WO2019203686A1 - Пептид и способ лечения болезни альцгеймера - Google Patents

Пептид и способ лечения болезни альцгеймера Download PDF

Info

Publication number
WO2019203686A1
WO2019203686A1 PCT/RU2019/000158 RU2019000158W WO2019203686A1 WO 2019203686 A1 WO2019203686 A1 WO 2019203686A1 RU 2019000158 W RU2019000158 W RU 2019000158W WO 2019203686 A1 WO2019203686 A1 WO 2019203686A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
disease
amyloid
beta
zinc
Prior art date
Application number
PCT/RU2019/000158
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Александр Олегович МОРОЗОВ
Original Assignee
Александр Олегович МОРОЗОВ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Александр Олегович МОРОЗОВ filed Critical Александр Олегович МОРОЗОВ
Publication of WO2019203686A1 publication Critical patent/WO2019203686A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions

Definitions

  • the invention relates to biochemistry and medicine and is a peptide with the amino acid sequence (in single-letter codes) H [isoD] [pS] GYEVHH, where the special codes [isoD] and [pS] denote the isomerized amino acid residue of aspartic acid and the phosphorylated amino acid residue of serine, respectively .
  • This peptide is capable of forming a stable zinc-mediated intermolecular complex with a metal-binding domain of human amyloid beta.
  • the present inventor has shown that this peptide can be effectively used to treat Alzheimer's disease.
  • Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease, one of the common forms of dementia, "senile dementia.” Most often, Alzheimer's disease develops after 50 years, although there are cases of diagnosis in earlier age periods. (Cummings, JL (2004). Alzheimer's disease. N Engl J Med 351, 56-67.) Named after the German psychiatrist Alois Alzheimer, the disease is currently diagnosed in about 46 million people in the world.
  • the disease may be due to hereditary disorders, but in most patients the disease occurs sporadically, without any specific reason (Selkoe, DJ. (2001). Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev 81, 741- 66).
  • Symptoms of Alzheimer's disease appear slowly, and only weak forgetfulness may be the first symptom. At this stage, individuals may forget the latest events, actions, names of familiar people, or names of things and may not be able to solve simple mathematical problems. As the disease progresses, the symptoms become more visible and more serious. This forces people affected by Alzheimer's to seek medical attention. Symptoms characteristic of the middle stage of Alzheimer's include forgetting how to perform simple functions, such as tidying oneself, with problems with speech, understanding, reading or writing. Patients in the late stage of Alzheimer's disease may become fearful or aggressive, may go far from home and, in the end, need complete care.
  • this disease is characterized by neuritic plaques, mainly associated with cerebral cortex, limbic system and basal ganglia.
  • the main component of these plaques is the amyloid-beta (Ab) peptide, which is a cleavage product of the amyloid-beta precursor protein (bARR or APP).
  • APP is a type I transmembrane glycoprotein that contains a large ectopic N-terminal domain, a transmembrane domain, and a small cytoplasmic C-terminal tail.
  • Alternative splicing of the transcript of one APP gene on chromosome 21 leads to several isoforms that differ in the number of amino acids.
  • An Ab peptide is a compound that is usually found in biological fluids, such as blood or cerebrospinal fluid, in which it is present in low concentrations of 0.5 to 5 nM, and this is the same in healthy people and in patients suffering from the disease Alzheimer's (Mayeux, R. et al. (1999). Plasma amyloid bet peptide 1-42 and incipient Alzheimer's disease. Ann Neurol 46, 412-6; Seubert, P. et al. (1992). Isolation and quantification of soluble Alzheimer's beta-peptide from biological fluids. Nature 359, 325-7)
  • the 1-16 N-terminal region of the Ab peptide is a region that undoubtedly participates in the most convincing and decisive pathway for the formation of amyloid plaques.
  • beta-amyloid is a metal-binding domain, where zinc (Zh) and copper (Cu) bind to the Ab peptide (Guilloreau, L., Damian, L., Coppel, Y., Mazarguil, H., Winterhalter, M. and Faller, P. (2006). Structural and thermo dynamical properties of Cull amyloid-beta 16/28 complexes associated with Alzheimer's disease. J Biol Inorg Chem 11, 1024-38; Kozin, SA, Zirah, S., Rebuffat, S., Hoa, GH and Debey, P. (2001).
  • amyloid plaques are more significantly formed surrounded by neurons in the presence of a high concentration of zinc ions (Frederickson, CJ and Bush, AI (2001). Synaptically released zinc: physiological functions and pathological effects. Biometals 14, 353-66; Frederickson, CJ, Suh, SW, Silva, D. and Thompson, RB (2000). Importance of zinc in the central nervous system: the zinc-containing neuron. J Nutr 130, 1471 S-83S).
  • US 7018797 teaches a method for inhibiting the binding of ⁇ -amyloid peptides to a-7 nicotinic acetylcholine receptor for the treatment of neurodegenerative diseases.
  • compounds derived from naphthalene in particular 5,8-dihydroxy-trans-2-di (N-propylamino) -3-methyl-1, 2,3,4-tetrahydronaphthalene, were proposed as compounds, which can inhibit the binding of the Ab peptide to the a-7 nicotinic acetylcholine receptor.
  • an antigenic construct containing an antigenic peptide corresponding to a sequence within a tau protein, including a phospho epitope, where the peptide is (a), modified by binding to a lipophilic or hydrophobic fragment that facilitates insertion into the lipid bilayer of the liposome, and (b) reconstructed in liposome so that the peptide is presented on the surface of the liposome to induce an immune response in an animal suffering from a neurodegenerative disorder.
  • the indicated antigenic construct is used to treat Alzheimer's disease.
  • WO 2009/149485, December 17, 2009 describes a group of inventions that relates to medicine and relates to the use of mimotopes for the treatment of b-amyloidosis, including Alzheimer's disease, where the above mimotopes are polypeptides containing from 4 to 20 amino acid residues, and are capable of inducing in vivo antibody formation to unshortened Ab 1-40 / 42 and N-terminally shortened forms AbrE3 -40/42, Ab3 -40/42, Ab ⁇ 1-40 / 42, AbrEI 1-40 / 42 and Ab14-40/42 without disturbances in the physiological functions of BPA signal transmission.
  • WO 2006/121656, 11.16.2006 describes a method for preventing or treating a disease associated with Ab amyloid deposits in the brain of a patient in need of such prophylaxis or treatment.
  • the method includes administering an effective dose.
