WO2019245392A1 - Rapid differential diagnosis kit for detecting infectious coryza and swollen head syndrome in the poultry farming industry - Google Patents

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WO2019245392A1 PCT/PE2019/000006 PE2019000006W WO2019245392A1 WO 2019245392 A1 WO2019245392 A1 WO 2019245392A1 PE 2019000006 W PE2019000006 W PE 2019000006W WO 2019245392 A1 WO2019245392 A1 WO 2019245392A1
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Manolo Clemente Fernandez Diaz
Sandra Steffany MORALES RUIZ
Jorge Eduardo BENDEZU EGUS
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Farmacologicos Veterinarios Sac
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Abstract

To reduce the time in diagnosing infectious coryza (IC), a disease that causes large losses in the poultry farming industry, the present work seeks to develop immunochromatography strips (ICS) that allow the causative agent (Avibacterium paragallinarum) to be detected. The monoclonal antibody Am-lG7G8 was obtained from a peptide of TonB-dependent transporter (TonB-dT) protein. Using this antibody, a qualitative ICS prototype was developed (presence and absence), which showed specificity for Avibacterium paragallinarum in samples of avian metapneumovirus and other avian pathogens, and provided results 30 minutes after applying the sample.

Description

KIT DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL Y RÁPIDO PARA DETECCIÓN DE LA CORIZA DIFFERENTIAL AND QUICK DIAGNOSTIC KIT FOR DETECTION OF CORIZA
INFECCIOSA Y EL SINDROME DE CABEZA HINCHADA EN LA INDUSTRIAINFECTIOUS AND THE INFLATED HEAD SYNDROME IN THE INDUSTRY
AVÍCOLA NOTICE
SECTOR DE LA TÉCNICA SECTOR OF THE TECHNIQUE
La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología y la industria farmacéutica aviar, en particular con el diagnostico mediante la obtención de pruebas diagnósticas del tipo tira ¡nmunocromatográfica para la detección de Avibacterium paragallinarum en aves con coriza infecciosa y el síndrome de cabeza hinchada.  The present invention is related to the field of biotechnology and the avian pharmaceutical industry, in particular to the diagnosis by obtaining diagnostic tests of the immunochromatographic strip type for the detection of Avibacterium paragallinarum in birds with infectious coryza and swollen head syndrome .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN BACKGROUND OF THE INVENTION
Debido a la producción intensiva y tecnificacia, los animales en las granjas se han tomado más susceptibles a tos distintos patógenos, en ese sentido, los esfuerzos en tos ámbitos de sanidad animal como la prevención, el diagnóstico, tratamiento y control de enfermedades que afectan la industria avícola se han convertido en una prioridad. Entre las principales enfermedades tenemos a la coriza infecciosa (Cl) y el síndrome de cabeza hinchada (SCH), las cuales tienen pomo agentes patógenos a la bacteria Avibacterium paragallinarum y al virus Metapneumovirus aviar (aMPV), respectivamente. Un gran reto para la sanidad avícola es que ambos patógenos provocan enfermedades con signos clínicos similares como una enfermedad respiratoria aguda con cuadros clásicos de destilación nasal, tos, estornudos, edema submandibular, sinusitis, rinitis, entre otros (Sorianoy Terzolo 2004, Pringle, 1998; Cook et al., 2000. Aung y Liman, 2006).  Due to intensive production and technology, animals on farms have become more susceptible to different pathogens, in that sense, efforts in areas of animal health such as prevention, diagnosis, treatment and control of diseases that affect Poultry industry have become a priority. Among the main diseases we have infectious coryza (Cl) and swollen head syndrome (SCH), which have as pathogens agents the bacterium Avibacterium paragallinarum and the avian Metapneumovirus (aMPV) virus, respectively. A great challenge for poultry health is that both pathogens cause diseases with similar clinical signs such as acute respiratory disease with classic pictures of nasal distillation, cough, sneezing, submandibular edema, sinusitis, rhinitis, among others (Sorianoy Terzolo 2004, Pringle, 1998 ; Cook et al., 2000. Aung and Liman, 2006).
Como medida de control actual, el establecimiento de un diagnóstico visual es básicamente de carácter orientativo y además que requieren técnicas microbiológicas y moleculares con parámetros laboriosos en laboratorios altamente especializados. Las técnicas que vienen siendo empleadas para el diagnóstico de aMPV involucran seroneutralización viral, inmunodifusión, microinmunoflorescencia y ELISA (OIE, 2009, McFariane y Jackson, 1998, Mekkes y De Wit, 1999). El uso de técnicas moleculares como la prueba RT-qPCR ha demostrado se[ sensible y rápida para aMPV (Bayon- Auboyer et al., 2000; Toquin et al., 2003), sin embargo, sólo se pueden identificar algunas variedades virales (Pedersen et al., 2Q00; Pedersen et al., 2001). As a current control measure, the establishment of a visual diagnosis is basically of an orientation nature and also that they require microbiological and molecular techniques with laborious parameters in highly specialized laboratories. The techniques that have been used for the diagnosis of aMPV involve viral seroneutralization, immunodiffusion, microimmunoflorescence and ELISA (OIE, 2009, McFariane and Jackson, 1998, Mekkes and De Wit, 1999). The use of molecular techniques such as the RT-qPCR test has been shown to be [sensitive and rapid for aMPV (Bayon- Auboyer et al., 2000; Toquin et al., 2003), however, only some viral varieties can be identified (Pedersen et al., 2Q00; Pedersen et al., 2001).
En el caso de Avibacterium paragallinarum, realizar un diagnóstico que involucre el aislamiento bacteriano, además de pruebas bioquímicas, es complicado y lento, sin embargo, dicho diagnóstico puede complementarse a métodos moleculares. Las técnicas de biología molecular han demostrado ser sensibles y específicas, sin embargo, actualmente existe una demanda por el desarrollo de pruebas de diagnóstico rápidas, simples y exactas para una identificación temprana del agente patógeno, y de esta manera tomar medidas de control sanitario apropiadas in situ en las granjas locales. In the case of Avibacterium paragallinarum, making a diagnosis that involves bacterial isolation, in addition to biochemical tests, is complicated and slow, however, such diagnosis can be complemented by molecular methods. Molecular biology techniques have proven to be sensitive and specific, however, there is currently a demand for the development of rapid, simple and accurate diagnostic tests for early identification of the pathogen, and thus take appropriate sanitary control measures in situ on local farms.
Las tiras inmunocromatográficas (TIC) son de aplicación y resultado rápido y simple: no requieren equipamiento e instalaciones costosas, ni mucho menos personal altamente calificado. Los TICs son ampliamente empleados para el diagnóstico de patógenos implicados en enfermedades humanas (Heesqhen et al., 1998; Watanabe et al., 2001 ; Yamasaki et al., 2013); y también aviares (Peng et al, 2007; Peng et al., 2008; Cui et al., 2008; Zhang et al., 2010; Wang et al., 2008; Nurulfiza et al., 2011 ; Moongkamdi et al. 2011). Los genomas disponibles de Avibacterium paragallinarum y aMPV abren las posibilidades de selección de antígenos para ser empleados como analitos de detección en el diseño de pruebas de diagnóstico (Reqqena et al., 2013). Actualmente, en Perú son limitadas las iniciativas de desarrollo de tecnologías significativas para realizar pruebas de diagnóstico rápido destinadas a ser empleadas en sanidad animal. Siendo estas pruebas de diagnóstico rápido útiles para el monitoreo y el control de las enfermedades que afectan el sector agropecuario. Immunochromatographic strips (ICT) are quick and simple to apply and result: they do not require expensive equipment and facilities, much less highly qualified personnel. ICTs are widely used for the diagnosis of pathogens involved in human diseases (Heesqhen et al., 1998; Watanabe et al., 2001; Yamasaki et al., 2013); and also aviars (Peng et al., 2007; Peng et al., 2008; Cui et al., 2008; Zhang et al., 2010; Wang et al., 2008; Nurulfiza et al., 2011; Moongkamdi et al. 2011 ). The available genomes of Avibacterium paragallinarum and aMPV open the possibilities of antigen selection to be used as detection analytes in the design of diagnostic tests (Reqqena et al., 2013). Currently, in Peru, initiatives for the development of significant technologies to perform rapid diagnostic tests to be used in animal health are limited. These rapid diagnostic tests are useful for monitoring and control of diseases that affect the agricultural sector.
En la actualidad los métodos de detección actuales para el SCH y Cl involucran múltiples procesos que demandan mucha inversión de tiempo y dinero, además de requerir el sacrificio del ave. Diagnosticar estas dos enfermedades (SCH y Cl) de forma tardía impide que se lleve a cabo un tratamiento oportuno de las mismas, lo que provoca una pérdida de peso en las aves de carne y una disminución entre 10-40 % de la eficiencia en la postura en ponedoras (Blackall J and Soriano-Vargas E., 2013). Durante el año 2017, sólo en Lima Metropolitana y el Callao se produjeron alrededor de 260 millones de pollos (MINAGRI., 2018) y la incidencia de enfermedades como la Cl y el SCH siguen provocando grandes pérdidas en la industria avícola. Es así como en este sector existe una dependencia por los servicios de diagnóstico, que incluyen el sacrificio de animales y el envío de muestras a laboratorios especializados, esto consume tiempo y tiene costos elevados. La Cl, por ejemplo, es una infección constante y de rápido propagación (1-2 días de incubación y pico alto de infección a los 4 días), su detección y diferenciación de SCH es vital para la toma de decisión en campo, ya que Cl se trata mediante el uso de antibióticos y bactéricas específicas; mientras que SCH se trata con la aplicación sólo de vacunas inactivadas específicas para cada subtipo viral. Cabe indicar que en el mercado mundial actual no existen TICs similares para el diagnóstico de estas enfermedades aviares. Currently, the current detection methods for SCH and Cl involve multiple processes that require a lot of time and money investment, in addition to requiring the sacrifice of the bird. Diagnosing these two diseases (SCH and Cl) late prevents timely treatment of them, which causes a loss of weight in poultry and a decrease between 10-40% of the efficiency in the laying position (Blackall J and Soriano-Vargas E., 2013). During 2017, only 260 million chickens occurred in Metropolitan Lima and Callao alone (MINAGRI., 2018) and the incidence of diseases such as Cl and SCH continue to cause great losses in the poultry industry. This is how in this sector there is a dependence on diagnostic services, which include the slaughter of animals and the sending of samples to specialized laboratories, this is time consuming and has high costs. Cl, for example, is a constant and rapidly spreading infection (1-2 days of incubation and high peak infection at 4 days), its detection and differentiation of SCH is vital for decision making in the field, since Cl is treated by the use of specific antibiotics and bacterics; while SCH is treated with the application only of inactivated vaccines specific for each viral subtype. It should be noted that in the current world market there are no similar ICTs for the diagnosis of these avian diseases.
