WO2019039574A1 - 遺伝性腎疾患アルポート症候群治療薬に係る新規治療薬 - Google Patents

遺伝性腎疾患アルポート症候群治療薬に係る新規治療薬 Download PDF

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剛 首藤
紘平 大町
アン スイコ マリー
将大 加世田
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    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic drug for Alport syndrome which is a hereditary kidney disease.
  • AS Alport syndrome
  • Patent Document 1 Angiotensin, and aldosterone inhibition as a mechanism.
  • these drugs are only symptomatic treatments and there is no curative treatment of AS. Under these circumstances, many patients with AS are ultimately forced to transition to end-stage renal failure.
  • metformin is an oral diabetes therapeutic drug that was born internationally in 1959, and also in Japan, metformin hydrochloride is sold by many pharmaceutical manufacturers as an active ingredient. Metformin exerts therapeutic effects on diabetes such as suppression of blood sugar level elevation through suppression of gluconeogenesis in the liver, suppression of glycogenolysis in hepatocytes by glucogan and improvement of insulin resistance. The therapeutic effect of metformin in AS is unclear.
  • the inventors have initiated studies on elucidation of the pathogenesis mechanism of AS for which there is still no specific treatment and development of a new treatment method more effective than existing symptomatic treatment. is there.
  • the present invention addresses the development of a novel therapeutic method for AS.
  • AS model mice As a result of earnest studies, the inventors have revealed that multiple molecules have abnormal expression in the kidney glomeruli of AS model mice. In addition, when these molecules were analyzed, the inventors found that multiple intracellular metabolic pathways were excessively promoted. From these, the inventors conceived that AS can treat AS by improving intracellular metabolism in renal glomerulus, and when using metformin as one of intracellular metabolism improving agents, AS model mouse Experimentally confirm that the therapeutic effect can be seen, and completed the invention.
  • the present invention has the following configuration.
  • the first constitution of the present invention is a drug for treating Alport syndrome characterized by treating Alport syndrome by regulating the metabolism of kidney glomeruli.
  • a second configuration of the present invention is the drug for treatment of Alport syndrome according to the first configuration, wherein metabolic regulation of kidney glomeruli is made with a biguanide compound or a salt thereof as an active ingredient.
  • a third configuration of the present invention is the drug for treating Alport syndrome according to the second configuration, wherein the biguanide compound is metformin or a salt thereof.
  • a fourth aspect of the present invention is the drug for treatment of Alport syndrome according to the third aspect, wherein metformin or a salt thereof is metformin hydrochloride.
  • the present invention makes it possible to provide a novel therapeutic method in AS. That is, in AS, it becomes clear that therapeutic effects can be brought about by adjusting metabolic abnormalities in renal glomerulus, and it is clarified that a biguanide compound or a salt thereof may be used as such a therapeutic agent. became.
  • the drug for treating Alport syndrome of the present invention (hereinafter, abbreviated as “the drug for AS treatment”) will be described.
  • the AS therapeutic agent in the present invention is characterized in that metabolic regulation in renal glomerulus is performed.
  • metabolic regulation is broadly defined as adjusting the metabolism in the kidney glomerulus, and narrowly, it is defined as the metabolic abnormality in the kidney glomerulus (Comlex I bigenesis, It is defined as suppressing excessive promotion of Respiratory electron transport, Respiratory electron transport, ATP synthesis by chemiosmotic, The citric acid (TCA) cycle and respiratory transport.
  • the metabolic regulation in renal glomerulus is made with a biguanide compound or a salt thereof as an active ingredient.
  • metformin is a compound found by the present inventors as a compound that exerts a therapeutic effect on metabolic regulation in the kidney and AS. From this, it is expected that the biguanide compounds such as metformin have the same pharmacological mechanism as metformin, and thus exert therapeutic effect in AS by performing metabolic regulation in the kidney glomerulus.
  • biguanide compounds for example, metformin (1,1-Dimethylbiguanide), buformin (1-Butylbiguanide) or salts thereof are preferably used.
  • metformin or a salt thereof is used as the biguanide compound, and it is more preferable to use metformin hydrochloride as such a compound. That is, metformin has long been used as a drug for treating diabetes, and is a compound for which sufficient knowledge on drug performance such as its pharmacokinetics and safety has been accumulated. From this, by using metformin hydrochloride and the like, metformin or a salt thereof in metabolic regulation in renal glomeruli, it has the effect of being able to accelerate development as a pharmaceutical.
