WO2019170796A1 - Use of sphingosine-1-phosphate signal transduction modulators - Google Patents

Use of sphingosine-1-phosphate signal transduction modulators Download PDF

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WO2019170796A1
WO2019170796A1 PCT/EP2019/055667 EP2019055667W WO2019170796A1 WO 2019170796 A1 WO2019170796 A1 WO 2019170796A1 EP 2019055667 W EP2019055667 W EP 2019055667W WO 2019170796 A1 WO2019170796 A1 WO 2019170796A1
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sphingosine
bone
phosphate
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disorders
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Bodo Levkau
Sarah WESKE
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Universität Duisburg-Essen
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Definitions

  • Sphingosine-1-phosphate also known as S1P
  • S1P1-5 G-protein coupled receptors
  • S1P1-5 G-protein coupled receptors
  • S1P1-5 G-protein coupled receptors
  • S1P1-5 G-protein coupled receptors
  • S1P1-5 G-protein coupled receptors
  • S1P1-5 G-protein coupled receptors
  • S1P1-5 G-protein coupled receptors
  • S1P1-5 G-protein coupled receptors
  • S1P1-5 G-protein coupled receptors
  • S1P1-5 G-protein coupled receptors
  • S1P1-5 G-protein coupled receptors
  • S1P1-5 G-protein coupled receptors
  • Pho sphanolamine Pho sphanolamine
  • Sphingosine-1-phosphate plays an important role in cardiovascular, immunological and neurological diseases, and the function of S1P and SlP receptor analogues as well as their influence on immunological and anti-inflammatory mechanisms are the subject of current research.
  • a variety of synthetic ligands of the SlP receptors that can act both agonistically and antagonistically on one or more SlP receptors are known. These usually have a high structural similarity with S1P.
  • the synthetic, orally bioavailable S1P analog FTY720 is known to be an agonist of four of the five SlP receptor subtypes and has been successfully used as
  • Immunosuppressant for autoimmune diseases, transplants and multiple sclerosis clinically tested. It is approved under the name Fingolimod (Gilenya®) for the treatment of patients with highly active, relapsing-remitting multiple sclerosis.
  • WO 2013/026765 A1 describes compounds which are suitable for the prevention, treatment and diagnosis of diseases or disorders which are associated with SlP receptors, in particular of diseases having the regulatory function of sphingosine 1-phosphate ( S1P) and its analogs such as inflammation, pain, autoimmune diseases and cardiovascular diseases.
  • S1P sphingosine 1-phosphate
  • the present invention was based on the object to provide other applications available.
  • This object is achieved by the use of a modulator of sphingosine-1-phosphate signal transduction for the manufacture of a medicament for the treatment of a disease or disorder associated with sphingosine-1-phosphate and its receptors in
  • the disease or disorder is selected from the group comprising diseases or disorders of bone tissue, adipose tissue and / or glucose metabolism.
  • inhibitors of sphingosine 1-phosphate lyase and agonists of sphingosine 1-phosphate receptor type 2 can increase bone mass as well as bone strength and can significantly reduce the proportion of adipose tissue. Furthermore, it was found that inhibitors of sphingosine 1-phosphate lyase and agonists of sphingosine 1 Phosphate receptor type 2 can accelerate the uptake of glucose from the blood. These influences on bone and adipose tissue metabolism as well as the
  • Glucose metabolism allows the use of modulators of sphingosine-l-phosphate signal transduction in the treatment of diseases and disorders of bone tissue, adipose tissue and glucose metabolism associated with sphingosine-1-phosphate and its receptors.
  • the term "modulator of sphingosine 1-phosphate signal transduction” means means which, by influencing the sphingosine 1-phosphate metabolism, change its concentration in the body and thus influence its biological action, or agents which signal , which are caused by sphingosine 1-phosphate receptors, including the substance sphingosine 1-phosphate itself.
  • the modulators may be compounds or other substances that involve the activity of enzymes involved in sphingosine-1-phosphate metabolism or affect the activity of sphingosine 1-phosphate receptors.
  • Sphingosine-1-phosphate is also referred to as (2S, 3R, 4 '' -2-amino-4-octadecene-1,3-diol-1-phosphate and is also abbreviated hereafter to S1P.
  • Formulation for example bound to carriers such as albumin or apolipoprotein M, increases the concentration in the body and can bring about corresponding receptor-mediated effects. Preference is usually given to influencing the sphingosine-1-phosphate metabolism or its receptors by agonists or antagonists. Also,
  • S1P activity is increased for the treatment of diseases and disorders of bone tissue and adipose tissue. This can be done by
  • sphingosine 1-phosphate level increasing agents in particular by SlP receptor-specific agonists and / or inhibitors of enzymes that accomplish the pharmacological degradation of sphingosine-1-phosphate.
  • the modulator is an inhibitor of sphingosine 1-phosphate lyase. It has been shown that the administration of inhibitors of sphingosine-1-phosphate lyase can increase bone mass and bone strength in vivo. Likewise, the administration of inhibitors of sphingosine-l-phosphate lyase could significantly reduce the proportion of white adipose tissue in vivo. Also, the
  • inhibitor means compounds or other substances which influence an enzyme in such a way that it slows down, inhibits it or prevents its reactions.
  • the inhibitor of sphingosine 1-phosphate lyase is selected from the group comprising (E) -1- (4 - ((1R, 2S, 3R) -1, 2,3,4-tetrahydroxybutyl) -1H- imidazol-2-yl) ethanone oxime (LX-2931), (1R, 2S, 3R) -1- (2- (isoxazol-3-yl) -1H-imidazol-4-yl) butane-1, 2, 3,4-tetraol (LX-2932), 4-deoxypyrodoxin (DOP), 2-acetyl-4 (5) - [1R, 2S, 3R, 4-tetrahydroxybutyl] imidazole (THI) and / or compounds according to the following Formula 1)
  • Ri is selected from the group comprising H, Cl and / or CN.
  • the compound known under the name LX-2931 is according to IUPAC as (E) -l- (4- ((lR, 2S, 3R) -l, 2,3,4-tetrahydroxybutyl) -1H-imidazol-2-yl) ethanone oxime.
  • the compound known under the name LX-2932 is according to IUPAC as (lR, 2S, 3R) -l- (2- (isoxazol-3-yl) -1H-imidazol-4-yl) butane-l, 2,3, 4-tetraol.
  • THI-known compound is referred to as 2-acetyl-4 (5) - [1R, 2S, 3R, 4-tetrahydroxybutyl] imidazole according to IUPAC.
  • the inhibitor of sphingosine 1-phosphate lyase is LX-2931.
  • Compound LX-2931 has been found to be particularly useful in vivo.
  • Also useful are agonists of sphingosine 1-phosphate receptors. Basically, agonists of sphingosine 1-phosphate receptors of subtypes 1 to 5 (S1P1-5) are useful.
  • the compound is 2- (4- (5- (3,4-diethoxyphenyl) -1,4,4-oxadiazol-3-yl) -2,3-dihydro-1H-1-nyl-1-amino ) ethanol, known by the name CYM5442, as well as the compounds of the following formulas (2) to (6):
  • the modulator is an agonist of the sphingosine 1-phosphate receptor type 2.
  • the subtype 2 of the sphingosine 1-phosphate receptors is mediated by the SLP-dependent Reactions that lead to therapeutic benefits, for example in osteoporosis models, is involved.
  • the agonist of sphingosine 1-phosphate receptor type 2 is selected from the group comprising 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2 -oxoethyl] -1,6-dihydro-6-oxo-3-pyridinecarbonitrile (CYM5520), 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2- oxoethyl] -2,5-pyrrolidinedione (ML-031) and / or the compound represented by the following formula (7)
  • the compound of the formula (7) is also known from PubChem No. SID 46371153 and advantageously exhibits a good selectivity to the sphingosine-1-phosphate receptor type 2.
  • the compound of the formula (7) is preferably usable.
  • CYM5520 Preferably also usable is CYM5520.
  • the compound known by the name CYM5520 is according to IUPAC as l- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2-oxoethyl] -l, 6-dihydro-6 called oxo-3-pyridinecarbonitrile.
  • the CYM5520 compound has been found to be well suited in in vivo models. Another advantage is that CYM5520 has no known side effects.
  • the sphingosine 1-phosphate receptor type 2 agonist is 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2-oxoethyl] -2,5-pyrrolidinedione that of the following formula (8)
  • salts or esters of the compounds indicated in particular physiologically tolerated salts or esters, and also solvates, in particular hydrates.
  • salt is understood to mean forms of the compounds in which they assume or are charged with an ionic form and are present with a cation or anion as counterion or are in solution.
  • the modulators in particular the SlP-fyase inhibitors and S1P-receptor agonists advantageously makes it possible to therapeutically influence the balance between bone and adipose tissue and / or the glucose metabolism. This will allow treatment of bone tissue and adipose tissue disorders and disorders as well as glucose metabolism associated with sphingosine 1-phosphate and its receptors.
  • the disorders or disorders of adipose tissue are metabolic or genetic diseases or disorders. These are especially selected from the group comprising obesity, abnormal Fipidstoff Oplage and / or the obesity of organs.
  • a preferred disease is obesity.
  • obesity is understood to mean a condition or a disease with excess weight and / or fat multiplication, which is characterized by an increase of the body fat with frequently pathological consequences which exceeds the normal level.
  • SlP-fyase inhibitors and SlP receptor agonists could advantageously effect a significant reduction of white adipose tissue in vivo compared to controls.
  • the disorders or disorders of glucose metabolism are metabolic or genetic diseases or disorders. These are especially selected from the group comprising glucose intolerance, insulin resistance, abnormal glucose metabolism and / or diabetes.
  • the term "glucose intolerance” in the context of this invention is insufficient regulation of blood sugar Roger that. As a result, blood sugar increases sharply and exceeds a level that is considered healthy. In a healthy person, the increase in blood sugar after insulin glucose is rapidly lowered, with glucose intolerance or
  • Insulin resistance remains significantly elevated. It could be shown that SlP lyase inhibitors and SlP2 receptor agonists could advantageously cause a significantly faster reduction in blood glucose level in vivo compared to controls. Glucose intolerance can be a precursor to type II diabetes.
  • Bone tissue genetic or metabolic diseases or disorders are in particular from the group comprising fractures (broken bones), osteoporosis, disturbed or delayed bone healing, bone stabilization, tumor-associated bone weakness and / or metabolic diseases leading to decreased bone quality or
  • a disturbed or delayed bone healing which should be supported or accelerated therapeutically, or a bone stabilization may be necessary for example after implants and osteoprostheses.
  • Bone healing disorders also occur with delayed bone fracture healing and the treatment of extensive defect fractures, complicated bone fractures, bone loss, Sudeck's disease, and segmental bone defects.
  • Treatment for tumor-associated bone weakness may be beneficial in primary bone tumors and / or metastases. For example, diseases that lead to decreased bone quality or bone quantity are
  • Hereditary diseases such as osteogenesis imperfecta (vitreous bone disease) and metabolic osteopathies.
  • the modulators are particularly useful for the treatment of osteoporosis
  • osteoporosis for the purposes of the invention includes genetic osteoporosis, primary and secondary osteoporosis as well as a local one transient osteoporosis. It could be shown that in particular inhibitors of
  • Sphingosine-1-phosphate lyase and agonists of the sphingosine-1-phosphate receptor type 2 performed well in in vivo models of osteoporosis.
  • Preferred diseases are genetic and hormonal osteoporosis.
  • modulation of SlP receptor signaling shifts the balance between bone and adipose tissue with therapeutic advantages in preclinical models of genetic and hormonal osteoporosis.
  • the treatment may include a therapeutic and / or prophylactic treatment.
  • Preferred is a treatment of a disease or disorder associated with sphingosine-1-phosphate and its receptors in a mammal.
  • Another object of the invention relates to a pharmaceutical composition or a pharmaceutical composition comprising a modulator of sphingosine-1-phosphate signal transduction for the treatment of a disease or disorder associated with sphingosine-1-phosphate and its receptors, wherein the disease or disorder is selected is from the group comprising diseases or disorders of bone tissue, adipose tissue and / or glucose metabolism.
  • the modulator is an inhibitor of sphingosine 1-phosphate lyase or an agonist of sphingosine 1-phosphate receptor type 2.
  • the inhibitor of sphingosine 1-phosphate lyase is selected from the group comprising (E. ) -l- (4 - ((lR, 2S, 3R) -l, 2,3,4-tetrahydroxybutyl) -1H-imidazol-2-yl) ethanone oxime, (lR, 2S, 3R) -l- ( 2- (isoxazol-3-yl) -1H-imidazol-4-yl) butan-1, 2,3,4-tetraol, 4-deoxypyrodoxin, 2-acetyl-4 (5) - [1R, 2S, 3R, 4-tetrahydroxybutyl] -imidazole and / or compounds according to the following formula (1)
  • Ri is selected from the group comprising H, Cl and / or CN.
  • the agonist of sphingosine 1-phosphate receptor type 2 is selected from the group comprising 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2-oxoethyl ] - 1,6-dihydro-6-oxo-3-pyridinecarbonitrile, 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2-oxoethyl] -2, 5-pyrrolidinedione and / or the compound represented by the following formula (7)
  • the disorders or disorders of adipose tissue are metabolic or genetic diseases or disorders, in particular selected from the group consisting of obesity, abnormal lipid metabolism and / or obesity of organs.
  • the diseases or disorders of the glucose metabolism are preferably metabolic or genetic diseases or disorders, in particular selected from the group comprising glucose intolerance, insulin resistance, abnormal glucose metabolism and / or diabetes.
  • Bone tissue genetic or metabolic diseases or disorders in particular selected from the group comprising fractures (bone fractures), osteoporosis
  • composition or the medicament may further comprise pharmaceutically acceptable auxiliaries and / or carriers as active ingredient.
  • auxiliaries and / or carriers as active ingredient.
  • the type of additives, carriers and / or adjuvants depends on the desired mode of administration.
  • Oral agents may, for example, be in the form of tablets, film-coated tablets or capsules, even in retarded form, and may contain common excipients, such as binders, fillers, lubricants, disintegrating agents, such as starch or wetting agents.
  • a tablet is soluble in water.
  • Oral liquid preparations may be in the form of aqueous or oily suspensions,
  • Suitable carrier substances are, for example, organic or inorganic substances which are suitable for enteral, for example oral or rectal, or parenteral administration and with which
  • the drug or composition may be liquid, semi-solid or solid
  • Dosage form for example in the form of injection solutions, drops, juices, syrups,
  • oral administration are preferred
  • the drug or composition may be sterilized.
  • the composition or drug is orally, rectally, pulmonarily, enterally and / or parenterally administrable.
  • Preferred is oral administration or administration by injection.
  • FIG. 1 Changes in bone homeostasis after genetic knockout of the S1P
  • mice (5 , gp / flox / flox Cre-) and control animals (5 , gp / flox / lox Cre +).
  • FIG. 2 shows changes in bone homeostasis in C57Bl6J mice
  • mice and control animals (5 , gp / lox / lox cre +).
  • Figure 4 Changes in bone homeostasis of mice that were sphingosine 1-phosphate receptor type 2 deficient compared to the wild type.
  • FIG. 5 shows changes in adipose tissue of mice containing sphingosine-1-phosphate
  • Receptor type 2 deficient compared to the wild type.
  • FIG. 7 shows changes in the mechanical stability of the bones of the mice
  • FIG. 8 shows the change in the bone homeostasis in FIG. 8a, of the adipose tissue in FIG. 8
  • FIG. 9 shows the change in the bone homeostasis in FIG. 9a, the adipose tissue in FIG. 9
  • FIG. 10 shows in FIG. 10a the serum SlP concentrations versus the concentration of the
  • Bone-forming marker RGNR and in FIG. 10B shows the serum SlP concentrations against the body mass index (BMI) in a human study cohort.
  • Micro-computed tomography was used to study the bone microarchitecture of the femurs. This was done using a Skyscan X-ray Microscope 1072 and a CT Analyzer, Version 1.13.5.1+ (Skyscan, Belgium).
  • Femur bones were placed in a tight plastic tube to prevent movement during scanning. Quantification of the trabecular
  • Bone parameters of the distal femora were measured over a 1 ⁇ m thick area, the beginning of which was defined approximately 0.4 ⁇ m proximal to the growth plate. This region was then used to calculate diaphyseal parameters such as cortical thickness and BMD. Image acquisition was performed at 100 kV and 98 pA with an angle increment of 0.45 ° between the projections. The voxel size was 19 pm (isotropic). The
  • Density calibration was performed against hydroxyapatite phantoms at densities of 250 mg / cm 3 and 750 mg / cm 3 .
  • 800 transverse CT sections covering a range of 6.3 mm were obtained.
  • Image acquisition was performed at 100 kV and 98 mA with an angle increment of 0.45 ° between the projections.
  • Voxel size was 8 pm (isotropic).
  • the image reconstruction was done with the NRecon software (V.1.6.9.4, Skyscan, Belgium) and corrections were made.
  • Trabecular bone was manually segmented by cortical bone and trabecular bone parameters were analyzed over 126 sections, starting 50 sections distal to the growth plate.
