WO2019039496A1 - がん細胞の細胞死誘導剤の製造方法、及びがん細胞の細胞死誘導方法 - Google Patents

がん細胞の細胞死誘導剤の製造方法、及びがん細胞の細胞死誘導方法 Download PDF

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plasma
cancer cells
cancer
cells
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洋平 ▲高▼橋
勝 堀
宏昌 田中
博司 橋爪
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株式会社ニコン
国立大学法人名古屋大学
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    • H05H1/24—Generating plasma
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an agent for inducing cell death in cancer cells, and a method for inducing cell death in cancer cells.
  • Priority is claimed on Japanese Patent Application No. 2017-160045, filed Aug. 23, 2017, the content of which is incorporated herein by reference.
  • Plasma technology is applied to the fields of electricity, chemistry, and materials.
  • medical applications of plasma technology have been studied.
  • ultraviolet rays and radicals are generated in addition to charged particles such as electrons and ions. These have been found to have various effects on living tissues, including sterilization of living tissues.
  • Patent Document 1 describes that a culture solution is irradiated with 60 Hz non-equilibrium atmospheric pressure plasma to produce an anti-tumor aqueous solution.
  • One embodiment of the present invention is a cell death inducer for cancer cells, comprising a step of irradiating plasma generated by ionizing a gas under atmospheric pressure using a microwave power source to a water or a composition containing water Manufacturing method.
  • one embodiment of the present invention is a method for inducing cell death of cancer cells, which comprises the step of contacting the cancer cells with the agent for inducing cell death of cancer cells produced by the method of the above embodiment. .
  • one embodiment of the present invention is a method for inducing cell death of cancer cells, comprising the step of irradiating cancer cells with plasma generated by ionizing a gas under atmospheric pressure using a microwave power source. .
  • FIG. 2A shows cell viability of MCF10A cells and HeLa cells treated with a cancer cell death inducer.
  • Cell death of cancer cell death inducer (cancer cell death inducer) produced by the production method according to one embodiment of the present invention on normal cells (MCF10A cells) and cancer cells (HeLa cells) Shows inducible activity.
  • the cell survival rate is shown as a relative value when the cell survival rate in cells cultured in a medium without plasma irradiation is 1.
  • FIG. 2B shows cell viability of MCF10A cells and HeLa cells diluted 1 to 256 times with the cancer cell death inducer and treated with the diluted cancer cell death inducer. Relationship between irradiation time of plasma (microwave excited plasma) generated by ionizing gas under atmospheric pressure using microwave power source and concentration of hydrogen peroxide and nitrite ion in cancer cell death inducer Show.
  • a cancer cell death inducer (cancer cell death inducer (microwave excited plasma)) manufactured by irradiating microwave excitation plasma, and a cancer cell death inducer manufactured by irradiation of 60 Hz non-equilibrium atmospheric pressure plasma It shows cell death-inducing activity against cancer cells (HeLa cells) of (cancer cell death inducer (60 Hz atmospheric pressure plasma)).
  • the cancer cell death inducer was produced by irradiating the plasma to DMEM medium for the irradiation times shown in FIG. 4 respectively.
  • “60 Hz atmospheric pressure plasma” indicates a cancer cell death inducer (60 Hz atmospheric pressure plasma).
  • Microwave excited plasma refers to a cancer cell death inducer (microwave excited plasma).
  • the cell survival rate is shown as a relative value when the cell survival rate in cells cultured in a medium without plasma irradiation is 1.
  • the cell death induction activity with respect to a cancer cell (HeLa cell) of a cancer cell death inducer (microwave excitation plasma) and a cancer cell death inducer (60 Hz atmospheric pressure plasma) is shown.
  • the cancer cell death inducer was produced by irradiating the plasma to DMEM medium at the irradiation distances shown in FIG. 5 respectively.
  • “60 Hz atmospheric pressure plasma” indicates a cancer cell death inducer (60 Hz atmospheric pressure plasma).
  • “Microwave excited plasma” refers to a cancer cell death inducer (microwave excited plasma).
  • the cell survival rate is shown as a relative value when the cell survival rate in cells cultured in a medium without plasma irradiation is 1.
  • the present invention provides a method for producing a cell death inducer of cancer cells.
  • water or a composition containing water is irradiated with plasma (hereinafter, referred to as “microwave-excited plasma”) generated by ionizing a gas under atmospheric pressure using a microwave power source.
  • microwave-excited plasma irradiation process A process (hereinafter, referred to as “microwave-excited plasma irradiation process”) is included.
  • the microwave excited plasma can be generated, for example, using a plasma generation system as illustrated in FIG.
  • the plasma generator 1 and the microwave power source 2 are connected by the coaxial cable 3.
  • the gas is supplied to the plasma generator 1 from the gas cylinder 4 for supplying a gas as a process gas via the gas supply pipe 5.
  • the microwaves generated by the microwave power source 2 are transmitted to the plasma generator 1 via the coaxial cable 3.
  • the gas is ionized by the microwaves, and a plasma is generated in the plasma generation region.
  • the method of generating the microwave excitation plasma is not limited to the system illustrated in FIG. 1, and an apparatus, system or the like capable of generating the microwave excitation plasma can be used without particular limitation.
  • An apparatus or system for generating a microwave excitation plasma may be commercially available.
  • microwave refers to radio waves in the frequency range of 300 MHz to 300 GHz.
  • the microwaves used in the manufacturing method of the present embodiment are not particularly limited, but for example, those having a frequency of 900 MHz to 6 GHz, 1.5 GHz to 4 GHz, 2 GHz to 3 GHz, and 2.4 GHz to 2.5 GHz may be used. it can.
  • the input power of the microwave power supply at the time of generating the microwave may be 20 to 2000 W.
  • the input power of the microwave power can be 50 W.
  • the gas ionized by microwaves is not particularly limited, and examples thereof include oxygen, nitrogen, carbon dioxide, air, and rare gases (helium, argon, neon, etc.).
  • the flow rate of the process gas at the time of plasma generation is not particularly limited, but may be 0.5 to 10 standard liters per minute (slm). As an example, the flow rate of the process gas can be 2 slm.
  • the flow rate of the process gas can be controlled, for example, using a mass flow controller.
  • Table 1 shows an example of plasma conditions of the microwave excitation plasma.
  • the microwave excitation plasma is irradiated to the composition containing water or water.
  • the microwave excitation plasma By irradiating the water with microwave excitation plasma, hydrogen peroxide, nitrite ion and the like are generated.
  • a composition containing water is irradiated with a microwave excitation plasma, hydrogen peroxide, nitrite ions and the like are generated in the water contained in the composition.
  • These substances such as hydrogen peroxide and nitrite ion make water or a composition containing water irradiated with microwave-excited plasma have cancer cell-specific cell death-inducing activity.
  • the composition containing water is not particularly limited as long as it contains water.
  • the composition containing water may be an aqueous solution, an emulsion, a suspension, or a gel.
  • the composition comprising water is an aqueous solution.
  • the content of water in the composition containing water is, for example, 50 to 99.99% by mass, 60 to 99.99% by mass, 70 to 99.99% by mass, 80 to 99.99% by mass, 90 to 99 .99 mass% etc. are mentioned.
  • composition containing water examples include those which do not exhibit cytotoxic activity to normal cells.
  • Such compositions include cell culture media, saline, phosphate buffered saline, various buffers (phosphate buffer, Tris buffer, HEPES buffer, citrate buffer, etc.), etc. It can be mentioned.
  • the medium for cell culture is not particularly limited, and a medium generally used for cell culture can be used.
  • Dulbecco's modified Eagle's medium DMEM's medium
  • Eagle's minimal essential medium Glasgow minimal essential medium
  • nutrient mixture F-12 ham Iscove's modified Dulbecco's medium
  • RPMI-1640 Dulbecco's phosphate buffered medium for culturing human cells Physiological saline, Hank's balanced salt solution and the like are exemplified, but not limited thereto.
  • commercially available cell culture media may be used.