  • an immunogenic fragment of Ab with the absence of a T-cell epitope capable of eliciting an immune response in the form of antibodies to the specified fragment of Ab, where the immunogenic fragment contains one or more linear peptides of 8 amino acids (8 measures) Ab, while the specified one or more 8 measures include Ab (21-28) (AEDVGSNK).
  • peptide compounds are used to bind to b-amyloid peptides and inhibit their polymerization in the form of amyloid plaques, as well as a drug or for the preparation or determination of drugs for the treatment of neurodegenerative diseases, in particular Alzheimer's disease.
  • the inventor obtained a peptide corresponding in its amino acid composition to fragment 6-14 of human amyloid beta, but in contrast to it, the peptide of the present invention contains chemically modified amino acid residues, namely a phosphorylated serine residue (denoted as “[pS]”) and the isomerized aspartic acid residue (referred to as “[isoD]”).
  • the peptide of the present invention has a non-nine-membered amino acid sequence H [isoD] [pS] GYEVHH with open or protected ends of the main polypeptide chain (for example, with an acetylated N-terminal amine and amidated C-terminal hydroxyl) and is referred to below as “ isoD-pS-hAb.
  • This peptide is capable of forming a stable zinc-mediated intermolecular complex with a metal-binding domain of human amyloid beta.
  • the author of the present invention It is shown that this peptide can be effectively used to treat Alzheimer's disease.
  • a pharmaceutical composition has also been created for the treatment of Alzheimer's disease.
  • As an active component it uses the isoD-pS-hAb peptide according to the invention.
  • the remaining components are selected from a range of neutral carriers and diluents and are well known to those skilled in the art (e.g., physiological saline).
  • a pharmaceutical composition for treating Alzheimer's disease comprising an effective amount of a peptide of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a method for reducing zinc-induced aggregation of beta-amyloid comprising reacting the peptide of the invention with amyloid beta.
  • FIG. Figure 1 shows the obtained sets of kinetic binding curves (BPR sensograms) of the isoD-pS-PAR analyte with immobilized Ab (1 - 16) -Gly-Gly-Gly-Gly-Cys) after subtraction of the control background.
  • FIG. 2 shows the effect of “isoD-pS-hAb” on zinc-dependent aggregation of human beta-amyloid Ab42.
  • lyophilized synthetic peptides (purity greater than 98%), which were used as analyte or ligand, were dissolved in a suitable buffer system.
  • concentration of each peptide in solution was determined spectrophotometrically using an extinction coefficient of 1450 M 1 cm 1 at 276 nm (peak absorption of the amino acid residue Tug 10 in human Ab).
  • CM5 sensor chip with hydrophilic carboxymethylated dextran matrix suitable HBS buffer (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% PVA P20), 1 -ethyl-3 - (3-dimethylaminopropyl) -25 carbodiimide (EDC ), N-hydroxysuccinimide (NHS), 2- (2-pyridinyldithio) -ethaneamine (PDEA), and the cysteine used in the analyzes were purchased from the manufacturer (BIAcore, GE, USA). Ligand immobilization was carried out in accordance with the manufacturer's protocols and using appropriate working solutions.
  • the synthetic peptide AC-DAEFRHDSGYEVHHQKGGGGC-NH 2 (“Ab (1 - 16) -Gly-Gly-Gly-Gly-Cys”) was used as a ligand that was immobilized via a disulfide bond of the thiol group of the C-terminal cysteine residue.
  • the synthetic peptide Ac-H [isoD] [pS] GYEVHH-NH 2 (“isoD-pS-hAb”) was used as an analyte.
  • the concentration of sample solutions of each analyte was 0, 2, 5, 10, 15 and 20 micromoles).
  • Figure 1 shows the obtained sets of kinetic binding curves (BPR sensograms) of the isoD-pS-rbA analyte with immobilized Ab (l-16) -Gly-Gly-Gly-Gly-Cys) after subtracting control background.
  • the measurements were carried out at 25 ° C in 10 mM HEPES buffer (pH 6.8) containing various analyte concentrations (0, 2, 5, 10, 15 and 20 micromoles, curves 1-
  • the peptide according to the invention is an agent capable of forming a stable intermolecular complex with a metal-binding domain of human beta-amyloid.
  • the size of zinc-induced aggregates of Ab42 peptides was determined by correlation spectroscopy using a Zetasizer Nano ZS particle size analyzer (Malvern Instruments Ltd., UK), which allows measuring particle diameter in the range from 0.6 nm to 10 microns. The measurements were carried out at a temperature of 25 ° C in accordance with the manufacturer's instructions.
  • the method of correlation spectroscopy is based on the determination of the diffusion coefficient of dispersed particles in a liquid by analyzing the correlation function of fluctuations in the intensity of scattered light. Particle size is determined by the Stokes-Einstein formula, which relates the diffusion coefficient to the hydrodynamic radius of the particle. It is assumed that the particle has a spherical shape.
  • Nano ZS gives the distribution of particle size, which uses the program CONTIN, which is part of its software.
  • CONTIN which is part of its software.
  • the program uses a mathematical algorithm that allows you to choose from all possible particle size distributions the one that best describes the experimentally determined correlation function.
  • the program also determines the average particle size in the polydisperse population, which was used in this work for comparative analysis.
  • Samples for determining the size of peptide aggregates by correlation spectroscopy were prepared as follows. 100 ⁇ l of a solution of Ab42 peptide with a concentration of 30 ⁇ M in buffer A (10 mm HEPES, 150 mm NaCl, pH 7.4) was mixed with 20 ⁇ l of a solution of zinc chloride with a concentration of 150 mm in buffer A in a single-use microcuvette BRAND UV (BRAND GMBH, Germany) and immediately used to determine the size of the aggregates.
  • FIG. 2 shows the effect of “isoD-pS-hAb” on zinc-dependent aggregation of human beta-amyloid Ab42.
  • the results of the spatial memory analysis of animals obtained in this test showed a significant difference between intact and injected AbRR / PSl mice (Fig.
  • the invention is applicable in the field of biochemistry and medicine, namely, it can be effectively used to treat Alzheimer's disease.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биохимии и к медицине и представляет собой пептид формулы H[isoD][pS]GYEVHH, где остаток серина является фосфорилированным, а остаток аспарагиновой кислоты изомеризирован. Данный пептид способен образовывать стабильный цинк-опосредованный межмолекулярный комплекс с метал-связывающим доменом человеческого бета-амилоида и используется для лечения болезни Альцгеймера.