  • the three-point bending test for determining mechanical failure of the femur was performed using a Shimadzu EZ Test EZ-SX material testing system. Load and deflection curves were collected using TrapeziumX software (both Shimadzu, Japan). A support of 5 mm was used on the underside of the femur and the load was applied in the middle of the posterior part of the femur. All tests were performed using a 500 N load cell at a constant loading rate of 3 mm / min. The data was collected at 5 ms intervals. The breaking force and stiffness were taken directly from the load and
  • mice in which the SlP lyase can be inducibly deleted were investigated.
  • SlP-lyase (Sgpll) knockout mice (Andreas Billich, Novartis) carry the Cre recombinase under a tamoxifen-inducible ⁇ -actin promoter (actb-CreERT2).
  • actb-CreERT2 tamoxifen-inducible ⁇ -actin promoter
  • the Cre recombinase was induced in 11 animals of the 65-week-old mice, 10 non-induced control animals were kept under identical conditions. After eight months, the trabecular portion of the animals' distal lemora was examined by quantitative microcomputer tomography (m-CT) as described above.
  • m-CT quantitative microcomputer tomography
  • Ligur 1 shows a microcomputertomography image of the trabecular portion of the distal lemora of a knockout mouse (Sgpl a ° x, ilox Cre-) in l.
  • La compared to the identically treated control animals (Sgpl aox / ilox Cre +) of the same age and sex in Lig. lb.
  • Lig. Lc shows the quantification of bone volume per tissue volume (BV / TV). As can be seen from Ligur lc, a 4.5-fold increase in bone volume per eight months after induction of Cre recombinase
  • Tissue volume compared to the controls. This increase in bone volume is believed to occur in a 3.7-fold increase in the number of trabeculae (Tb.N.) in Ligur ld, and a concomitant 27% decrease in the distance between the trabeculae (Tb.Sp.) as in Ligur le shown, is well founded. However, as shown by the Ligur lf, the thickness of the trabeculae (Tb.Th.) was unchanged.
  • FIG. 2 shows in FIG. 2a a microcomputer tomography image of the trabecular portion of the distal femora of a control and in FIG. 2b of a mouse administered DOP.
  • Fig. 2c shows the quantification of the bone volume per
  • Bone volume per tissue volume compared to controls (-). Furthermore, as shown in FIG. 2d, a 1.7-fold increase in the number of trabeculae (Tb.N.) and a concomitant 24% decrease in the distance between the trabeculae (Tb.Sp.) in comparison to the controls as in FIG 2e is shown. As can be seen from FIG. 2f, the thickness of the trabeculae (Tb.Th.) was unchanged.
  • Figure 2g shows a microcomputer tomography image of the cortical bone of the femora in a control and Figure 2h in a DOP-treated C57B16J mouse.
  • Figure 2i shows the increase in bone density (BMD) and Figure 2j the increase in thickness (Ct.Th.) of the cortical bone of the femora in the DOP-treated C57B16J mice.
  • Bone stability was tested in the 3-point bending test as described above. The force determined from this is shown for controls (-) and DOP-treated animals in Figure 2k, the rigidity in Figure 21.
  • Figures 2m and 2n show the Young's modulus and the breaking stress.
  • FIG. 2k shows a significant increase in the force required for a fracture and thus in the
  • FIG. Figure 3a shows a photograph of the perigonadal white adipose tissue of SlP-lyase knockout mouse (5 , gp / lox / lox Cre-) and Figure 3b of a control animal (5 , gp / lox / lox Cre +).
  • the length measure was 5 mm.
  • Figure 3f shows representative axial MRI images of the SIP lyase knockout mouse (5, gp / £ lox / lox Cre £) and the control animal (SGPL aox / a x ° Cre +).
  • Quantification shows a significant reduction of the total fat volume relative to the total volume of the tissue.
  • FIG. 4a shows a microcomputer tomography image of the trabecular portion of the distal femora of a wild-type control
  • FIG. 4b shows that of a S1P2-deficient mouse (S1P2 ').
  • the catch measure was 350 pm.
  • Fig. 4c shows the quantification of bone volume per tissue volume (BV / TV).
  • the S1P2-deficient mice had a 45% reduction compared to their wild-type controls
  • Tb.N. The number of trabeculae (Tb.N.) and the distance between the trabeculae (Tb.Sp.) of the S1P2-deficient mice were not significantly changed, while Figure 4f shows that the thickness of the trabeculae (Tb.Th.) was significantly reduced.
  • FIG. 4g shows a microcomputer tomography image of the cortical bone of the femora of a wild-type control and FIG. 4h in an S1P2-deficient mouse (S1P2 ').
  • the catch measure was 200 pm.
  • FIG. 4i shows the respective thickness of the cortical bone of the femora (Ct.Th.) and FIG. 4j the bone density (BMD).
  • the S1P2 I mice had a smaller cortex thickness (Ct.Th.) compared to wildtype controls, while bone density did not change significantly.
  • Bone stability was tested in the 3-point bending test as described above, and the force determined therefrom is shown for the wild-type controls (S1P2 , ) and the .S7 / J 2-deficient mice in Figure 4k. As understood from this, the S1P2 v mice had lower bone stability compared to wild-type controls.
  • FIG. 5a shows a photograph of the perigonadalen white adipose tissue of a wild-type mouse (S1P2 ') and Figure 5b a .S7 / J 2-deficient mouse (S1P2,).
  • the length measure was 5 mm.
  • the quantifications shown in Figures 5c, 5d and 5e show that the osteopenic phenotype of the S1P2 I mice was associated with a characteristic fatty tissue phenotype.
  • the S1P2 I mice were 14% heavier than the controls and showed a massive increase in the perigonadal WAT mass of 70%. The S1P2 I mice thus had a relative WAT weight increased by 44% compared to the wild-type controls.
  • mice that were sphingosine 1-phosphate receptor type 2 deficient were osteopenic and obese.
  • IPTH therapy is also used in human osteoporosis therapy and is a reliable positive control for the treatment of osteoporosis in the OVX model.
  • Eight animals were given 80 pg / kg iPTH once daily by subcutaneous injection on 5 days per week for 6 weeks.
  • Seven control animals received parallel subcutaneous injections of NaCl solution.
  • the trabecular portion of the animals' distal femora was examined by quantitative microcomputer tomography (m-CT) and bone stability was determined in the 3-point bending test.
  • FIGS. 6a, 6b and 6c respectively show microcomputed tomography images of the trabecular portion of the distal femur of a mouse after ovariectomy (OVX), which was untreated (NaCl), or treated with DOP or iPTH. The length measure was in each case 350 pm.
  • Fig. 6d shows the quantification of the bone volume per
  • FIGS. 6e show that the DOP-treated OVX animals, such as the iPTH-treated OVX animals, had a 3-fold higher BV / TV compared to the untreated OVX animals.
  • FIGS. 6e show that the DOP-treated OVX animals, such as the iPTH-treated OVX animals, had a 3-fold higher BV / TV compared to the untreated OVX animals.
  • FIGS. 6e show that the
  • Trabecular numbers were significantly increased with DOP as with iPTH-treated OVX animals, while Figure 6f shows, and the distance between the trabeculae (Tb.Sp.) of the DOP and iPTH-treated OVX animals were reduced.
  • Figure 6g shows that the thickness of the trabeculae (Tb.Th.) was always unchanged.
  • FIG. 7 shows the results of the mechanical stress in the bending test.
  • FIG. 7 a shows the respectively determined force against the bending for the untreated OVX animals treated with DOP-treated animals (OVX + DOP) and iPTH-treated OVX animals (OVX + iPTH).
  • the FIG. 7a shows a significant increase in the force required for fracture and thus the bone stability of the DOP-treated and iPTH-treated animals in the 3-point bending test.
  • FIGS. 7b, 7c, 7d and 7e respectively show the breaking force, the rigidity, the elastic modulus and the breaking stress. Overall, it can be seen from FIG. 7 that the stability of the bones of the DOP-treated OVX animals in comparison to the
  • the therapeutic potential of inhibiting SlP lyase by the SlP lyase inhibitor LX-2932 (IUPAC: (1R, 2S, 3R) -1- (2- (isoxazol-3-yl) -1H-imidazole-4 yl) butanediol, 2,3,4-tetraol).
  • SlP lyase inhibitor LX-2932 IUPAC: (1R, 2S, 3R) -1- (2- (isoxazol-3-yl) -1H-imidazole-4 yl) butanediol, 2,3,4-tetraol.
  • the pharmacological inhibition of SlP lyase was carried out in the model of osteoporosis after ovariectomy (OVX) in mice as described in Example 4.
  • LX2931 is administered four weeks after ovariectomy
  • Ligur 8a shows the percentage of bone volume per tissue volume (BV / TV) for controls (-) and inhibition of SlP lyase by LX-2932. How one As Figure 8a shows, bone volume increased from 0.133 ⁇ 0.04% of the control to 0. 596 ⁇ 0.13% due to the inhibition of SlP lyase.
  • the weight of epididymal white adipose tissue was determined in six treated and four control animals.
  • Figure 8b shows the relative weight for controls (-) and inhibition of SlP lyase by LX-2932.
  • the proportion of white adipose tissue after administration of LX-2932 dropped significantly from 32.815 ⁇ 2.7 mg / g to 17.363 ⁇ 1.25 mg / g.
  • FIG. 8c shows the respective blood glucose level of the controls (-) and in the case of inhibition of the SlP lyase by LX-2932. As can be seen from FIG. 8c, when LX-2932 inhibited SlP lyase, the animals showed an increased glucose uptake or a faster metabolism of glucose than the controls, the values being equalized after 90 minutes after glucose uptake.
  • the therapeutic potential of administering an agonist of the sphingosine 1-phosphate receptor type 2 was achieved by administration of the compound CYM5520 (IUPAC 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl ] -2-oxoethyl] -l, 6-dihydro-6-oxo-3-pyridinecarbonitrile) in the model of osteoporosis following ovariectomy (OVX) in mice as described in Examples 4 and 5.
  • CYM5520 IUPAC 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl ] -2-oxoethyl] -l, 6-dihydro-6-oxo-3-pyridinecarbonitrile
  • CYM5520 is given four weeks after ovariectomy at a concentration of 10 mg / kg in a solution of IOOmI 0.9% NaCl per injection intraperitoneally 5 days / week for a period of 8 weeks.
  • CYM5520 is given four weeks after ovariectomy at a concentration of 10 mg / kg in a solution of IOOmI 0.9% NaCl per injection intraperitoneally 5 days / week for a period of 8 weeks.
  • IOOmI 0.9% NaCl intraperitoneally 5 days / week for a period of 8 weeks.
  • Nine 22-week-old female C57B16J mice and five control animals were used.
  • FIG. 9a shows the percentage of bone volume per tissue volume (BV / TV) for controls (-) and administration of the SlP2 receptor agonist
  • Figure 9b shows the relative weight for controls (-) and administration of the SlP2 receptor agonist (CYM5520).
  • Figure 9b shows that the proportion of white adipose tissue after administration of CYM5520 dropped significantly from 32.815 ⁇ 2.75 mg / g to 23.002 ⁇ 1.29 mg / g. Treatment with CYM5520 also showed a clear therapeutic effect.
  • a glucose tolerance test was performed as described in Example 5.
  • Figure 9c shows the respective blood glucose levels of the controls (-) and when the SlP2 receptor agonist (CYM5520) is administered. As can be seen from FIG. 9c, the animals also showed an increased glucose uptake or a faster metabolism of the glucose than the controls when the SlP2 receptor agonist CYM5520 was administered, the values being equalized after 120 minutes after the glucose uptake.
  • Procollagen type I N-terminal propeptide were determined in the samples of the study population using the IDS-iSYS Multi-Discipline Automated Analyzer (Immunodiagnostic Systems Limited) with the IDS-iSYS Intact PINP Assay. For each analyte, three concentrations of control material were measured. The coefficients of variation were 4.4% at low concentrations, 4.5% at medium concentrations, and 4.3% at high concentrations, each relative to the control material.
  • the S1P concentrations were determined in the samples of the study population by means of
  • Liquid chromatography tandem mass spectrometry determined. 20m ⁇ of serum were incubated with 20m ⁇ of the internal standard (1miho ⁇ / ⁇ [l6, l7, 18-2H7] SLP (SlP-d7, Avanti Polar Lipids, Alabaster, U.S.A.) Proteins were probed with 350m ⁇ acetonitrile / After centrifugation at 10,000 g for 15 minutes, the extracts were subjected to reverse phase chromatography on a Zorbax SB-C8 column (2.1 x 50 mm, Agilent Technologies, Santa Clara, USA) subjected to a flow rate of 0.35 ml / min, S1P was eluted with a binary gradient for 6 minutes (methanol / acetonitrile / 0.1%).
  • FIG. 10a shows the plot of the SlP concentrations in the serum against the
  • FIG. 10b shows the plot of the SlP concentrations in the serum against the body mass index (BMI) of the study participants. Continuous data were presented as median (1st-3rd quartile), categorical data as proportions expressed. Group comparisons were performed with Chi-Squared or Kruskal-Wallis tests. A p-value ⁇ 0.05 was considered statistically significant.
  • BMI body mass index
  • FIGS. 10a there was a strong positive association between the SlP concentrations in the serum of the study participants and the clinically used bone formation marker RGNR.
  • FIG. 10b shows an association between serum SlP levels and the body mass index (BMI) of the study participants.
  • BMI body mass index
  • Bone marker RGNR and negatively associated with pathologically increased BMI in humans.
  • Bone tissue, adipose tissue and glucose metabolism such as osteoporosis, obesity, in particular in response to postmenopausal estrogen deficiency, or may favorably affect a disturbed glucose metabolism.

Abstract

The invention relates to the use of a sphingosine-1-phosphate signal transduction modulator for producing a medicament for treating a disease or disorder, which is associated with sphingosine-1-phosphate and its receptors, wherein the disease or disorder is selected from the group comprising diseases or disorders of the bone tissue, of the fatty tissue and/or of the glucose metabolism, and to corresponding medicaments.

Description

Verwendung von Modulatoren der Sphingosin- 1 -phosphat-Signaltransduktion  Use of modulators of sphingosine 1-phosphate signal transduction
B e s c h r e i b u n g Description
Sphingosin- 1 -phosphat, auch S1P, ist ein Sphingolipid und beeinflusst verschiedene grundlegende biologische Prozesse durch Interaktion mit einer Familie von fünf G-Protein- gekoppelten Rezeptoren (S1P1-5). Von dem Sphingosin- 1 -phosphat- Rezeptor Typ 1 (S1P1) ist beispielsweise bekannt, dass dieser an fundamentalen biologischen Prozessen wie der Regulation des Immunzelltransfers, vaskulärer Barrierefunktion und der Angiogenese beteiligt ist. Metabolismus und Konzentration von Sphingosin- 1 -phosphat werden über verschiedene Enzyme beeinflusst. Während SlP-Phosphatasen S1P zu Sphingosin abbauen können, spaltet das Enzym SlP-Lyase S1P irreversibel zu Hexadecanal und Sphingosine-1-phosphate, also known as S1P, is a sphingolipid and affects several basic biological processes by interacting with a family of five G-protein coupled receptors (S1P1-5). For example, the sphingosine 1-phosphate receptor type 1 (S1P1) is known to be involved in fundamental biological processes such as the regulation of immune cell transfer, vascular barrier function and angiogenesis. Metabolism and concentration of sphingosine-1-phosphate are influenced by different enzymes. While SlP phosphatases can degrade S1P to sphingosine, the enzyme S1P slips S1P irreversibly to hexadecanal and
Pho sphoethanolamin . Pho sphanolamine.
Sphingosin- 1 -Phosphat spielt eine wichtige Rolle bei kardiovaskulären, immunologischen und neurologischen Erkrankungen, und die Funktion von S1P und SlP-Rezeptoranaloga sowie deren Einflüsse auf immunologische und anti-inflammatorische Mechanismen sind Gegenstand aktueller Forschung. Eine Vielzahl synthetischer Liganden der SlP-Rezeptoren, die sowohl agonistisch als auch antagonistisch auf einen oder mehrere SlP-Rezeptoren wirken können, sind bekannt. Diese weisen meist eine hohe strukturelle Ähnlichkeit mit S1P auf. Beispielsweise ist das synthetische, oral bioverfügbare S1P Analogon FTY720 bekannt als Agonist von vier der fünf SlP-Rezeptor-Subtypen und wurde erfolgreich als Sphingosine-1-phosphate plays an important role in cardiovascular, immunological and neurological diseases, and the function of S1P and SlP receptor analogues as well as their influence on immunological and anti-inflammatory mechanisms are the subject of current research. A variety of synthetic ligands of the SlP receptors that can act both agonistically and antagonistically on one or more SlP receptors are known. These usually have a high structural similarity with S1P. For example, the synthetic, orally bioavailable S1P analog FTY720 is known to be an agonist of four of the five SlP receptor subtypes and has been successfully used as
Immunsuppressivum bei Autoimmunerkrankungen, Transplantationen und Multipler Sklerose klinisch getestet. Es ist unter der Bezeichnung Fingolimod (Gilenya®) zur Behandlung von Patienten mit hochaktiver, schubförmig-remittierender Multipler Sklerose zugelassen. Immunosuppressant for autoimmune diseases, transplants and multiple sclerosis clinically tested. It is approved under the name Fingolimod (Gilenya®) for the treatment of patients with highly active, relapsing-remitting multiple sclerosis.