  • Irradiation of the microwave excitation plasma to the water or the composition containing water can be performed, for example, as illustrated in FIG. Specifically, the container 10 containing water or a composition 11 containing water is placed below the plasma generation region of the plasma generator 1 to generate microwave excitation plasma. Thereby, microwave excitation plasma is irradiated to the composition 11 containing water or water.
  • the distance from the plasma nozzle 6 to the plasma irradiation surface of water or a composition containing water can be, for example, 1 to 30 mm, 2 to 20 mm, 3 to 15 mm, and the like.
  • irradiation time of the microwave excitation plasma to the composition containing water or water for example, 10 seconds or more, 20 seconds or more, 30 seconds or more, 60 seconds or more, or 100 seconds or more can be mentioned.
  • the upper limit of the irradiation time is not particularly limited, but may be, for example, 5 minutes or less, 4 minutes or less, or 3 minutes or less, from the balance between the energy input amount and the cell death inducing activity.
  • 20 seconds to 5 minutes, 30 seconds to 4 minutes, 60 to 200 seconds, 100 to 180 seconds and the like are exemplified.
  • Water or a composition containing water irradiated with microwave-excited plasma exhibits cell death-inducing activity against cancer cells, but does not exhibit cell death-inducing activity against normal cells. Therefore, it can be used as a cell death inducer that induces cell death specifically in cancer cells.
  • the cell death inducer produced by the production method of the present embodiment has a higher cell death inducer effect on cancer cells than the cell death inducer produced by irradiating 60 Hz atmospheric pressure plasma. Therefore, cancer cells can be killed efficiently.
  • epithelial tumor cells cervical cancer cells, lung cancer cells, liver cancer cells, gastric cancer cells, colon cancer cells, breast cancer cells, bladder cancer cells, prostate cancer cells, ovarian cancer cells, skin cancer cells And pharyngeal cancer cells, tongue cancer cells and the like, but not limited thereto.
  • the organism from which the cancer cells are derived is not particularly limited, and examples thereof include humans and mammals other than humans (bovines, pigs, horses, sheep, goats, dogs, cats, monkeys, etc.).
  • the manufacturing method of the present embodiment may include other processes in addition to the microwave excitation plasma irradiation process.
  • a step of diluting water or a composition containing water after microwave excitation plasma irradiation (dilution step), adding another component to water or a composition containing water after microwave excitation plasma irradiation A process (component addition process) etc. are mentioned.
  • the manufacturing method of the present embodiment may include a dilution step after the microwave excitation plasma irradiation step.
  • Water or a composition containing water after microwave-excited plasma irradiation has cell death-inducing activity against cancer cells even when diluted by about 10 times. Therefore, cancer cells may be prepared by diluting water or a composition containing water after microwave-excited plasma irradiation by about 1.1 to 10 times, or about 1.1 to 5 times, or about 1.1 to 3 times. It may be used as a cell death inducer.
  • the dilution may be performed using water or a composition containing water before microwave excitation plasma irradiation, or may be performed using another aqueous solution.
  • the manufacturing method of the present embodiment may include a component addition step after the microwave excitation plasma irradiation step.
  • the components to be added include, for example, components necessary for survival of normal cells.
  • medium components such as amino acids, saccharides, vitamins, and inorganic salts may be added to the water after the microwave excitation plasma irradiation. By adding such medium components, it is possible to induce cancer cell death while increasing the survival rate of normal cells.
  • the present invention brings a cancer cell cell death inducer produced by the production method of the above embodiment (hereinafter referred to as "the present cancer cell death inducer") into contact with cancer cells.
  • the present cancer cell death inducer a cancer cell cell death inducer produced by the production method of the above embodiment
  • a method for inducing cell death of cancer cells comprising the steps.
  • the cancer cells to be contacted with the present cancer cell death inducer are not particularly limited, and the cancer cells listed in the above-mentioned “Method for producing cell death inducer of cancer cells” The same thing is mentioned.
  • the contact between the cancer cell death inducer and the cancer cells is performed in vitro (ex vivo or in vitro).
  • the cancer cell may be a cultured cell or a cancer cell collected from a living body.
  • the term "cultured cell” refers to a cell cultured for an arbitrary time in vitro. The culture time is not particularly limited, and may be, for example, one hour or more.
  • the cancer cell is a cultured cell, it may be an established cancer cell line.
  • the cancer cells may be cancer cells in a cell population in which normal cells are mixed.
  • the present cancer cell death inducer has high cell death inducer activity against cancer cells, but has no cell death inducer activity against normal cells. Therefore, when the cancer cell death inducer is brought into contact with a cell population in which cancer cells and normal cells coexist, cell death is induced only in the cancer cells. Thereby, in a cell population in which cancer cells and normal cells coexist, only cancer cells can be selectively killed.
  • the method of contact is not particularly limited.
  • the cancer cell death inducer may be added to a culture medium in which the cancer cell is cultured.
  • the culture medium in which cancer cells are cultured may be replaced with the present cancer cell death inducer.
  • the cancer cells are cells collected from a living body, the collected cells may be suspended in the cancer cell death inducer.
  • the contact time between the cancer cell death inducer and the cancer cells is, for example, 5 hours or more, 10 hours or more, 15 hours It can be more than or 20 hours or more.
  • the upper limit of the contact time is not particularly limited, but can be, for example, 50 hours or less.
  • the cancer cell death inducer is produced by irradiating a cell culture medium such as DMEM medium with microwave irradiation plasma, the culture is continued as it is in the presence of the cancer cell death inducer. May be When cancer cells and normal cells are mixed, by continuing culture in the presence of the present cancer cell death inducer, the proportion of cancer cells is decreased, and the proportion of normal cells is increased. You can get it.
  • a cell population composed of only normal cells can be obtained.
  • the conditions in the contact period of this cancer cell death inducer and a cancer cell can be made into the conditions similar to the conditions of normal cell culture.
  • 310 K, 5% CO 2 and the like are exemplified as the conditions during the contact period.
  • the contact between the cancer cell death inducer and the cancer cell may be performed in vivo.
  • the cancer cell may be a cancer cell in a tumor generated in vivo.
  • the method of contact is not particularly limited.
  • the cancer cell death inducer may be administered to the tumor site or in the vicinity of the tumor by infusion, injection or the like.
  • the agent for inducing death of cancer cell may be administered to the excision site, and the cancer cell death inducer may be contacted with the cancer cells remaining at the excision site.
  • the cancer cell is a skin cancer cell such as a melanoma cell
  • the agent for inducing death of cancer cell may be applied to the lesion site. Since the present cancer cell death inducer does not induce cell death to normal cells, it can kill only cancer cells without killing normal cells even when administered to a living body. .
  • the present invention comprises the step of irradiating cancer cells with a plasma (microwave-excited plasma) generated by ionizing a gas under atmospheric pressure using a microwave power source, to cancer cells.
  • a plasma microwave-excited plasma
  • the microwave excitation plasma As a method of generating the microwave excitation plasma, a method similar to the method exemplified in the above-mentioned “Method of manufacturing cell death inducer for cancer cells” is exemplified. Moreover, the cancer cell which irradiates a microwave excitation plasma is not specifically limited, The thing similar to the cancer cell mentioned by the above-mentioned "the manufacturing method of the ⁇ cell-death inducer of a cancer cell >>" is mentioned.
  • the cancer cell may be a cultured cell or a cancer cell collected from a living body.
  • the cancer cell may be an established cancer cell line.
  • the cancer cells may be cancer cells in a cell population in which normal cells are mixed.
  • Irradiation of a microwave excitation plasma with respect to a cancer cell can be performed by, for example, substituting the composition 11 containing the water in the container 10 or water in the container 10 to a cancer cell in FIG.
  • the container 10 containing cancer cells is placed below the plasma generation region of the plasma generator 1 to generate microwave excitation plasma.
  • the cancer cells are irradiated with the microwave excitation plasma.
