WO2019197760A1 - Method for purifying proteins from a microalgae extract - Google Patents

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WO2019197760A1
WO2019197760A1 PCT/FR2019/050811 FR2019050811W WO2019197760A1 WO 2019197760 A1 WO2019197760 A1 WO 2019197760A1 FR 2019050811 W FR2019050811 W FR 2019050811W WO 2019197760 A1 WO2019197760 A1 WO 2019197760A1
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cpc
stationary phase
migration
column
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Application number
PCT/FR2019/050811
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French (fr)
Inventor
Sébastien CHOLLET
Luc Marchal
Anthony MASSE
Original Assignee
Universite De Nantes
Centre National De La Recherche Scientifique
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
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Definitions

  • the present invention is in the field of marine microalgae extracts, and concerns in particular a protein fraction isolated from a red microalga and its method of production.
  • Phycobiliproteins can be obtained in large quantities from algae or microalgae.
  • Phycobiliproteins are of four types: allophycocyanin, phycocyanin, phycoerythrin and phycoerythrocyanin. Such proteins are recovered after cell disintegration and solid-liquid separation steps.
  • the supernatant obtained which contains the phycobiliprotein can be isolated and / or purified using a capture technique (absorption) on ion exchange resin, at least one isoelectric precipitation optionally coupled to liquid / liquid extractions using bi-aqueous systems.
  • aqueous two-phase systems such as ATPS (English term: aqueous two phase system), which may include PEG 6000 ( polyethylene glycol of molar mass: 6000 g mol 1 ) and a phosphate buffer in a medium at pH 7.
  • ATPS American term: aqueous two phase system
  • PEG 6000 polyethylene glycol of molar mass: 6000 g mol 1
  • phosphate buffer in a medium at pH 7.
  • CPC centrifugal partition chromatography
  • the present invention aims to improve the prior art techniques for extracting and purifying phycobiliproteins with a yield greater than 70% and a high degree of purity, in a simple, fast manner and by implementing a method which is part of a sustainable development approach.
  • the present invention relates to a method for purifying at least one protein comprising a purification step using a centrifugal partition chromatography column (CPC column) from a microalgae extract dispersed in a mixture comprising a aqueous two-phase solvent system (ATPS), said two phases constituting a mobile phase of the CPC and a stationary phase of the CPC.
  • CPC column centrifugal partition chromatography column
  • AVS aqueous two-phase solvent system
  • CPC centrifugal partition chromatography
  • the term "ATPS" refers to an aqueous system of two-phase solvents, examples of such systems are described in the article by Arafat M. Goja et al. J Bioproces Biotechniq 2013, 4: 1.
  • the ATPS system implemented in the context of the invention is advantageously a system comprising polyethylene glycol (PEG), such as the aqueous system of two-phase solvents contains from 8 to 15% by weight of polyethylene glycol of molar mass from 2000 to 8000 g. mol 1 , or 3500 to 6500 g. mol 1 , and 10 to 17% by weight of K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 at pH 7.
  • PEG polyethylene glycol
  • the ATPS system used comprises polyethylene glycol with a molar mass of 6000 g. mol 1 which is qualified as PEG 6000.
  • polyethylene glycol of molar mass of 1000, 2000 and 8000 g. mol 1 will also be qualified respectively as PEG 1000, PEG 2000 and PEG 8000.
  • the inventors have unexpectedly shown that the ATPS two-phase solvent system used in carrying out CPC chromatography makes it possible to obtain a protein extracted from a microalgae with an unprecedented yield and degree of purity.
  • a CPC performed under such conditions has proved particularly effective and quick to perform for the purification of a phycobiliprotein. This process makes it possible to have short purification cycles from the extract, while operating with very small volumes of liquids.
  • the overall yield of extracted protein is greater than 70% and the proteins obtained are not, or very slightly, denatured.
  • the method according to the invention implements the following steps:
  • step b) an injection of the mixture obtained in step a) into the CPC column by starting a first pump adapted to pass the phase to be injected contained in the first container in contact with the stationary phase in a first direction of migration;
  • the method described above comprises a step d. pumping by configuring the pumping in the opposite direction to the aforementioned first direction of migration, described as second direction of migration (upward mode (AM) versus downward mode (DM)).
  • This mode of operation of the CPC chromatography is called dual mode ("dual mode") and allows alternating stationary and mobile phases during separation. It is thus possible to make the stationary phase mobile and conversely to make the mobile phase stationary.
  • This step allows the extrusion recovery of the protein of interest, and also allows the reconditioning of a portion of the column with recycled stationary phase injected into the column.
  • the inventors have shown that such a process makes it possible to finely separate phycobiliproteins from other very close molecules of structure and / or mass.
  • the CPC column comprises cells of substantially spherical geometry. This configuration of the cells makes it possible to optimize the purification efficiency of phycobiliproteins.
  • the internal volume of all the cells is advantageously such that the retention in the stationary phase is between 50 and 80%, or even 65 and 70%.
  • This configuration of the cells makes it possible to promote the decantation of the two-phase system (ATPS) and thus to achieve better stationary phase retentions than systems operating with cells having other geometries, such as "twin cell” cells.
  • the number of cells is less than or equal to 50.
  • the inventors have shown that the use of CPC under the conditions according to the invention made it possible to use relatively short columns of less than 50 cells while remaining effective: this facilitates handling and reduces the necessary eluent volumes.
  • the method according to the invention uses two CPC chromatography columns, a first CPC column and a second CPC column, which operate sequentially. Sequential operation involves mounting two columns, first and second columns, in parallel.
  • step c) is carried out in the second column thus carrying out the purification of the captured protein: impurities that can be entrained by the mobile phase (the duration of steps b) and d) being equal to that of step c) ); and
  • step b1) an injection of a first volume of the mixture obtained in step a1) in a first CPC column by starting a first pump adapted to pass the phase to be injected contained in the first container in contact with the phase stationary in a first direction of migration;
  • c1) a washing to remove impurities by starting a second pump adapted to transit the mobile phase contained in a second container in contact with the stationary phase in the first direction of migration;
  • step b2) injecting a second volume of the mixture obtained in step a) into the second CPC column by starting the first pump adapted to pass the phase to be injected contained in the first container in contact with the stationary phase in the first direction of migration;
  • the process according to the invention comprises at least one filtration step of at least one of the two phases chosen from the stationary phase (enriched in BPE) and the mobile phase (to be recycled), by membrane filtration.
  • the process according to the invention more advantageously comprises at least three membrane filtration steps for filtering once the mobile phase and twice the stationary phase enriched in BPE.
  • a membrane process makes it possible to recover the proteins with an improved degree of purity, and to be able to recycle the bi-phasic solvent system.
  • Purified water is added during this step for the realization of the filtration and in order to recover the maximum of material.
  • the purified water is preferably deionized water by distillation, filtration and / or electrodialysis.
  • the membrane filters implemented according to the invention are configured in the following manner: in which a first membrane filter filters the stationary phase recovered in steps e1) and e2) to improve the purification of the substance of interest which is isolated; a second membrane filter filters the stationary phase eluted from the first membrane filter for recycling; and a third membrane filter filters the mobile phase recovered at the column outlet for recycling.
  • the membranes used are preferably membranes capable of ultrafiltration or nanofiltration, such as the range marketed by NADIR®.
  • the injection into the two CPC columns carried out according to the process of the invention of at least one of the liquids chosen from the microalgae extract dispersed in a mixture comprising an aqueous system of two-phase solvents, the phase mobile and the stationary phase is controlled by three-way valves, designated first, second and third three-way valves.
  • the liquids chosen from the microalgae extract dispersed in a mixture comprising an aqueous system of two-phase solvents, the mobile phase and the stationary phase open into a first four-way valve upstream of the first CPC column and into a second four-way valve upstream of the second CPC column.
  • the modes of elution of the mobile and stationary phases in the CPC columns are sequentially controlled by these two four-way valves, designated first and second four-way valves.
  • the first and second four-way valves open respectively on the collection lines of the first and second CPC columns.
  • the mobile and stationary phases at the CPC column output are separated sequentially by a four-way valve and a fourth three-way valve.
  • a concentrated microalgal porphyridium cruentum extract - stored overnight in the fridge - is thawed by centrifugation.
  • the whole is inserted into a 15 mL flask (a 15 mL plastic flask from Fisherbrand®) and then placed for 15 minutes in an ultrasonic bath known under the trade name VWR® Ultrasonic Cleaner.
  • the mixture from the sonication is centrifuged at 3900 rpm (revolutions per minute) for 20 minutes in a Mikro 22R TM centrifuge of the company Hettich zentrifugen TM.
  • rpm means "rotation per minute” in English, its French translation being “revolutions per minute”.
  • the supernatant is then passed on a CPC column under the conditions detailed in point II. of this experimental part.
  • Tests were also conducted with PEG 1000, 2000 and 8000 respectively (polyethylene glycol of molar mass: 1000, 2000 and 8000 g, mol -1 ).