  • the active ingredient compound when various compounds or salts thereof (hereinafter collectively referred to as “active ingredient compound”) are used as the active ingredient, the active ingredient compound may be used as the active ingredient in the form of retaining its chemical structure.
  • the active ingredient compound may be included in DDS.
  • AS treatment does not naturally mean the cure of AS, but is defined as a concept including the improvement of the symptoms, the suppression of progression, and the prevention.
  • administration to AS patients can be used to treat urinary protein reduction, suppress symptoms of AS such as renal tissue fibrosis, and the like as treatments for AS.
  • ⁇ Protein urine score> The proteinuria score was calculated as the ratio of total urine protein concentration / urine creatinine concentration. Urinary total protein concentration was measured using the Bradford method. Urinary creatinine levels were measured according to a protocol using a creatinine measurement kit.
  • the mouse kidney freezing block was divided into halves after fresh dissected mouse kidney, immersed in OCT compound (Sakura Finetech) in cryomold and rapidly frozen by liquid nitrogen.
  • the kidney freezing block was sliced to 4 ⁇ m with a cryostat and used as a frozen section.
  • ⁇ Immunofluorescent staining (Nephrin)> Renal frozen sections were immediately immersed in an ice cold acetone solution at ⁇ 20 ° C. for 5 minutes, washed with PBS and fixed by further incubation at 4 ° C. for 10 minutes in 4% paraformaldehyde. Then, it was blocked for 1 hour at room temperature with 3% BSA / PBS in a wet box. After washing with PBS, each primary antibody diluted 1:50 with 3% BSA / PBS was reacted at room temperature for 1 hour. After washing with PBS, the fluorescently labeled secondary antibody (Alexa fluor antibody) diluted 1: 500 with PBS was reacted at room temperature for 45 minutes. After that, nuclear staining was performed with DAPI solution, enclosed with Vector shield, and photographed and analyzed with Biorevo (Keyence).
  • RNA recovery from mouse> The mouse tissues were immersed in RNA later to maintain RNA stability, rotated at 4 ° C. for 12 hours, removed from RNA later, and stored at ⁇ 80 ° C. The tissue was thawed, washed with cold PBS (-), and placed in a 1.5 mL tube. Thereafter, 1 mL of RNA iso Plus was added, the organ was minced with an eyebrow, and homogenized with a homogenizer. The mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes, 0.2 mL of chloroform was added, and the mixture was stirred well. Thereafter, RNA was recovered as in the cultured cells. After RNA recovery, RNA concentration was measured, DNase was treated according to the protocol, and only RNA was purified by phenol / chloroform method and ethanol precipitation method. The RNA pellet was dissolved in DEPC-treated water and used for subsequent experiments.
  • Real-time RT-PCR (iQ5 real-time PCR analysis system) was performed to examine the expression level of each gene in mouse tissues.
  • Prime Script RT reagent kit was used for RT reaction, and SYBR Premix Ex Taq II was used for PCR reaction. Briefly, using the Oligo dT primer as a template, 0.25 g of total RNA extracted from cultured cells and mouse tissues was subjected to reverse transcription (37 ° C. for 30 minutes, 85 ° C. for 10 seconds).
  • PCR reaction is performed using 5'-primer and 3'-primer for amplification of each gene mRNA (1 cycle at 94 ° C for 2 minutes, 30 cycles for 94 ° C for 30 seconds and 60 seconds for 30 seconds, 5 cycles for 72 ° C) Did.
  • PCR reaction of 18S rRNA was simultaneously performed as internal control.
  • the quantification of the target PCR product was performed by the comparative CT method (CT method).
  • Protein extraction from mouse tissue The mouse tissues were excised, placed in liquid nitrogen and snap frozen, and stored at -80 ° C. After thawing, 1 mL of cold PBS (-) was added to the tissue, minced with an ophthalmic scissors, and homogenized with a homogenizer. Thereafter, the supernatant was removed by centrifugation (12,000 rpm, 4 ° C., 5 minutes), and 400 ⁇ L of RIPA buffer was added and homogenized. The mixture was allowed to stand on ice for 2 hours and centrifuged (15,000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) to recover the supernatant as a protein solution. Protein concentration was quantified by BCA method.