Description

ПЕПТИД И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ
АЛЬЦГЕЙМЕРА
Область техники
Изобретение относится к биохимии и медицине и представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью (в однобуквенных кодах) H[isoD][pS]GYEVHH, где специальными кодами [isoD] и [pS] обозначены изомеризованный аминокислотный остаток аспарагиновой кислоты и фосфорилированный аминокислотный остаток серина, соответственно. Данный пептид способен образовывать стабильный цинк-опосредованный межмолекулярный комплекс с метал-связывающим доменом человеческого бета-амилоида. Автором настоящего изобретения показано, что указанный пептид может эффективно применяться для лечения болезни Альцгеймера.
Предшествующий уровень техники
Болезнь Альцгеймера - это нейродегенеративное заболевание, одна из распространенных форм деменции, «старческого слабоумия». Чаще всего болезнь Альцгеймера развивается после 50 лет, хотя есть и случаи диагностики в более ранних возрастных периодах. (Cummings, J.L. (2004). Alzheimer's disease. N Engl J Med 351, 56-67.) Названная по имени немецкого психиатра Алоиса Альцгеймера болезнь на данный момент диагностирована у порядка 46 миллионов человек в мире.
У некоторых пациентов заболевание может быть связано с наследственными нарушениями, но у большинства пациентов заболевание встречается спорадически, без какой-либо определенной причины (Selkoe, DJ. (2001). Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev 81, 741-66).
Симптомы болезни Альцгеймера проявляются медленно, и первым симптомом может быть лишь слабая забывчивость. На этой стадии индивидуумы могут забывать последние события, действия, имена знакомых людей или названия вещей и могут быть не в состоянии решить простые математические задачи. При прогрессировании болезни симптомы становятся более заметными и более серьезными. Это вынуждают людей, пораженных болезнью Альцгеймера, прибегать к медицинской помощи. Симптомы, характерные для средней стадии болезни Альцгеймера, включают забывание того, как выполнять простые функции, такие как приводить себя в порядок, при этом возникают проблемы с речью, пониманием, чтением или письмом. Пациенты на поздней стадии болезни Альцгеймера могут становиться боязливыми или агрессивными, могут уходить далеко от дома и, в конце концов, нуждаться в полном уходе.
Гистологически это заболевание характеризуется нейритными бляшками, главным образом ассоциированными с корой головного мозга, лимбической системой и базальными ганглиями. Основным компонентом указанных бляшек является пептид амилоид-бета (Ab), который является продуктом расщепления белка-предшественника амилоида-бета (bARR или АРР). АРР является трансмембранным гликопротеидом типа I, который содержит крупный эктопический N-концевой домен, трансмембранный домен и небольшой цитоплазматический С- концевой хвост. Альтернативный сплайсинг транскрипта одного гена АРР в хромосоме 21 приводит к нескольким изоформам, которые отличаются количеством аминокислот.
Ab пептид представляет собой соединение, которое обычно обнаруживается в биологических жидкостях, таких как кровь или цереброспинальная жидкость, в которых он присутствует в низких концентрациях от 0,5 до 5 нМ, и это одинаково как у здоровых людей, так и у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера (Mayeux, R. et al. (1999). Plasma amyloid beta- peptide 1-42 and incipient Alzheimer's disease. Ann Neurol 46, 412- 6; Seubert, P. et al. (1992). Isolation and quantification of soluble Alzheimer's beta-peptide from biological fluids. Nature 359, 325-7)
На настоящий момент, по всем имеющимся данным, можно сделать вывод, что 1-16 N-концевая область пептида Ab является областью, которая несомненно участвует в наиболее убедительном и определяющем пути феномена формирования амилоидных бляшек.
Было определено, что 1-16 N-концевая область бета- амилоида является металл-связывающим доменом, где цинк (Zh) и медь (Си) присоединяются к Ab пептиду (Guilloreau, L., Damian, L., Coppel, Y., Mazarguil, H., Winterhalter, M. and Faller, P. (2006). Structural and thermo dynamical properties of Cull amyloid-beta 16/28 complexes associated with Alzheimer's disease. J Biol Inorg Chem 11, 1024-38; Kozin, S.A., Zirah, S., Rebuffat, S., Hoa, G.H. and Debey, P. (2001). Zinc binding to Alzheimer's Abeta(l-16) peptide results in stable soluble complex. Biochem Biophys Res Commun 285, 959-64). В настоящее время выявлено, что амилоидные бляшки характеризуются аномально высокой концентрацией двухвалентных металлов и, в частности, цинка (Lovell, М.