  • a distance from the plasma spout 6 to the cancer cell 1 to 30 mm, 2 to 20 mm, 3 to 15 mm, etc. can be exemplified.
  • irradiation time of microwave excitation plasma to cancer cells for example, 20 seconds or more, 30 seconds or more, 60 seconds or more, or 100 seconds or more can be mentioned.
  • the upper limit of the irradiation time is not particularly limited, but may be, for example, 5 minutes or less, 4 minutes or less, or 3 minutes or less, from the balance between the energy input amount and the cell death inducing activity.
  • 20 seconds to 5 minutes, 30 seconds to 4 minutes, 60 to 200 seconds, 100 to 180 seconds and the like are exemplified.
  • cancer cells to be irradiated with the microwave excitation plasma may be suspended in water or a composition containing water (medium for cell culture, buffer solution, etc.).
  • the cancer cells in the medium may be irradiated with microwave excitation plasma.
  • cancer cells may be suspended in a medium or a buffer, and the cancer cells may be irradiated with microwave excitation plasma together with the medium or the buffer.
  • irradiation with the microwave excitation plasma generates hydrogen peroxide, nitrite ions, etc. in the medium or buffer solution in addition to the intracellular fluid of cancer cells. Substances such as hydrogen peroxide and nitrite ion induce cell death of cancer cells.
  • irradiation of microwave-excited plasma to cancer cells may be performed on cancer cells in vivo.
  • the cancer cell may be a cancer cell in a tumor generated in vivo.
  • Irradiation of microwave excitation plasma can also be performed to cancer cells in a living body using a plasma generation system as illustrated in FIG. 1.
  • a tumor site is disposed below the plasma generation region of the plasma generator 1 to generate microwave excitation plasma.
  • the cancer cells in the tumor are irradiated with the microwave excitation plasma.
  • the distance from the plasma spout 6 to the tumor site may be, for example, 1 to 30 mm, 2 to 20 mm, or 3 to 15 mm.
  • microwave-excited plasma may be irradiated to the lesion site of the body surface.
  • microwave excitation plasma may be irradiated to the body surface of the site where the tumor is present.
  • a tumor site may be exposed by surgery, and microwave excitation plasma may be irradiated to the exposed tumor.
  • the excision site may be irradiated with microwave excitation plasma to induce cell death of cancer cells remaining in the excision site.
  • cancer cells in the living body are irradiated with microwave-excited plasma
  • the intracellular fluid of the cancer cells and the extracellular fluid (interstitial fluid, plasma, lymph, etc.) near the cancer cells are peroxidized.
  • Hydrogen, nitrite ion, etc. are generated.
  • Substances such as hydrogen peroxide and nitrite ion induce cell death of cancer cells.
  • cell death of normal cells is not induced, even when cancer cells in vivo are irradiated with microwave-excited plasma, only cancer cells can be selectively selected without killing normal cells. It can be killed and injured.
  • Example 1 Production of Cell Death Inducing Agent for Cancer Cells
  • the microwave power supply was a 2.45 GHz microwave power supply, and the microwave power supply and the plasma generator were connected via a coaxial cable and a three stub tuner.
  • the microwave power was set to 50W.
  • Argon gas was used as a process gas.
  • the argon gas flow rate was fixed at 2 standard liters per minute (slm) using a mass flow controller.
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium
  • argon gas was ionized with a microwave of 2.45 GHz under atmospheric pressure to generate plasma
  • the DMEM medium was irradiated with plasma for a predetermined time.
  • the distance between the plasma spout and the plasma-irradiated surface of DMEM medium was 5 mm.
  • the DMEM medium after plasma irradiation was used in the following examples as a cell death inducer for cancer cells (hereinafter referred to as "cancer cell death inducer").
  • the length of the plasma plume of the plasma generated with the microwave of 2.45 GHz was about 13 mm from the plasma jet nozzle.
  • the electron density of plasma was about 7.3 ⁇ 10 14 cm ⁇ 3 .
  • Example 2 Cell Proliferation Assay A cancer cell death inducer was produced by the method described in Example 1. The irradiation time of the microwave excitation plasma to the DMEM medium was 30 seconds. HeLa cells (human epithelial tumor cells) and MCF10A cells (human mammary epithelial cells) were used as cells for cell proliferation assay. These cells are cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and penicillin (100 U / mL) -streptomycin (100 ⁇ g / mL) and incubated in a 310 K, 5% CO 2 humidified incubator. Maintained.
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin 100 U / mL
  • -streptomycin 100 ⁇ g / mL
  • HeLa cells or MCF10A were suspended in DMEM medium, and 200 ⁇ L of the suspension was added to each well of the 96-well plate and cultured for 24 hours. The cell concentration was 10,000 cells / well. Subsequently, 200 ⁇ L of the culture medium was removed from each well, and 200 ⁇ L of a cancer cell death inducer was added and cultured again. After 20 hours, the cancer cell death inducer was removed from each well and 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium, inner 100 ⁇ L of DMEM medium containing salt reagent (Promega Corp) was added. After incubation for 1 hour, the absorbance at 490 nm (which is linearly proportional to the number of living cells) was measured.
  • FIG. 2 (A) shows cell viability of MCF10A cells and HeLa cells treated with a cancer cell death inducer.
  • the cell viability was shown as a relative value when the absorbance of control cells cultured in plasma non-irradiated DMEM medium was taken as 1.
  • FIG. 2 (A) shows cell viability in HeLa cells, cell viability was greatly reduced by culturing with a cancer cell death inducer.
  • MCF10A cells cell viability did not decrease so much even when cultured with a cancer cell death inducer.
  • FIG. 2 (B) shows that the cancer cell death inducer is 1 ⁇ , 2 ⁇ , 4 ⁇ , 8 ⁇ , 16 ⁇ , 32 ⁇ , 64 ⁇ , 128 ⁇ or in DMEM medium supplemented with FBS and penicillin / streptomycin.
  • the result of having performed a cell proliferation assay with the diluted cancer cell death inducer diluted by 256 times is shown.
  • the cell viability was shown as a relative value when the absorbance of control cells cultured in plasma non-irradiated DMEM medium was taken as 1.
  • the cell viability was 0.8 or more at any dilution rate.
  • Example 3 Measurement of Hydrogen Peroxide Concentration and Nitrite Ion Concentration
  • a cancer cell death inducer was produced by the method described in Example 1. The irradiation time of microwave excitation plasma to DMEM medium was varied between 10 and 180 seconds. (Measurement of hydrogen peroxide concentration)
  • the cancer cell death inducer was diluted to an appropriate concentration by adding 0.25 M sodium phosphate to the cancer cell death inducer. 50 ⁇ L of the diluted cancer cell death inducer was added to each well of the 96 well plate. Subsequently, to each well was added 50 ⁇ L of Amplex Red TM reagent (Invitrogen).
  • the absorbance of DMEM medium prior to plasma irradiation was subtracted.
  • the absolute concentration of nitrite ion was calculated by using a calibration curve of nitrite ion diluted to 140 ⁇ M with pure water.
  • the relationship between the irradiation time of the microwave excitation plasma and the hydrogen peroxide concentration and the nitrite ion concentration in the cancer cell death inducer is shown in FIG.
  • the hydrogen peroxide concentration and the nitrite ion concentration in the cancer cell death inducer increased at a rate of 6.0 ⁇ M / sec and 2.2 ⁇ M / sec, respectively.
  • the hydrogen peroxide concentration in the cancer cell death inducer was 180 ⁇ M
  • the nitrite ion concentration was 77 ⁇ M.
  • Example 4 Comparison with cancer cell death inducer manufactured by 60 Hz atmospheric pressure plasma (irradiation time) A cancer cell death inducer (hereinafter referred to as “cancer cell death inducer (microwave excited plasma)”) was produced by the method described in Example 1. In addition, the DMEM medium was irradiated with 60 Hz non-equilibrium atmospheric pressure plasma to produce a cancer cell death inducer (hereinafter referred to as “cancer cell death inducer (60 Hz atmospheric pressure plasma)”). The irradiation of the 60 Hz non-equilibrium atmospheric pressure plasma was performed by the method described in JP-A-2016-169164.