  • the PVDF membrane was washed three times with 0.1% Tween 20-TBS (-) or 0.05% Tween 20-PBS (-), and the primary antibody reaction (room temperature) was performed. After the primary antibody reaction, the cells were washed three times with 0.1% Tween 20-TBS (-) or 0.05% Tween 20-PBS (-), and a secondary antibody reaction (room temperature) was performed.
  • the metformin administration group showed a significantly lower value compared with the control, and the value was similar to the losartan administration group. 3. Furthermore, as a result of calculating a positive area
  • the results for inflammatory cytokines are shown in FIG. (1)
  • the level of IL-6 was significantly lower in the metformin-administered group compared to the control and lower than the losartan-administered group.
  • the value of IL-1 ⁇ in the metformin-administered group was significantly lower than that in the control, and was lower than that in the losartan-administered group.
  • KC IL-8
  • the metformin-administered group was significantly lower than the control, and was equivalent to the losartan-administered group.
  • the results for fiberization related molecules are shown in FIG. (1)
  • the Mmp12 group in the metformin group was significantly lower than the control, and was equivalent to the losartan group.
  • Mmp9 was significantly lower in the metformin-administered group compared to the control, and lower than the losartan-administered group.
  • the metformin-administered group showed a significantly lower value compared with the control, and the same value as the losartan-administered group.
  • ⁇ -Sma the metformin group showed significantly lower values than the control, and the lower value than the losartan group.
  • metformin suppresses the expression of various inflammation / fibrosis related genes that fluctuate in AS. 4.
  • the inhibitory effect of metformin was considered to be equivalent to losartan, and depending on the parameters, it was found to be more effective than losartan.
  • the number of podocytes per glomerulus was calculated based on WT1 staining, and it was a large value in the metformin administration group compared to the control, and was a value equivalent to the losartan administration group. 3. Furthermore, when the number of cell proliferation per glomerulus was calculated based on PCNA staining, in the metformin administration group, it was a small value compared with the control, and was a value equivalent to the losartan administration group.

