WO2019017384A1 - ペプチド誘導体及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

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豊雅 片桐
哲郎 吉丸
宮本　貴史
康秀 岡本
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国立大学法人徳島大学
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Definitions

  • the present invention relates to peptide derivatives useful for cancer treatment and pharmaceutical compositions containing the same.
  • the estrogen receptor alpha (Estrogen-receptor: ERalpha) plays a central role in the development and progression of breast cancer.
  • Recent endocrine therapies for breast cancer use selective ER ⁇ modulators (eg, tamoxifen and raloxifene), ER ⁇ downregulators (eg, fulvestrant), and aromatase inhibitors (Aromatase inhibitors: AI), and ER ⁇ signaling
  • ER ⁇ modulators eg, tamoxifen and raloxifene
  • ER ⁇ downregulators eg, fulvestrant
  • aromatase inhibitors aromatase inhibitors
  • ER ⁇ signaling The main targets are (1) to (3).
  • the method using tamoxifen which inhibits the growth of breast cancer cells through competitive binding to ER ⁇ is a standard therapy for ER ⁇ positive breast cancer patients.
  • Non-patent Documents 4 and 5 tamoxifen therapy is often not effective and patients may relapse and die from endocrine therapy resistant tumors.
  • AIs that block estrogen synthesis, compared to tamoxifen, produce substantial clinical effects such as good efficacy, significant prolongation of recurrence-free survival, and prolongation of relapse time in menopausal women, Some patients who received AI therapy relapse (Non-patent Documents 6 and 7).
  • the exact molecular events that affect the efficacy of these endocrine therapies have not yet been elucidated.
  • the complex of the tumor-specific protein brefeldin A-inhibited guanine nucleotide exchange protein 3 (brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3: BIG3) with the tumor suppressor prohibitin 2 (prohibitin 2: PHB2) is ER ⁇ positive It plays a central role in estrogen signal regulation in breast cancer (Non-patent Documents 8 and 9).
  • BIG3 inhibits the ability of PHB2 to bind to PHB2 and inhibit estrogen-dependent transcriptional activation, resulting in constitutive ER ⁇ activity. Based on these findings, a strategy of releasing PHB2 from the complex with BIG3 by inhibiting BIG3-PHB2 interaction and exerting the tumor suppressor activity of PHB2 may be a novel therapy for breast cancer.
  • Patent Document 1 a dominant negative peptide of BIG3 that specifically inhibits the BIG3-PHB2 interaction.
  • this peptide inhibits the ER ⁇ signal pathway leading to the growth of breast cancer and is confirmed to suppress the growth of breast cancer.
  • the growth inhibitory effect of breast cancer cells by the dominant negative peptide of BIG3 has been clarified.
  • the known dominant negative peptides were not very stable and the duration of the inhibitory effect on the BIG3-PHB2 interaction was not very long. Therefore, the present inventors have found that by introducing a stapling structure into the molecule of the above-mentioned dominant negative peptide, the duration of the inhibitory effect on the BIG3-PHB2 interaction is improved.
  • PCT / JP 2017/001187 Yoshimaru, T. et al., Sci Rep. 7 (1), 1821 (2017). It was confirmed that the peptide (staple peptide; stERAP No.
  • an object of the present invention is to provide a peptide having a longer duration of inhibitory effect on BIG3-PHB2 interaction.
  • the present inventors have found that the introduction of a stapling structure into the above-described dominant negative peptide molecule improves the duration of the inhibitory effect on the BIG3-PHB2 interaction, Furthermore, it discovered that stability was enhanced by increasing intramolecular crosslinking, and completed the present invention.
  • the present invention provides the following peptides, as well as their uses:
  • a peptide comprising an amino acid sequence in which at least two pairs of amino acid residues in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 have been replaced with the same number of stapling structures, or salts thereof; [2] The peptide according to [1] or a salt thereof, wherein two pairs of amino acid residues are replaced by two stapling structures; [3] The peptide according to [1] or [2], or a salt thereof, wherein the two pairs of amino acid residues are the following (a) and (b): (A) the third and seventh amino acid residues from the N-terminus of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; (B) the eighth and twelfth amino acid residues from the N-terminus of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; [4] The peptide according to [1] or [2], or a salt thereof, wherein the two pairs of amino acid residues are the following (c) and (d):
  • the present invention provides a method for treating cancer, which comprises the step of administering the peptide according to any of the above [1] to [11], or a salt thereof to a subject in need of treatment.
  • the present invention also relates to the use of the peptide according to any one of the above [1] to [11] or a salt thereof in the manufacture of a pharmaceutical composition for treating cancer.
  • the present invention relates to the use of the peptide according to any one of the above [1] to [11], or a salt thereof, in the treatment of cancer.
  • the present invention also relates to a method for producing a pharmaceutical composition for treating cancer, which comprises the step of mixing or blending the peptide according to any one of the above [1] to [11], or a salt thereof with a carrier.
  • a peptide which has a longer duration of inhibitory effect on BIG3-PHB2 interaction.
  • the pharmaceutical composition containing the peptide of the present invention can be applied to the treatment of cancer.
  • FIG. 1 shows a schematic view of double stapled ERAP (No. 45 and No. 46).
  • FIG. 2 shows that double stapled ERAP stably suppresses the growth of estrogen-dependent human breast cancer cell lines in a stable manner.
  • FIG. 2A, B Human breast cancer cell line MCF-7 cells are treated with double stapled ERAP No. 45 (A) or double stapled ERAP No. 46 (B) and then immediately stimulated with 10 nM estrogen for 24 hours The inhibitory effect was evaluated in the MTT assay for up to 96 hours each time. Data represent the mean ⁇ standard deviation of three independent experiments.
  • FIG. 3 shows the chymotrypsin resistance of double stapled ERAP.
  • the chromatogram of double stapled ERAP No. 45 (A) and double stapled ERAP No. 46 (B) when reacting double stapled ERAP with chymotrypsin at 37 ° C. for 24 hours is shown.
  • FIG. 4 shows the results of MTT assay which showed no effect of double stapled ERAP No. 46 on proliferation of mammary epithelial cell MCF-10A cells.
  • MCF-10A cells were treated with double stapled ERAP at the concentrations indicated in the figure for up to 96 hours and cell proliferation was assessed every 24 hours.
  • FIG. 5 shows that double stapled ERAP No. 46 inhibits the interaction between BIG3 and PHB2.
  • A, B The inhibitory effect of double stapled ERAP No. 46 on BIG3-PHB2 interaction in MCF-7 cells was evaluated by Western blot. MCF-7 cells were treated with 1 ⁇ M and 10 ⁇ M of double stapled ERAP No. 46 and single stapled ERAP and then immediately stimulated with 10 nM estrogen for 24 hours (A) and 96 hours (B).
  • FIG. 6 is a schematic diagram of stapled ERAP synthesis.
  • FIG. 6 shows a synthetic scheme of amino acid derivatives used for stapled ERAP synthesis.
  • (I) to (vi) show the conditions of reagents and amino acid synthesis in each reaction: (i) 2,4-dimethoxybenzaldehyde, AcOH, MgSO 4 , CH 2 Cl 2 ; (ii) NaBH 4 , MeOH, CH 2 Cl 2, 87% yield (2 steps); (iii) compound 2, EDC ⁇ HCl, DIPEA, CH 2 Cl 2, 76% yield; (iv) LiOH ⁇ H 2 O, THF, MeOH, H 2 O (V) TBSOTf, 2,6-lutidine, CH 2 Cl 2 ; (vi) Fmoc-OSu, Na 2 CO 3 , THF, H 2 O, 90% yield (two steps).
  • FIG. 7 shows a scheme for the stapled synthesis of ERAP by ring closing olefin metathesis.
  • FIG. 8 shows a scheme for the stapled synthesis of ERAP via intramolecular amidation.
  • FIG. 9 shows that ESR1 mutant breast cancer cell lines bind PI3K in an estrogen independent manner.
  • A shows an immunoblot in which ER ⁇ and PI3K bind in the presence of estrogen in the ESR1 wild type breast cancer cell line. Lysates of MCF-7 cells transfected with FLAG-tagged ESR1 (WT) were immunoprecipitated with anti-FLAG antibody and immunoblotted using the antibodies shown in the figure.
  • FIG. 10 shows that ESR1 mutant breast cancer cell lines have high PKC ⁇ activity independent of estrogen.
  • A shows PKC ⁇ activity of breast cancer cell lines transfected with ESR1 mutant.
  • the MCF-7 cells transfected with each ESR1 mutant were treated with 100 nM of PI3K inhibitor wortmannin for 24 hours, and then immunoprecipitated with an anti-PKC ⁇ antibody to measure PKC ⁇ activity against PH39 peptide containing Ser39. Data represent the mean ⁇ standard error of three independent experiments. NS, no statistical significance, *** P ⁇ 0.001.
  • C An immunoblot in which the phosphorylated PKC ⁇ of MCF-7 cells transfected with the ESR1 mutant is PI3K dependent. After MCF-7 cells transfected with each ESR1 mutant were treated with stERAP and wortmannin for 24 hours, they were immunoprecipitated with anti-PKC ⁇ antibody and immunoblotted using the antibodies shown in the figure.
  • FIG. 11 shows the combined inhibitory effect of stERAP and an anti-estrogen agent on the growth of MCF-7 cells transfected with the ESR1 mutant.
  • Data represent the mean ⁇ standard error of three independent experiments. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001. It is a figure which shows the continuation of FIG. 11-1.
  • FIG. 12 shows the suppressive effect of stERAP on the growth of ESRF mutant transfected MCF-7 cells in the presence of estrogen.
  • Cell proliferation was evaluated when MCF-7 cells transfected with each ESR1 mutant were reacted with 10 ⁇ M stERAP for 24 hours in the presence of each estrogen concentration (0.1, 1, 10 nM).
  • Data represent the mean ⁇ standard error of three independent experiments. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001.
  • FIG. 13 shows the inhibitory effect of stERAP in the presence of estrogen on the ER ⁇ transcriptional activity of MCF-7 cells transfected with the ESR1 mutant.
  • FIG. 14 evaluated cell proliferation when MCF-7 cells knocked in with Y537S of ESR1 were reacted for 24 hours in the presence of each concentration of stERAP and 10 nM estrogen in the figure (horizontal axis). Data represent the mean ⁇ standard error of three independent experiments.
  • FIG. 15 shows that BIG3 functions as AKAP in HER2-positive breast cancer cell lines.
  • A shows the expression of BIG3 in HER2-positive breast cancer cell lines.
  • FIG. 1 shows the kinase activity and phosphatase activity of BIG3.
  • Cell lysates of SK-BR-3 cells treated with 10 ⁇ M H-89, 100 ⁇ g / mL trastuzumab and 10 nM lapatinib for 24 hours are immunoprecipitated with anti-BIG3 antibody, and its PKA activity and PP1C ⁇ activity are substrate for CREBtide and p-NPB Calculated as As a negative control, lysates of SK-BR-3 cells were immunoprecipitated with rat anti-IgG antibody.
  • Data represent the mean ⁇ SE of three independent experiments. *** P ⁇ 0.001.
  • FIG. 16 shows the activation mechanism of BIG3 in HER2-positive breast cancer cell lines.
  • BIG3 shows an immunoblot phosphorylated by PKA via HER2 signal.
  • Cell lysates of SK-BR-3 cells and KPL-4 cells treated with 10 ⁇ M H-89, 100 ⁇ g / mL trastuzumab and 10 nM lapatinib for 30 minutes are immunoprecipitated with anti-BIG3 antibody, and the antibody shown in the figure is used for immunoprecipitation. Blot analysis was performed.
  • FIG. 17 shows that BIG3 regulates PHB2 suppressive activity in HER2-positive breast cancer cell lines.
  • (A) shows an immunoblot in which BIG3 binds to PHB2 and regulates its phosphorylation.
  • FIG. 18 shows phosphorylation of PKC ⁇ -dependent PHB2 (Ser39).
  • A An immunoblot in which PHB2 (Ser39) is phosphorylated in a PKC ⁇ -dependent manner in HER2-positive breast cancer cell lines.
  • FIG. 19 shows that phosphorylated PHB2 (Ser39) suppresses transcriptional activity in the nucleus.
  • A shows an immunoblot in which transcription repressors NcoR and HDAC1 bind to the phosphorylation of PHB2 (ser39).
  • HA-tagged PHB2 construct (WT), alanine mutant of Ser39 (S39A), and glutamate mutant of Ser39 (S39E) are transfected into SK-BR-3 cells in which PHB2 expression is suppressed by siRNA method, and 48 After time, it was treated with 1 ⁇ M stERAP for 24 hours.
  • FIG. 20 shows threonine phosphorylation of PHB2 and its activation mechanism.
  • FIG. 1 shows immunoblots in which threonine phosphorylation of PHB2 is induced in a PKC ⁇ -independent manner in HER2-positive breast cancer cell lines.
  • siRNA method After treating SK-BR-3 cells in which expression of PKC ⁇ is suppressed by siRNA method with 1 ⁇ M stERAP and 100 ⁇ g / mL trastuzumab for 24 hours, the cell lysate is immunoprecipitated with anti-PHB2 antibody, and the antibody shown in the figure is used. Immunoblot analysis was performed.
  • (B) shows an immunoblot in which PHB2 is threonine-phosphorylated by TTK and MK5.
  • FIG. 21 shows the effect of threonine phosphorylation of PHB2 by TTK and MK5 on HER2 signal.
  • A, B Immunoblots showing that threonine phosphorylation of PHB2 by TTK and MK5 inhibits the binding of HER2-HER3 and HER2-Shc.
  • FIG. 1 shows an immunoblot that avoids the binding inhibition of HER2-HER3 and HER2-Shc by PHB2 by TTK inhibitors.
  • FIG. 22 shows the identification of the threonine phosphorylation site of PHB2.
  • A shows immunoblots evaluated that the threonine / phosphorylation sites of PHB2 are Thr42 and Thr169.
  • the body (T42A + T169A) was transfected and treated 48 hours later with 1 ⁇ M stERAP for 24 hours.
  • FIG. 1 shows immunoblots in which phosphorylation of Thr42 and Thr169 of PHB2 inhibits the binding of HER2-HER3 and HER2-Shc.
  • the body (T42 + T169) was transfected and treated 48 hours later with 1 ⁇ M stERAP for 24 hours.
  • FIG. 23 shows threonine phosphorylation of PHB2 by TTK and MK5.
  • A shows an immunoblot in which PHB2 and TTK bind. After treating SK-BR-3 cells with 1 ⁇ M stERAP for 24 hours, the cells are lysed, immunoprecipitated with anti-PHB2 antibody, anti-TTK antibody, and rabbit IgG antibody, and immunoblot analysis using the antibodies shown in the figure. did.
  • B, C Immunoblots with Phos-tag to evaluate threonine phosphorylation of PHB2 by TTK and MK5.
  • FIG. 24 shows the suppressive effect of stERAP on the proliferation of HER2-positive breast cancer cell lines.
  • FIG. 16 shows the results of MTT assay which evaluated the inhibitory effect of stERAP on the proliferation of HER2-positive breast cancer cell line. SK-BR-3 cells, BT-474 cells, and KPL-4 cells were reacted with stERAP for 24 hours. Data represent the mean ⁇ SE of three independent experiments.
  • FIG. 25 shows that stERAP inhibits the interaction of HER2-HER3 as well as HER2-Shc.
