WO2019221159A1

WO2019221159A1 - イノシトールリン酸を用いて抗菌性を付与した骨再生用材料の製造方法、及びその製造方法で製造された抗菌性骨再生用材料

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Publication number: WO2019221159A1
Application number: PCT/JP2019/019238
Authority: WO
Inventors: 守相澤; みちよ本田; 倫啓横田; 航大阿部; 真結上田; 敏宏春日; 賢石井; 守雄松本; 昌士牧田
Original assignee: 学校法人明治大学; 国立大学法人名古屋工業大学; 学校法人慶應義塾; Ｏｒｔｈｏｒｅｂｉｒｔｈ株式会社
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2019-05-15
Publication date: 2019-11-21
Also published as: US20210213163A1

Abstract

術後早期に抗菌性が発揮される生分解性繊維を含む骨再生用材料を提供する。生分解性繊維を含む抗菌性を有する骨再生用材料の製造方法であって、外径が１０～１００μｍであり、少なくとも生分解性樹脂を３０重量％以上、カルシウム化合物粒子を４０重量％以上含み、前記カルシウム化合物粒子の一部が表面に露出している前記生分解性繊維を、イノシトールリン酸溶液に浸漬して、次いで銀イオンを含む溶液に浸漬する工程によって、生分解性繊維を含む抗菌性を有する骨再生用材料を製造する。

Description

イノシトールリン酸を用いて抗菌性を付与した骨再生用材料の製造方法、及びその製造方法で製造された抗菌性骨再生用材料

　本発明は、イノシトールリン酸を用いて抗菌性を付与した骨再生用材料及びその製造方法に関する。

従来、骨再生用材料として水酸アパタイト（以下ＨＡｐと略記する）、リン酸三カルシウム（以下ＴＣＰと略記する）等のカルシウム化合物からなる人工骨が用いられている。最近は、骨形成を促す因子を含有した足場材を患部に充填して人体の自己再生修復機能を利用するタイプの材料が盛んに用いられている（特許文献１）。

人体に材料をインプラントするには外科手術を介するので、手術の後で細菌感染のリスクが存在する。そのための対策としてインプラントする材料に抗菌性を付与するか、もしくは抗生剤を投与することが可能である。抗菌性を付与する手段として銀、亜鉛、銅等の金属が用いられる。特に銀はイオン化した状態で優れた殺菌力を有し、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）等の耐性菌を生じさせず、尚且つ抗菌スペクトルも広いので広く好適に用いられている。

骨再生用材料に銀を担持させる方法としては、材料がチタンなどの金属材料であれば、フレーム溶射法を用いて銀金属を吹き付けて表面コーティングすることができる。しかし、骨再生用材料が生分解性繊維から構成されている場合には高温による影響および複雑形状へのコーティングの観点からこの方法を用いることは困難である。

近時、生分解性繊維にリン酸カルシウム化合物の粒子を含有させ、材料が生体内にインプラントされた後、生分解性繊維の分解吸収と共にリン酸カルシウムを溶出させて骨形成を促進するタイプの骨再生用インプラント材料が開発されている。このタイプの骨再生用材料に抗菌性を持たせる方法として、生分解性繊維に含有されたリン酸カルシウム粒子に銀を担持させて、体内で生分解性繊維が分解されてリン酸カルシウム粒子が溶解されると共に含有されていた銀が溶出されて抗菌性を発揮するという設計が提案されている（非特許文献１）。しかし、細菌感染が生じるリスクは術後早期の時点が最も高いので、銀イオンは骨再生用材料をインプラントした後早期に溶出されることが望ましい。非特許文献１の方法では、銀は繊維の内部に含有されているので、抗菌に必要な量の銀イオンが術後早期に溶出されない可能性がある。

他方、溶出される銀イオンは細菌を死滅させる抗菌性を有するが、同時に、増殖する必要がある骨芽細胞や周辺の細胞に対して細胞毒性を発現してしまう可能性がある。抗菌性も細胞毒性も、銀イオン濃度が上昇するほど効果が高くなるため、人工骨に対して抗菌性を付与するにあたっては、これら二つの互いに相反する要請を同時に満たすことが重要な課題である。

特許６１６２９１６号公報

Flexible, silver containing nanocomposites for the repair of bone defects: antimicrobial effect against E. coli infection and comparison to tetracycline, Journal of Materials Chemistry 2008 Oliver D. Schneider et al.等。