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Abstract

【課題】未だ特異的治療法の存在しないASの病態形成機構の解明と，既存の対症療法よりもさらに効果的な新規治療方法の開発。 【解決手段】腎糸球体の代謝調整を行うことにより，アルポート症候群の治療を行うことを特徴とするアルポート症候群治療薬。特に，これら腎糸球体の代謝調整を行う有効成分として，ビグアナイド系化合物もしくはその塩を用いることができ，さらに好ましくはメトホルミンないしその塩，最も好ましくはメトホルミン塩酸塩を用いることができる。

Description

遺伝性腎疾患アルポート症候群治療薬に係る新規治療薬
　本発明は，遺伝性腎疾患であるアルポート症候群の治療薬に関する。
　アルポート症候群（AS）は，腎糸球体基底膜を構成するIV型コラーゲン遺伝子の変異によって生じる遺伝性の腎疾患であり，代表的な小児腎疾患である（特許文献１）。
　ASは腎不全進行を予防する目的で，レニン・アンジオテンシン・アルドステロン阻害をメカニズムとする治療薬が用いられている。しかしながら，これらの治療薬は対症療法に過ぎず，ASの根治的な治療はない。このような事情もあって，AS患者の多くは，最終的に末期腎不全への移行を余儀なくされているのが現状である。
　現在，AS患者は，日本には1200人ほど存在すると推計されている。また，欧米では，5千人から１万人に1人の割合で発症すると言われており，AS患者・患者家族を支援し，治療研究の助成を行うためのAlport Syndrome Foundationも存在している。
　一方，メトホルミンは，1959年に国際誕生した経口糖尿病治療薬であり，日本においても，メトホルミン塩酸塩を有効成分として，多くの製薬メーカーから販売されている。メトホルミンは，肝臓での糖新生の抑制，グルコガンによる肝細胞でのグリコーゲン分解抑制・インスリン抵抗性の改善を通じて，血糖値の上昇抑制等の糖尿病治療効果を発揮する。ASにおけるメトホルミンの治療効果については，明らかとなっていない。
国際公開第２０１４／０５８８８１号パンフレット
　このような状況から発明者らは，未だ特異的治療法の存在しないASの病態形成機構の解明と，既存の対症療法よりもさらに効果的な新規治療方法の開発について，研究を開始したものである。
　上記事情を背景として本発明では，ASについて新規な治療方法の開発を課題とする。
　発明者らは，鋭意研究の結果，ASモデルマウスの腎糸球体において，複数の分子が発現異常を起こしていることを明らかにした。加えて，これら分子について解析を行ったところ，複数の細胞内代謝経路が過剰に促進されていることを発明者らは見出したものである。
　これらより発明者らは，ASにおいて，腎糸球体における細胞内代謝を改善させることでASの治療が行えることに想到し，細胞内代謝改善薬の一つとしてメトホルミンを用いたところ，ASモデルマウスにおいて治療効果がみられることを実験的に確認し，発明を完成させたものである。
　本発明は，以下の構成からなる。
　本発明の第一の構成は，腎糸球体の代謝調整を行うことにより，アルポート症候群の治療を行うことを特徴とするアルポート症候群治療薬である。
　本発明の第二の構成は，腎糸球体の代謝調整が，ビグアナイド系化合物もしくはその塩を有効成分としてなされることを特徴とする第一の構成に記載のアルポート症候群治療薬である。
　本発明の第三の構成は，ビグアナイド系化合物が，メトホルミンないしその塩であることを特徴とする第二の構成に記載のアルポート症候群治療薬である。
　本発明の第四の構成は，メトホルミンないしその塩が，メトホルミン塩酸塩であることを特徴とする第三の構成に記載のアルポート症候群治療薬である。
　本発明により，ASにおいて新規治療方法の提供が可能となった。すなわち，ASでは，腎糸球体における代謝異常を調整することにより，治療効果がもたらされることが明らかとなるとともに，そのような治療薬として，ビグアナイド系化合物もしくはその塩を用いればよいことが明らかとなった。
ASモデルマウスの腎糸球体におけるプロテオミクス解析の結果を示したグラフ。 実験方法の概容を説明した図。 ASモデルマウスにおいて，メトホルミンが，腎機能に与える影響を調べた結果を示した図。 ASモデルマウスにおいて，メトホルミンが，腎組織障害に与える影響を調べた結果を示した図。 ASモデルマウスにおいて，メトホルミンが，各種炎症関連因子に与える影響を調べた結果を示した図。 ASモデルマウスにおいて，メトホルミンが，各種繊維化関連因子に与える影響を調べた結果を示した図。 ASモデルマウスにおいて，メトホルミンが，AS腎糸球体障害に与える影響を調べた結果を示した図。
　ここでは，本発明のアルポート症候群治療薬（以下，「AS治療薬」と略する）について，説明を行う。
　本発明におけるAS治療薬は，腎糸球体における代謝調整を行うことを特徴とする。
