhibitory concentration IC 50 activity.
  • A431 cell line was cultured under the conditions of DMEM + 10% FBS.
  • a 96-well cell culture plate was inoculated with 100 ⁇ L of A431 cell suspension in logarithmic growth phase, with a density of 5 ⁇ 10 4 / ml. The plate was cultured in an incubator for 24 hours to make the cells adhere (37 ° C, 5% CO 2 ). .
  • Each compound has been dissolved in DMSO to prepare a 10 mM stock solution, which is diluted 400 times the target concentration with DMSO and diluted to 2 times the target concentration with serum-free medium to maintain the DMSO concentration in the drug solution at 0.5. %.
  • DMSO fetal sulfate
  • 100 ⁇ L / well of each concentration of drug solution was sequentially added. Three replicates were set for each concentration, and a blank control and a negative control were set. The culture was continued at 37 ° C and 5% CO 2 for 72 hours.
  • the compound-positive drugs of the present invention have better H1975 (EGFR-T790M / L858R) cell inhibitory activity, and some compound-control-positive drugs have better selectivity of relative mutant strains.

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Abstract

提供具有式（I）结构的2-氨基嘧啶衍生物、含有式（I）化合物的药物组合物及所述化合物在制备预防或治疗表皮生长因子受体（EGFR）激酶相关疾病的用途，特别是用于预防或治疗与表皮生长因子受体激酶相关的癌症的用途。

Description

EGFR抑制剂及其制备和应用 技术领域
本申请属于医药技术领域，具体涉及2-氨基嘧啶衍生物及其用于制备抗肿瘤药物的用途。
本申请要求中国专利CN201810704812.2(申请日2018年6月27日，发明名称EGFR抑制剂及其制备和应用)的优先权。
背景技术
表皮生长因子受体(Epidermal Rrowth Factor Receptor,EGFR)是一种广泛分布于人体组织细胞膜上的具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体蛋白，是酪氨酸激酶erbB受体家族的一员。通过与配体表皮生长因子(EGF)结合，EGFR在细胞膜上形成同源二聚体，或者与家族中其他的受体(比如erbB2，erbB3，或erbB4)形成异源二聚体而活化，引起EGFR细胞内关键的酪氨酸残基磷酸化，激活激酶结构域，进一步激活细胞内多个下游的信号通路。这些细胞内信号通路在细胞增殖、生存及抗凋亡中起重要作用。
EGFR的酪氨酸激酶结构域可发生突变，导致组成性的信号激活，这种活性信号通路在肿瘤细胞的生长、生存和迁移过程中起至关重要的作用。最常见的激活突变是19号外显子的框内缺失突变和858密码子的错义突变(L858R)。带有EGFR突变的肺癌对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)高度敏感(Science[2004]第304期，1497-500)，第一代以EGFR为靶点的酪氨酸激酶抑制剂(如吉非替尼、厄洛替尼)等药物已在非小细胞肺癌的临床治疗中获得巨大成功(New England Journal of medicine[2004]第350期，2129-39；The Lancet Oncology[2012]第13卷第3期，239-46)。然而，接受TKI抑制剂治疗的患者往往由于形成耐药性而面临复发的问题。最常见的耐药机制就是EGFR的T790M二次突变，存在约50％的耐药肿瘤病人中(PLOS Medicine[2005]第2期，1-11)。第二代EGFR不可逆抑制剂如卡奈替尼(Canertinib)、阿法替尼(Afatinib)等可以克服耐药，但这些分子对EGFR T790M突变体的选择性差，对野生型EGFR产生的抑制作用较强，在体内的耐受剂量较低。