Weiter beschreibt die WO 2013/026765 Al Verbindungen, die zur Vorbeugung, Behandlung und Diagnose von Erkrankungen oder Störungen, die mit SlP-Rezeptoren in Verbindung stehen, geeignet sind, insbesondere von Erkrankungen, die mit den regulatorischen Funktion von Sphingosin- 1 -phosphat (S1P) und seinen Analoga verbunden sind wie Entzündungen, Schmerzen, Autoimmunkrankheiten und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Furthermore, WO 2013/026765 A1 describes compounds which are suitable for the prevention, treatment and diagnosis of diseases or disorders which are associated with SlP receptors, in particular of diseases having the regulatory function of sphingosine 1-phosphate ( S1P) and its analogs such as inflammation, pain, autoimmune diseases and cardiovascular diseases.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zu Grunde, weitere Anwendungsmöglichkeiten zur Verfügung zu stellen. The present invention was based on the object to provide other applications available.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung eines Modulators der Sphingosin- 1- phosphat-Signaltransduktion zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung oder Störung, die mit Sphingosin- 1 -phosphat und dessen Rezeptoren in This object is achieved by the use of a modulator of sphingosine-1-phosphate signal transduction for the manufacture of a medicament for the treatment of a disease or disorder associated with sphingosine-1-phosphate and its receptors in
Zusammenhang steht, wobei die Erkrankung oder Störung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Erkrankungen oder Störungen des Knochengewebes, des Fettgewebes und/oder des Glukose-Stoffwechsels. Context, wherein the disease or disorder is selected from the group comprising diseases or disorders of bone tissue, adipose tissue and / or glucose metabolism.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den nebengeordneten Ansprüchen und den Unteransprüchen. Further advantageous embodiments of the invention will become apparent from the independent claims and the dependent claims.
Überraschend wurde festgestellt, dass durch Anheben des Sphingosin- 1 -phosphat-Spiegels im Körper Knochenzustände und Erkrankungen des Knochengewebes sowie der Aufbau des Fettgewebes beeinflusst werden können. Es konnte festgestellt werden, dass die Surprisingly, it has been found that by raising the level of sphingosine 1-phosphate in the body bone conditions and diseases of the bone tissue as well as the structure of the adipose tissue can be influenced. It could be stated that the
Verabreichung von Inhibitoren der Sphingosin- 1 -phosphat- Lyase und Agonisten des Sphingosin- 1 -phosphat- Rezeptor Typ 2 die Knochenmasse wie auch die Knochenstärke erhöhen und den Anteil an Fettgewebe deutlich senken können. Weiter konnte festgestellt werden, dass Inhibitoren der Sphingosin- 1 -phosphat- Lyase und Agonisten des Sphingosin- 1- phosphat-Rezeptor Typ 2 die Aufnahme von Glukose aus dem Blut beschleunigen können. Diese Beeinflussungen des Knochen- und Fettgewebsmetabolismus sowie des Administration of inhibitors of sphingosine 1-phosphate lyase and agonists of sphingosine 1-phosphate receptor type 2 can increase bone mass as well as bone strength and can significantly reduce the proportion of adipose tissue. Furthermore, it was found that inhibitors of sphingosine 1-phosphate lyase and agonists of sphingosine 1 Phosphate receptor type 2 can accelerate the uptake of glucose from the blood. These influences on bone and adipose tissue metabolism as well as the
Glukosestoffwechsels erlauben eine Verwendung von Modulatoren der Sphingosin-l- phosphat-Signaltransduktion in der Behandlung von Erkrankungen und Störungen des Knochengewebes, des Fettgewebes und des Glukosestoffwechsels, die mit Sphingosin- 1- phosphat und dessen Rezeptoren in Zusammenhang stehen. Glucose metabolism allows the use of modulators of sphingosine-l-phosphate signal transduction in the treatment of diseases and disorders of bone tissue, adipose tissue and glucose metabolism associated with sphingosine-1-phosphate and its receptors.
Unter dem Begriff„Modulator der Sphingosin- 1 -phosphat-Signaltransduktion“ sind im Sinne dieser Erfindung Mittel zu verstehen, die durch Beeinflussung des Sphingosin- 1 -phosphat Metabolismus dessen Konzentration im Körper ändern und somit dessen biologische Wirkung beeinflussen, oder Mittel, die Signale, die durch Sphingosin- 1 -phosphat-Rezeptoren hervorgerufen werden, beeinflussen, einschließlich der Substanz Sphingosin- 1 -phosphat selbst. Die Modulatoren können insbesondere Verbindungen oder andere Stoffe sein, die die Aktivität von Enzymen, die am Sphingosin- l-phosphat Metabolismus beteiligt sind, oder die Aktivität von Sphingosin- 1 -phosphat-Rezeptoren beeinflussen. For the purposes of the present invention, the term "modulator of sphingosine 1-phosphate signal transduction" means means which, by influencing the sphingosine 1-phosphate metabolism, change its concentration in the body and thus influence its biological action, or agents which signal , which are caused by sphingosine 1-phosphate receptors, including the substance sphingosine 1-phosphate itself. In particular, the modulators may be compounds or other substances that involve the activity of enzymes involved in sphingosine-1-phosphate metabolism or affect the activity of sphingosine 1-phosphate receptors.
Sphingosin- l-phosphat wird auch als (2S, 3R,4£’)-2-Amino-4-octadecen-l,3-diol- l-phosphat bezeichnet und im Folgenden auch als S1P abgekürzt. Sphingosine-1-phosphate is also referred to as (2S, 3R, 4 '' -2-amino-4-octadecene-1,3-diol-1-phosphate and is also abbreviated hereafter to S1P.
Eine Verabreichung von Sphingosin- l-phosphat in reiner Form oder in geeigneter Administration of sphingosine-l-phosphate in pure form or as appropriate
Formulierung, beispielsweise gebunden an Träger wie Albumin oder Apolipoprotein M, erhöht die Konzentration im Körper und kann entsprechende Rezeptor- vermittelte Effekte bewirken. Bevorzugt ist üblicherweise eine Beeinflussung des Sphingosin- l-phosphat Metabolismus oder dessen Rezeptoren durch Agonisten oder Antagonisten. Auch Formulation, for example bound to carriers such as albumin or apolipoprotein M, increases the concentration in the body and can bring about corresponding receptor-mediated effects. Preference is usually given to influencing the sphingosine-1-phosphate metabolism or its receptors by agonists or antagonists. Also
Kombinationen dieser Möglichkeiten können bevorzugt sein, insbesondere der Modulation Rezeptor- spezifischer Agonisten und/oder Antagonisten sowie der den SlP-Metabolismus modifizierender Enzyme. Bevorzugt wird zur Behandlung von Erkrankungen und Störungen des Knochengewebes und Fettgewebes die S1P- Aktivität erhöht. Dies kann durch Combinations of these possibilities may be preferred, in particular the modulation of receptor-specific agonists and / or antagonists as well as the enzymes modifying the SlP metabolism. Preferably, S1P activity is increased for the treatment of diseases and disorders of bone tissue and adipose tissue. This can be done by
Verwendung von den Sphingosin- 1 -phosphat-Spiegel erhöhenden Mitteln erzielt werden, insbesondere durch SlP-Rezeptor- spezifische Agonisten und/oder Inhibitoren von Enzymen, die den pharmakologischen Abbau von Sphingosin- 1 -phosphat bewerkstelligen. Use of sphingosine 1-phosphate level increasing agents, in particular by SlP receptor-specific agonists and / or inhibitors of enzymes that accomplish the pharmacological degradation of sphingosine-1-phosphate.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Modulator ein Inhibitor der Sphingosin- 1- phosphat-Lyase. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Verabreichung von Inhibitoren der Sphingosin- 1 -phosphat- Lyase Knochenmasse und Knochenstärke in vivo erhöht werden können. Ebenfalls konnte die Verabreichung von Inhibitoren der Sphingosin- l-phosphat- Lyase den Anteil an weißem Fettgewebe in vivo deutlich senken. Auch wurde die In preferred embodiments, the modulator is an inhibitor of sphingosine 1-phosphate lyase. It has been shown that the administration of inhibitors of sphingosine-1-phosphate lyase can increase bone mass and bone strength in vivo. Likewise, the administration of inhibitors of sphingosine-l-phosphate lyase could significantly reduce the proportion of white adipose tissue in vivo. Also, the
Glukoseaufnahme und Insulinsensitivität verbessert. Unter dem Begriff„Inhibitor“ sind im Sinne dieser Erfindung Verbindungen oder andere Stoffe zu verstehen, die ein Enzym derart beeinflussen, dass dieses verlangsamt, gehemmt oder dessen Reaktionen verhindert werden. Improved glucose uptake and insulin sensitivity. For the purposes of this invention, the term "inhibitor" means compounds or other substances which influence an enzyme in such a way that it slows down, inhibits it or prevents its reactions.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Inhibitor der Sphingosin- 1 -phosphat- Lyase ausgewählt aus der Gruppe umfassend (E)-l-(4-((lR,2S,3R)-l,2,3,4-Tetrahydroxybutyl)-lH- imidazol-2-yl)ethanon-oxim (LX-2931), (lR,2S,3R)-l-(2-(Isoxazol-3-yl)-lH-imidazol-4- yl)butan-l,2,3,4-tetraol (LX-2932), 4-Deoxypyrodoxin (DOP), 2-Acetyl-4(5)-[lR, 2S, 3R, 4- tetrahydroxybutyl]-imidazol (THI) und/oder Verbindungen gemäß der folgenden Formel (1) In preferred embodiments, the inhibitor of sphingosine 1-phosphate lyase is selected from the group comprising (E) -1- (4 - ((1R, 2S, 3R) -1, 2,3,4-tetrahydroxybutyl) -1H- imidazol-2-yl) ethanone oxime (LX-2931), (1R, 2S, 3R) -1- (2- (isoxazol-3-yl) -1H-imidazol-4-yl) butane-1, 2, 3,4-tetraol (LX-2932), 4-deoxypyrodoxin (DOP), 2-acetyl-4 (5) - [1R, 2S, 3R, 4-tetrahydroxybutyl] imidazole (THI) and / or compounds according to the following Formula 1)
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0001
worin Ri ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend H, Cl und/oder CN. wherein Ri is selected from the group comprising H, Cl and / or CN.
Die unter der Bezeichnung LX-2931 bekannte Verbindung wird gemäß IUPAC als (E)-l-(4- ((lR,2S,3R)-l,2,3,4-Tetrahydroxybutyl)-lH-imidazol-2-yl)ethanon-oxim bezeichnet. Die unter der Bezeichnung LX-2932 bekannte Verbindung wird gemäß IUPAC als (lR,2S,3R)-l- (2-(Isoxazol-3-yl)-lH-imidazol-4-yl)butan-l,2,3,4-tetraol bezeichnet. Die unter der The compound known under the name LX-2931 is according to IUPAC as (E) -l- (4- ((lR, 2S, 3R) -l, 2,3,4-tetrahydroxybutyl) -1H-imidazol-2-yl) ethanone oxime. The compound known under the name LX-2932 is according to IUPAC as (lR, 2S, 3R) -l- (2- (isoxazol-3-yl) -1H-imidazol-4-yl) butane-l, 2,3, 4-tetraol. The under the
Bezeichnung THI bekannte Verbindung wird gemäß IUPAC als 2-Acetyl-4(5)-[lR, 2S, 3R, 4- tetrahydroxybutyl] -imidazol bezeichnet. Vorzugsweise ist der Inhibitor der Sphingosin- 1 -phosphat- Lyase LX-2931. Die Verbindung LX-2931 hat sich in in vivo als besonders geeignet gezeigt. Weiter verwendbar sind Agonisten der Sphingosin- 1 -phosphat-Rezeptoren. Grundsätzlich sind Agonisten der Sphingosin- 1 -phosphat-Rezeptoren der Subtypen 1 bis 5 (S1P1-5) verwendbar. Beispielsweise verwendbar ist die Verbindung 2-(4-(5-(3,4-Diethoxyphenyl)- 1 ,2,4-oxadiazol-3-yl)-2,3-dihydro- 1 H-\nden- 1 -yl amino) ethanol, bekannt unter der Bezeichnung CYM5442, sowie die Verbindungen der folgenden Formeln (2) bis (6): The term THI-known compound is referred to as 2-acetyl-4 (5) - [1R, 2S, 3R, 4-tetrahydroxybutyl] imidazole according to IUPAC. Preferably, the inhibitor of sphingosine 1-phosphate lyase is LX-2931. Compound LX-2931 has been found to be particularly useful in vivo. Also useful are agonists of sphingosine 1-phosphate receptors. Basically, agonists of sphingosine 1-phosphate receptors of subtypes 1 to 5 (S1P1-5) are useful. For example, the compound is 2- (4- (5- (3,4-diethoxyphenyl) -1,4,4-oxadiazol-3-yl) -2,3-dihydro-1H-1-nyl-1-amino ) ethanol, known by the name CYM5442, as well as the compounds of the following formulas (2) to (6):
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000007_0001
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Modulator ein Agonist des Sphingosin- 1- phosphat-Rezeptor Typ 2. Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass der Subtyp 2 der Sphingosin- 1 -phosphat-Rezeptoren in der Vermittlung der SlP-abhängigen Reaktionen, die zu therapeutischen Vorteilen beispielsweise in Osteoporose-Modellen führen, beteiligt ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Agonist des Sphingosin- 1 -phosphat-Rezeptor Typ 2 ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend l-[2-[2,5-Dimethyl-l-(phenylmethyl)-lH-pyrrol- 3-yl]-2-oxoethyl]-l,6-dihydro-6-oxo-3-pyridincarbonitril (CYM5520), l-[2-[2,5-Dimethyl-l- (phenylmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-2-oxoethyl]-2,5-pyrrolidindion (ML-031) und/oder die Verbindung gemäß der folgenden Formel (7) In preferred embodiments, the modulator is an agonist of the sphingosine 1-phosphate receptor type 2. Without being bound to any particular theory, it is believed that the subtype 2 of the sphingosine 1-phosphate receptors is mediated by the SLP-dependent Reactions that lead to therapeutic benefits, for example in osteoporosis models, is involved. In preferred embodiments, the agonist of sphingosine 1-phosphate receptor type 2 is selected from the group comprising 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2 -oxoethyl] -1,6-dihydro-6-oxo-3-pyridinecarbonitrile (CYM5520), 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2- oxoethyl] -2,5-pyrrolidinedione (ML-031) and / or the compound represented by the following formula (7)
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0001
Die Verbindung der Formel (7) ist auch unter der PubChem Nr. SID 46371153 bekannt und zeigt in vorteilhafter Weise eine gute Selektivität gegenüber dem Sphingosin- 1 -phosphat- Rezeptor Typ 2. Die Verbindung der Formel (7) ist bevorzugt verwendbar.  The compound of the formula (7) is also known from PubChem No. SID 46371153 and advantageously exhibits a good selectivity to the sphingosine-1-phosphate receptor type 2. The compound of the formula (7) is preferably usable.
Vorzugsweise verwendbar ist auch CYM5520. Die unter der Bezeichnung CYM5520 bekannte Verbindung wird gemäß IUPAC als l-[2-[2,5-Dimethyl-l-(phenylmethyl)-lH- pyrrol-3-yl]-2-oxoethyl]-l,6-dihydro-6-oxo-3-pyridincarbonitril bezeichnet. Die Verbindung CYM5520 hat sich in in v/vo-Modellen als gut geeignet gezeigt. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass von CYM5520 keine Nebenwirkungen bekannt sind. Preferably also usable is CYM5520. The compound known by the name CYM5520 is according to IUPAC as l- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2-oxoethyl] -l, 6-dihydro-6 called oxo-3-pyridinecarbonitrile. The CYM5520 compound has been found to be well suited in in vivo models. Another advantage is that CYM5520 has no known side effects.
Der Sphingosin- 1 -phosphat-Rezeptor Typ 2-Agonist l-[2-[2,5-Dimethyl-l-(phenylmethyl)- lH-pyrrol-3-yl]-2-oxoethyl]-2,5-pyrrolidindion entsprechend der der folgenden Formel (8) The sphingosine 1-phosphate receptor type 2 agonist is 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2-oxoethyl] -2,5-pyrrolidinedione that of the following formula (8)
Figure imgf000008_0002
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ist auch unter der Bezeichnung ML-031 bekannt und bevorzugt verwendbar. is also known under the name ML-031 and preferably used.
Verwendbar sind weiter Salze oder Ester der angegebenen Verbindungen, insbesondere physiologisch verträgliche Salze oder Ester, sowie Solvate, insbesondere Hydrate. Unter dem Begriff "Salz" sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Formen der Verbindungen zu verstehen, in denen diese eine ionische Form annehmen bzw. geladen sind und mit einem Kation oder Anion als Gegenion vorliegen oder sich in Fösung befinden. It is also possible to use salts or esters of the compounds indicated, in particular physiologically tolerated salts or esters, and also solvates, in particular hydrates. Under the For the purposes of the present invention, the term "salt" is understood to mean forms of the compounds in which they assume or are charged with an ionic form and are present with a cation or anion as counterion or are in solution.