  • the irradiation time of the microwave excitation plasma or 60 Hz non-equilibrium atmospheric pressure plasma to the DMEM medium was 30 seconds, 60 seconds, 120 seconds, or 180 seconds.
  • a cell proliferation assay was performed in the same manner as in Example 2 using a cancer cell death inducer (microwave excitation plasma) and a cancer cell death inducer (60 Hz atmospheric pressure plasma). HeLa cells were used as cells for cell proliferation assay.
  • FIG. 4 The results of the cell proliferation assay are shown in FIG.
  • "60 Hz atmospheric pressure plasma” shows the result by a cancer cell death inducer (60 Hz atmospheric pressure plasma).
  • Microwave excitation plasma shows the result by a cancer cell death inducer (microwave excitation plasma).
  • the cell viability was shown as a relative value when the absorbance of control cells cultured in plasma non-irradiated DMEM medium was taken as 1.
  • the cancer cell death inducer microwave excitation plasma
  • the cell viability was 0.25 or less at any irradiation time. The longer the irradiation time of the microwave excitation plasma, the lower the cell survival rate.
  • the cell survival rate was 0.1 or less.
  • the cancer cell death inducer 60 Hz atmospheric pressure plasma
  • the cell survival rate decreased as the irradiation time increased, but the cell survival rate was 0.4 or more even with the irradiation time of 120 seconds.
  • Example 5 Comparison with cancer cell death inducer manufactured by 60 Hz atmospheric pressure plasma (irradiation distance) A cancer cell death inducer (microwave excited plasma) was produced by the method described in Example 1. Also, the DMEM medium was irradiated with 60 Hz non-equilibrium atmospheric pressure plasma to produce a cancer cell death inducer (60 Hz atmospheric pressure plasma). The distance between the plasma spout and the plasma-irradiated surface of DMEM medium was varied between 3 and 13 mm. The plasma irradiation time was 30 seconds. A cell proliferation assay was performed in the same manner as in Example 2 using a cancer cell death inducer (microwave excitation plasma) and a cancer cell death inducer (60 Hz atmospheric pressure plasma). HeLa cells were used as cells for cell proliferation assay.
  • FIG. 5 The results of the cell proliferation assay are shown in FIG. In FIG. 5, "60 Hz atmospheric pressure plasma” shows the result by the cancer cell death inducer (60 Hz atmospheric pressure plasma). Moreover, “microwave excitation plasma” shows the result by a cancer cell death inducer (microwave excitation plasma).
  • the cell viability was shown as a relative value when the absorbance of control cells cultured in plasma non-irradiated DMEM medium was taken as 1. As shown in FIG. 5, with the cancer cell death inducer (microwave excited plasma), the cell viability was 0.10 or less at any irradiation distance. There was no significant difference in cell viability depending on the irradiation distance.
  • the cancer cell death inducer 60 Hz atmospheric pressure plasma
  • the cell survival rate decreased as the irradiation distance decreased.
  • the cell survival rate was 0.4 or more at any irradiation distance. From the results of Examples 4 and 5, the cancer cell death inducer (microwave excited plasma) has a higher cell death induction activity of cancer cells as compared to the cancer cell death inducer (60 Hz atmospheric pressure plasma). It was shown.
  • plasma generator microwave power source 3 coaxial cable 4 gas cylinder 5 gas supply pipe 6 plasma spout 10 container 11 water or composition containing water 100 plasma generation system

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Abstract

マイクロ波電源を用いて大気圧下で気体を電離して生成したプラズマを、水を含む液体に照射する工程を含む、がん細胞の細胞死誘導剤の製造方法。また、前記製造方法により製造されたがん細胞の細胞死誘導剤を、がん細胞に接触させる工程を含む、がん細胞の細胞死誘導方法。また、マイクロ波電源を用いて大気圧下で気体を電離して生成したプラズマを、がん細胞に照射する工程を含む、がん細胞の細胞死誘導方法。