因此，有必要开发活性和选择性更好的第三代小分子EGFR抑制剂，能高选择性抑制T790M、19号外显子缺失、L858R错义突变等突变体。同时，对IGFR受体激酶有较低的抑制活性，避免脱靶造成的高血糖副作用(Transl Lung Cancer Res[2015]第5期，576-83)。
发明内容
本发明的目的是提供一种2-氨基嘧啶类EGFR抑制剂，其对EGFR突变具有高度选择性 且安全性更好。
本发明的另一个目的是提供所述的EGFR抑制剂在制备预防或治疗表皮生长因子受体(EGFR)激酶相关疾病的药物的用途。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
本发明所述的如下式(I)所示的化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐：
Figure PCTCN2019091970-appb-000001
其中，R 1选自C 1-C 8烷基或C 3-C 8环烷基，任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、C 1-C 8烷基、C 1-C 8烷氧基、卤取代C 1-C 8烷氧基、C 3-C 8环烷基或C 3-C 8环烷氧基的取代基所取代；
R 2选自氢、氘、卤素、氰基、硝基、C 1-C 8烷基、C 1-C 8烷氧基、C 3-C 8环烷基、C 2-C 8烯基、C 2-C 8炔基、三氟甲基、二氟甲基或三氟甲氧基；
R 3选自氢、氘、卤素、氰基、硝基、C 1-C 8烷基、C 3-C 8环烷基、C 2-C 8烯基或C 2-C 8炔基，任选进一步被一个或多个选自卤素、C 1-C 8烷基、C 1-C 8烷氧基、卤取代C 1-C 8烷氧基、C 3-C 8环烷基或C 3-C 8环烷氧基的取代基所取代；
R 4选自氢、卤素、氰基、硝基、C 1-C 8烷基、卤代C 1-C 8烷基、-C(O)R 5、-C(O)NR 5R 6、-OR 5、-NR 5R 6、-NR 5C(O)R 6、-NR 7(CH 2) mNR 5R 6、-NC(O)R 7(CH 2) mNR 5R 6、-NR 7(CH 2) mNR 5C(O)R 6、-NR 7(CH 2) mOR 6、-NC(O)R 7(CH 2) mOR 6、-O(CH 2) mNR 5R 6或-O(CH 2) mNR 5C(O)R 6；
R 5、R 6和R 7各自独立选自氢、C 1-C 8烷基或C 3-C 8环烷基，其中C 1-C 8烷基、C 3-C 8环烷基任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、-NR 8R 9、C 1-C 8烷基、C 1-C 8烷氧基、卤取代C 1-C 8烷氧基、C 3-C 8环烷基或C 3-C 8环烷氧基的取代基取代；
或R 5、R 6、R 7两两间可独立地形成4-10元杂环基；
m为1，2，3，4；
R 8和R 9各自独立选自氢、C 1-C 8烷基或C 3-C 8环烷基。
本发明优选方案，所述的式(I)化合物，其中：R 1选自C 1-C 8烷基或C 3-C 8环烷基，任选进一步被一个或多个选自卤素或羟基的取代基所取代；
R 2选自氢、氘、卤素或C 1-4烷基；
R 3选自氢、氘、卤素、C 1-C 8烷基或C 3-C 8环烷基；
R 4选自氢、卤素、氰基、硝基、C 1-C 8烷基、卤代C 1-C 8烷基、-NR 5R 6或-NR 7(CH 2) mNR 5R 6；
R 5、R 6和R 7各自独立选自氢、C 1-C 8烷基或C 3-C 8环烷基；
或R 5、R 6、R 7两两间可独立地形成4-10元杂环基；
m为1，2，3或4。
本发明优选方案，所述的式(I)化合物，其中：R 1选自C 1-C 4烷基，任选进一步被一个或多个选自卤素或羟基的取代基所取代；
R 2选自氢、氘、卤素或甲基；
R 3选自氢、氘、卤素、C 1-C 8烷基或C 3-C 8环烷基；
R 4选自-NR 5R 6或-NR 7(CH 2) mNR 5R 6；
R 5、R 6和R 7各自独立选自氢或C 1-C 4烷基；
m为1，2，3或4。
本发明优选方案，所述的式(I)化合物，其特征在于：
R 1选自甲基、二氟甲基、三氟甲基、乙基、正丙基、异丙基或三氟乙基；
R 2选自氢、氘、F、Cl、Br或甲基；
R 3选自氢或氘；
R 4为-NR 7(CH 2) mNR 5R 6；
R 5、R 6和R 7各自独立选自氢、甲基或乙基；
m为1，2，3或4。
作为最优选的方案，具体优选的通式(I)化合物或其药学上可接受的盐，包括如下：
Figure PCTCN2019091970-appb-000002
本发明另一方面提供式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐的制备方法，包括如下步骤：
Figure PCTCN2019091970-appb-000003
式(II)化合物与式(III)化合物在金属催化剂存在下发生取代反应得到式(IV)化合物，经过还原反应得到通式(V)化合物，再发生缩合反应得到式(I)化合物，其中，R 1、R 2、R 3、R 4如式(I)化合物所定义。
本发明另一方面提供药物组合物，其包括治疗有效剂量的前述式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐及可药用的载体。
本发明另一方面提供了前述式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐，或前述药物组合物在制备用于治疗对EGFR突变体尤其是L858R EGFR突变体、T790M EGFR突变体和外显子19缺失激活突变体活性介导疾病的治疗药物中的应用。