  • UV-visible spectrum is measured between 250 and 800 nm for each of the phases for the systems studied.
  • the purity index will be evaluated for the characteristic wavelengths of phycobiliproteins (550nm for BPE) and the wavelength characteristic of total proteins (280nm)
  • CPC centrifugal partition chromatography
  • the chromatography part comprises all the components of a centrifugal partition chromatography apparatus:
  • An AP100 pump sold by Armen Instrument TM, allowing the various phases of the system to be set in motion.
  • the connectors used on this device are 1 / 8th low-pressure PTFE connectors marketed by UpChurch®.
  • the visual column studied is connected to the system via two rotating joints marketed by the company Armen TM.
  • the UV / visible signal is recorded by a spectra detector 100 (Thermo separation, San Jose, US).
  • the column is made of polycarbonate and has a volume of 48 ml (ie 1.3 ml per cell).
  • the column is pre-equilibrated at 65-70% retention by eluting the saline phase (which comprises the phosphate buffer system) at 35 mL / min and 1600 rpm (revolutions per minute) through the phase comprising the PEG in descending mode during 2 minutes 30 to 3 minutes.
  • saline phase which comprises the phosphate buffer system
  • the extract to be treated is then injected in descending mode at 20 ml / min and 1600 rpm.
  • the capture is then performed in the column.
  • the capture consists of a transfer of the target molecule (s) to the stationary phase for which they have a high affinity (partition coefficient KD> 5).
  • Fresh mobile phase elution is performed at 20 mL / min and 1600 rpm in order to remove molecules with less affinity for the stationary phase (KD ⁇ 5).
  • the recovery of the target protein is carried out in ascending (AM) mode, that is to say that the "dual mode" is activated, eluting at 20 ml / min and 1600 rpm.
  • the entire purification process on CPC is shown in FIG. 2.
  • the retentions of the ATPS systems 2 and 3 were measured and are reported in Table 2 (the operating conditions corresponding to the measurements reported in Table 2 are 10 to 40 mL / min in flow with a centrifugal acceleration of 155 xg): Table 2.
  • the recovery of the BPE and the regeneration of the phases (PEG and salts) is carried out by membrane filtration.
  • the membrane chosen for the filtration is a membrane (or membrane filter) for ultrafiltration (UF) marketed under the reference RM UH050 P1016 by the company NADIR®, and having a cutoff threshold at 50 kDa.
  • a membrane for nanofiltration (NF) sold by the company NADIR® can be used alternately or in combination.
  • FIG. 4 illustrates the entire process which integrates the membrane filtration steps. IV. CPC column purification
  • a first column 1 is put into operation and injected with microalgal extract dispersed in ATPS from a first container 2 (see point I. of this experimental part, A in Figure 4).
  • a first pump 3 is connected on the one hand upstream to the first container 2, and downstream on a first three-way valve 4 to perform the injection (B in Figure 4).
  • a first four-way valve 5 is placed downstream of the first column 1 for the downward mode.
  • the stationary phase and the mobile phase are recovered separately during the sequence, respectively in a third receptacle 9 and a fourth receptacle 10, thanks to a second four-way valve 11a and a third three-way valve 11b .
  • the stationary phase recovered in the third container 9 is treated by membrane process by passing through a first membrane filter 12 under the conditions described in point III. (E in Figure 4), to obtain;
  • a stationary phase to be cleaned by another treatment using a passage in a second membrane filter 14 (F in FIG. 4): the filtered stationary phase is collected in a fifth container 15 downstream of which a third pump 16 is connected and a third three-way valve 17, one of the outputs leads to an inlet pipe of the first column 1 CPC to feed continuously in stationary phase recycled.
  • the mobile phase recovered in the fourth container 10 is also treated by membrane process by passing through a third membrane filter 18 under the conditions described in point III. (D in FIG. 4), which makes it possible to regenerate the mobile phase packaged in the second container 6 in order to feed it continuously into the recycled mobile phase, as explained above.
  • FIG. 4 schematically shows the succession of the steps of the purification process according to the invention, and for which the main steps A, B, C, D, E and F have been repeated in connection with FIG.
  • the pumps and / or the valves are controlled by an automaton which makes it possible to replenish the columns in mobile and stationary phases according to the levels measured using sensors.
  • a second CPC column 19 is connected in parallel with the first column 1 as illustrated in FIG. 4.
  • Such an arrangement allows continuous operation, with mobile and / or stationary phase charging. optimal in at least one of the two columns, which represents a gain in productivity consequent as shown in point VI.
  • the purity index measured represents the ratio: specific absorbance of the protein at 550 nm / absorbance at 280 nm
  • the purity index measured is between 3.5 to 4.2 and a productivity of purified BPE of 4.2 g / h / hr.
  • L stat (gram of BPE purified per hour per liter of stationary phase engaged in the column); the results are shown in FIG. 5 by a graph containing on the abscissa the volume collected in ml and the ordinate on the purity index (550/220).
  • the first and third four-way valves 5 and 21 are placed upstream of the two CPC columns, to allow the choice of the elution mode in the two columns and to be able to finely control the synchronous / asynchronous operation of the two CPC columns.
  • the pumps and / or the valves are controlled by an automaton which makes it possible to restock the columns in mobile and stationary phase according to the levels measured using sensors.
  • Figure 5 shows the measurement of the purity index (550/280) as a function of the volume collected in mL, by a scatter plot (indicated by the squares) indicated by the "A" brace corresponding to the fractions collected during seven sequences.
  • the brace "B” shows a four point cloud corresponding to the measure of the purity index of the content remaining in the column.

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Abstract

The invention relates to a method for purifying proteins comprising a purification step that uses centrifugal partition chromatography, referred to as CPC, from a microalgae extract dispersed in a mixture comprising an aqueous two-phase solvent system.

Description

Procédé de purification de protéines à partir d’extrait de microalques  Process for purifying proteins from microalve extract
La présente invention est du domaine des extraits de microalgues marines, et concerne en particulier une fraction protéinique isolée à partir d’une microalgue rouge et son procédé d’obtention. Les phycobiliprotéines peuvent être obtenues en quantités importante à partir des algues ou des microalgues. Les phycobiliprotéines sont de quatre types : l’allophycocyanine, la phycocyanine, la phycoérythrine et la phycoérythrocyanine. De telles protéines sont récupérées après désintégration cellulaire et des étapes de séparation solide-liquide. Le surnageant obtenu qui contient la phycobiliprotéine peut être isolé et/ou purifié en utilisant une technique de capture (absorption) sur résine échangeuse d’ions, au moins une précipitation isoélectrique éventuellement couplée à des extractions liquide/liquide mettant en oeuvre des systèmes aqueux bi-phasiques, comme cela est décrit par exemple dans la demande US2010/0178674. Il est également connu d’isoler ce type de protéine grâce à des composés organiques tels que l’acide salicylique, comme cela est décrit dans la demande WO2016030643. Cependant de telles techniques de précipitation et/ou d’absorption à l’échelle industrielle, demandent de manipuler des volumes en eau conséquents et des quantités de sels très importantes, ce qui requiert la mise en service d’installations complexes à contrôler et à maintenir en fonctionnement, et impacte fortement l’environnement. The present invention is in the field of marine microalgae extracts, and concerns in particular a protein fraction isolated from a red microalga and its method of production. Phycobiliproteins can be obtained in large quantities from algae or microalgae. Phycobiliproteins are of four types: allophycocyanin, phycocyanin, phycoerythrin and phycoerythrocyanin. Such proteins are recovered after cell disintegration and solid-liquid separation steps. The supernatant obtained which contains the phycobiliprotein can be isolated and / or purified using a capture technique (absorption) on ion exchange resin, at least one isoelectric precipitation optionally coupled to liquid / liquid extractions using bi-aqueous systems. -phasic, as described for example in the application US2010 / 0178674. It is also known to isolate this type of protein through organic compounds such as salicylic acid, as described in the application WO2016030643. However, such precipitation and / or absorption techniques on an industrial scale require the handling of large volumes of water and very large amounts of salts, which requires the commissioning of complex installations to be controlled and maintained. in operation, and strongly impacts the environment.