以上のような状況下で、生分解性繊維を含む骨再生用材料に銀を担持させて、骨再生用材料が生体内にインプラントされた後に銀イオンを溶出することによって術後早期において抗菌性を発揮し、尚且つ細胞毒性を発現する恐れの少ない安全性の高い骨再生用材料、及びその製造方法が求められていた。

上記課題を解決するために、本発明の発明者等は鋭意検討した結果、相当量のカルシウム化合物の粒子を含有した生分解性繊維の表面には、繊維内に埋め込まれたカルシウム化合物の粒子の一部が露出していることに着目した。その露出したカルシウム化合物の粒子に、カルシウム化合物のカルシウムイオン（Ca²⁺）と銀イオン（Ag⁺）とをイノシトールリン酸の水酸基（OH^-）を介してキレート結合させることによって、意図した量に制御された抗菌性を付与することができることに想到した。

上記想到に基づいて、本発明の発明者等は、生分解性繊維を含む抗菌性を有する骨再生用材料の製造方法であって、
外径が１０～１００μｍであり、少なくとも生分解性樹脂を３０重量％以上、カルシウム化合物粒子を４０重量％以上含み、前記カルシウム化合物粒子の一部が表面に露出している前記生分解性繊維を、
イノシトールリン酸溶液に浸漬して、
次いで銀イオンを含む溶液に浸漬する、工程を含む、
生分解性繊維を含む抗菌性を有する骨再生用材料の製造方法の発明に至った。

さらに、本発明の発明者等は生分解性繊維を含む抗菌性を有する骨再生用材料であって、
前記生分解性繊維は、外径が１０～１００μｍであり、生分解性樹脂を少なくとも３０重量％以上、カルシウム化合物粒子を４０重量％以上含み、前記カルシウム化合物粒子の一部は、前記生分解性繊維の表面に露出しており、
前記表面に露出したカルシウム化合物粒子のカルシウムイオンと銀イオンがイノシトールリン酸を介して結合されることによって、前記生分解性繊維の表面に銀が略均質に分布して固定されている、
生分解性繊維を含む抗菌性を有する骨再生用材料、の発明に至った。　

好ましくは、本発明に用いるイノシトールリン酸はフィチン酸（IP6）である。

好ましくは、本発明に用いる生分解性樹脂はポリL乳酸（PLLA）又はポリ乳酸―ポリグリコール酸共重合体（PLGA）である。

好ましくは、本発明に用いるカルシウム化合物はβ相リン酸三カルシウムもしくは炭酸カルシウムである。

好ましくは、本発明に用いる骨再生用材料は綿状に成形されている。

本発明の抗菌性を付与した骨再生材料は、生分解性繊維の表面に銀を担持しているので、術後早期の細菌感染に対して有効な抗菌性を発揮する。

本発明の抗菌性を付与した骨再生材料は、生分解性繊維の表面に固定する銀の量を、銀イオン溶液の濃度と生分解性繊維に含まれるカルシウム化合物粒子の量を調整することによって、抗菌性と細胞毒性のバランスを適切に制御することが可能である。

本発明の抗菌性を付与した骨再生材料は、銀は生分解性繊維の表面にのみ担持されているので、銀イオンの溶出は術後早期の段階に限られる。それ故、外科手術の後長期間にわたって銀イオンが溶出されることがないので、細胞毒性を発現する懸念が少ない。

本発明の抗菌性を付与した綿状の骨再生材料は、骨形成因子となるカルシウム化合物粒子を多量に含み、なおかつ制御された抗菌性／細胞毒性を有するので、高い骨形成能を有すると共に安全性が高い優れたインプラント材料である。