Eine Verabreichung der Modulatoren, insbesondere der SlP-Fyase-Inhibitoren und S1P- Rezeptor- Agonisten ermöglicht in vorteilhafter Weise eine therapeutische Beeinflussung des Gleichgewichts zwischen Knochen- und Fettgewebe und/oder des Glukosestoffwechsels. Hierdurch wird eine Behandlung von Erkrankungen und Störungen des Knochengewebes und Fettgewebes sowie des Glukosestoffwechsels ermöglicht, die mit Sphingosin- 1 -phosphat und dessen Rezeptoren in Zusammenhang stehen. Administration of the modulators, in particular the SlP-fyase inhibitors and S1P-receptor agonists advantageously makes it possible to therapeutically influence the balance between bone and adipose tissue and / or the glucose metabolism. This will allow treatment of bone tissue and adipose tissue disorders and disorders as well as glucose metabolism associated with sphingosine 1-phosphate and its receptors.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Erkrankungen oder Störungen des Fettgewebes metabolische oder genetische Erkrankungen oder Störungen. Diese sind insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Adipositas, abnorme Fipidstoffwechsellage und/oder die Verfettung von Organen. Eine bevorzugte Erkrankung ist Adipositas. Unter dem Begriff „Adipositas“ oder Fettleibigkeit, Fettsucht, wird im Sinne dieser Erfindung ein Zustand oder eine Erkrankung mit Übergewicht und/oder Fettvermehrung, der/die durch eine über das normale Maß hinausgehende Vermehrung des Körperfettes mit häufig krankhaften Folgen gekennzeichnet ist, verstanden. In preferred embodiments, the disorders or disorders of adipose tissue are metabolic or genetic diseases or disorders. These are especially selected from the group comprising obesity, abnormal Fipidstoffwechsellage and / or the obesity of organs. A preferred disease is obesity. For the purposes of this invention, the term "obesity" or obesity, obesity, is understood to mean a condition or a disease with excess weight and / or fat multiplication, which is characterized by an increase of the body fat with frequently pathological consequences which exceeds the normal level.
Es konnte gezeigt werden, dass SlP-Fyase-Inhibitoren und SlP-Rezeptor- Agonisten in vorteilhafter Weise in vivo eine signifikante Verringerung des weißen Fettgewebes verglichen mit Kontrollen bewirken konnten. It could be shown that SlP-fyase inhibitors and SlP receptor agonists could advantageously effect a significant reduction of white adipose tissue in vivo compared to controls.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Erkrankungen oder Störungen des Glukose- Stoffwechsels metabolische oder genetische Erkrankungen oder Störungen. Diese sind insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Glukose-Intoleranz, Insulin-Resistenz, abnorme Glukosestoffwechsellage und/oder Diabetes. Unter dem Begriff„Glukose- Intoleranz“ wird im Sinne dieser Erfindung eine unzureichende Regulation des Blutzuckers verstanden. Somit steigt in der Folge der Blutzucker stark an und überschreitet ein Maß, das als gesund angesehen wird. Bei einem gesunden Menschen wird der Blutzuckeranstieg nach Aufnahme von Glukose durch Insulin rasch abgesenkt, bei Glukoseintoleranz bzw. In preferred embodiments, the disorders or disorders of glucose metabolism are metabolic or genetic diseases or disorders. These are especially selected from the group comprising glucose intolerance, insulin resistance, abnormal glucose metabolism and / or diabetes. The term "glucose intolerance" in the context of this invention is insufficient regulation of blood sugar Roger that. As a result, blood sugar increases sharply and exceeds a level that is considered healthy. In a healthy person, the increase in blood sugar after insulin glucose is rapidly lowered, with glucose intolerance or
Insulinresistenz bleibt er signifikant erhöht. Es konnte gezeigt werden, dass SlP-Lyase- Inhibitoren und SlP2-Rezeptor- Agonisten in vorteilhafter Weise in vivo eine signifikant raschere Senkung des Blutglukosespiegels verglichen mit Kontrollen bewirken konnten. Glukoseintoleranz kann eine Vorstufe der Diabetes Typ II sein. Insulin resistance remains significantly elevated. It could be shown that SlP lyase inhibitors and SlP2 receptor agonists could advantageously cause a significantly faster reduction in blood glucose level in vivo compared to controls. Glucose intolerance can be a precursor to type II diabetes.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die Erkrankungen oder Störungen des In preferred embodiments, the diseases or disorders of the
Knochengewebes genetische oder metabolische Erkrankungen oder Störungen. Diese sind insbesondere aus der Gruppe umfassend Frakturen (Knochenbrüche), Osteoporose, gestörte oder verzögerte Knochenheilung, Knochenstabilisation, Tumor-assoziierte Knochenschwäche und/oder metabolische Erkrankungen, die zu verminderter Knochenqualität oder Bone tissue genetic or metabolic diseases or disorders. These are in particular from the group comprising fractures (broken bones), osteoporosis, disturbed or delayed bone healing, bone stabilization, tumor-associated bone weakness and / or metabolic diseases leading to decreased bone quality or
Knochenquantität führen. Lead bone quantity.
Eine gestörte oder verzögerte Knochenheilung, die therapeutisch unterstützt oder beschleunigt werden soll, oder eine Knochenstabilisation kann beispielsweise nach Implantaten und Osteoprothesen notwendig sein. Knochenheilungsstörungen treten auch bei verzögerter Knochenbruchheilung und der Behandlung von ausgedehnten Defektfrakturen, komplizierten Knochenbrüchen, bei Knochensubstanzverlust, bei Morbus Sudeck, und bei segmentalen Knochendefekten auf. Eine Behandlung Tumor-assoziierte Knochenschwäche kann bei primäre Knochentumoren und/oder Metastasen vorteilhaft sein. Erkrankungen, die zu verminderter Knochenqualität oder Knochenquantität führen, sind beispielsweise A disturbed or delayed bone healing, which should be supported or accelerated therapeutically, or a bone stabilization may be necessary for example after implants and osteoprostheses. Bone healing disorders also occur with delayed bone fracture healing and the treatment of extensive defect fractures, complicated bone fractures, bone loss, Sudeck's disease, and segmental bone defects. Treatment for tumor-associated bone weakness may be beneficial in primary bone tumors and / or metastases. For example, diseases that lead to decreased bone quality or bone quantity are
Erbkrankheiten wie Osteogenesis imperfecta (Glasknochenkrankheit) und metabolische Osteopathien. Hereditary diseases such as osteogenesis imperfecta (vitreous bone disease) and metabolic osteopathies.
Die Modulatoren sind insbesondere verwendbar zur Behandlung der Osteoporose The modulators are particularly useful for the treatment of osteoporosis
(Knochenatrophie). Der Begriff der„Osteoporose“ umfasst im Sinne der Erfindung die genetische Osteoporose, die primäre und sekundäre Osteoporose wie auch eine lokale transiente Osteoporose. Es konnte gezeigt werden, dass insbesondere Inhibitoren der (Atrophy). The term "osteoporosis" for the purposes of the invention includes genetic osteoporosis, primary and secondary osteoporosis as well as a local one transient osteoporosis. It could be shown that in particular inhibitors of
Sphingosin- 1 -phosphat- Lyase und Agonisten des Sphingosin- 1 -phosphat- Rezeptor Typ 2 in in v/vo-Modellen der Osteoporose gute Ergebnisse erzielten. Sphingosine-1-phosphate lyase and agonists of the sphingosine-1-phosphate receptor type 2 performed well in in vivo models of osteoporosis.
Bevorzugte Erkrankungen sind genetische und hormonell bedingte Osteoporose. So konnte in vorteilhafter Weise gezeigt werden, dass eine Modulation der SlP-Rezeptor-Signalgebung das Gleichgewicht zwischen Knochen- und Fettgewebe mit therapeutischen Vorteilen in präklinischen Modellen der genetischen und hormonellen Osteoporose verschob. Preferred diseases are genetic and hormonal osteoporosis. Thus, it has been shown to be beneficial that modulation of SlP receptor signaling shifts the balance between bone and adipose tissue with therapeutic advantages in preclinical models of genetic and hormonal osteoporosis.
Die Behandlung kann eine therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung beinhalten. Bevorzugt ist eine Behandlung einer Erkrankung oder Störung, die mit Sphingosin- 1- phosphat und dessen Rezeptoren in einem Säuger in Zusammenhang steht. The treatment may include a therapeutic and / or prophylactic treatment. Preferred is a treatment of a disease or disorder associated with sphingosine-1-phosphate and its receptors in a mammal.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Arzneimittel umfassend einen Modulator der Sphingosin- 1 -phosphat-Signaltransduktion zur Behandlung einer Erkrankung oder Störung, die mit Sphingosin- 1 -phosphat und dessen Rezeptoren in Zusammenhang steht, wobei die Erkrankung oder Störung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Erkrankungen oder Störungen des Knochengewebes, des Fettgewebes und/oder des Glukose-Stoffwechsels. Another object of the invention relates to a pharmaceutical composition or a pharmaceutical composition comprising a modulator of sphingosine-1-phosphate signal transduction for the treatment of a disease or disorder associated with sphingosine-1-phosphate and its receptors, wherein the disease or disorder is selected is from the group comprising diseases or disorders of bone tissue, adipose tissue and / or glucose metabolism.
Es konnte festgestellt werden, dass die Verabreichung von Inhibitoren der Sphingosin- 1- phosphat-Lyase und Agonisten des Sphingosin- 1 -phosphat- Rezeptor Typ 2 die It has been found that the administration of inhibitors of sphingosine 1-phosphate lyase and agonists of the sphingosine 1-phosphate receptor type 2 the
Knochenmasse wie auch die Knochenstärke erhöhen und den Anteil an Fettgewebe deutlich senken können, sowie weiter die Aufnahme von Glukose aus dem Blut beschleunigen können. Diese Effekte erlauben es, Modulatoren der Sphingosin- 1 -phosphat-Signaltransduktion in Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen und Störungen des Knochengewebes und Fettgewebes sowie des Glukosestoffwechsels, die mit Sphingosin- 1 -phosphat und dessen Rezeptoren in Zusammenhang stehen, zu verwenden. Zur Beschreibung der Modulatoren und der Erkrankung oder Störungen wird auf die vorstehenden Ausführungen verwiesen. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Modulator ein Inhibitor der Sphingosin- 1 -phosphat- Lyase oder ein Agonist des Sphingosin- 1 -phosphat- Rezeptor Typ 2. Vorzugsweise ist der Inhibitor der Sphingosin- 1 -phosphat- Lyase ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend (E)-l-(4-((lR,2S,3R)-l,2,3,4-Tetrahydroxybutyl)-lH-imidazol- 2-yl)ethanon-oxim, (lR,2S,3R)-l-(2-(Isoxazol-3-yl)-lH-imidazol-4-yl)butan-l,2,3,4-tetraol, 4-Deoxypyrodoxin, 2-Acetyl-4(5)-[lR, 2S, 3R, 4-tetrahydroxybutyl]-imidazol und/oder Verbindungen gemäß der folgenden Formel (1) Increase bone mass as well as the bone strength and can significantly reduce the proportion of fatty tissue, and further accelerate the uptake of glucose from the blood. These effects make it possible to use modulators of sphingosine-1-phosphate signal transduction in drugs for the treatment of disorders and disorders of bone tissue and adipose tissue as well as the glucose metabolism associated with sphingosine-1-phosphate and its receptors. For a description of the modulators and the disease or disorders, reference is made to the above statements. In preferred embodiments, the modulator is an inhibitor of sphingosine 1-phosphate lyase or an agonist of sphingosine 1-phosphate receptor type 2. Preferably, the inhibitor of sphingosine 1-phosphate lyase is selected from the group comprising (E. ) -l- (4 - ((lR, 2S, 3R) -l, 2,3,4-tetrahydroxybutyl) -1H-imidazol-2-yl) ethanone oxime, (lR, 2S, 3R) -l- ( 2- (isoxazol-3-yl) -1H-imidazol-4-yl) butan-1, 2,3,4-tetraol, 4-deoxypyrodoxin, 2-acetyl-4 (5) - [1R, 2S, 3R, 4-tetrahydroxybutyl] -imidazole and / or compounds according to the following formula (1)
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worin Ri ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend H, Cl und/oder CN. wherein Ri is selected from the group comprising H, Cl and / or CN.
Vorzugsweise ist der Agonist des Sphingosin- 1 -phosphat-Rezeptor Typ 2 ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend l-[2-[2,5-Dimethyl-l-(phenylmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-2-oxoethyl]- l,6-dihydro-6-oxo-3-pyridincarbonitril, l-[2-[2,5-Dimethyl-l-(phenylmethyl)-lH-pyrrol-3- yl]-2-oxoethyl]-2,5-pyrrolidindion und/oder die Verbindung gemäß der folgenden Formel (7) Preferably, the agonist of sphingosine 1-phosphate receptor type 2 is selected from the group comprising 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2-oxoethyl ] - 1,6-dihydro-6-oxo-3-pyridinecarbonitrile, 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2-oxoethyl] -2, 5-pyrrolidinedione and / or the compound represented by the following formula (7)
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In bevorzugten Ausführungsformen sind die Erkrankungen oder Störungen des Fettgewebes metabolische oder genetische Erkrankungen oder Störungen, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Adipositas, abnorme Lipidstoffwechsellage und/oder die Verfettung von Organen. Bevorzugt sind die Erkrankungen oder Störungen des Glukose-Stoffwechsels metabolische oder genetische Erkrankungen oder Störungen, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Glukose-Intoleranz, Insulin-Resistenz, abnorme Glukosestoffwechsellage und/oder Diabetes. Vorzugsweise sind die Erkrankungen oder Störungen des In preferred embodiments, the disorders or disorders of adipose tissue are metabolic or genetic diseases or disorders, in particular selected from the group consisting of obesity, abnormal lipid metabolism and / or obesity of organs. The diseases or disorders of the glucose metabolism are preferably metabolic or genetic diseases or disorders, in particular selected from the group comprising glucose intolerance, insulin resistance, abnormal glucose metabolism and / or diabetes. Preferably, the diseases or disorders of the
Knochengewebes genetische oder metabolische Erkrankungen oder Störungen, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Frakturen (Knochenbrüche), Osteoporose Bone tissue genetic or metabolic diseases or disorders, in particular selected from the group comprising fractures (bone fractures), osteoporosis
(Knochenatrophie), gestörte oder verzögerte Knochenheilung, Knochenstabilisation, Tumor assoziierte Knochenschwäche und/oder metabolische Erkrankungen, die zu verminderter Knochenqualität oder Knochenquantität führen. (Bone atrophy), disturbed or delayed bone healing, bone stabilization, tumor associated bone weakness, and / or metabolic diseases resulting in decreased bone quality or bone quantity.
Die Zusammensetzung oder das Arzneimittel können neben dem Modulator als Wirkstoff weiterhin pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffen und/oder Träger umfassen. Die Art der Zusatz-, Träger- und/oder Hilfsstoffe hängt von der gewünschten Verabreichungsart ab. Orale Mittel können beispielsweise als Tablette, Filmtablette oder Kapsel, auch in retardierter Form, vorliegen und können übliche Exzipienzien enthalten, wie Bindemittel, Füllstoffe, Gleitmittel, desintegrierende Mittel wie Stärke oder Netzmittel. Vorzugsweise ist eine Tablette in Wasser lösbar. Orale flüssige Präparate können in Form wässriger oder öliger Suspensionen, In addition to the modulator, the composition or the medicament may further comprise pharmaceutically acceptable auxiliaries and / or carriers as active ingredient. The type of additives, carriers and / or adjuvants depends on the desired mode of administration. Oral agents may, for example, be in the form of tablets, film-coated tablets or capsules, even in retarded form, and may contain common excipients, such as binders, fillers, lubricants, disintegrating agents, such as starch or wetting agents. Preferably, a tablet is soluble in water. Oral liquid preparations may be in the form of aqueous or oily suspensions,
Fösungen, Emulsionen, Sirupen, Elixieren oder Sprays vorliegen. Als Trägersubstanzen sind beispielsweise organische oder anorganische Stoffe verwendbar, die sich für eine enterale, beispielsweise orale oder rektale, oder parenterale Applikation eignen und mit den Solutions, emulsions, syrups, elixirs or sprays. Suitable carrier substances are, for example, organic or inorganic substances which are suitable for enteral, for example oral or rectal, or parenteral administration and with which
Verbindungen nicht reagieren, beispielsweise Wasser, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Polyethylenglykole, Glycerintriacetat und andere Fettsäureglyceride, Gelatine, Sojalecithin, Kohlenhydrate wie Lactose oder Stärke, Magnesiumstearat, Talkum oder Cellulose. Compounds such as water, vegetable oils, benzyl alcohols, polyethylene glycols, glycerol triacetate and other fatty acid glycerides, gelatin, soybean lecithin, carbohydrates such as lactose or starch, magnesium stearate, talc or cellulose.