D’autres méthodes ont été développées pour l’extraction de telles protéines à partir des algues ou des microalgues. Une de ces méthodes alternatives consiste à isoler des protéines en mettant en oeuvre des systèmes aqueux à deux phases tels que l’ATPS (acronyme anglo-saxon pour le terme anglais : « aqueous two phase System »), lequel peut comprendre du PEG 6000 (polyéthylène glycol de masse molaire : 6000 g. mol 1) et un tampon phosphate dans un milieu à pH 7. L’article Liu Y. et al. , Food and Bioproducts Processing, vol.90(2) Apr. page 111-117 décrit un tel système d’ATPS pour l’extraction de phycobiliprotéines à partir de la microalgue spirulina platensis par la méthode de distribution à contre-courant (connue sous l’acronyme anglo-saxon : CCD - « contercurrent distribution »). Une telle méthode dite CCD comporte de nombreuses étapes, notamment des extractions multi-étagées (dix niveaux de séparation), et les puretés des protéines obtenues restent médiocres. Other methods have been developed for extracting such proteins from algae or microalgae. One of these alternative methods consists in isolating proteins by using aqueous two-phase systems such as ATPS (English term: aqueous two phase system), which may include PEG 6000 ( polyethylene glycol of molar mass: 6000 g mol 1 ) and a phosphate buffer in a medium at pH 7. The article Liu Y. et al. , Food and Bioproducts Processing, vol.90 (2) Apr. page 111-117 describes such an ATPS system for the extraction of phycobiliproteins from the microalga spirulina platensis by the countercurrent distribution method (known under the acronym: CCD - "Contercurrent distribution"). Such a so-called CCD method involves many steps, including multi-step extractions (ten separation levels), and the purities of the proteins obtained remain poor.
Une autre technique employée pour la purification des protéines à partir d’une algue est la technique dite de chromatographie de partage centrifuge (CPC) qui est une chromatographie liquide-liquide sans support solide. La demande KR201 101 19071 décrit une telle méthode de CPC pour l’isolation de fucoxanthine à partir d’un extrait d’algue.  Another technique used for the purification of proteins from an alga is the so-called centrifugal partition chromatography (CPC) technique which is liquid-liquid chromatography without solid support. Application KR201 101 19071 describes such a CPC method for isolating fucoxanthin from an algae extract.
La présente invention vise à améliorer les techniques de l’art antérieures en vue d’extraire et de purifier des phycobiliprotéines avec un rendement supérieur à 70% et un haut degré de pureté, de manière simple, rapide et en mettant en oeuvre un procédé qui s’inscrive dans une démarche de développement durable. The present invention aims to improve the prior art techniques for extracting and purifying phycobiliproteins with a yield greater than 70% and a high degree of purity, in a simple, fast manner and by implementing a method which is part of a sustainable development approach.
La présente invention concerne à cet effet un procédé de purification d’au moins une protéine comprenant une étape de purification mettant en oeuvre une colonne de chromatographie de partage centrifuge (colonne CPC) à partir d’un extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant un système aqueux de solvants à deux phases (ATPS), lesdites deux phases constituant une phase mobile de la CPC et une phase stationnaire de la CPC. To this end, the present invention relates to a method for purifying at least one protein comprising a purification step using a centrifugal partition chromatography column (CPC column) from a microalgae extract dispersed in a mixture comprising a aqueous two-phase solvent system (ATPS), said two phases constituting a mobile phase of the CPC and a stationary phase of the CPC.
Le terme « chromatographie de partage centrifuge » (CPC) désigne la technique de chromatographie sans support solide, basée sur le principe des coefficients de partage de différents solutés dans un milieu comprenant deux liquides non miscibles constituant un système bi-phasique liquide/liquide, et sur la mise en contact des deux liquides tout en les séparant un très grand nombre de fois par une agitation et un déplacement d’une des phases provoquées par une force centrifuge. Une telle chromatographie CPC est décrite dans la demande FR 2 791 578. The term "centrifugal partition chromatography" (CPC) refers to the chromatography technique without solid support, based on the principle of the partition coefficients of different solutes in a medium comprising two immiscible liquids constituting a liquid / liquid two-phase system, and contacting the two liquids while separating them a very large number of times by stirring and displacement of one of the phases caused by a centrifugal force. Such CPC chromatography is described in application FR 2 791 578.
Le terme « ATPS » désigne un système aqueux de solvants à deux phases, des exemples de tels systèmes sont décrit dans l’article de Arafat M. Goja et al. J Bioproces Biotechniq 2013, 4:1. Le système ATPS mis en oeuvre dans le cadre de l’invention est avantageusement un système comprenant du polyéthylène glycol (PEG), tel que le système aqueux de solvants à deux phases contient de 8 à 15% en masse de polyéthylène glycol de masse molaire de 2000 à 8000 g. mol 1, voire 3500 à 6500 g. mol 1, et 10 à 17% en masse de K2HPO4/KH2PO4 à pH 7. L’ATPS comprend en outre un tampon pour maintenir un pH=7, il s’agit de du tampon phosphate de potassium (K2HPO4/KH2PO4). Plus avantageusement, le procédé selon l’invention met en oeuvre l’utilisation du système ATPS contenant de 8 à 15% (w/w) de PEG 6000 et 10 à 17% (w/w) de K2HPO4/KH2PO4 (pH7). Dans ce cadre, le système ATPS mis en oeuvre comprend du polyéthylène glycol de masse molaire de 6000 g. mol 1 qui est qualifié de PEG 6000. The term "ATPS" refers to an aqueous system of two-phase solvents, examples of such systems are described in the article by Arafat M. Goja et al. J Bioproces Biotechniq 2013, 4: 1. The ATPS system implemented in the context of the invention is advantageously a system comprising polyethylene glycol (PEG), such as the aqueous system of two-phase solvents contains from 8 to 15% by weight of polyethylene glycol of molar mass from 2000 to 8000 g. mol 1 , or 3500 to 6500 g. mol 1 , and 10 to 17% by weight of K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 at pH 7. The ATPS further comprises a buffer to maintain a pH = 7, it is potassium phosphate buffer ( K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 ). More advantageously, the process according to the invention uses the use of the ATPS system containing from 8 to 15% (w / w) of PEG 6000 and 10 to 17% (w / w) of K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (pH7). In this context, the ATPS system used comprises polyethylene glycol with a molar mass of 6000 g. mol 1 which is qualified as PEG 6000.
Dans la suite de la présente demande les polyéthylènes glycol de masse molaire de 1000, 2000 et 8000 g. mol 1 seront également qualifiés respectivement de PEG 1000, PEG 2000 et PEG 8000. In the remainder of the present application polyethylene glycol of molar mass of 1000, 2000 and 8000 g. mol 1 will also be qualified respectively as PEG 1000, PEG 2000 and PEG 8000.
Les inventeurs ont montré de manière inattendue que le système de solvants à deux phases ATPS utilisés en réalisant une chromatographie CPC permettait d’obtenir une protéine extraite d’une microalgue avec un rendement et un degré de pureté sans précédent. Une CPC réalisée dans de telles conditions s’est avérée particulièrement efficace et rapide à exécuter pour la purification d’une phycobiliprotéine. Ce procédé permet d’avoir des cycles courts de purification à partir de l’extrait, tout en fonctionnant avec des volumes de liquides très réduit. Le rendement global en protéine extraite est supérieur à 70% et les protéines obtenues ne sont pas, ou très faiblement, dénaturées. The inventors have unexpectedly shown that the ATPS two-phase solvent system used in carrying out CPC chromatography makes it possible to obtain a protein extracted from a microalgae with an unprecedented yield and degree of purity. A CPC performed under such conditions has proved particularly effective and quick to perform for the purification of a phycobiliprotein. This process makes it possible to have short purification cycles from the extract, while operating with very small volumes of liquids. The overall yield of extracted protein is greater than 70% and the proteins obtained are not, or very slightly, denatured.
Avantageusement, le procédé selon l’invention met en oeuvre les étapes suivantes : Advantageously, the method according to the invention implements the following steps:
a) une dispersion de l’extrait à purifier dans le système aqueux de solvants à deux phases dans un premier récipient ;  a) a dispersion of the extract to be purified in the aqueous system of two-phase solvents in a first container;
b) une injection du mélange obtenu à l’étape a) dans la colonne CPC par mise en route d’une première pompe adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient en contact avec la phase stationnaire dans un premier sens de migration ;  b) an injection of the mixture obtained in step a) into the CPC column by starting a first pump adapted to pass the phase to be injected contained in the first container in contact with the stationary phase in a first direction of migration;
c) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route d’une deuxième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans un deuxième récipient en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration; c) a washing to remove impurities by starting a second pump adapted to transit the mobile phase contained in a second container in contact with the stationary phase in the first direction of migration;
d) une extrusion par mise en route d’une troisième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de second sens de migration.  d) an extrusion by putting into operation a third pump adapted to pass the mobile phase in contact with the stationary phase in the opposite direction to the above-mentioned first direction of migration, referred to as the second direction of migration.