　本発明において「代謝調整を行う」とは，広義には，腎糸球体における代謝を整えることとして定義され，狭義には，本発明で明らかとなった腎糸球体における代謝異常（Comlex I bigenesis，Respiratory electron transport，Respiratory electron transport, ATP synthesis by chemiosmotic，The citric acid（TCA） cycle and respiratory elctron transport）の過剰な促進を抑制することとして定義される。
　本発明において腎糸球体における代謝調整は，ビグアナイド系化合物もしくはその塩を有効成分としてなされることが好ましい。すなわち，メトホルミンは，腎における代謝調整ならびにASにおいて治療効果を発揮する化合物として発明者らにより見出された化合物である。これより，メトホルミンをはじめとするビグアナイド系化合物は，メトホルミンと同様の薬理機序を有することから，腎糸球体において代謝調整を行うことにより，ASにおける治療効果を発揮することが期待できる。
　このようなビグアナイド系化合物として，例えば，メトホルミン（1,1-Dimethylbiguanide），ブホルミン（1-Butylbiguanide）もしくはこれらの塩を用いることが好ましい。
　ビグアナイド系化合物として，メトホルミンないしその塩を用いることが好ましく，このような化合物として，メトホルミン塩酸塩を用いることがさらに好ましい。
　すなわち，メトホルミンは，古くから糖尿病治療薬として用いられており，その体内動態や安全性など医薬品性能に関する知見が十分に蓄積している化合物である。これより，メトホルミン塩酸塩をはじめとするメトホルミンないしその塩を，腎糸球体における代謝調整に用いることにより，医薬品としての開発を加速することができる効果を有する。
　なお，本発明において，各種化合物ないしその塩（以下，これらを合わせて「有効成分化合物」という）を有効成分として用いる場合，有効成分化合物についてそのままの化学構造を保持した形で有効成分としてもよいし，本発明の趣旨に鑑み，生体内における代謝等を受けて化合物の構造を変化させ有効成分化合物として作用する，もしくは，血中半減期を長くするための化学的修飾を行うなどの，いわゆるDDS化された有効成分化合物を含むものとしてもよい。
　本発明の薬剤の剤形について，特に限定する必要はなく，種々の剤形を用いることができる。典型的には，経口用錠剤が挙げられるが，これに限定する必要はなく，カプセル剤，散剤，経皮吸収型製剤，注射剤など種々の形態を採用することができる。
　本発明において，「AS治療」とは，ASの根治を当然に意味するものではなく，その症状の改善や進行の抑制，予防を行うことを含む概念として定義される。
　典型的には，AS患者に投与を行うことにより，尿たんぱくの減少や，腎組織繊維化等のASに生じる症状を抑制することなどがASの治療として挙げられる。
　以下，実験例を示して，本発明について詳述する。
＜＜実験方法概略＞＞
＜マウス＞
　各実験例で用いたX連鎖型Alport症候群モデルマウス（Col4a5 tm1Yseg G5X mutant）は，ジャクソンラボラトリーから購入した。検討には購入したAlport症候群マウスを繁殖させた仔マウスを用いた。また，同週齢のC57BL/6 マウス（日本チャールズリバーより購入）をWTマウスのコントロールとした。
　これらのマウスを，図２の実験概容の条件にて用いた。
＜薬物投与＞
　Losartan，Metformin，ともに自由飲水による投与を行った。
＜採尿＞
　尿について，マウスが餌や水が自由に摂取・行動できる代謝ケージを用い，24時間で蓄積された尿を撹拌し回収した。回収された尿は，夾雑物を除くため，4℃，12,000rpmで5分間遠心し，-80℃で保存した。
＜尿中アルブミン測定＞
　尿中のアルブミンは，ExocellのAlbumin定量ELISA kitであるAlbuwellを用い，製品プロトコールに従い測定を行った。得られた値は，尿中クレアチニン値で補正し，U-Albumin値として算出した。
＜タンパク尿スコア＞
　タンパク尿スコアは，尿中総タンパク質濃度／尿中クレアチニン濃度の比で算出した。尿中総タンパク質濃度は，Bradford 法を用いて測定した。尿中クレアチニン値は，クレアチニン測定キットを用いプロトコールに従い測定を行った。
＜血清クレアチニン＞
　血液は，ジエチルエーテル麻酔下でマウスの下大静脈より約500μLを採取した。その後，遠心（3,000 rpm，15分，4℃）を行い，得られた血清を-80℃で保存し，試料とした。Serum Creは富士ドライケムを用い，プロトコールに従い測定した。
＜パラフィン切片の作成＞
　マウスより腎臓を摘出後，10%ホルマリン溶液中で3日間ローテートし，固定した（ホルマリンは24時間毎に新鮮なものに交換した）。ホルマリン固定後，PBS (-) により洗浄し，EtOH，JFCを用いて脱水した。次に，HISTOS5によってパラフィン置換を行い，Leica EG1160を用いてパラフィンブロックを作製した。パラフィンブロックは4℃で保存した。作製したパラフィンブロックはLeica RM2125RTを用いて薄切を行い，マスコートガラス（マツナミ）に乗せ12時間37℃で乾燥し，切片を作製した。