Description

がん細胞の細胞死誘導剤の製造方法、及びがん細胞の細胞死誘導方法
　本発明は、がん細胞の細胞死誘導剤の製造方法、及びがん細胞の細胞死誘導方法に関する。
　本願は、２０１７年８月２３日に、日本に出願された特願２０１７－１６００４５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　プラズマ技術は、電気、化学、材料の各分野に応用されている。近年においては、プラズマ技術の医療への応用が検討されている。プラズマの内部では、電子やイオン等の荷電粒子の他に、紫外線やラジカルが発生する。これらには、生体組織の殺菌をはじめとして、生体組織に対する種々の効果があることが分かってきている。
　例えば、特許文献１には、６０Ｈｚの非平衡大気圧プラズマを培養液に照射して、抗腫瘍水溶液を製造することが記載されている。
特開２０１６－１６９１６４号公報
　本発明の一実施形態は、マイクロ波電源を用いて大気圧下で気体を電離して生成したプラズマを、水又は水を含む組成物に照射する工程を含む、がん細胞の細胞死誘導剤の製造方法である。
　また、本発明の一実施形態は、上記実施形態の製造方法により製造されたがん細胞の細胞死誘導剤を、がん細胞に接触させる工程を含む、がん細胞の細胞死誘導方法である。
　また、本発明の一実施形態は、マイクロ波電源を用いて大気圧下で気体を電離して生成したプラズマを、がん細胞に照射する工程を含む、がん細胞の細胞死誘導方法である。
プラズマ発生システムの一例を示す概略図である。 本発明の一実施形態にかかる製造方法により製造された、がん細胞の細胞死誘導剤（がん細胞死誘導剤）の、正常細胞（ＭＣＦ１０Ａ細胞）及びがん細胞（ＨｅＬａ細胞）に対する細胞死誘導活性を示す。細胞生存率は、プラズマ非照射の培地で培養した細胞における細胞生存率を１としたときの相対値で示した。図２Ａは、がん細胞死誘導剤で処理したＭＣＦ１０Ａ細胞及びＨｅＬａ細胞の細胞生存率を示す。 本発明の一実施形態にかかる製造方法により製造された、がん細胞の細胞死誘導剤（がん細胞死誘導剤）の、正常細胞（ＭＣＦ１０Ａ細胞）及びがん細胞（ＨｅＬａ細胞）に対する細胞死誘導活性を示す。細胞生存率は、プラズマ非照射の培地で培養した細胞における細胞生存率を１としたときの相対値で示した。図２Ｂは、がん細胞死誘導剤を１～２５６倍に希釈し、当該希釈した各がん細胞死誘導剤で処理したＭＣＦ１０Ａ細胞及びＨｅＬａ細胞の細胞生存率を示す。 マイクロ波電源を用いて大気圧下で気体を電離して生成したプラズマ（マイクロ波励起プラズマ）の照射時間と、がん細胞死誘導剤中の過酸化水素濃度及び亜硝酸イオン濃度との関係を示す。 マイクロ波励起プラズマを照射して製造したがん細胞死誘導剤（がん細胞死誘導剤（マイクロ波励起プラズマ））、及び６０Ｈｚ非平衡大気圧プラズマを照射して製造したがん細胞死誘導剤（がん細胞死誘導剤（６０Ｈｚ大気圧プラズマ））の、がん細胞（ＨｅＬａ細胞）に対する細胞死誘導活性を示す。がん細胞死誘導剤は、それぞれ図４に示す照射時間で、プラズマをＤＭＥＭ培地に照射して製造した。図４中、「６０Ｈｚ大気圧プラズマ」は、がん細胞死誘導剤（６０Ｈｚ大気圧プラズマ）を示す。「マイクロ波励起プラズマ」は、がん細胞死誘導剤（マイクロ波励起プラズマ）を示す。細胞生存率は、プラズマ非照射の培地で培養した細胞における細胞生存率を１としたときの相対値で示した。 がん細胞死誘導剤（マイクロ波励起プラズマ）、及びがん細胞死誘導剤（６０Ｈｚ大気圧プラズマ）の、がん細胞（ＨｅＬａ細胞）に対する細胞死誘導活性を示す。がん細胞死誘導剤は、それぞれ図５に示す照射距離で、プラズマをＤＭＥＭ培地に照射して製造した。図５中、「６０Ｈｚ大気圧プラズマ」は、がん細胞死誘導剤（６０Ｈｚ大気圧プラズマ）を示す。「マイクロ波励起プラズマ」は、がん細胞死誘導剤（マイクロ波励起プラズマ）を示す。細胞生存率は、プラズマ非照射の培地で培養した細胞における細胞生存率を１としたときの相対値で示した。
≪がん細胞の細胞死誘導剤の製造方法≫
　一実施形態において、本発明は、がん細胞の細胞死誘導剤の製造方法を提供する。本実施形態の製造方法は、マイクロ波電源を用いて大気圧下で気体を電離して生成したプラズマ（以下、「マイクロ波励起プラズマ」という。）を、水又は水を含む組成物に照射する工程（以下、「マイクロ波励起プラズマ照射工程」という。）を含む。
［マイクロ波励起プラズマ照射工程］
（マイクロ波励起プラズマの発生）
　マイクロ波励起プラズマは、例えば、図１に例示するようなプラズマ発生システムを用いて、発生させることができる。図１に例示するプラズマ発生システム１００では、プラズマ発生装置１とマイクロ波電源２とが、同軸ケーブル３で接続されている。また、プロセスガスとして気体を供給するガスボンベ４から、ガス供給管５を介して、プラズマ発生装置１に気体が供給される。マイクロ波電源２により発生されたマイクロ波は、同軸ケーブル３を介して、プラズマ発生装置１に伝送される。プラズマ発生装置１では、マイクロ波により気体が電離し、プラズマ発生領域においてプラズマが発生する。
　マイクロ波励起プラズマの発生方法は、図１に例示したシステムに限定されず、マイクロ波励起プラズマを発生可能な装置、システム等を特に制限なく用いることができる。マイクロ波励起プラズマを発生するための装置又はシステムは、市販のものを用いてもよい。
　本明細書において、「マイクロ波」とは、周波数３００ＭＨｚ～３００ＧＨｚの範囲の電波を指す。本実施形態の製造方法に用いるマイクロ波としては、特に限定されないが、例えば、周波数９００ＭＨｚ～６ＧＨｚ、１．５ＧＨｚ～４ＧＨｚ、２ＧＨｚ～３ＧＨｚ、２．４ＧＨｚ～２．５ＧＨｚの範囲のものを用いることができる。
　マイクロ波を発生させる際のマイクロ波電源の投入電力としては、２０～２０００Ｗが挙げられる。一例として、マイクロ波電源の投入電力は、５０Ｗとすることができる。
　マイクロ波で電離する気体（プロセスガス）としては、特に限定されないが、例えば、酸素、窒素、二酸化炭素、空気、希ガス（ヘリウム、アルゴン、ネオン等）等が挙げられる。
　プラズマ発生の際のプロセスガスの流速としては、特に限定されないが、０．５～１０　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｌｉｔｅｒ／分（ｓｌｍ）が挙げられる。一例として、プロセスガスの流速は、２　ｓｌｍとすることができる。プロセスガスの流速は、例えば、マスフローコントローラを用いて制御することができる。
　マイクロ波励起プラズマのプラズマ条件の一例を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（プラズマの照射）
　本実施形態の製造方法においては、水又は水を含む組成物に、マイクロ波励起プラズマを照射する。水にマイクロ波励起プラズマを照射することにより、過酸化水素、亜硝酸イオン等が生成される。水を含む組成物にマイクロ波励起プラズマを照射すると、当該組成物に含まれる水において、過酸化水素、亜硝酸イオン等が生成される。これらの過酸化水素、亜硝酸イオン等の物質により、マイクロ波励起プラズマを照射された水又は水を含む組成物は、がん細胞特異的な細胞死誘導活性を有するようになる。
　水を含む組成物は、特に限定されず、水を含んでいればよい。水を含む組成物は、水溶液であってもよく、エマルションであってもよく、懸濁液であってもよく、ゲル状であってもよい。一例として、水を含む組成物は、水溶液である。
　水を含む組成物における水の含有量としては、例えば、５０～９９．９９質量％、６０～９９．９９質量％、７０～９９．９９質量％、８０～９９．９９質量％、９０～９９．９９質量％等が挙げられる。
　水を含む組成物としては、例えば、正常細胞に対して細胞傷害活性を示さないものが挙げられる。そのような組成物としては、細胞培養用の培地、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、各種緩衝液（リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸緩衝液など）等が挙げられる。細胞培養用の培地は、特に限定されず、細胞培養に一般的に用いられる培地を用いることができる。例えば、ヒト細胞の培養用培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）、イーグル最少必須培地、グラスゴー最少必須培地、栄養混合物Ｆ－１２ハム、イスコフ改変ダルベッコ培地、ＲＰＭＩ－１６４０、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ハンクス平衡塩類溶液等が例示されるが、これらに限定されない。また、市販の細胞培養用培地を用いてもよい。