Le procédé décrit ci-dessus comprend une étape d. de pompage en configurant le pompage dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de deuxième sens de migration (mode ascendant (AM) versus mode descendant (DM)). Ce mode de fonctionnement de la chromatographie CPC est qualifié de mode double (« dual mode ») et permet d'alterner les phases stationnaire et mobile en cours de séparation. Il est ainsi possible de rendre mobile la phase stationnaire et inversement de rendre stationnaire la phase mobile. Cette étape permet la récupération par extrusion de la protéine d’intérêt, et permet également le reconditionnement d’une partie de la colonne avec de la phase stationnaire recyclée injectée dans la colonne. The method described above comprises a step d. pumping by configuring the pumping in the opposite direction to the aforementioned first direction of migration, described as second direction of migration (upward mode (AM) versus downward mode (DM)). This mode of operation of the CPC chromatography is called dual mode ("dual mode") and allows alternating stationary and mobile phases during separation. It is thus possible to make the stationary phase mobile and conversely to make the mobile phase stationary. This step allows the extrusion recovery of the protein of interest, and also allows the reconditioning of a portion of the column with recycled stationary phase injected into the column.
Les inventeurs ont montré qu’un tel procédé permet de séparer finement des phycobiliprotéines d’autres molécules de structure et/ou de masse très proches. The inventors have shown that such a process makes it possible to finely separate phycobiliproteins from other very close molecules of structure and / or mass.
Avantageusement, la colonne de CPC comprend des cellules de géométrie sensiblement sphériques. Cette configuration des cellules permet d’optimiser le rendement de purification des phycobiliprotéines. Le volume interne de l’ensemble des cellules est avantageusement tel que la rétention en phase stationnaire soit comprise entre 50 et 80%, voire 65 et 70%. Advantageously, the CPC column comprises cells of substantially spherical geometry. This configuration of the cells makes it possible to optimize the purification efficiency of phycobiliproteins. The internal volume of all the cells is advantageously such that the retention in the stationary phase is between 50 and 80%, or even 65 and 70%.
La rétention en phase stationnaire se défini comme suit : Sf = [Volume de phase stationnaire dans les cellules (en mL)] / [Volume des cellules (en mL)] x 100, c'est-à-dire
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Stationary phase retention is defined as follows: Sf = [Stationary phase volume in cells (in mL)] / [Cell volume (in mL)] x 100, i.e.
Figure imgf000006_0001
Cette configuration des cellules permet de favoriser la décantation du système à deux phases (ATPS) et donc d’atteindre de meilleures rétentions en phase stationnaire que les systèmes fonctionnant avec des cellules ayant d’autres géométries, telles que les cellules dites « twin cells ». De préférence, le nombre de cellules est inférieur ou égal à 50. Les inventeurs ont montré que l’utilisation de la CPC dans les conditions selon l’invention permettait d’utiliser des colonnes relativement courtes de moins de 50 cellules tout en restant efficace : ce qui facilite les manipulations et réduit les volumes d’éluant nécessaires. This configuration of the cells makes it possible to promote the decantation of the two-phase system (ATPS) and thus to achieve better stationary phase retentions than systems operating with cells having other geometries, such as "twin cell" cells. . Preferably, the number of cells is less than or equal to 50. The inventors have shown that the use of CPC under the conditions according to the invention made it possible to use relatively short columns of less than 50 cells while remaining effective: this facilitates handling and reduces the necessary eluent volumes.
Avantageusement, le procédé selon l’invention met en oeuvre deux colonnes de chromatographie CPC, une première colonne CPC et une deuxième colonne CPC, qui fonctionnent de manière séquentielle. Le fonctionnement séquentiel implique de monter deux colonnes, une première et une deuxième colonne, en parallèle. Advantageously, the method according to the invention uses two CPC chromatography columns, a first CPC column and a second CPC column, which operate sequentially. Sequential operation involves mounting two columns, first and second columns, in parallel.
Les séquences sont avantageusement calibrées afin de réaliser une purification en continue :  The sequences are advantageously calibrated in order to carry out a continuous purification:
- lorsque les étapes b) et d) sont réalisées dans la première colonne, permettant ainsi la récupération de la phase stationnaire enrichie en phycobiliprotéines (à l’étape n-1 du procédé en continu) puis à la réalisation d’une nouvelle injection, l’étape c) est réalisée dans la seconde colonne en effectuant ainsi la purification de la protéine capturée : des impuretés pouvant être entraînées par la phase mobile (la durée des étapes b) et d) étant égale à celle de l’étape c)) ; et  when steps b) and d) are carried out in the first column, thus making it possible to recover the stationary phase enriched in phycobiliproteins (at step n-1 of the continuous process) and then to carry out a new injection, step c) is carried out in the second column thus carrying out the purification of the captured protein: impurities that can be entrained by the mobile phase (the duration of steps b) and d) being equal to that of step c) ); and
- les étapes d), puis b) sont réalisées dans la seconde colonne pendant que dans la première colonne est réalisée l’étape c) ; et ainsi de suite...  - Steps d), then b) are performed in the second column while in the first column is performed step c); And so on...
Grâce à ce fonctionnement séquentiel, une production en continue est réalisable. La préparation de volumes important en protéines purifiées à l’échelle industrielle est accessible, grâce à un tel procédé.  Thanks to this sequential operation, continuous production is feasible. The preparation of large volumes of proteins purified on an industrial scale is accessible, thanks to such a process.
Le procédé selon l’invention en mode séquentiel met en oeuvre avantageusement les étapes suivantes : The method according to the invention in sequential mode advantageously implements the following steps:
a) une dispersion de l’extrait à purifier dans le système aqueux de solvants à deux phases dans un premier récipient ;  a) a dispersion of the extract to be purified in the aqueous system of two-phase solvents in a first container;
b1 ) une injection d’un premier volume du mélange obtenu à l’étape a1 ) dans une première colonne CPC par mise en route d’une première pompe adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient en contact avec la phase stationnaire dans un premier sens de migration ;  b1) an injection of a first volume of the mixture obtained in step a1) in a first CPC column by starting a first pump adapted to pass the phase to be injected contained in the first container in contact with the phase stationary in a first direction of migration;
c1 ) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route d’une deuxième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans un deuxième récipient en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration ; c1) a washing to remove impurities by starting a second pump adapted to transit the mobile phase contained in a second container in contact with the stationary phase in the first direction of migration;
d1 ) une extrusion par mise en route d’une troisième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de second sens de migration ;  d1) an extrusion by putting into operation a third pump adapted to pass the mobile phase in contact with the stationary phase in the opposite direction to the aforesaid first direction of migration, referred to as the second direction of migration;
e1 ) une récupération de la phase stationnaire enrichie en substance d’intérêt ;  e1) recovery of the stationary phase enriched in substance of interest;
b2) une injection d’un deuxième volume du mélange obtenu à l’étape a) dans la seconde colonne CPC par mise en route de la première pompe adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient en contact avec la phase stationnaire dans le premier sens de migration ;  b2) injecting a second volume of the mixture obtained in step a) into the second CPC column by starting the first pump adapted to pass the phase to be injected contained in the first container in contact with the stationary phase in the first direction of migration;
c2) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route de la deuxième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans le deuxième récipient en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration ;  c2) washing to remove impurities by starting the second pump adapted to pass the mobile phase contained in the second container in contact with the stationary phase in the first direction of migration;
d2) une extrusion par mise en route de la troisième pompe adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le second sens de migration ;  d2) an extrusion by putting into operation the third pump adapted to pass the mobile phase in contact with the stationary phase in the second direction of migration;
e2) une récupération de la phase stationnaire enrichie en substance d’intérêt.  e2) a recovery of the stationary phase enriched in substance of interest.
Avantageusement, le procédé selon l’invention comprend au moins une étape de filtration d’au moins une des deux phases choisies parmi la phase stationnaire (enrichie en BPE) et la phase mobile (à recycler), par filtration membranaire. Le procédé selon l’invention comprend plus avantageusement au moins trois étapes de filtration membranaire pour filtrer une fois la phase mobile et deux fois la phase stationnaire enrichie en BPE. Un tel processus de filtration sur membrane, qualifié de procédé membranaire, permet de récupérer les protéines avec un degré de pureté amélioré, et de pouvoir recycler le système de solvant bi-phasique. De l’eau purifiée est ajoutée lors de cette étape pour la réalisation de la filtration et afin de récupérer le maximum de matière. L’eau purifiée est de préférence une eau déminéralisée par distillation, filtration et/ou électrodialyse. Avantageusement, les filtres à membrane mis en œuvre procédé selon l’invention sont configurés de la manière suivante : dans lequel un premier filtre membranaire filtre la phase stationnaire récupérée aux étapes e1 ) et e2) pour améliorer la purification de la substance d’intérêt qui est isolée ; un deuxième filtre membranaire filtre la phase stationnaire éluée à partir du premier filtre membranaire en vue de son recyclage ; et un troisième filtre membranaire filtre la phase mobile récupérée en sortie de colonne en vue de son recyclage. Les membranes mise en œuvre sont de préférence des membranes aptes à faire de l’ultrafiltration ou de la nanofiltration, telle que la gamme commercialisée par la société NADIR®. Advantageously, the process according to the invention comprises at least one filtration step of at least one of the two phases chosen from the stationary phase (enriched in BPE) and the mobile phase (to be recycled), by membrane filtration. The process according to the invention more advantageously comprises at least three membrane filtration steps for filtering once the mobile phase and twice the stationary phase enriched in BPE. Such a membrane filtration process, referred to as a membrane process, makes it possible to recover the proteins with an improved degree of purity, and to be able to recycle the bi-phasic solvent system. Purified water is added during this step for the realization of the filtration and in order to recover the maximum of material. The purified water is preferably deionized water by distillation, filtration and / or electrodialysis. Advantageously, the membrane filters implemented according to the invention are configured in the following manner: in which a first membrane filter filters the stationary phase recovered in steps e1) and e2) to improve the purification of the substance of interest which is isolated; a second membrane filter filters the stationary phase eluted from the first membrane filter for recycling; and a third membrane filter filters the mobile phase recovered at the column outlet for recycling. The membranes used are preferably membranes capable of ultrafiltration or nanofiltration, such as the range marketed by NADIR®.