А., Robertson, J.D., Teesdale, W.J., Campbell, J.L. and Markesbery, W.R. (1998). Copper, iron and Zinc in Alzheimer's disease senile plaques. J Neurol Sci 158, 47-52). Некоторое количество исследований и экспериментов, как in vivo так и in vitro, показали, что высокие концентрации цинка вызывают преципитацию Ab пептида, приводящую к образованию амилоидных бляшек. Кроме того, было показано, что амилоидные бляшки более значимо образуются в окружении нейронов в присутствии высокой концентрации ионов цинка (Frederickson, C.J. and Bush, A.I. (2001). Synaptically released zinc: physiological functions and pathological effects. Biometals 14, 353- 66; Frederickson, C.J., Suh, S.W., Silva, D. and Thompson, R.B. (2000). Importance of zinc in the central nervous system: the zinc- containing neuron. J Nutr 130, 1471 S-83S).
Именно поэтому в настоящее время считается, что блокирование взаимодействия Ab пептида с цинком должно привести к уменьшению агрегации Ab пептида в виде амилоидных бляшек и тем самым предотвратить патологии, связанные с этим взаимодействием.
В патенте US 6001852 в качестве лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера предлагается Клиохинол, который является цинк-хелатирующим агентом.
В патенте US 7018797 представлен метод ингибирования связывания b-амилоидных пептидов с а-7 никотиновым рецептором ацетилхолина для лечения нейродегенеративных заболеваний. В US 7018797, соединения, полученные из нафталина, в частности, 5,8-дигидрокси-транс-2-ди (N- пропиламино)-3 -метил- 1 ,2,3,4-тетрагидронафталин, были предложены в качестве соединений, которые могут подавлять связывание Ab пептида с а-7 никотиновым рецептором ацетилхолина.
В US 7314724 в качестве лекарства против болезни Альцгеймера было предложено использование растворимых форм ламининов и их фрагментов (>10 кДа), которые способны связываться с Ab и держать его в мономерном состоянии.
Из документа WO 2010/115843, 14.10.2010 известна антигенная конструкция, содержащая антигенный пептид, соответствующий последовательности в пределах тау-белка, включающий фосфо-эпитоп, где пептидом является (а), модифицированный путем связывания с липофильным или гидрофобным фрагментом, который облегчает встраивание в липидный бислой липосомы, и (б), реконструированный в липосому так, что пептид презентирован на поверхности липосомы, для индукции иммунного ответа у животного, страдающего от нейродегенеративного расстройства. Указанная антигенная конструкция используется для лечения болезни Альцгеймера.
Из документа ЕА 12325, 28.08.2009 В1 известно использование З-амино-1-пропансульфоновой кислоты в способе лечения болезни Альцгеймера.
Из документа WO 2013/041962, 28.03.2013 известно получение антитела для использования при лечении болезни Альцнеймера.
В документе WO 2009/149485, 17.12.2009 описана группа изобретений, которая относится к медицине и касается применения мимотопов для лечения b-амилоидозов, включая болезнь Альцгеймера, где вышеуказанные мимотопы являются полипептидами, содержащими от 4 до 20 аминокислотных остатков, и способны вызывать in vivo образование антител к неукороченному Ab 1-40/42 и укороченным с N-конца формам AbrE3 -40/42, Ab3 -40/42, Abΐ 1-40/42, AbrEI 1-40/42 и Ab14- 40/42 без нарушения физиологических функций передачи сигнала БПА.
В документе WO 2006/121656, 16.11.2006 описан способ для предотвращения или лечения заболевания, ассоциированного с отложениями амилоида Ab в головном мозге пациента, нуждающегося в такой профилактике или лечении. Способ включает введение эффективной дозы иммуногенного фрагмента Ab с отсутствием Т-клеточного эпитопа, способного вызывать иммунный ответ в форме антител к указанному фрагменту Ab, где иммуногенный фрагмент содержит один или более линейных пептидов из 8 аминокислот (8-меров) Ab, при этом указанный один или более 8-меров включают Ab(21-28) (AEDVGSNK).
Из документа RU 2588143 С2, 27.06.2016 известно изобретение, которое относится к пептидному соединению Ra- R 1 -R2-R3 -R4-Rb (I) или Ra-R4-R3-R2-Rl-Rb (II), где Ra представляет собой N-концевую первичную аминную группу аминокислоты R1 или R4, либо свободную, либо замещенную аминозащитной группой, Rb представляет собой гидроксильную группу С-концевой карбоксильной группы аминокислоты R1 или R4, либо свободную, либо замещенную гидроксизащитной группой, и R1-R2-R3-R4 или R4-R3-R2-R1 представляют собой HADD, KADD, DDAK, RADD, DDAR, KAED, DEAK, RAED, DEAR, HADE, EDAH, KADE, EDAK, RADE, EDAR, HAEE, EEAH, KAEE, EEAK, RAEE и EEAR. Данные пептидные соединения применяются для связывания с b-амилоидными пептидами и ингибирования полимеризации их в виде амилоидных бляшек, а также в качестве лекарственного средства или для подготовки или определения препаратов с целью лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера.