　水又は水を含む組成物に対するマイクロ波励起プラズマの照射は、例えば、図１に例示するように行うことができる。具体的には、プラズマ発生装置１のプラズマ発生領域の下方に、水又は水を含む組成物１１を入れた容器１０を置き、マイクロ波励起プラズマを発生させる。これにより、水又は水を含む組成物１１に、マイクロ波励起プラズマが照射される。プラズマ噴出口６から、水又は水を含む組成物のプラズマ照射面までの距離としては、１～３０ｍｍ、２～２０ｍｍ、３～１５ｍｍ等を例示できる。
　水又は水を含む組成物に対するマイクロ波励起プラズマの照射時間としては、例えば、１０秒以上、２０秒以上、３０秒以上、６０秒以上、又は１００秒以上が挙げられる。照射時間の上限は、特に限定されないが、エネルギー投入量と細胞死誘導活性とのバランスから、例えば、５分以下、４分以下、又は３分以下が挙げられる。マイクロ波励起プラズマの照射時間の範囲としては、２０秒～５分、３０秒～４分、６０～２００秒、１００～１８０秒等が例示される。
　マイクロ波励起プラズマを照射した水又は水を含む組成物は、がん細胞に対して細胞死誘導活性を示すが、正常細胞に対しては細胞死誘導活性を示さない。そのため、がん細胞特異的に細胞死を誘導する細胞死誘導剤として用いることができる。
　また、本実施形態の製造方法により製造された細胞死誘導剤は、６０Ｈｚ大気圧プラズマを照射して製造された細胞死誘導剤よりも、がん細胞に対する細胞死誘導効果が高い。
そのため、がん細胞を効率よく殺傷することができる。
　本実施形態の製造方法により製造された細胞死誘導剤が、細胞死を誘導し得るがん細胞としては、上皮腫瘍細胞、造血器腫瘍細胞、肉腫細胞等が挙げられる。上皮腫瘍細胞としては、子宮頸がん細胞、肺がん細胞、肝がん細胞、胃がん細胞、大腸がん細胞、乳がん細胞、膀胱がん細胞、前立腺がん細胞、卵巣がん細胞、皮膚がん細胞、咽頭がん細胞、舌がん細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。がん細胞が由来する生物は、特に限定されず、ヒト、ヒト以外の哺乳類（ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、サル等）が例示される。
［他の工程］
　本実施形態の製造方法は、上記マイクロ波励起プラズマ照射工程に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、マイクロ波励起プラズマ照射後の水又は水を含む組成物を希釈する工程（希釈工程）、マイクロ波励起プラズマ照射後の水又は水を含む組成物に他の成分を添加する工程（成分添加工程）等が挙げられる。
（希釈工程）
　本実施形態の製造方法は、上記マイクロ波励起プラズマ照射工程の後に、希釈工程を含んでいてもよい。マイクロ波励起プラズマ照射後の水又は水を含む組成物は、１０倍程度まで希釈しても、がん細胞に対する細胞死誘導活性を有する。そのため、マイクロ波励起プラズマ照射後の水又は水を含む組成物を、１．１～１０倍程度、又は１．１～５倍程度、１．１～３倍程度に希釈して、がん細胞の細胞死誘導剤としてもよい。
　希釈は、マイクロ波励起プラズマ照射前の水又は水を含む組成物を用いて行ってもよく、他の水溶液を用いて行ってもよい。
（成分添加工程）
　本実施形態の製造方法は、上記マイクロ波励起プラズマ照射工程の後に、成分添加工程を含んでいてもよい。添加する成分としては、例えば、正常細胞の生存に必要な成分等が挙げられる。例えば、水にマイクロ波励起プラズマを照射した場合には、マイクロ波励起プラズマ照射後の水に、アミノ酸、糖類、ビタミン類、無機塩類等の培地成分を添加してもよい。そのような培地成分を添加することにより、がん細胞に細胞死を誘導する一方、正常細胞の生存率を高めることができる。
≪がん細胞の細胞死誘導方法≫
［第１実施形態］
　一実施形態において、本発明は、上記実施形態の製造方法により製造されたがん細胞の細胞死誘導剤（以下、「本がん細胞死誘導剤」という。）を、がん細胞に接触させる工程を含む、がん細胞の細胞死誘導方法を提供する。
　本実施形態の方法において、本がん細胞死誘導剤と接触させるがん細胞は、特に限定されず、上記「≪がん細胞の細胞死誘導剤の製造方法≫」で挙げたがん細胞と同様のものが挙げられる。
　一態様において、本がん細胞死誘導剤とがん細胞との接触は、生体外（ｅｘ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で行われる。この場合、がん細胞は、培養細胞であってもよく、生体から採取されたがん細胞であってもよい。なお、本明細書において、「培養細胞」とは、生体外において、任意の時間培養された細胞を指す。培養時間は、特に限定されず、例えば、１時間以上であってよい。がん細胞が培養細胞である場合、樹立されたがん細胞株であってもよい。
　また、がん細胞は、正常細胞が混在する細胞集団中のがん細胞であってもよい。本がん細胞死誘導剤は、がん細胞に対しては高い細胞死誘導活性を有するが、正常細胞に対しては細胞死誘導活性を有しない。そのため、がん細胞と正常細胞とが混在する細胞集団に、本がん細胞死誘導剤を接触させた場合、がん細胞のみに細胞死が誘導される。これにより、がん細胞と正常細胞とが混在する細胞集団において、がん細胞のみを選択的に殺傷することができる。
　本がん細胞死誘導剤を、生体外で、がん細胞と接触させる場合、接触方法は特に限定されない。例えば、がん細胞が培養細胞である場合、がん細胞を培養している培地に、本がん細胞死誘導剤を添加してもよい。あるいは、がん細胞を培養している培地を、本がん細胞死誘導剤で置換してもよい。また、がん細胞が生体から採取された細胞である場合、採取した細胞を本がん細胞死誘導剤に懸濁してもよい。
　本がん細胞死誘導剤を、生体外で、がん細胞と接触させる場合、本がん細胞死誘導剤とがん細胞との接触時間は、例えば、５時間以上、１０時間以上、１５時間以上、又は２０時間以上とすることができる。接触時間の上限は、特に限定されないが、例えば、５０時間以下とすることができる。また、本がん細胞死誘導剤が、ＤＭＥＭ培地等の細胞培養培地にマイクロ波照射プラズマを照射して製造されたものである場合、そのまま本がん細胞死誘導剤の存在下で培養を続けてもよい。がん細胞と正常細胞とが混在している場合、本がん細胞死誘導剤の存在下で培養を続けることにより、がん細胞の比率が低下し、正常細胞の比率が上昇した細胞集団を得ることができる。あるいは、正常細胞のみで構成される細胞集団を得ることができる。
　なお、本がん細胞死誘導剤とがん細胞との接触期間中の条件は、通常の細胞培養の条件と同様の条件とすることができる。例えば、ヒト細胞である場合、接触期間中の条件として、３１０Ｋ、５％　ＣＯ２等が例示される。
　一態様において、本がん細胞死誘導剤とがん細胞との接触は、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で行ってもよい。この場合、がん細胞は、生体内で発生した腫瘍中のがん細胞であり得る。
　本がん細胞死誘導剤を、生体内で、がん細胞と接触させる場合、接触方法は特に限定されない。例えば、点滴や注射等により、腫瘍部位又は腫瘍近傍に、本がん細胞死誘導剤を投与してもよい。あるいは、手術で腫瘍を摘出した後、摘出部位に本がん細胞死誘導剤を投与し、摘出部位に残存するがん細胞に本がん細胞死誘導剤を接触させてもよい。また、がん細胞がメラノーマ細胞等の皮膚がん細胞である場合、病変部位に、本がん細胞死誘導剤を塗布してもよい。
　本がん細胞死誘導剤は、正常細胞に対しては細胞死を誘導しないため、生体に投与した場合であっても、正常細胞を殺傷することなく、がん細胞のみを殺傷することができる。
［第２実施形態］
　一実施形態において、本発明は、マイクロ波電源を用いて大気圧下で気体を電離して発生させたプラズマ（マイクロ波励起プラズマ）を、がん細胞に照射する工程を含む、がん細胞の細胞死誘導方法を提供する。
　マイクロ波励起プラズマの発生方法としては、上記「≪がん細胞の細胞死誘導剤の製造方法≫」で例示した方法と同様の方法が例示される。
　また、マイクロ波励起プラズマを照射するがん細胞は、特に限定されず、上記「≪がん細胞の細胞死誘導剤の製造方法≫」で挙げたがん細胞と同様のものが挙げられる。