  • FIG. 7 shows an immunoblot in which stERAP inhibits the interaction of HER2-HER3 and HER2-Shc of HER2-positive breast cancer cell lines.
  • FIG. 26 shows the suppressive effect of stERAP on trastuzumab-resistant HER2-positive breast cancer cell line.
  • A shows the results of MTT assay which evaluated the inhibitory effect of stERAP on the growth of trastuzumab-resistant HER2-positive breast cancer cell line. Trastuzumab resistant SK-BR-3 cells were reacted with stERAP and trastuzumab for 24 hours. Data represent the mean ⁇ SE of three independent experiments. * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001.
  • B shows an immunoblot in which stERAP inhibits the interaction of HER2-HER3 and HER2-Shc of trastuzumab-resistant HER2-positive breast cancer cell line.
  • FIG. 27 shows the effect of stERAP on the NF- ⁇ B signal of trastuzumab-resistant HER2-positive breast cancer cell line.
  • FIG. 7 shows an immunoblot in which stERAP suppresses NF- ⁇ B nuclear translocation and I ⁇ B ⁇ phosphorylation of trastuzumab-resistant HER2-positive breast cancer cell line.
  • FIG. 28 shows the effect of stERAP on the cell cycle of trastuzumab-resistant HER2-positive breast cancer cell line.
  • Figure 5 shows FACS analysis showing the effect of stERAP on cell cycle.
  • FIG. 29 shows the in vivo antitumor effect of stERAP in trastuzumab-resistant HER2-positive breast cancer cells.
  • Figure 7 shows the inhibitory effect of stERAP on tumor growth in orthotopic transplant mouse models of KPL-4 cells and trastuzumab resistant SK-BR-3 cells. The left figure shows the change in tumor diameter of the group administered 150 ⁇ g / kg of stERAP every 7 days, and the right figure shows the weight change of the mouse.
  • FIG. 30 shows three types of stERAP (single stERAP, double stERAP # 45) against three types of breast cancer cell lines (SK-BR-3, BT-20, MDA-MB-231) and synovial sarcoma cell line SW982. 2 shows the results of examining the influence on cell proliferation given by double stERAP # 46).
  • FIG. 31 shows the cell cycle effects of two types of stERAP (single stERAP and double stERAP # 46) on SK-BR-3 cells (FIG.
  • FIG. 31A shows the result of the examination.
  • Each peptide was added at a concentration of 5 ⁇ M, and after 96 hours, cells were stained with Propidium Iodide (PI), and the fluorescence intensity of each cell was measured by a flow cytometer to create a histogram.
  • the ratio of the number of cells of each fine cycle (SubG1, G1, S, G2 / M,> 2N cells) is shown in the graph. It is a figure which shows the continuation of FIG. 31-1.
  • L-amino acids and D-amino acids described in the present specification may also include amino groups, carboxyl groups and side chains modified. Examples of preferable modifications include acetylation of an amino group, amidation of a carboxyl group, and addition of a tag peptide such as a FLAG tag or an HA tag.
  • BIG3 refers to brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3 (brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein).
  • BIG3 inhibits the function of PHB2 that suppresses estrogen-dependent transcriptional activation.
  • A7322 An example of a representative base sequence of human BIG3 gene is shown in SEQ ID NO: 6 (GenBank Accession No. NM — 020340.4), and the amino acid sequence encoded thereby is shown in SEQ ID NO: 7.
  • SEQ ID NO: 6 GenBank Accession No. NM — 020340.4
  • PHB2 refers to prohibitin 2.
  • PHB2 binds to the estrogen receptor to inhibit the estrogen receptor signaling pathway and suppresses estrogen-dependent cell proliferation.
  • the PHB 2 is also referred to as a “REA (Repressor of Estrogen Activity)”.
  • SEQ ID NO: 8 GenBank Accession No. NM_010114481.1
  • SEQ ID NO: 10 GenBank Accession No. NM_001267700.1
  • amino acid sequences encoded thereby are examples of representative nucleotide sequences of human PHB2 gene. It shows in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11, respectively.
  • PHB2 is not limited to one encoded by the above-mentioned base sequence, but also includes these isoforms and variants.
  • PHB2 peptide refers to a PHB2-derived peptide that inhibits the binding of BIG3 to PHB2.
  • estrogen receptor includes both estrogen receptor alpha (ER alpha) and estrogen receptor beta (ER beta). Estrogen receptors are translocated into the nucleus when estrogen binds, and bind to the enhancer sequence ERE on DNA to cause transcriptional activation of genes associated with cell proliferation. This induces estrogen dependent cell proliferation.
  • ER ⁇ and ER ⁇ are encoded by the ESR1 and ESR2 genes, respectively.
  • the nucleotide sequence of a representative human ESR1 gene is shown in SEQ ID NO: 12 (GenBank Accession No. NM — 0000125.3).
  • the nucleotide sequence of a representative human ESR2 gene is shown in SEQ ID NO: 14 (GenBank Accession No. NM — 0014377.2).
  • ER ⁇ and ER ⁇ are not limited to those encoded by the above base sequences, but also include isoforms and variants thereof.
  • the estrogen receptor is ER ⁇ .
  • EBP refers to a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 is a sequence consisting of the 165th to 177th or 165th to 178th amino acid residues of the amino acid sequence of BIG3 (SEQ ID NO: 7), and binds to PHB2.
  • ERAP has the ability to bind to PHB2, and competitively binding to PHB2 inhibits BIG3 from forming a complex with PHB2.
  • stapling structure refers to a structure in which two (one pair) amino acid residues in the amino acid sequence constituting a peptide are cross-linked. And, a peptide in which the original amino acid residue is substituted by one or more splicing structures is referred to herein as a "stapled peptide".
  • stERAP stapled ERAP
  • ERAP a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 It is a peptide.
  • short stapled ERAP is a peptide consisting of a partial sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 5 (short ERAP) in which at least one pair of amino acid residues is replaced with a stapling structure.
  • short stapled ERAP is also described as "sh stapled ERAP”.
  • a peptide in which the original amino acid residue is substituted by one stapling structure is referred to as “single stapled peptide” or “single cross-linked peptide", and the original amino acid residue is substituted by two stapling structures.
  • Peptides are referred to as “double stapled peptides” or “double crosslinked peptides”.
  • single stapled ERAP is a peptide (ERAP) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 with a pair of amino acid residues replaced with a stapling structure
  • double-stapled ERAP double-stapled ERAP
  • dsERAP, double stERAP, double-stapled ERAP means two pairs of amino acid residues in the peptide (ERAP) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 Is a peptide replaced with a stapling structure.
  • These stapled peptides can be called peptide derivatives or peptide analogs because they have a structure in which some of them are artificially replaced.
  • treatment includes alleviating or ameliorating at least one symptom caused by the target disease, suppressing the progression of the disease, suppressing the spread of the disease site, and the like.
  • treatment of cancer includes suppression of cancer cell growth, suppression of cancer progression, induction of regression and remission of cancer, alleviation and improvement of symptoms associated with cancer, suppression of cancer metastasis, Postoperative recurrence suppression and induction of survival time extension are included.
  • the peptide of the present invention is an amino acid in which n pairs (n is a natural number) of amino acid residues in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 has been replaced with n stapling structures. It is a peptide containing a sequence. n is preferably 3 or less, more preferably 2. Therefore, in the present invention, n pairs of amino acid residues usually refer to 1 to 3 pairs, 1 pair or 2 pairs, preferably 2 pairs of amino acid residues.
  • the amino acid residue to be substituted with the stapling structure is not particularly limited, but the 1st glutamine (Q) from the N-terminus of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 or 5; Since aspartic acid (D) and glutamine (Q) at position 9 are amino acid residues important for binding to PHB2, from the viewpoint of binding affinity to PHB2, SEQ ID NO: 4 (QMLSDLTLQLRQR) or SEQ ID NO: It is preferable to select from amino acid residues other than the 1st glutamine (Q), the 5th aspartic acid (D) and the 9th glutamine (Q) from the N-terminus of the amino acid sequence described in 5 (QMLSDLTLQLRQQ).
  • chymotrypsin resistance can be imparted by introducing a staple structure into leucine residue (L) among amino acid residues constituting a peptide.
  • L leucine residue
  • at least two pairs of amino acid residues including at least one L selected from the group consisting of third, sixth, eighth and tenth in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 5 are positions to be replaced with staple structures As preferred.
  • amino acid residues to be replaced by a splicing structure may include, for example, the following pairs of amino acid residues; (A) the third (L) and seventh amino acid residues (T) from the N-terminus of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; (B) Eighth (L) and twelfth amino acid residues (Q) from the N-terminus of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4; (C) third (L) and seventh amino acid residues (T) from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; and (d) from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 Th (L) and 14th amino acid residue (Q).
  • the stapling structure is not particularly limited.
  • peptide stapling techniques are known (eg, Blakwell, H. E. et al., Angew. Chem., Int. Ed. 37, 3281-3284 (1994); Aihara, K. et al., Tetrahedron). 71, 4183-4191 (2015), etc., and these known stapling techniques can be used to form stapling structures.
  • an amino acid derivative having a substituent such as an alkenyl group is incorporated and a peptide is synthesized by solid phase synthesis or the like, and an olefin metathesis reaction or an intramolecular amidation reaction is performed between the substituents of the amino acid derivative to form a stapling structure.
  • a stapling structure can be formed.
  • Commercially available amino acid derivatives can be used for forming the stapling structure.
  • a structure represented by the following formula (I) can be mentioned as an example of a preferable stapling structure.
  • the solid and dotted double lines indicate a single bond or a double bond.
  • the glutamine derivative of formula (III) can be synthesized, for example, according to the following scheme (III) (Aihara, K. et al., Tetrahedron 71, 4183-4191 (2015)).
  • the synthesis of stapled ERAP according to scheme (I) can be carried out, for example, as follows using the glutamine derivative of the above formula (III).
  • a pair of amino acid residues at positions where a stapling structure is to be formed is replaced with a glutamine derivative of formula (III), respectively.
  • the peptide is synthesized by peptide synthesis.
  • the Fmoc-protected peptide N-terminus is deprotected and acetylated, and then the acetylated peptide is treated with Hoveyda-Grubbs second generation catalyst to perform an olefin metathesis reaction.
  • the acid labile protecting group is deprotected and the peptide is released from the resin using a TFA / m-cresol / thioanisole / 1,2-ethanedithiol / H 2 O cocktail.
  • This makes it possible to obtain a stapled ERAP or sh stapled ERAP having a stapling structure of Formula (I) (a double bond of a solid line and a dotted line is a double bond).
  • the number of amino acid residues to be intervened between stapling structures is not particularly limited, but in general, 3 residues are preferable.
  • a structure in which a pair of amino acid residues flanking three residues is replaced with one stapling structure is an example of a preferable stapling structure in the present invention.
  • the stapling structure flanking three residues is effective in maintaining the alpha helical structure of the peptide.
  • glutamic acid derivatives of the formula (IV) can be used.
  • glutamine derivatives of the formula (V) can be synthesized, for example, according to the scheme shown in FIG. 6 (hereinafter, “scheme (IV)”). As shown in Scheme (IV), allyl (4-aminobutyl) carbamate (compound 1) is coupled with 2,4-dimethoxybenzaldehyde to give allyl [4- ⁇ (2,4-dimethoxybenzyl) amino ⁇ butyl ] Carbamate (compound 2) is obtained.
  • Compound 2 is coupled with N- ⁇ - (tert-butoxycarbonyl) -L-glutamic acid ⁇ -methyl ester (Compound 3) to give (S) -methyl-5- ⁇ (4-[ ⁇ (allyloxy)] Carbonyl ⁇ amino] butyl) (2,4-dimethoxybenzyl) amino ⁇ -2- ⁇ (tert-butoxycarbonyl) amino ⁇ -5-oxopentanoate (compound 4) is obtained.
  • the synthesis of stapled ERAP according to scheme (II) can be carried out, for example, as follows using the glutamic acid derivative of the above formula (IV) and the glutamine derivative of the above formula (V).
  • the pair of amino acid residues at the position where the stapling structure is to be formed is replaced with a glutamic acid derivative of formula (IV) and a glutamine derivative of formula (V)
  • the peptides are then synthesized by standard Fmoc solid phase peptide synthesis.
  • the Fmoc-protected peptide is mixed with a solution of tetrakis (triphenylphosphine) palladium (Pd (PPh 3 ) 4 ) in CHCl 3 / AcOH / N-methylmorpholine to reduce the substituent of the glutamine derivative residue.
  • tetrakis (triphenylphosphine) palladium Pd (PPh 3 ) 4
  • CHCl 3 / AcOH / N-methylmorpholine CHCl 3 / AcOH / N-methylmorpholine
  • the acid labile protecting group is deprotected and the peptide is released from the resin using a TFA / m-cresol / thioanisole / 1,2-ethanedithiol / H 2 O cocktail.
  • the number of amino acid residues to be interposed between the stapling structures is not particularly limited, but in general, it is preferably 3 residues.
  • the peptide chain After introducing the first (i.e. first pair) stapling structure, the peptide chain can be synthesized to the position where the next (i.e. second pair) staple structure is introduced by repeating the same reaction.
  • the second intramolecular crosslinking reaction results in a second pair of stapling structures.
  • the target structure can be obtained by repeating the same reaction.
  • two (or more) peptide fragments into which one stapling structure has been introduced can be linked to form a peptide into which two (or more) stapling structures have been introduced.
  • two pairs of amino acid residues that are substituted into the stapling structure are located at least adjacently or independently via one or more amino acid residues.
  • the amino acid residue intervening inside one stapling structure is not replaced with another stapling structure.
  • the number of amino acid residues intervening between the stapling structures can be, for example, 0 (ie, adjacent), 1, 2 or 3.
  • a pair of amino acid residues at the N-terminal side and a second pair located at the C-terminal side across residues 0 to 3 A peptide in which each of the amino acid residues of the is substituted with a stapling structure has a preferred structure in the present invention. Then, by setting at least one of the amino acid residues constituting each amino acid pair to L, the peptide can be expected to be resistant to the action of chymotrypsin.
  • a structure comprising at least two stapling structures represented by the following formula (II) can be mentioned.
  • the solid and dotted double lines are a single bond or a double bond;
  • the combination of A 1 , A 2 , A 3 , A 4 and A 5 is selected from:
  • a 5 R
  • a 1 QM
  • a 2 SDL
  • a 3 LQ
  • a 4 RQR
  • a 5 OH
  • “-” indicates that there is no amino acid residue and that it is a peptide bond (ie, two stapling structures are linked);
  • “OH” indicates that one end of the above-mentioned stapling structure constitutes the C-terminus of the peptide derivative).
  • the peptide having two stapling structures represented by the above formula (II) is a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 (QMLSDLTLQLRQR), which comprises two pairs of (a) and (b) below: It can also be said that the amino acid residue is a peptide replaced by the staple structure of formula (I), respectively; (A) the third (L) and seventh amino acid residues (T) from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; and (b) the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 Th (L) and 12th amino acid residue (Q).
  • a peptide in which two pairs of amino acid residues of (c) and (d) below are replaced with a staple structure of formula (I): is there; (C) the third (L) and seventh amino acid residues (T) from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; and (d) the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 Th (L) and 14th amino acid residue (Q).