Das Arzneimittel oder die Zusammensetzung kann als flüssige, halbfeste oder feste The drug or composition may be liquid, semi-solid or solid
Arzneiform, beispielsweise in Form von Injektionslösungen, Tropfen, Säften, Sirupen,Dosage form, for example in the form of injection solutions, drops, juices, syrups,
Sprays, Suspensionen, Tabletten, Kapseln oder in Form von Pellets oder Granulaten vorliegen und/oder verabreicht werden. Für eine orale Verabreichung eignen sich bevorzugt Sprays, suspensions, tablets, capsules or in the form of pellets or granules and / or administered. For oral administration are preferred
Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln oder Granulaten. Das Arzneimittel oder die Zusammensetzung kann sterilisiert sein. Die Zusammensetzung oder das Arzneimittel ist oral, rektal, pulmonal, enteral und/oder parenteral verabreichbar. Bevorzugt ist eine orale Verabreichung oder eine Verabreichung durch Injektion. Preparations in the form of tablets, dragees, capsules or granules. The drug or composition may be sterilized. The composition or drug is orally, rectally, pulmonarily, enterally and / or parenterally administrable. Preferred is oral administration or administration by injection.
Wenn nicht anders ausgeführt, weisen die verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke die Bedeutung auf, wie sie gemeinhin von einem Durchschnittsfachmann in dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird. Unless otherwise stated, the technical and scientific terms used are as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs.
Beispiele und Figuren, die der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind nachstehend angegeben. Examples and figures which serve to illustrate the present invention are given below.
In den Figuren zeigt: In the figures shows:
Figur 1 Veränderungen der Knochenhomöostase nach genetischem Knockout der S1P- FIG. 1 Changes in bone homeostasis after genetic knockout of the S1P
Fyase in Mäusen (5,gp/flox/flox Cre-) und Kontrolltieren (5,gp/flox/£loxCre+). Fyase in mice (5 , gp / flox / flox Cre-) and control animals (5 , gp / flox / lox Cre +).
Figur 2 Veränderungen der Knochenhomöostase in C57Bl6J-Mäusen nach  Figure 2 shows changes in bone homeostasis in C57Bl6J mice
pharmakologischer Inhibition der SlP-Fyase durch 4-Deoxypyridoxin (DOP). Figur 3 Veränderungen des Fettgewebe nach SlP-Fyase Knockout (Sgp/£lox/£lox Cre-) in pharmacological inhibition of SlP-fyase by 4-deoxypyridoxine (DOP). Figure 3 Changes in Adipose Tissue After SlP-Fyase Knockout (Sgp / lox / lox Cre) in
Mäusen und Kontrolltieren (5,gp/£lox/£loxCre+). Mice and control animals (5 , gp / lox / lox cre +).
Figur 4 Veränderungen der Knochenhomöostase von Mäusen, die Sphingosin- 1- phosphat-Rezeptor Typ 2-defizient waren im Vergleich zum Wildtyp.  Figure 4 Changes in bone homeostasis of mice that were sphingosine 1-phosphate receptor type 2 deficient compared to the wild type.
Figur 5 Veränderungen des Fettgewebes von Mäusen, die Sphingosin- l-phosphat- FIG. 5 shows changes in adipose tissue of mice containing sphingosine-1-phosphate
Rezeptor Typ 2-defizient waren im Vergleich zum Wildtyp. Receptor type 2 deficient compared to the wild type.
Figur 6 Veränderungen der Knochenhomöostase von Mäusen nach Ovarektomie  Figure 6 Changes in bone homeostasis of mice after ovariectomy
(OVX), die unbehandelt waren (NaCl), oder mit DOP oder iPTH behandelt wurden.  (OVX), which were untreated (NaCl), or treated with DOP or iPTH.
Figur 7 Veränderungen der mechanischen Stabilität der Knochen der Mäuse nach  FIG. 7 shows changes in the mechanical stability of the bones of the mice
Ovarektomie (OVX), die unbehandelt waren (NaCl), oder mit DOP oder iPTH behandelt wurden. Figur 8 die Veränderung der Knochenhomöostase in Figur 8a, des Fettgewebes inOvarectomy (OVX) that was untreated (NaCl), or treated with DOP or iPTH. FIG. 8 shows the change in the bone homeostasis in FIG. 8a, of the adipose tissue in FIG
Figur 8b und der Glukoseaufnahme aus dem Blut in Figur 8c von Mäusen nach Ovarektomie (-) und nach pharmakologischer Inhibition der SlP-Lyase durch LX29311. Figure 8b and the glucose uptake from the blood in Figure 8c of mice after ovariectomy (-) and after pharmacological inhibition of SlP lyase by LX29311.
Figur 9 die Veränderung der Knochenhomöostase in Figur 9a, des Fettgewebes in  FIG. 9 shows the change in the bone homeostasis in FIG. 9a, the adipose tissue in FIG
Figur 9b und der Glukoseaufnahme aus dem Blut in Figur 9c von Mäusen nach Ovarektomie (-) und nach Verabreichung des Agonisten des SlP2-Rezeptors CYM5520.  Figure 9b and glucose uptake from the blood in Figure 9c of mice after ovariectomy (-) and after administration of the agonist of the SlP2 receptor CYM5520.
Figur 10 in Figur lOa die SlP-Konzentrationen im Serum gegen die Konzentration des  FIG. 10 shows in FIG. 10a the serum SlP concentrations versus the concentration of the
Knochenbildungsmarker RGNR und in Figur lOb zeigt die SlP-Konzentrationen im Serum gegen den Body Mass Index (BMI) in einer humanen Studien- Kohorte.  Bone-forming marker RGNR and in FIG. 10B shows the serum SlP concentrations against the body mass index (BMI) in a human study cohort.
Methoden quantitative Mikro-Computertomographie (m-CT): Methods Quantitative Micro Computed Tomography (m-CT):
Die Mikro-Computertomographie diente der Untersuchung der Knochenmikroarchitektur der Femora. Diese wurde unter Verwendung eines Skyscan-Röntgenmikro-Tomographen 1072 und eines CT- Analysators, Version 1.13.5.1+ (Skyscan, Belgien) durchgeführt.  Micro-computed tomography was used to study the bone microarchitecture of the femurs. This was done using a Skyscan X-ray Microscope 1072 and a CT Analyzer, Version 1.13.5.1+ (Skyscan, Belgium).
Femurknochen wurden in einem festsitzenden Plastikschlauch platziert, um eine Bewegung während des Scannens zu verhindern. Die Quantifizierung der trabekulären  Femur bones were placed in a tight plastic tube to prevent movement during scanning. Quantification of the trabecular
Knochenparameter der distalen Femora erfolgte über einen 1 pm dicken Bereich, dessen Beginn ca. 0,4 pm proximal der Wachstumsfuge definiert wurde. Diese Region wurde dann verwendet, um diaphysäre Parameter wie kortikale Dicke und BMD zu berechnen. Die Bilderfassung wurde bei 100 kV und 98 pA mit einem Winkelinkrement von 0,45° zwischen den Projektionen durchgeführt. Die Voxelgröße betrug 19 pm (isotrop). Die Bone parameters of the distal femora were measured over a 1 μm thick area, the beginning of which was defined approximately 0.4 μm proximal to the growth plate. This region was then used to calculate diaphyseal parameters such as cortical thickness and BMD. Image acquisition was performed at 100 kV and 98 pA with an angle increment of 0.45 ° between the projections. The voxel size was 19 pm (isotropic). The
Dichtekalibrierung wurde gegen Hydroxyapatit-Phantome mit Dichten von 250 mg/cm3 und 750 mg/cm3 durchgeführt. Für die distale Femurmetaphyse-Region wurden 800 transversale CT-Schnitte, die einen Bereich von 6,3 mm bedeckten, gewonnen. Die Bilderfassung wurde bei 100 kV und 98 mA mit einem Winkelinkrement von 0,45° zwischen den Projektionen durchgeführt. Die Density calibration was performed against hydroxyapatite phantoms at densities of 250 mg / cm 3 and 750 mg / cm 3 . For the distal femoral metaphyseal region, 800 transverse CT sections covering a range of 6.3 mm were obtained. Image acquisition was performed at 100 kV and 98 mA with an angle increment of 0.45 ° between the projections. The
Voxelgröße betrug 8 pm (isotrop). Die Bildrekonstruktion wurde mit der NRecon- Software (V.1.6.9.4; Skyscan, Belgien) durchgeführt, und entsprechende Korrekturen wurden verwendet. Voxel size was 8 pm (isotropic). The image reconstruction was done with the NRecon software (V.1.6.9.4, Skyscan, Belgium) and corrections were made.
Trabekulärer Knochen wurde manuell von kortikalem Knochen segmentiert, und trabekuläre Knochenparameter wurden über 126 Schnitte analysiert, wobei 50 Schnitte distal von der Wachstumsplatte begonnen wurden.  Trabecular bone was manually segmented by cortical bone and trabecular bone parameters were analyzed over 126 sections, starting 50 sections distal to the growth plate.
Bestimmung der mechanischen Belastbarkeit: Determination of mechanical load capacity:
Der Dreipunkt-Biegetest zur Bestimmung des mechanischen Versagens des Femur wurde unter Verwendung eines Materialprüf Systems Shimadzu EZ Test EZ-SX durchgeführt. Last- und Auslenkungskurven wurden mittels TrapeziumX Software (beide Shimadzu, Japan) gesammelt. Es wurde eine Stützweite von 5 mm an der Unterseite des Oberschenkelknochens verwendet und die Last wurde in der Mitte des hinteren Teils des Oberschenkelknochens angelegt. Alle Tests wurden unter Verwendung einer 500 N-Lastzelle bei einer konstanten Belastungsrate von 3 mm/min durchgeführt. Die Daten wurden in Intervallen von 5 ms erfasst. Die Bruchkraft und die Steifigkeit wurden direkt aus den Belastungs- und  The three-point bending test for determining mechanical failure of the femur was performed using a Shimadzu EZ Test EZ-SX material testing system. Load and deflection curves were collected using TrapeziumX software (both Shimadzu, Japan). A support of 5 mm was used on the underside of the femur and the load was applied in the middle of the posterior part of the femur. All tests were performed using a 500 N load cell at a constant loading rate of 3 mm / min. The data was collected at 5 ms intervals. The breaking force and stiffness were taken directly from the load and
Auslenkungskurven erhalten. Der Elastizitätsmodul und die Bruchspannung wurden basierend auf den Formeln für das Elastizitätsmodul = KL3/(48 n) und der Bruchspannung = FuitLc/(4 lmin) berechnet. Obtained deflection curves. Young's modulus and breaking stress were calculated based on the formulas of Young's modulus = KL 3 / (48 n) and fracture stress = F uit Lc / (4 lmin).
Statistische Auswertung: Statistical evaluation:
Statistische Signifikanzen der Unterschieden zwischen Gruppen wurden durch gepaarte oder nicht gepaarte zweiseitige t-Tests oder Einweg- ANOVA mit einem Tukey- Mehrfach vergleichstest (GraphPad Prism 5.0; GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) bewertet. Die Daten wurden vor der Analyse auf Normalität und gleiche Varianz getestet. Statistical significances of differences between groups were assessed by paired or unpaired two-tailed t-tests or one-way ANOVA with a Tukey multiple comparison test (GraphPad Prism 5.0, GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). The data was tested for normality and equal variance prior to analysis.
Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (s.m.) angegeben. Beispiel 1 All results were reported as the mean ± standard error of the mean (sm). example 1
Untersuchung der Auswirkung einer genetischen Deletion und einer pharmakologischen Inhibition der SlP-Lyase auf die Knochenhomöostase a) genetische Deletion der SlP-Lyase  Investigation of the effect of a genetic deletion and a pharmacological inhibition of SlP lyase on bone homeostasis a) genetic deletion of the SlP lyase
Um zu untersuchen, ob eine Erhöhung der S1P- Konzentration im erwachsenen Organismus die Knochenhomöostase beeinflusst, wurde der Knochenphänotyp von Mäusen, bei denen die SlP-Lyase induzierbar deletiert werden kann, untersucht. Diese SlP-Lyase ( Sgpll ) Knockout Mäuse (Andreas Billich, Novartis) tragen die Cre Rekombinase unter einem Tamoxifen- induzierbaren ß- Aktin Promotor (actb-CreERT2). Die Cre Rekombinase wurde bei 11 Tieren der 65-Wochen alten Mäuse induziert, 10 nicht-induzierte Kontrolltiere wurden unter identischen Bedingungen gehalten. Nach acht Monaten wurde der trabekuläre Anteil der distalen Lemora der Tiere mittels quantitativer Mikrocomputertomografie (m-CT) wie vorstehend beschrieben untersucht.  To investigate whether an increase in the S1P concentration in the adult organism influences bone homeostasis, the bone phenotype of mice in which the SlP lyase can be inducibly deleted was investigated. These SlP-lyase (Sgpll) knockout mice (Andreas Billich, Novartis) carry the Cre recombinase under a tamoxifen-inducible β-actin promoter (actb-CreERT2). The Cre recombinase was induced in 11 animals of the 65-week-old mice, 10 non-induced control animals were kept under identical conditions. After eight months, the trabecular portion of the animals' distal lemora was examined by quantitative microcomputer tomography (m-CT) as described above.
Die Ligur 1 zeigt in Lig. la eine Mikrocomputertomografie- Aufnahme des trabekulären Anteils der distalen Lemora einer Knockout-Maus (Sgpla°x,ilox Cre-) im Vergleich zu den identisch behandelten Kontrolltieren (Sgplaox/ilox Cre+) gleichen Alters und Geschlechts in Lig. lb. Die Lig. lc zeigt die Quantifizierung des Knochenvolumens pro Gewebevolumen (BV/TV). Wie der Ligur lc entnommen werden kann, ergab sich acht Monate nach der Induktion der Cre Rekombinase ein 4,5-facher Anstieg des Knochenvolumens pro Ligur 1 shows a microcomputertomography image of the trabecular portion of the distal lemora of a knockout mouse (Sgpl a ° x, ilox Cre-) in l. La compared to the identically treated control animals (Sgpl aox / ilox Cre +) of the same age and sex in Lig. lb. Lig. Lc shows the quantification of bone volume per tissue volume (BV / TV). As can be seen from Ligur lc, a 4.5-fold increase in bone volume per eight months after induction of Cre recombinase
Gewebevolumen im Vergleich zu den Kontrollen. Es wird angenommen, dass diese Zunahme des Knochenvolumens in einem in Ligur ld gezeigten 3,7-fachen Anstieg der Trabekelanzahl (Tb.N.) und einer damit einhergehenden 27%igen Abnahme des Abstandes zwischen den Trabekeln (Tb.Sp.) wie in Ligur le gezeigt, begründet ist. Wie man der Ligur lf entnimmt, war die Dicke der Trabekel (Tb.Th.) hingegen unverändert. b) pharmakologischen Inhibition der SlP-Lyase Um zu untersuchen, ob eine pharmakologische Inhibition der SlP-Lyase einen ähnlichen Knochenphänotyp hervorruft, wurden elf 23 Wochen alten männlichen C57B16J Mäusen (Charles River Laboratories) der SlP-Lyase Inhibitor 4-Deoxypyridoxin (DOP) in einer Konzentration von 30 mg/l (5 mg/kg/Tag) für eine Dauer von 12 Wochen mit dem Tissue volume compared to the controls. This increase in bone volume is believed to occur in a 3.7-fold increase in the number of trabeculae (Tb.N.) in Ligur ld, and a concomitant 27% decrease in the distance between the trabeculae (Tb.Sp.) as in Ligur le shown, is well founded. However, as shown by the Ligur lf, the thickness of the trabeculae (Tb.Th.) was unchanged. b) pharmacological inhibition of SlP lyase In order to investigate whether pharmacological inhibition of SlP lyase causes a similar bone phenotype, eleven 23 week old male C57B16J mice (Charles River Laboratories) were injected with the SlP lyase inhibitor 4-deoxypyridoxine (DOP) at a concentration of 30 mg / l ( 5 mg / kg / day) for a period of 12 weeks with the
Trinkwasser verabreicht. Fünf Kontrolltiere wurden unter identischen Bedingungen gehalten. Nach 12 Wochen wurde der trabekuläre Anteil der distalen Femora der Tiere mittels quantitativer Mikrocomputertomografie (m-CT) untersucht. Drinking water administered. Five control animals were kept under identical conditions. After 12 weeks, the trabecular portion of the animals' distal femora was examined by quantitative microcomputer tomography (m-CT).
