WO2019124306A1 - Ｄｎａウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法、及び、活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法 - Google Patents

Ｄｎａウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法、及び、活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法 Download PDF

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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/42—Apparatus for the treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves

Definitions

  • the present invention relates to a method of measuring the activity of a DNA virus or unicellular organism, and a method of measuring the bactericidal activity of an active energy ray irradiation apparatus.
  • the sterilization and disinfection of unicellular organisms such as pathogenic viruses and bacteria are very important in maintaining a hygienic environment.
  • the sterilization and disinfection of drinking water and environmental water need to be strictly carried out in order to directly affect people's health.
  • administration of drugs such as chlorine agents has often been used, but there has been a problem that the drug residue causes an influence on the ecosystem, causes of allergies, and the like. Therefore, in recent years, sterilization / disinfection treatments that damage the nucleic acid by irradiation with active energy rays such as ultraviolet rays and radiation have come to be widely used.
  • active energy ray irradiation treatment is expected as a countermeasure against protozoa such as cryptosporidium having chlorine resistance.
  • the active energy ray irradiation apparatus used to kill viruses and unicellular organisms.
  • the irradiation dose of the active energy ray irradiation device it is possible to verify the extent to which the setting of the device or light source or the irradiation amount measuring device is performed.
  • the actual bactericidal activity varies depending on the irradiation time, the residence time in the irradiation device, the irradiation site, etc. Therefore, the verification of the bactericidal activity possessed by the actual device can be performed by living bacteria or pathogenicity by the culture method. There is a big problem that it takes a long time to make a decision.
  • Non-Patent Document 1 uses PCR to detect the damage rate of nucleic acid based on the results of two real-time PCR when the amplification products of PCR are 40-70 bp and 3000-4000 bp. A method of determining the damage rate is disclosed. However, there is a problem that there is a problem of having to perform PCR twice, and when the amplification product exceeds 3000 bp, a PCR amplification error easily occurs.
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring the activity of a DNA virus or unicellular organism conveniently and quickly. Another object of the present invention is to provide a method for measuring the bactericidal activity of an active energy ray irradiation apparatus simply and quickly.
  • the present inventors found that by setting the amplification range of quantitative PCR to 1500-2800 bp, the result of quantitative PCR can be used as a method for measuring the activity of a virus or unicellular organism.
  • the present invention comprises the steps of 1) preparing a target nucleic acid possessed by a DNA virus or unicellular organism, 2) preparing a primer with a target nucleic acid as a template and an amplification range of 1500-2800 bp by PCR.
  • Activity of a DNA virus or unicellular organism characterized by comprising the steps of: performing quantitative PCR using a target nucleic acid and a primer; and 4) converting the results of the quantitative PCR into the activity of the DNA virus or unicellular organism. It provides a measurement method.
  • the present invention further provides a method for measuring the activity of a virus or unicellular organism, comprising the step of processing the target nucleic acid with endonuclease.
  • the present inventors found that the result of quantitative PCR can be used as a method for measuring the bactericidal activity of an active energy ray irradiation apparatus by setting the amplification range of quantitative PCR to 1500-2800 bp.
  • a step of irradiating treated DNA with active energy ray using an active energy ray irradiation device to obtain treated DNA and 2) amplification range by PCR for the obtained treated DNA is 1500-2800 bp. It is characterized by having the steps of preparing a primer having a length of 3), performing quantitative PCR using the treated DNA and the primer, and 4) converting the result of quantitative PCR into bactericidal activity by active energy rays.
  • the present invention provides a method of measuring the bactericidal activity of an active energy ray irradiation device.
  • the activity of the DNA virus or unicellular organism can be conveniently measured. Further, by using the method of measuring the bactericidal activity of the active energy ray irradiation device of the present invention, the substantial bactericidal activity of the active energy ray irradiation device can be simply measured.
  • FIG. 21 is a diagram showing a calibration curve obtained by PCR in Reference Example 1-5.
  • the present invention comprises the steps of 1) preparing a target nucleic acid possessed by a DNA virus or unicellular organism, and 2) preparing a primer whose amplification product by PCR using the target nucleic acid is 1500-2800 bp in length, Activity of a DNA virus or unicellular organism, characterized by comprising the steps of: performing quantitative PCR using a target nucleic acid and a primer; and 4) converting the results of the quantitative PCR into the activity of the DNA virus or unicellular organism. It provides a measurement method. By this method, the activity of DNA virus or unicellular organism can be measured by quantitative PCR. As used herein, activity refers to the growth potential of DNA viruses or unicellular organisms.
  • Step of preparing target nucleic acid possessed by DNA virus or unicellular organism ⁇ DNA virus or unicellular organism>
  • a target nucleic acid possessed by a DNA virus or unicellular organism is amplified by quantitative PCR.
  • the target nucleic acid is DNA (deoxyribonucleic acid).
  • the DNA virus may be a virus having DNA as a nucleic acid. Although it is possible to measure the activity of those with or without pathogenicity, it is useful from the viewpoint of public health that it is possible to measure the activity of viruses with pathogenicity without culturing.
  • DNA viruses include lambda phage, herpes virus, human papilloma virus, JC virus, cytomegalovirus, adenovirus, hepatitis B virus, varicella-zoster virus, parvovirus, EB virus, M13 phage, T2 phage, T4 phage , T5 phage, T6 phage, T7 phage and the like.
  • the unicellular organism may be a prokaryotic unicellular organism or a eukaryotic unicellular organism. If one cell has one activity, the activity measurement will be more accurate.
  • unicellular organisms include bacteria, protozoa, algae, ciliates, flagellates, spores and the like. Preferred are bacteria and protozoa. Although it is possible to measure the activity of those with or without pathogenicity, it is useful that the activity of unicellular organisms with pathogenicity can be measured without culture from the viewpoint of public health.
  • bacteria examples include E. coli, Legionella, Shigella, Vibrio cholerae, Campylobacter, Yersinia, typhus, diphtheria, Streptococcus, Streptococcus, Bacillus anthracis, Brucella, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Plasmodium, bacteria.
  • Mycobacterium tuberculosis, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, Staphylococci, Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Bacillus cereus, Plasmodium, Mycoplasma and the like can be mentioned.
  • protozoa examples include cryptosporidium, giardia, amoeba, malaria, toxoplasma, microsporidia, isospora, negreria, baumtia, leishmania, trypanosome, trichomonas, babesiosis, lamblias flagellum, valantidium, paramecium and the like.