  • a particularly preferred peptide is a combination of A 1 , A 2 , A 3 , A 4 and A 5 in the formula of (II)
  • “-” indicates that there is no amino acid residue and that it is a peptide bond (ie, two stapling structures are linked); “OH” indicates that one end of the above-mentioned stapling structure constitutes the C-terminus of the peptide derivative.
  • peptides correspond to the following peptides: (I) In the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 (QMLSDLTLQLRQR), the following two pairs of amino acid residues (a) and (b) were each replaced with the staple structure of formula (I) peptide; (A) the third (L) and seventh amino acid residues (T) from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4; and (b) the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 Th (L) and 12th amino acid residue (Q); or (Ii) In the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 (QMLSDLTLQLRQRQ), the following two pairs of amino acid residues (c) and (d) were each replaced with the staple structure of formula (I) peptide; (C) the third (L) and seventh amino acid residues (T) from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;
  • the peptide of the present invention also includes those in which either or both of the N-terminal and C-terminal amino acid residues are modified.
  • the type of modification is not particularly limited, but is preferably one that does not affect the affinity to PHB2 and cell permeability.
  • Examples of preferred modifications include, for example, acetylation of amino acid residues at the N-terminus, amidation of amino acid residues at the C-terminus, and addition of tag peptides such as HA tag and FLAG tag.
  • the amino acid residue at the N-terminus is acetylated and the amino acid residue at the C-terminus is amidated Peptides can be mentioned.
  • amino acid residues other than the N-terminal and C-terminal amino acid residues are not modified.
  • the peptide of the present invention is not limited to one composed of L-amino acids, and may contain one or more D-amino acids.
  • the compositional ratio of L-amino acid to D-amino acid in the peptide is not particularly limited, all amino acid residues are L-type (hereinafter “L-type peptide”) or all for maintaining ⁇ -helix structure It is preferable that the amino acid residue of is D-type (hereinafter "D-type peptide"). Therefore, in any of the above-mentioned peptides of the present invention, peptides in which all amino acid residues are replaced with D-form amino acid residues are also mentioned as preferred embodiments of the peptide of the present invention.
  • preferred peptides include, for example, peptides in which all amino acid residues are replaced with D-type amino acid residues in the peptide represented by formula (II) Can.
  • the peptide of the invention may be a retro-inverse form of any of the peptides of the invention described above.
  • the amino acid sequence is reversed from the original peptide, and all amino acid residues are replaced with D-form amino acid residues. That is, the retro-inverse form is a D-type peptide having an amino acid sequence reverse to that of the original peptide. Therefore, a peptide which is a retro-inverse of any of the above-mentioned peptides of the present invention is also mentioned as a preferred embodiment of the peptide of the present invention.
  • preferable peptides include, for example, a peptide that is a retro-inverse form of the peptide represented by the formula (II).
  • the peptide of the present invention is a D-type peptide
  • synthesis of D-type stapled ERAP or sh-staple ERAP by using D-amino acid instead of L-amino acid in the method as described above Can.
  • amino acid derivatives for forming a stapling structure also use D-type. Since some of the D-type amino acid derivatives that can be used for forming a stapling structure are commercially available, these commercially available D-type amino acid derivatives may be used.
  • D-type optical isomer of glutamine derivative represented by formula (III) (amino acid derivative for stapling)
  • D-glutamine derivative of formula (III) may be used.
  • the D-glutamine derivative of the formula (III) is replaced by N- ⁇ - (tert-butoxy) instead of N- ⁇ - (tert-butoxycarbonyl) -L-glutamic acid ⁇ -methyl ester (compound 3) It can be synthesized by using carbonyl) -D-glutamic acid ⁇ -methyl ester.
  • a D-type stapled ERAP can be obtained by synthesizing D-type peptide by standard Fmoc solid phase peptide synthesis and using an olefin metathesis reaction according to scheme (I).
  • peptide solid phase synthesis is performed based on the reverse amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 5 or a partial sequence thereof.
  • the D-type optical isomer of the glutamic acid derivative represented by formula (IV) is used as an amino acid derivative for stapling.
  • the “D-glutamic acid derivative of the formula (IV)” and the D-form optical isomer of the glutamine derivative represented by the formula (V) may be used.
  • D-glutamic acid derivative of the formula (IV) commercially available one can be used. Further, in the scheme (IV) shown in FIG.
  • the D-glutamine derivative of the formula (V) is replaced with N- ⁇ - (tert-butoxycarbonyl) -L-glutamic acid ⁇ -methyl ester (compound 3) to obtain N- ⁇ . It can be synthesized by using-(tert-butoxycarbonyl) -D-glutamic acid ⁇ -methyl ester. Then, in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, the pair of amino acid residues at the position where it is desired to form a stapling structure is a D-glutamic acid derivative of the formula (IV) and a D- of the formula (V).
  • D-type stapled ERAP By substituting a glutamine derivative and synthesizing a D-type peptide by standard Fmoc solid phase peptide synthesis using D-amino acids, and performing an intramolecular amidation reaction according to scheme (II), D-type stapled ERAP can be obtained You can get it.
  • peptide solid phase synthesis may be performed based on the reverse amino acid sequence of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5.
  • the peptide of the present invention may also be in the form of a salt.
  • the form of the salt is not particularly limited, but is preferably a pharmaceutically acceptable salt.
  • pharmaceutically acceptable salt refers to a salt that retains the pharmacological or pharmacological efficacy and properties of the peptide.
  • salts with alkali metals lithium, potassium, sodium etc.
  • salts with alkaline earth metals calcium, magnesium etc.
  • other metals copper, iron, zinc, manganese etc.
  • salts with inorganic acids hydroochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid etc.
  • These salts can be prepared according to known methods.
  • compositions The peptide of the present invention or a salt thereof can be formulated as a pharmaceutical composition together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the peptide of the present invention has the ability to bind to PHB2 and competitively inhibits the BIG3-PHB2 interaction. Formation of the BIG3-PHB2 complex enhances estrogen-dependent transcriptional activity leading to the growth of cancer cells. Therefore, the peptide of the present invention which inhibits BIG3-PHB2 interaction to suppress the formation of BIG3-PHB2 complex is particularly useful as a pharmaceutical composition for treating cancer.
  • Enhancement of estrogen-dependent transcriptional activity by formation of the BIG3-PHB2 complex mainly occurs in estrogen receptor positive cells.
  • the peptides of the present invention are particularly useful as pharmaceutical compositions for treating estrogen receptor positive cancers.
  • estrogen receptor positive cancer include breast cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, and prostate cancer (Nelles JL, et al., Expert Rev Endocrinol Metab. 2011 May; 6 (3): 437-451.), Lung cancer (especially non-small cell lung cancer) (Stabile LP, et al., Cancer Res. 2005 Feb 15; 65 (4): 1459-70 .; Marquez-Garban DC, et al., Steroids.
  • the cancer to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied is preferably expressing BIG3 and PHB2, but the estrogen receptor positive cancer generally expresses BIG3 and PHB2. Whether a cancer is estrogen receptor positive or not can be confirmed by known methods such as ELISA and immunohistochemical staining.
  • the peptide of the present invention also has a growth inhibitory effect on tamoxifen resistant estrogen receptor positive cancer. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention may be applied to tamoxifen-resistant estrogen receptor positive cancer.
  • tamoxifen resistant estrogen receptor positive cancer to which the pharmaceutical composition of the present invention is applied include, for example, tamoxifen resistant estrogen receptor positive breast cancer. Therefore, as an example of a preferred administration subject of the pharmaceutical composition of the present invention, there can be mentioned a patient having estrogen receptor positive breast cancer refractory to tamoxifen therapy.
  • the peptide of the present invention also showed growth inhibitory activity in breast cancer cells having a mutation in the estrogen receptor (ESR1).
  • Mutation of ESR1 is considered to be one of the mechanisms for acquiring resistance to hormonal therapy. Furthermore, also in triple negative breast cancer cells, the peptide of the present invention showed an excellent cytostatic action (FIG. 30). Triple negative generally refers to breast cancer cells lacking expression of HER2, estrogen receptor, and progesterone receptor, which are the main drug treatment target factors. Therefore, triple negative breast cancer is usually resistant to drug treatment. Alternatively, the present inventors have found that the peptide of the present invention has a high cytostatic effect also on HER2-positive breast cancer cells generally known as high grade breast cancer. Thus, the peptides of the present invention are useful as pharmaceutical compositions for administration to patients with these treatment-resistant or malignant breast cancers.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the peptide of the present invention for administration to either or both of drug-resistant breast cancer patients and malignant breast cancer.
  • the invention also relates to a peptide of the invention for use in the treatment of drug resistant breast cancer patients and / or malignant breast cancer.
  • the invention further relates to the use of a peptide of the invention in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of drug resistant breast cancer patients and / or malignant breast cancer.
  • the present invention provides a method for treating breast cancer, comprising the steps of selecting a drug-resistant breast cancer patient and a patient having either or both of malignant breast cancer, and administering the peptide of the present invention to the selected patient. Also provide.
  • Medication resistant breast cancer patients can be identified by observing their outcome after general medication.
  • treatment may prove to be treatment resistant if no degeneracy of the lesion is clearly observed.
  • a state in which the enlargement of the lesion is inhibited is included in the degeneration of the lesion.
  • markers that predict malignancy of breast cancer are known. When those markers are detected, it is known that the patient has high grade breast cancer.
  • HER2 is one of the indicators of breast cancer grade.
  • triple negative breast cancer patients are said to be resistant to drug treatment.
  • Triple negative is a breast cancer characterized by the lack of expression of estrogen and progesterone receptors in addition to HER2 as described above.
  • markers of malignancy and drug therapy resistance can be quantitatively evaluated by immunostaining and gene expression analysis. For example, if the expression level is similar to that of a negative control, it is judged to be negative. For negative controls, treatment resistant cancer cell lines lacking expression of these markers can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be produced by combining the peptide of the present invention or a salt thereof and a pharmaceutically acceptable carrier, using known formulation techniques.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to an inert substance used as a diluent or solvent for a drug.
  • the pharmaceutically acceptable carrier to be used for the pharmaceutical composition of the present invention may be appropriately selected from carriers used for general medicines according to the dosage form of the pharmaceutical composition to be prepared.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and dosage forms generally used for pharmaceuticals such as liquid, tablet, elixir, capsule, granule, powder and the like can be appropriately selected.
  • additives such as excipients, stabilizers, suspensions, preservatives, surfactants, solubilizers, pH adjusters, aggregation inhibitors, etc. may be added as appropriate. it can.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a pharmaceutically effective amount of the peptide of the present invention or a salt thereof.
  • the pharmaceutically effective amount can be appropriately selected depending on the dosage form of the pharmaceutical composition, the administration interval, the age of the administration subject, sex, body weight, body surface area, type of disease and the like.
  • examples of the content of the peptide of the present invention or a salt thereof in the pharmaceutical composition of the present invention include 0.001 mg to 1000 mg, 0.01 mg to 100 mg, 0.1 mg to 30 mg, 0.1 mg to 10 mg and the like. It is not limited.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may optionally contain other agents.
  • other drugs include anti-inflammatory agents, analgesics, antipyretics, other cancer therapeutic agents and the like.
  • Other cancer therapeutic agents that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention are not particularly limited, but selective ER ⁇ modulators (eg tamoxifen and raloxifene), ER ⁇ downregulators (eg And hormone therapeutic agents such as aromatase inhibitors, LH-RH agonist preparations and progesterone preparations. These agents may also be formulated in the form of prodrugs or pharmaceutically acceptable salts.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject by appropriately selecting an appropriate administration route depending on the dosage form.
  • the route of administration is not particularly limited, and examples include oral administration, and intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraosseous, peritoneal and intravenous injection and the like.
  • systemic administration and local administration near the disease site may be used, but topical administration is preferred.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by means such as injection into cancerous tissue or in the vicinity thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be surgically administered into or near cancer tissues.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be made into a sustained release formulation by being combined with a suitable carrier.
  • the administration interval of the pharmaceutical composition of the present invention may also be appropriately selected depending on the age, sex, body weight, body surface area, type of disease, etc. of the subject to be administered, and the dosage form and administration route of the present pharmaceutical composition.
  • Examples of administration intervals include, but are not limited to, daily, every four days, every seven days, etc.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention may also be appropriately selected depending on the age, sex, body weight, body surface area, type of disease, etc. of the subject to be administered, and the dosage form and administration route of the present pharmaceutical composition. it can.
  • doses of the peptide of the present invention or a salt thereof include, but are not limited to, for example, 0.001 to 1000 mg / kg / day, 0.005 to 500 mg / kg / day, 0.01 to 250 mg / kg / day, etc. It is not a thing.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used in combination with other pharmaceutical agents, depending on the condition of the subject of administration.
  • the drug to be used in combination is not particularly limited, but when used for estrogen receptor positive cancer, selective ER ⁇ modulators (eg, tamoxifen and raloxifene), ER ⁇ downregulators (eg, fulvestrant), aromatase inhibitors, Hormone therapeutic agents such as LH-RH agonist preparations and progesterone preparations can be mentioned. Among these hormone therapeutic agents, particularly preferred ones include tamoxifen and fulvestrant.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is used for the treatment of cancer, it may be examined, before administration, whether the cancer to be treated expresses BIG3 and PHB2. Whether or not the cancer to be treated expresses BIG3 and PHB2 can be confirmed by detecting transcripts or translation products of these genes in a sample collected from the subject.
  • a known method can be used for the detection method, for example, a method of detecting a transcript by a probe or PCR method (for example, cDNA microarray method, Northern blot method, RT-PCR method, etc.), and a translation product as an antibody etc. And the like (for example, Western blotting, immunostaining, etc.) can be used.
  • the invention also provides a product or a kit comprising the pharmaceutical composition of the invention.
  • the product or kit of the present invention may comprise a container containing the pharmaceutical composition of the present invention.
  • suitable containers include, but are not limited to, bottles, vials, and test tubes.
  • the container may be formed of various materials such as glass or plastic.
  • the container may be labeled and the label may describe the disease or condition of the pharmaceutical composition of the present invention to be used.
  • the label may also indicate directions for administration and the like.
  • the product or kit of the present invention may, in addition to the container containing the pharmaceutical composition of the present invention, optionally further include a second container containing a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the product or kit of the present invention further comprises other buffers, diluents, filters, injection needles, syringes, and other inserts containing instructions for use that are desirable from a commercial and user point of view. May be included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be provided in a pack or dispenser device which can optionally contain one or more unit dosage forms containing the active ingredient.
  • the pack may, for example, comprise metal or plastic foil, such as a blister pack.
  • the pack or dispenser device may be accompanied by instructions for administration.
  • the present invention also provides the following uses and methods, etc .: (A) use of the peptide of the present invention or a salt thereof in the manufacture of a pharmaceutical composition for treating cancer; (B) a peptide of the invention or a salt thereof for use in the treatment of cancer; (C) A method or process for producing a pharmaceutical composition for treating cancer, comprising formulating the peptide of the present invention or a salt thereof and a pharmaceutically acceptable carrier Or process; (D) A method or process for producing a pharmaceutical composition for treating cancer, comprising the step of mixing the peptide of the present invention or a salt thereof with a pharmaceutically acceptable carrier; And (e) a method for treating cancer comprising administering to a subject a peptide of the present invention or a salt thereof.
  • X 1.5 equivalents of amino acid to resin are used and the same HBTU and allowed to react at room temperature for 2 hours as the active agent.