本发明另一方面提供了前述式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐，或前述药物组合物在制备用于治疗单独或部分地由EGFR突变体活性介导疾病的治疗药物中的应用。
本发明另一方面提供了前述式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐，或前述药物组合物在制备用于治疗癌症药物中的应用。
作为进一步优选的方案，所述癌症选自卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠道间质瘤、甲状腺癌、胆管癌、子宫内膜癌、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤或间皮瘤。
除非有相反陈述，下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义。
本发明中“C 1-C 8烷基”指包括1至8个碳原子的直链烷基和含支链烷基，烷基指饱和的脂族烃基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁 基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基或其各种支链异构体等。
本发明中“环烷基”指饱和单环烃取代基，“C 3-C 8环烷基”指包括3至8个碳原子的单环环烷基，例如：单环环烷基的非限制性实施例包含环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。
本发明中“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其中一个或多个环原子选自氮、氧或S(O)r(其中r是整数0、1、2)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。“4-10元杂环基”指包含4至10个环原子的环基。单环杂环基的非限制性实施例包含吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。
本发明中“烯基”指由至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成的如上述定义的烷基，“C 2-C 8烯基”指含有2-8个碳的直链或含支链烯基。例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-，2-或3-丁烯基等。
本发明中“炔基”指至少两个碳原子和至少一个碳-碳三键组成的如上所定义的烷基，“C 2-C 8炔基”指含有2-8个碳的直链或含支链炔基。例如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-，2-或3-丁炔基等。
本发明中“烷氧基”指-O-(烷基)，其中烷基的定义如上所述。“C 3-C 8烷氧基”指含1-8个碳的烷基氧基，非限制性实施例包含甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。
本发明中“环烷氧基”指和-O-(未取代的环烷基)，其中环烷基的定义如上所述。“C 3-C 8环烷氧基”指含3-8个碳的环烷基氧基，非限制性实施例包含环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。
“卤素”或者“卤”指氟、氯、溴或碘。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
本发明制备步骤中，所用试剂的缩写分别表示：
Figure PCTCN2019091970-appb-000004
Figure PCTCN2019091970-appb-000005
附图说明
图1实施例1化合物的核磁共振氢谱。
图2实施例1化合物的质谱。
图3实施例2化合物的核磁共振氢谱。
图4实施例2化合物的质谱。
图5实施例3化合物的核磁共振氢谱。
图6实施例3化合物的质谱。
图7实施例4化合物的核磁共振氢谱。
图8实施例4化合物的质谱。
图9实施例5化合物的核磁共振氢谱。
图10实施例5化合物的质谱。
图11实施例6化合物的核磁共振氢谱。
图12实施例6化合物的质谱。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1
N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-6-甲氧基吡啶吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000006
步骤1:6-溴-2-甲氧基-3-硝基吡啶的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000007
室温下，向四口瓶中依次加入2,6-二溴-3-硝基吡啶(40.00g，141.90mmol)、THF(520ml)，降温0-5℃，加入甲醇钠(30％，28.11g，156.08mmol)，3h反应终止。将反应液倒入冰水(500ml)，加MTBE(500ml x3)萃取，合并有机相，加饱和食盐水(200ml)洗涤，有机相浓缩，粗品结晶，得淡黄固体19.89g，收率60％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.15(d,J＝8.2Hz,1H),7.22(d,J＝8.2Hz,1H),4.14(s,3H)。