  • the target nucleic acid possessed by the DNA virus or unicellular organism is prepared for quantitative PCR. Specifically, part or all of the outer shell such as the virus shell or cell wall may be destroyed.
  • the target nucleic acid may be extracted and isolated, or may be used in the state of being released from the outer shell.
  • the method of breaking the outer shell may be a known conventional method. Methods such as an osmotic pressure method, an enzyme treatment method, a surfactant treatment method, a freezing and thawing method, an ultrasonic treatment, and a grinding treatment can be used.
  • a commercially available DNA extraction kit may be used.
  • the target nucleic acid may be genomic DNA, plasmid DNA, or organelle DNA. In the case of one copy of one cell, genomic DNA is preferable because activity measurement is more accurate.
  • the present invention measures the presence or absence of a DNA error by performing PCR with a long amplification range of 1500-2800 bp.
  • the target nucleic acid to be a template may be used as it is, but it is preferable to use in combination with endonuclease treatment since it is possible to clarify errors borne by DNA and to more accurately measure the result of quantitative PCR.
  • endonucleases for example, Endonuclease III, Tma Endonuclease III, Endonuclease VIII, Endonuclease IV, Endonuclease V, T4 PDG, S1 Nuclease can be used.
  • a primer for performing quantitative PCR is designed to use the target nucleic acid as a template.
  • the amplification product by PCR is adjusted to 1500-2800 bp. If the amplification product is less than 1500 bp, even DNA having a DNA error and no activity may be amplified by PCR. If it is larger than 2800 bp, errors in the PCR itself may increase and amplification products may not be obtained successfully.
  • the amplification product is preferably 1500-2500 bp, particularly preferably 1700-2200 bp.
  • Primers for quantitative PCR are designed as a set of forward and reverse. At this time, it is preferable to use a primer having sequence specificity so as not to cause an amplification error in the target nucleic acid.
  • Step of performing quantitative PCR using target nucleic acid and primers Quantitative PCR is performed using the obtained target nucleic acid and primers.
  • quantitative PCR known and commonly used methods may be used, and agarose gel electrophoresis, intercalator method, fluorescent probe method and the like can be mentioned. From the viewpoint of accuracy, a fluorescent probe method in which a probe annealing to a target area is used in combination is preferable.
  • the intercalator method or the fluorescent probe method is preferable because real-time quantitative PCR can be performed and rapid measurement is possible.
  • the amount of amplification product obtained can be determined by a calibration curve from a standard product.
  • the standard product may be a DNA fragment to which the sequence is homologous or may be a different sequence.
  • a standard curve can be drawn by measuring the fluorescence concentration of a sample whose concentration has been changed, with respect to a standard of approximately the same length as the amplification product.
  • PCR conditions may be used as PCR conditions.
  • the conditions of holding stage is 95 ° C. ⁇ 3 min
  • cycling stage is 95 ° C. ⁇ 3 sec
  • 65-66 ° C. ⁇ 90 sec for 40 cycles.
  • the result of quantitative PCR can be treated as the activity of DNA virus or unicellular organism.
  • the result of quantitative PCR can be made active by the following formula.
  • Activity per ml of sample (U / ml) (number of copies of DNA in sample) / (number of ml of sample)
  • the DNA copy number in the sample can be determined by performing quantitative PCR using a standard having a bp number almost equal to the amplification range as a template, and making a calibration curve and referring to it.
  • the activity measurement method of the present invention can convert the result of quantitative PCR as it is into the activity of DNA virus or unicellular organism. This is because by performing PCR with an amplification range having a specific length of 1500-2800 bp, it is possible to accurately measure undamaged DNA.
  • the activity measurement in this method is accurate can be proved by the correlation between the DNA copy number obtained from quantitative PCR and the viable cell number obtained in bioassay such as culture method.
  • the decrease in activity before and after ultraviolet (UV) irradiation may be compared by quantitative PCR and culture methods.
  • a step of irradiating the DNA with active energy ray irradiation using an active energy ray irradiation device to obtain a treated DNA and 2) the obtained treated DNA has an amplification range of 1500-2800 bp by PCR. It has a step of preparing a primer to be a length, 3) a step of performing quantitative PCR using treated DNA and the primer, and 4) a step of converting the result of quantitative PCR into a bactericidal force by active energy rays.
  • the present invention also provides a method of measuring the bactericidal activity of an active energy ray irradiation device. By this method, the bactericidal activity of the active energy ray irradiation device can be measured.
  • the bactericidal activity as used herein refers to the ability to damage DNA by active energy radiation.
  • DNA is irradiated with active energy ray using an active energy ray irradiation device for which the bactericidal activity is to be measured. And get processed DNA.
  • active energy ray any energy ray which damages DNA may be used, and radiation (x-ray, gamma ray, electron beam etc.), ultraviolet ray, infrared ray etc. may be mentioned. It is ultraviolet light that is often used in industry.
  • DNA is prepared and treated DNA irradiated with active energy rays is obtained.
  • a DNA obtained by extraction from an organism or a virus may be used, a PCR amplification product may be used, or a synthetic DNA may be used. From environmental impact, preferably, it is a non-pathogenic DNA fragment.
  • the number of bps of the pre-treatment DNA may be equal to or greater than the amplification range of the subsequent PCR, but when performing electrophoresis, it is 1.5 more than the DNA amplification range so that contamination of the template and the amplification product does not occur. It is preferable that the chain length be longer by about twice or more.
  • An active energy ray may be irradiated in an open environment using an open petri dish or the like, or DNA may be placed in a container or line of a material which can transmit the active energy ray, and the active energy ray may be irradiated.
  • the DNA contained in a container such as a petri dish, a microtube, a test tube, or a bag may be irradiated with active energy rays, or the line through which the DNA solution passes through the tube may be irradiated with active energy rays. Absent.
  • the active energy ray is irradiated, the dose and the irradiation time may be adjusted appropriately.
  • step 2) A step of preparing a primer having an amplification range of 1500 to 2800 bp by PCR on the obtained treated DNA 3)
  • step of performing quantitative PCR using the treated DNA and the primer The method can be carried out in the same manner as step 2) or 3) of the method for measuring the activity of DNA virus or unicellular organism.