  • cleavage of the Fmoc group was carried out in the process at room temperature for 10 minutes with 20% piperidine in DMF.
  • Double stapled ERAP No. 45 Column: Cosmosil 5C 18 (10 x 250 mm); Solvent: A 0.1% TFA-H 2 O, B 0.1% TFA in CH 3 CN, B (10% -45% over 30 min) in solvent A; Flow: 3.0 mL / min; Detect: 220 nm, Retention time 24.5 min MS m / z calcd for C 76 H 130 N 26 O 23 S [M + 2 H] + 904.5, found 904.6 Double stapled ERAP No.
  • Example 2 Effect of double stapled ERAP on estrogen dependent breast cancer cells
  • Human breast cancer cell line MCF-7 was purchased from JCRB cell bank (Osaka, Japan), and mammary epithelial cell line MCF-10A from American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). All cell lines maintained cells at 37 ° C., 5% CO 2 in appropriate medium.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • 5% CO 2 5% CO 2 in appropriate medium.
  • For cell proliferation assay each cell 48 well plate (2 ⁇ 10 4 cells / 200 ⁇ L) was seeded, and for immunoprecipitation, each cell 10 cm dish (2 ⁇ 10 6 cells / 10 mL) was used.
  • MCF-7 cells were prepared by using 10% FBS (Nichirei Bioscience, Tokyo, Japan), 1% Antibiotic / Antimycotic solution (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass., USA), 0.1 mM NEAA (Thermo Fisher Scientific), 1 mM sodium pyruvate The cells were seeded in MEM (Thermo Fisher Scientific) supplemented with Thermo Fisher Scientific) and 10 ⁇ g / mL insulin (Sigma, St. Louis, Mo., USA).
  • MCF-10A cells were seeded in MEBM (Lonza) supplemented with Single Quots kit (BPE, hydrocortisone, hEGF, insulin, gentamycin / amphotericin B) (Lonza, Walkersville, MD, USA) and 100 ng / mL cholera toxin.
  • BPE Single Quots kit
  • MCF-7 cells 10% FBS, 1% Antibiotic / Antimycotic solution, 0.1 mM NEAA, 1 mM sodium pyruvate and 10 ⁇ g / mL insulin the day after seeding for 17 ⁇ -estradiol (estrogen, Sigma) stimulation
  • the medium was changed to phenol red free DMEM / F12 (Thermo Fisher Scientific) supplemented with After 24 hours, cells were treated with 10 nM estrogen alone, or 10 nM estrogen and peptide (single stapled ERAP, double stapled ERAP).
  • Cell proliferation assay in MCF-7 and MCF-10A was performed using Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan). Data are shown as mean ⁇ standard deviation of 3 independent experiments.
  • Chymotrypsin resistance chymotrypsin resistance is obtained by adding 1 ⁇ g of chymotrypsin (# C7761, Sigma) and 5 ⁇ g of double stapled ERAP in buffer (50 mM Tris-HCl; pH 8.0, 10 mM CaCl 2 ) for 24 hours at 37 ° C. The reaction was carried out and the whole amount was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Immunoprecipitation analysis was performed by using a cell lysis solution dissolved in cell lysis buffer (50 mM Tris-HCl; pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% NP-40, and 0.5% CHAPS, 0.1% protease inhibitor cocktail III) to rat IgG.
  • the antibody and rec-Protein G Sepharose 4B (Thermo Fisher Scientific) were used to preclear for 3 hours at 4 ° C. Thereafter, the supernatant was reacted with 5 ⁇ g of an antibody against BIG3 at 4 ° C. for 12 hours.
  • the antigen-antibody complex was precipitated with rec-Protein G Sepharose 4B for 1 hour at 4 ° C. Immunoprecipitated protein complexes were washed four times with lysis buffer and subjected to SDS-PAGE and immunoblot analysis.
  • Double stapled ERAP was synthesized with double stapled ERAP No. 45) and a crosslink of 174L and 178Q (FIG. 1, double stapled ERAP No. 46).
  • double stapled ERAP No. 45 double stapled ERAP No.
  • FIG. 46 has a stronger inhibitory effect on estrogen-dependent proliferation than single stapled ERAP, and shows an inhibition rate of 81% even at 1 ⁇ M (FIG. 2B, Single stapled ERAP: 51% inhibition rate, double stapled ERAP No. 45: 21% inhibition rate), IC 50 enhanced single stapled ERAP by a factor of 2 and 0.43 ⁇ M (FIG. 2C).
  • MCF-10A cells are normal mammary epithelial cells that are negative for both ER ⁇ and BIG3.
  • double stapled ERAP No. 46 showed 79% and 91% inhibition of estrogen-dependent cell proliferation after 96 hours at 1 ⁇ M and 10 ⁇ M in breast cancer cells MCF-7, which are both ER ⁇ and BIG3 positive.
  • FIG. 2B the proliferation of MCF-10A cells was hardly affected up to 10 ⁇ M (FIG. 4), suggesting that the double stapling structure is not involved in the function of normal mammary epithelial cells.
  • MCF-7 cells and HEK293T cells were purchased from American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA, USA). Y537S knock-in MCF-7 cells were provided by Dr. Laki Buluwela (Imperial College London, UK). All cell lines were cultured under the conditions recommended by the respective depositor.
  • Cell culture MCF-7 cells are 10% FBS (Nichirei Bioscience, Tokyo, Japan) and 1% Antibiotic / Antimycotic solution (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass., USA), 0.1 mM NEAA (Thermo Fisher Scientific), 1 mM pyruvate HEK 293 T cells are DMEM supplemented with 10% FBS and 1% antibiotic / antimycotic solution in MEM (Thermo Fisher Scientific) supplemented with sodium (Thermo Fisher Scientific) and 10 ⁇ g / mL insulin (Sigma, St.
  • Y537S knock-in MCF-7 cells were cultured in DMEM (Sigma) supplemented with 10% FBS, 1% antibiotic / antimycotic solution, 0.1 mM NEAA. Each cell is seeded in a 48-well plate (2 ⁇ 10 4 cells / 0.2 mL), 6-well plate (5 ⁇ 10 5 cells / 2 mL), 10 cm dish (2 ⁇ 10 6 cells / 10 mL), 5% CO 2 After 24 hours of incubation at 37 ° C., the cells were treated with an inhibitor such as stERAP.
  • the single peptide stapled ERAP (stERAP, stapled ERAP) described in WO 2017/12646 was used as the binding inhibitor of the compound and the inhibitor BIG3-PHB2.
  • Tamoxifen is purchased from Sigma, Fulvestrant is purchased from LKT laboratories (St. Paul, MN, USA), Everolimus is purchased from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA), staurosporine and wortmannin are from Oncotherapy Science (Kanagawa, Japan) and Dr. Takuya Sasaki (Tokushima University, Tokushima, Japan).
  • the membrane is an anti-FLAG tag antibody (M2) (Sigma); an anti-PHB2 antibody (Abcam, Cambridge, UK); an anti-PKC ⁇ antibody (H-7), an anti-PI3-kinase p85 ⁇ (U13) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-phosphorylated PI3K p85 / p55 antibody (Tyr458 / Tyr199), anti-phosphorylated PKC ⁇ / ⁇ II antibody (Thr638 / Thr641) (Cell Signaling Technology); anti-ER ⁇ antibody (SP1) (Thermo Fisher Scientific); Incubation was carried out for 12 hours in the presence of phosphorylated PHB2 purified antibody (Ser 39) (Scrum Co., Ltd., Tokyo, Japan).
  • Immunoprecipitation Cells are lysed in 0.1% NP-40 lysis buffer as described in the "Western Blot Analysis" section and at 4 ° C using Normal IgG and rec-Protein G Sepharose 4B (Thermo Fisher Scientific). The cell lysate was precleaned for 3 hours. After centrifugation, the supernatant was incubated at 4 ° C. for 12 hours in the presence of 5 ⁇ g of anti-PKC ⁇ antibody, anti-ER ⁇ antibody, and anti-FLAG tag antibody. Thereafter, the antigen-antibody complex was precipitated by adding rec-Protein G Sepharose 4B and incubating at 4 ° C. for 1 hour. The immunoprecipitated protein complexes were washed three times with lysis buffer and separated by SDS-PAGE. Thereafter, Western blot analysis was performed.
  • PKC ⁇ Protein Kinase C alpha activity
  • the activity of PKC ⁇ includes the substrate Ser39 in kinase buffer (25 mM Hepes, pH 7.2, 25 mM MgCl 2 , 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 0.25 mM DTT) for PKC ⁇ immunoprecipitates PHB2 peptide (YGVRE S VFTVE (SEQ ID NO: 17)) and 0.5 mM ATP and 30 ° C., allowed to react for 30 minutes, it was measured using ADP-Glo kinase assay Kit (Promega , Fitchburg, WI, USA) and.
  • Cell proliferation assay was performed using Cell-Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan). Cells were seeded at 2 ⁇ 10 4 cells / well in a 48-well plate and maintained in an incubator (37 ° C.) in the presence of 5% CO 2 . At the indicated times, a 10-fold diluted CCK-8 solution was added and incubated for 30 minutes, and the absorbance at 450 nm was measured to calculate the number of viable cells.
  • Cell-Counting Kit-8 CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan. Cells were seeded at 2 ⁇ 10 4 cells / well in a 48-well plate and maintained in an incubator (37 ° C.) in the presence of 5% CO 2 . At the indicated times, a 10-fold diluted CCK-8 solution was added and incubated for 30 minutes, and the absorbance at 450 nm was measured to calculate the number of viable cells.
  • Luciferase Reporter Assay ERE For reporter assay, MCF-7 cells are transfected 16 hours after transfection of ERE reporter (SABiosciences, Frederick, MD, USA) with assay medium (Opti-MEM, 10% FBS, 0.1, 0.1%). It was changed to mM NEAA, 1 mM Sodium pyruvate, 10 ⁇ g / mL insulin), and after 8 hours, it was treated with estrogen and stERAP for 24 hours. Cell lysates were evaluated for luciferase activity and Renilla-luciferase activity using the Promega dual luciferase reporter assay (Promega, Tokyo, Japan). All data were normalized by Renilla-luciferase activity, taking into account transfection efficiency.
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • AKT protein kinase B
  • mTOR mimmalian target of rapamycin
  • the breast cancer cell line of the ESR1 mutant is considered to activate PKC, which is a downstream molecule of PI3K, because the ESR1 mutant having high PKC ⁇ activity independent of estrogen binds to PI3K (Biochem Biophys Res Commun, 310, 720, 2004).
  • PKC protein kinase
  • stERAP treatment in the presence of estrogen can almost completely suppress estrogen-stimulated proliferation in mock and WT, and in the presence of 1 nM or more of estrogen in each ESR1 mutant, the inhibitory effect of stERAP is synergistically S463 P, Y 537 S, D 538 G, S 463 P / D 538 G exhibited inhibition rates of 62%, 80%, 75%, and 77%, respectively (FIG. 12). In addition, 76%, 82%, 84% and 83% further enhanced the inhibition rate in the presence of 10 nM estrogen (FIG. 12). It was considered that this was due to the addition of the estrogen signal, which increased the point of action of stERAP and caused a synergistic suppression effect.
  • ERE-luciferase activity was increased in a concentration-dependent manner with estrogen of 0.1 nM or more, but the activity was almost completely suppressed by stERAP treatment (FIG. 13) .
  • ERE-luciferase activity is markedly induced in transfected cells of each ESR1 mutant even in the absence of estrogen (S463P: 2.3 times, Y537S: 7.5 times, D538G: 5.0 times, S463P / D538G: 6.6 times), , Y537S transfected cells had induced activation comparable to 10 nM estrogen stimulation of WT (FIG. 13).
  • stERAP was able to significantly suppress ERE-luciferase activity under any conditions.
  • Example 4 Effect of stERAP on trastuzumab-resistant HER2-positive breast cancer cells
  • MCF-7, BT-474, SK-BR-3 were purchased from American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA).
  • KPL-4 was provided by Dr. Ryoichi Kobayashi (Kawasaki Medical School, Okayama, Japan) under the substance transfer agreement
  • trastuzumab-resistant SK-BR-3 was provided by Dr. Hirotaka Kanzaki (Okayama University, Okayama, Japan). All cell lines were cultured under the conditions recommended by the respective depositor.
  • Cell culture SK-BR-3 cells McCoy'A (Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% FBS (Nichirei Bioscience, Tokyo, Japan) and 1% antibiotic / antimycotic solution (Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA) And KPL-4 cells, BT-474 cells, and trastuzumab-resistant SK-BR-3 cells were cultured in DMEM (Sigma, St. Louis, MO, USA) supplemented with 10% FBS and 1% antibiotic / antimycotic solution. The cells were seeded in 48-well plate (2 ⁇ 10 4 cells / 0.2 mL), 6-well plate (5 ⁇ 10 5 cells / 2 mL), 10 cm dish (2 ⁇ 10 6 cells / 10 mL). The cells were incubated at 37 ° C., 5% CO 2 and treated 24 hours later with inhibitors such as stERAP.
  • the single peptide stapled ERAP (stERAP) described in WO 2013/018690 was used as the binding inhibitor of the compound and the inhibitor BIG3-PHB2.
  • Recombinant PHB2 was purchased from Abnova (Taipei, Taiwan), recombinant TTK and recombinant MK5 from SignalChem (Richmond, Canada), and TTK inhibitor AZ3146 was purchased from Santa Cruz Biotechnology.
  • Anti-BIG3 purified antibody (anti-hA7322 (His13), Sigma); anti-HA tag antibody (3F10, Roche, Mannheim, Germany); anti-PHB2 antibody, anti-NcoR antibody (Abcam, Cambridge, UK); anti-PKA ⁇ cat antibody (C-20), anti-PKC ⁇ antibody (H-7), anti-PP1C ⁇ antibody (FL-18), anti-HDAC1 antibody (H-51) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-HER2 antibody (Merck) , Darmstadt, Germany); anti-HER3 antibody (1B2E), anti-TTK antibody (D-8), anti-MK5 antibody (D70A10), anti-CHK1 antibody (G-4), anti-phosphorylated Shc (Y239 / Y240), anti-p38 Antibody, anti-phosphorylated p38 antibody (T180 / Y182), anti-NF- ⁇ B p65 antibody, anti-IBB antibody (L35A5), anti-phosphorylated I ⁇ B antibody (S32 /
  • Phos-tag SDS-PAGE In order to evaluate the direct phosphorylation of PHB2 by kinase, Phoss-tag SDS-PAGE was performed using precast SuperSep gels (50 ⁇ M phos-tag acrylate and 100 ⁇ M ZnCl 2 , Wako Chemical, Osaka, Japan). As a molecular weight marker, WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III (Wako Chemical) was used. The phosphorylation efficiency was calculated by the ratio of the phosphorylated PHB2 band to the total PHB2 band.
  • Immunoprecipitation Cells are lysed in 0.1% NP-40 lysis buffer as described in the "Western Blot Analysis" section and at 4 ° C using Normal IgG and rec-Protein G Sepharose 4B (Thermo Fisher Scientific). The cell lysate was precleaned for 3 hours. After centrifugation, the supernatant was incubated at 4 ° C. for 12 hours in the presence of 5 ⁇ g of anti-BIG3 antibody, anti-PHB2 antibody, anti-HER2 antibody, anti-PKC ⁇ and anti-HA tag antibody. Thereafter, the antigen-antibody complex was precipitated by adding rec-Protein G Sepharose 4B and incubating at 4 ° C. for 1 hour. The immunoprecipitated protein complexes were washed three times with lysis buffer and separated by SDS-PAGE. Thereafter, Western blot analysis was performed.