Однако, к сожалению, несмотря на успехи в предотвращении образования амилоидных бляшек, влияние известных препаратов на улучшение когнитивных функций при болезни Альцгеймера в среднем является очень ограниченным.
Исходя из вышеизложенного, на настоящий момент существует необходимость получения альтернативных эффективных средств для лечения болезни Альцгеймера, в том числе за счет снижения или предотвращения связывания ионов Zn (II) с b-амилоидным пептидом.
Раскрытие изобретения
Автором настоящего изобретения был получен пептид, соответствующий по своему аминокислотному составу фрагменту 6-14 человеческого бета-амилоида, но в отличие от него пептид по настоящему изобретению содержит химически модифицировнные аминокислотные остатки, а именно фосфорилированый остаток серина (обозначаемый как“[pS]”) и изомеризованный остаток аспарагиновой кислоты (обозначаемый как “[isoD]”). Пептид по настоящему изобретению имеет нонамерную (девяти-членную) аминокислотную последовательность H[isoD][pS]GYEVHH с открытыми или защищенными концами основной полипептидной цепи (например, с ацетилированным N- концевым амином и амидированным С-концевым гидроксилом) и обозначается далее как “isoD-pS-hAb”. Данный пептид способен образовывать стабильный цинк-опосредованный межмолекулярный комплекс с метал-связывающим доменом человеческого бета-амилоида. Автором настоящего изобретения показано, что указанный пептид может эффективно применяться для лечения болезни Альцгеймера. На основе пептида создана также фармацевтическая композиция для лечения болезни Альцгеймера. В качестве активного компонента в ней используется пептид “isoD-pS-hAb” согласно изобретению. Остальные компоненты выбраны из круга нейтральных носителей и разбавителей и хорошо известны специалисту в данной области техники (например, физиологичекский раствор).
Таким образом, автором настоящего изобретения к рассмотрению предложено следующее.
1. Пептид “isoD-pS-hAb”, способный образовывать стабильный цинк-опосредованный межмолекулярный комплекс с метал-связывающим доменом человеческого бета-амилоида.
2. Фармацевтическая композиция для лечения болезни Альцгеймера, содержащая эффективное количество пептида согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
3. Способ снижения цинк-индуцированной агрегации бета- амилоида, включающий взаимодействие пептида согласно изобретению с бета-амилоидом.
4. Способ образования цинк-опосредованных межмолекулярных комплексов пептид-бета-амилоид, включающий в взаимодействие пептида согласно изобретению с бета-амилоидом. 5. Способ лечения болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции согласно изобретению. Краткое описание фигур чертежей
На Фиг. 1 представлены полученные наборы кинетических кривых связывания (сенсограммы БППР) аналита “isoD-pS- пАР”с иммобилизованным Ab( 1 - 16)-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys) после вычитания контрольного фона.
Фиг. 2 демонстрирует влияние “isoD-pS-hAb” на цинк- зависимую агрегацию человеческого бета-амилоида Ab42.
На Фиг. 3 представлены результаты анализа пространственной памяти животных, свидетельствующие о значительной разнице между интактными и инъектированными мышами линии «AbRR/PSl» (N «intact» = 9 голов, сплошная линия, черные кружочки), инъектированных препаратом «isoD-pS-hAb» мышей линии «AbRR/PSl» (N «isoD-pS-hAb» = 8 голов, возраст 7 мес., прерывистая линия, черные треугольнички), и контрольных мышей дикого типа (N «wt» = 10 голов, пунктирная линия, пустые треугольнички) в водном лабиринте Морриса. На оси ординат указано время, затраченное животными на поиск платформы при последовательных тестированиях в течение 5 дней. Лучший пример осуществления изобретения
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
ПРИМЕР 1.
Экспериментальное свидетельство способности“isoD-pS- hAb” образовывать стабильные цинк-опосредованные межмолекулярные комплексы с металл-связывающим доменом человеческого бета-амилоида
Образование цинк-связанных комплексов между isoD-pS- hAb (аналитом) и иммобилизованным пептидным фрагментом DAEFRHDSGYEVHHQK (лигандом), соответствующим металл- связывающему домену 1-16 бета-амилоида человека, Ab(1- 16), было исследовано с помощью биосенсора на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (БППР) «ШАсоге 3000» (GE Healthcare, США) в водных буферных системах при физиологических значениях pH. По результатам таких экспериментов рассчитывается значение константы диссоциации (Кд) взаимодействия субстанции и иммобилизованного лиганда. Если значение Кд равно или меньше 10 4 М, то такое взаимодействие рассматривается в качестве биологически значимого.