Finalmente, un mimótopo es una macromolécula, a menudo un péptido, que imita la estructura de un epítopo. Debido a esta propiedad provoca una respuesta de anticuerpos similares a los provocados por el epítopo. Un anticuerpo para un determinado epítopo del antígeno reconocerá un mimótopo que imita ese epítopo. En ese sentido los anticuerpos de la presente invención reconocerían un epítopo de la proteína tonB-dT de Avibacterium paragallinarum o un mimótopo que imita ese epítopo. Finally, a mimotope is a macromolecule, often a peptide, that mimics the structure of an epitope. Due to this property it provokes an antibody response similar to those caused by the epitope. An antibody to a particular epitope of the antigen will recognize a mimotope that mimics that epitope. In that sense, the antibodies of the present invention would recognize an epitope of the tonB-dT protein from Avibacterium paragallinarum or a mimotope that mimics that epitope.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1 : Evaluación de Anticuerpos Policlonales (AcP) mediante ensayos de Western blot utilizando AcP-12 y AcP-18 contra cultivos bacterianos de serovares de Avibacterium paragallinarum. SerA: Serovar A. SerB: Serovar B. SerC: Serovar C. Carril 1 : lisado bacteriano (0.3 mg/ml); Canil 2: lisado bacteriano (1/10); Carril 3: lisado bacteriano (1/100); Carril 4: lisado bacterianp (1/1 ,000); Carril 5: lisado bacteriano (1/10,000); Carril 6: Sobrenadante de cultiyo bacteriano (0.75 mg/ml); Carril 7: Sobrenadante de cultivo bacteriano (1/10); Carril 8: Sobrenadante de cultivo bacteriano (1/100); Carril 9: Sobrenadante de cultivo bacteriano (1/1 ,000); Carril 10: Sobrenadante de cultivo bacteriano (1/10,000). Figure 1: Evaluation of Polyclonal Antibodies (AcP) by Western blot assays using AcP-12 and AcP-18 against bacterial cultures of Avibacterium paragallinarum serovars. SerA: Serovar A. SerB: Serovar B. SerC: Serovar C. Lane 1: bacterial lysate (0.3 mg / ml); Canil 2: bacterial lysate (1/10); Lane 3: bacterial lysate (1/100); Lane 4: bacterianp lysate (1/1, 000); Lane 5: bacterial lysate (1 / 10,000); Lane 6: Bacterial culture supernatant (0.75 mg / ml); Lane 7: Bacterial culture supernatant (1/10); Lane 8: Bacterial culture supernatant (1/100); Lane 9: Bacterial culture supernatant (1/1, 000); Lane 10: Bacterial culture supernatant (1 / 10,000).
Figura 2: ELISA indirecto para la evaluación de la capacidad de detección de AcP-12 y AcP-18 frente a sus correspondientes péptidos (4mg/ml). *: p <0.05. Barras de error indican desviación estándar (DE). Figura 3: Ensayo de ELISA para la evaluación de la capacidad de detección de las diluciones de AcP-12 frente a lisados (Lis.) y sqbrenadantes (Sob.) de cultivo bacteriano de serovares de Avibacterium paragallinarum (0.3 mg/ml). ORT: Omithobacterium rhinotracheale, aMPV: Metapneumovirus aviar SerA: serovar A. SerB: serovar B. SerC: serovar C. *: p <0.05. Figure 2: Indirect ELISA for the evaluation of the detection capacity of AcP-12 and AcP-18 against their corresponding peptides (4mg / ml). *: p <0.05. Error bars indicate standard deviation (SD). Figure 3: ELISA test for the evaluation of the detection capacity of AcP-12 dilutions against lysates (Lis.) And sqbrenatants (Sob.) Of bacterial serovar culture of Avibacterium paragallinarum (0.3 mg / ml). ORT: Omithobacterium rhinotracheale, aMPV: Avian metapneumovirus SerA: serovar A. SerB: serovar B. SerC: serovar C. *: p <0.05.
Figura 4: Ensayo de ELISA para la evaluación de la capacidad de detección de las diluciones de AcP-18 frente a lisados (Lis.) y spbrenadantes (Sob.) de 0.3 mg/ml. ORT: Omithobacterium rhinotracheale, aMPV: Metapneumovirus aviar SerA: serovar A. SerB: serovar B. SerC: serovar C. *: p <0.05. Figure 4: ELISA test for the evaluation of the detection capacity of dilutions of AcP-18 against lysates (Lis.) And spbrenadantes (Sob.) Of 0.3 mg / ml. ORT: Omithobacterium rhinotracheale, aMPV: Avian metapneumovirus SerA: serovar A. SerB: serovar B. SerC: serovar C. *: p <0.05.
Figura 5: Especificidad de los AcP-12 (1/600) frente a patógenos aviares que originan similares signos clínicos. Las líneas punteadas indican el punto de corte (establecido como la media + 1 DE de las absorbencias de ORT, aMPV, virus de NewCastle (NDV) y virus de Laringotraqueitis infecciosa aviar (ILT)). Figure 5: Specificity of AcP-12 (1/600) against avian pathogens that give rise to similar clinical signs. Dotted lines indicate the cut-off point (established as the mean + 1 SD of the absorbencies of ORT, aMPV, NewCastle virus (NDV) and avian infectious laryngotracheitis virus (ILT)).
Figura 6: Especificidad de los AcP-18 (1/600) frente a patógenos aviares que originan similares signos clínicos. Las líneas punteadas indican el punto de corte (establecido como la media + 1 DE de las absorbencias de ORT, aMPV, virus de NewCastle (NDV) y virus de Laringotraqueitis infecciosa aviar (ILT)). Figure 6: Specificity of AcP-18 (1/600) against avian pathogens that give rise to similar clinical signs. Dotted lines indicate the cut-off point (established as the mean + 1 SD of the absorbencies of ORT, aMPV, NewCastle virus (NDV) and avian infectious laryngotracheitis virus (ILT)).
Figura 7: Evaluación de AcP-12 y AcP-18 copo anticuerpos de captura (3mg/ml) en combinación con AcP-12 como anticuerpo de detección (1/600) para el desarrollo de ELISA en formato sándwich frente a diluciones de lisado bacteriano del serovar C. *: p <0.05 Figure 7: Evaluation of AcP-12 and AcP-18 copo capture antibodies (3mg / ml) in combination with AcP-12 as detection antibody (1/600) for the development of sandwich ELISA against dilutions of bacterial lysate of serovar C. *: p <0.05
Figura 8: Evaluación de AcP-18 y AcP-12 copio anticuerpos de captura (3mg/ml) en combinación con AcP-18 como anticuerpo de detección (1/600) para el desarrollo de ELISA en formato sándwich frente a diluciones de lisado bacteriano del serovar C. *: p <0.05. Figura 9A: Ensayos de Western blot empleando el anticuerpo 1 G7G8 frente a los lisados de cultivos obtenidos de los serovares A, B y C de Avibacterium paragallinarum. Las flechas negras indican la banda reactiva correspondiente a la proteína tonB-dT presente en las muestras cuyo peso molecular es de aproximadamente 90kilodaltons (kDa).Figure 8: Evaluation of AcP-18 and AcP-12 copied capture antibodies (3mg / ml) in combination with AcP-18 as a detection antibody (1/600) for the development of sandwich ELISA against dilutions of bacterial lysate of serovar C. *: p <0.05. Figure 9A: Western blot assays using antibody 1 G7G8 against culture lysates obtained from serovars A, B and C of Avibacterium paragallinarum. The black arrows indicate the reactive band corresponding to the tonB-dT protein present in samples whose molecular weight is approximately 90 kilodaltons (kDa).
Figura 9B: Ensayos de Western blot empleandq el anticuerpo monoclonal 1G7G8 frente a los sobrenadantes de cultivos obtenidos de los serovares A, B y C de Avibacterium paragallinarum. Las flechas negras indican la banda reactiva correspondiente a la proteína tonB-dT presente en las muestras cuyo peso molecular es de aproximadamente 90kilodaltons (kDa). Figure 9B: Western blot assays using monoclonal antibody 1G7G8 against culture supernatants obtained from serovars A, B and C of Avibacterium paragallinarum. The black arrows indicate the reactive band corresponding to the tonB-dT protein present in samples whose molecular weight is approximately 90 kilodaltons (kDa).
Figura 10: Evaluación de la Reactividad de anticuerpos 1G7G8 mediante ensayos de ELISA usando lisados (unidades formadoras de placa (UFC)/mL) de los cultivos de los serovares de Avibacterium paragallinarum. Serovares A, B y C). Las barras de error representan la desviación estándar (DE). Las líneas punteadas representan el punto de corte el cual fue calculado como la media de Ia absorbancia obtenida a 104 UFC/mL +Figure 10: Evaluation of the Reactivity of 1G7G8 antibodies by ELISA assays using lysates (plaque forming units (CFU) / mL) of the Avibacterium paragallinarum serovar cultures. Serovars A, B and C). Error bars represent the standard deviation (SD). The dashed lines represent the cut-off point which was calculated as the average absorbance obtained at 104 CFU / mL +
2DE. UFC: unidades formadoras de colonias. : p=0.001. Anova de dos variables y Test de Tukey fueron usados para el análisis. 2 OF. UFC: colony forming units. : p = 0.001. Anova of two variables and Tukey's test were used for the analysis.
Figura 11 : Evaluación de la Reactividad de anticuerpos 1G7G8 mediante ensayo de ELISA usando sobrenadantes de cultivos de los serovares de Avibacterium paragallinarum. Serovar A, B y C). Las barras de error representan la desviación estándar (DE). Las líneas punteadas representen el punto de corte el cual fue calculado como la media de la absorbancia obtenida del logaritmo de la dilución -4 del sobrenadante + 2DE. UFC: unidades formadoras de colonias. ***: p=0.001. Anova de dos variables y Test de Tukey fueron usados para el análisis. Figure 11: Evaluation of the Reactivity of 1G7G8 antibodies by ELISA assay using culture supernatants of Avibacterium paragallinarum serovars. Serovar A, B and C). Error bars represent the standard deviation (SD). The dashed lines represent the cut-off point which was calculated as the average absorbance obtained from the log of dilution -4 of the supernatant + 2DE. UFC: colony forming units. ***: p = 0.001. Anova of two variables and Tukey's test were used for the analysis.
Figura 12: Especificidad del anticuerpo monoclonal 1G7G8 empleando distintas concentraciones de cultivos celulares infectados con otros patógenos aviares como ORT (Omithobacterium rhinotracheale), ILTXf (virus de Laringotraqueitis infecciosa aviar), NDV (virus de NewCastle) y aMPV (Metapneumovirus aviar) mediante ensayos de ELISA directo. Las líneas punteadas representan el punto de corte el cual fue calculado como la media de las absorbencias qbtenidas a 3mg/mL + 2DE.Este punto de corte fue tomado con el fin de evaluar saturapiones de antigenos no específicos que conlleven a una reactividad cruzada por parte del anticuerpo monoclonal 1G7G8. Figure 12: Specificity of the 1G7G8 monoclonal antibody using different concentrations of cell cultures infected with other avian pathogens such as ORT (Omithobacterium rhinotracheale), ILTXf (avian infectious Laringotracheitis virus), NDV (NewCastle virus) and aMPV (Avian metapneumovirus) Direct ELISA. The dashed lines represent the cut-off point which was calculated as the average of the absorbencies obtained at 3mg / mL + 2DE. cut was taken in order to evaluate saturations of non-specific antigens that lead to cross-reactivity by the monoclonal antibody 1G7G8.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN DESCRIPTION OF THE INVENTION
La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología y la industria farmacéutica aviar, en particular con el diagnostico mediante la obtención de pruebas diagnósticas del tipo tira inmunocromatográfica (TIC) para la detección de Avibacterium paragallinarum en aves con coriza infecciosa (Cl) y el síndrome de cabeza hinchada (SCH). The present invention is related to the field of biotechnology and the avian pharmaceutical industry, in particular to the diagnosis by obtaining diagnostic tests of the immunochromatographic strip type (ICT) for the detection of Avibacterium paragallinarum in birds with infectious coryza (Cl) and swollen head syndrome (SCH).