本発明の銀担持骨再生用材料の外観写真本発明の銀担持骨再生用材料を構成する生分解性繊維の概念図は本発明の銀担持骨再生用材料の作製方法本発明の銀担持骨再生用材料の走査型電子顕微鏡(SEM)観察結果本発明の銀担持骨再生用材料のエネルギー分散型X線分光法（EDX）による元素マッピング本発明の銀担持骨再生用材料のエネルギー分散型X線分光法（EDX）による元素分析本発明の骨再生用材料の生分解性繊維へのIP6の吸着実験の結果本発明の骨再生用材料への銀イオンの固定化方法本発明の銀担持骨再生材料からの銀イオンの固定化実験の結果本発明の銀担持骨再生材料からの銀イオンの溶出実験の結果本発明の銀担持骨再生材料からの銀イオンの溶出量の経時変化本発明の銀担持骨再生材料のシェーク法による相対抗菌率評価法本発明の銀担持骨再生材料の阻止円法による抗菌性評価本発明の銀担持骨再生材料の阻止円法による抗菌性評価結果細胞毒性試験の実験方法ＭＴＴアッセイによる細胞毒性試験結果細胞毒性試験の結果動物実験の実施方法埋入期間経過後にウサギから脛骨を取り出し時の写真本発明の銀担持骨再生用材料をウサギへ埋入した動物実験の組織学的評価本発明の銀担持骨再生用材料をウサギへ埋入した動物実験の組織学的評価本発明の銀担持骨再生用材料をウサギへ埋入した動物実験の組織学的評価本発明の銀担持骨再生用材料をウサギへ埋入した動物実験の組織学的評価本発明の銀担持骨再生用材料をウサギへ埋入した動物実験の組織学的評価本発明の銀担持骨再生用材料をウサギへ埋入した動物実験の組織学的評価本発明の銀担持骨再生用材料をウサギへ埋入した動物実験のμCT像本発明の銀担持骨再生用材料をウサギへ埋入した動物実験のμCT像本発明の銀担持骨再生用材料をウサギへ埋入した動物実験のμCT像本発明の銀担持骨再生用材料をマウスへ埋入した動物実験の結果を示す。本発明の銀担持骨再生用材料をマウスへ埋入した動物実験の結果を示す。

発明の詳細な説明

以下、本発明を実施するための形態について図面を用いて説明する。
＜生分解性繊維＞
本発明の銀担持骨再生用材料の生分解性繊維は、ポリ乳酸、又はポリ乳酸-ポリグリコール酸共重合体、例えばポリL乳酸（PLLA）又はポリ乳酸-ポリグリコール酸共重合体（PLGA）を好適なマトリクス樹脂として、エレクトロスピニング法を用いて紡糸して製造される。繊維の外径は１０～１００μｍ、より好ましくは２０～５０μｍがカルシウム化合物粒子が部分的に露出した状態で含有させる上で好ましい。エレクトロスピニング法で用いる紡糸溶液にカルシウム化合物粒子を均一に分散含有させた状態で紡糸することで、生分解性繊維にカルシウム化合物の粒子を均一に分散させることができる。生分解性繊維に含有されたカルシウム化合物の粒子の量が４０～７０重量％あると、繊維の表面にカルシウム化合物の粒子が露出している。

＜骨再生用材料＞
本発明の銀担持骨再生用材料としては、カルシウム化合物粒子を含む紡糸溶液を用いてエレクトロスピニング法で紡糸した生分解性繊維を好適に用いることができる。紡糸した生分解性繊維をエレクトロスピニング装置のコレクターに綿状に堆積させて回収することによって綿状の骨再生用材料を形成したものは、例えば本出願の出願人の一人によってReBOSSIS登録商標で製造販売されており、術者にとっての取扱い性に優れた骨欠損部充填材料として実際の臨床現場で広く用いられている。

＜イノシトールリン酸＞
本発明の骨再生用材料に銀を担持させるために用いるイノシトールリン酸は、水酸基がリン酸化されたイノシトールをいい、イノシトールトリスリン酸(IP3; C₆H₁₅O₁₅P₃)、イノシトールペンタキスリン酸(IP5; C₆H₁₇O₂₁P₅)、フィチン酸(IP6; C₆H₁₈O₂₄P₆)を含む。フィチン酸(IP6)は安価であり、キレート結合する水酸基をもっとも多く有するので、特に好適に用いることができる。

＜カルシウム化合物＞　
本発明の骨再生用材料に用いるカルシウム化合物としては、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ケイ素溶出型炭酸カルシウムを好適に用いる。骨形成能の点でβ相リン酸三カルシウム（β-ＴＣＰ）が特に好適である。カルシウム化合物粒子のサイズは１～４μｍであることが、粒子の一部が繊維表面に露出した形で、生分解性繊維に含有させる上で好ましい。