＜PAS染色＞
　腎切片はキシレン用いて脱パラフィン操作を行い，その後エタノールを用いて脱キシレン操作を行った。PAS染色はPeriodic Acid Shiff stainingキットを用いて行い，ヘマトキシリン染色によって核染色を行った。PAS染色後，切片はエタノール，キシレンによって段階的に脱水，透徹を行い，カナダバルサムによって封入した。染色画像はKeyenceによって撮影した。
＜Masson’s Trichrome 染色＞
　腎切片はキシレンを用いて脱パラフィン操作を行い，その後エタノールを用いて脱キシレン操作を行った。その後Bouin’s solutionにより，室温で14時間固定した。染色はMasson’s Trichrome 染色キットを用い，プロトコールに従って行った。核染色はヘマトキシリンを用いた。Masson’s trichrome染色後，切片は脱水，透徹を行い，カナダバルサムによって封入した。染色画像はBiorevo（Keyence）によって撮影した。
＜免疫化学染色 (WT1, F4/80, PCNA)＞
　パラフィン切片を脱パラフィン，脱キシレン処理後，1% Triton in TBSに30分間浸し，クリーニングを行った。その後，抗原賦活化のためクエン酸緩衝液（pH 6.0）に浸し，98℃で20分間加熱した。その後20分間静置した後，切片を取り出し，内因性ペルオキシダーゼ除去のため，3% H2O2 in methanol溶液に浸し，15分間室温で反応させた。その後，湿潤箱内でBlocking solution（DAKO）を組織に乗せ，30分間室温でブロッキングを行った。TBS-tweenで洗浄後，F4/80，PCNA抗体を Antibody diluent（DAKO）で1:100に希釈し，一晩反応させた。TBS-tweenで洗浄後，その後2次抗体として，HRP-conjugated 抗体を0.3% Triton-X in PBSにより1:500に希釈し，40分間室温で反応させた。TBS-tweenで洗浄後，3,3’-Diaminobenzidine tetrahydrochloride（DAB）solution（DAB 10mg，0.05M Tris-Buffer（pH 7.6），30% H2O2 5μL）を10分間室温で反応させ呈色させた。カウンター染色にはヘマトキシリン（Gill3）を用いた。染色終了後，脱水，透徹，封入を行い，Biorevo（Keyence）によって撮影・解析を行った。
＜凍結切片＞
　マウス腎凍結ブロックは解剖摘出後の新鮮なマウス腎臓を半割し，クリオモルド内でOCT compound（サクラファインテック）に浸し，液体窒素により急速凍結した。腎凍結ブロックはクライオスタットにより，4μmに薄切し，凍結切片とした。
＜免疫蛍光染色（Nephrin）＞
　腎凍結切片は作成後すぐに氷冷したアセトン溶液に-20℃で5分間浸し，PBS洗浄後，更に4% Paraformaldehydeで10分間 4°Cでインキュベーションすることで固定した。その後，湿潤箱内で3 % BSA/PBSにより室温で1時間ブロッキングした。PBSによる洗浄後，3 % BSA/PBSで1:50に希釈した各1次抗体を室温で1時間反応させた。更にPBS洗浄後，PBSにより1:500に希釈した蛍光標識2次抗体（Alexa fluor antibody）を室温で45分間反応させた。その後，DAPI solutionにより核染色を行い，Vector shieldで封入し，Biorevo（Keyence）によって撮影・解析を行った。
＜マウスからのRNA回収＞
　マウス組織はRNA安定性保持のため，RNA laterに浸し，4℃，12時間,ローテートを行った後，RNA laterを除き，-80℃で保存した。組織は解凍後，冷却したPBS（-）を用いて洗浄し，1.5 mL tubeに入れた。その後，RNA iso Plusを1mL加え，臓器を眼科ばさみにて細切後，ホモジナイザーによってホモジナイズを行った。室温に5分間静置し，クロロホルム 0.2 mLを加え，よく撹拌した。以下，培養細胞と同様にRNA回収を行った。RNA回収後RNA濃度を測定し，DNaseをプロトコールに従って処理，更にフェノール／クロロホルム法，エタノール沈殿法によってRNAのみを精製した。RNAペレットはDEPC処理水によって溶解し，その後の実験に用いた。
＜Real-time RT-PCR＞
　マウス組織における各遺伝子の発現量を検討するためにReal-time RT-PCR（iQ5 リアルタイム PCR 解析システム）を行った。Real-time RT-PCRにはRT反応用にPrime Script RT reagent kitを，PCR反応用にSYBR Premix Ex Taq IIを用いた。概略を示すと，培養細胞およびマウス組織から抽出した total RNA 0.25gを鋳型とし，Oligo dT primerを用いて逆転写反応（37℃ 30分，85℃ 10秒）を行った。その後，各遺伝子mRNA 増幅用の5’-primer および 3’-primer を用いてPCR反応を（94℃ 2分 1サイクル，94℃ 30秒および 60℃ 30秒 40サイクル，72℃ 5分 1サイクル）を行った。なお，internal controlとして18S rRNAのPCR反応を同時に行った。標的PCR産物の定量は，Comparative CT法（CT法）により行った。