Avantageusement, l’injection dans les deux colonnes CPC mise en œuvre selon le procédé de l’invention d’au moins un des liquides choisis parmi l’extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant un système aqueux de solvants à deux phases, la phase mobile et la phase stationnaire, est contrôlé par des vannes trois voies, désignées première, deuxième et troisième vannes trois voies. Advantageously, the injection into the two CPC columns carried out according to the process of the invention of at least one of the liquids chosen from the microalgae extract dispersed in a mixture comprising an aqueous system of two-phase solvents, the phase mobile and the stationary phase, is controlled by three-way valves, designated first, second and third three-way valves.
Avantageusement, les liquides choisis parmi l’extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant un système aqueux de solvants à deux phases, la phase mobile et la phase stationnaire, débouchent dans une première vanne quatre voies en amont de la première colonne CPC et dans une deuxième vanne quatre voies en amont de la deuxième colonne CPC. Les modes d’élution des phases mobile et stationnaire dans les colonnes CPC sont contrôlées séquentiellement par ces deux vannes quatre voies, désignée première et deuxième vannes quatre voies. La première et la deuxième vanne quatre voies débouchent respectivement sur les canalisations de collecte des première et deuxième colonnes CPC. Advantageously, the liquids chosen from the microalgae extract dispersed in a mixture comprising an aqueous system of two-phase solvents, the mobile phase and the stationary phase, open into a first four-way valve upstream of the first CPC column and into a second four-way valve upstream of the second CPC column. The modes of elution of the mobile and stationary phases in the CPC columns are sequentially controlled by these two four-way valves, designated first and second four-way valves. The first and second four-way valves open respectively on the collection lines of the first and second CPC columns.
Avantageusement, les phases mobile et stationnaire en sortie de colonne CPC sont séparées séquentiellement par une vanne quatre voies et une quatrième vanne trois voies. PARTIE EXPERIMENTALE : Advantageously, the mobile and stationary phases at the CPC column output are separated sequentially by a four-way valve and a fourth three-way valve. EXPERIMENTAL PART :
I. Préparation de l’extrait contenant la protéine d’intérêt : une phycobiliprotéine, la B-phycoérythrine (BPE) - (figure 1) I. Preparation of the Extract Containing the Protein of Interest: A Phycobiliprotein, B-Phycoerythrin (BPE) - (Figure 1)
Un extrait de microalgue porphyridium cruentum concentré - conservé une nuit au frigo - est décongelé par centrifugation. A concentrated microalgal porphyridium cruentum extract - stored overnight in the fridge - is thawed by centrifugation.
1 g d’extrait de microalgue décongelée est repris dans 10 ml_ de la phase inférieur de l’ATPS (phase mobile dans la suite du procédé) contenant 1 1 .6% (w/w) PEG 6000 et 13% (w/w) K2HPO4/KH2PO4 (pH=7) : quand cela n’est pas indiqué, c’est ce système qui est utilisé dans tout le reste de la partie expérimentale. 1 g of thawed microalgae extract is taken up in 10 ml of the lower phase of ATPS (mobile phase in the rest of the process) containing 11.6% (w / w) PEG 6000 and 13% (w / w). ) K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (pH = 7): when this is not indicated, it is this system that is used throughout the rest of the experimental part.
L’ensemble est inséré dans un flacon de 15 mL (un flacon plastique de 15 mL de la société Fisherbrand®) et ensuite placé 15 minutes dans un bain ultrason connu sous le nom commercial VWR® Ultrasonic Cleaner. The whole is inserted into a 15 mL flask (a 15 mL plastic flask from Fisherbrand®) and then placed for 15 minutes in an ultrasonic bath known under the trade name VWR® Ultrasonic Cleaner.
Ensuite le mélange issu de la sonication est centrifugé à 3900 rpm (tours par minutes) pendant 20 mn dans une centrifugeuse de type Mikro 22R™, de la société Hettich zentrifugen™. Then the mixture from the sonication is centrifuged at 3900 rpm (revolutions per minute) for 20 minutes in a Mikro 22R ™ centrifuge of the company Hettich zentrifugen ™.
L’acronyme « rpm » signifie « rotation per minute » en anglais, sa traduction française étant « tours par minute ». The acronym "rpm" means "rotation per minute" in English, its French translation being "revolutions per minute".
Le surnageant est ensuite passé sur une colonne CPC dans les conditions détaillées au point II. de la présente partie expérimentale. The supernatant is then passed on a CPC column under the conditions detailed in point II. of this experimental part.
Des essais ont également été conduits avec respectivement du PEG à 1000, 2000 et 8000 (polyéthylène glycol de masse molaire : 1000, 2000 et 8000 g. mol-1). Tests were also conducted with PEG 1000, 2000 and 8000 respectively (polyethylene glycol of molar mass: 1000, 2000 and 8000 g, mol -1 ).
II. a tests préliminaires en vue de l’évaluation du meilleurs système d’ATPS. L’extrait qui doit être purifié par CPC a été évalué dans des tubes à essai pour identifier le meilleur des systèmes pour la purification de la phycobiliprotéine. II. preliminary tests to evaluate the best ATPS system. The extract to be purified by CPC was evaluated in test tubes to identify the best systems for the purification of phycobiliprotein.
La préparation de l’extrait en vue de la capture ou des tests préliminaires (essais en vials) est réalisée de la manière suivante : The preparation of the extract for capture or preliminary tests (vial tests) is carried out as follows:
• Décongeler l’extrait de microalgue concentré par centrifugation.  • Thaw the concentrated microalgae extract by centrifugation.
• Mettre 1g d’extrait de microalgue dans 10 mL de l’un des quatres système ATPS - système 1 à 4, voir ci-après - (les deux phases pour les essais en vials).  • Put 1g of microalgae extract in 10 mL of one of the four ATPS systems - System 1 to 4, see below - (both phases for vial tests).
Pour le cas de l’extraction avant les essais de capture, la phase saline a été uniquement utilisée.  For the case of extraction before the capture tests, the saline phase was used only.
• Passer 15 minutes au bain ultrason.  • Spend 15 minutes in the ultrasonic bath.
• Centrifuger à 3900 rpm pendant 20min sur la centrifugeuse (ref. grosse centrifugeuse). Pour l’extrait de spiruline, il faut centrifuger dans la petite centrifugeuse à 13000 rpm 2 fois 20min.  • Centrifuge at 3900 rpm for 20min on the centrifuge (ref big centrifuge). For Spirulina extract, it is necessary to centrifuge in the small centrifuge at 13000 rpm twice 20min.
• Une fois l’extraction réalisée, on mesure le spectre UV-visible entre 250 et 800 nm de chacune des phases pour les systèmes étudiés.  • Once the extraction is carried out, the UV-visible spectrum is measured between 250 and 800 nm for each of the phases for the systems studied.
La mesure du spectre UV-visible se fait de la manière suivante : The measurement of the UV-visible spectrum is as follows:
• Dans deux cellules en quartz, introduire 0,1 mL (ou 0,2 mL selon le facteur de dilution recherché) de phase supérieure ou inférieure de la fiole témoin et compléter à 2 mL avec un co-solvant (ici on utilise l’eau déminéralisé).  • In two quartz cells, introduce 0.1 mL (or 0.2 mL depending on the desired dilution factor) of the upper or lower phase of the control vial and make up to 2 mL with a co-solvent (here the demineralized water).
• Réaliser la mesure de la ligne de base dans une gamme caractéristique correspondant au soluté à analyser.  • Perform the measurement of the baseline in a characteristic range corresponding to the solute to be analyzed.
• Laisser une des deux cellules dans l'appareil en tant que référence.  • Leave one of the two cells in the device as a reference.
• Dans l'autre fiole, après l'avoir vidée et rincée à l’eau déminée, introduire 0,1 mL (ou 0,2 mL) de phase à analyser et compléter à 2 mL avec le co solvant.  • In the other vial, after emptying and rinsing it with demineralized water, introduce 0.1 mL (or 0.2 mL) of phase to be analyzed and make up to 2 mL with the co-solvent.