  • Step 4 Step of Converting Result of Quantitative PCR into Bactericidal Power by Active Energy Ray
  • the bactericidal power of active energy ray is calculated based on the result obtained by quantitative PCR. From the results of quantitative PCR, it is possible to deduce the number of intact DNA by irradiation. When it is desired to show bactericidal activity, bactericidal activity can be obtained by expressing the ratio of copy numbers before and after irradiation with active energy rays.
  • Bactericidal activity (%) [1- (DNA copy number after active energy ray irradiation / DNA copy number before active energy ray irradiation)] * 100
  • the bactericidal activity measurement method of the present invention can convert the result of quantitative PCR as it is into the bactericidal activity of the active energy ray irradiation apparatus. This is because by performing PCR of an amplification range having a specific length of 1500-2800 bp, it is possible to accurately measure undamaged DNA, ie, DNA that could not be sterilized.
  • the activity measurement in this method is accurate means that the present method is carried out using live bacteria as the pre-treatment DNA, and the DNA copy number obtained from quantitative PCR and the live bacteria obtained by bioassay such as culture method We can prove it by correlating numbers. For example, the decrease in activity before and after ultraviolet (UV) irradiation may be compared by quantitative PCR and culture methods.
  • UV ultraviolet
  • the amplification range of quantitative PCR needs to be 1500-2800 bp. If the amplification range of PCR is smaller than 1500 bp, the residual activity in this method can not be used because it will be higher than the result of the bioassay, and if larger than 2800 bp, the residual activity in this method will be greater than the result of the bioassay Because it is too low to use.
  • the amplification product is preferably 1500-2500 bp, particularly preferably 1700-2200 bp.
  • the measurement method of the present invention can measure the activity of DNA virus or unicellular organism easily and quickly by using quantitative PCR.
  • the target DNA virus or single cell biomass can be simply measured from water, soil, food, biological origin, etc., which is very useful in industry.
  • the bactericidal activity measuring method of this invention can measure the bactericidal activity of an active energy ray irradiation apparatus easily and speedily by using quantitative PCR. In particular, it is suitable for measuring the residual activity amount after active energy ray irradiation whose activity can not be discriminated by morphological observation using a microscope or the like.
  • UV light source LED (30-50mW; UVMAX260-FW-50, Sensor Electronic Technology Inc.)
  • Virus sample 1 ⁇ 10 10 copies / mL (TE buffer, pH 8.0)
  • T4PDG was prepared with 10 ⁇ T4 PDG Reaction Buffer, BSA (final concentration 0.1 mg / mL), and Nuclease free water so that the titer of T4PDG would be 40 U / 1 g DNA. The enzyme reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours.
  • Plaque assay spot assay
  • Plaque assay was performed as follows. Approximately 9 mL of soft agar was mixed with 300 ⁇ L of E. coli culture, poured onto a plate and allowed to dry. Next, 1 ⁇ L each of the sample phage suspension was spotted on a plate, and incubated at 37 ° C. overnight to observe spots. If the phage is infectious, plaques are observed around the spots.
  • Virus lambda phage (Gelman Culture Collection, No. 4499)
  • PCR primer amplification range 100 bp Forward Primer TAACACGCTCACCATGAAGC (SEQ ID NO: 1) Reverse Primer GCCACATCCACCGACTTTT (SEQ ID NO: 2) Fluorescent Probe FAM-ACTAATGGGCGTGGCT-MGB (SEQ ID NO: 3)
  • Amplification range 2000 bp Forward Primer TAACACGCTCACCATGAAGC (SEQ ID NO: 4) Reverse Primer GCCACATCCACCGACTTTT (SEQ ID NO: 5) Fluorescent Probe FAM-CCGTCTACGGAAAGC-MGB (SEQ ID NO: 6)
  • Amplification range 2500 bp Forward Primer TAACACGCTCACCATGAAGC (SEQ ID NO: 7) Reverse Primer CATACAT CGCCTTCACAATGG (SEQ ID NO: 8) Fluorescent Probe FAM-ATCTGACCGAAGGCCA-MGB (SEQ ID NO: 9)
  • Amplification range 3000 bp Forward Primer TAACACGCTCACCATGAAGC (SEQ ID NO: 10) Reverse Primer GAGCCTATCC AGTCGCAGTTC (SEQ ID NO: 11) Fluorescent Probe FAM-ACAGGAAGAACTTGCCG-MGB (SEQ ID NO: 12)
  • Amplification range 3500 bp Forward Primer TAACACGCTCACCATGAAGC (SEQ ID NO: 13) Reverse Primer GATGCCGTTCATGACCTGAT (SEQ ID NO: 14) Fluorescent Probe FAM-AATATGCCGGTATCACG-MGB (SEQ ID NO: 15)
  • the relationship between the DNA concentration obtained with each primer and probe and the threshold cycle (CT), that is, the calibration curve is shown in FIG.
  • Virus lambda phage (Gelman Culture Collection, No. 4499) ⁇ Ultraviolet radiation dose: 40mJ / cm 2
  • the primers used are as follows. Amplification range: 100 bp Forward Primer TAACACGCTCACCATGAAGC (SEQ ID NO: 16) Reverse Primer GCCACATCCACCGACTTTT (SEQ ID NO: 17)
  • Amplification range 1600 bp Forward Primer TAACACGCTCACCATGAAGC (SEQ ID NO: 18) Reverse Primer CGTAAACTCCACCCTTCGTCC (SEQ ID NO: 19)
  • Amplification range 2000 bp Forward Primer TAACACGCTCACCATGAAGC (SEQ ID NO: 20) Reverse Primer AGCTTGGGCGATGACTGAG (SEQ ID NO: 21)
  • Amplification range 2500 bp Forward Primer TAACACGCTCACCATGAAGC (SEQ ID NO: 22) Reverse Primer CATACAT CGCCTTCACAATGG (SEQ ID NO: 23)
  • Plaque assay was performed as follows. Approximately 9 mL of soft agar was mixed with 300 ⁇ L of E. coli culture, poured onto a plate and allowed to dry. Next, a dilution series of a sample phage suspension was prepared, and 1 ⁇ L of each was spotted on a plate and incubated overnight at 37 ° C. to observe spots. If the phage is infectious, plaques are observed around the spots.
  • the plaque assay / qPCR ratio does not change even after the enzyme treatment, but with the amplification range extended 1600 bp, the plaque assay / qPCR ratio is closer to 1 when enzyme treatment is combined rather than qPCR alone It turned out that it became.