La presente invención consiste en un sistema inmunocromatográfico en el cual se utilizan anticuerpos monoclonales de captura y/o detección que permiten identificar a la proteína tonB-dT presente en muestras biológicas de un ave con signos clínicos de la enfermedad de Cl, mediante el uso de anticuerpos específicos contra epítopes conservados de la proteína (tonB-dT). En ese ^entido, para el desarrollo de la presente invención el trabajo se dividió en 4 etapas: The present invention consists of an immunochromatographic system in which monoclonal antibodies of capture and / or detection are used that allow to identify the tonB-dT protein present in biological samples of a bird with clinical signs of Cl disease, through the use of specific antibodies against conserved protein epitopes (tonB-dT). In that sense, for the development of the present invention the work was divided into 4 stages:
1) Bioinformática: Se identificaron proteínas candidatas en base a la información genómica disponible y se identificaron péptidos (14 aminoácidos de longitud) inmunógenos. 1) Bioinformatics: Candidate proteins were identified based on the available genomic information and immunogenic peptides (14 amino acids in length) were identified.
2) Producción de anticuerpos policlonales: Se sintetizaron los péptidos seleccionados y se emplearon para inmunizar conejos (New-Zeland) para luego obtener anticuerpos policlonales (AcP) y estos fueron evaluados en formatos de western blot (WB) y ELISA frente a derivados (lisados y sobrenadantes) de Avibacterium paragallinarum y aMPV. 2) Production of polyclonal antibodies: Selected peptides were synthesized and used to immunize rabbits (New-Zeland) to then obtain polyclonal antibodies (AcP) and these were evaluated in western blot (WB) and ELISA formats against derivatives (lysates) and supernatants) of Avibacterium paragallinarum and aMPV.
3) Producción de anticuerpos monoclonales: se continuo con aquellos péptidos inmunógenos que dieron origen a los AcP con una correcta reactividad y especificidad, dichos péptidos fueron empleados para inmunizar ratones BALB/C, luego se obtuvo el bazo para los ensayos de obtención de hibridqmas, selección de clonas productoras y purificación de anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos monoclonales (Am) fueron evaluados en formatos de Western blot y ELIS^. 4) Desarrollo de un kit inmunocromatográfico. 3) Production of monoclonal antibodies: those immunogenic peptides that gave rise to the AcP were continued with a correct reactivity and specificity, said peptides were used to immunize BALB / C mice, then the spleen was obtained for the hybridoma obtaining assays, selection of producing clones and purification of monoclonal antibodies. These monoclonal antibodies (Am) were evaluated in Western blot and ELIS ^ formats. 4) Development of an immunochromatographic kit.
Una descripción de la invención consiste en un kit diagnóstico para detección de coriza infecciosa y el síndrome de la cabeza hinchada en aves. Para lo cual se realizó una selección por bioinformática de candidatos antigénicos. Luego se realizó la producción de antígenos candidatos seleccionados. En la etapa siguiente se obtuvieron los anticuerpos específicos a los antígenos seleccionados. Primero como anticuerpos policlonales (AcP) y luego como monoclonales (Am), para luego proceder con la obtención del hibridoma específico. Y finalmente se realizó la obtención del dispositivo de inmunoensayo, en donde dicho dispositivo comprende una tira inmunocromatográfica. A description of the invention consists of a diagnostic kit for detection of infectious coryza and swollen head syndrome in birds. For which a bioinformatics selection of antigenic candidates was made. Then the production of selected candidate antigens was performed. In the next stage the antibodies specific to the selected antigens were obtained. First as polyclonal antibodies (AcP) and then as monoclonal antibodies (Am), then proceed with obtaining the specific hybridoma. And finally the immunoassay device was obtained, wherein said device comprises an immunochromatographic strip.
Del genoma de Avibacterium paragallinarum Se seleccionó una proteína tonB-dT, de la cual se obtuvo el péptido tonB-dT-AvP-12 de secuencia SEQ ID NO: 1. El hibridoma (1G7G8) produce el anticuerpo que reconoce al péptido tonB-dT-AvP-12 y este tiene la secuencia SEQ ID NO: 1. El anticuerpo monoplonal, (ver siguiente tabla), reconoce la siguiente secuencia específica de aminoácidos (aa) SEQ ID NO: 1 , considerar que la C al final es un puente de unión a la molécula portadora para la inmunización.  From the genome of Avibacterium paragallinarum A tonB-dT protein was selected, from which the tonB-dT-AvP-12 peptide of sequence SEQ ID NO was obtained: 1. The hybridoma (1G7G8) produces the antibody that recognizes the tonB-dT peptide -AvP-12 and this has the sequence SEQ ID NO: 1. The monoplonal antibody, (see following table), recognizes the following specific amino acid sequence (aa) SEQ ID NO: 1, consider that the C at the end is a bridge binding to the carrier molecule for immunization.
Organismo Nombre del péptido Secuencia (aa) Organism Peptide Name Sequence (aa)
Avibacterium TonB-dT-AvP-12 NPLNAEDIEISKGGC paragallinarum  Avibacterium TonB-dT-AvP-12 NPLNAEDIEISKGGC paragallinarum
Para efectos de la presente invención: For purposes of the present invention:
- 1 G7G8 Hybridoma- AvP-FARVET e hibridoma 1G7G8 se tratan del mismo hibridoma. - 1 G7G8 Hybridoma- AvP-FARVET and hybridoma 1G7G8 treat the same hybridoma.
- El anticuerpo monoclonal producido por dicha hibridoma se llama: anticuerpo monoclonal 1G7G8. - The monoclonal antibody produced by said hybridoma is called: monoclonal antibody 1G7G8.
En un aspecto, la presente invención da a conocer un método para determinar la predisposición de un individuo a desarrollar una afección o enfermedad de coriza infecciosa o cabeza hinchada, comprendiendo el método: (a) someter una muestra a inmunocromatografía utilizando un dispositivo ¡nmunocromatográfico que comprende una membrana que tiene un anticuerpo de captura unido a la misma en una zona de ensayo, en el que el anticuerpo de captura es capaz de unirse con un analito, y en el que el dispositivo comprende además una estructura conjugada fluídicamente acoplada a la membrana en un extremo próximo, de manera que la estructura conjugada comprende un anticuerpo detector que tiene una fracción informadora conjugada y el analito es una proteína (tonB-dT) presente en una muestra biológica de un ave, en el que el anticuerpo de captura es: anticuerpo monoclonal 1G7G8, producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01 ; y en el que el anticuerpo detector es: anticuerpo monoclonal 1G7G8, producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01 , yIn one aspect, the present invention discloses a method for determining the predisposition of an individual to develop an infectious coryza condition or disease or swollen head, the method comprising: (a) subjecting a sample to immunochromatography using an immunochromatographic device comprising a membrane having a capture antibody bound thereto in a test zone, in which the capture antibody is capable of binding with an analyte, and in that the device further comprises a conjugate structure fluidically coupled to the membrane at a near end, such that the conjugate structure comprises a detector antibody having a conjugated reporter fraction and the analyte is a protein (tonB-dT) present in a sample biological of a bird, in which the capture antibody is: monoclonal antibody 1G7G8, produced by hybridoma cells deposited with Accession No. 200218-01; and wherein the detector antibody is: monoclonal antibody 1G7G8, produced by hybridoma cells deposited with Accession No. 200218-01, and
(b) determinar una señal en la zona de ensayo, en la que la presencia de una señal en la zona de ensayo es Indicativa de la predisposición del ave a desarrollar la afección o enfermedad. (b) determine a signal in the test zone, in which the presence of a signal in the test zone is indicative of the predisposition of the bird to develop the condition or disease.
La presente invención, en otros aspectos, da a conocer un kit que comprende: The present invention, in other aspects, discloses a kit comprising:
(a) un dispositivo ¡nmunocromatográfico según |a presente invención; y (b) un anticuerpo de detección que tiene un fragmento informador conjugado al mismo; en una realización, el anticuerpo de detección es el anticuerpo monoclonal 1G7G8 producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01 , en el que el anticuerpo está marcado con un fragmento informador.  (a) an immunochromatographic device according to the present invention; and (b) a detection antibody having a reporter fragment conjugated thereto; In one embodiment, the detection antibody is the 1G7G8 monoclonal antibody produced by hybridoma cells deposited with Access No. 200218-01, in which the antibody is labeled with a reporter fragment.
En otro aspecto, la presente invención da a conocer un kit que comprende el anticuerpo monoclonal 1G7G8 producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01. In another aspect, the present invention discloses a kit comprising the 1G7G8 monoclonal antibody produced by hybridoma cells deposited with Accession No. 200218-01.
En otros aspectos, el dispositivo y los reactivos para llevar a cabo el inmunoensayo pueden envasarse en forma de un kit. Por ejemplo, dicho kit puede incluir un dispositivo de ensayo apropiado, reactivos de anticuerpos y/o reactivos para el desarrollo del ensayo, tales como soluciones tampón y/o reactivos para la detección del marcador elegido, si es necesario. En algunos aspectos, la presente invención da a conocer un kit para determinar la presencia de una proteína (tonB-dT) en una muestra biológica de un ave, comprendiendo dicho kit un dispositivo tal como el que se describe en la presente memoria descriptiva, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones de utilización. In other aspects, the device and reagents for carrying out the immunoassay can be packaged in the form of a kit. For example, said kit may include an appropriate test device, antibody reagents and / or reagents for the development of the assay, such as buffer solutions and / or reagents for the detection of the chosen marker, if necessary. In some aspects, the present invention discloses a kit for determining the presence of a protein (tonB-dT) in a biological sample of a bird, said kit comprising a device such as that described herein, optionally with reagents and / or instructions for use.
En otras realizaciones, el kit puede incluir además opcionalmente otros materiales/componentes deseables desde un punto de vista comercial y del usuario final, entre los que incluyen lancetas, soluciones tampón (por ejemplo, Solución Jampón de muestra, diluyentes, filtros, capilares, apujas y/o jeringas, por ejemplo, para recoger/obtener una muestra biológica. In other embodiments, the kit may optionally also include other desirable materials / components from a commercial and end-user point of view, including lancets, buffer solutions (eg, Sample buffer solution, diluents, filters, capillaries, punches and / or syringes, for example, to collect / obtain a biological sample.
En otras realizaciones adicionales, el kit puede incluir además un sistema que permite la detección de los resultados del ensayo. Los resultados se pueden detectar visualmente o instrumentalmente dependiendo de la marca presente en los complejos. En una realización preferente, los resultados se detectan visualmente. In other additional embodiments, the kit may also include a system that allows the detection of test results. The results can be detected visually or instrumentally depending on the brand present in the complexes. In a preferred embodiment, the results are detected visually.
La presente invención utiliza una hibridoma 1G7G8, el cual ha sido depositado en un depositario Internacional con fecha anterior a la presentación de la presente invención ante una Oficina de Patentes. The present invention utilizes a 1G7G8 hybridoma, which has been deposited in an International Depositary prior to the presentation of the present invention before a Patent Office.