步骤2:6-溴-2-甲氧基吡啶-3-胺的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000008
室温下，向四口瓶中依次加入6-溴-2-甲氧基-3-硝基吡啶(9.50g，38.62mmol)、铁粉(11.50g，193.11mmol)、氯化铵(10.80g，193.11mmol)和乙醇(190ml)、水(95ml)，氮气保护，升温至80℃，1h反应终止。反应液加硅藻土过滤，滤液浓缩，加水(950ml)，EA(380ml x2)萃取，合并有机相，加饱和食盐水(200ml)洗涤，浓缩，得黑色油状液体8.28g，收率100％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.86(d,J＝7.8Hz,1H),6.76(d,J＝7.8Hz,1H),3.98(s,3H)。
步骤3:N-(6-溴-2-甲氧基吡啶-3-基)乙酰胺的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000009
室温下，向四口瓶中依次加入6-溴-2-甲氧基吡啶-3-胺(12.00g，59.10mmol)、乙酸酐(48.67g，466.90mmol)，20℃，1h反应终止。反应液加水(240ml)搅拌1h，析出褐色沉淀，抽滤，滤饼干燥，得褐色固体9.80g，收率68％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.49(d,J＝8.2Hz,1H),7.06(d,J＝8.2Hz,1H),4.02(s,3H),2.21(s,3H)。
步骤4:N-(6-溴-2-甲氧基-5-硝基-吡啶-3-基)乙酰胺的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000010
室温下，向四口瓶中依次加入N-(6-溴-2-甲氧基吡啶-3-基)乙酰胺(6.80g，27.74mmol)、三氟乙酸酐(68ml)，降温至0℃以下，滴加发烟硝酸(2.00g，28.58mmol)，0.5h反应终止。反应液缓慢倒入冰水(500g)搅拌1h，析出灰白色沉淀，抽滤，滤饼干燥，得黄色固 体7.60g，收率94％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)9.12(s,1H),4.06(s,3H),2.16(s,3H)。
步骤5:N-(6-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基-吡啶-3-基)乙酰胺的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000011
室温下，向四口瓶中依次加入N-(6-溴-2-甲氧基-5-硝基-吡啶-3-基)乙酰胺(5.60g，19.30mmol)、N,N,N’-三甲基乙二胺(2.96g，28.96mmol)，乙腈(168ml)，升温至80℃，1h反应终止。将反应液50℃减压蒸去溶剂，EA(70ml)打浆，抽滤，EA(20ml)洗涤，滤饼干燥，得黄色粉末5.40g，收率72％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)8.74(s,1H),4.03(s,3H),3.92(br,2H),3.41(t,J＝6.7Hz,2H),3.32(s,3H),2.84(d,J＝4.6Hz,6H),2.07(s,3H)。
步骤6:N 2-(2-(二甲基氨基)乙基)-6-甲氧基-N 2-甲基-3-硝基吡啶-2,5-二胺的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000012
室温下，向四口瓶中依次加入N-(6-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基-吡啶-3-基)乙酰胺(3.60g，11.34mmol)、甲醇(90ml)、37％盐酸(2.22g，22.68mmol)，升温至60℃，3h反应终止。将反应液加5％NaHCO3中和至pH＝8～9，40℃减压蒸去溶剂，加水(30ml)，加DCM(100ml x3)萃取，合并有机相，浓缩，粗品柱层析，得棕黄色油状物0.70g，收率22％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.46(s,1H),4.73(br,2H),3.93(s,3H),3.59-3.54(m,2H),2.77(s,3H),2.52(s,2H),2.17(s,6H)。
步骤7：2-氯-5-氟-N-(萘-2-基)嘧啶-4-胺的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000013
室温下，向四口瓶中依次加入2-氨基萘(2.00g，13.97mmol)、2,4-氯-5-氟嘧啶(4.70g，27.93mmol)、DMF(20ml)，氮气保护，降温至15-20℃，少量多次加入60％钠氢(1.70g，40.90mmol)，保温10℃，4h反应终止。将反应液缓慢倒入冰水(120ml)溶液中淬灭，加DCM(50ml)提取一次，有机层饱和食盐水洗涤，分出有机层，浓缩，粗品柱层析纯化(DCM)，得红棕色固体1.50g，收率39％。