  • Primer amplification range for T5 phage 2000 bp Forward Primer TAACTGCCCAAAATGCTTC (SEQ ID NO: 24) Reverse Primer AATTCTGGAGCAATCCATCG (SEQ ID NO: 25)
  • Primer amplification range for M13 phage 2000 bp Forward Primer GCGTTGGCCGATTCATTAA (SEQ ID NO: 26) Reverse Primer TCACTGCCCGCTTTCCA (SEQ ID NO: 27)
  • Amplification range 2500 bp Forward Primer GCTACTTGGAGCCACTATCGACTA (SEQ ID NO: 28) Reverse Primer CTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGG (SEQ ID NO: 29) Fluorescent Probe FAM-TCCTGTCTGTTGAGGACC-MGB (SEQ ID NO: 30)
  • the activity measuring method and the bactericidal activity measuring method of the present invention can measure the bactericidal activity of the DNA virus or single cell organism or the bactericidal activity of the active energy ray irradiation apparatus without waiting for the culture of the virus or single cell organism.

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Abstract

本発明は、１）ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の保有する標的核酸を用意する工程と、２）標的核酸を鋳型としたＰＣＲによる増幅範囲が１５００－２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程と、３）標的核酸とプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程と、４）定量ＰＣＲの結果をＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性能に変換する工程とを有することを特徴とする、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法を提供するものである。　また本発明は、活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法を提供するものである。

Description

ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法、及び、活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法
　本発明は、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法、及び、活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法に関する。
　本願は、２０１７年１２月２１日に、日本に出願された特願２０１７－２４５０２３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　病原性を有するウイルスや細菌等の単細胞生物の殺菌・消毒は、衛生環境の維持に置いて大変重要である。特に飲料水や環境水の殺菌・消毒は、人々の健康に直結する為、厳密に行われる必要がある。従来は、塩素剤等の薬剤投与が多く用いられているが、薬剤の残留が生態系への影響やアレルギー等の原因となるという課題があった。そこで、近年紫外線や放射線といった活性エネルギー線照射を行い核酸に損傷を与える殺菌・消毒処理が多く利用されるようになってきた。特に、耐塩素性を有するクリプトスポリジウムなどの原虫対策に、活性エネルギー線照射処理が期待されている。
　しかし、ウイルスや単細胞生物の殺菌に用いる活性エネルギー線照射装置については、各種課題が存在する。例えば、活性エネルギー線照射装置の照射線量については、装置や光源の設定や照射量測定装置等である程度の検証は可能である。しかし、実際の殺菌力については、照射時間や照射装置内での滞留時間、照射場所等でバラつきがあるため、実際の装置が保有する殺菌力の検証は、培養法により、生菌や病原性の確認を行う必要があり、判定までに時間がかかってしまうという大きな課題が存在していた。
　また、殺菌対象であるウイルスや単細胞生物についても、殺菌・消毒処理がきちんと行われたかどうかの検証には、多くの課題があった。たとえば処理前後で顕微鏡観察したとしても、形態変化が無い場合があるため、ウイルスや単細胞生物が病原性を保持しているのかどうか判別できなかった。また、菌量やウイルス量を測定するのに定量ＰＣＲを用いる場合があるが、従来の一般的な定量ＰＣＲでは核酸の損傷の有無に関係なく増幅反応が進む場合があるため、核酸の損傷有無に伴う不活化の効果を判定しにくかった。よって、殺菌・消毒処理の正確な検証、つまり、ウイルスや単細胞生物の保有する活性能の測定を行うには、やはり培養法により生菌や病原性の確認を行う必要があり、判定までに時間がかかってしまうという大きな課題があった。
　核酸の損傷率を知るために、非特許文献１では、ＰＣＲを利用して核酸の損傷率をＰＣＲの増幅産物が４０－７０ｂｐと３０００－４０００ｂｐとなる２つのリアルタイムＰＣＲの結果から、標的核酸の損傷率を求める方法が開示されている。しかし、ＰＣＲを２回行う手間がある上、増幅産物が３０００ｂｐを越える場合、ＰＣＲ増幅エラーが起こりやすくなるという課題があった。
Ｏｌｉｖｅｒ　Ｒｏｔｈｆｕｓｓ、"Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ"，　２０１４，　Ｖｏｌ．４２，　Ｎｏ．６，　ｅ４１
　本発明の課題は、簡便かつスピーディーにＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性を測定する方法を提供することにある。
　また、本発明の課題は、簡便かつスピーディーに活性エネルギー線照射装置の殺菌力を測定する方法を提供するものである。
　本発明者らは鋭意検討の結果、定量ＰＣＲの増幅範囲を１５００－２８００ｂｐとすることで、定量ＰＣＲの結果をウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法として使用できることを見出した。
　すなわち本発明は、１）ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の保有する標的核酸を用意する工程と、２）標的核酸を鋳型としＰＣＲによる増幅範囲が１５００－２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程と、３）標的核酸とプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程と、４）定量ＰＣＲの結果をＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性能に変換する工程とを有することを特徴とする、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法を提供するものである。
　また本発明は、さらに、標的核酸をエンドヌクレアーゼ処理する工程を有するウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法を提供するものである。