Respecto al hibridoma de la presente invención se debe tener en cuenta lo siguiente: -El nombre del hibridoma es 1G7G8 Hybridoma- AvP-FARVET. Regarding the hybridoma of the present invention, the following should be taken into account: -The name of the hybridoma is 1G7G8 Hybridoma- AvP-FARVET.
-El nombre del Depositario Internacional es: Autoridad Depositaría Internacional de Canadá: Agencia de Salud Pública de Canadá Laboratorio Nacional de Microbiología. El número de acceso es 200218-01.  -The name of the International Depositary is: Canada International Depositary Authority: Public Health Agency of Canada National Microbiology Laboratory. The access number is 200218-01.
-El depósito ha sido realizado de acuerdo con Ios lineamientos del T retado de Budapest.-The deposit has been made in accordance with the guidelines of the Budapest Challenge.
(Ver Certificado de Depósito). (See Certificate of Deposit).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
I.- Bioinformática: Análisis de las proteínas de Avibacterium paragallinarum I.- Bioinformatics: Analysis of Avibacterium paragallinarum proteins
Análisis de los genomas de Avibacterium paragallinarum: Analysis of the genomes of Avibacterium paragallinarum:
Del genoma de Avibacterium paragallinarurp publicado por nuestros laboratorios FARVET (Requena, D. et al 2013) se extrajeron todas las proteínas predichas mediante anotación automática. Para obtener información relativa a la membrana citoplasmática, estas proteínas fueron analizadas en el prograrpa SignalP 4.1. De los resultados de este análisis, son de interés las proteínas secretorias y transmembrana, pues tienen regiones expuestas al medio extracelular, Sin embarco, las proteínas de 2 o más regiones transmembrana son complejas de modelar computacionalmente y presentan problemas para conservar su estructura al ser expresadas. Por ello, de este subgrupo se trabajará solamente con las proteínas con 1 región transmembrana.  From the genome of Avibacterium paragallinarurp published by our FARVET laboratories (Requena, D. et al 2013) all predicted proteins were extracted by automatic annotation. To obtain information regarding the cytoplasmic membrane, these proteins were analyzed in the SignalP 4.1 program. Of the results of this analysis, secretory and transmembrane proteins are of interest, since they have regions exposed to the extracellular environment. However, proteins from 2 or more transmembrane regions are complex to compute modeling and present problems to preserve their structure when expressed. . Therefore, this subgroup will only work with proteins with 1 transmembrane region.
Como resultado del análisis, se obtuvo un pool de 180 proteínas secretorias y 89 con solo una región transmembrana. Nuestros laboratorios (FARVET) además cuentan con los genomas de las 9 cepas de referencia del esquema de serotipificación de Kume (A1 - A4, B1, C1-C4) y dos genomas de dos cepas más provenientes de aislados locales. Entonces, para verificar que las 180 proteínas secretorias y 89 con una región transmembrana estén presentes en la mayoría (je los especímenes a detectar, se realizó una comparación por BLAST de nuestro pool proteínas candidatas contra los otros genomas de Avibacterium paragallinarum, considerando una identidad mínima del 90% para quedamos con las proteínas más conservadas. Esto permitió reducir el set de proteínas candidatas a un grupo de 16 proteínas secretorias y 17 proteínas con solamente una región transmembrana. Estas proteínas se analizaron con el objetivo de encontrar regiones conservadas y expuestas al solvente. As a result of the analysis, a pool of 180 secretory proteins and 89 with only one transmembrane region was obtained. Our laboratories (FARVET) also have the genomes of the 9 reference strains of the Kume serotyping scheme (A1 - A4, B1, C1-C4) and two genomes of two more strains from local isolates. Then, to verify that the 180 secretory proteins and 89 with a transmembrane region are present in the majority (ie the specimens to be detected, a comparison was made by BLAST of our pool candidate proteins against the other genomes of Avibacterium paragallinarum, considering a minimal identity of 90% to keep the most conserved proteins.This allowed reducing the set of candidate proteins to a group of 16 secretory proteins and 17 proteins with only one transmembrane region.These proteins were analyzed with the aim of finding regions conserved and exposed to the solvent .
Búsqueda de regiones expuestas y conservadas en las proteínas de Avibacterium paragallinarum: Se analizaron las proteínas restantes de los dos grupos, las proteínas secretorias (PS) y las proteínas que presentan una región transmembrana (PTM). Search for exposed and conserved regions in the proteins of Avibacterium paragallinarum: The remaining proteins of the two groups, the secretory proteins (PS) and the proteins presenting a transmembrane region (PTM) were analyzed.
Predicción de exposición Exposure Prediction
Se usó el servidor NetSurfP ver. 1.1. (Protein Surface Accessibility and Secundary Structure Predictions) para la predicción de Ias regiones expuestas y/o de superficie para cada proteína. The NetSurfP server ver was used. 1.1. (Protein Surface Accessibility and Secundary Structure Predictions) for the prediction of the exposed and / or surface regions for each protein.
De la predicción, se obtuvieron varios fragnpentos (péptidos) candidatos por cada proteína.  From the prediction, several candidate fragnpents (peptides) were obtained for each protein.
PS: se obtuvo 37 péptidos expuestos. PS: 37 exposed peptides were obtained.
P1TM: se obtuvo 28 péptidos expuestos.  P1TM: 28 exposed peptides were obtained.
Predicción de conservación Conservation Prediction
De las proteínas analizadas 24 fueron consideradas expuestas por la predicción CNF de las cuales 19 presentan una estructura de únicamente loop, mientras que 2 fueron consideradas expuestas por threading, con modelos de calidad aceptable.  Of the analyzed proteins 24 were considered exposed by the CNF prediction of which 19 have a loop-only structure, while 2 were considered exposed by threading, with models of acceptable quality.
Búsqueda de regiones expuestas y conservadas en las proteínas de Avibacterium paragallinarum: Search for exposed and conserved regions in the proteins of Avibacterium paragallinarum:
Además, se analizó el pool de proteínas candidatas (16 PS y 17 P1TM) con la finalidad de descartar posible reacción cruzada con otros patógenos, los cuales fueron identificados por su presencia en los pollos de granjas comerciales.  In addition, the pool of candidate proteins (16 PS and 17 P1TM) was analyzed in order to rule out possible cross-reaction with other pathogens, which were identified by their presence in commercial farm chickens.
Tras el análisis para descartar reacción cruzada, de las 33 proteínas totales, tres fueron completamente descartadas pues tenían una identidad de más del 98% y cobertura del 100% con proteínas reportadas de la lista de patógenos a evitar. De los 30 restantes, se obtuvo tres candidatos muy buenos, los cuplés solo alcanzan identidades de hasta 37% y en regiones pequeñas (<60aa) con las proteínas de los patógenos a evitar. Además, un segundo set de 5 proteínas que Ilega a alcanzar hasta 49%. En total nos quedan 8 (7 P1TM y 1PS) Las otras 22 proteínas tienen identidades maypres (alrededor del 73%) y en hits largos (75-100% de la longitud total de la proteína) con las proteínas de los patógenos a evitar. Por ello se determinó que los mejores candidatps los cuales se muestran en la siguiente tabla: After analysis to rule out cross-reaction, of the 33 total proteins, three were completely discarded as they had an identity of more than 98% and 100% coverage with reported proteins from the list of pathogens to avoid. Of the remaining 30, three very good candidates were obtained, the cuplés only reach identities of up to 37% and in small regions (<60aa) with the proteins of the pathogens to avoid. In addition, a second set of 5 proteins that reaches up to 49%. In total we have 8 (7 P1TM and 1PS) The other 22 proteins have Maypres identities (around 73%) and in long hits (75-100% of the total length of the protein) with the pathogen proteins to avoid. Therefore, it was determined that the best candidates are shown in the following table:
Tabla 1: Óptimos candidatos a analizar. Table 1: Optimal candidates to analyze.
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Para el tipo de estrategia propuesta, son más adecuadas las proteínas secretoriaspues pueden ser capturadas directamente de la muestra infectada sin necesidad de un procesamiento adicional. Del cuadro anterior la proteína“pseudogen_01342" (tonB- dependent Receptor Plug domain protein), la pual por fines prácticos fue denominada “tonB-dT” se presentó como el mejor candidato para el desarrollo del test de inmunodiagnóstico. Dicha secuencia que fue extraída del genoma de una cepa de Avibacterium paragallinarum fue depositada ep la base de datos del NCBI-GENBANK bajo el código de acceso: MG242130. For the type of strategy proposed, secretory proteins are more suitable since they can be captured directly from the infected sample without the need for further processing. From the previous table the protein "pseudogen_01342" (tonB-dependent Plug domain protein Receptor), the pual for practical purposes was called "tonB-dT" was presented as the best candidate for the development of the immunodiagnostic test. This sequence was extracted from the Genome of a strain of Avibacterium paragallinarum was deposited in the NCBI-GENBANK database under the access code: MG242130.
II.- Producción de Anticuerpos Policlonales II.- Production of Polyclonal Antibodies
Selección de péptidos antigénicos en las proteínas candidatas Selection of antigenic peptides in candidate proteins
Mediante el uso de los programas BEBIPREP y OPTIMUM ANTIGEN (Laboratorios Genscript) se realizó la elección de péptidos para el diseño de anticuerpos, esto permitió identificar a las secuencias elegidas por los análisis bioinformáticos. De esta manera se seleccionó en la proteína (tonB-dT) de Avibacterium paragallinarum una lista de péptidos candidatos. Tabla 2: Lista de péptidos antigénicos que fueron sintetizados. Through the use of the BEBIPREP and OPTIMUM ANTIGEN (Genscript Laboratories) programs, the selection of peptides for the design of antibodies was made, this allowed to identify the sequences chosen by the bioinformatic analyzes. In this way, a list of candidate peptides was selected in the protein (tonB-dT) of Avibacterium paragallinarum. Table 2: List of antigenic peptides that were synthesized.
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Con los 6 péptidos sintetizados se produjeron apticuerpos policlonales en conejos (New- Zeland) los cuales fueron evaluados por Western blot y ELISA y sus resultados se muestran en la tabla 3.  With the 6 synthesized peptides polyclonal apticibodies were produced in rabbits (New-Zeland) which were evaluated by Western blot and ELISA and their results are shown in table 3.
La correspondencia con el peso molecular (aproximadamente 90kDa) indicaría que se trataría de la proteína tonB-dT. AcP-12 y 18 se tratan de los anticuerpos policlonales 12 y 18 contra los cultivos de Avibacterium paragallinarum (Figura 1).  The correspondence with the molecular weight (approximately 90kDa) would indicate that it would be the tonB-dT protein. AcP-12 and 18 are about polyclonal antibodies 12 and 18 against cultures of Avibacterium paragallinarum (Figure 1).