本発明を実施するための形態

図１は本発明の好ましい実施形態である綿状の骨再生用材料の外観写真である。図２は、本発明の実施形態による銀担持骨再生用材料を構成する生分解性繊維の概念図である。

図２を参照して、本発明の銀担持骨再生用材料の生分解性繊維１は、マトリクス樹脂５中にカルシウム化合物粒子２を含み、カルシウム化合物粒子２は、生分解性繊維１の表面に部分的に露出している。カルシウム化合物粒子２のカルシウムイオン（Ca²⁺）と銀イオン４（Ag⁺）とが、イノシトールリン酸３の水酸基（OH^-）とのキレート結合によって架橋されている。

本発明の骨再生材料を体内にインプラントすると、時間の経過と共に生分解性繊維１が溶解する結果、イノシトールリン酸３が溶け出てくる。銀イオン４がイノシトールリン酸３とキレート結合した状態で溶け出てくるときに周囲にカルシウムイオンが存在すると、イノシトールリン酸３のキレートはAg⁺よりもCa^2＋と結びついた方が安定（キレート安定性が高い）なので、イノシトールリン酸と銀の結合が切断されて、銀イオン４がカルシウムイオンと置換され、その結果、銀イオンが溶出されて抗菌作用を発揮すると考えられる。

図３は、本発明の実施形態による銀担持骨再生用材料の作製方法を示す。所定量を秤り取った綿状の骨再生用材料を6 well プレートに移し、そこに1000 ppmのフィチン酸水溶液(pH 7; ６ mL)を加え、37℃で24時間インキュベートした。その後、同容量の純水で５回洗浄したのち、所定の濃度の硝酸銀水溶液(0～20 mM; ６ mL)に浸漬し、同容量の純水で５回洗浄して風乾させた。

上記した手順にしたがって作製して得られた銀担持骨再生用材料の微細構造の走査型電子顕微鏡写真を図４に示す。同銀担持骨再生用材料のエネルギー分散型X線分光法（EDX）による元素マッピングを図５に示す。EDXの元素分析により同銀担持骨再生用材料に銀イオンが存在することを確認した結果を図６に示す。これらの図に示す銀担持骨再生用材料の微細構造と元素マッピング及び元素分析の結果から、銀イオンを固定化した後も骨再生用材料の表面構造にはほとんど変化がないことが分かる。また、その視野における元素の分布のEDX分析から、繊維形状に対応する分布でカルシウム、リン、銀が分布していることが明らかである。

生分解性繊維を硝酸銀水溶液に浸すと、生分解性樹脂のマイナスに帯電した官能基（カルボキシル基、カルボニル基等）がAg⁺と結合して銀が繊維の表面に付着するが、銀イオンと生分解性樹脂の官能基とのイオン結合は弱いので、樹脂の表面に付着した銀は固定されることはなく、純水による洗浄で外れてしまう。その結果、洗浄後の生分解性繊維の表面には、フィチン酸を介してカルシウム化合物粒子とキレート結合で固定された銀のみが残っていると考えられる。

実験

＜生分解性繊維へのイノシトールリン酸の吸着＞
6 well プレートに綿状の骨再生材料（ReBOSSIS登録商標 PLLA30重量％／β-TCP40重量％／ケイ素溶出型炭酸カルシウム30重量％）のサンプル0.15 gを設置し、1000 ppm濃度の６ mLIP6溶液中に浸漬し、室温または37℃加湿条件下で24時間放置した。その後、繊維に未吸着のIP6溶液を回収除去した。浸漬前のIP6溶液および回収した溶液のリン酸イオン濃度を誘導結合プラズマ発光分光分析法（ICP）により測定した。IP6吸着量を浸漬前後のリン酸イオン濃度差により算出した結果を図７に示す。図７に示す通り、25℃室温条件下では、０．０４mmol/gを若干下回る量のIP6の吸着が認められた。これに対し、37℃加湿条件下では、０．０４mmol/gを若干上回る量のIP6の吸着が認められ
た。

＜イノシトールリン酸による生分解性繊維への銀の固定化＞
図８に示す手順に従い、IP6を吸着させた綿状の骨再生用材料（ReBOSSIS登録商標）のサンプルを6 well プレートに設置し、硝酸銀水溶液（濃度：０、５、１０、２０ mM）５ mL中に浸漬し、２０分間静置した。その後、繊維から未吸着の硝酸銀水溶液を回収除去し、ICPによって銀の吸着量を測定した。図９に示す通り、浸漬した硝酸銀水溶液の濃度が高くなるほど、吸着量が増加した。