Перед каждым экспериментом лиофилизированные синтетические пептиды (чистота более 98%), которые использовались в качестве аналита или лиганда, растворяли в подходящей буферной системе. Концентрация каждого пептида в растворе определялась спектрофотометрически с использованием коэффициента экстинкции 1450 М 1 cm 1 при 276 нм (пик поглощения аминокислотного остатка Туг 10 в человеческом Ab).
Сенсорный чип СМ5 с гидрофильной карбоксиметилированной декстрановой матрицей, подходящий буфер HBS (10 мМ HEPES, pH 7.4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0.005% ПВА Р20), 1 -ethyl-3 -(3-dimethylaminopropyl)-25 carbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), 2-(2- pyridinyldithio)-ethaneamine (PDEA), и цистеин, используемые в анализах, были закуплены у компании-производителя (BIAcore, GE, USA). Иммобилизация лиганда проводилась в соотвтествие с протоколами компании-производителя и с использованием соотвтествующих рабочих растворов.
БППР эксперименты были проведен на инструменте «BIAcore 3000» (GE Healthcare, США). Синтетический пептид AC-DAEFRHDSGYEVHHQKGGGGC-NH2 (“ Ab( 1 - 16)-Gly-Gly- Gly-Gly-Cys”) был использован в качестве лиганда, который иммобилизировали через дисульфидную связь тиоловой группы С-концевого остатка цистеина. В качестве аналита использовали синтетический пептид Ac- H[isoD][pS]GYEVHH-NH2 (“isoD-pS- hAb”). Концентрации образцов растворов каждого аналита были 0, 2, 5, 10, 15 и 20 микромолей). На Фиг. 1 представлены полученные наборы кинетических кривых связывания (сенсограммы БППР) аналита “isoD-pS-rbA ”c иммобилизованным Ab(l-16)-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys) после вычитания контрольного фона. Измерения проводились при 25 °С в 10 мМ HEPES буфере (pH 6,8), содержащем различные концентрации аналита (0, 2, 5, 10, 15 и 20 микромолей, кривые 1-
Figure imgf000015_0001
6, соответственно) в присутствии 100 мкМ Zn .
На основании полученых данных было найдено, что константа диссоциации цинк-опосредованных взаимодействий между“isoD-pS-hAb” и иммобилизованным Ab( 1-16)-Gly-Gly- Gly-Gly-Cys составляет (5 ± 0.7)х10 7 М.
Таким образом, показано образование стабильных межмолекулярных комплексов между металл-связывающим доменом бета-амилоида и тестируемым пептидом в присутствии ионов цинка. При этом в отсутствии ионов цинка никаких взаимодействий зафиксированно не было. Следовательно, пептид согласно изобретению представляет собой средство, способное образовать стабильный межмолекулярный комплекс с металл-связывающим доменом человеческого бета-амилоида.
ПРИМЕР 2.
Анализ влияния “isoD-pS-hAb” на образование цинк- индуцированных агрегатов человеческого бета-амилоида (Ab42) методом корреляционной спектроскопии (динамического лазерного светорассеяния).
Размер цинк-индуцированных агрегатов пептидов Ab42 определяли методом корреляционной спектроскопии, используя анализатор размера частиц Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Великобритания), позволяющий измерять диаметр частиц в диапазоне от 0.6 нм до 10 мкм. Измерения проводили при температуре 25 °С в соответствии с инструкцией производителя. Метод корреляционной спектроскопии основан на определении коэффициента диффузии дисперсных частиц в жидкости путем анализа корреляционной функции флуктуаций интенсивности рассеянного света. Размер частиц определяется по формуле Стокса-Эйнштейна, которая связывает коэффициент диффузии с гидродинамическим радиусом частицы. При этом предполагается, что частица имеет сферическую форму.
Для полидисперсной популяции частиц анализатор Zetasizer
Nano ZS даёт распределение частиц по размеру, для чего используется программа CONTIN, являющаяся частью его программного обеспечения. Программа использует математический алгоритм, позволяющий из всех возможных распределений частиц по размеру выбрать то, которое наилучшим образом описывает экспериментально определяемую корреляционную функцию. Программа также определяет средний размер частиц в полидисперсной популяции, который использовался в данной работе для сравнительное анализа.
Пробы для определения размера агрегатов пептидов методом корреляционной спектроскопии готовились следующим образом. 100 мкл раствора пептида Ab42 с концентрацией 30 мкМ в буфере А (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, pH 7,4) смешивали с 20 мкл раствора хлорида цинка концентрацией 150 мМ в буфере А в одноразовой микрокювете BRAND UV (BRAND GMBH, Германия) и немедленно использовали для определения размера агрегатов. Для определения влияния пептида isoD-pS-hAb на цинк- индуцированную агрегацию Ab42 к 100 мкл раствора Ab42 предварительно добавляли 1 мкл раствора пептида isoD-pS-hAb в буфере А с концентрацией, позволяющей получать желаемое молярное соотношение данных пептидов и Ab42 в интервале от 1 до 10, инкубировали смесь 10 мин при комнатной температуре, после чего вносили цинк как описано выше. Конечная концентрация Ab42 в анализируемой пробе составляла 25 мкМ, молярное отношение цинкМД42 было 1 :1, а молярное отношение между isoD-pS-hAb и Ab42 составляло 1 :1, 3:1 и 10: 1.