Ensayos de ELISA empleando anticuerpos policlonales Los antígenos (péptidos, lisados o diluciones de sobrenadantes de los cultivos de Avibacterium paragallinarum) fueron diluidos a en PBS y se agregó 100 mI a cada pocilio de la placa de ELISA y se dejó a 4°C durante toda la noche. Al día siguiente se lavó 3 veces con buffer de lavado (PBS - Tween 20 (0.05% v/v)). Luego se colocó 100 mL de la solución de bloqueo (buffer fosfato salino, pH 7.4 al 10% suero fetal bovino) en cada pozo y se dejó incubando durante 1 hora. Luego se lavó la placa durante 3 veces y se colocó 100 mL de AcP-12 o AcP-18, se incubo a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego se lavó 4 veces la placa y se colocó 100 mL del anticuerpo secundario conjugado anti-rabit-HRP preparado en PBS y se incubó durante 2 horas. Luego se lavó 3 veces la placa, se agregó 100 mL de la solución reveladora de TMB (3,3’, 5,5’- tetramethylbenzidina), se detuvo la reacción agregando 50 mL de solución stop (H2SO4 2N) y las absorbencias fueron obtenidas a 450nm utilizando un lector de ELISA. ELISA assays using polyclonal antibodies The antigens (peptides, lysates or dilutions of supernatants from the Avibacterium paragallinarum cultures) were diluted in PBS and 100 ml was added to each well of the ELISA plate and left at 4 ° C overnight. The next day it was washed 3 times with wash buffer (PBS-Tween 20 (0.05% v / v)). Then 100 mL of the blocking solution (phosphate buffered saline, pH 7.4 at 10% fetal bovine serum) was placed in each well and left to incubate for 1 hour. The plate was then washed for 3 times and 100 mL of AcP-12 or AcP-18 was placed, incubated at room temperature for 2 hours. The plate was then washed 4 times and 100 mL of the secondary anti-rabit-HRP conjugate antibody prepared in PBS was placed and incubated for 2 hours. The plate was then washed 3 times, 100 mL of the TMB developer solution (3.3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine) was added, the reaction was stopped by adding 50 mL of stop solution (H2SO4 2N) and the absorbencies were obtained at 450nm using an ELISA reader.
Con los ensayos de ELISA se evaluó la capacidad de detección de AcP frente a los péptidos utilizados para su producción. Se observó diferencias estadísticas a concentraciones de 125; 62.5 y 31.25 ng/ml (Fjgura 2). With ELISA assays, the ability to detect AcP against the peptides used for its production was evaluated. Statistical differences were observed at concentrations of 125; 62.5 and 31.25 ng / ml (Figure 2).
Mediante ensayos ELISA se procedió a la evajuación de la capacidad de detección de AcP-12 (diluciones) frente a cultivos bacterianos (lisados y sobrenadantes) a una concentración de 0.3mg/ml (Figura 3). The ELP assays were used to evacuate the detection capacity of AcP-12 (dilutions) against bacterial cultures (lysates and supernatants) at a concentration of 0.3mg / ml (Figure 3).
De igual forma se realizó ensayos ELISA para evaluar la capacidad de detección de AcP-18 (diluciones) frente a cultivos bacterianos (lisados y sobrenadantes) a una concentración de 0.3mg/ml (Figura 4). Likewise, ELISA assays were carried out to evaluate the detection capacity of AcP-18 (dilutions) against bacterial cultures (lysates and supernatants) at a concentration of 0.3mg / ml (Figure 4).
Se procedió a la evaluación de la especificidad de AcP -12 frente a otros patógenos aviares. Se establecieron puntos de corte para pliscriminar entre una reactividad positiva y negativa. Se agregó otros patógenos que comparten la misma zona de infección en el ave que Avibacterium paragallinarum, y de esta forma se comprueba la especificidad (Figura 5). The specificity of AcP -12 was evaluated against other avian pathogens. Cut-off points were established to discriminate between positive and negative reactivity. Other pathogens that share the same area of infection in the bird as Avibacterium paragallinarum were added, and in this way the specificity is checked (Figure 5).
Se procedió a la evaluación de la especificidad de AcP -18 frente a otros patógenos aviares. Se establecieron puntos de corte para ¡discriminar entre una reactividad positiva y negativa. Se agregó otros patógenos que coryiparten la misma zona de infección en el ave que Avibacterium paragallinarum, y de esta forma se comprueba la especificidad (Figura 6). The specificity of AcP -18 was assessed against other avian pathogens. Cut-off points were established to discriminate between positive and negative reactivity. Other pathogens that share the same area of infection in the bird as Avibacterium paragallinarum were added, and in this way the specificity is checked (Figure 6).
Finalmente se realizó ensayos de ELISA en formato sándwich, en los que se observó una mayor reactividad positiva para AcP-18 comparado con AcP-12 cuando estos fueron utilizados como anticuerpos de captura en combinación con AcP-12 como anticuerpo de detección. El formato sándwich fue: arriba AcP-12 para detección y debajo de captura AcP-12 y AcP-18 (Figura 7). Finally, ELISA assays were performed in sandwich format, in which a higher positive reactivity for AcP-18 compared to AcP-12 was observed when these were used as capture antibodies in combination with AcP-12 as detection antibody. The sandwich format was: AcP-12 above for detection and below AcP-12 and AcP-18 capture (Figure 7).
Asimismo, se observó una mayor reactividad positiva para AcP-18 comparado con AcP- 12 cuando estos fueron utilizados como anticuerpos de captura en combinación con Acp-18 como anticuerpo de detección. El formato sándwich fue: arriba AcP-18 para detección y debajo de captura AcP-12 y AcP-18 (Figura 8). Likewise, a higher positive reactivity was observed for AcP-18 compared to AcP-12 when they were used as capture antibodies in combination with Acp-18 as detection antibody. The sandwich format was: AcP-18 above for detection and below AcP-12 and AcP-18 capture (Figure 8).
Tabla 3.- Toma de acciones durante el desarrollo de la invención (Péptidos, policlonales hasta producción de monoclonales). Table 3.- Taking actions during the development of the invention (Peptides, polyclonal until monoclonal production).
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W.B. Ensayos de western blot, presencia de blinda reactiva esperada.  W.B. Western blot tests, presence of expected reactive shield.
ELISA: Reactividad y especificidad firentq a los antígenos de Avibacterium paragallinarum. III.- Producción de anticuerpos monoclonales ELISA: Firentq reactivity and specificity to the antigens of Avibacterium paragallinarum. III.- Production of monoclonal antibodies
En base a los resultados obtenidos con los AVR para Avibacterium paragallinarum, se toma la decisión de utilizar a los péptidos que dieron origen a los anticuerpos poiiclonaies -12 y -18, dentro de nuestra lista de péptidos antigénicos corresponderían al tonB-dT-Avp-12 y tonB-dT-AvP-18. Based on the results obtained with the AVRs for Avibacterium paragallinarum, the decision is made to use the peptides that gave rise to the polycyclone antibodies -12 and -18, within our list of antigenic peptides they would correspond to tonB-dT-Avp- 12 and tonB-dT-AvP-18.
Con los antígenos seleccionados se hiperinmunizaron ratones BALB/C para luego extraer los bazos y llevar a cabo ensayos de fgsión celular con células de mieloma de ratón para obtener células inmortales o linfocitos B inmortales (hibridomas) los cuales pueden ser cultivados en frascos de cultivo para que produzcan anticuerpos monoclonales específicos al antígeno utilizado para los ensayos de inmunizaciones. De esta forma se pueden cultivar los hibridomas pn cuyos medios de cultivos se pueden obtener anticuerpos monoclonales de forma cqnstante. With the selected antigens, BALB / C mice were hyperimmunized to then extract the spleens and carry out cell fusion tests with mouse myeloma cells to obtain immortal cells or immortal B lymphocytes (hybridomas) which can be cultured in culture bottles for that produce monoclonal antibodies specific to the antigen used for immunization assays. In this way, pn hybridomas can be cultured whose culture media can obtain monoclonal antibodies in a constant way.
Protocolo para fusión de células/obtención de hibridomas. Protocol for cell fusion / obtaining hybridomas.
Para esta etapa de formación de monoclonales se requiere de un bioterio especializado para la crianza de ratones de la raza BALB/C. Se siguieron protocolos generales, el mismo que es descrito a continuación: For this stage of monoclonal formation, a specialized bioterium is required for the breeding of BALB / C mice. General protocols were followed, the same as described below:
A.- Inmunización A.- Immunization
1. Se utilizó ratones hembra BALB/C de 8 a 10 semanas de edad  1. BALB / C female mice 8 to 10 weeks old were used
2. Los ratones BALB/C fueron inmunizados tres veces: día 0, día 14 y día 21 con el péptido de interés, el cual estuvo en una concentración de 100 μg del péptido/antígeno.  2. BALB / C mice were immunized three times: day 0, day 14 and day 21 with the peptide of interest, which was at a concentration of 100 μg of the peptide / antigen.
3. Se tomó muestra de sangre (suero) antes de cada inmunización para la titulación de sus anticuerpos, el cual se espera aumente en el tiempo de 100 a 1 ,000 veces 3. Blood sample (serum) was taken before each immunization for the titration of its antibodies, which is expected to increase in time from 100 to 1,000 times
4. Se realizó un“booster” utilizando el antigeno por tres días consecutivos (día 28, día 29 y día 30) 4. A “booster” was performed using the antigen for three consecutive days (day 28, day 29 and day 30)
5. A los 31 días post-inmunización se aisló las células de bazo (esplenocitos). 5. At 31 days post-immunization, spleen cells (splenocytes) were isolated.
B.- Fusión de esplenocitos de ratón v línea celular de mieloma. B.- Fusion of mouse splenocytes and myeloma cell line.
6. Se utilizó la línea celular de mieloma SP2/0.  6. The myeloma cell line SP2 / 0 was used.
7. Aislamiento de esplenocitos de ratón B^LB/C inmunizados: Los ratones BALB/C Inmunizados fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue aislado y colocado en placa Petri que contenía 5 mL de medio SFM Hyb al 10 % de suero fetal bovino (SFB). 7. Isolation of immunized B ^ LB / C mouse splenocytes: Immunized BALB / C mice were sacrificed by cervical dislocation and the spleen was isolated and placed in a Petri dish containing 5 mL of 10% SFM Hyb medium of fetal bovine serum (SFB).
Las capas llpídlcas fueron removidas y el bazo fue cortado en pequeños pedazos y triturado con el objetivo de obtener esplenocitos en el medio.  The pelvic layers were removed and the spleen was cut into small pieces and crushed in order to obtain splenocytes in the middle.
Se tomó la suspensión de esplenocitos y se centrifugo a 1 ,000 rpm por 5 minutos.  The splenocyte suspension was taken and centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes.
Se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron los esplenocitos en 20 mL de medio SFM Hyb al 10% SFB.  The supernatant was removed and the splenocytes were resuspended in 20 mL of 10% SFM Hyb SFB medium.
Se contaron los esplenocitos y se mezcló directamente con la línea de células de mieloma.  Splenocytes were counted and mixed directly with the myeloma cell line.
8. Fusión celular:  8. Cellular fusion:
Se centrifugó la mezcla celular a 1 ,000 rpm por 5 minutos  The cell mixture was centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes
Se lavó el pellet celular con 25 mL de medio SFM Hyb y se centrifugó a 1 ,000 rpm por 5 minutos  The cell pellet was washed with 25 mL of SFM Hyb medium and centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes
Se eliminó el sobrenadante y se agregó lentamente a temperatura ambiente 1.5 mL de 50% PEG 1500 por cada 3 x 108 células mezcladas. The supernatant was removed and 1.5 mL of 50% PEG 1500 was added slowly at room temperature for every 3 x 10 8 mixed cells.