＜イノシトールリン酸によって固定化された銀の溶出＞
図８に示す手順に従い、IP6を用いて異なる量の銀（硝酸銀水溶液濃度：０、５、１０、２０ mM）を担持させた骨再生用材料（ReBOSSIS登録商標）のサンプルをpH 7.3に調整した20 mM HEPESバッファーに37℃で24時間(0.01 g/mL)浸漬し、中性条件下での銀イオンの溶出量をICP-AESにより調査した。その結果を図１０に示す。硝酸銀の濃度が高くなるほど、銀イオンの溶出量も多くなった。０、５および１０ mMで処理したサンプルでは吸着量と溶出量がほとんど一致していた。

図１１は、図８に従って異なる量の銀（硝酸銀水溶液濃度：０、３、５、１０、２０ mM）を担持させた骨再生用材料（ReBOSSIS登録商標）のサンプルの銀イオン溶出量の経時変化を測定した結果を示す。銀の担持量が異なるいずれのサンプルも、HEPESバッファーに浸漬して６時間を超えると、溶出量はほぼ一定となった。銀イオンの溶出量と抗菌性は銀イオン濃度に深く依存的な関係にするため、この結果は、使用する硝酸銀水溶液の濃度により、容易に抗菌性をコントロールできることを示しており、術後早期の感染予防に有効であると考えられる。

今回調べた範囲内で、硝酸銀水溶液の濃度を選択することにより、骨再生用材料 1gあたり銀担持量を0から50 mgまで制御することが可能であり、浸漬した硝酸銀水溶液の濃度が高いほど、銀イオンの担持量も増加することが明らかとなった。

＜抗菌性の評価＞
IP6で表面修飾した骨再生材料（ReBOSSIS登録商標）を硝酸銀水溶液（濃度0, 1.25, 2.5, 5.0 mM）に浸漬して銀を担持させてサンプルIP6_ReBO(0), IP6_ReBO(1.25), IP6_ReBO(2.5), IP6_ReBO(5.0)を作製し、それぞれのサンプルについて、I.シェーク法と、II.阻止円法の二つの方法によって抗菌性を評価した。

I．シェーク法による抗菌性評価
培地：LB培地（１×,１/１０×）
サンプル：LB培地, IP6で表面修飾して銀を担持させIP6_ReBO(0)IP6_ReBO(1.25), IP6_ReBO(2.5), IP6_ReBO(5.0)
菌：大腸菌（E.ｃoli）
菌数：１×１０⁵ cells/tube
菌液の調製
１）コントロール
５０ mL遠沈管へＬＢ培地を９ｍｌ入れ、さらに１Ｘ１０⁵CFU/mLに調製した菌液１ mLを入れ菌懸濁液を作製
２）サンプル
９ｍｌの抽出液を調製し、さらに１×１０⁵ＣＦＵ／mLに調製した菌液１ mLを入れ懸濁液を作製

37℃の振とう器へ菌液を入れた５０ｍｌ遠沈管をセットし、培養を開始。24時間後に５０ mL遠沈管から菌懸濁液を採取し、分光光度計を用いて濁度を測定した。吸光度と菌数の関係から抗菌性を評価した結果を図１２に示す。図１２に示す通り、いずれの条件においても、サンプルIP6_ReBO(5.0)のみ抗菌性を発揮した。この結果から、LB培地の濃度に関わらず、AgNO₃濃度が５．０ mM以上で抗菌性を発揮することが分かった。

II.阻止円法による抗菌性評価
綿状骨再生用材料（ReBOSSIS登録商標）のIP6_ReBO(0), IP6_ReBO(1.25), IP6_ReBO(2.5), IP6_ReBO(5.0)のサンプル0.15 gを金型成形器へ充填し、加圧成形することによりdisc状試料片を作製した。この試料片を滅菌した後に、上記各サンプルの抗菌性評価を阻止円法を用いて行なった。