步骤8：N 2-(6-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基吡啶-3-基)-5-氟-N 4-(萘-2-基)嘧啶-2,4-二胺)的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000014
室温下，向四口瓶中依次加入N 2-(2-(二甲基氨基)乙基)-6-甲氧基-N 2-甲基-3-硝基吡啶-2,5-二胺(3.00g，11.14mmol)、2-氯-5-氟-N-(萘-2-基)嘧啶-4-胺(3.01g，11.14mmol)、Pd 2(dba) 3(0.80g，0.89mmol)、Xantphos(1.02g，1.78mmol)、K 3PO 4(5.84g，27.85mmol)和1,4-二氧六环(45ml)，氮气保护，升温至65℃，搅拌反应11h。将反应液冷却至室温，加入水(90ml)淬灭反应，加入DCM(100mL x3)萃取，合并有机相，加水(40ml)洗涤一次，有机相浓缩，粗品柱层析得红棕色油状物1.42g，收率25.49％。
步骤9：N 2-(2-(二甲基氨基)乙基)-N 5-(5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)-6-甲氧基-N 2-甲基吡啶-2,3,5-三胺的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000015
室温下，向四口瓶中依次加入N 2-(6-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基吡啶-3-基)-5-氟-N 4-(萘-2-基)嘧啶-2,4-二胺)(1.42g，28.03mmol)、铁粉(0.78g，140.16mmol)、氯化铵(0.75g，140.16mmol)和乙醇(28ml)、水(14ml)，氮气保护，升温至75℃，2h反应终止。反应液加硅藻土过滤，滤液浓缩，粗品柱层析得黄色固体0.65g，收率48.7％。
步骤10：N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-6-甲氧基吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000016
室温下，向四口瓶中依次加入N 2-(2-(二甲基氨基)乙基)-N 5-(5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)-6-甲氧基-N 2-甲基吡啶-2,3,5-三胺(0.65g，1.36mmol)、TEA(0.41g，4.09mmol)、二氯甲烷(19.5mL)，氮气保护，降温至-30℃以下，滴加丙烯酰氯(0.13g，1.49mmol)的DCM溶液，1h反应终止。反应液加入5％NaHCO 3(10ml)淬灭反应，加入DCM(20ml x2) 萃取，合并有机相，浓缩，粗品柱层析得粉色固体0.053g，收率7.3％。 1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.07(br,1H),9.45(br,1H),8.39(br,1H),8.23(s,1H),8.19(s,1H),8.06(d,J＝2.9Hz,1H),7.80(s,3H),7.71(d,J＝9.4Hz,1H),7.45(t,J＝8.2Hz,1H),7.36(m,1H),6.75(m,1H),6.18(m,1H),5.67(d,J＝10.6Hz,1H),3.84(s,3H),3.51(m,2H),2.83(s,3H),2.57(m,2H),2.34(s,6H)。MS(ESI)m/z:531.0[M+H] +。
实施例2
N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000017
N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-3-基)丙烯酰胺的制备方法与实施例1类似。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ9.98(br,1H),9.45(br,1H),8.36(br,1H),8.32(s,1H),8.13(s,1H),8.06(s,1H),7.79(m,3H),7.59(d,J＝7.8Hz,1H),7.43(t,J＝7.3Hz,1H),7.39–7.34(m,1H),6.57(m,1H),6.21(d,J＝16.6Hz,1H),5.73(d,J＝11.1Hz,1H),4.87(q,J＝8.9Hz,2H),3.41(m,2H),2.86(s,3H),2.58(m,2H),2.35(s,6H)。MS(ESI)m/z:599.2[M+H] +。
实施例3
N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)
氨基)-6-异丙基吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000018