　また本発明者らは鋭意検討の結果、定量ＰＣＲの増幅範囲を１５００－２８００ｂｐとすることで、定量ＰＣＲの結果を活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法として使用できることを見出した。
　すなわち本発明は、１）活性エネルギー線照射装置を用いて、ＤＮＡに活性エネルギー線照射処理し、処理ＤＮＡを得る工程と、２）得られた処理ＤＮＡに対し、ＰＣＲによる増幅範囲が１５００－２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程と、３）処理ＤＮＡとプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程と、４）定量ＰＣＲの結果を活性エネルギー線による殺菌力に変換する工程とを有することを特徴とする、活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法を提供するものである。
　本発明の活性測定方法を用いることで、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性が簡便に測定可能となる。
　また、本発明の活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法を用いることで、活性エネルギー線照射装置の実質的な殺菌力を簡便に測定することができる。
参考例１－５において、ＰＣＲによって求められた検量線を示す図である。
＜ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法＞
　本発明は、１）ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の保有する標的核酸を用意する工程と、２）標的核酸を鋳型としたＰＣＲによる増幅産物が１５００－２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程と、３）標的核酸とプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程と、４）定量ＰＣＲの結果をＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性能に変換する工程とを有することを特徴とする、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法を提供するものである。
　本方法により、定量ＰＣＲでＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性を測定することが出来る。ここでいう活性とは、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の増殖能力のことをいう。
１）ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の保有する標的核酸を用意する工程
＜ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物＞
　本発明の活性測定方法では、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の保有する標的核酸を定量ＰＣＲにて増幅させる。このとき、標的核酸はＤＮＡ（デオキシリボ核酸）である。
　ＤＮＡウイルスとしては、核酸としてＤＮＡを有するウイルスであれば良い。
病原性があるものも無いものも活性測定可能であるが、公衆衛生上の観点から病原性を有するウイルスの活性測定が培養せずとも可能であることは有用である。
　ＤＮＡウイルスとしては、たとえばラムダファージ、ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＪＣウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、パルボウイルス、ＥＢウイルス、Ｍ１３ファージ、Ｔ２ファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ５ファージ、Ｔ６ファージ、Ｔ７ファージ等が挙げられる。
　単細胞生物としては、原核単細胞生物でも真核単細胞生物でも構わない。１細胞で１活性を有するものであると、活性測定がより正確となる。
　単細胞生物としては、細菌、原虫、藻類、繊毛虫、鞭毛虫、胞子、等が挙げられる。好ましくは細菌、原虫である。
　病原性があるものも無いものも活性測定可能であるが、公衆衛生上の観点から病原性を有する単細胞生物の活性測定が、培養せずとも可能であることは有用である。
　細菌としては、例えば、大腸菌、レジオネラ菌、赤痢菌、コレラ菌、カンピロバクター、エルシニア菌、チフス菌、ジフテリア菌、連鎖球菌、炭疽菌、破傷風菌、ブルセラ属菌、緑膿菌、サルモネラ菌、ペスト菌、結核菌、腸炎ビブリオ、リステリア菌、ブドウ球菌、ボツリヌス菌、セレウス菌、ウェルシュ菌、ペスト菌、マイコプラズマ等が挙げられる。
　原虫としては例えば、クリプトスポリジウム、ジアルジア、アメーバ、マラリア、トキソプラズマ、サイクロスポラ、ミクロスポリディア、イソスポラ、ネグレリア、バウムチア、リーシュマニア、トリパノソーマ、トリコモナス、バベシア、ランブル鞭毛虫、バランチジウム、ゾウリムシ等が挙げられる。
＜標的核酸＞
　ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物が保有する標的核酸を、定量ＰＣＲするために用意する。具体的には、ウイルス殻や細胞壁といった外殻の一部または全部を破壊すればよい。標的核酸は抽出して単離しても良いし、外殻から開放された状態のまま使用しても構わない。
　外殻の破壊方法は公知慣用の方法を用いればよい。浸透圧法、酵素処理法、界面活性剤処理法、凍結融解法、超音波処理、磨砕処理等の方法を用いることが出来る。市販のＤＮＡ抽出キットを用いても構わない。
　標的核酸は、ゲノムＤＮＡであっても、プラスミドＤＮＡであっても、細胞小器官ＤＮＡであってもよい。１細胞１コピーである場合、活性測定がより正確である為、ゲノムＤＮＡであることが好ましい。
＜エンドヌクレアーゼ処理＞
　本発明は、１５００－２８００ｂｐという長い増幅範囲のＰＣＲを行うことで、ＤＮＡのエラーの有無を測定するものである。このとき、鋳型となる標的核酸はそのまま用いても良いが、エンドヌクレアーゼ処理をすることで、ＤＮＡが負ったエラーを明確化し、定量ＰＣＲの結果をより正確に測定できる為、併用することが好ましい。
　エンドヌクレアーゼとしては、例えば、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ＩＩＩ、Ｔｍａ　Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ＩＩＩ、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ＶＩＩＩ、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ＩＶ、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｖ、Ｔ４ＰＤＧ、Ｓ１　Ｎｕｃｌｅａｓｅを用いることが出来る。
２）標的核酸を鋳型としたＰＣＲによる増幅産物が１５００－２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程
　定量ＰＣＲを行う為のプライマーは、標的核酸を鋳型とするように設計する。このとき、ＰＣＲによる増幅産物が１５００－２８００ｂｐとなるように調整することが本発明の特徴である。増幅産物が１５００ｂｐ未満であると、ＤＮＡエラーがあり活性を有さないＤＮＡであっても、ＰＣＲで増幅してしまう可能性がある。２８００ｂｐより大きい場合、ＰＣＲ自体のエラーが多くなり増幅産物がうまく得られない場合がある。
　増幅産物としては、好ましくは１５００－２５００ｂｐであり、特に好ましくは１７００－２２００ｂｐである。
　定量ＰＣＲ用のプライマーは、フォワードとリバースのセットで設計する。このとき、標的核酸中で増幅エラーが起きないよう、配列特異性のあるプライマーとするのが好ましい。
３）標的核酸とプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程