Se Incubó a por 1 minuto a 37°C  Incubated for 1 minute at 37 ° C
Se agregó muy lentamente 20 mL de medio SFM Hyb Se centrifugó a 1 ,000 rpm por 5 minutos, se descartó el sobrenadante y se agregaron 10 mL de me<jiio HAT y se sembraron en placas de 24 pocilios a una concentración de 106 células/pozo. Durante este proceso se aseguró una equitativa distribución de las células en cada pozo mediante una ligera agitación. 20 mL of SFM Hyb medium was added very slowly. It was centrifuged at 1,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded and 10 mL of HAT medium was added and seeded in 24-well plates at a concentration of 10 6 cells. /water well. During this process, an equitable distribution of the cells in each well was ensured by slight agitation.
Se Incubaron las placas en una Incubadora a 37°C en 5% de C02.  The plates were incubated in an Incubator at 37 ° C in 5% C02.
Luego después de 7 días se evaluó la producción de anticuerpos y se clasificó el subtipo de cada anticuerpo mediante ELISA.  Then after 7 days the antibody production was evaluated and the subtype of each antibody was classified by ELISA.
Los cultivos positivos de hlbridomas fueron almacenados en medio de cultivo suplementado con 10% de SFB y 10% de DiyiSO por cada 7 x 10a células por vial y guardados en nitrógeno líquido. Los viales con las 4 clonas obtenidas se muestran en la tabla 4. Tabla 4: Lista de las clonas. Positive hybridoma cultures were stored in culture medium supplemented with 10% SFB and 10% DiyiSO for every 7x10 to cells per vial and stored in liquid nitrogen. The vials with the 4 clones obtained are shown in table 4. Table 4: List of clones.
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Se procedió con estas 4 clonas a realizar los ensayos de descríopreservación, adaptación y producción de los anticuerpos monoclonales.  These 4 clones were carried out to perform the assays for the preservation, adaptation and production of monoclonal antibodies.
Las clonas fueron descriopreservadas y amplificadas en medio CD-Hybridome en escaladas de placas de 6-well, flask de 25 cm2, flask 75 cm2 y flask de 225 cm2. Cada repique celular se realizó esperando la confluencia de estas células los cuales duraron un tiempo de 3 días. The clones were described and amplified in CD-Hybridome medium in 6-well plate climbs, 25 cm2 flasks, 75 cm2 flasks and 225 cm2 flasks. Each cell ringing was performed waiting for the confluence of these cells which lasted a time of 3 days.
Ensayos de ELISA empleando anticuerpos monoclonales y póptidos. ELISA assays using monoclonal antibodies and peptides.
En cada repique se tomó muestras del sobrenadante de cultivos de hibridoma para evaluar la presencia de los anticuerpos monoclonales, así como su reactividad. Para evaluar dicha reactividad se emplearon los péptidos TonB-dt-AvP-12 y TonB-dt-AvP-18. Samples of the hybridoma culture supernatant were taken at each ring to assess the presence of the monoclonal antibodies, as well as their reactivity. To evaluate this reactivity, the TonB-dt-AvP-12 and TonB-dt-AvP-18 peptides were used.
Los péptidos fueron diluidos a 1 μg/ml y se agregó 100 mI por cada pocilio de la placa de ELISA (se repitió para cada dilución de péptido) y se incubó a 4°C durante toda la noche. The peptides were diluted to 1 μg / ml and 100 ml was added for each well of the ELISA plate (repeated for each peptide dilution) and incubated at 4 ° C overnight.
Al día siguiente se lavó 3 veces con buffer de lavado (PBS - Tween 20 (0.05% v/v)). Luego se colocó 100 mL de la solución de bloqueo (Buffer fosfato salino, pH 7.4 al 10% Suero fetal bovino) en cada pozo y se dejó incubando durante 1 hora. The next day it was washed 3 times with wash buffer (PBS-Tween 20 (0.05% v / v)). Then 100 mL of the blocking solution (Saline phosphate buffer, pH 7.4 at 10% Bovine fetal serum) was placed in each well and left to incubate for 1 hour.
Luego se lavó la placa durante 3 veces y se colocó 100 mL de las diluciones de los sobrenadantes de los cultivos de hibridomas pn PBS (1 :10; 1 :30; 1 :90; 1 :270; 1 :810; 1 :2,430), se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego se lavó 4 veces la placa y se colocó 100 mL del anticuerpo secundario conjugado anti-Mouse-HRP (lgG1 o lgG2b) preparado en PBS y se incubó durante 2 horas. Luego se lavó 3 veces la placa, se agregó 100 mL de la solución reveladora de TMB, se detuvo la reacción agregando 50 mL de solución stop (H2SO4 2N) y las absorbencias fueron obtenidas a 450nm utilizando un lector de ELISA. La evaluación de los primeros sobrenadantes pos muestra altos niveles de reactividad de los anticuerpos frente a los péptidos originales. Las 4 clonas presentaron una reactividad que disminuyó de forma proporcional a la dilución de los sobrenadantes. The plate was then washed 3 times and 100 mL of the dilutions of the supernatants of the pBS hybridoma cultures were placed (1: 10; 1: 30; 1: 90; 1: 270; 1: 810; 1: 2,430 ), incubated at room temperature for 2 hours. The plate was then washed 4 times and 100 mL of the anti-Mouse-HRP conjugated secondary antibody (lgG1 or lgG2b) prepared in PBS was placed and incubated for 2 hours. Then he washed the plate 3 times, 100 mL of the TMB developer solution was added, the reaction was stopped by adding 50 mL of stop solution (H2SO4 2N) and the absorbencies were obtained at 450 nm using an ELISA reader. The evaluation of the first post supernatants shows high levels of antibody reactivity against the original peptides. The 4 clones showed a reactivity that decreased proportionally to the dilution of the supernatants.
Tabla 5: Títulos de anticuerpos obtenidos de los cultivos de hibridomas. Table 5: Antibody titers obtained from hybridoma cultures.
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Todas las clonas en cultivos presentaron un título mayor a 1 :2,430.  All crop clones had a titer greater than 1: 2,430.
Los valores de ratio se obtuvieron de dividir las absorbencias de Elisa entre la absorbencia del blanco. Valores mayores a 2,1 fueron considerados como positivos. Evaluación de la reactividad de las clonas mediante ensayos de western blot  The ratio values were obtained by dividing the absorbances of Elisa by the absorbency of the target. Values greater than 2.1 were considered positive. Evaluation of the reactivity of the clones by western blot assays
Luego de realizar la adaptación de las clonas a su medio de crecimiento, se realizó una evaluación de reactividad de estos anticuerpos frente a los antígenos de Avibacteríum paragallinarum para establecer su nivel de reactividad empleando ensayos de Western Blot. Según estos resultados de las 4 clonas obtenidas sólo una de ellas presentó una reactividad positiva frente a los antígenos fie Avibacteríum paragallinarum y sus serovares, por lo cual se decidió seguir con la clona 1G7G8. Según estos ensayos se confirmó la reactividad de los serovares frente al anticuerpo monoclonal 1G7G8. De esta forma se confirmó la presencia de la proteína (tonB-dT) en los lisados y sobrenadantes de los distintos serovares de Avibacteríum paragallinarum (Figuras 9A y 9B). After adapting the clones to their growth medium, an evaluation of reactivity of these antibodies against the antigens of Avibacteríum paragallinarum was performed to establish their level of reactivity using Western Blot assays. According to these results of the 4 clones obtained, only one of them presented a positive reactivity against the antigens faithful Avibacteríum paragallinarum and its serovars, so it was decided to continue with clone 1G7G8. According to these tests, the reactivity of serovars against the 1G7G8 monoclonal antibody was confirmed. In this way the presence of the protein (tonB-dT) in the lysates and supernatants of the various serovars of Avibacteríum paragallinarum (Figures 9A and 9B) was confirmed.
Ensayos de ELISA empleando el anticuerpo monoclonal 1G7G8, Usados y sobrenadantes de los serovares de Avibacteríum paragallinarum. ELISA assays using monoclonal antibody 1G7G8, used and supernatants of the serovars of Avibacteríum paragallinarum.
Los antígenos (lisados o diluciones de sobrenadantes) fueron diluidos a en PBS y se agregó 100 pl a cada pocilio de la placa de ELISA y se dejó a 4°C durante toda la noche. Al día siguiente se lavó 3 veces con buffer de lavado (PBS - Tween 20 (0.05% v/v)). Luego se colocó 100 mL de la solución de bloqpeo (buffer fosfato salino, pH 7.4 al 10% suero fetal bovino) en cada pozo y se dejó incubando durante 1 hora. Luego se lavó la placa durante 3 veces y se colocó 100 mL del monoclonal 1G7G8 (5 μg/mL), se incubo a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego se lavó 4 veces la placa y se colocó 100 mL del anticuerpo secundario conjugado anti-Mouse-HRP (lgG1) preparado en PBS y se incubó durante 2 horas. Luego se lavó 3 veces la placa, se agregó 100 mL de la solución reveladora de TMB, se detuvo la reacción agregando 50 mL de solución stop (H2SO42N) y las absorbancias fueron obtenidas a 450nm utilizando un lector de ELISA. The antigens (lysates or dilutions of supernatants) were diluted in PBS and 100 pl was added to each well of the ELISA plate and left at 4 ° C overnight. The next day it was washed 3 times with wash buffer (PBS-Tween 20 (0.05% v / v)). Then 100 mL of the blocking solution (saline phosphate buffer, pH 7.4 at 10%) was placed fetal bovine serum) in each well and left to incubate for 1 hour. The plate was then washed for 3 times and 100 mL of monoclonal 1G7G8 (5 µg / mL) was placed, incubated at room temperature for 2 hours. The plate was then washed 4 times and 100 mL of the anti-Mouse-HRP conjugated secondary antibody (IgG1) prepared in PBS was placed and incubated for 2 hours. The plate was then washed 3 times, 100 mL of the TMB developer solution was added, the reaction was stopped by adding 50 mL of stop solution (H 2 SO 4 2N) and the absorbances were obtained at 450 nm using an ELISA reader.
Mediante los ensayos de ELISA se evaluó Ia reactividad del anticuerpo monoclonal 1G7G8 frente a los sobrenadantes de los cultivos (diluciones) y empleando lisados bacterianos previamente cuantificados (UFC/mL) de Avibacteríum paragallinarum. Se obtuvo una correcta cinética de reconocimientp por parte del anticuerpo 1G7G8 frente a los distintos UFC/mL y los sobrenadantes de cultivos bacterianos (Figura 10 y Figura 11 ). También, se procedió a evaluar la especificidad del anticuerpo 1G7G8 frente a distintos lisados de antígenos como: Virus de Newcastle (NDV), Laringotraqueitis infecciosa aviar (ILT), Omithobacteríum rhinotrpchaale (ORT) y Metapneumovirus aviar (aMPV) para establecer su especificidad (Figura 12). The ELISA assays evaluated the reactivity of the monoclonal antibody 1G7G8 against the culture supernatants (dilutions) and using previously quantified bacterial lysates (CFU / mL) of Avibacteríum paragallinarum. A correct recognition kinetics was obtained by the 1G7G8 antibody against the different CFU / mL and the bacterial culture supernatants (Figure 10 and Figure 11). Also, we proceeded to evaluate the specificity of the 1G7G8 antibody against different lysates of antigens such as: Newcastle virus (NDV), Avian infectious laryngotracheitis (ILT), Omithobacterium rhinotrpchaale (ORT) and Avian metapneumovirus (aMPV) to establish its specificity (Figure 12).