Результаты показаны на Фиг. 2 - влияние“isoD-pS-hAb” на цинк-зависимую агрегацию человеческого бета-амилоида Ab42.
Из приведенных на Фиг. 2 данных следует, что добавление isoD-pS-hAb существенно снижает способность Ab42 подвергаться цинк-индуцированой агрегации. При этом при повышении концентрации субстанции в смесях процесс ингибирования такой агрегации усиливается.
ПРИМЕР 3.
Улучшение когнитивных функций мышиной модели («AbRR/PSl») болезни Альцгеймера под действием внутривенного введения “isoD-pS-hAb” экспериментальным животным. Для оценки влияния субстанции “isoD-pS-nAP“ на характеристики памяти и обучения экспериментальных животных была использована стандартная методика оценки пространственной памяти в водном лабиринте Морриса. Водный лабиринт Морриса является классическим инструментом для оценки пространственной памяти, зависящей от функции гиппокампа. Важно отметить, что именно в гиппокампе у пациентов при болезни Альцгеймера и у трасгенных мышей линии «AbRR/PSl» агрессивно развивается церебральный амилоидоз. Были использованы три группы семимесячных мышей: интактные животные линии «AbRR/PSl» (N «intact» = 9 голов), инъектированные препаратом “isoD-pS-hAb” мыши линии «AbRR/PSl» (N «isoD-pS-hAb» = 8 голов; препарат вводился внутривенно в дозе 5мг/кг три раза - в возрасте 4, 5 и 6 месяцев), и контрольные мыши дикого типа (N «wt» = 10 голов). Результаты анализа пространственной памяти животных, полученные в этом тесте, продемонстрировали значительную разницу между интактными и инъектированными мышами линии «AbRR/PSl» (Фиг. 3) - анализ пространственной памяти интактных животных линии «AbRR/PSl» (N «intact» = 9 голов, сплошная линия, черные кружочки), инъектированных препаратом «isoD-pS-hAb» мышей линии «AbRR/PSl» (N «isoD- pS-hAb» = 8 голов, возраст 7 мес., прерывистая линия, черные треугольнички), и контрольных мышей дикого типа (N «wt» = 10 голов, пунктирная линия, пустые треугольнички) в водном лабиринте Морриса. Размер бассейна 180 см, платформа расположена стационарно. На оси ординат указано время, затраченное животными на поиск платформы при последовательных тестированиях в течение 5 дней.
Начиная с 3-го дня обучения время, которое требовалось контрольным животным (дикого типа) и инъектированным препаратом «isoD-pS-hAb» трансгенным мышам для нахождения платформы, достоверно сокращалось. В то же время в группе интактных мышей линии «AbRR/PSl» это время оставалось таким же, как и на 1-й день обучения. Таким образом, было показано, что систематические внутривенные инъекции «isoD-pS-hAb» (в дозах по 5 мг/кг) приводили к улучшению способности животных к обучению и поддержанию долговременной памяти по сравнению с интактной контрольной группой трансгенных мышей, что свидетельствует о существенном когнитивно-стимулирующем эффекте этой субстанции.
Промышленная применимость
Изобретение применимо в области биохимии и медицины, а именно, может эффективно применяться для лечения болезни Альцгеймера.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Пептид H[isoD][pS]GYEVHH с открытыми или защищенными концами основной полипептидной цепи (например, с ацетилированным N-концевым амином и амидированным С- концевым гидроксилом), способный образовывать стабильный цинк-опосредованный межмолекулярный комплекс с метал- связывающим доменом человеческого бета-амилоида.
2. Фармацевтическая композиция для лечения болезни
Альцгеймера, содержащая эффективное количество пептида по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
3. Способ снижения цинк-индуцированной агрегации бета- амилоида, включающий взаимодействие пептида по п. 1 с бета- амилоидом.
4. Способ образования цинк-опосредованных межмолекулярных комплексов пептид-бета-амилоид, включающий взаимодействие пептида по п. 1 с бета-амилоидом.
5. Способ лечения болезни Альцгеймера, включающий введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по п. 2.
PCT/RU2019/000158 2018-04-17 2019-03-13 Пептид и способ лечения болезни альцгеймера WO2019203686A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018114087 2018-04-17
RU2018114087A RU2679059C1 (ru) 2018-04-17 2018-04-17 Пептид и способ лечения болезни альцгеймера