N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-6-异丙基吡啶-3-基)丙烯酰胺的制备方法与实施例1类似。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ9.76(br,1H),9.44(br,1H),8.39(br,1H),8.21(s,1H),8.08(d,J＝3.5Hz,1H),8.00(s,1H),7.77(m,3H),7.61(d,J＝7.8Hz,1H),7.39(m,2H),6.41(dd,J＝17.0,10.1Hz,1H),6.15(d,J＝17.0Hz,1H),5.69(d,J＝10.0Hz,1H),5.18(m,1H),3.17(m,2H),2.84(s,3H),2.47(m,2H),2.20(s,6H),1.21(d,J＝6.1Hz,6H)。MS(ESI)m/z:559.0[M+H] +。
实施例4
N-(5-((5-氯-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-6-甲氧基吡啶吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000019
N-(5-((5-氯-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-6-甲氧基吡啶吡啶-3-基)丙烯酰胺的制备方法与实施例1类似。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ10.59(br,1H),10.20(br,1H),8.82(br,1H),8.42(s,1H),8.25(s,1H),8.12(d,J＝10.5Hz,1H),7.82(m,3H),7.72(d,J＝8.6Hz,1H),7.46(t,J＝7.2Hz,1H),7.37(t,J＝7.4Hz,1H),6.94(m,1H),6.18(d,J＝16.3Hz,1H),5.66(d,J＝9.9Hz,1H),3.83(s,3H),3.67(m,2H),2.78(s,3H),2.67(s,6H),2.49(m,2H)。MS(ESI)m/z:547.0[M+H] +。
实施例5
N-(5-((5-氯-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000020
N-(5-((5-氯-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-3-基)丙烯酰胺的制备方法与实施例1类似。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ9.82(br,1H),8.80(br,1H),8.49(br,1H),8.25(s,1H),8.09(s,1H),8.04(s,1H),7.75(m,3H),7.59(d,J＝7.3Hz,1H),7.40(m,2H),6.41(dd,J＝16.9,10.1Hz,1H),6.18(d,J＝16.7Hz,1H),5.72(d,J＝9.9Hz,1H),4.83(q,J＝8.9Hz,2H),3.22(m,2H),2.88(s,3H),2.47(m,2H),2.18(s,6H)。MS(ESI)m/z:615.0[M+H] +。
实施例6
N-(5-((5-氯-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-6-异丙基吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成
Figure PCTCN2019091970-appb-000021
N-(5-((5-氯-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-6-异丙基吡啶-3-基)丙烯酰胺的制备方法与实施例1类似。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ9.92(br,1H),8.86(br,1H),8.25(br,1H),8.13(m,3H),7.80(d,J＝13.6Hz,3H),7.66(d,J＝9.1Hz,1H),7.41(m,2H),6.64(m,1H),6.20(d,J＝16.8Hz,1H),5.71(d,J＝10.5Hz,1H),5.16(dt,J＝12.3,6.1Hz,1H),3.48(m,2H),2.78(s,3H),2.60(m,2H),2.30(m,6H),1.21(d,J＝6.0Hz,6H)。MS(ESI)m/z:575.0[M+H] +。
实施例7
化合物对激酶抑制活性测试
本试验采用γ- 33p-ATP同位素测试法测试化合物对激酶EGFR(WT)、EGFR(T790M/L858R)、IGF1R的抑制作用，并得出化合物对该酶抑制活性的半数抑制浓度IC 50，对照药AZD-9291参考专利WO2013014448A1中的方法制备。
1.基础反应缓冲液
20mM Hepes(pH 7.5),10mM MgCl 2,1mM EGTA,0.02％Brij35,0.02mg/ml BSA,0.1mM Na3VO4,2mM DTT,1％DMSO。
2.化合物配制
化合物采用100％DMSO溶解至特定的浓度，之后采用自动加样装置梯度稀释成不同浓度的待测样品(DMSO溶解液)。
3.反应步骤
3.1使用基础反应缓冲液稀释反应底物；
3.2将激酶加入底物溶液中，轻柔混匀；
3.3采用自动加样系统将100％DMSO稀释的不同浓度化合物加入激酶溶液中，室温下孵育20min；