＜マウス組織からのタンパク質抽出＞
　マウス組織は摘出後，液体窒素に入れ急速凍結し，-80℃で保存した。解凍後，組織に冷PBS（-）1mLを加え，眼科バサミによって細切し，ホモジナイザーによってホモジナイズした。その後，遠心分離（12,000rpm，4℃，5分間）により上清を除去し，RIPA buffer を400μL加え更にホモジナイズした。氷上で２時間静置し，遠心分離（15,000 rpm，4℃，10分間）を行い，上清をタンパク質溶液として回収した。タンパク質濃度は，BCA法によって定量した。
＜Western blotting＞
　マウス腎組織から抽出した各タンパク質をサンプルとして用い，Western blotting 法を行った。まず，ポリアクリルアミドゲルを作製し，SDS-PAGE を行った後，PVDF膜への転写を250mAで2時間行った。転写の確認はponceau染色により行った。Ponceau染色の方法は，転写後のPVDF膜をponceau S 溶液に浸し，5分間 incubateし,滅菌水で2回 wash して確認する。その後，転写したPVDF膜は，0.1 % Tween 20-TBS（-）または 0.05% Tween 20-PBS（-）で希釈した 5% スキムミルクで1時間ブロッキングを行った。次に0.1 % Tween 20-TBS（-）または 0.05% Tween 20-PBS（-）で PVDF 膜を 3回洗浄し，1 次抗体反応（室温）を行った。1次抗体反応後，0.1 % Tween 20-TBS（-）または 0.05% Tween 20-PBS（-）で 3回洗浄し，2次抗体反応（室温）を行った。2 次抗体反応後，0.1 % Tween 20-TBS（-）または 0.05% Tween 20-PBS（-）で PVDF 膜を 3回洗浄し，Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate または，Immuno-star発光試薬を処理し，LAS-4000 mini（FUJIFILM）によって抗体反応を検出した。HRP 標識2 次抗体は全て Jackson Immuno Reserch Laboratoriesで購入した。
＜＜実験例１，ASモデルマウスにおける腎糸球体のプロテオミクス解析＞＞
　ASモデルマウスの腎糸球体についてプロテオミクス解析を行い，各種分子の発現を調べることにより，ASにおける病態メカニズムの解明を目的に検討を行った。
１．結果を図１に示す。
(1)　LC-MS/MSの分析により，ASでは，WTと比較して，いくつかの代謝経路に関する分子が過剰に発現していることが分かった。
(2)　さらにパスウェイ解析により，ASでは，WTと比較して，いくつかの代謝経路が過剰に促進されていることが分かった（Complex I biogenesis，Respiratory electron transport，Respiratory electron transport, ATP synthesis by chemiosmotic，The citric acid（TCA） cycle and respiratory elctron transport）。
２．これより，ASの腎糸球体において，細胞内代謝関連分子の発現変動が引き起こされていることが分かった。
＜＜実験例２，メトホルミンによるAS腎機能への影響＞＞
　腎糸球体における代謝調整を行う薬物の一つとしてメトホルミンを用い，AS腎機能にどのような影響を及ぼすかを調べることを目的に検討を行った。
１．結果を図３に示す。
(1)　タンパク尿について，メトホルミン投与群は，コントロールと比較して，尿中タンパク量は一貫して少なく，18週齢以降では，有意に少なかった（図３Ａ）。また，メトホルミン投与群は，ロサルタン投与群と比較すると，一貫して高い値であった。
(2)　尿中アルブミンについて，メトホルミン投与群は，ロサルタン投与群ほどではないものの，コントロールと比較して，有意に低い値であった（図３Ｂ）。
(3)　血清クレアチニンについて，メトホルミン投与群は，コントロールと比較して，有意に低い値であり，ロサルタン投与群ならびにWTと同等の値であった（図３Ｃ）。
２．これらの結果から，メトホルミンは，ASにおける腎機能低下を抑制することが分かった。
＜＜実験例３，メトホルミンによるAS腎組織障害への影響＞＞
　メトホルミンがASにおける腎組織障害へどのような影響を及ぼすかを調べることを目的に検討を行った。
１．免疫染色の結果を，図４に示す。
(1)　PAM染色において，メトホルミン投与群では，コントロールと比較と比較して，強く染まっていた。また，メトホルミン投与群は，ロサルタン投与群と比較しても強く，WTと同程度，染まっていた。
(2)　マッソントリクローム染色において，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して，その染色は弱いものであった。また，メトホルミン投与群は，ロサルタン投与群と比較しても，その染色は弱いものであった。
(3)　マクロファージマーカーであるF4/80染色において，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して，ほとんど染まっていなかった。また，メトホルミン投与群は，ロサルタン投与群と比較して，同程度，染まっていた。