• Passer cet échantillon au spectromètre et réaliser l’acquisition du spectre entre 250 et 800 nm.  • Pass this sample to the spectrometer and acquire the spectrum between 250 and 800 nm.
L’indice de pureté sera évalué pour les longueur d’onde caractéristique de phycobiliprotéines (550nm pour la BPE) et la longueur d’onde caractéristique des protéines totales (280nm) Système 1 : 14.3% (w/w) PEG 1000 et 16% (w/w) K2HPO4/KH2PO4 (pH=7) Système 2 : 14.3% (w/w) PEG 2000 et 16% (w/w) K2HPO4/KH2PO4 (pH=7) Système 3 : 1 1.6% (w/w) PEG 6000 et 13% (w/w) K2HPO4/KH2PO4 (pH=7) Système 4 : 1 1.6% (w/w) PEG 8000 et 10% (w/w) K2HPO4/KH2PO4 (pH=7) The purity index will be evaluated for the characteristic wavelengths of phycobiliproteins (550nm for BPE) and the wavelength characteristic of total proteins (280nm) System 1: 14.3% (w / w) PEG 1000 and 16% (w / w) K2HPO4 / KH2PO4 (pH = 7) System 2: 14.3% (w / w) PEG 2000 and 16% (w / w) K2HPO4 / KH2PO4 (pH = 7) System 3: 1 1.6% (w / w) PEG 6000 and 13% (w / w) K2HPO4 / KH2PO4 (pH = 7) System 4: 1 1.6% (w / w) PEG 8000 and 10 % (w / w) K2HPO4 / KH2PO4 (pH = 7)
Les résultats obtenus sont montrés sur le tableau 1 : The results obtained are shown in Table 1:
Tableau 1.  Table 1.
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Les meilleurs indices de pureté ont été obtenus avec le PEG 6000, avec un indice de pureté qui reste supérieur à 1 ,20 dans le cas des PEG 2000 et PEG 8000. Les résultats obtenus pour les coefficients de partage des protéines totales entre la phase supérieure et la phase inférieure de l’ATPS sont montrés sur la colonne de droite du tableau 1. : le PEG 6000 est plus sélectif que les autres PEG de plus faibles poids moléculaires. Pour le système 4 comprenant du PEG 8000, la viscosité de la phase supérieure est supérieure à 80 cP (mPa.s), ce qui limite son utilisation en CPC. En effet, l’élution en mode ascendant paraît inenvisageable car la séquence de purification nécessite un dual mode. The best purity indices were obtained with PEG 6000, with a purity index that remains above 1.20 in the case of PEG 2000 and PEG 8000. The results obtained for the total protein partition coefficients between the upper phase and the lower phase of ATPS are shown in the right column of Table 1. PEG 6000 is more selective than other PEGs of lower molecular weight. For system 4 comprising PEG 8000, the viscosity of the upper phase is greater than 80 cP (mPa.s), which limits its use in CPC. Indeed, the elution in ascending mode seems unthinkable because the purification sequence requires a dual mode.
II. b Principe de purification de la BPE sur colonne de chromatographie de partage centrifuge (CPC) selon l’invention La colonne utilisée contient 36 cellules sphériques et est montée sur un visual CPC. Le visual CPC est un outil permettant la visualisation de l’hydrodynamique dans les cellules. Le processus se décompose en deux parties, une partie chromatographie et une partie visualisation. II. b Purification principle of BPE on a centrifugal partition chromatography (CPC) column according to the invention The column used contains 36 spherical cells and is mounted on a CPC visual. Visual CPC is a tool for visualizing hydrodynamics in cells. The process is divided into two parts, a chromatography part and a visualization part.
La partie chromatographie comporte tous les composants d’un appareil de chromatographie de partage centrifuge :  The chromatography part comprises all the components of a centrifugal partition chromatography apparatus:
Une pompe AP100 commercialisé par la société Armen Instrument™, permettant la mise en mouvement des différentes phases du système. An AP100 pump sold by Armen Instrument ™, allowing the various phases of the system to be set in motion.
- Les connectiques utilisées sur cet appareil sont des connectiques 1/8è basse pression en PTFE commercialisé par la société UpChurch®. - The connectors used on this device are 1 / 8th low-pressure PTFE connectors marketed by UpChurch®.
- Une vanne rhéodhyne quatre voies permettant de sélectionner le mode d’élution ascendant ou descendant (c'est-à-dire AM ou DM).  - A four-way rheodhyne valve for selecting the ascending or descending elution mode (ie AM or DM).
La colonne du visual étudiée est reliée au système par l’intermédiaire de deux joints tournants commercialisé par la société Armen™.  The visual column studied is connected to the system via two rotating joints marketed by the company Armen ™.
Le signal UV/visible est enregistré par un détecteur spectra 100 (Thermo séparation, San José, US).  The UV / visible signal is recorded by a spectra detector 100 (Thermo separation, San José, US).
La colonne est en polycarbonate et possède un volume de 48 mL (soit 1 ,3 mL par cellule). The column is made of polycarbonate and has a volume of 48 ml (ie 1.3 ml per cell).
La colonne est pré-équilibrée à 65-70 % de rétention en éluant la phase saline (qui comporte le système tampon phosphate) à 35 mL/mn et 1600 rpm (tours par minutes) à travers la phase comportant le PEG en mode descendant pendant 2 mn 30 à 3 mn. The column is pre-equilibrated at 65-70% retention by eluting the saline phase (which comprises the phosphate buffer system) at 35 mL / min and 1600 rpm (revolutions per minute) through the phase comprising the PEG in descending mode during 2 minutes 30 to 3 minutes.
L’extrait à traiter est ensuite injecté en mode descendant à 20 mL/min et 1600 rpm. La capture est alors réalisée dans la colonne. La capture consiste en un transfert de la (ou des) molécule(s) cible(s) vers la phase stationnaire pour laquelle ils ont une forte affinité (coefficient de partage KD > 5). The extract to be treated is then injected in descending mode at 20 ml / min and 1600 rpm. The capture is then performed in the column. The capture consists of a transfer of the target molecule (s) to the stationary phase for which they have a high affinity (partition coefficient KD> 5).
Une élution de phase mobile fraîche est réalisée à 20 mL/min et 1600 rpm afin d’enlever les molécules ayant moins d’affinités pour la phase stationnaire (KD < 5). La récupération de la protéine cible est réalisée en mode ascendant (AM), c'est- à-dire qu’on active le « dual mode », en éluant à 20 ml_/mn et 1600 rpm. L’ensemble du procédé de purification sur CPC est montré sur la figure 2. Les rétentions des systèmes 2 et 3 d’ATPS ont été mesurées et sont reportées dans le tableau 2 (les conditions opératoires correspondant aux mesures reportées dans le tableau 2 sont de 10 à 40 mL/min en débit avec une accélération centrifuge de 155 x g) : Tableau 2. Fresh mobile phase elution is performed at 20 mL / min and 1600 rpm in order to remove molecules with less affinity for the stationary phase (KD <5). The recovery of the target protein is carried out in ascending (AM) mode, that is to say that the "dual mode" is activated, eluting at 20 ml / min and 1600 rpm. The entire purification process on CPC is shown in FIG. 2. The retentions of the ATPS systems 2 and 3 were measured and are reported in Table 2 (the operating conditions corresponding to the measurements reported in Table 2 are 10 to 40 mL / min in flow with a centrifugal acceleration of 155 xg): Table 2.
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Les meilleurs résultats ont été obtenus pour le système 3 qui a été retenu et sera utilisé dans toute la suite de la partie expérimental, puisqu’il ressort sans ambiguité du tableau 2 (notamment à 20 mL/min) que le système intégrant le PEG 6000 permet d’obtenir une rétention de la phase stationnaire plus importante que celui intégrant le PEG 2000. The best results were obtained for the system 3 that was selected and will be used throughout the rest of the experimental part, since it is clear from Table 2 (particularly at 20 mL / min) that the system incorporating the PEG 6000 allows to obtain a retention of the stationary phase greater than that integrating the PEG 2000.
III. Procédé de filtration membranaire III. Membrane filtration process
La récupération de la BPE et la régénération des phases (PEG et sels) est réalisée par filtration membranaire. La membrane choisie pour la filtration est une membrane (ou filtre membranaire) pour ultrafiltration (UF) commercialisée sous la référence RM UH050 P1016 par la société NADIR®, et possédant un seuil de coupure à 50 kDa. Une membrane pour nanofiltration (NF) commercialisée par la société NADIR® peut être utilisée alternativement ou en combinaison. The recovery of the BPE and the regeneration of the phases (PEG and salts) is carried out by membrane filtration. The membrane chosen for the filtration is a membrane (or membrane filter) for ultrafiltration (UF) marketed under the reference RM UH050 P1016 by the company NADIR®, and having a cutoff threshold at 50 kDa. A membrane for nanofiltration (NF) sold by the company NADIR® can be used alternately or in combination.