3.4室温下加入 33P-ATP(10μM,10μCi/μl)启动激酶反应，反应2h；
4.检测
反应液经离子交换过滤系统除去未反应的ATP及反应产生的ADP等离子后检测底物中 33P同位素放射量。
5.数据处理
依据放射量计算加入不同浓度抑制剂体系中的激酶活性从而得到不同浓度化合物对激酶活性的抑制作用，采用graphpad prism拟合得化合物抑制IC 50。
本发明化合物的生物化学活性通过以上的试验进行测定，测得的酶活性IC 50值参见表1：
表1激酶抑制活性测试结果
Figure PCTCN2019091970-appb-000022
结论：本发明化合物与对照阳性药相比，有更好的EGFR(L858R/T790M)突变激酶抑制活性，部分化合物对比专利WO2016082713实施例41化合物(CCB120067)有显著的IGF1R激酶选择性优势，可防止脱靶产生血糖升高副作用。
实施例8
Hcc827细胞增殖抑制试验
本实验采用MTT的方法测试化合物对Hcc827的细胞活性作用，并得出化合物抑制细胞增殖活性的半数抑制浓度IC 50。
1.Hcc827细胞株在RPMI-1640+10％FBS的条件下进行培养。在96孔细胞培养板中接种100μL的处于对数生长期的Hcc827细胞悬液，密度为5X 10  4/ml，将培养板于培养箱中培养24h令细胞贴壁(37℃，5％CO 2)。
2.各化合物已事先溶解在DMSO中配制成10mM的储存液，采用DMSO梯度稀释为目标浓度的400倍，采用无血清培养基稀释到目的浓度的2倍，维持药液中DMSO浓度均为0.5％。在接种细胞的96孔板中依次加入不同浓度药液，100μL/孔。每个浓度设3个复孔，并设空白对照及阴性对照，继续在37℃、5％CO 2中继续培养72h。
3.终止培养，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml)，继续在37℃、5％CO 2中继续培养4h后弃除培养基，加入DMSO 150μL/孔，室温震荡10min，在490nM波长处测OD 值，并经Graphpad Prism 6.0数据处理计算IC 50值。
实施例9
NCI-H1975细胞增殖抑制试验
本实验采用MTT的方法测试化合物对NCI-H1975的细胞活性作用，并得出化合物抑制细胞增殖活性的半数抑制浓度IC 50值。
1.NCI-H1975细胞株在RPMI-1640+10％FBS的条件下进行培养，在96孔细胞培养板中接种100μL的处于对数生长期的NCI-H1975细胞悬液，密度为5X 10 4/ml，将培养板于培养箱中培养24h令细胞贴壁(37℃，5％CO 2)。
2.弃除96孔细胞培养板中含10％FBS的RPMI-1640培养基，换用含0.2％FBS的RPMI-1640培养基。各化合物已事先溶解在DMSO中配制成10mM的储存液，采用DMSO梯度稀释为目标浓度的400倍，采用无血清培养基将其稀释到目的浓度的2倍。在接种细胞的96孔板中依次加入不同浓度药液，100μL/孔。每个浓度设3个复孔，并设空白对照及阴性对照，继续在37℃、5％CO 2中继续培养72h。
3.终止培养，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml)，继续在37℃、5％CO 2中继续培养4h后弃除培养基，加入DMSO 150μL/孔，室温震荡10min，在490nM波长处测OD值，并经Graphpad Prism数据处理计算IC 50值。
实施例10
A431细胞增殖抑制试验
本实验采用MTT的方法测试化合物对A431的细胞活性作用，并得出化合物抑制细胞增殖活性的半数抑制浓度IC 50。
1.A431细胞株在DMEM+10％FBS的条件下进行培养。在96孔细胞培养板中接种100μL的处于对数生长期的A431细胞悬液，密度为5X10 4/ml，将培养板于培养箱中培养24h令细胞贴壁(37℃，5％CO 2)。
2.各化合物已事先溶解在DMSO中配制成10mM的储存液，采用DMSO梯度稀释为目标浓度的400倍，采用无血清培养基稀释到目的浓度的2倍，维持药液中DMSO浓度均为0.5％。在接种细胞的96孔板中依次加入不同浓度药液，100μL/孔。每个浓度设3个复孔，并设空白对照及阴性对照，继续在37℃、5％CO 2中继续培养72h。
3.终止培养，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml)，继续在37℃、5％CO 2中继续培养4h后弃除培养基，加入DMSO 150μL/孔，室温震荡10min，在490nM波长处测OD 值，并经Graphpad Prism 6.0数据处理计算IC 50值。
本发明化合物生物化学活性通过以上的试验进行测定，测得的细胞抑制IC 50值参见表2：
表2细胞抑制实验结果
Figure PCTCN2019091970-appb-000023
结论：本发明化合物对照阳性药有更好的H1975(EGFR-T790M/L858R)细胞抑制活性，部分化合物对照阳性药有更好的相对突变株的选择性。

Claims (10)

  1. 如式(I)所示的化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐：
    Figure PCTCN2019091970-appb-100001