  • KPL-4 cell suspension and trastuzumab-resistant SK-BR-3 cell suspension (1 ⁇ 10 7 cells / mouse) are mixed with an equal amount of Matrigel (BD), and 5 weeks old female BALB / c injected into the mammary fat pad of nude mice (Charles River Laboratories, Tokyo, Japan).
  • the mice were housed in a sterile isolation facility with a 12 hour light / 12 hour dark cycle and had free access to rodent chow and water. Tumors were allowed to grow for a week to reach a size of approximately 100 mm 3 (calculated as 1/2 ⁇ (width ⁇ length 2 )). Thereafter, mice were randomly divided into each experimental group (5 animals / group).
  • StERAP treatment was administered to mice by tail vein injection at 150 ⁇ g / kg every 7 days. Tumor volumes were measured every 4 days for 4 weeks using a caliper. All tests were conducted according to the animal facility guidelines of Tokushima University.
  • PKA Protein Kinase A
  • PKC ⁇ Protein Kinase C alpha
  • a kinase buffer 25 mM Hepes, pH 7.2, 25 mM MgCl 2 , 5 mM EDTA, 5 mM EGTA
  • the reaction was performed at 30 ° C. for 30 minutes with a synthetic substrate CREBtide (KRREILSRRPSYR) and 0.5 mM ATP under 0.25 mM DTT), and measured using an ADP-Glo kinase assay Kit (Promega, Fitchburg, Wis., USA).
  • PP1C ⁇ Activity The phosphatase activity of PP1C ⁇ was performed using Protein Phosphatase Assay Kit (AnaSpec, Fremont, CA, USA). After incubating the cell lysate with a substrate (p-Nitrophenyl phosphate) for 60 minutes at room temperature, the reaction was stopped and the absorbance at 405 nm was measured. PP1 C ⁇ activity ( ⁇ mole / min) was defined as the amount of enzyme catalyzing 1 ⁇ mole of substrate per minute.
  • Cell proliferation assay was performed using Cell-Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan). The cells were harvested, plated at 2 ⁇ 10 4 cells / well in a 48-well plate, and maintained in an incubator (37 ° C.) in the presence of 5% CO 2 . At the indicated times, a 10-fold diluted CCK-8 solution was added and incubated for 30 minutes, and the absorbance at 450 nm was measured to calculate the number of viable cells.
  • CCK-8 Cell-Counting Kit-8
  • the primers used for amplification are as follows; BIG3: 5'-CTTGACAAGGCCTTTGGAGT-3 '(SEQ ID NO: 18) and 5'-CAATATGCTTTTCCCCGCTTT-3' (SEQ ID NO: 19), ⁇ 2-MG: 5'-AACT TAG AGGTGGGGAGCAG-3 '(SEQ ID NO: 20) and 5'-CACAACCATGCCTTACTTTATC-3' (SEQ ID NO: 21).
  • cytoplasmic and nuclear fractions were isolated using NE-PER nuclear and cytolytic extraction reagent (Thermo Fisher Scientific).
  • Cell cycle cells are fixed with cold 70% ethanol, stained with 20 ⁇ g / mL propidium iodide (Sigma) and 1 mg / mL ribonuclease A (Sigma) and analyzed by FACSCalibur (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) Cell cycle was assessed using CellQuest software (BD, Franklin Lakes, NJ, USA).
  • Phosphorylated PHB2 (Ser39) Inhibits Transcriptional Activity in the Nucleus It was evaluated that phosphorylation of PHB2 (Ser39) is involved in the suppression of transcriptional activity using a phosphorylation mutant of PHB2.
  • the HA-tagged PHB2 construct and the alanine mutant (S39A) of Ser39 were transfected into SK-BR-3 cells in which expression of PHB2 was suppressed by the siRNA method, and after 48 hours, stERAP was treated for 24 hours The nuclear fraction was isolated and immunoprecipitated with HA antibody.
  • the threonine-phosphorylation of PHB2 and its activation mechanism The activation mechanism of threonine-phosphorylation of PHB2 was examined. First, assuming the involvement of PKC ⁇ in the same way as phosphorylation of Ser 39, the threonine / phosphorylation of PHB2 was evaluated when the expression of PKC ⁇ was suppressed by the siRNA method. The threonine / phosphorylation of PHB2 induced by stERAP treatment was evaluated. Is strongly maintained in trastuzumab- and siPKC ⁇ -treated cells (FIG. 20A), suggesting that threonine phosphorylation of PHB2 is activated by kinases other than PKC ⁇ .
  • Thr155 and Thr169 show high scores (each 0.849, 0.992; Table 1A), both of which suppress the ER ⁇ transcription activity of PHB2 Although it existed in the domain (19-49 aa, 150-174 aa; Proc Natl Acad Sci USA, 96, 6947, 1999), it was suggested that the phosphorylation of Thr169 may be due to a kinase other than PKC.
  • TTK, CHK1 and MK5 were suppressed by the siRNA method, and threonine and phosphate of PHB2 were evaluated when treated with stERAP.
  • threonine phosphorylation of PHB2 induced by stERAP treatment showed 79% and 74% inhibitory effect by siTTK treatment and siMK5 treatment (FIG. 20B).
  • siCHK1 treatment also had a 33% inhibition rate on threonine phosphorylation of PHB2, but it was determined that TTK and MK5 are largely involved in threonine phosphorylation of PHB2.
  • TTK inhibitor AZ3146 was used to examine the effect on threonine phosphorylation of PHB2 and HER2 signal. As a result, it was reproduced that the interaction between HER2-HER3 and HER2-Shc was significantly inhibited by the treatment with stERAP alone (96% and 91% inhibition rate for each), whereas AZ3146 had its inhibitory effect. Almost completely canceled (FIG. 20C). Furthermore, AZ3146 inhibited threonine phosphorylation of PHB2 to 23% (FIG. 20C), suggesting that threonine phosphorylation of PHB2 by TTK activation is involved in the inhibition of HER2 signal.
  • threonine / phosphorylation sites of PHB2 were Thr42 and Thr169.
  • the HA-tagged PHB2 construct (WT), an alanine variant of Thr42 (T42A), an alanine variant of Thr169 (T169A), and a double alanine variant of Thr42 and Thr169 (T42A + T169A) are endogenously treated by the siRNA method.
  • each HA-tagged PHB2 (wild-type WT, alanine mutant S39A of Ser39, double alanine mutant T42A + T169A of Thr42 and Thr169) was expressed in SK-BR-3 cells in which endogenous PHB2 expression was suppressed by the siRNA method.
  • stERAP treatment for 24 hours, and immunoprecipitated with anti-HER2 antibody and anti-BIG3 antibody.
  • each HA-tagged PHB2 was directly bound to HER2 even in the untreated stERAP, but the binding between BIG3 and each HA-tagged PHB2 was almost completely inhibited by the stERAP treatment (FIG.
  • Threonteh Phosphorylation of PHB2 by TTK and MK5 Whether TTK and PHB2 bind or not was examined by immunoprecipitation with anti-TTK antibody and anti-PHB2 antibody to SK-BR-3 cells treated with stERAP for 24 hours. As a result, it was found that TTK and PHB2 strongly interact by immunoprecipitation with both antibodies (FIG. 23A), suggesting that TTK directly phosphorylates PHB2.
  • the possibility that TTK and MK5 directly threonine-phosphorylate PHB2 was evaluated by SDS-PAGE using Phos-tag. The experiment was carried out for 30 minutes at 30 ° C.
  • the immune serum was immunoblotted in the same manner as above, the serum of phosphorylated Thr42 was also slightly reactive, but the phosphorylated Thr169 serum exhibited almost the same phosphorylation behavior as the anti-phosphorylated threonine antibody, and Thr169 was MK5 Strongly suggested as a phosphorylation site of PHB2.
  • stERAP inhibits the interaction of HER2-HER3 and HER2-Shc
  • SK-BR-3 cells 0.05 ⁇ M and 1 ⁇ M
  • BT- 474 cells 0.5 ⁇ M and 10 ⁇ M
  • KPL-4 cells 0.01 ⁇ M and 1 ⁇ M
  • trastuzumab could hardly inhibit the binding of HER2 to HER3 and Shc
  • treatment with stERAP alone could obtain a strong inhibitory effect (Fig. 25).
  • stERAP has a significant suppressive effect regardless of resistant and sensitive cells It became clear that it had.
  • the effect of stERAP on the binding of HER2-HER3 heterodimer and HER2-Shc in trastuzumab-resistant SK-BR-3 cells was examined.
  • stERAP was able to almost completely inhibit the binding of HER2-HER3 to HER2-Shc and phosphorylation of Shc (Y239 / Y240) in sensitive and resistant cell lines (FIG. 26B).
  • PHB released from BIG3 binds to HER2 by stERAP treatment, suggesting that PHB2 is involved in the inhibition of HER2-HER3 and HER2-Shc complex.
  • HERCEPTIN treatment alone had little effect on the binding of HER2-HER3 and HER2-Shc.
  • stERAP induces cell growth inhibitory effect by inducing G1 phase arrest, and promotes cell death by using in combination with trastuzumab having different action mechanism.
  • Example 5 Effects of Double StERAP Materials and methods Cell lines and culture conditions
  • Three human breast cancer cell lines SK-BR-3, BT-20, MDA-MB-231 and human synovial sarcoma cell line SW982 were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Purchased from SK-BR-3 cells were cultured in McCoy's 5A medium (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass., USA) and BT-20 in EMEM medium (Thermo Fisher Scientific) at 37 ° C., 5% CO 2 . MDA-MB-231 cells and SW982 cells were cultured at 37 ° C. without adjusting the CO 2 concentration using Leibovitz's L-15 medium (Thermo Fisher Scientific). All media were used supplemented with 10% FBS (Thermo Fisher Scientific), 1% antibiotic-antimycotic solution (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan).
  • Cell proliferation assay Cell seeding: 1 x 10 4 cells / 200 ⁇ L in well in 48-well plates for SK-BR-3 cells, BT-20 cells, MDA-MB-231 cells, 0.5 x 10 4 cells / 200 ⁇ L for SW982 cells I went in well. After 48 hours, the medium of each well is replaced with medium containing peptide (single stERAP and double stERAP # 46: serial dilution of 20 ⁇ M to 3-fold, double stERAP # 45: serial dilution of 50 ⁇ M to 2-fold), and further 96 After time culture, cell proliferation level was measured using Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan).
  • SK-BR-3 cells and MDA-MB-231 cells were each seeded at 5 ⁇ 10 5 cells / 10 cm dish. After 72 hours, replace the medium with fresh medium supplemented with 5 ⁇ M peptide, collect cells by trypsinization after 48 hours, 72 hours, 96 hours, add 70% ethanol solution and fix at least overnight at -20 ° C did.
  • the cell suspension solution is replaced with 70% ethanol by Propidium Iodide (PI) / RNase Staining Solution (Cell Signaling Technologies, Danvers, Mass., USA), reacted for 15 minutes at room temperature in the dark, and then treated with a cell strainer ( Cell clumps were removed by BD biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).
  • PI Propidium Iodide
  • RNase Staining Solution Cell Signaling Technologies, Danvers, Mass., USA
  • double stERAP # 46 has the highest growth inhibitory effect, and is a high-grade cell line derived from triple negative breast cancer (BT-20 and MDA-MB-231) and a cell line derived from synovial sarcoma A strong growth inhibitory effect was also observed in SW982.
  • the present invention provides peptides with a longer duration of inhibitory effect on BIG3-PHB2 interaction.
  • the pharmaceutical composition containing the peptide of the present invention or a salt thereof can be used to treat cancer, particularly estrogen receptor positive cancer, and estrogen receptor negative breast cancer and prostate cancer.