La figure 4 illustre l’ensemble du procédé qui intègre les étapes de filtration membranaire. IV. purification sur colonne CPC FIG. 4 illustrates the entire process which integrates the membrane filtration steps. IV. CPC column purification
Une première colonne 1 est mise en fonctionnement et y est injecté l’extrait de microalgues dispersé dans l’ATPS à partir d’un premier récipient 2 (voir point I. de la présente partie expérimentale, A sur la figure 4). Une première pompe 3 est branchée d’une part en amont sur le premier récipient 2, et en aval sur une première vanne trois voies 4 pour réaliser l’injection (B sur la figure 4). Une première vanne quatre voies 5 est placée en aval de la première colonne 1 pour le mode descendant. Après un lavage réalisé par élution de la phase mobile à partir d’un deuxième récipient 6 par une deuxième pompe 7 dans la colonne 1 et alimentation au travers d’une deuxième vanne trois voies 8, laquelle pompe 7 est placée en aval du deuxième récipient 6, une extrusion est effectuée dans les conditions détaillées au point II : pour cela le mode ascendant est mis en oeuvre et la phase stationnaire contenue dans le cinquième récipient 15 (présenté plus loin) est éluée dans la colonne 1 via la troisième pompe 16 (présentée plus loin). (C sur la figure 4). A first column 1 is put into operation and injected with microalgal extract dispersed in ATPS from a first container 2 (see point I. of this experimental part, A in Figure 4). A first pump 3 is connected on the one hand upstream to the first container 2, and downstream on a first three-way valve 4 to perform the injection (B in Figure 4). A first four-way valve 5 is placed downstream of the first column 1 for the downward mode. After washing carried out by elution of the mobile phase from a second container 6 by a second pump 7 in the column 1 and feeding through a second three-way valve 8, which pump 7 is placed downstream of the second container 6, an extrusion is carried out under the conditions detailed in point II: for this the upward mode is implemented and the stationary phase contained in the fifth container 15 (presented below) is eluted in column 1 via the third pump 16 ( presented below). (C in Figure 4).
En sortie, la phase stationnaire et la phase mobile sont récupérées séparément au cours de la séquence, respectivement dans un troisième récipient 9 et un quatrième récipient 10, grâce à une deuxième vanne quatre voies 1 1 a et une troisième vanne trois voies 1 1 b. At the output, the stationary phase and the mobile phase are recovered separately during the sequence, respectively in a third receptacle 9 and a fourth receptacle 10, thanks to a second four-way valve 11a and a third three-way valve 11b .
La phase stationnaire récupérée dans le troisième récipient 9 est traitée par procédé membranaire par passage dans un premier filtre membranaire 12 dans les conditions décrites au point III. (E sur la figure 4), pour obtenir ; The stationary phase recovered in the third container 9 is treated by membrane process by passing through a first membrane filter 12 under the conditions described in point III. (E in Figure 4), to obtain;
- la BPE purifiée, d’une part, laquelle est collectée dans un cinquième récipient 13 ; et  the purified BPE, on the one hand, which is collected in a fifth container 13; and
- une phase stationnaire à nettoyer par un autre traitement mettant en oeuvre un passage dans un deuxième filtre membranaire 14 (F sur la figure 4) : la phase stationnaire filtrée est collectée dans un cinquième récipient 15 en aval duquel sont branchés une troisième pompe 16 et une troisième vanne trois voies 17 dont une des sorties débouche sur une canalisation d’entrée de la première colonne 1 CPC pour l’alimenter en continue en phase stationnaire recyclée. La phase mobile récupérée dans le quatrième récipient 10 est traitée également par procédé membranaire par passage dans un troisième filtre membranaire 18 dans les conditions décrites au point III. (D sur la figure 4), ce qui permet de régénérer la phase mobile conditionnée dans le deuxième récipient 6 pour l’alimenter en continue en phase mobile recyclée, tel qu’expliqué ci-avant. a stationary phase to be cleaned by another treatment using a passage in a second membrane filter 14 (F in FIG. 4): the filtered stationary phase is collected in a fifth container 15 downstream of which a third pump 16 is connected and a third three-way valve 17, one of the outputs leads to an inlet pipe of the first column 1 CPC to feed continuously in stationary phase recycled. The mobile phase recovered in the fourth container 10 is also treated by membrane process by passing through a third membrane filter 18 under the conditions described in point III. (D in FIG. 4), which makes it possible to regenerate the mobile phase packaged in the second container 6 in order to feed it continuously into the recycled mobile phase, as explained above.
La figure 4 montre de manière schématique la succession des étapes du procédé de purification selon l’invention, et pour lesquelles les grandes étapes A, B, C, D, E et F ont été reprises en lien avec la figure 3. FIG. 4 schematically shows the succession of the steps of the purification process according to the invention, and for which the main steps A, B, C, D, E and F have been repeated in connection with FIG.
Les pompes et/ou les vannes sont pilotées par un automate qui permet de réapprovisionner les colonnes en phases mobile et stationnaire en fonction des niveaux mesurés à l’aide de capteurs. The pumps and / or the valves are controlled by an automaton which makes it possible to replenish the columns in mobile and stationary phases according to the levels measured using sensors.
V. purification sur deux colonnes CPC en mode séquentiel V. purification on two CPC columns in sequential mode
De manière à augmenter la cadence et le rendement, une deuxième colonne CPC 19 est montée en parallèle de la première colonne 1 comme illustré sur la figure 4. Un tel montage permet un fonctionnement en continu, avec un remplissage en phase mobile et/ou stationnaire optimal dans au moins une des deux colonnes, ce qui représente un gain en productivité conséquent comme cela est montré au point VI. Grâce à cette méthode, les inventeurs ont montrés que le rendement matière était bien supérieur à 70%, sans qu’il y ait de précipitation indésirable de protéine, et une absence de dénaturation permettant d’avoir accès à des protéines dont la structure et la fonction sont entièrement préservées au regard de la protéine native. L’indice de pureté mesurée (représente le ratio : absorbance spécifique de la protéine à 550 nm / absorbance à 280 nm) est compris entre de 3,5 à 4,2 et une productivité en BPE purifiée de 4,2 g/h/Lstat (gramme de BPE purifiée par heure par litre de phase stationnaire engagé dans la colonne) ; les résultats sont montrés à la figure 5 par un graphique contenant en abscisse le volume collecté en mL et en ordonnée l’indice de pureté (550/220). La première et une troisième vannes quatre voies 5 et 21 sont placées en amont des deux colonnes CPC, pour permettre le choix du mode d’élution dans les deux colonnes et pouvoir contrôler finement le fonctionnement synchrone/asynchrone des deux colonnes CPC. In order to increase the rate and efficiency, a second CPC column 19 is connected in parallel with the first column 1 as illustrated in FIG. 4. Such an arrangement allows continuous operation, with mobile and / or stationary phase charging. optimal in at least one of the two columns, which represents a gain in productivity consequent as shown in point VI. With this method, the inventors have shown that the material yield was well above 70%, without there being any undesirable precipitation of protein, and an absence of denaturation allowing access to proteins whose structure and function are fully preserved with respect to the native protein. The purity index measured (represents the ratio: specific absorbance of the protein at 550 nm / absorbance at 280 nm) is between 3.5 to 4.2 and a productivity of purified BPE of 4.2 g / h / hr. L stat (gram of BPE purified per hour per liter of stationary phase engaged in the column); the results are shown in FIG. 5 by a graph containing on the abscissa the volume collected in ml and the ordinate on the purity index (550/220). The first and third four-way valves 5 and 21 are placed upstream of the two CPC columns, to allow the choice of the elution mode in the two columns and to be able to finely control the synchronous / asynchronous operation of the two CPC columns.
Les pompes et/ou les vannes sont pilotées par un automate qui permet de réapprovisionner les colonnes en phase mobile et stationnaire en fonction des niveaux mesurés à l’aide de capteurs. The pumps and / or the valves are controlled by an automaton which makes it possible to restock the columns in mobile and stationary phase according to the levels measured using sensors.
VI. Mesure de la pureté et du rendement pour le mode à deux colonnes CPC en fonctionnement séquentiel et en mode capture (« dual mode ») VI. Purity and Efficiency Measurement for Two-Column CPC Mode in Sequential Operation and Dual Mode
Les inventeurs ont montré que l’utilisation d’un mode séquentiel avec une réinjection de 70 mL d’extrait par séquence (une séquence correspond à l’enchaînement des étapes schématisé sur la figure 4) permet, sur cette chaîne de procédés, d’obtenir une pureté constante en sortie (voir figure 5) et un rendement en BPE supérieur à 70%. The inventors have shown that the use of a sequential mode with a reinjection of 70 ml of extract per sequence (a sequence corresponds to the sequence of steps shown diagrammatically in FIG. 4) makes it possible, in this process chain, to obtain a constant purity output (see Figure 5) and a BPE yield greater than 70%.