具体的には、LB寒天培地上に前記したdisc状試料片を設置し、そこへ1×10⁶CFU/plateとなるよう調製した大腸菌を含むトップアガーを重層させた。37℃で48時間培養した後に阻止円の形成を観察して、相対抗菌率（図１３）を比較することで、抗菌性を評価した。銀イオンを固定化していない、即ち、IP6_Rebo (0)上で大腸菌を培養した場合、disc周囲には菌が増殖し、阻止円の形成は認められなかった。一方、IP6_Rebo(1.25, 2.5, 5.0)はいずれも試料片周辺に大腸菌のコロニー形成が認められず、阻止円の形成が観察された(図１４)。

また、硝酸銀水溶液（濃度5.0, 10, 20 mM）に浸漬して銀を担持させてサンプルIP6_ReBO(5), IP6_ReBO(10), IP6_ReBO(20)を作製し、同様の実験を行ったところ、サンプルIP6_ReBO（10）とIP6_ReBO（20）の阻止帯の面積は同程度であったが、IP6_ReBO(5)のそれに比べ、面積が大きいことが分かった。この結果は、固定化される銀イオンは硝酸銀水溶液の濃度に依存して増加するが、硝酸銀水溶液10 mM以上の濃度では固定化された銀イオン量が、抗菌作用に必要十分な銀イオン量に達しているため、それ以上銀イオンを固定化しても抗菌レベルにも大きな変化が生じないことが考えられた。

＜細胞毒性の評価＞
図１５は細胞毒性試験の実験方法を示す。サンプルIP6_ReBO(0), IP6_ReBO(1.25), IP6_ReBO(2.5), IP6_ReBO(5.0)を、それぞれ0.01 ｇ/mLとなるように、培地に24時間浸漬静置し、遠心分離により上清（抽出液）のみを回収する。予めWell上に調製した骨芽細胞上に、前述の回収した抽出液を浸し、24時間後ＭＴＴアッセイにより、吸光度から換算した細胞数のグラフが図１６である。

図１７は、IP6_ReBO(X)群に骨芽細胞を直接播種し、その細胞数を血球計算盤版によりカウントした結果である。図１７によれば、溶出した銀イオン濃度2.41 ppm以上で、細胞毒性が発現すると考えられる。因みにこれは、浸漬した硝酸銀水溶液では、約2.5 mMに相当する。

動物実験１

IP6を用いて銀を担持させた骨再生用材料（ReBOSSIS登録商標）のサンプルを使用して動物実験を行い、生体適合性を評価した。体重約３ｋｇの日本白色種ウサギの雄の右足および左足脛骨にドリルを使用して４．１ｍｍ径の欠損を作製し、試料（硝酸銀水溶液濃度０、５、１０ mMそれぞれで銀担持された綿形状骨再生用材料）を埋入した。埋入時は欠損作製の際に出てきた血液と試料とを混ぜ合わせた上で埋入した。埋入期間は４週間で、それぞれのｎ数は３であった（図１８）。

埋入期間経過後にウサギから脛骨を取り出し、各評価分析を行った。埋入試料取り出し時の写真を図１９に示す。１０ mM銀担持サンプルは埋入部と思われる部分が黒ずんでいた。この色は担持させた銀に由来すると考えられる。０、５ mM銀担持サンプルは埋入部がわからなくなる程度に修復しているのが認められた。

図２０～２５は、病理切片による組織学的評価を示す。それぞれ１個体目の左足Ag(０)担持、１個体目の右足Ag（５）担持、2個体目の左足Ag（５）担持、2個体目の右足Ag（１０）担持、３個体目の左足Ag（０）担持、３個体目の右足Ag（１０）担持の試料埋入部位の切片にヘビラヌエバボーン染色を施した顕微鏡写真（明視野）を示す。試料は黒い影のように像には映っているが、銀の担持量にかかわらず欠損部の新生骨の良好な侵入が見られた。

図２６～２８は、本発明の銀担持骨再生用材料の０、５、１０ mM銀担持試料をウサギへ埋入した動物実験の結果をμCTスキャン像で示す。すべての銀担持濃度において銀による有害な作用がないことが確認され,生体適合性が高いことが分かった。