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Abstract

本発明は、BIG3とPHB2との相互作用を阻害するBIG3のドミナントネガティブペプチドの一部を、少なくとも2個のステープリング構造で置き換えた構造を含むペプチドを提供する。本発明のペプチドは、優れた細胞増殖抑制作用を有する。またその細胞増殖抑制作用は、シングルステープルドペプチドに比べて長い時間継続する。そのため、がんの治療において、臨床応用に適した特徴を備える。

Description

ペプチド誘導体及びそれを含む医薬組成物
　本発明は、がん治療に有用なペプチド誘導体及びそれを含む医薬組成物に関する。
　本出願は、2017年7月19日に出願された特願2017-140101の恩典を主張し、その全内容が参照によって本明細書に組み入れられる。
　エストロゲン受容体α（Estrogen-receptor:ERα）は、乳がんの発生と進行に中心的な役割を果たす。近年の乳がんに対する内分泌療法は、選択的ERαモジュレーター（例えば、タモキシフェン及びラロキシフェン）、ERαダウンレギュレーター（例えば、フルベストラント）、およびアロマターゼ阻害剤（aromatase inhibitor:AI）を使用するものであり、ERαシグナリングを主に標的としている（非特許文献１～３）。これらの治療法のうち、ERαへの競合的結合を介して乳がん細胞の増殖を阻害するタモキシフェンを用いる方法は、ERα陽性乳がん患者に対する標準療法である。しかしながら、タモキシフェン療法は、しばしば有効でない場合があり、患者は内分泌療法耐性腫瘍を再発して死亡することもある（非特許文献４、５）。また、エストロゲン合成をブロックするAIは、タモキシフェンと比較して、良好な有効性、無再発生存期間の有意な延長、および閉経女性における再発期間の延長のような実質的な臨床効果をもたらすが、AI療法を受けた一部の患者は再発する（非特許文献６、７）。これらの内分泌療法の有効性に影響を与える正確な分子事象は、未だ解明されていない。
　がん特異的タンパク質であるブレフェルジンA阻害グアニンヌクレオチド交換タンパク質3（brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3:BIG3）と腫瘍サプレッサーであるプロヒビチン2（prohibitin 2:PHB2）との複合体は、ERα陽性乳がんにおけるエストロゲンシグナル調節において中心的な役割を果たす（非特許文献８、９）。BIG3は、PHB2と結合してエストロゲン依存性転写活性化を抑制するPHB2の能力を阻害し、恒常的なERα活性をもたらす。
　これらの知見に基づき、BIG3-PHB2相互作用の阻害によりBIG3との複合体からPHB2を遊離させ、PHB2の腫瘍抑制活性を発揮させるという戦略は、乳がんの新規療法となりうる。この戦略に基づき、本発明者らは、以前、BIG3-PHB2相互作用を特異的に阻害するBIG3のドミナントネガティブペプチドを開発した（特許文献１）。このペプチドは、PHB2の腫瘍抑制活性を再活性化することにより、乳がん増殖をもたらすERαシグナルパスウェイを阻害し、乳がん増殖を抑制することが確認されている（特許文献１）。
WO2013/018690
Johnston, S. R., Clin. Cancer Res. 16, 1979-1987 (2010). Fisher, B. et al., J. Natl. Cancer Inst. 97, 1652-1662 (2005). Jordan, V. C., Nature Rev. Drug Discov. 2, 205-213 (2003). Clarke, R. et al., Pharmacol. Rev. 53, 25-71 (2001). Fisher, B. et al., J. Natl. Cancer Inst. 93, 684-690 (2001). Chlebowski, R. et al., Breast 2, S1-11 (2009). Chumsri, S. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 125, 13-22 (2011). Kim, J. W. et al., Cancer Sci. 100, 1468-1478 (2009). Yoshimaru, T. et al., Nat. Commun. 4, 2443 (2013). Yoshimaru, T. et al., Sci Rep. 7(1), 1821 (2017)
　さきに述べたとおり、BIG3のドミナントネガティブペプチドによる、乳がん細胞の増殖抑制作用が明らかにされている。しかし、公知のドミナントネガティブペプチドは、安定性が高いとはいえず、BIG3-PHB2相互作用に対する阻害効果の持続期間はそれほど長くなかった。そこで、本発明者らは上記ドミナントネガティブペプチドの分子内にステープリング構造（stapling structure；架橋構造）を導入することにより、BIG3-PHB2相互作用に対する阻害効果の持続時間が改善されることを見出した（PCT/JP2017/001187、Yoshimaru, T. et al., Sci Rep. 7(1), 1821 (2017)）。ステープリング構造が導入されたペプチド（ステープルドペプチド；stERAP No.12等）は、より安定した乳がん増殖抑制効果を示すことが確認された。
　上記ステープルドペプチドは、BIG3-PHB2相互作用に対する阻害効果の持続期間を延長させた。しかし、臨床応用のためには、その阻害効果がより長い期間持続することが望まれる。
　そのため、本発明は、BIG3-PHB2相互作用に対する阻害効果の持続期間がより長いペプチドを提供することを課題とする。
　以前、本発明者らは、上記ドミナントネガティブペプチドの分子内にステープリング構造（stapling structure）を導入することにより、BIG3-PHB2相互作用に対する阻害効果の持続時間が改善されることを見出したが、さらに分子内架橋を増やすことで安定性が亢進されることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のペプチド、ならびにその用途を提供する：
［１］配列番号：４または配列番号：５に記載のアミノ酸配列において、少なくとも2対のアミノ酸残基が、同数のステープリング構造で置き換えられたアミノ酸配列を含むペプチド、またはその塩；
［２］2対のアミノ酸残基が、2個のステープリング構造で置き換えられた［１］に記載のペプチド、またはその塩；
［３］2対のアミノ酸残基が、以下の（ａ）および（ｂ）である、［１］または［２］に記載のペプチド、またはその塩：
（ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列のN末端から3番目および7番目のアミノ酸残基；
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列のN末端から8番目および12番目のアミノ酸残基；
［４］2対のアミノ酸残基が、以下の（ｃ）および（ｄ）である、［１］または［２］に記載のペプチド、またはその塩：
（ｃ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列のN末端から3番目および7番目のアミノ酸残基；
（ｄ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列のN末端から10番目および14番目のアミノ酸残基；
［５］ステープリング構造が下記式（Ｉ）で表される、［１］～［４］のいずれか一項に記載のペプチド、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、実線と点線の二重線は単結合または二重結合を示す。）
またはその塩；
［６］ステープリング構造が下記式（ＩＩ）で表される、［５］に記載のペプチド、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、実線と点線の二重線は単結合または二重結合であり；
A1、A2、A3、A4およびA5の組み合わせは以下から選択される：
　　A1=QM、A2=SDL、A3=－、A4=QLR、A5=R
　　A1=QM、A2=SDL、A3=LQ、A4=RQR、A5=OH
ここで「－」はアミノ酸残基が無くペプチド結合（すなわち2個のステープリング構造は連結）であることを示し；
また「OH」は、上記ステープリング構造の一端がペプチド誘導体のC末端を構成することを示す）
またはその塩；
［７］N末端およびC末端のアミノ酸残基のいずれかまたは両方が修飾されている、［１］～［６］のいずれか一項に記載のペプチド、またはその塩；
［８］N末端およびC末端のアミノ酸残基のいずれかまたは両方が、アセチル化、アミド化およびHAタグ付加のいずれかまたはこれらの組み合わせにより修飾されている、［７］に記載のペプチド、またはその塩；
［９］N末端のアミノ酸残基がアセチル化されており、かつC末端のアミノ酸残基がアミド化されている、［８］に記載のペプチド、またはその塩；
［１０］全てのアミノ酸残基がD型のアミノ酸残基に置き換えられた、［１］～［９］のいずれか一項に記載のペプチド、またはその塩；
［１１］［１］～［９］のいずれか一項に記載のペプチドのレトロインバース体であるペプチド、またはその塩；
［１２］［１］～［１１］のいずれか一項に記載のペプチド、またはその塩と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物；
［１３］がん治療用である、［１２］に記載の医薬組成物；
［１４］がんが乳がんまたは前立腺がんである、［１３］に記載の医薬組成物；ならびに
［１５］がんがエストロゲン受容体陽性のがんである、［１３］または［１４］に記載の医薬組成物。
　あるいは本発明は、前記［１］～［１１］のいずれかに記載のペプチド、またはその塩を、治療を必要とする対象に投与する工程を含む、がんの治療方法を提供する。また本発明は、前記［１］～［１１］のいずれかに記載のペプチド、またその塩の、がんの治療用医薬組成物の製造における使用に関する。更に本発明は、前記［１］～［１１］のいずれかに記載のペプチド、またはその塩の、がんの治療における使用に関する。そして本発明は、前記［１］～［１１］のいずれかに記載のペプチド、またはその塩を、担体と混合あるいは配合する工程を含む、がんの治療用医薬組成物の製造方法に関する。
　本発明によれば、BIG3-PHB2相互作用に対する阻害効果の持続期間がより長いペプチドが提供される。本発明のペプチドを含む医薬組成物は、がんの治療に適用することができる。
図１はダブルステープルドERAP(No.45とNo.46)の模式図を示す。 図２はダブルステープルドERAPが長期安定的にエストロゲン依存性のヒト乳がん細胞株の増殖を抑制することを示す。（図２Ａ，Ｂ）ヒト乳がん細胞株MCF-7細胞をダブルステープルドERAP No.45（Ａ）またはダブルステープルドERAP No.46（Ｂ）で処理し、その後直ちに10nMエストロゲンで刺激し、24時間ごとに96時間までMTTアッセイで阻害効果を評価した。データは3回の独立した実験の平均値±標準偏差を表す。（Ｃ）シングルステープルドERAP（黒丸●）、ダブルステープルドERAP No.45（黒三角▲）またはダブルステープルドERAP No.46（黒四角■）のペプチド濃度（0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10μM）と増殖抑制率のシグモイド曲線を表す。 図３はダブルステープルドERAPのキモトリプシン耐性を示す。ダブルステープルドERAPとキモトリプシンを37℃で24時間反応させたときのダブルステープルドERAP No.45（Ａ）とダブルステープルドERAP No.46（Ｂ）のクロマトグラムを示す。実験は、ダブルステープルドERAPとキモトリプシン反応液を、高速液体クロマトグラフィー（逆相カラム、流速0.3mL/min、グラジエント溶出；A液:0.1％トリフルオロ酢酸、B液:0.1%トリフルオロ酢酸/アセトニトリル、A/B=90/10（0-20min）-40/60（20-80min））に供してUV210nmで検出した。 図４は乳腺上皮細胞MCF-10A細胞の増殖においてはダブルステープルドERAP No.46の効果がないことを示したMTTアッセイの結果を示す。MCF-10A細胞を図に示した濃度のダブルステープルドERAPで96時間まで処理し、24時間ごとに細胞増殖を評価した。 図５はダブルステープルドERAP No.46がBIG3とPHB2との相互作用を阻害することを示す。（Ａ, Ｂ）MCF-7細胞においてBIG3-PHB2相互作用に及ぼすダブルステープルドERAP No.46の阻害効果をウェスタンブロットにより評価した。MCF-7細胞をダブルステープルドERAP No.46およびシングルステープルドERAPの1μMと10μMで処理し、その後直ちに10nMエストロゲンで24時間（Ａ）および96時間（Ｂ）刺激した。その後、細胞を溶解し、抗BIG3抗体を用いて免疫沈降し、図に示した抗体を用いたイムノブロット解析を行った。結合阻害率は非処理細胞でのPHB2のバンド面積を100としたときの比率で表した。 図６－８は、ステープルドERAP合成のスキーム図である。図６は、ステープルドERAP合成のために使用したアミノ酸誘導体の合成スキームを示す。（ｉ）～（ｖｉ）は各反応における試薬およびアミノ酸合成の条件を示す：（ｉ）2,4-ジメトキシベンズアルデヒド、AcOH、MgSO4、CH2Cl2；（ｉｉ）NaBH4、MeOH、CH2Cl2、収率87%（2段階）；（ｉｉｉ）化合物2、EDC・HCl、DIPEA、CH2Cl2、収率76%；（ｉｖ）LiOH・H2O、THF、MeOH、H2O、収率92%；（ｖ）TBSOTf、2,6-ルチジン、CH2Cl2、；（ｖｉ）Fmoc-OSu、Na2CO3、THF、H2O、収率90%（2段階）。 図７は、閉環オレフィンメタセシスによるERAPのステープリング合成のスキームを示す。 図８は、分子内アミド化を介したERAPのステープリング合成のスキームを示す。 図９は、ESR1変異体の乳がん細胞株がエストロゲン非依存的にPI3Kと結合することを示す。（Ａ）ESR1野生型の乳がん細胞株ではエストロゲン存在下でERαとPI3Kは結合するイムノブロットを示す。FLAGタグ化ESR1（WT）をトランスフェクションしたMCF-7細胞の溶解物を抗FLAG抗体により免疫沈降し、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。（Ｂ）ESR1変異体Y537SをトランスフェクションしたMCF-7細胞を10μM stERAPで処理したときのPI3K、PKCαおよびPHB2のリン酸化のイムノブロットを示す。MCF-7細胞にFLAGタグ化ESR1変異体（Y537S）をトランスフェクションしたあと、10μM stERAPを経時的に処理した細胞溶解物を抗ERα抗体で免疫沈降し、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。 図１０は、ESR1変異体の乳がん細胞株がエストロゲン非依存的に高いPKCα活性を有していることを示す。（Ａ）ESR1変異体をトランスフェクションした乳がん細胞株のPKCα活性を示す。各ESR1変異体をトランスフェクションしたHEK293T細胞およびMCF-7細胞にPKCα阻害剤staurosporineを24時間処理したあと、抗PKCα抗体で免疫沈降して、Ser39を含むPHB2ペプチド（YGVRESVFTVE（配列番号：１７））を基質としてPKCα活性を測定した。また、PKCαの免疫沈降物を図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。*** P < 0.001。 （Ｂ）ESR1変異体をトランスフェクションした乳がん細胞株のPKCα活性はPI3K依存的であることを示す。各ESR1変異体をトランスフェクションしたMCF-7細胞にPI3K阻害剤wortmanninを100nMで24時間処理したあと、抗PKCα抗体で免疫沈降して、Ser39を含むPHB2ペプチドに対するPKCα活性を測定した。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。NS,統計的有意性なし、*** P < 0.001。（Ｃ）ESR1変異体をトランスフェクションしたMCF-7細胞のリン酸化PKCαがPI3K依存的であるイムノブロットを示す。各ESR1変異体をトランスフェクションしたMCF-7細胞にstERAPおよびwortmanninを24時間処理したあと、抗PKCα抗体で免疫沈降して、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。 図１１は、ESR1変異体をトランスフェクションしたMCF-7細胞の増殖に対するstERAPと抗エストロゲン剤の併用的な抑制効果を示す。各ESR1変異体をトランスフェクションしたMCF-7細胞に10μM stERAPと抗エストロゲン剤である1μM タモキシフェン（TAM）と2μM フルベストラント（Fluv）、およびmTOR阻害剤である0.5μM エベロリムス（Ever）を96時間反応させたときの細胞増殖を評価した。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001。 図１１－１の続きを示す図である。 図１２は、ESR1変異体をトランスフェクションしたMCF-7細胞のエストロゲン共存下での増殖に対するstERAPの抑制効果を示す。各ESR1変異体をトランスフェクションしたMCF-7細胞を各エストロゲン濃度（0.1,1,10nM）の共存下で10μM stERAPを24時間反応させたときの細胞増殖を評価した。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001。 図１３は、ESR1変異体をトランスフェクションしたMCF-7細胞のERα転写活性に対するエストロゲン共存下でのstERAPの抑制効果を示す。各ESR1変異体をトランスフェクションしたMCF-7細胞を各エストロゲン濃度（0.1,1,10nM）の共存下で10μM stERAPを24時間反応させ、ERE-ルシフェラーゼ活性（ERα転写活性）を測定した。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。 図１４は、ESR1のY537SをノックインしたMCF-7細胞を図中（横軸）の各濃度のstERAP単独および10nM エストロゲン存在下で24時間反応させたときの細胞増殖を評価した。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。 図１５は、HER2陽性乳がん細胞株でのBIG3はAKAPとして機能することを示す。（Ａ）HER2陽性乳がん細胞株でのBIG3の発現を示す。Luminalタイプ乳がん細胞株（MCF-7細胞）、HER2陽性乳がん細胞株（BT-474細胞、SK-BR-3細胞、KPL-4細胞）および正常乳腺細胞株（MCF-10A細胞）のBIG3のmRNAレベルをリアルタイムPCRにより求めた。