　得られた標的核酸とプライマーとを用いて定量ＰＣＲを行う。定量ＰＣＲとしては、公知慣用の方法を用いればよく、アガロースゲル電気泳動法、インターカレーター法、蛍光プローブ法等が挙げられる。正確性から、標的範囲にアニールするプローブを併用する蛍光プローブ法が好ましい。インターカレーター法や蛍光プローブ法であれば、リアルタイム定量ＰＣＲを行うことが出来るので、スピーディーな測定が可能であることから好ましい。
　得られた増幅産物量は、標準品からの検量線で求めることが出来る。標準品は、配列が相同するＤＮＡ断片であっても良いし、異なる配列であっても構わない。増幅産物とほぼ同じ長さの標準品について、濃度を振ったサンプルの蛍光濃度を測定することで、検量線を描くことができる。
　ＰＣＲの条件としては、公知慣用の方法を用いればよい。例えばＤＮＡウイルスの標的核酸を増幅する場合の一例として、Ｈｏｌｄｉｎｇ　Ｓｔａｇｅは９５℃　ｘ　３ｍｉｎ、Ｃｙｃｌｉｎｇ　Ｓｔａｇｅは９５℃　ｘ　３ｓｅｃ、６５－６６℃　ｘ　９０ｓｅｃを４０サイクルという条件が挙げられる。
４）定量ＰＣＲの結果をＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性能に変換する工程
　本方法に依ると、定量ＰＣＲの結果はＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性能として扱うことが出来る。
　具体的には、定量ＰＣＲの結果を以下の式で活性能とすることが出来る。
 
サンプル１ｍｌ当たりの活性能（Ｕ／ｍｌ）＝（サンプル中のＤＮＡコピー数）／（サンプルｍｌ数）
 
　サンプル中のＤＮＡコピー数は、増幅範囲とほぼ同等のｂｐ数を有する標準品を鋳型として定量ＰＣＲを行い、検量線を作製し参照することで求めることが出来る。
　本発明の活性測定方法は、定量ＰＣＲの結果をそのままＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性能に変換することが出来る。これは、１５００－２８００ｂｐという特定の長さを有する増幅範囲のＰＣＲを行うことで、損傷のないＤＮＡを正確に測定できるからである。
　本方法での活性測定が正確であることは、定量ＰＣＲから得られるＤＮＡコピー数と、培養法等のバイオアッセイで得られる生菌数とが相関することで証明が出来る。
　例えば、紫外線（ＵＶ）照射前後での活性低下を、定量ＰＣＲと培養法で比較すればよい。
＜活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法＞
　本発明は、１）活性エネルギー線照射装置を用いて、ＤＮＡに活性エネルギー線照射処理し、処理ＤＮＡを得る工程と、２）得られた処理ＤＮＡに対し、ＰＣＲによる増幅範囲が１５００－２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程と、３）処理ＤＮＡとプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程と、４）定量ＰＣＲの結果を活性エネルギー線による殺菌力に変換する工程とを有することを特徴とする、活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法も提供するものである。
　本方法により、活性エネルギー線照射装置の殺菌力を測定することが出来る。ここでいう殺菌力とは、活性エネルギー線照射によりＤＮＡに損傷を与える能力のことを言う。
１）活性エネルギー線照射装置を用いて、ＤＮＡに活性エネルギー線照射処理し、処理ＤＮＡを得る工程
　本工程では、殺菌力を測定したい活性エネルギー線照射装置を用いて、ＤＮＡに活性エネルギー線を照射し、処理ＤＮＡを得る。
　活性エネルギー線としては、ＤＮＡに損傷を与えるエネルギー線であれば良く、放射線（エックス線、ガンマ線、電子線等）、紫外線、赤外線等が挙げられる。産業上良く使用されているのは紫外線である。
　本測定方法では、ＤＮＡを用意し活性エネルギー線を照射した処理ＤＮＡを得る。
　ＤＮＡとしては特に限定は無く、生物やウイルスから抽出して得られるＤＮＡを用いてもよいし、ＰＣＲ増幅産物を用いてもよいし、合成ＤＮＡを用いてもよい。環境への影響から、好ましくは、病原性のないＤＮＡ断片である。
　処理前ＤＮＡのｂｐ数としては、その後のＰＣＲの増幅範囲以上であれば良いが、電気泳動を行う場合には、鋳型と増幅産物のコンタミネーションが起きないよう、ＤＮＡ増幅範囲よりも１．５倍程度以上鎖長が長いほうが好ましい。
　ＤＮＡに対し活性エネルギー線照射処理を行うのにあたって、特に方法に限定は無い。開放シャーレ等を用いるオープン環境で活性エネルギー線を照射するか、活性エネルギー線を透過できる材質の容器やライン中にＤＮＡを入れ、活性エネルギー線を照射すればよい。例えばシャーレ、マイクロチューブ、試験管、バッグ等の容器に入っているＤＮＡに活性エネルギー線を照射しても良いし、管にＤＮＡ液を通液したラインに対し活性エネルギー線を照射しても構わない。
　活性エネルギー線を照射する場合、線量と照射時間については適宜調整すればよい。
２）得られた処理ＤＮＡに対し、ＰＣＲによる増幅範囲が１５００－２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程
３）処理ＤＮＡとプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程
　本２）３）の工程については、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法の２）３）工程と同様に行うことができる。
４）定量ＰＣＲの結果を活性エネルギー線による殺菌力に変換する工程
　本工程では、定量ＰＣＲで得られた結果を元に、活性エネルギー線による殺菌力を計算する。
　定量ＰＣＲの結果から、照射により傷がついていないＤＮＡ数を導き出すことができる。殺菌力を示したい場合、活性エネルギー線照射前後でコピー数の比を表すことで、殺菌力とすることができる。
 
　殺菌力（％）＝［１－（活性エネルギー線照射後のＤＮＡコピー数　／　活性エネルギー線照射前のＤＮＡコピー数）］＊１００
　本発明の殺菌力測定方法は、定量ＰＣＲの結果をそのまま活性エネルギー線照射装置の殺菌能に変換することが出来る。これは、１５００－２８００ｂｐという特定の長さを有する増幅範囲のＰＣＲを行うことで、損傷のないＤＮＡ、すなわち殺菌できなかったＤＮＡを正確に測定できるからである。
　本方法での活性測定が正確であることは、処理前ＤＮＡとして生菌を用いた上で本法を行い、定量ＰＣＲから得られるＤＮＡコピー数と、培養法等のバイオアッセイで得られる生菌数とが相関することで証明が出来る。
　例えば、紫外線（ＵＶ）照射前後での活性低下を、定量ＰＣＲと培養法で比較すればよい。
＜定量ＰＣＲ＞
　前記活性測定方法およびまたは殺菌力測定方法において、このように正確な結果を得る為には、定量ＰＣＲの増幅範囲が１５００－２８００ｂｐである必要がある。ＰＣＲの増幅範囲が１５００ｂｐより小さい場合、本方法での残活性能がバイオアッセイの結果よりも高くなるため使用できず、２８００ｂｐより大きい場合は、本方法での残活性能がバイオアッセイの結果よりも低くなるため使用できないからである。
　増幅産物としては、好ましくは１５００－２５００ｂｐであり、特に好ましくは１７００－２２００ｂｐである。
　このように、本発明の測定方法は、定量ＰＣＲを用いることで簡単かつスピーディーにＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性を測定することが出来る。本方法を利用することで、水や土壌、食品や生体由来物質等から、目的のＤＮＡウイルスまたは単細胞生物量を簡便に測定することが出来るため、産業上非常に有用である。
　また、本発明の殺菌力測定方法は、定量ＰＣＲを用いることで簡単かつスピーディに活性エネルギー線照射装置の殺菌力を測定することができる。
　特に、顕微鏡等を用いた形態観察では活性が判別できない、活性エネルギー線照射後の残活性量を測定することに適している。
　以下、本発明を実施例にて詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
＜定量ＰＣＲ条件＞
　定量ＰＣＲについては以下の条件にて行った。