　一態様において、がん細胞に対するマイクロ波励起プラズマの照射は、生体外（ｅｘ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で行われる。この場合、がん細胞は、培養細胞であってもよく、生体から採取されたがん細胞であってもよい。がん細胞が培養細胞である場合、樹立されたがん細胞株であってもよい。また、がん細胞は、正常細胞が混在する細胞集団中のがん細胞であってもよい。
　細胞にマイクロ波励起プラズマを照射すると、細胞の細胞内液中に、過酸化水素、亜硝酸イオン等が生成される。細胞ががん細胞である場合、これらの過酸化水素、亜硝酸イオン等の物質により、がん細胞の細胞死が誘導される。一方、細胞が正常細胞である場合、正常細胞の細胞死は誘導されない。そのため、がん細胞と正常細胞とが混在する細胞集団に、マイクロ波励起プラズマを照射した場合、がん細胞のみに細胞死が誘導される。これにより、がん細胞と正常細胞とが混在する細胞集団において、がん細胞のみを選択的に殺傷することができる。
　がん細胞に対するマイクロ波励起プラズマの照射は、例えば、図１において、容器１０内の水又は水を含む組成物１１を、がん細胞に置き換えることにより行うことができる。例えば、プラズマ発生装置１のプラズマ発生領域の下方に、がん細胞を入れた容器１０を置き、マイクロ波励起プラズマを発生させる。これにより、がん細胞にマイクロ波励起プラズマが照射される。プラズマ噴出口６から、がん細胞までの距離としては、１～３０ｍｍ、２～２０ｍｍ、３～１５ｍｍ等を例示できる。
　がん細胞に対するマイクロ波励起プラズマの照射時間としては、例えば、２０秒以上、３０秒以上、６０秒以上、又は１００秒以上が挙げられる。照射時間の上限は、特に限定されないが、エネルギー投入量と細胞死誘導活性とのバランスから、例えば、５分以下、４分以下、又は３分以下が挙げられる。マイクロ波励起プラズマの照射時間の範囲としては、２０秒～５分、３０秒～４分、６０～２００秒、１００～１８０秒等が例示される。
　また、マイクロ波励起プラズマを照射するがん細胞は、水又は水を含む組成物（細胞培養用の培地、緩衝液など）に懸濁されていてもよい。例えば、がん細胞が培養細胞である場合、培地中のがん細胞にマイクロ波励起プラズマを照射してもよい。あるいは、がん細胞を培地や緩衝液に懸濁し、当該培地や緩衝液とともにがん細胞にマイクロ波励起プラズマを照射してもよい。
　この場合、マイクロ波励起プラズマの照射により、がん細胞の細胞内液中に加えて、培地や緩衝液中にも、過酸化水素、亜硝酸イオン等が生成される。これらの過酸化水素、亜硝酸イオン等の物質により、がん細胞の細胞死が誘導される。
　一態様において、がん細胞に対するマイクロ波励起プラズマの照射は、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）のがん細胞に対して行ってもよい。この場合、がん細胞は、生体内で発生した腫瘍中のがん細胞であり得る。
　生体内のがん細胞に対しても、図１に例示されるようなプラズマ発生システムを用いて、マイクロ波励起プラズマの照射を行うことができる。例えば、プラズマ発生装置１のプラズマ発生領域の下方に、腫瘍部位を配置し、マイクロ波励起プラズマを発生させる。これにより、当該腫瘍中のがん細胞に、マイクロ波励起プラズマが照射される。プラズマ噴出口６から、腫瘍部位までの距離としては、１～３０ｍｍ、２～２０ｍｍ、３～１５ｍｍ等を例示できる。
　生体内のがん細胞が、皮膚がん（メラノーマなど）等の体表に存在する腫瘍中のがん細胞である場合、当該体表の病変部位に対してマイクロ波励起プラズマを照射すればよい。また、生体内のがん細胞が、体表近傍に存在する腫瘍中のがん細胞である場合、当該腫瘍が存在する部位の体表に対して、マイクロ波励起プラズマを照射すればよい。また、生体内のがん細胞が、体内に存在する腫瘍中のがん細胞である場合、手術で腫瘍部位を露出させ、露出した腫瘍に対してマイクロ波励起プラズマを照射してもよい。あるいは、手術で腫瘍を摘出した後、摘出部位にマイクロ波励起プラズマを照射し、摘出部位に残存するがん細胞の細胞死を誘導してもよい。
　生体内のがん細胞に対して、マイクロ波励起プラズマを照射した場合、がん細胞の細胞内液及びがん細胞近傍の細胞外液（間質液、血漿、リンパなど）中に、過酸化水素、亜硝酸イオン等が生成する。これらの過酸化水素、亜硝酸イオン等の物質により、がん細胞の細胞死が誘導される。一方、正常細胞の細胞死は誘導されないため、生体内のがん細胞に対してマイクロ波励起プラズマを照射した場合であっても、正常細胞を殺傷することなく、がん細胞のみを選択的に殺傷することができる。
　以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］がん細胞の細胞死誘導剤の製造
　図１に例示するプラズマ発生システム１００と同様のプラズマ発生システムを用いて、マイクロ波励起プラズマを発生させた。マイクロ波電源には２．４５ＧＨｚマイクロ波電源を用い、マイクロ波電源とプラズマ発生装置とを、同軸ケーブル及びスリースタブチューナを介して接続した。マイクロ波電力は、５０Ｗに設定した。プロセスガスとしてアルゴンガスを使用した。アルゴンガスの流速は、マスフローコントローラを用いて、２　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｌｉｔｅｒ／分（ｓｌｍ）に固定した。
　全量３ｍＬのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地、カタログｎｏ．５７９６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を３５ｍｍディッシュに入れ、プラズマ発生装置の下方に置いた。プラズマ発生装置において、大気圧下で、アルゴンガスを２．４５ＧＨｚのマイクロ波で電離してプラズマを発生させ、ＤＭＥＭ培地にプラズマを所定時間照射した。プラズマ噴出口とＤＭＥＭ培地のプラズマ照射面との距離は、５ｍｍとした。プラズマ照射後のＤＭＥＭ培地を、がん細胞の細胞死誘導剤（以下、「がん細胞死誘導剤」という。）として以下の実施例に用いた。
　なお、２．４５ＧＨｚのマイクロ波で発生させたプラズマのプラズマプルームの長さは、プラズマ噴出口から約１３ｍｍであった。また、プラズマの電子密度は、約７．３×１０１４ｃｍ－３であった。
［実施例２］細胞増殖アッセイ
　実施例１に記載の方法でがん細胞死誘導剤を製造した。ＤＭＥＭ培地に対するマイクロ波励起プラズマの照射時間は３０秒とした。
　細胞増殖アッセイ用の細胞として、ＨｅＬａ細胞（ヒト上皮腫瘍細胞）及びＭＣＦ１０Ａ細胞（ヒト乳房上皮細胞）を用いた。これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン（１００　Ｕ／ｍＬ）－ストレプトマイシン（１００　μｇ／ｍＬ）を補充したＤＭＥＭ培地で培養し、３１０Ｋ、５％　ＣＯ２の加湿されたインキュベータで維持した。
　次に、ＨｅＬａ細胞又はＭＣＦ１０ＡをＤＭＥＭ培地に懸濁し、その懸濁液２００μＬを、９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、２４時間培養した。細胞濃度は、１０，０００個／ウェルとした。続いて、各ウェルから２００μＬの培地を除去し、２００μＬのがん細胞死誘導剤を添加して、再度培養した。２０時間後、各ウェルからがん細胞死誘導剤を除去し、３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－５－（３ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，　ｉｎｎｅｒ　ｓａｌｔ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ）を含有するＤＭＥＭ培地を１００μＬ添加した。１時間培養した後、４９０ｎｍの吸光度（生細胞の数に直線的に比例する）を測定した。
　細胞増殖アッセイの結果を図２に示す。図２（Ａ）は、がん細胞死誘導剤で処理したＭＣＦ１０Ａ細胞及びＨｅＬａ細胞の細胞生存率を示す。細胞生存率は、プラズマ非照射のＤＭＥＭ培地で培養したコントロール細胞における吸光度を１としたときの相対値で示した。図２（Ａ）に示されるように、ＨｅＬａ細胞では、がん細胞死誘導剤で培養することにより、細胞生存率が大きく低下した。一方、ＭＣＦ１０Ａ細胞では、がん細胞死誘導剤で培養しても、細胞生存率はそれほど低下しなかった。