データはβ2-MG含量で標準化して、MCF-10A細胞における値を1.0としたときの比率で表し、3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。（Ｂ）BIG3とPKA、PP1CαならびにPHB2が結合したイムノブロットを示す。SK-BR-3細胞およびKPL-4細胞を溶解し、抗BIG3抗体およびラットIgG抗体を用いて細胞溶解物を免疫沈降し、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。データは3回の独立した実験の代表例である。（Ｃ）BIG3のキナーゼ活性とホスファターゼ活性を示す。SK-BR-3細胞を10μM H-89、100μg/mL トラスツズマブおよび10nM ラパチニブで24時間処理した細胞溶解物を抗BIG3抗体で免疫沈降し、そのPKA活性とPP1Cα活性をCREBtideおよびp-NPBを基質として算出した。また、ネガティブ・コントロールとして、SK-BR-3細胞の溶解物をラット抗IgG抗体で免疫沈降したものを用いた。データは3回の独立した実験の平均値±SEを表す。***P < 0.001。 図１６は、HER2陽性乳がん細胞株でのBIG3の活性化機構を示す。BIG3はHER2シグナルを介したPKAによりリン酸化されるイムノブロットを示す。SK-BR-3細胞およびKPL-4細胞を10μM H-89、100μg/mL トラスツズマブおよび10nM ラパチニブで30分間処理した細胞溶解物を抗BIG3抗体で免疫沈降し、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。 図１７は、HER2陽性乳がん細胞株でのBIG3がPHB2の抑制活性を制御することを示す。（Ａ）BIG3がPHB2と結合して、そのリン酸化を制御しているイムノブロットを示す。SK-BR-3細胞およびKPL-4細胞を1μM stERAPで24時間処理した細胞溶解物を抗BIG3抗体および抗PHB2抗体で免疫沈降し、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。（Ｂ）PHB2はEGFRシグナルを介してSer39がリン酸化されるイムノブロットを示す。siRNA法によりPKAの発現を抑制したあと1μM stERAPを24時間処理したSK-BR-3細胞、ならびに1μM stERAP存在下で100μg/mLトラスツズマブおよび10nM ラパチニブで24時間処理したSK-BR-3細胞をそれぞれ溶解し、抗PHB2抗体で免疫沈降して、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。 図１８は、PKCα依存性PHB2（Ser39）のリン酸化を示す。（Ａ）HER2陽性乳がん細胞株ではPKCα依存的にPHB2（Ser39）がリン酸化されるイムノブロットを示す。siRNA法によりPKCαの発現を抑制したSK-BR-3細胞を1μM stERAPで24時間処理したあと、その細胞溶解液を抗PHB2抗体で免疫沈降して、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。（Ｂ）SK-BR-3細胞のEGFRシグナルによるPKCα活性を示す。SK-BR-3細胞を1μM stERAPおよびstERAP存在下で10nM ラパチニブで24時間処理した細胞溶解物を抗PKCα抗体で免疫沈降し、CREBtideを基質としてPKCα活性を算出した。データは3回の独立した実験の平均値±標準誤差を表す。 図１９は、リン酸化PHB2（Ser39）は核内の転写活性を抑制することを示す。（Ａ）転写抑制因子NcoRとHDAC1がPHB2（ser39）のリン酸化に結合するイムノブロットを示す。siRNA法によりPHB2の発現を抑制したSK-BR-3細胞に、HAタグ化したPHB2コンストラクト（WT）、Ser39のアラニン変異体（S39A）、Ser39のグルタミン酸変異体（S39E）をトランスフェクションし、48時間後に1μM stERAPで24時間処理した。比重遠心により核画分を単離したあと、その核抽出液を抗HA抗体で免疫沈降し、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。（Ｂ）PHB2（Ser39）のリン酸化はHER2シグナルを抑制できないイムノブロットを示す。SK-BR-3細胞を1μM stERAP存在下で100μg/mL トラスツズマブおよび10nM ラパチニブで24時間処理した細胞溶解物を抗HER2抗体で免疫沈降して、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。 図２０は、PHB2のスレオニン・リン酸化とその活性化機構を示す。（Ａ）HER2陽性乳がん細胞株ではPKCα非依存的にPHB2のスレオニン・リン酸化が誘導されるイムノブロットを示す。siRNA法によりPKCαの発現を抑制したSK-BR-3細胞を1μM stERAPおよび100μg/mL トラスツズマブで24時間処理したあと、その細胞溶解物を抗PHB2抗体で免疫沈降し、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。（Ｂ）TTKおよびMK5によってPHB2がスレオニン・リン酸化されるイムノブロットを示す。siRNA法によりTTK、CHK1、およびMK5の発現を抑制したSK-BR-3細胞を、1μM stERAPで24時間処理したあと、その細胞を溶解して図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。 図２１は、TTKおよびMK5によるPHB2のスレオニン・リン酸化がHER2シグナルに及ぼす影響を示す。（Ａ, Ｂ）TTKおよびMK5によるPHB2のスレオニン・リン酸化がHER2-HER3とHER2-Shcの結合を阻害するイムノブロットを示す。siRNA法によりTTK、MK5、およびCHK1の発現を抑制したSK-BR-3細胞（Ａ）およびKPL-4細胞（Ｂ）を、1μM stERAPで24時間処理したあと、その細胞を溶解して抗HER2抗体で免疫沈降して、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。（Ｃ）TTK阻害剤によってPHB2によるHER2-HER3とHER2-Shcの結合阻害を回避するイムノブロットを示す。SK-BR-3細胞を2μM AZ3146および1μM stERAPで24時間処理したあと、その細胞溶解液を抗HER2抗体で免疫沈降して、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。 図２２は、PHB2のスレオニン・リン酸化部位の同定を示す。（Ａ）PHB2のスレオニン・リン酸化部位がThr42とThr169であることを評価したイムノブロットを示す。siRNA法によりPHB2の発現を抑制したSK-BR-3細胞に、HAタグ化したPHB2コンストラクト、Thr42のアラニン変異体（T42A）、Thr169のアラニン変異体（T169A）、Thr42とThr169のダブル・アラニン変異体（T42A+T169A）をトランスフェクションし、48時間後に1μM stERAPで24時間処理した。その後、細胞を溶解し、抗HA抗体で免疫沈降し、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。（Ｂ）PHB2のThr42とThr169のリン酸化がHER2-HER3とHER2-Shcの結合を阻害するイムノブロットを示す。siRNA法によりPHB2の発現を抑制したSK-BR-3細胞に、HAタグ化したPHB2コンストラクト、Thr42のアラニン変異体（T39A）、Thr169のアラニン変異体（T169AE）、Thr42とThr169のダブル・アラニン変異体（T42+T169）をトランスフェクションし、48時間後に1μM stERAPで24時間処理した。その後、細胞を溶解し、抗HER2抗体および抗BIG3抗体で免疫沈降し、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。 図２３は、TTKおよびMK5によるPHB2のスレオニン・リン酸化を示す。（Ａ）PHB2とTTKが結合するイムノブロットを示す。SK-BR-3細胞を1μM stERAPで24時間処理したあと、その細胞を溶解し、抗PHB2抗体、抗TTK抗体、およびウサギIgG抗体で免疫沈降し、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。（Ｂ, Ｃ）TTKおよびMK5によるPHB2のスレオニン・リン酸化を評価するPhos-tagを用いたイムノブロットを示す。リコンビナントPHB2とリコンビナントTTK（Ｂ）およびリコンビナントMK5（Ｃ）をPHB2とのモル比を変化させて、ATP存在下で30℃、30分間反応させたあと、図中に示す抗体を用いてPhos-tagによるイムノブロット解析を行った。 図２４は、HER2陽性乳がん細胞株の増殖に及ぼすstERAPの抑制効果を示す。HER2陽性乳がん細胞株の増殖におけるstERAPの阻害効果を評価したMTTアッセイの結果を示す。SK-BR-3細胞、BT-474細胞、KPL-4細胞をstERAPで24時間反応させた。データは3回の独立した実験の平均値±SEを表す。* P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。 図２５は、stERAPがHER2-HER3ならびにHER2-Shcの相互作用を阻害することを示す。stERAPがHER2陽性乳がん細胞株のHER2-HER3およびHER2-Shcの相互作用を阻害するイムノブロットを示す。HER2陽性乳がん細胞株（SK-BR-3細胞、BT-474細胞、KPL-4細胞）を各濃度のstERAPおよび100μg/mL トラスツズマブで24時間処理したあと、その細胞溶解物を抗HER2抗体で免疫沈降し、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。 図２６は、トラスツズマブ耐性HER2陽性乳がん細胞株に対するstERAPの抑制効果を示す。（Ａ）トラスツズマブ耐性HER2陽性乳がん細胞株の増殖におけるstERAPの阻害効果を評価したMTTアッセイの結果を示す。トラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞をstERAPおよびトラスツズマブで24時間反応させた。データは3回の独立した実験の平均値±SEを表す。* P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。（Ｂ）stERAPがトラスツズマブ耐性HER2陽性乳がん細胞株のHER2-HER3およびHER2-Shcの相互作用を阻害するイムノブロットを示す。SK-BR-3細胞およびトラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞を20μM stERAPおよび100μg/mL トラスツズマブで24時間処理したあと、その細胞溶解物を抗HER2抗体で免疫沈降し、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。 図２７は、トラスツズマブ耐性HER2陽性乳がん細胞株のNF-κBシグナルに及ぼすstERAPの影響を示す。stERAPがトラスツズマブ耐性HER2陽性乳がん細胞株のNF-κBの核移行とIκBαのリン酸化を抑制するイムノブロットを示す。SK-BR-3細胞およびトラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞を20μM stERAPおよび100μg/mL トラスツズマブで24時間処理したあと、その細胞を溶解し、図中に示す抗体を用いてイムノブロット解析した。 図２８は、トラスツズマブ耐性HER2陽性乳がん細胞株の細胞周期に及ぼすstERAPの影響を示す。細胞周期におけるstERAPの効果を示したFACS解析を示す。トラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞を20μM stERAPおよび100μg/mL トラスツズマブで24時間処理したあと、細胞を固定化し、ヨウ化プロピジウムで細胞を染色してフローサイトメトリーにより解析した。 図２９は、トラスツズマブ耐性HER2陽性乳がん細胞におけるstERAPのin vivo抗腫瘍効果を示す。KPL-4細胞およびトラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞の同所性移植マウスモデルでの腫瘍増殖に対するstERAPの阻害効果を示す。左図は150μg/kgのstERAPを7日毎に投与した群の腫瘍径変動であり、右図はマウスの体重変動を示す。グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；黒丸：未処理、白丸：150μg/kg stERAP。腫瘍径および体重のデータは、各群の平均±標準誤差を示す（n＝5、***P < 0.001）。 図３０は、3種類の乳がん細胞株（SK-BR-3、BT-20、MDA-MB-231）および滑膜肉腫細胞株SW982に対して、3種類のstERAP（シングルstERAP、ダブルstERAP#45、ダブルstERAP#46）が与える細胞増殖への影響を調べた結果を示す。シングルstERAPとダブルstERAP#46は、20μMから3倍系列希釈で計11点濃度のペプチドを添加した。ダブルstERAP#45は、50μMから2倍系列希釈で計8点濃度のペプチドを添加した。ペプチド添加96時間後に生細胞数を測定し、ペプチド未添加の陰性対照細胞を基準に相対値を算出しグラフにした。SW982細胞株に対するダブルstERAP#45の実験は実施しなかった。 図３１は、SK-BR-3細胞（図３１Ａ）とMDA-MB-231細胞（図３１Ｂ）に対して、2種類のstERAP（シングルstERAP、ダブルstERAP#46）が与える細胞周期への影響を調べた結果を示す。各ペプチドを5μM濃度で添加し、96時間後に細胞をPropidium Iodide(PI)で染色し、フローサイトメーターにより各細胞の蛍光強度を測定しヒストグラムを作成した。グラフ内に各細周期（SubG1期、G1期、S期、G2/M期、＞2N細胞）の細胞数の比率を示した。 図３１－１の続きを示す図である。
　本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
定義
　本明細書で使用する「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」という単語は、特に明記しない限り「少なくとも1つの」を意味する。
　本明細書においては、特に断りの無い限り、大文字で表記されるアミノ酸は、L-アミノ酸を表す。一方、小文字で表記されるアミノ酸は、D-アミノ酸を表す。また、本明細書において表記されるL-アミノ酸およびD-アミノ酸は、アミノ基、カルボキシル基および側鎖のいずれかが修飾されたものも含み得る。好ましい修飾の例としては、アミノ基のアセチル化、カルボキシル基のアミド化、およびFLAGタグ、HAタグ等のタグペプチドの付加等が挙げられる。
　また、本明細書においては、特に断りのない限り、アミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置を示す番号は、N末端のアミノ酸残基を1としてC末端方向に順に付与したものである。
　本明細書で使用する「BIG3」という用語は、ブレフェルジンＡ阻害グアニンヌクレオチド交換タンパク質3（brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein）をさす。BIG3は、PHB2と複合体を形成することにより、エストロゲン依存的転写活性化を抑制するPHB2の機能を阻害する。BIG3は、「ARFGEF3（ARFGEF family member 3）」または「A7322」とも称される。ヒトBIG3遺伝子の代表的な塩基配列の例を配列番号：６（GenBank Accession No.NM_020340.4）に、またそれによってコードされるアミノ酸配列を配列番号：７に示す。本発明において、BIG3は前記塩基配列にコードされるものに限定されず、これらのアイソフォームや変異体も包含する。
　本明細書で使用する「PHB2」という用語は、プロヒビチン2（prohibitin 2）をさす。PHB2は、エストロゲン受容体と結合してエストロゲン受容体シグナル伝達経路を阻害し、エストロゲン依存性細胞増殖を抑制する。PHB2は、「REA（Repressor of Estrogen Activity）」とも称される。ヒトPHB2遺伝子の代表的な塩基配列の例を配列番号：８（GenBank Accession No.NM_001144831.1）および配列番号：１０（GenBank Accession No.NM_001267700.1）に、またそれらによってコードされるアミノ酸配列を配列番号：９および配列番号：１１にそれぞれ示す。本発明において、PHB2は前記塩基配列にコードされるものに限定されず、これらのアイソフォームや変異体も包含する。
　本明細書で使用する「PHB2ペプチド」という用語は、BIG3とPHB2の結合を阻害する、PHB2由来のペプチドをさす。具体的には配列番号：１７に示されるアミノ酸配列 (YGVRESVFTVE)を包含する。
　本明細書において使用される「エストロゲン受容体」という用語は、エストロゲン受容体α（ERα）およびエストロゲン受容体β（ERβ）の両方を包含する。エストロゲン受容体はエストロゲンが結合すると核内に移行し、DNA上のエンハンサー配列であるEREに結合して細胞増殖に関連する遺伝子の転写活性化を引き起こす。これにより、エストロゲン依存性細胞増殖が誘導される。ERαおよびERβはそれぞれESR1遺伝子およびESR2遺伝子によってコードされている。代表的なヒトESR1遺伝子の塩基配列を配列番号：１２（GenBank Accession No.NM_000125.3）に示す。また、代表的なヒトESR2遺伝子の塩基配列を配列番号：１４（GenBank Accession No.NM_001437.2）に示す。本発明において、ERαおよびERβは前記塩基配列にコードされるものに限定されず、これらのアイソフォームや変異体も包含する。本発明の好ましい態様では、エストロゲン受容体はERαである。
　本明細書において使用される「ERAP」という用語は、配列番号：４または配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをさす。配列番号：４または配列番号：５に記載のアミノ酸配列は、BIG3のアミノ酸配列（配列番号：７）の165～177番目または165～178番目のアミノ酸残基からなる配列であり、PHB2との結合に重要なアミノ酸残基（配列番号：７に記載のアミノ酸配列中、165番目のグルタミン（Q）、169番目のアスパラギン酸（D）および173番目のグルタミン（Q））を含む。ERAPは、PHB2に対する結合能を有し、PHB2に競合的に結合することにより、BIG3がPHB2と複合体を形成することを阻害する。