La figure 5 reporte la mesure de l’indice de pureté (550/280) en fonction du volume collecté en mL, par un nuage de points (matérialisé par les carrés) indiqué par l’accolade « A » correspondant aux fractions collectées lors de sept séquences. L’accolade « B » montre un nuage de quatre points correspondant à la mesure de l’indice de pureté du contenu restant dans la colonne. Figure 5 shows the measurement of the purity index (550/280) as a function of the volume collected in mL, by a scatter plot (indicated by the squares) indicated by the "A" brace corresponding to the fractions collected during seven sequences. The brace "B" shows a four point cloud corresponding to the measure of the purity index of the content remaining in the column.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de purification d’au moins une protéine comprenant une étape de purification mettant en oeuvre une colonne de chromatographie de partage centrifuge, dite colonne CPC (1 , 19), à partir d’un extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant : A method for purifying at least one protein comprising a purification step using a centrifugal partition chromatography column, called CPC column (1, 19), from a microalgae extract dispersed in a mixture comprising:
- un système aqueux de solvants à deux phases contenant de 8 à 15% en masse de polyéthylène glycol de masse molaire de 2000 à 8000 g. mol 1, voire 3500 à 6500 g. mol 1 , et 10 à 17% en masse de K2HPO4/KH2PO4 à pH 7 ; an aqueous system of two-phase solvents containing from 8 to 15% by weight of polyethylene glycol with a molar mass of 2000 to 8000 g. mol 1 , or 3500 to 6500 g. mol 1 , and 10 to 17% by weight of K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 at pH 7;
- une phase mobile de la CPC ; et  - a mobile phase of the CPC; and
- une phase stationnaire de la CPC.  - a stationary phase of the CPC.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le procédé met en oeuvre les étapes suivantes : 2. Method according to claim 1, wherein the method implements the following steps:
a) une dispersion de l’extrait à purifier dans le système aqueux de solvants à deux phases dans un premier récipient (2);  a) a dispersion of the extract to be purified in the aqueous system of two-phase solvents in a first container (2);
b) une injection du mélange obtenu à l’étape a) dans la colonne CPC (1 , 19) par mise en route d’une première pompe (3) adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient (2) en contact avec la phase stationnaire dans un premier sens de migration ;  b) an injection of the mixture obtained in step a) into the CPC column (1, 19) by starting a first pump (3) adapted to pass the phase to be injected contained in the first container (2) in contact with the stationary phase in a first direction of migration;
c) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route d’une deuxième pompe (7) adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans un deuxième récipient (6) en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration;  c) washing to remove impurities by starting a second pump (7) adapted to pass the mobile phase contained in a second container (6) in contact with the stationary phase in the first direction of migration;
d) une extrusion par mise en route d’une troisième pompe (16) adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de second sens de migration.  d) an extrusion by putting into operation a third pump (16) adapted to pass the mobile phase in contact with the stationary phase in the opposite direction to the aforementioned first direction of migration, referred to as the second direction of migration.
3. Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2, dans lequel la colonne CPC (1 , 19) comporte au plus 50 cellules sensiblement sphériques. 3. Method according to one of claims 1 or 2, wherein the CPC column (1, 19) comprises at most 50 substantially spherical cells.
4. Procédé selon l’une des revendications 1 à 3, dans lequel ledit procédé met en oeuvre deux colonnes de chromatographie CPC (1 et 19), une première colonne CPC (1 ) et une deuxième colonne CPC (19), qui fonctionnent de manière séquentielle. 4. Method according to one of claims 1 to 3, wherein said method uses two CPC chromatography columns (1 and 19), a first CPC column (1) and a second CPC column (19), which operate from sequentially.
5. Procédé selon la revendication 4, mettant en oeuvre les étapes suivantes : a) une dispersion de l’extrait à purifier dans le système aqueux de solvants à deux phases dans un premier récipient (2) ; 5. Method according to claim 4, implementing the following steps: a) a dispersion of the extract to be purified in the aqueous system of two-phase solvents in a first container (2);
b1 ) une injection d’un premier volume du mélange obtenu à l’étape a) dans la première colonne CPC (1 ) par mise en route d’une première pompe (3) adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient (2) en contact avec la phase stationnaire dans un premier sens de migration ;  b1) an injection of a first volume of the mixture obtained in step a) in the first CPC column (1) by starting a first pump (3) adapted to transit the injection phase contained in the first container (2) in contact with the stationary phase in a first direction of migration;
c1 ) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route d’une deuxième pompe (7) adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans un deuxième récipient (6) en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration ;  c1) washing to remove impurities by starting a second pump (7) adapted to pass the mobile phase contained in a second container (6) in contact with the stationary phase in the first direction of migration;
d1 ) une extrusion par mise en route d’une troisième pompe (16) adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le sens inverse au susdit premier sens de migration, qualifié de second sens de migration ;  d1) an extrusion by putting into operation a third pump (16) adapted to pass the mobile phase in contact with the stationary phase in the opposite direction to the aforementioned first direction of migration, referred to as the second direction of migration;
e1 ) une récupération de la phase stationnaire enrichie en substance d’intérêt ;  e1) recovery of the stationary phase enriched in substance of interest;
b2) une injection d’une deuxième volume du mélange obtenu à l’étape a) dans la seconde colonne CPC (19) par mise en route de la première pompe (3) adaptée pour faire transiter la phase à injecter contenue dans le premier récipient (2) en contact avec la phase stationnaire dans le premier sens de migration ;  b2) injecting a second volume of the mixture obtained in step a) into the second CPC column (19) by starting the first pump (3) adapted to pass the phase to be injected contained in the first container; (2) in contact with the stationary phase in the first direction of migration;
c2) un lavage pour éliminer les impuretés par mise en route de la deuxième pompe (7) adaptée pour faire transiter la phase mobile contenue dans le deuxième récipient (6) en contact sur la phase stationnaire dans le premier sens de migration ;  c2) washing to remove impurities by starting the second pump (7) adapted to pass the mobile phase contained in the second container (6) in contact with the stationary phase in the first direction of migration;
d2) une extrusion par mise en route de la troisième pompe (16) adaptée pour faire transiter la phase mobile en contact sur la phase stationnaire dans le second sens de migration ; e2) une récupération de la phase stationnaire enrichie en substance d’intérêt. d2) an extrusion by putting into operation the third pump (16) adapted to pass the mobile phase in contact with the stationary phase in the second direction of migration; e2) a recovery of the stationary phase enriched in substance of interest.
Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, dans lequel ledit procédé comporte au moins une étape de filtration d’au moins une phase choisie parmi la phase stationnaire et la phase mobile par filtration membranaire.  Method according to one of claims 1 to 5, wherein said method comprises at least one filtration step of at least one phase selected from the stationary phase and the mobile phase by membrane filtration.
Procédé selon les revendications 5 et 6 prises ensembles, dans lequel un premier filtre membranaire (12) filtre la phase stationnaire récupérée à l’étape e1 ) et e2) pour améliorer la purification de la substance d’intérêt qui est isolée ; un deuxième filtre membranaire (14) filtre la phase stationnaire éluée à partir du premier filtre membranaire (12) en vue de son recyclage ; et un troisième filtre membranaire (18) filtre la phase mobile récupérée en sortie de colonne en vue de son recyclage. A process according to claims 5 and 6 taken together, wherein a first membrane filter (12) filters the stationary phase recovered in step e1) and e2) to improve the purification of the substance of interest which is isolated; a second membrane filter (14) filters the stationary phase eluted from the first membrane filter (12) for recycling; and a third membrane filter (18) filters the mobile phase recovered at the column outlet for recycling.
Procédé selon l’une des revendications 5 à 7, dans lequel l’injection dans les deux colonnes CPC (1 ,19) d’au moins un des liquides choisis parmi l’extrait de microalgue dispersé dans un mélange comprenant un système aqueux de solvants à deux phases, la phase mobile et la phase stationnaire, est contrôlé par des vannes trois voies, désignées première, troisième et quatrième vannes trois voies (4, 8, 17). Process according to one of Claims 5 to 7, in which the injection into the two CPC columns (1, 19) of at least one of the liquids chosen from the microalgae extract dispersed in a mixture comprising an aqueous solvent system. in two phases, the mobile phase and the stationary phase, is controlled by three-way valves, designated first, third and fourth three-way valves (4, 8, 17).
Procédé selon l’une des revendications 1 à 8, dans lequel les phases mobile et stationnaire en sortie de colonne CPC (1 , 19) sont séparées séquentiellement par une vanne quatre voies (1 1 a) et une quatrième vanne trois voies (1 1 b). Method according to one of Claims 1 to 8, in which the mobile and stationary PCC column output phases (1, 19) are sequentially separated by a four-way valve (11a) and a fourth three-way valve (11 b).
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