　図２（Ｂ）は、がん細胞死誘導剤を、ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充しないＤＭＥＭ培地で１倍、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍又は２５６倍に希釈し、当該希釈したがん細胞死誘導剤で細胞増殖アッセイを行った結果を示す。細胞生存率は、プラズマ非照射のＤＭＥＭ培地で培養したコントロール細胞における吸光度を１としたときの相対値で示した。図２（Ｂ）に示されるように、ＭＣＦ１０Ａ細胞では、いずれの希釈率でも、細胞生存率は０．８以上だった。一方、ＨｅＬａ細胞では、１倍及び２倍希釈したがん細胞死誘導剤で培養した場合、細胞生存率は０．１以下だった。がん細胞死誘導剤の希釈率が４倍以上の範囲では、希釈率が大きくなるほど、ＨｅＬａ細胞の細胞生存率が上昇した。
　これらの結果は、正常細胞であるＭＣＦ１０Ａ細胞においては、がん細胞死誘導剤の濃度に関わらず、細胞死は誘導されないのに対し、がん細胞であるＨｅＬａ細胞においては、がん細胞死誘導剤の濃度に依存して細胞死が誘導されることを示している。
［実施例３］過酸化水素濃度、亜硝酸イオン濃度の測定
　実施例１に記載の方法でがん細胞死誘導剤を製造した。ＤＭＥＭ培地に対するマイクロ波励起プラズマの照射時間は、１０～１８０秒の間で変化させた。
（過酸化水素濃度の測定）
　がん細胞死誘導剤に０．２５Ｍのリン酸ナトリウムを添加して、がん細胞死誘導剤を適当な濃度に希釈した。希釈したがん細胞死誘導剤５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。続いて、各ウェルに、５０μＬのＡｍｐｌｅｘ　ＲｅｄＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。室温、遮光下で３０分間培養した後、マイクロプレートリーダー（Ｐｏｗｅｒｓｃａｎ　ＨＴ、ＤＳ　Ｐｈａｒｍａ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を用いて、５６０ｎｍの吸光度を測定した。測定された吸光度から、プラズマ照射する前のＤＭＥＭ培地の吸光度を差し引いた。過酸化水素の絶対濃度は、０．２５Ｍのリン酸ナトリウムを用いて２０μＭまで希釈した過酸化水素の検量線により算出した。
（亜硝酸イオン濃度の測定）
　がん細胞死誘導剤に純水を添加して、がん細胞死誘導剤を適当な濃度に希釈した。希釈したがん細胞死誘導剤５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。続いて、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｇｉｂｃｏ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；５０μＬ）を各ウェルに添加した。さらに、１００μＬのＯｘｉｓＳｅｌｅｃｔ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ（ｎｉｔｒｉｔｅ／ｎｉｔｒａｔｅ）　ａｓｓａｙ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｉｎｃ．）を各ウェルに添加した。室温で１０分間培養した後、マイクロプレートリーダーを用いて、５４０ｎｍの吸光度を測定した。測定された吸光度から、プラズマ照射する前のＤＭＥＭ培地の吸光度を差し引いた。亜硝酸イオンの絶対濃度は、純水を用いて１４０μＭまで希釈した亜硝酸イオンの検量線により算出した。
　マイクロ波励起プラズマの照射時間と、がん細胞死誘導剤における過酸化水素濃度及び亜硝酸イオン濃度との関係を図３に示す。がん細胞死誘導剤における過酸化水素濃度及び亜硝酸イオン濃度は、６．０μＭ／秒及び２．２μＭ／秒の割合でそれぞれ増加した。プラズマ照射時間３０秒の場合、がん細胞死誘導剤における過酸化水素濃度は１８０μＭであり、亜硝酸イオン濃度は７７μＭであった。
［実施例４］６０Ｈｚ大気圧プラズマで製造したがん細胞死誘導剤との比較（照射時間）
　実施例１に記載の方法でがん細胞死誘導剤（以下、「がん細胞死誘導剤（マイクロ波励起プラズマ）」という。）を製造した。また、ＤＭＥＭ培地に、６０Ｈｚ非平衡大気圧プラズマを照射して、がん細胞死誘導剤（以下、「がん細胞死誘導剤（６０Ｈｚ大気圧プラズマ）」という。）を製造した。６０Ｈｚ非平衡大気圧プラズマの照射は、特開２０１６－１６９１６４号公報に記載の方法で行った。ＤＭＥＭ培地に対する、マイクロ波励起プラズマ又は６０Ｈｚ非平衡大気圧プラズマの照射時間は、３０秒、６０秒、１２０秒、又は１８０秒とした。
　がん細胞死誘導剤（マイクロ波励起プラズマ）及びがん細胞死誘導剤（６０Ｈｚ大気圧プラズマ）を用いて、実施例２と同様の方法で、細胞増殖アッセイを行った。細胞増殖アッセイの細胞としては、ＨｅＬａ細胞を用いた。
　細胞増殖アッセイの結果を図４に示す。図４中、「６０Ｈｚ大気圧プラズマ」は、がん細胞死誘導剤（６０Ｈｚ大気圧プラズマ）による結果を示す。「マイクロ波励起プラズマ」は、がん細胞死誘導剤（マイクロ波励起プラズマ）による結果を示す。細胞生存率は、プラズマ非照射のＤＭＥＭ培地で培養したコントロール細胞における吸光度を１としたときの相対値で示した。
　図４に示されるように、がん細胞死誘導剤（マイクロ波励起プラズマ）では、いずれの照射時間でも、細胞生存率が０．２５以下であった。マイクロ波励起プラズマの照射時間が長くなるほど細胞生存率が低下し、照射時間が１２０秒及び１８０秒のものでは、細胞生存率は０．１以下であった。
　一方、がん細胞死誘導剤（６０Ｈｚ大気圧プラズマ）でも、照射時間が長くなるほど細胞生存率が低下したが、照射時間が１２０秒のものでも、細胞生存率は０．４以上であった。
［実施例５］６０Ｈｚ大気圧プラズマで製造したがん細胞死誘導剤との比較（照射距離）
　実施例１に記載の方法でがん細胞死誘導剤（マイクロ波励起プラズマ）を製造した。また、ＤＭＥＭ培地に、６０Ｈｚ非平衡大気圧プラズマを照射して、がん細胞死誘導剤（６０Ｈｚ大気圧プラズマ）を製造した。プラズマ噴出口とＤＭＥＭ培地のプラズマ照射面との距離は、３～１３ｍｍの間で変化させた。なお、プラズマ照射時間は、３０秒とした。
　がん細胞死誘導剤（マイクロ波励起プラズマ）及びがん細胞死誘導剤（６０Ｈｚ大気圧プラズマ）を用いて、実施例２と同様の方法で、細胞増殖アッセイを行った。細胞増殖アッセイの細胞としては、ＨｅＬａ細胞を用いた。
　細胞増殖アッセイの結果を図５に示す。図５中、「６０Ｈｚ大気圧プラズマ」は、がん細胞死誘導剤（６０Ｈｚ大気圧プラズマ）による結果を示す。また、「マイクロ波励起プラズマ」は、がん細胞死誘導剤（マイクロ波励起プラズマ）による結果を示す。細胞生存率は、プラズマ非照射のＤＭＥＭ培地で培養したコントロール細胞における吸光度を１としたときの相対値で示した。
　図５に示されるように、がん細胞死誘導剤（マイクロ波励起プラズマ）では、いずれの照射距離でも、細胞生存率が０．１０以下であった。照射距離によって、細胞生存率に大きな差は認められなかった。
　一方、がん細胞死誘導剤（６０Ｈｚ大気圧プラズマ）では、照射距離が小さくなるほど、細胞生存率が低下した。しかし、いずれの照射距離でも、細胞生存率は０．４以上であった。
　実施例４及び５の結果から、がん細胞死誘導剤（マイクロ波励起プラズマ）は、がん細胞死誘導剤（６０Ｈｚ大気圧プラズマ）と比較して、がん細胞の細胞死誘導活性が高いことが示された。
　１　プラズマ発生装置
　２　マイクロ波電源
　３　同軸ケーブル
　４　ガスボンベ
　５　ガス供給管　
　６　プラズマ噴出口
　１０　容器
　１１　水又は水を含む組成物
　１００　プラズマ発生システム

Claims (6)

  1. 　マイクロ波電源を用いて大気圧下で気体を電離して生成したプラズマを、水又は水を含む組成物に照射する工程を含む、がん細胞の細胞死誘導剤の製造方法。
  2. 　前記マイクロ波の周波数が、９００ＭＨｚ～６ＧＨｚである、請求項１に記載のがん細胞の細胞死誘導剤の製造方法。
  3. 　請求項１又は請求項２に記載の製造方法により製造されたがん細胞の細胞死誘導剤を、がん細胞に接触させる工程を含む、がん細胞の細胞死誘導方法。
  4. 　マイクロ波電源を用いて大気圧下で気体を電離して生成したプラズマを、がん細胞に照射する工程を含む、がん細胞の細胞死誘導方法。
  5. 　前記マイクロ波の周波数が、９００ＭＨｚ～６ＧＨｚである、請求項４に記載のがん細胞の細胞死誘導方法。
  6. 　前記がん細胞が、水又は水を含む組成物内に配置されている、請求項４又は５に記載のがん細胞の細胞死誘導方法。
PCT/JP2018/030924 2017-08-23 2018-08-22 がん細胞の細胞死誘導剤の製造方法、及びがん細胞の細胞死誘導方法 WO2019039496A1 (ja)

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