２．また，マクロファージ浸潤について，F4/80で染色された陽性領域を算出した結果，メトホルミン投与群は，コントロールと比較して有意に低い値を示し，ロサルタン投与群と同程度の値であった。
３．さらに，マッソントリクローム染色より陽性領域を繊維化スコアとして算出した結果，メトホルミン投与群は，コントロールと比較して有意に低い値を示し，ロサルタン投与群よりも低い値であった。
４．これらの結果から，メトホルミンは，ASの腎組織障害を抑制していることが分かった。
５．また，ASの腎組織障害抑制効果は，ロサルタンと同等程度と考えられ，パラメーターによっては，それ以上の効果を有することが分かった。
＜＜実験例４，メトホルミンによる各種炎症・繊維化関連遺伝子への影響＞＞
　ASにおいて，メトホルミンが各種炎症・繊維化関連遺伝子の発現への影響を調べることを目的に検討を行った。
１．炎症性サイトカインに関する結果を図５に示す。
(1)　IL-6について，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して有意に低い値であり，ロサルタン投与群よりも低い値であった。
(2)　IL-1βについて，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して有意に低い値であり，ロサルタン投与群よりも低い値であった。
(3)　KC（IL-8）について，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して有意に低い値であり，ロサルタン投与群と同等の値であった。
２．繊維化関連分子に関する結果を図６に示す。
(1)　Mmp12について，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して有意に低い値であり，ロサルタン投与群と同等の値であった。
(2)　Mmp9について，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して有意に低い値であり，ロサルタン投与群よりも低い値であった。
(3)　Tgf-βについて，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して有意に低い値を示し，ロサルタン投与群と同程度の値であった。
(4)　α-Smaについて，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して有意に低い値を示し，ロサルタン投与群よりも低い値であった。
３．これらの結果より，メトホルミンは，ASにおいて変動する各種炎症・繊維化関連遺伝子の発現を抑制することが分かった。
４．また，メトホルミンの抑制効果は，ロサルタンと同等程度と考えられ，パラメーターによっては，ロサルタンを超える効果を示すことが分かった。
＜＜実験例５，メトホルミンによるAS腎糸球体障害への影響＞＞
　メトホルミンがASにおける腎糸球体障害へどのような影響を及ぼすかを調べることを目的に検討を行った。
１．結果を図７に示す。
(1)　WT1染色において，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して強く染まっており，ロサルタン投与群と同程度，染まっていた。
(2)　Nephrin Nuclei染色において，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して強く染まっており，ロサルタン投与群と同程度，染まっていた。
(3)　PCNA染色において，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して，その染色は弱く，ロサルタン投与群と同程度であった。
２．また，WT1染色をもとに，糸球体当たりのポドサイト数の算出を行ったところ，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して，大きな値であり，ロサルタン投与群と同等の値であった。
３．さらに，PCNA染色をもとに，糸球体当たりの細胞増殖数の算出を行ったところ，メトホルミン投与群では，コントロールと比較して小さな値であり，ロサルタン投与群と同等の値であった。
４．これらの結果から，メトホルミンは，ASにおいてポドサイト障害を抑制するとともに，糸球体細胞の増殖を抑制していることが分かった。

 

Claims (4)

  1. 腎糸球体の代謝調整を行うことにより，アルポート症候群の治療を行うことを特徴とするアルポート症候群治療薬
     
  2. 腎糸球体の代謝調整が，ビグアナイド系化合物もしくはその塩を有効成分としてなされることを特徴とする請求項１に記載のアルポート症候群治療薬
     
  3. ビグアナイド系化合物が，メトホルミンないしその塩であることを特徴とする請求項２に記載のアルポート症候群治療薬
     
  4. メトホルミンないしその塩が，メトホルミン塩酸塩であることを特徴とする請求項３に記載のアルポート症候群治療薬
     
     
     

     
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