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019203686A1 true WO2019203686A1 (ru) 2019-10-24

Family

ID=65273511

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2019/000158 WO2019203686A1 (ru) 2018-04-17 2019-03-13 Пептид и способ лечения болезни альцгеймера

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2679059C1 (ru)
WO (1) WO2019203686A1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006121656A2 (en) * 2005-05-05 2006-11-16 Merck & Co., Inc. Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of alzheimer's disease
WO2013041962A1 (en) * 2011-09-19 2013-03-28 Axon Neuroscience Se Protein-based therapy and diagnosis of tau-mediated pathology in alzheimer's disease
RU2588143C2 (ru) * 2010-10-27 2016-06-27 Кимонелла Венчерс Лтд Пептидное соединение, полезное для ингибирования образования амилоидных бляшек

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006121656A2 (en) * 2005-05-05 2006-11-16 Merck & Co., Inc. Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of alzheimer's disease
RU2588143C2 (ru) * 2010-10-27 2016-06-27 Кимонелла Венчерс Лтд Пептидное соединение, полезное для ингибирования образования амилоидных бляшек
WO2013041962A1 (en) * 2011-09-19 2013-03-28 Axon Neuroscience Se Protein-based therapy and diagnosis of tau-mediated pathology in alzheimer's disease

Also Published As

Publication number Publication date
RU2679059C1 (ru) 2019-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Carpenter Effects of metals on the nervous system of humans and animals
Shen et al. Ultrasound with microbubbles improves memory, ameliorates pathology and modulates hippocampal proteomic changes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease
Pickering‐Brown et al. Pick's disease is associated with mutations in the tau gene
US8409575B2 (en) Antibodies specific for amyloid beta protofibril
Poujois et al. Wilson disease: brain pathology
Blume et al. BACE1 inhibitor MK-8931 alters formation but not stability of dendritic spines
JP2001501972A (ja) アミロイドベータタンパク質（球状アッセンブリーおよびその使用）
Ayton et al. β-amyloid: The known unknowns
Shapira et al. Hyperbaric oxygen therapy alleviates vascular dysfunction and amyloid burden in an Alzheimer’s disease mouse model and in elderly patients
Si et al. Matrix metalloproteinase-9 inhibition prevents aquaporin-4 depolarization-mediated glymphatic dysfunction in Parkinson’s disease
JP2009108059A (ja) 認知障害を患う患者の治療のための薬物の調製を目的とする治療用ヒトアルブミンの使用
Gruden et al. S100A9 protein aggregates boost hippocampal glutamate modifying monoaminergic neurochemistry: a glutamate antibody sensitive outcome on Alzheimer-like memory decline
Mandybur et al. Cerebral aging: a quantitative study of gliosis in old nude mice
US9161950B2 (en) Neuronal protection by cerium oxide nanoparticles
Reyes Barcelo et al. Soluble aggregates of the amyloid-β peptide are trapped by serum albumin to enhance amyloid-β activation of endothelial cells
RU2679059C1 (ru) Пептид и способ лечения болезни альцгеймера
RU2679080C1 (ru) Пептид и способ лечения болезни альцгеймера
EP1392347B1 (en) Preventing cell death using segments of neural thread proteins
JP7419229B2 (ja) 方法
CA3191044A1 (en) Use of annexin a5
Wang et al. Fasudil alleviates brain damage in rats after carbon monoxide poisoning through regulating neurite outgrowth inhibitor/oligodendrocytemyelin glycoprotein signalling pathway
US20100119450A1 (en) Soluble low-density lipoprotein receptor related protein binds directly to alzheimer's amyloid-beta peptide
EP3370738A2 (en) Treatment of neurodegenerative disease with sodium chlorite
Kozin Role of Interaction between Zinc and Amyloid Beta in Pathogenesis of Alzheimer’s Disease
Walton Cognitive Deterioration and Related Neuropathology in Older People with Alzheimer's Disease could Result from Life-Long Exposure to Aluminium Compounds

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19789510

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19789510

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1