・ＰＣＲ装置　Ｓｔｅｐ　Ｏｎｅ　Ｐｌｕｓ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズジャパン製）
・ＰＣＲキット　ＴａｑＭａｎ　Ｆａｓｔ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズジャパン製）
・ＰＣＲ条件
　Ｈｏｌｄｉｎｇ　Ｓｔａｇｅ　９５℃　ｘ　３ｍｉｎ
　Ｃｙｃｌｉｎｇ　Ｓｔａｇｅ（４０サイクル）　
　（１００ｂｐ）　９５℃ｘ３ｓｅｃ、６０℃ｘ２０ｓｅｃ
　（２０００ｂｐ）　９５℃ｘ３ｓｅｃ、６５℃ｘ９０ｓｅｃ
　（＞２０００ｂｐ）　９５℃ｘ３ｓｅｃ、６５℃ｘ１２０ｓｅｃ
＜紫外線照射条件＞
・紫外線光源　：　ＬＥＤ（３０－５０ｍＷ；　ＵＶＭＡＸ２６０－ＦＷ－５０，　Ｓｅｎｓｏｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．）
・ウイルスサンプル　：　１ｘ１０１０ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ（ＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０）
＜ＤＮＡ抽出及び酵素処理＞
・ＤＮＡ抽出キット　：　ＱＩＡＧＥＮ　ＭｉｎＥｌｕｔｅ　Ｖｉｒｕｓ　Ｓｐｉｎキット（株式会社キアゲン製）
・酵素　：　エンドヌクレアーゼ　Ｔ４ＰＤＧ（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ　Ｉｎｃ．　Ｎｏ．Ｍ０３０８Ｓ）
・酵素処理条件　：　Ｔ４ＰＤＧの力価が４０Ｕ／１ｇ　ＤＮＡとなるように、１０×Ｔ４ＰＤＧ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ、ＢＳＡ（最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ　ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒで調製した。酵素反応は３７℃で２時間行った。
＜培養法（プラークアッセイ）＞
　プラークアッセイ（スポットアッセイ）は次のようにして行った。約９ｍＬのソフトアガーを大腸菌培養液３００μＬと混合し、平板上に注ぎ、乾燥させた。次に試料であるファージ懸濁液各１μＬを平板上にスポットし、３７℃で一晩インキュベートしてスポットを観察した。ファージに感染性があれば、スポットの周りにプラークが観察される。
＜ＤＮＡウイルスの活性測定方法＞
（参考例１～５）　定量ＰＣＲ用の検量線作成及びＰＣＲ正確性の確認
　鋳型としてラムダファージを用いて、定量ＰＣＲの検量線を作成した。
　用いたプライマーは以下のとおりである。
・ウイルス　：　ラムダファージ（Ｇｅｌｍａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，　Ｎｏ．４４９９）
・ＰＣＲプライマー
増幅範囲：１００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＴ（配列番号２）
蛍光Ｐｒｏｂｅ　ＦＡＭ－ＡＣＴＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＣＴ－ＭＧＢ（配列番号３）
増幅範囲：２０００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号４）
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＴ（配列番号５）
蛍光Ｐｒｏｂｅ　ＦＡＭ－ＣＣＧＴＣＴＡＣＧＧＡＡＡＧＣ－ＭＧＢ（配列番号６）
増幅範囲：２５００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＣＡＴＡＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＣＡＡＴＧＧ（配列番号８）
蛍光Ｐｒｏｂｅ　ＦＡＭ－ＡＴＣＴＧＡＣＣＧＡＡＧＣＧＣＡ－ＭＧＢ（配列番号９）
増幅範囲：３０００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号１０）
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＧＡＧＣＣＴＡＴＣＣＡＧＴＣＧＣＡＧＴＴＣ（配列番号１１）
蛍光Ｐｒｏｂｅ　ＦＡＭ－ＡＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＴＧＣＣＧ－ＭＧＢ（配列番号１２）
増幅範囲：３５００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号１３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡＴ（配列番号１４）
蛍光Ｐｒｏｂｅ　ＦＡＭ－ＡＡＴＡＴＧＣＣＧＧＴＴＡＴＣＡＣＧ－ＭＧＢ（配列番号１５）
　各プライマー、プローブで得られたＤＮＡ濃度とＴｈｒｅｓｈｏｌｄ　Ｃｙｃｌｅ（ＣＴ）との関係、すなわち検量線を図１に示す。ＣＴ＝３０の場合のＤＮＡ数を検量線から求めると、表１の通りとなった。増幅範囲が１００ｂｐのときを１とすると、２５００ｂｐでは３．３であるのに対し、３０００ｂｐでは１３．３、３５００ｂｐでは１１．３と１０倍以上の値となった。これは、増幅範囲が２５００ｂｐ以下では検出するためのＤＮＡ量が３倍以内であるのに対し、増幅範囲が３０００ｂｐを超えると、検出するためのＤＮＡが１００ｂｐの１０倍以上必要であることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
活性能測定および培養法との比較
（参考例６・実施例１～４・比較例１及び２）　ラムダファージ
　ＤＮＡ源として、ラムダファージ（Ｇｅｌｍａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，　Ｎｏ．４４９９）を使用して、紫外線を照射し（４０ｍＪ／ｃｍ２）、紫外線照射ファージを得た。
　得られた紫外線照射ファージから処理ＤＮＡ抽出し、当該処理ＤＮＡを鋳型として用いて、定量ＰＣＲをインターカレート法にて行い、活性測定を行った。また、処理ＤＮＡに対し、さらに前述の方法にて、エンドヌクレアーゼによる酵素処理を行ったサンプルを調製した。
　また、培養法（プラークアッセイ）での活性測定を行い、本発明の活性測定方法と比較した。
・ウイルス　：　ラムダファージ（Ｇｅｌｍａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，　Ｎｏ．４４９９）
・紫外線照射量　：　４０ｍＪ／ｃｍ２
　用いたプライマーは以下のとおりである。
増幅範囲：１００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号１６）
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＴ（配列番号１７）
増幅範囲：１６００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号１８）
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＣＧＴＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＴＣＧＴＣ（配列番号１９）
増幅範囲：２０００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号２０）
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＡＧＣＴＴＧＧＧＣＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧ（配列番号２１）
増幅範囲：２５００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号２２）
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＣＡＴＡＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＣＡＡＴＧＧ（配列番号２３）