Tabla 6: Toma de acciones durante el desarrollo de la invención (desde la producción de monoclonales hasta desarrollo de las tiras). Table 6: Taking actions during the development of the invention (from monoclonal production to development of the strips).
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W.B. Ensayos de western blot, presencia de banda reactiva esperada.  W.B. Western blot tests, presence of expected reactive band.
ELISA: Reactividad y especificidad frente a los antígenos de Avibacterium paragallinarum.  ELISA: Reactivity and specificity against the antigens of Avibacterium paragallinarum.
IV.- Set de tiras inmunocromatográficas (TIC). IV.- Set of immunochromatographic strips (TIC).
Principio de la Prueba. Esta prueba rápida es un ensayo cualitativo para la detección de antígenos de Avibacterium paragallinarum. La prueba emplea una única combinación de anticuerpos monoclonales conjugados a oro y fijados en una fase sólida lo cual identifica selectivamente Avibacterium paragallinarum. Ias muestras aplicadas fluyen a través de una membrana hasta un dispositivo absorbente, los anticuerpos conjugados a oro se unen al antígeno de Avibacterium paragallinarum formando un complejo anticuerpo- antígeno. Este complejo es captado por otro anticuerpo ubicado en la zona TEST (T) produciendo una banda roja. En ausencia de Avibacterium paragallinarum no se formará banda en la zona“T”. El complejo continúa migrando hacia el dispositivo adsorbente, los anticuerpos no conjugados se unen a los anticuerpos en la zona de control (C) produciendo una banda roja demostrando que la prueba funciono correctamente. Principle of the Test. This rapid test is a qualitative test for the detection of Avibacterium paragallinarum antigens. The test employs a unique combination of monoclonal antibodies conjugated to gold and fixed in a solid phase which selectively identifies Avibacterium paragallinarum. The applied samples flow through a membrane to an absorbent device, the gold-conjugated antibodies bind to the Avibacterium paragallinarum antigen forming an antibody-antigen complex. This complex is captured by another antibody located in the TEST zone (T) producing a red band. In the absence of Avibacterium paragallinarum no band will be formed in the "T" zone. The complex continues to migrate to the adsorbent device, unconjugated antibodies bind to the antibodies in the control zone (C) producing a red band demonstrating that the test worked correctly.
Un set de tiras inmunocromatográficas (TIC) fue desarrollado para la rápida detección de Avibacterium paragallinarum. El anticuerpo monoclonal 1G7G8 fue utilizado, el cual identifica la proteína transportadora dependiente en Av. paragallinarum (tonB-dT). Este anticuerpo fue conjugado a partículas de oro y también fue empleado como anticuerpo de captura sobre una membrana. De los resultados presentados se puede inferir que el uso de un mismo anticuerpo 1G7G8 es válido para la detección y captura de la tonB-dT c|e Avibacterium paragallinarum. A set of immunochromatographic strips (TIC) was developed for the rapid detection of Avibacterium paragallinarum. The 1G7G8 monoclonal antibody was used, which identifies the dependent transporter protein in Av. Paragallinarum (tonB-dT). This antibody was conjugated to gold particles and was also used as a capture antibody on a membrane. From the results presented, it can be inferred that the use of the same 1G7G8 antibody is valid for the detection and capture of tonB-dT c | e Avibacterium paragallinarum.
Obtención de TICs. Obtaining ICTs.
1.- Síntesis de la proteína recombinante tonB-dT (rtonB-dT) de Av. paragallinarum Se obtuvo de forma recombinante la proteína tonB-dT en Escherichia coli (rtonB- dT) cuya secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 2, en la cual se muestran la cola de histidinas agregada al lado amino terminal de la proteína con fines de purificación. Luego de la purificación se realizó un en ensayo de SDS-PAGE para identificar en tonB-dT su peso molecular (~ 86.47kDa) y pureza (>85%). 2.- Evaluación de la combinación de anticuerpos 1G7G8 en las membranas. 1.- Synthesis of the recombinant protein tonB-dT (rtonB-dT) from Av. Paragallinarum The tonB-dT protein was recombinantly obtained in Escherichia coli (rtonB-dT) whose amino acid sequence is SEQ ID NO: 2, in which shows the histidine tail added to the amino terminal side of the protein for purification purposes. After purification, an SDS-PAGE test was performed to identify in tonB-dT its molecular weight (~ 86.47kDa) and purity (> 85%). 2.- Evaluation of the combination of 1G7G8 antibodies in the membranes.
Se realizó el ensayo de conjugación con partículas de oro al anticuerpo monoclonal 1G7G8 (Detección) y además se fijó este anticuerpo sin conjugar a la membrana (Captura). Se empleó muestras de lisados bacterianos diluidas 1 :1 con buffer diluyente y rtonB-dT (0.8 mg/mL) diluida 1/100 con diluyente.  The conjugation test with gold particles to the monoclonal antibody 1G7G8 (Detection) was performed and this antibody was also fixed without conjugating to the membrane (Capture). Samples of bacterial lysates diluted 1: 1 with diluent buffer and rtonB-dT (0.8 mg / mL) diluted 1/100 with diluent were used.
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XI anticuerpo 1G7G8 es bueno para ser usado pomo anticuerpo de captura y anticuerpo de detección de rtonB-dT para Avibacterium paragallinarum. 3.- Especificidad de la línea de anticuemos fijados en la membrana.  XI antibody 1G7G8 is good to be used as capture antibody and detection antibody of rtonB-dT for Avibacterium paragallinarum. 3.- Specificity of the line of anticuemos fixed in the membrane.
Este ensayo nos permitió identificar la reactividad de las membranas frente a patógenos relacionados con la enfermedad de Cl en Aves. Se obtuvieron valores de nula reactividad para las muestras empleadas. Metapneumovirus aviar = -; y Omithobacterium rhinotracheale = -.  This test allowed us to identify the reactivity of membranes against pathogens related to Cl disease in Birds. Zero reactivity values were obtained for the samples used. Avian metapneumovirus = -; and Omithobacterium rhinotracheale = -.
Evaluación de la TIC frente a muestras de ayes con Coriza Infecciosa (Cl). Evaluation of the ICT against samples of woes with Coriza Infecciosa (Cl).
Se evaluó el prototipo de las TICs en muestras biológicas provenientes de aves con sospecha de Cl provenientes de una granja local. Se compararon los resultados con los obtenidos por el aislado microbiológico. The prototype of the TICs in biological samples from birds with suspected Cl from a local farm was evaluated. The results were compared with those obtained by the microbiological isolate.
1. Materiales v métodos:  1. Materials and methods:
1. Material biológico:  1. Biological material:
Aves ponedoras (n=7) provenientes de una granja fueron enviadas a nuestras Instalaciones durante el mes de octubre del 2017. A partir de cabezas de aves con sospecha de Cl se colectó el moco nasal de las aves con la ayuda de una pipeta.  Laying birds (n = 7) from a farm were sent to our facilities during the month of October 2017. From the heads of birds with suspected Cl, the nasal mucus of the birds was collected with the help of a pipette.
2. Evaluación del Kit:  2. Kit Evaluation:
Las muestras colectadas (100 mL de moco y secreción) fueron colocadas en tubos de 2 mL previamente llenados con 100 mL de buffer de lisis y fueron homogenizados. Luego se tomaron 100 mL del homogenizado y se diluyeron con 100 mL del buffer diluyente del kit. De esta nueva mezcla se tomaron 100 mL para ser empleado en el prototipo del TIC. Para la obtención de resultados se esperó 30 minutos hasta la aparición de las bapdas rojas en la zona T y C.  The collected samples (100 mL of mucus and secretion) were placed in 2 mL tubes previously filled with 100 mL of lysis buffer and homogenized. Then 100 mL of the homogenate was taken and diluted with 100 mL of the diluent buffer of the kit. 100 mL were taken from this new mixture to be used in the ICT prototype. To obtain results, 30 minutes were expected until the appearance of the red bapdas in zone T and C.
3. Aislamiento microbiológico: Las cabezas de aves sospechosas fueron empleadas para realizar aislados microbiológicos para la caracterización de Avibacterium paragalfinarum , para lo cual se siguieron protocolos previamente publicados (Blackall J and Soriano- Vargas E., 2013). 3. Microbiological isolation: Suspect bird heads were used to perform microbiological isolates for the characterization of Avibacterium paragalfinarum, for which previously published protocols were followed (Blackall J and Soriano-Vargas E., 2013).
4. Análisis de resultados:  4. Analysis of results:
Se elaboró un cuadro de doble entrada con los resultados cualitativos de ambas las pruebas  A double entry table was prepared with the qualitative results of both tests
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Las aves provenientes de la granja presentaron los signos clínicos típicos de Cl, caracterizado por inflamación de los senos paranasales, jadeos, conjuntivitis, presencia de moco en las narinas y acumulación de material caseoso en los parpados. Luego se llevó a cabo la toma de muestra mediante aspiración del moco acumulado en los senos paranasales a través de las narinas. Con la muestra de las aves se llevó a cabo el ensayo con las tiras inmunocromatográficas del Kit, los ensayos fueron realizadas entre los 30-40 minutos en base a la aparición de las líneas en la zona TEST, se obtuvo reactividad en 6/7 aves evaluadas. The birds coming from the farm presented the typical clinical signs of Cl, characterized by inflammation of the sinuses, gasps, conjunctivitis, presence of mucus in the nostrils and accumulation of caseous material in the eyelids. The sampling was then carried out by aspiration of the mucus accumulated in the paranasal sinuses through the nostrils. With the sample of the birds the test was carried out with the immunochromatographic strips of the Kit, the tests were performed between 30-40 minutes based on the appearance of the lines in the TEST zone, it was obtained reactivity in 6/7 birds evaluated.
Las cabezas de las aves fueron empleadas para llevar a cabo el aislamiento microbiológico de Avibacterium paragallinarum. Según el análisis microbiológico se logró aislar Avibacterium paragallinarum en 6 de 7 (6/7) aves evaluadas, estos resultados fueron corroborados con los obtenidos con el kit. Bird heads were used to carry out the microbiological isolation of Avibacterium paragallinarum. According to the microbiological analysis, it was possible to isolate Avibacterium paragallinarum in 6 of 7 (6/7) birds evaluated, these results were corroborated with those obtained with the kit.
2. Comparación entre el aislamiento microbiológico v el kit. 2. Comparison between microbiological isolation and kit.
Los resultados obtenidos para ambas pruebas se presentan en la siguiente tabla. Tabla 7: Resultados obtenidos por el Aislamiento microbiológico y el kit.  The results obtained for both tests are presented in the following table. Table 7: Results obtained by the microbiological Isolation and the kit.
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Se elaboró un cuadro de doble entrada (Tabla p) con la información de la tabla 7, luego teniendo como referencia el aislamiento miprobiológico se obtuvieron valores de sensibilidad de 100% con intervalos de confianza (IC) al 95% (61 - 100), valores de especificidad de 100% con IC al 95% (20,7-100) y un valor de concordancia de 1 para el kit. A double entry box (Table p) was prepared with the information in Table 7, then having as reference the myprobiological isolation, sensitivity values of 100% were obtained with 95% confidence intervals (CI) (61-100), specificity values of 100% with 95% CI (20.7-100) and a concordance value of 1 for the kit.