Die Figur 2 zeigt in Fig. 2a eine Mikrocomputertomografie- Aufnahme des trabekulären Anteils der distalen Femora einer Kontrolle (control) und in Fig. 2b einer Maus, der DOP verabreicht wurde. Die Fig. 2c zeigt die Quantifizierung des Knochenvolumens pro FIG. 2 shows in FIG. 2a a microcomputer tomography image of the trabecular portion of the distal femora of a control and in FIG. 2b of a mouse administered DOP. Fig. 2c shows the quantification of the bone volume per
Gewebevolumen (BV/TV). Wie der Figur 2c entnommen werden kann, zeigte die Femora der Mäuse, denen DOP verabreicht wurde(DOP), einen l,3-fachen Anstieg des Tissue volume (BV / TV). As can be seen from Figure 2c, the femora of the mice administered DOP (DOP) showed a 1.3-fold increase in
Knochenvolumens pro Gewebevolumen im Vergleich zu den Kontrollen (-). Weiter zeigte sich wie in Figur 2d gezeigt ein l,7-facher Anstieg der Trabekelanzahl (Tb.N.) sowie ein damit einhergehender 24%iger Abfall des Abstandes zwischen den Trabekeln (Tb.Sp.) im Vergleich zu den Kontrollen wie in Figur 2e gezeigt ist. Wie man der Figur 2f entnimmt, war die Dicke der Trabekel (Tb. Th.) unverändert. Bone volume per tissue volume compared to controls (-). Furthermore, as shown in FIG. 2d, a 1.7-fold increase in the number of trabeculae (Tb.N.) and a concomitant 24% decrease in the distance between the trabeculae (Tb.Sp.) in comparison to the controls as in FIG 2e is shown. As can be seen from FIG. 2f, the thickness of the trabeculae (Tb.Th.) Was unchanged.
Die Figur 2g zeigt eine Mikrocomputertomografie- Aufnahme der Kortikalis der Femora in einer Kontrolle und Figur 2h in einer mit DOP behandelten C57B16J Maus. Die Figur 2i zeigt die Zunahme der Knochendichte (BMD) und die Figur 2j die Zunahme der Dicke (Ct.Th.) der Kortikalis der Femora in den mit DOP behandelten C57B16J Mäusen. Die Knochenstabilität wurde im 3-Punkt-Biegetest wie oben beschrieben getestet. Die hieraus ermittelte Kraft ist für Kontrollen (-) und DOP-behandelte Tiere in Figur 2k gezeigt, die Steifigkeit in Figur 21. Die Figuren 2m und 2n zeigen den Elastizitätsmodul und die Bruchspannung. Die Figur 2k zeigt eine signifikante Zunahme der für einen Bruch erforderlichen Kraft und damit der Figure 2g shows a microcomputer tomography image of the cortical bone of the femora in a control and Figure 2h in a DOP-treated C57B16J mouse. Figure 2i shows the increase in bone density (BMD) and Figure 2j the increase in thickness (Ct.Th.) of the cortical bone of the femora in the DOP-treated C57B16J mice. Bone stability was tested in the 3-point bending test as described above. The force determined from this is shown for controls (-) and DOP-treated animals in Figure 2k, the rigidity in Figure 21. Figures 2m and 2n show the Young's modulus and the breaking stress. FIG. 2k shows a significant increase in the force required for a fracture and thus in the
Knochenstabilität der DOP-behandelten Tiere im 3-Punkt-Biegetest. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine induzierbare Deletion wie auch eine pharmakologische Inhibition der SlP-Lyase in vivo zu einem gesteigerten Knochenvolumen und einer gesteigerten Knochenstabilität führen. Bone stability of DOP-treated animals in the 3-point bending test. These results show that an inducible deletion as well as a pharmacological inhibition of SlP lyase in vivo lead to an increased bone volume and an increased bone stability.
Beispiel 2 Example 2
Untersuchung der Auswirkung einer genetischen Deletion der SlP-Lyase auf das Fettgewebe  Investigation of the effect of genetic deletion of SlP lyase on adipose tissue
Das Gewicht und das perigonadale weiße Fettgewebe (WAT) von jeweils neun der Knockout- Mäuse (5,gp/flox/flox Cre-) und der Kontrolltiere (Sgp/£lox/£lox Cre+), wie in Beispiel la) beschrieben, wurde nach 8 Monaten ebenfalls analysiert. The weight and perigonadal white adipose tissue (WAT) of nine of each of the knockout mice (5 , gp / flox / flox Cre) and the control animals (Sgp / lox / lox Cre +) as described in Example la) also analyzed after 8 months.
Die resultierenden Veränderungen im Fettgewebe sind in Figur 3 dargestellt. Die Figur 3a zeigt eine Fotografien des perigonadales weiße Fettgewebe von SlP-Lyase Knockout Maus (5,gp/£lox/£lox Cre-) und Figur 3b eines Kontrolltiers (5,gp/£lox/£lox Cre+). Das Längenmaß betrug 5 mm. Die in den Figuren 3c, 3d und 3e dargestellten Quantifizierungen zeigen, dass die 5,gp/£lox/£lox Cre+/ Mäuse ein um 20% niedrigeres Körpergewicht und ein um 77% reduziertes perigonadales weißes Fettgewebe (WAT) im Vergleich zu Sgp/£lox/£lox Cre_/ Mäuse gleichen Alters und Geschlechts aufwiesen. Zusammengefasst resultierte dies in einem um 71% erniedrigten relativen WAT Gewicht (mg/g Körpergewicht) der Sgpla°x,ilox Cre+/ Mäuse, wie in Fig.3e gezeigt ist. The resulting changes in adipose tissue are shown in FIG. Figure 3a shows a photograph of the perigonadal white adipose tissue of SlP-lyase knockout mouse (5 , gp / lox / lox Cre-) and Figure 3b of a control animal (5 , gp / lox / lox Cre +). The length measure was 5 mm. The quantifications shown in Figures 3c, 3d and 3e show that the 5 , gp / lox / lox Cre + / mice have a 20% lower body weight and a 77% reduced perigonadal white adipose tissue (WAT) compared to Sgp / Lox / lox Cre_ / mice of the same age and sex. In summary, this resulted in a 71% decreased relative WAT weight (mg / g body weight) of the Sgpl a ° x, ilox Cre + / mice as shown in Fig. 3e.
Die Figur 3f zeigt repräsentative axiale MRT Aufnahmen der SlP-Lyase Knockout-Maus (5,gp/£lox/£lox Cre-) und des Kontrolltiers (Sgplaox/a°x Cre+). Die in Figur 3g dargestellte Figure 3f shows representative axial MRI images of the SIP lyase knockout mouse (5, gp / £ lox / lox Cre £) and the control animal (SGPL aox / a x ° Cre +). The illustrated in Figure 3g
Quantifizierung zeigt eine deutliche Reduktion des Gesamtfettvolumens bezogen auf das Gesamtvolumen des Gewebes. Quantification shows a significant reduction of the total fat volume relative to the total volume of the tissue.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Deletion der SlP-Lyase in vivo in einer Gewichtsreduktion basierend auf einem Schwund des weißen Fettgewebes resultiert. Beispiel 3 These results show that the deletion of SlP lyase in vivo results in a weight reduction based on a disappearance of white adipose tissue. Example 3
Untersuchung des Sphingosin- 1 -phosphat-Rezeptor Typ 2  Investigation of sphingosine 1-phosphate receptor type 2
Um zu untersuchen, ob es sich bei dem involvierten Rezeptor, über den der SlP-Effekt in vivo vermittelt wurde, um den Sphingosin- 1 -phosphat-Rezeptor Typ 2 (SlP2-Rezeptor) handelte, erfolgte die Analyse der Knochen und des Fettgewebes von S1P2- defizienten Mäusen (Jerold Chun, Scripps Research Institute). Analysiert wurden die Femora von 13 männlichen 24 Wochen alten S1P2- defizienten Mäusen ( S1P2 ' ) und 23 gleich alten männlichen Wildtyp-Mäusen ( SlP2+,+ ) mittels quantitativer Mikro-Computertomografie (m- CT) wie vorstehend beschrieben. To investigate whether the receptor involved in mediating the SlP effect in vivo was the sphingosine 1-phosphate receptor type 2 (SlP2 receptor), bones and adipose tissue were analyzed S1P2 deficient mice (Jerold Chun, Scripps Research Institute). The femurs of 13 male 24-week-old S1P2-deficient mice (S1P2 ') and 23 equally-old male wild-type mice (SlP2 +, + ) were analyzed by quantitative micro-computed tomography (m-CT) as described above.
Die Figur 4a zeigt eine Mikrocomputertomografie- Aufnahme des trabekulären Anteils der distalen Femora einer Wildtypkontrolle, Figur 4b den einer S1P2 -defizienten Maus ( S1P2 ' ). Das Fängenmaß betrug 350 pm. Die Fig. 4c zeigt die Quantifizierung des Knochenvolumens pro Gewebevolumen (BV/TV). Wie der Figur 4c entnommen werden kann, wiesen die S1P2- defizienten Mäuse im Vergleich zu ihren Wildtypkontrollen ein um 45% reduziertes FIG. 4a shows a microcomputer tomography image of the trabecular portion of the distal femora of a wild-type control, and FIG. 4b shows that of a S1P2-deficient mouse (S1P2 '). The catch measure was 350 pm. Fig. 4c shows the quantification of bone volume per tissue volume (BV / TV). As can be seen from Figure 4c, the S1P2-deficient mice had a 45% reduction compared to their wild-type controls
Knochenvolumen pro Gewebevolumen auf. Die Figuren 4d und 4d zeigen, dass die Bone volume per tissue volume. Figures 4d and 4d show that the
Trabekelanzahl (Tb.N.) und der Abstand zwischen den Trabekeln (Tb.Sp.) der S1P2- defizienten Mäuse nicht signifikant verändert waren, während die Figur 4f zeigt, dass die Dicke der Trabekel (Tb.Th.) signifikant reduziert war. The number of trabeculae (Tb.N.) and the distance between the trabeculae (Tb.Sp.) of the S1P2-deficient mice were not significantly changed, while Figure 4f shows that the thickness of the trabeculae (Tb.Th.) was significantly reduced.
Die Figur 4g zeigt eine Mikrocomputertomografie- Aufnahme der Kortikalis der Femora einer Wildtyp-Kontrolle und Figur 4h in einer S1P2- defizienten Maus ( S1P2 ' ). Das Fängenmaß betrug 200 pm. Die Figur 4i zeigt die jeweilige Dicke der Kortikalis der Femora (Ct.Th.) und Figur 4j die Knochendichte (BMD). Wie man der 4 i und 4j entnimmt, wiesen die S1P2 I Mäuse eine geringere Dicke der Kortikalis (Ct.Th.) im Vergleich zu den Wildtypkontrollen auf, während die Knochendichte keine signifikante Änderung zeigte. Die Knochenstabilität wurde im 3-Punkt-Biegetest wie oben beschrieben getestet und die hieraus ermittelte Kraft ist für die Wildtyp-Kontrollen (S1P2 , ) und die .S7/J2-defizienten Mäuse in Figur 4k gezeigt. Wie man dieser entnimmt, wiesen die S1P2 v Mäuse eine geringere Knochenstabilität im Vergleich zu den Wildtypkontrollen auf. FIG. 4g shows a microcomputer tomography image of the cortical bone of the femora of a wild-type control and FIG. 4h in an S1P2-deficient mouse (S1P2 '). The catch measure was 200 pm. FIG. 4i shows the respective thickness of the cortical bone of the femora (Ct.Th.) and FIG. 4j the bone density (BMD). As can be seen in Figures 4i and 4j, the S1P2 I mice had a smaller cortex thickness (Ct.Th.) compared to wildtype controls, while bone density did not change significantly. Bone stability was tested in the 3-point bending test as described above, and the force determined therefrom is shown for the wild-type controls (S1P2 , ) and the .S7 / J 2-deficient mice in Figure 4k. As understood from this, the S1P2 v mice had lower bone stability compared to wild-type controls.
Weiter wurde das Gewicht und das perigonadale weiße Fettgewebe (WAT) von 11 Wildtyp- Kontrollen und 23 S1P2- defizienten Mäusen bestimmt. Die Veränderungen im Fettgewebe sind in Figur 5 dargestellt. Die Figur 5a zeigt eine Fotografie des perigonadalen weißen Fettgewebes einer Wildtyp-Maus ( S1P2 ' ) und die Figur 5b einer .S7/J2-defizienten Maus (S1P2 , ). Das Längenmaß betrug 5 mm. Die in den Figuren 5c, 5d und 5e dargestellten Quantifizierungen zeigen, dass der osteopenische Phänotyp der S1P2 I Mäuse mit einem charakteristischen Fettge websphänotyp einherging. Die S1P2 I Mäuse waren um 14% schwerer als die Kontrollen und zeigten eine massive Erhöhung der perigonadale WAT Masse von 70%. Die S1P2 I Mäusen wiesen damit im Vergleich zu den Wildtypkontrollen ein um 44% erhöhtes relatives WAT Gewicht auf. Further, the weight and perigonadal white adipose tissue (WAT) of 11 wild-type controls and 23 S1P2-deficient mice were determined. The changes in adipose tissue are shown in FIG. 5a shows a photograph of the perigonadalen white adipose tissue of a wild-type mouse (S1P2 ') and Figure 5b a .S7 / J 2-deficient mouse (S1P2,). The length measure was 5 mm. The quantifications shown in Figures 5c, 5d and 5e show that the osteopenic phenotype of the S1P2 I mice was associated with a characteristic fatty tissue phenotype. The S1P2 I mice were 14% heavier than the controls and showed a massive increase in the perigonadal WAT mass of 70%. The S1P2 I mice thus had a relative WAT weight increased by 44% compared to the wild-type controls.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Mäuse, die Sphingosin- 1 -phosphat- Rezeptor Typ 2-defizient waren, osteopenisch und adipös waren. These results indicate that mice that were sphingosine 1-phosphate receptor type 2 deficient were osteopenic and obese.
Beispiel 4 Example 4
Untersuchung der Inhibition der SlP-Lyase in einem Osteoporose-Modell in vivo  Investigation of the inhibition of SlP lyase in an osteoporosis model in vivo
Um das therapeutische Potenzial der Inhibition der SlP-Lyase zu untersuchen wurde das Modell der Osteoporose nach Ovarektomie (OVX) bei Mäusen gewählt. Dieses Modell gilt als weltweit anerkanntes Modell der postmenopausalen Osteoporose bei Frauen. Die To investigate the therapeutic potential of inhibition of SlP lyase, the model of osteoporosis following ovariectomy (OVX) in mice was chosen. This model is considered to be a globally recognized model of postmenopausal osteoporosis in women. The
Durchführung der operativen Eingriffe (Ovariektomie) erfolgte an C57B16J Mäusen durch Charles River Laboratories, Frankreich. Die pharmakologische Inhibition der SlP-Lyase erfolgte über den SlP-Lyase Inhibitor 4- Deoxypyridoxin (DOP). Die DOP-Behandlung der Tiere erfolgte über 6 Wochen und startete 4 Wochen nach der Ovarektomie. Hierzu wurde sieben 22 Wochen alten weiblichen C57B16J Mäusen 4-Deoxypyridoxin (DOP) in einer Konzentration von 3 mg/l (0,5 mg/kg/Tag) für eine Dauer von 6 Wochen mit dem Trinkwasser verabreicht. Als Referenztherapie wurde eine Behandlung mit iPTH (intermittierende Parathormontherapie) der OVX-Mäuse durchgeführt. Die iPTH Therapie findet auch in der humanen Osteoporosetherapie Anwendung und ist eine zuverlässige Positivkontrolle für die Behandlung der Osteoporose im OVX Modell. Hierzu wurden acht Tieren 80 pg/kg iPTH einmal täglich mittels subkutaner Injektion an 5 Tagen pro Woche für die Dauer von 6 Wochen verabreicht. Sieben Kontrolltiere erhielten parallel subkutane Injektionen von NaCl-Lösung. Nach der Behandlung wurde der trabekuläre Anteil der distalen Femora der Tiere mittels quantitativer Mikrocomputertomografie (m-CT) untersucht und die Knochenstabilität im 3-Punkt-Biegetest bestimmt. Surgery (ovariectomy) was performed on C57B16J mice by Charles River Laboratories, France. The pharmacological inhibition of SlP lyase was carried out via the SlP lyase inhibitor 4-deoxypyridoxine (DOP). The DOP treatment of the animals was over 6 weeks and started 4 weeks after the ovariectomy. For this purpose, seven 22-week-old female C57B16J mice were administered 4-deoxypyridoxine (DOP) at a concentration of 3 mg / L (0.5 mg / kg / day) for 6 weeks with the drinking water. As a reference therapy, treatment with iPTH (intermittent parathyroid therapy) of the OVX mice was performed. IPTH therapy is also used in human osteoporosis therapy and is a reliable positive control for the treatment of osteoporosis in the OVX model. Eight animals were given 80 pg / kg iPTH once daily by subcutaneous injection on 5 days per week for 6 weeks. Seven control animals received parallel subcutaneous injections of NaCl solution. After treatment, the trabecular portion of the animals' distal femora was examined by quantitative microcomputer tomography (m-CT) and bone stability was determined in the 3-point bending test.