動物実験２

「マウス浅殿筋感染症モデル」を用いてin vivo環境下での抗菌性試験を実施した。マウス生体の浅殿筋に抗菌性綿形状人工骨補填材(Ag⁺イオン濃度：0, 1, 5 mMで抗菌加工)を発光黄色ぶどう球菌（MSSA）1x10⁸ CFU2μLと共に埋入した(各n=5)。埋入後１日目と3日目でのマウス内の発光MSSAを光イメージング（IVIS）で測定し、マウス内の細菌数の変化を観察した。

動物実験２におけるマウス内の細菌増殖変化の観察結果を図２９と図３０に示す。図２９、３０において、Ag(0, 1, 5 mM)とは、図８に示す要領で綿状の骨再生材料（ReBOSSIS登録商標）をフィチン酸（IP6）溶液に浸漬し洗浄した後に、濃度が0, 1, 5 mMの硝酸銀溶液に浸漬した後で純水で洗浄することによって、綿状の骨再生材料の繊維の表面に、それぞれの場合の量の銀を担持させた骨再生用材料を示す。図29はマウスのIVIS像を示す。白く光っている部分が細菌が存在する箇所であり、その光の大小により間接的に細菌の数の変化がわかる。

図30は上記の細菌の光を数値化した結果である。1日目から3日目でAg⁺イオン濃度0 mM（control）で1.6倍のPI（Photon Intensity：細菌量）が観察された。一方、1 mMでは1.34倍、5 mMでは0.78倍の細菌量で、有意に細菌増殖が抑制されていた（図２９：写真（3日目）と図３０（1、3日目））。Ag⁺イオンをIP6で固定化した綿形状人工骨は生体内でも抗菌性を示すことが明らかになった。

以上、本発明を実施するための好ましい形態について説明したが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で各種の変形が可能である。

１．生分解性繊維
２．カルシウム化合物粒子
３．イノシトールリン酸
４．銀イオン
５．マトリクス樹脂

Claims

生分解性繊維を含む抗菌性を有する骨再生用材料の製造方法であって、
外径が１０～１００μｍであり、少なくとも生分解性樹脂を３０重量％以上、カルシウム化合物粒子を４０重量％以上含み、前記カルシウム化合物粒子の一部が表面に露出している前記生分解性繊維を、
イノシトールリン酸溶液に浸漬して、
次いで銀イオンを含む溶液に浸漬する、工程を含む、
生分解性繊維を含む抗菌性を有する骨再生用材料の製造方法。
前記生分解性樹脂はPLLA樹脂である、請求項１に記載の抗菌性を有する骨再生用材料の製造方法。
前記生分解性樹脂はPLGA樹脂である、請求項１に記載の抗菌性を有する骨再生用材料の製造方法。
前記カルシウム化合物粒子は、外径１～４μｍのβ相リン酸三カルシウム粒子である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗菌性を有する骨再生用材料の製造方法。
前記カルシウム化合物粒子は、炭酸カルシウム又はリン酸カルシウムを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗菌性を有する骨再生用材料の製造方法。
前記生分解性繊維を含む骨再生用材料は綿形状に形成されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗菌性を有する骨再生用材料の製造方法。
生分解性繊維を含む抗菌性を有する骨再生用材料であって、
前記生分解性繊維は、外径が１０～１００μｍであり、生分解性樹脂を少なくとも３０重量％以上、カルシウム化合物粒子を４０重量％以上含み、前記カルシウム化合物粒子の一部は、前記生分解性繊維の表面に露出しており、
前記表面に露出したカルシウム化合物粒子のカルシウムイオンと銀イオンがイノシトールリン酸を介して結合されることによって、前記生分解性繊維の表面に銀が略均質に分布して固定されている、
前記生分解性繊維を含む抗菌性を有する骨再生用材料。
前記生分解性樹脂はPLLA樹脂である、請求項７に記載の抗菌性を有する骨再生用材料。
前記生分解性樹脂はPLGA樹脂である、請求項７に記載の抗菌性を有する骨再生用材料。
前記カルシウム化合物粒子は、炭酸カルシウム又はリン酸カルシウムを含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の抗菌性を有する骨再生用材料。
　
前記カルシウム化合物粒子は、外径１～４μｍのβ相リン酸三カルシウム粒子である、請求項７～１０のいずれか一項に記載の抗菌性を有する骨再生用材料。
前記生分解性繊維を含む骨再生用材料は綿形状に形成されている、請求項７～１１のいずれか一項に記載の抗菌性を有する骨再生用材料。