Tabla 8: Cuadro de doble entrada para la obtención de la sensibilidad, especificidad y concordancia. Table 8: Double entry table for obtaining sensitivity, specificity and concordance.
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Un valor de concordancia de 1 obtenido entre el aislamiento microbiológico y el kit nos indica que ambas pruebas obtuvieron un 100% de concordancia entre sus resultados. El kit presentó un 100% de sensibilidad, especificidad y concordancia frente a la técnica de aislamiento microbiológico de Avibacterium paragallinarum.
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A concordance value of 1 obtained between the microbiological isolation and the kit indicates that both tests obtained 100% concordance between their results. The kit presented 100% sensitivity, specificity and concordance with the microbiological isolation technique of Avibacterium paragallinarum.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Dispositivo de inmunoensayo caracterizado porque comprende: 1. Immunoassay device characterized in that it comprises:
- Una membrana que tiene una zona de captura de proteína tonB-dT definida por un anticuerpo de captura inmovilizado en la misma; el mismo que reconoce a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1 : - A membrane having a tonB-dT protein capture zone defined by a capture antibody immobilized therein; the same that recognizes the amino acid sequence SEQ ID NO 1:
- Una zona de aplicación de muestra y una trayectoria de flujo desde la zona de aplicación de muestra a la zona de captura de proteína tonB-dT  - A sample application zone and a flow path from the sample application zone to the tonB-dT protein capture zone
- Una estructura conjugada situada en la trayectoria de flujo, cuya estructura conjugada comprende un reactivo de detección específico para tonB-Dt, siendo el reactivo de detección móvil o movilizable, en el que el anticuerpo de captura es: el anticuerpo monoclonal 1G7G8 producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01 ; y en el que el reactivo de detección es un anticuerpo detector seleccionado entre: anticuerpo monoclonal 1G7G8 producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01 , en donde dicho anticuerpo reconoce a la secuencia SEQ ID NO: 1  - A conjugate structure located in the flow path, whose conjugate structure comprises a detection reagent specific for tonB-Dt, the mobile or mobilizable detection reagent, in which the capture antibody is: the 1G7G8 monoclonal antibody produced by cells of hybridoma deposited with Access No. 200218-01; and wherein the detection reagent is a detector antibody selected from: 1G7G8 monoclonal antibody produced by hybridoma cells deposited with Accession No. 200218-01, wherein said antibody recognizes the sequence SEQ ID NO: 1
2. Dispositivo, según la reivindicación 1 , en el que la presencia o cantidad de un tonB-dT en una muestra de fluido se puede determinar por formación de un complejo entre el anticuerpo de captura y la proteína (tonB-dT) que puede encontrarse presente en la muestra de fluido. 2. Device according to claim 1, wherein the presence or amount of a tonB-dT in a fluid sample can be determined by forming a complex between the capture antibody and the protein (tonB-dT) that can be found present in the fluid sample.
3. Dispositivo, según la reivindicación 1 , en el que la presencia o cantidad de un tonB-dT en una muestra de fluido se puede determinar por formación de un complejo entre el anticuerpo de captura y la proteína (tonB-dT) que puede encontrarse presente en la muestrp de fluido.3. Dispositivo, según la reivindicación 1 , en el que el anticuerpq de captura es el anticuerpo monoclonal 1G7G8 producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01 y el anticuerpo detector es el anticuerpo monoclonal 1G7G8 producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01. 3. Device according to claim 1, wherein the presence or amount of a tonB-dT in a fluid sample can be determined by forming a complex between the capture antibody and the protein (tonB-dT) that can be found present in the fluid sample. 3. Device according to claim 1, wherein the capture antibody is 1G7G8 monoclonal antibody produced by hybridoma cells deposited with Accession No. 200218-01 and the detector antibody is 1G7G8 monoclonal antibody produced by hybridoma cells deposited with n Accession 200218-01.
4. Dispositivo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo detector está marcado con una fracción informadora. 4. Device according to any one of claims 1 to 3, wherein the detector antibody is labeled with an reporter fraction.
5. Dispositivo, según la reivindicación 4, en el que el anticuerpo detector es un anticuerpo detector conjugado de oro. 5. Device according to claim 4, wherein the detector antibody is a gold conjugate detector antibody.
6. Dispositivo, según la reivindicación 2, en el que una fuente de muestra de fluido es moco de las narinas de un ave. 6. Device according to claim 2, wherein a source of fluid sample is mucus from the nostrils of a bird.
7. Dispositivo, según la reivindicación 1 , en el que dicho dispositivo comprende:7. Device according to claim 1, wherein said device comprises:
- Una zona de aplicación de la muestra; - A sample application area;
- Una membrana microporosa que tiene upa zona de captura de proteína tonB-dT definida por un anticuerpo de captura inmovilizado a la misma, en el que el anticuerpo de captura es 1G7G8, producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01 ;  - A microporous membrane having a tonB-dT protein capture zone defined by a capture antibody immobilized therein, in which the capture antibody is 1G7G8, produced by hybridoma cells deposited with Accession No. 200218-01 ;
- Una trayectoria de flujo desde la zona de aplicación de la muestra a la zona de captura de la proteína tonB-dT de manera que la presencia o cantidad de la proteína tonB-dT en una muestra de fluido se puede determinar por formación de un complejo entre el anticuerpo de captura y la proteína tonB-dT que puede encontrarse presente en la muestra de fluido;  - A flow path from the sample application zone to the tonB-dT protein capture zone so that the presence or amount of the tonB-dT protein in a fluid sample can be determined by complex formation between the capture antibody and the tonB-dT protein that may be present in the fluid sample;
- Y una estructura conjugada situada en la trayectoria de flujo, de manera que la estructura conjugada comprende un reactivo de detección específico para la proteína tonB-dT siendo el reactivo de detección móvil o movilizable, de manera que el reactivo de detección es 1G7G8 conjugado de oro, producido por células de hibridoma depositadas con el n° de Acceso 200218-01.  - And a conjugate structure located in the flow path, so that the conjugate structure comprises a detection reagent specific for the tonB-dT protein being the mobile or mobilizable detection reagent, so that the detection reagent is conjugated 1G7G8 gold, produced by hybridoma cells deposited under Accession No. 200218-01.
8. Dispositivo, según la reivindicación 1 , en el que dicho dispositivo de ínmunoensayo es un dispositivo inmunocromatográfico que comprende una membrana que tiene un anticuerpo de captura unido a la misma en una zona de prueba, en el que el anticuerpo de captura es capaz de unirse con un analito y en el que el dispositivo comprende además una estructura conjugada acoplada fluidicamente a la membrana en un extremo próximo, de manera que la estructura conjugada comprende un anticuerpo detector que tiene una fracción informadora conjugada a la misma de manera que el analito es una proteína tonB-dT, presente en una muestra de fluido de un ave, en el que el anticuerpo de captura es: anticuerpo monoclonal 1G7G8, producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01 ; o en el que el anticuerpo detector es: anticuerpo monoclonal 1G7G8, producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01. 8. Device according to claim 1, wherein said immunoassay device is an immunochromatographic device comprising a membrane having a capture antibody bound thereto in a test zone, wherein the capture antibody is capable of bind with an analyte and wherein the device further comprises a conjugate structure fluidly coupled to the membrane at a proximal end, such that the conjugate structure comprises a detector antibody having a reporter fraction conjugated thereto such that the analyte is a tonB-dT protein, present in a sample of fluid from a bird, in which the antibody from capture is: monoclonal antibody 1G7G8, produced by hybridoma cells deposited with Accession No. 200218-01; or in which the detector antibody is: monoclonal antibody 1G7G8, produced by hybridoma cells deposited with Accession No. 200218-01.
9. Dispositivo, según la reivindicación 8, en el que la membrana comprende además una zona de control que tiene un anticuerpo de control unido a la misma, de manera que el anticuerpo de control es capaz de unirse con un reactivo de detección. 9. Device according to claim 8, wherein the membrane further comprises a control zone having a control antibody attached thereto, so that the control antibody is capable of binding with a detection reagent.
10. Dispositivo, según la reivindicación 9, en el que el anticuerpo de control es un IgG anti-ratón. 10. Device according to claim 9, wherein the control antibody is an anti-mouse IgG.
11. Kit que comprende: 11. Kit comprising:
(a) el dispositivo de la reivindicación 1 ;  (a) the device of claim 1;
y (b) un anticuerpo detector que tiene una fracción informadora conjugada al mismo anticuerpo monoclonal 1G7G8 producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01 , en dondq el anticuerpo monoclonal reconoce una secuencia peptídica SEQ ID NO: 1. and (b) a detector antibody having a reporter fraction conjugated to the same monoclonal antibody 1G7G8 produced by hybridoma cells deposited with Accession No. 200218-01, where the monoclonal antibody recognizes a peptide sequence SEQ ID NO: 1.
12. Anticuerpo monoclonal producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01 , en donde el anticuerpo monoclonal reconoce una secuencia peptídica SEQ ID NO: 1. 12. Monoclonal antibody produced by hybridoma cells deposited with Accession No. 200218-01, wherein the monoclonal antibody recognizes a peptide sequence SEQ ID NO: 1.
captura es: anticuerpo monoclonal 1G7G8, producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01 ; o en el que el anticuerpo detector es: anticuerpo monoclonal 1G7G8, producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01. capture is: monoclonal antibody 1G7G8, produced by hybridoma cells deposited with Accession No. 200218-01; or in which the detector antibody is: monoclonal antibody 1G7G8, produced by hybridoma cells deposited with Accession No. 200218-01.
9. Dispositivo, según la reivindicación 8, en el que la membrana comprende además una zona de control que tiene un anticuerpo de control unido a la misma, de manera que el anticuerpo de control es capaz de unirse con un reactivo de detección. 9. Device according to claim 8, wherein the membrane further comprises a control zone having a control antibody attached thereto, so that the control antibody is capable of binding with a detection reagent.
10. Dispositivo, según la reivindicación 9, en el que el anticuerpo de control es un IgG anti-ratón. 10. Device according to claim 9, wherein the control antibody is an anti-mouse IgG.
11. Kit que comprende: 11. Kit comprising:
(a) el dispositivo de la reivindicación 1 ;  (a) the device of claim 1;
y (b) un anticuerpo detector que tiene una fracción informadora conjugada al mismo anticuerpo monoclonal 1G7G8 producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01 , en dondq el anticuerpo monoclonal reconoce una secuencia peptidica SEQ iD NO: 1. and (b) a detector antibody having a reporter fraction conjugated to the same monoclonal antibody 1G7G8 produced by hybridoma cells deposited with Accession No. 200218-01, where the monoclonal antibody recognizes a peptide sequence SEQ iD NO: 1.
12. Anticuerpo monoclonal producido por células de hibridoma depositadas con n° de Acceso 200218-01, en donde el anticuerpo monoclonal reconoce una secuencia peptidica SEQ ID NO: 1. 12. Monoclonal antibody produced by hybridoma cells deposited with Accession No. 200218-01, wherein the monoclonal antibody recognizes a peptide sequence SEQ ID NO: 1.
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