Die Figuren 6a, 6b und 6c zeigen jeweils Mikrocomputertomografie- Aufnahmen des trabekulären Anteils der distalen Femora einer Maus nach Ovarektomie (OVX), die unbehandelt war (NaCl), oder mit DOP oder iPTH behandelt wurde. Das Längenmaß betrug jeweils 350 pm. Die Fig. 6d zeigt die Quantifizierung des Knochenvolumens pro FIGS. 6a, 6b and 6c respectively show microcomputed tomography images of the trabecular portion of the distal femur of a mouse after ovariectomy (OVX), which was untreated (NaCl), or treated with DOP or iPTH. The length measure was in each case 350 pm. Fig. 6d shows the quantification of the bone volume per
Gewebevolumen (BV/TV). Wie der Figur 6d entnommen werden kann, wiesen die mit DOP behandelten OVX-Tiere, wie die iPTH-behandelten OVX-Tiere, ein 3-fach höheres BV/TV im Vergleich zu den unbehandelten OVX-Tieren auf. Die Figuren 6e zeigt, dass die Tissue volume (BV / TV). As can be seen from Figure 6d, the DOP-treated OVX animals, such as the iPTH-treated OVX animals, had a 3-fold higher BV / TV compared to the untreated OVX animals. FIGS. 6e show that the
Trabekelanzahl (Tb.N.) der mit DOP wie mit iPTH-behandelten OVX-Tiere signifikant erhöht waren, während Figur 6f zeigt, und der Abstand zwischen den Trabekeln (Tb.Sp.) der mit DOP wie der iPTH-behandelten OVX-Tiere verringert waren. Figur 6g zeigt, dass die Dicke der Trabekel (Tb.Th.) jeweils unverändert war. Trabecular numbers (Tb.N.) were significantly increased with DOP as with iPTH-treated OVX animals, while Figure 6f shows, and the distance between the trabeculae (Tb.Sp.) of the DOP and iPTH-treated OVX animals were reduced. Figure 6g shows that the thickness of the trabeculae (Tb.Th.) was always unchanged.
Die Figur 7 zeigt die Ergebnisse der mechanischen Belastung im Biegetest. Die Figur 7 a zeigt die jeweils ermittelte Kraft gegen die Biegung für die unbehandelten OVX-Tiere, die mit DOP-behandelte Tiere (OVX + DOP) und iPTH-behandelten OVX-Tiere (OVX + iPTH). Die Figur 7a zeigt eine signifikante Zunahme der für einen Bruch erforderlichen Kraft und damit der Knochenstabilität der DOP -behandelten wie der iPTH-behandelten Tiere im 3-Punkt- Biegetest. Die Figuren 7b, 7c, 7d und 7e zeigen jeweils die Bruchkraft, die Steifigkeit, den Elastizitätsmodul und die Bruchspannung. Insgesamt lässt sich der Figur 7 entnehmen, dass die Stabilität der Knochen der DOP -behandelten OVX-Tiere im Vergleich zu den FIG. 7 shows the results of the mechanical stress in the bending test. FIG. 7 a shows the respectively determined force against the bending for the untreated OVX animals treated with DOP-treated animals (OVX + DOP) and iPTH-treated OVX animals (OVX + iPTH). The FIG. 7a shows a significant increase in the force required for fracture and thus the bone stability of the DOP-treated and iPTH-treated animals in the 3-point bending test. FIGS. 7b, 7c, 7d and 7e respectively show the breaking force, the rigidity, the elastic modulus and the breaking stress. Overall, it can be seen from FIG. 7 that the stability of the bones of the DOP-treated OVX animals in comparison to the
unbehandelten OVX-Tieren signifikant erhöht war. untreated OVX animals was significantly increased.
Die Verabreichung des SlP-Lyase-Inhibitors DOP zeigte somit insgesamt einen The administration of the SlP lyase inhibitor DOP thus showed a total of one
therapeutischen Effekt der pharmakologischen Inhibition der SlP-Lyase im Modell der Ovarektomie-induzierten Osteoporose, die zu einem Anstieg des Knochenvolumens und einer erhöhten Knochenstabilität führte. therapeutic effect of the pharmacological inhibition of SlP lyase in the model of ovariectomy-induced osteoporosis, which led to an increase in bone volume and increased bone stability.
Beispiel 5 Example 5
Untersuchung der Inhibition der SlP-Lyase durch die Verbindung LX293 in einem  Investigation of the inhibition of SlP lyase by the compound LX293 in one
Osteoporose-Modell in vivo Osteoporosis model in vivo
Weiter wurde das therapeutische Potenzial einer Inhibition der SlP-Lyase über den SlP- Lyase Inhibitor LX-2932 (IUPAC: (lR,2S,3R)-l-(2-(Isoxazol-3-yl)-lH-imidazol-4-yl)butan- l,2,3,4-tetraol) untersucht. Die pharmakologische Inhibition der SlP-Lyase erfolgte im Modell der Osteoporose nach Ovarektomie (OVX) bei Mäusen wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Verabreichung von LX2931 erfolgt vier Wochen nach der Ovariektomie in einer Further, the therapeutic potential of inhibiting SlP lyase by the SlP lyase inhibitor LX-2932 (IUPAC: (1R, 2S, 3R) -1- (2- (isoxazol-3-yl) -1H-imidazole-4 yl) butanediol, 2,3,4-tetraol). The pharmacological inhibition of SlP lyase was carried out in the model of osteoporosis after ovariectomy (OVX) in mice as described in Example 4. LX2931 is administered four weeks after ovariectomy
Konzentration von 100 mg/kg/Tag über das Trinkwasser für einen Zeitraum von 8 Wochen bei sieben 22 Wochen alten weiblichen C57B16J Mäusen. Lünf Kontrolltiere wurden unter identischen Bedingungen gehalten. Concentration of 100 mg / kg / day on drinking water for a period of 8 weeks in seven 22 week old female C57B16J mice. Liver control animals were kept under identical conditions.
Nach der Behandlung wurden das Knochenvolumen pro Gewebevolumen (BV/TV) bestimmt. Die Ligur 8a zeigt den prozentualen Anteil des Knochenvolumens pro Gewebevolumen (BV/TV) für die Kontrollen (-) und die Inhibition der SlP-Lyase durch LX-2932. Wie man der Figur 8a entnimmt, stieg das Knochenvolumen durch die Inhibition der SlP-Lyase von 0,113 ± 0,04 % der Kontrolle auf 0, 596 ± 0,13 % an. After treatment, bone volume per tissue volume (BV / TV) was determined. Ligur 8a shows the percentage of bone volume per tissue volume (BV / TV) for controls (-) and inhibition of SlP lyase by LX-2932. How one As Figure 8a shows, bone volume increased from 0.133 ± 0.04% of the control to 0. 596 ± 0.13% due to the inhibition of SlP lyase.
Weiter wurde das Gewicht des epidydimalen weißen Fettgewebes (WAT) bei sechs behandelten und vier Kontroll-Tieren bestimmt. Die Figur 8b zeigt das relative Gewicht für die Kontrollen (-) und die Inhibition der SlP-Lyase durch LX-2932. Wie man der Figur 8b entnimmt, sank der Anteil des weißen Fettgewebes nach Verabreichung von LX-2932 von 32,815 ± 2,7 mg/g deutlich auf 17,363 ± 1,25 mg/g ab. Further, the weight of epididymal white adipose tissue (WAT) was determined in six treated and four control animals. Figure 8b shows the relative weight for controls (-) and inhibition of SlP lyase by LX-2932. As can be seen from Figure 8b, the proportion of white adipose tissue after administration of LX-2932 dropped significantly from 32.815 ± 2.7 mg / g to 17.363 ± 1.25 mg / g.
Ferner wurde nach den acht Wochen Verabreichung von LX-2932 bei den sieben behandelten Mäusen und den fünf Kontrolltieren ein Glukosetoleranztest durchgeführt. Hierzu wurden die Tiere am Vortag gewogen und für einen Futterentzug für 6 Stunden in einen frischen Käfig mit Wasser, aber ohne Futter gesetzt. Am Versuchstag wurden die Tiere gewogen und die Bestimmung des basalen Blutglukoselevels erfolgte über die Entnahme eines Bluttropfens (ca. 10m1) nach Punktion der Schwanzvene mit Hilfe des STAT STRIP Xpress-i Further, after the eight-week administration of LX-2932, a glucose tolerance test was performed in the seven treated mice and the five control animals. For this purpose, the animals were weighed the day before and placed in a fresh cage with water, but without food for a feed withdrawal for 6 hours. On the day of the experiment the animals were weighed and the determination of the basal blood glucose level was made by taking a blood drop (about 10m1) after the tail vein had been punctured using the STAT STRIP Xpress-i
Glukosemessgerät (Nova® Biomedical, Waltham, MA, USA). Mit einer sterilen 27G Kanüle erfolgte dann die Injektion der 20%igen Glukoselösung in PBS (2mg Glukose/Gramm Körpergewicht bei einem maximalen Injektionsvolumen von 200m1) i.p.. Die Bestimmung der Glukose im Blut erfolgte in einem Abstand von 15, 30, 60, 90, 120 und 180 Minuten nach der Glukoseinjektion. Die Figur 8c zeigt den jeweiligen Blutglukosespiegel der Kontrollen (-) und bei Inhibition der SlP-Lyase durch LX-2932. Wie man der Figur 8c entnimmt, zeigten die Tiere bei Inhibition der SlP-Lyase durch LX-2932 eine erhöhte Glukoseaufnahme bzw. eine schnellere Verstoffwechselung der Glukose als die Kontrollen, wobei sich nach 90 Minuten nach Glukoseaufnahme die Werte anglichen. Glucose meter (Nova® Biomedical, Waltham, MA, USA). A sterile 27G cannula was then used to inject the 20% glucose solution into PBS (2 mg glucose / gram body weight at a maximum injection volume of 200 ml) ip. The determination of glucose in the blood was carried out at a distance of 15, 30, 60, 90, 120 and 180 minutes after glucose injection. FIG. 8c shows the respective blood glucose level of the controls (-) and in the case of inhibition of the SlP lyase by LX-2932. As can be seen from FIG. 8c, when LX-2932 inhibited SlP lyase, the animals showed an increased glucose uptake or a faster metabolism of glucose than the controls, the values being equalized after 90 minutes after glucose uptake.
Dies zeigt, dass auch die Verabreichung des SlP-Lyase-Inhibitors LX-2932 einen This shows that also the administration of the SlP lyase inhibitor LX-2932 a
therapeutischen Effekt im Modell der Ovarektomie-induzierten Osteoporose zeigte, und zu einem Anstieg des Knochenvolumens, einem Rückgang des Fettgewebes und einer erhöhten Verstoffwechselung der Glukose führte. Beispiel 6 showed therapeutic effect in the model of ovariectomy-induced osteoporosis, and led to an increase in bone volume, a decrease in adipose tissue and increased metabolism of glucose. Example 6
Untersuchung der Modulation der SlP-Konzentration durch einen Agonist des S1P2- Rezeptors in einem Osteoporose-Modell in vivo  Investigation of the modulation of the SlP concentration by an agonist of the S1P2 receptor in an osteoporosis model in vivo
Das therapeutische Potenzial einer Verabreichung eines Agonisten des Sphingosin-l- phosphat-Rezeptor Typ 2 wurde mittels Verabreichung der Verbindung CYM5520 (IUPAC l-[2-[2,5-Dimethyl-l-(phenylmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-2-oxoethyl]-l,6-dihydro-6-oxo-3- pyridincarbonitril) im Modell der Osteoporose nach Ovarektomie (OVX) bei Mäusen wie in Beispiel 4 und 5 beschrieben, untersucht. The therapeutic potential of administering an agonist of the sphingosine 1-phosphate receptor type 2 was achieved by administration of the compound CYM5520 (IUPAC 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl ] -2-oxoethyl] -l, 6-dihydro-6-oxo-3-pyridinecarbonitrile) in the model of osteoporosis following ovariectomy (OVX) in mice as described in Examples 4 and 5.
Die Verabreichung von CYM5520 erfolgt vier Wochen nach der Ovariektomie in einer Konzentration von 10 mg/kg in einer Lösung IOOmI 0,9% NaCl per Injektion intraperitoneal an 5 Tagen/Woche für einen Zeitraum von 8 Wochen. Verwendet wurden neun 22 Wochen alte weibliche C57B16J Mäusen und fünf Kontrolltiere. Administration of CYM5520 is given four weeks after ovariectomy at a concentration of 10 mg / kg in a solution of IOOmI 0.9% NaCl per injection intraperitoneally 5 days / week for a period of 8 weeks. Nine 22-week-old female C57B16J mice and five control animals were used.
Nach der Behandlung wurden das Knochenvolumen pro Gewebevolumen (BV/TV) bestimmt. Die Figur 9a zeigt den prozentualen Anteil des Knochenvolumens pro Gewebevolumen (BV/TV) für die Kontrollen (-) und die Verabreichung des SlP2-Rezeptor- Agonisten After treatment, bone volume per tissue volume (BV / TV) was determined. Figure 9a shows the percentage of bone volume per tissue volume (BV / TV) for controls (-) and administration of the SlP2 receptor agonist
(CYM5520). Wie man der Figur 9a entnimmt, stieg das Knochenvolumen auch durch den SlP2-Rezeptor- Agonisten von 0,349 ± 0,12 % auf 0,781 ± 0,10 % an. (CYM5520). As can be seen from Figure 9a, bone volume also increased by the SlP2 receptor agonist from 0.349 ± 0.12% to 0.781 ± 0.10%.
Ebenfalls wurde das Gewicht des epidydimalen weißen Fettgewebes (WAT) bei 8 Also, the weight of epididymal white adipose tissue (WAT) at 8
behandelten und 4 Kontroll-Tieren bestimmt. Die Figur 9b zeigt das relative Gewicht für die Kontrollen (-) und die Verabreichung des SlP2-Rezeptor- Agonisten (CYM5520). Die Figur 9b zeigt, dass der Anteil des weißen Fettgewebes nach Verabreichung von CYM5520 deutlich von 32,815 ± 2,75 mg/g auf 23,002 ± 1,29 mg/g sank. Auch die Behandlung mit CYM5520 zeigte somit einen deutlichen therapeutischen Effekt. Ferner wurde nach den acht Wochen Verabreichung von CYM5520 bei den 9 behandelten Mäusen und den 5 Kontrolltieren ein Glukosetoleranztest wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt. Die Figur 9c zeigt den jeweiligen Blutglukosespiegel der Kontrollen (-) und bei Verabreichung des SlP2-Rezeptor- Agonisten (CYM5520). Wie man der Figur 9c entnimmt, zeigten die Tiere auch bei Verabreichung des SlP2-Rezeptor- Agonisten CYM5520 eine erhöhte Glukoseaufnahme bzw. eine schnellere Verstoffwechselung der Glukose als die Kontrollen, wobei sich nach 120 Minuten nach Glukoseaufnahme die Werte anglichen. treated and 4 control animals. Figure 9b shows the relative weight for controls (-) and administration of the SlP2 receptor agonist (CYM5520). Figure 9b shows that the proportion of white adipose tissue after administration of CYM5520 dropped significantly from 32.815 ± 2.75 mg / g to 23.002 ± 1.29 mg / g. Treatment with CYM5520 also showed a clear therapeutic effect. Further, after the eight weeks administration of CYM5520 in the 9 treated mice and the 5 control animals, a glucose tolerance test was performed as described in Example 5. Figure 9c shows the respective blood glucose levels of the controls (-) and when the SlP2 receptor agonist (CYM5520) is administered. As can be seen from FIG. 9c, the animals also showed an increased glucose uptake or a faster metabolism of the glucose than the controls when the SlP2 receptor agonist CYM5520 was administered, the values being equalized after 120 minutes after the glucose uptake.
Dies zeigt, dass auch die Verabreichung eines SlP2-Rezeptor- Agonisten einen This shows that also the administration of an SLP2 receptor agonist has a
therapeutischen Effekt im Modell der Ovarektomie-induzierten Osteoporose bewirkte und zu einem Anstieg des Knochenvolumens, einem Rückgang des Fettgewebes und einer erhöhten Verstoffwechselung der Glukose führte. therapeutic effect in the model of ovariectomy-induced osteoporosis and led to an increase in bone volume, a decrease in adipose tissue and increased metabolism of glucose.
Beispiel 7 Example 7
Untersuchung der Assoziationen zwischen S1P und Knochen- und Fettparametern im  Investigation of associations between S1P and bone and fat parameters in the
Menschen People
Um einen Einblick in die humane Situation zu erlangen wurden Daten von 4091 Teilnehmern der SHIP-Trend Studie in Mecklenburg- Vorpommern bezüglich Assoziationen zwischen S1P und Knochen- und Fettparametern analysiert. Die Studie umfasst eine stratifizierte repräsentative Stichprobe von 10.000 (Netto Stichprobengröße 8.826) und 4.420 Personen im Alter von 20-79 Jahren nahmen zwischen 2008 und 2012 an den Basisuntersuchungen der Studie teil. Alle Teilnehmer wurden standardisierten medizinischen Untersuchungen einschließlich Blutproben und einem umfangreichen computergestützten Interview zu gesundheitsbezogenen Lebensgewohnheiten und Krankengeschichten unterzogen. Im In order to gain insight into the humane situation, data from 4091 participants in the SHIP-Trend study in Mecklenburg-Western Pomerania were analyzed for associations between S1P and bone and fat parameters. The study included a stratified representative sample of 10,000 (net sample size 8,826) and 4,420 individuals aged 20-79 years between 2008 and 2012 participated in the baseline study. All participants underwent standardized medical examinations including blood tests and a comprehensive computer-assisted interview on health-related living habits and medical histories. in the
Rahmen der körperlichen Untersuchung wurden Körpergröße und -gewicht mit kalibrierten Skalen gemessen und der BMI wurde berechnet [BMI = Gewicht (kg) / Höhe2 (m2)]. Die Serum-Konzentration des klinisch eingesetzten Knochenbildungsmarkers PINP As part of the physical examination, body height and weight were measured with calibrated scales and the BMI was calculated [BMI = weight (kg) / height 2 (m 2 )]. The serum concentration of the clinically used bone marker PINP
(Procollagen Typ l-N-terminales Propeptid) wurden in den Proben der Studienpopulation mittels des IDS-iSYS Multi-Discipline Automated Analyzer (Immunodiagnostic Systems Limited) mit dem IDS-iSYS Intact PINP-Assay bestimmt. Für jeden Analyten wurden drei Konzentrationen an Kontrollmaterial gemessen. Die Koeffizienten der Variation betrug 4,4% bei niedrigen Konzentrationen, 4,5% bei mittleren Konzentrationen und 4,3% bei hohen Konzentrationen, jeweils bezogen auf das Kontrollmaterial. (Procollagen type I N-terminal propeptide) were determined in the samples of the study population using the IDS-iSYS Multi-Discipline Automated Analyzer (Immunodiagnostic Systems Limited) with the IDS-iSYS Intact PINP Assay. For each analyte, three concentrations of control material were measured. The coefficients of variation were 4.4% at low concentrations, 4.5% at medium concentrations, and 4.3% at high concentrations, each relative to the control material.