    其中，R 1选自C 1-C 8烷基或C 3-C 8环烷基，任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、C 1-C 8烷基、C 1-C 8烷氧基、卤取代C 1-C 8烷氧基、C 3-C 8环烷基或C 3-C 8环烷氧基的取代基所取代；
    R 2选自氢、氘、卤素、氰基、硝基、C 1-C 8烷基、C 1-C 8烷氧基、C 3-C 8环烷基、C 2-C 8烯基、C 2-C 8炔基、三氟甲基、二氟甲基或三氟甲氧基；
    R 3选自氢、氘、卤素、氰基、硝基、C 1-C 8烷基、C 3-C 8环烷基、C 2-C 8烯基或C 2-C 8炔基，任选进一步被一个或多个选自卤素、C 1-C 8烷基、C 1-C 8烷氧基、卤取代C 1-C 8烷氧基、C 3-C 8环烷基或C 3-C 8环烷氧基的取代基所取代；
    R 4选自氢、卤素、氰基、硝基、C 1-C 8烷基、卤代C 1-C 8烷基、-C(O)R 5、-C(O)NR 5R 6、-OR 5、-NR 5R 6、-NR 5C(O)R 6、-NR 7(CH 2) mNR 5R 6、-NC(O)R 7(CH 2) mNR 5R 6、-NR 7(CH 2) mNR 5C(O)R 6、-NR 7(CH 2) mOR 6、-NC(O)R 7(CH 2) mOR 6、-O(CH 2) mNR 5R 6或-O(CH 2) mNR 5C(O)R 6；
    R 5、R 6和R 7各自独立选自氢、C 1-C 8烷基或C 3-C 8环烷基，其中C 1-C 8烷基、C 3-C 8环烷基任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、-NR 8R 9、C 1-C 8烷基、C 1-C 8烷氧基、卤取代C 1-C 8烷氧基、C 3-C 8环烷基或C 3-C 8环烷氧基的取代基取代；
    或R 5、R 6、R 7两两间可独立地形成4-10元杂环基；
    m为1，2，3，4；
    R 8和R 9各自独立选自氢、C 1-C 8烷基或C 3-C 8环烷基。
  2. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于：
    R 1选自C 1-C 8烷基或C 3-C 8环烷基，任选进一步被一个或多个选自卤素或羟基的取代基所取代；
    R 2选自氢、氘、卤素或C 1-4烷基；
    R 3选自氢、氘、卤素、C 1-C 8烷基或C 3-C 8环烷基；
    R 4选自氢、卤素、氰基、硝基、C 1-C 8烷基、卤代C 1-C 8烷基、-NR 5R 6或-NR 7(CH 2) mNR 5R 6；
    R 5、R 6和R 7各自独立选自氢、C 1-C 8烷基或C 3-C 8环烷基；
    或R 5、R 6、R 7两两间可独立地形成4-10元杂环基；
    m为1，2，3或4。
  3. 如权利要求2所述的化合物，其特征在于：
    R 1选自C 1-C 4烷基，任选进一步被一个或多个选自卤素或羟基的取代基所取代；
    R 2选自氢、氘、卤素或甲基；
    R 3选自氢、氘、卤素、C 1-C 8烷基或C 3-C 8环烷基；
    R 4选自-NR 5R 6或-NR 7(CH 2) mNR 5R 6；
    R 5、R 6和R 7各自独立选自氢或C 1-C 4烷基；
    m为1，2，3或4。
  4. 如权利要求3所述的化合物，其特征在于：
    R 1选自甲基、二氟甲基、三氟甲基、乙基、正丙基、异丙基或三氟乙基；
    R 2选自氢、氘、F、Cl、Br或甲基；
    R 3选自氢或氘；
    R 4为-NR 7(CH 2) mNR 5R 6；
    R 5、R 6和R 7各自独立选自氢、甲基或乙基；
    m为1，2，3或4。
  5. 如下结构的化合物或其药学上可接受的盐：
    Figure PCTCN2019091970-appb-100002
  6. 一种药物组合物，其包含如权利要求1～5中任一项所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐和可药用的载体。
  7. 如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。
  8. 根据权利要求1～5中任一项所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐，或权利要求6所述的药物组合物在制备用于预防或治疗单独或部分地由表皮生长因子受体EGFR激酶活性介导的疾病的治疗药物中的应用。
  9. 根据权利要求1～5中任一项所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐，或权利要求6所述的药物组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的应用。
  10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症选自卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠道间质瘤、甲状腺癌、胆管癌、子宫内膜癌、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤或间皮瘤。
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