　プラークアッセイ（スポットアッセイ）は次のようにして行った。約９ｍＬのソフトアガーを大腸菌培養液３００μＬと混合し、平板上に注ぎ、乾燥させた。次に試料であるファージ懸濁液の希釈系列を調製し、各１μＬを平板上にスポットし、３７℃で一晩インキュベートしてスポットを観察した。ファージに感染性があれば、スポットの周りにプラークが観察される。
　ラムダファージにおける定量ＰＣＲ及びプラークアッセイの結果を以下表２－１に示す。
　紫外線（ＵＶ）照射後の残活性能については、以下の式で求めた。
 
　　ｑＰＣＲによる残活性能［％］　＝　ＵＶ照射後のＤＮＡコピー数　／　ＵＶ照射前のＤＮＡコピー数＊１００
　　プラーク法による残活性能［％］　＝　ＵＶ照射後のＤＮＡプラーク数　／　ＵＶ照射前のＤＮＡプラーク数＊１００
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　増幅範囲が１００ｂｐの場合は、酵素処理してもプラークアッセイ／ｑＰＣＲ比は変化しないが、増幅範囲を長くした１６００ｂｐではｑＰＣＲのみよりも酵素処理を組合せた方がプラークアッセイ／ｑＰＣＲ比は１に近くなることがわかった。
（参考例７および８・実施例５および６）　Ｔ５およびＭ１３
　参考例６および実施例４において、ラムダファージに代えて、Ｔ５ファージ（Ｇｅｌｍａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，　Ｎｏ．１６３５３）およびＭ１３ファージ（Ｔａｋａｒａ　３１１８）でも同様の試験を行い、結果を表２－２に示す。なお、紫外線照射量は１０ｍＪ／ｃｍ２とした。定量ＰＣＲでの増幅範囲は２０００ｂｐのみとした。使用したプライマーを以下に示す。
Ｔ５ファージ用プライマー
増幅範囲：２０００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＴＡＡＣＴＧＣＣＣＡＡＡＡＴＧＣＴＴＣＣ（配列番号２４）
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡＴＣＣＡＴＣＧ（配列番号２５）
Ｍ１３ファージ用プライマー
増幅範囲：２０００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＧＣＧＴＴＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＴＡＡ（配列番号２６）
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡ（配列番号２７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（参考例９－１２）　遺伝子損傷と測定の正確性の確認
・ｐＢＲ３２２　ＤＮＡの酵素処理（分解）
　ｐＢＲ３２２　ＤＮＡ（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ）を５μｇ、制限酵素Ｈｉｎｆ　I（タカラバイオ製）５０　ｕｎｉｔｓ、制限酵素に添付されている１０　ｘ　Ｈ　Ｂｕｆｆｅｒを１０μＬ測りとり、水で全量が１００μＬとなるよう調製し、３７℃で３時間インキュベートした。
・酵素処理後のｐＢＲ３２２　ＤＮＡの精製
　インキュベート後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ　８．０）で反応液中のＤＮＡ量を２　ｘ　１０９　ｃｏｐｉｅｓ／μＬに調整し、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）と磁気プレートを用い、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ　ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰに添付の取扱い説明書記載の方法に準じて、ＤＮＡの精製を行った。
（定量ＰＣＲによる測定）
　制限酵素で処理したｐＢＲ３２２　ＤＮＡと、制限酵素で処理していないｐＢＲ３２２　ＤＮＡを任意の割合で混合して、定量ＰＣＲを行った。
　この時、増幅範囲には、制限酵素Ｈｉｎｆ　I の認識部位が含まれていることから、制限酵素で処理したｐＢＲ３２２のＤＮＡを鋳型とする場合には、理論上定量ＰＣＲでは検出されない。よって、定量ＰＣＲが正確に行われるのであれば、制限酵素で処理したＤＮＡと処理しないＤＮＡをある一定の濃度で混合した場合、定量ＰＣＲの結果は、理論上の混合比と同等となるはずである。
　ただし、定量ＰＣＲの増幅部位が長すぎる、あるいは短すぎる場合には、定量ＰＣＲの検出精度が悪くなることから、理論値とのずれが生じてしまう。
　酵素処理ＤＮＡと未処理ＤＮＡの混合割合と定量ＰＣＲによる測定値、および理論値を表３に示す。
増幅範囲：２５００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＧＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＣＣＡＣＴＡＴＣＧＡＣＴＡ（配列番号２８）
Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　　ＣＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＧ（配列番号２９）
蛍光Ｐｒｏｂｅ　　ＦＡＭ－ＴＣＣＴＧＴＣＧＴＴＧＡＧＧＡＣＣ－ＭＧＢ（配列番号３０）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３から明らかなとおり、本発明の測定方法を用いると、定量ＰＣＲの結果は、制限酵素で処理したＤＮＡと処理しないＤＮＡの理論上の混合比と同等となり、定量ＰＣＲの結果が正確であることが確かめられた。
　本発明の活性測定方法や殺菌力測定方法は、ウイルスや単細胞生物の培養を待たずとも、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性や活性エネルギー線照射装置の殺菌力を測定することが可能である。

Claims (4)

  1. １）ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の保有する標的核酸を用意する工程と、
    ２）標的核酸を鋳型としたＰＣＲによる増幅産物が１５００－２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程と、
    ３）標的核酸とプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程と、
    ４）定量ＰＣＲの結果をＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性能に変換する工程とを有することを特徴とする、
    ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法。
  2. 　さらに、標的核酸をエンドヌクレアーゼ処理する工程を有する、請求項１に記載のＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法。
  3. １）活性エネルギー線照射装置を用いて、ＤＮＡに活性エネルギー線照射処理し、処理ＤＮＡを得る工程と、
    ２）得られた処理ＤＮＡに対し、ＰＣＲによる増幅範囲が１５００－２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程と、
    ３）処理ＤＮＡとプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程と、
    ４）定量ＰＣＲの結果を活性エネルギー線による殺菌力に変換する工程とを有することを特徴とする、
    活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法。
  4. 　さらに、活性エネルギー線照射処理後に得られた処理ＤＮＡをエンドヌクレアーゼ処理する工程を有する、請求項３に記載の活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法。
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