Die S1P- Konzentrationen wurden in den Proben der Studienpopulation mittels The S1P concentrations were determined in the samples of the study population by means of
Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie bestimmt. Hierzu wurden 20 mΐ Serum mit 20 mΐ des internen Standards (1 mihoΐ/ΐ [l6,l7,l8-2H7]-SlP (SlP-d7, Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA) inkubiert. Die Proteine wurden mit 350 mΐ Acetonitril/Wasser, 80/20 Vol./Vol. ausgefällt. Nach Zentrifugation bei 10.000 g für 15 Minuten wurden die Extrakte einer Umkehrphasenchromatographie auf einer Zorbax SB-C8-Säule (2,1 x 50 mm; Agilent Technologies, Santa Clara, USA) mit einer Flussrate von 0,35 ml/min unterzogen. S1P wurde mit einem binären Gradienten für 6 Minuten eluiert (Methanol/Acetonitril/0,l% Liquid chromatography tandem mass spectrometry determined. 20mΐ of serum were incubated with 20mΐ of the internal standard (1mihoΐ / ΐ [l6, l7, 18-2H7] SLP (SlP-d7, Avanti Polar Lipids, Alabaster, U.S.A.) Proteins were probed with 350mΐ acetonitrile / After centrifugation at 10,000 g for 15 minutes, the extracts were subjected to reverse phase chromatography on a Zorbax SB-C8 column (2.1 x 50 mm, Agilent Technologies, Santa Clara, USA) subjected to a flow rate of 0.35 ml / min, S1P was eluted with a binary gradient for 6 minutes (methanol / acetonitrile / 0.1%).
Ameisensäure, 2,5 / 2,5 / 95, Vol / Vol / Vol zu Methanol / Acetonitril / 0,1% Ameisensäure, 30/30/40, Vol / Vol / Vol) und mittels Tandem-Massenspektrometrie (Varian L1200 MS /Formic acid, 2.5 / 2.5 / 95, vol / vol / vol to methanol / acetonitrile / 0.1% formic acid, 30/30/40, vol / vol / vol) and by tandem mass spectrometry (Varian L1200 MS /
MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) im Mehrfachreaktionsmodus gemessen, wobei die Fragmentierung des [M+H]+ SlP-Elternions (m/z = 380) zum Tochterion m/z = 264 bestimmt wurde. Der interne Standard SlP-d7 mit dem m/z-Übergang von 387 zu 271 wurde verwendet, um Variationen in Probenvorbereitung und Gerätereaktion zu korrigieren. Kalibrierungskurven (vier Niveaus von 0; 0,1; 0,3; 1 und 3 m mol/1 S1P) wurden erzeugt, um die absolut S1P- Konzentrationen in den Serumproben zu berechnen. MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) in the multiple reaction mode, where the fragmentation of the [M + H] + SlP parent (m / z = 380) was determined to be the m / z = 264 daughter ion. The internal standard SlP-d7 with the m / z transition from 387 to 271 was used to correct for variations in sample preparation and device response. Calibration curves (four levels of 0, 0.1, 0.3, 1 and 3 m mol / 1 S1P) were generated to calculate the absolute S1P concentrations in the serum samples.
Die Figur lOa zeigt die Auftragung der SlP-Konzentrationen im Serum gegen die FIG. 10a shows the plot of the SlP concentrations in the serum against the
Konzentration des Knochenbildungsmarker PINP. Die Figur lOb zeigt die Auftragung der SlP-Konzentrationen im Serum gegen den Body Mass Index (BMI) der Studienteilnehmer. Kontinuierliche Daten wurden als Median (1.-3. Quartil), kategorische Daten als Proportionen ausgedrückt. Gruppenvergleiche wurden mit Chi-Squared- oder Kruskal- Wallis-Tests durchgeführt. Ein p-Wert <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Beziehung zwischen BMI und S1P wurde in einem linearen Regressionsmodell für Alter und Geschlecht beurteilt. Es wurde eine kurvenförmige Verbindung gefunden, die mit einer eingeschränkten kubischen Splinefunktion mit drei Knoten modelliert wurde, die sich am 5., 50. und 95. Perzentil befanden. In allen Modellen wurde das Geschlecht als potenzieller Concentration of bone marker PINP. FIG. 10b shows the plot of the SlP concentrations in the serum against the body mass index (BMI) of the study participants. Continuous data were presented as median (1st-3rd quartile), categorical data as proportions expressed. Group comparisons were performed with Chi-Squared or Kruskal-Wallis tests. A p-value <0.05 was considered statistically significant. The relationship between BMI and S1P was assessed in a linear regression model for age and gender. A curved connection was modeled using a restricted three-node cubic spline function at the 5th, 50th, and 95th percentiles. In all models, gender was considered as potential
Effektmodifikator getestet, aber signifikante Wechselwirkungen waren nicht nachweisbar. Alle statistischen Analysen wurden mit SAS 9.4 (SAS Institute Ine., USA) durchgeführt. Effect modifier tested, but significant interactions were undetectable. All statistical analyzes were performed with SAS 9.4 (SAS Institute Ine., USA).
Wie man der Figuren lOa entnimmt, zeigte sich eine starke positive Assoziation zwischen den SlP-Konzentrationen im Serum der Studienteilnehmer und dem klinisch eingesetzten Knochenbildungsmarker RGNR. Weiter zeigt die Figur lOb eine Assoziation zwischen Serum SlP-Spiegeln und dem Body Mass Index (BMI) der Studienteilnehmer. Interessanter Weise konnte ein Anstieg der SlP-Serumkonzentration mit zunehmendem BMI bis zu einem Scheitelpunkt von 30 kg/m2, dem Grenzpunkt zu Adipositas, verzeichnet werden. Ab diesem Scheitelpunkt konnte ein Abfall der S1P Konzentration im Serum mit weiter zunehmendem BMI assoziiert werden. Diese Befunde zeigen, dass S1P positiv mit dem As can be seen from FIGS. 10a, there was a strong positive association between the SlP concentrations in the serum of the study participants and the clinically used bone formation marker RGNR. In addition, FIG. 10b shows an association between serum SlP levels and the body mass index (BMI) of the study participants. Interestingly, an increase in the serum SlP concentration could be observed with increasing BMI up to a peak of 30 kg / m 2 , the limit of obesity. From this vertex, a decrease in the S1P concentration in the serum could be associated with a further increase in BMI. These findings show that S1P is positive with the
Knochenbildungsmarker RGNR und negativ mit krankhaft erhöhtem BMI im Menschen assoziiert ist. Bone marker RGNR and negatively associated with pathologically increased BMI in humans.
Die Ergebnisse zeigen insgesamt, dass eine Modulation der Sphingosin- l-phosphat- Signaltransduktion durch einen Sphingosin- 1 -phosphat- Lyase-Inhibitor oder einen Agonisten des Sphingosin- 1 -phosphat-Rezeptor Typ 2 Erkrankungen oder Störungen des Overall, the results show that modulation of sphingosine-1-phosphate signal transduction by a sphingosine-1-phosphate-lyase inhibitor or an agonist of sphingosine-1-phosphate receptor type 2 causes diseases or disorders of the sphingosine-1-phosphate receptor
Knochengewebes, des Fettgewebes und des Glukose-Stoffwechsels wie Osteoporose, Adipositas, insbesondere als Reaktion auf Östrogenmangel in der Postmenopause, oder einen gestörten Glukosestoffwechsel günstig beeinflussen können. Bone tissue, adipose tissue and glucose metabolism such as osteoporosis, obesity, in particular in response to postmenopausal estrogen deficiency, or may favorably affect a disturbed glucose metabolism.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e Patent claims
1. Verwendung eines Modulators der Sphingosin- 1 -phosphat-Signaltransduktion zur1. Use of a modulator of sphingosine 1-phosphate signal transduction to
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung oder Störung, die mit Sphingosin- 1 -phosphat und dessen Rezeptoren in Zusammenhang steht, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung oder Störung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Erkrankungen oder Störungen des Knochengewebes, des Fettgewebes und/oder des Glukose-Stoffwechsels. Preparation of a medicament for the treatment of a disease or disorder associated with sphingosine-1-phosphate and its receptors, characterized in that the disease or disorder is selected from the group consisting of disorders or disorders of bone tissue, adipose tissue and / or glucose metabolism.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Modulator ein 2. Use according to claim 1, characterized in that the modulator a
Inhibitor der Sphingosin- 1 -phosphat- Lyase ist.  Inhibitor of sphingosine 1-phosphate lyase.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor der 3. Use according to claim 2, characterized in that the inhibitor of
Sphingosin- 1 -phosphat- Lyase ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend (E)-l-(4- ((lR,2S,3R)-l,2,3,4-Tetrahydroxybutyl)-lH-imidazol-2-yl)ethanon-oxim, (lR,2S,3R)- l-(2-(Isoxazol-3-yl)-lH-imidazol-4-yl)butan-l,2,3,4-tetraol, 4-Deoxypyrodoxin, 2- Acetyl-4(5)-[lR, 2S, 3R, 4-tetrahydroxybutyl]-imidazol und/oder Verbindungen gemäß der folgenden Formel (1)  Sphingosine 1-phosphate lyase is selected from the group comprising (E) -1- (4- ((1R, 2S, 3R) -1,3,3,4-tetrahydroxybutyl) -1H-imidazol-2-yl) ethanone oxime, (1R, 2S, 3R) -1- (2- (isoxazol-3-yl) -1H-imidazol-4-yl) -butan-1, 2,3,4-tetraol, 4-deoxypyrodoxin, 2 Acetyl-4 (5) - [1R, 2S, 3R, 4-tetrahydroxybutyl] -imidazole and / or compounds according to the following formula (1)
Figure imgf000029_0001
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worin Ri ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend H, Cl und/oder CN.  wherein Ri is selected from the group comprising H, Cl and / or CN.
4. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Modulator ein 4. Use according to claim 1, characterized in that the modulator a
Agonist des Sphingosin- 1 -phosphat- Rezeptor Typ 2 ist.  Agonist of sphingosine 1-phosphate receptor type 2 is.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Agonist des 5. Use according to claim 4, characterized in that the agonist of
Sphingosin- 1 -phosphat- Rezeptor Typ 2 ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend 1- [2-[2,5-Dimethyl-l-(phenylmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-2-oxoethyl]-l,6-dihydro-6-oxo-3- pyridincarbonitril, l-[2-[2,5-Dimethyl- 1 -(phenylmethyl)- lH-pyrrol-3-yl]-2-oxoethyl]- 2,5-pyrrolidindion und/oder die Verbindung gemäß der folgenden Formel (7) Sphingosine 1-phosphate receptor type 2 is selected from the group comprising [2- [2,5-Dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2-oxoethyl] -l, 6-dihydro-6-oxo-3-pyridinecarbonitrile, 1- [2- [ 2,5-Dimethyl-1 - (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2-oxoethyl] -2,5-pyrrolidinedione and / or the compound represented by the following formula (7)
Figure imgf000030_0001
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Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankungen oder Störungen des Fettgewebes metabolische oder genetische Erkrankungen oder Störungen sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Adipositas, abnorme Lipidstoffwechsellage und/oder die Verfettung von Organen. Use according to any one of the preceding claims, characterized in that the diseases or disorders of the adipose tissue are metabolic or genetic diseases or disorders selected from the group consisting of obesity, abnormal lipid metabolism and / or the obesity of organs.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankungen oder Störungen des Glukose-Stoffwechsels metabolische oder genetische Erkrankungen oder Störungen sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Glukose-Intoleranz, Insulin-Resistenz, abnorme Glukosestoffwechsellage und/oder Diabetes. Use according to any one of the preceding claims, characterized in that the diseases or disorders of the glucose metabolism are metabolic or genetic diseases or disorders selected from the group comprising glucose intolerance, insulin resistance, abnormal glucose metabolism and / or diabetes.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankungen oder Störungen des Knochengewebes genetische oder metabolische Erkrankungen oder Störungen sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Frakturen, Osteoporose, gestörte oder verzögerte Knochenheilung, Knochenstabilisation, Tumor-assoziierte Knochenschwäche und/oder metabolische Erkrankungen, die zu verminderter Knochenqualität oder Knochenquantität führen. Use according to any one of the preceding claims, characterized in that the diseases or disorders of the bone tissue are genetic or metabolic diseases or disorders selected from the group comprising fractures, osteoporosis, disturbed or delayed bone healing, bone stabilization, tumor-associated bone weakness and / or metabolic diseases, which lead to decreased bone quality or bone quantity.
Arzneimittel umfassend einen Modulator der Sphingosin- l-phosphat- Signaltransduktion zur Behandlung einer Erkrankung oder Störung, die mit A pharmaceutical composition comprising a modulator of sphingosine-1-phosphate signal transduction for treating a disease or disorder associated with
Sphingosin- 1 -phosphat und dessen Rezeptoren in Zusammenhang steht, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung oder Störung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Erkrankungen oder Störungen des Knochengewebes, des Fettgewebes und/oder des Glukose-Stoffwechsels. 10. Arzneimittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Modulator ein Sphingosine 1-phosphate and its receptors is related, thereby in that the disease or disorder is selected from the group comprising diseases or disturbances of the bone tissue, adipose tissue and / or the glucose metabolism. 10. Medicament according to claim 9, characterized in that the modulator a
Inhibitor der Sphingosin- 1 -phosphat- Lyase oder ein Agonist des Sphingosin- 1- phosphat-Rezeptor Typ 2 ist, wobei vorzugsweise  Inhibitor of sphingosine 1-phosphate lyase or an agonist of sphingosine 1-phosphate receptor type 2, preferably
- der Inhibitor der Sphingosin- 1 -phosphat- Lyase ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend (E)-l-(4-((lR,2S,3R)- 1,2,3, 4-Tetrahydroxybutyl)-lH-imidazol-2- yl)ethanon-oxim, ( 1 R,2S ,3R)- 1 - (2- (Isoxazol-3-yl)- 1 H-imidazol-4-yl)butan- 1 ,2,3 ,4- tetraol, 4-Deoxypyrodoxin, 2-Acetyl-4(5)-[lR, 2S, 3R, 4-tetrahydroxybutyl]-imidazol und/oder Verbindungen gemäß der folgenden Formel (1)  the inhibitor of sphingosine 1-phosphate lyase is selected from the group comprising (E) -1- (4 - ((1R, 2S, 3R) -1,2,3,4-tetrahydroxybutyl) -1H-imidazole 2-yl) ethanone oxime, (1R, 2S, 3R) -1- (2- (isoxazol-3-yl) -1H-imidazol-4-yl) butane-1,2,3,4-tetraol , 4-Deoxypyrodoxin, 2-acetyl-4 (5) - [1R, 2S, 3R, 4-tetrahydroxybutyl] -imidazole and / or compounds according to the following formula (1)
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000031_0001
worin Ri ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend H, Cl und/oder CN; und/oder - der Agonist des Sphingosin- 1 -phosphat-Rezeptor Typ 2 ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend l-[2-[2, 5-Dimethyl-l -(phenylmethyl)- lH-pyrrol-3-yl]-2-oxoethyl]- l,6-dihydro-6-oxo-3-pyridincarbonitril, l-[2-[2,5-Dimethyl-l-(phenylmethyl)-lH- pyrrol-3-yl]-2-oxoethyl]-2,5-pyrrolidindion und/oder die Verbindung gemäß der folgenden Formel (7)  wherein Ri is selected from the group comprising H, Cl and / or CN; and / or - the agonist of the sphingosine-1-phosphate receptor type 2 is selected from the group comprising 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2 -oxoethyl] -1,6-dihydro-6-oxo-3-pyridinecarbonitrile, 1- [2- [2,5-dimethyl-1- (phenylmethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -2-oxoethyl] - 2,5-pyrrolidinedione and / or the compound of the following formula (7)
Figure imgf000031_0002
Figure imgf000031_0002
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