　本明細書において使用される「ステープリング構造」という用語は、ペプチドを構成するアミノ酸配列中2つ（1対）のアミノ酸残基が、架橋されている構造をさす。そして、1つまたは複数のステープリング構造によって元のアミノ酸残基が置換されているペプチドを、本明細書においては「ステープルドペプチド」という。たとえば、ステープルドERAP（stERAP、stapled ERAP）とは、配列番号：４または配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ERAP）において少なくとも1対のアミノ酸残基がステープリング構造で置き換えられたペプチドである。また、ショートステープルドERAPとは、配列番号：４または５に記載のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチド（ショートERAP）において少なくとも1対のアミノ酸残基がステープリング構造で置き換えられたペプチドである。本明細書において、ショートステープルドERAPは、「shステープルドERAP」とも表記される。
　1個のステープリング構造によって元のアミノ酸残基が置換されているペプチドを、「シングルステープルドペプチド」または「シングル架橋ペプチド」といい、2個のステープリング構造によって元のアミノ酸残基が置換されているペプチドを、「ダブルステープルドペプチド」または「ダブル架橋ペプチド」という。たとえば、シングルステープルドERAP(シングルstERAP、シングル stapled ERAP)とは、配列番号：４または配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ERAP）において1対のアミノ酸残基がステープリング構造で置き換えられたペプチドであり、ダブルステープルドERAP（dsERAP、ダブルstERAP、ダブル stapled ERAP）とは、配列番号：４または配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ERAP）において2対のアミノ酸残基がステープリング構造で置き換えられたペプチドである。
　これらのステープルドペプチドは、その一部が人為的に置き換えられた構造を有しているために、ペプチド誘導体、あるいはペプチドアナログと呼ぶことができる。
　本明細書において使用される「治療」という用語は、対象疾患によって生じる少なくとも1つの症状を緩和・改善すること、疾患の進行を抑制すること、および疾患部位の拡大を抑制すること等を包含する。例えば、「がんの治療」には、がん細胞の増殖抑制、がんの進行抑制、がんの退縮・寛解の誘導、がんに伴う症状の緩和・改善、がんの転移の抑制、術後の再発抑制、および生存期間延長の誘導などが含まれる。
本発明のペプチド
　本発明のペプチドは、配列番号：４または配列番号：５に記載のアミノ酸配列において、n対（nは自然数）のアミノ酸残基が、n個のステープリング構造で置き換えられたアミノ酸配列を含むペプチドである。nは3以下であることが好ましく、2であることがより好ましい。したがって、本発明において、n対のアミノ酸残基とは、通常1～3対、あるいは1対または2対、好ましくは2対のアミノ酸残基をさす。
　本発明のペプチドにおいて、ステープリング構造で置き換えるアミノ酸残基は、特に限定されないが、配列番号：４または配列番号：５に記載のアミノ酸配列のN末端から1番目のグルタミン（Q）、5番目のアスパラギン酸（D）および9番目のグルタミン（Q）は、PHB2との結合に重要なアミノ酸残基であるため、PHB2に対する結合親和性の観点からは、配列番号：４（QMLSDLTLQLRQR）または配列番号：５(QMLSDLTLQLRQRQ)に記載のアミノ酸配列のN末端から1番目のグルタミン（Q）、5番目のアスパラギン酸（D）および9番目のグルタミン（Q）以外のアミノ酸残基から選択することが好ましい。
　例えば、ペプチドを構成するアミノ酸残基のうち、ロイシン残基（L）にステープル構造を導入することによって、キモトリプシン耐性を付与することができる。たとえば配列番号：４または５のアミノ酸配列における3番目、6番目、8番目、および10番目からなる群から選択される少なくとも1つのLを含む少なくとも2対のアミノ酸残基は、ステープル構造に置き換える位置として好ましい。
　ステープリング構造で置き換えるアミノ酸残基の例としては、例えば、以下のアミノ酸残基の対を挙げることができる；
（ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列のN末端から3番目（L）および7番目のアミノ酸残基（T）；
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列のN末端から8番目（L）および12番目のアミノ酸残基（Q）；
（ｃ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列のN末端から3番目（L）および7番目のアミノ酸残基（T）；および
（ｄ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列のN末端から10番目（L）および14番目のアミノ酸残基（Q）。
　上記（ａ）および（ｂ）、あるいは（ｃ）および（ｄ）のアミノ酸残基をステープリング構造で置き換えることが特に好ましい。
　本発明のペプチドにおいて、ステープリング構造は特に限定されない。ペプチドのステープリング技術は公知であるため（例えば、Blakwell, H. E. et al., Angew. Chem., Int. Ed. 37, 3281-3284 (1994); Aihara, K. et al., Tetrahedron 71, 4183-4191 (2015) 等）、これら公知のステープリング技術を用いてステープリング構造を形成することができる。例えば、アルケニル基等の置換基を有するアミノ酸誘導体を組み込んで固相合成等によってペプチドを合成し、前記アミノ酸誘導体の置換基間でオレフィンメタセシス反応や分子内アミド化反応を行うことにより、ステープリング構造を形成することができる。ステープリング構造形成のためのアミノ酸誘導体は、市販のものを用いることができる。
　本発明のペプチドにおいて、好ましいステープリング構造の例としては、例えば、下記式（Ｉ）で表される構造を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、実線と点線の二重線は単結合または二重結合を示す。）
　上記式（Ｉ）のステープリング構造の形成は、例えば図７のスキーム（以下「スキーム（Ｉ）」）は、オレフィンメタセシス反応によりステープリング構造を形成する例である。一方、図８に示すスキーム（以下「スキーム（ＩＩ）」）は、分子内アミド化反応によりステープリング構造を形成する例である。
　スキーム（Ｉ）に示されるオレフィンメタセシス反応によりステープリング構造を形成する場合、ステープリングのためのアミノ酸誘導体としては、下記式（ＩＩＩ）で表されるグルタミン誘導体（4-｛アリル-［2-（tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ）-4-メトキシ-ベンジル］-カルボニル｝-2-（9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ）-酪酸）を用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　式（ＩＩＩ）のグルタミン誘導体は、例えば、以下のスキーム（ＩＩＩ）に従って合成することができる（Aihara, K. et al., Tetrahedron 71, 4183-4191 (2015)）。
スキーム（ＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 上記スキーム（ＩＩＩ）において、（ｉ）～（ｖｉ）はそれぞれ以下を示す；（ｉ）3-アミノ-1-プロペン、AcOH、MgSO4、CH2Cl2；（ｉｉ）NaBH4、MeOH、CH2Cl2；（ｉｉｉ）化合物2、DCC、CH2Cl2；（ｉｖ）LiOH・H2O、THF、MeOH、H2O；（ｖ）TBSOtf、2,6-ルチジン；（ｖｉ）Fmoc-OSu、Na2CO3、THF、H2O。
　スキーム（ＩＩＩ）に示すように、2-ヒドロキシ-4-メトキシベンズアルデヒド（化合物１）を3-アミノ-1-プロペンで還元的にアミノ化して、2-アリルアミノメチル-5-メトキシ－フェノール（化合物２）を得る。続いて、化合物2をN-α-（tert-ブトキシカルボニル）-L-グルタミン酸αメチルエステル（化合物３）とカップリングさせて、4-［アリル-（2-ヒドロキシ-4-メトキシ－ベンジル）カルバモイル］-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ－酪酸メチルエステル（化合物４）を得る。次に、化合物4のメチルエステルを加水分解して、4-［アリル-（2-ヒドロキシ-4-メトキシ－ベンジル）-カルバモイル］-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ－酪酸（化合物５）を得る。さらに、化合物５のBoc基をFmoc基に置換し、Hmb基のフェノール部分をTBSで保護することにより、式（ＩＩＩ）のグルタミン誘導体を得ることができる。なお、スキーム（ＩＩＩ）の実施に必要な試薬類は、全て市販のものを用いることができる。
　一方、スキーム（Ｉ）によるステープルドERAPの合成は、上記式（ＩＩＩ）のグルタミン誘導体を用いて、例えば、以下のように行うことができる。まず、配列番号：４または配列番号：５に記載のアミノ酸配列において、ステープリング構造を形成したい位置のアミノ酸残基の対をそれぞれ式（ＩＩＩ）のグルタミン誘導体で置き換えて、標準的なFmoc固相ペプチド合成によりペプチドを合成する。続いて、Fmoc保護されたペプチドN末端を脱保護およびアセチル化した後、アセチル化ペプチドをHoveyda-Grubbs第2世代触媒で処理してオレフィンメタセシス反応を行う。さらに、TFA/m-クレソール/チオアニソール/1,2-エタンジチオール/H2Oカクテルを用いて、酸不安定保護基の脱保護およびペプチドのレジンからの切り離しを行う。これにより、式（Ｉ）のステープリング構造（実線と点線の二重線が二重結合）を有するステープルドERAPまたはshステープルドERAPを得ることができる。なお、スキーム（Ｉ）により合成したステープルドERAPまたはshステープルドERAPにおいて、ステープリング構造の間に介在させるアミノ酸残基の数は、特に限定されないが、通常、3残基であることが好ましい。つまり、3残基を挟む1対のアミノ酸残基を1個のステープリング構造に置き換えた構造は、本発明における好ましいステープリング構造の例である。3残基を挟むステープリング構造は、ペプチドのαへリックス構造を維持するうえで有効である。
　また、スキーム（ＩＩ）に示される分子内アミド化反応によりステープリング構造を形成する場合、ステープリングのためのアミノ酸誘導体としては、下記式（ＩＶ）で表されるN-α-（9-フルオレニルメトキシカルボニル）-L-グルタミン酸γアリルエステルおよび下記式（Ｖ）で表される（S）-2-（（（（9H-フルオレン-9-イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）5-（（4-（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）ブチル）（2,4-ジメトキシベンジル）アミノ）-5-オキソペンタン酸を用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　また、上記2種類のアミノ酸誘導体のうち、式（ＩＶ）のグルタミン酸誘導体は、市販のものを用いることができる。また、式（Ｖ）のグルタミン誘導体は、例えば、図６に示されるスキーム（以下「スキーム（ＩＶ）」）に従って合成することができる。スキーム（ＩＶ）に示すように、アリル（4-アミノブチル）カルバメート（化合物１）を2,4-ジメトキシベンズアルデヒドとカップリングさせて、アリル［4-｛（2,4-ジメトキシベンジル）アミノ｝ブチル］カルバメート（化合物2）を得る。続いて、化合物２をN-α-（tert-ブトキシカルボニル）-L-グルタミン酸αメチルエステル（化合物３）とカップリングさせて、（S）-メチル-5-｛（4-［｛（アリルオキシ）カルボニル｝アミノ］ブチル）（2,4-ジメトキシベンジル）アミノ｝-2-｛（tert-ブトキシカルボニル）アミノ｝-5-オキソペンタノアート（化合物４）を得る。次に、化合物４のメチルエステルを加水分解して、（S）-5-｛（4-［｛（アリルオキシ）カルボニル｝アミノ］ブチル）（2,4-ジメトキシベンジル）アミノ｝-2-｛（tert-ブトキシカルボニル）アミノ｝-5-オキソペンタン酸（化合物５）を得る。さらに、化合物5のBoc基をFmoc基に置換することにより、式（Ｖ）のグルタミン誘導体を得ることができる。なお、スキーム（ＩＶ）の実施に必要な試薬類は、全て市販のものを用いることができる。
　一方、スキーム（ＩＩ）によるステープルドERAPの合成は、上記式（ＩＶ）のグルタミン酸誘導体および式（Ｖ）のグルタミン誘導体を用いて、例えば、以下のように行うことができる。まず、配列番号：４または配列番号：５に記載のアミノ酸配列において、ステープリング構造を形成したい位置のアミノ酸残基の対をそれぞれ式（ＩＶ）のグルタミン酸誘導体および式（Ｖ）のグルタミン誘導体で置き換えて、標準的なFmoc固相ペプチド合成によりペプチドを合成する。続いて、Fmoc保護されたペプチドをテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Pd（PPh3）4）のCHCl3/AcOH/N-メチルモルホリン溶液と混合し、グルタミン誘導体残基の置換基を還元する。続いて、N,N-ジイソプロピルカルボジイミド（DIPCDI）および1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール水和物（HOBt・H2O）を用いてグルタミン誘導体残基をカップリングさせることにより、分子内アミド化を行う。さらに、TFA/m-クレソール/チオアニソール/1,2-エタンジチオール/H2Oカクテルを用いて、酸不安定保護基の脱保護およびペプチドのレジンからの切り離しを行う。これにより、式（Ｉ）のステープリング構造（実線と点線の二重線が単結合）を有するステープルドERAPまたはshステープルドERAPを得ることができる。なお、スキーム（ＩＩ）により合成したステープルドERAPまたはshステープルドERAPにおいて、ステープリング構造の間に介在させるアミノ酸残基の数は、特に限定されないが、通常、3残基であることが好ましい。
　最初（すなわち1対目）のステープリング構造を導入後、同様の反応を繰り返すことによって次（すなわち2対目）のステープル構造を導入する位置までペプチド鎖を合成することができる。そして2回目の分子内架橋反応により、2対目のステープリング構造がもたらされる。更に架橋構造を増やす場合には、同様の反応を繰り返すことで目的とする構造を得ることができる。あるいは、1個のステープリング構造を導入した2つ（またはそれ以上）のペプチド断片を連結して、2個（またはそれ以上）のステープリング構造を導入したペプチドとすることもできる。
　したがって、ある態様において、ステープリング構造に置換される2対のアミノ酸残基は、少なくとも隣接するか、あるいは1つ以上のアミノ酸残基を介して独立して位置する。すなわち、通常は、1個のステープリング構造の内部に介在するアミノ酸残基を別のステープリング構造で置き換えることはない。たとえば2対のステープリング構造を導入する場合、ステープリング構造の間に介在するアミノ酸残基の数は、例えば0（すなわち隣接）、1、2、あるいは3とすることができる。以上のような条件を勘案すると、配列番号：４または５のアミノ酸配列中、N末端側の1対のアミノ酸残基と、0から3残基を挟んでそのC末端側に位置する2対目のアミノ酸残基のそれぞれをステープリング構造に置換したペプチドは、本発明における好ましい構造を有する。そして、各アミノ酸対を構成するアミノ酸残基のうち少なくとも1つをLとすることによって、ペプチドに、キモトリプシンの作用に対する耐性を期待することができる。
　本発明のペプチドの具体的な構造の例としては、例えば、下記式（ＩＩ）で表されるステープリング構造を少なくとも２つ備えた構造を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （式中、実線と点線の二重線は単結合または二重結合であり；
A1、A2、A3、A4およびA5の組み合わせは以下から選択される：
　　A1=QM、A2=SDL、A3=－、A4=QLR、A5=R
　　A1=QM、A2=SDL、A3=LQ、A4=RQR、A5=OH
ここで「－」はアミノ酸残基が無くペプチド結合（すなわち2個のステープリング構造は連結）であることを示し；
また「OH」は、上記ステープリング構造の一端がペプチド誘導体のC末端を構成することを示す）。
　上記式（ＩＩ）で表されるステープリング構造を2つ備えたペプチドは、配列番号：４（QMLSDLTLQLRQR）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、以下の（ａ）および（ｂ）の2対のアミノ酸残基が、それぞれ式（Ｉ）のステープル構造で置き換えられたペプチドであるともいえる；
（ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列のN末端から3番目（L）および7番目のアミノ酸残基（T）；ならびに
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列のN末端から8番目（L）および12番目のアミノ酸残基（Q）。
　あるいは、配列番号：５（QMLSDLTLQLRQRQ）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、以下の（ｃ）および（ｄ）の2対のアミノ酸残基が、式（Ｉ）のステープル構造で置き換えられたペプチドである；
（ｃ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列のN末端から3番目（L）および7番目のアミノ酸残基（T）；ならびに
（ｄ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列のN末端から10番目（L）および14番目のアミノ酸残基（Q）。
　式（ＩＩ）で表されるステープリング構造を少なくとも2つ備えたペプチドのうち、特に好ましいペプチドとしては、（ＩＩ）の式中、A1、A2、A3、A4およびA5の組み合わせが、以下から選択されるペプチドを挙げることができる；
　　A1=QM、A2=SDL、A3=－、A4=QLR、A5=R
　　A1=QM、A2=SDL、A3=LQ、A4=RQR、A5=OH
ここで「－」はアミノ酸残基が無くペプチド結合（すなわち2個のステープリング構造は連結）であることを示し；
また「OH」は、上記ステープリング構造の一端がペプチド誘導体のC末端を構成することを示す。
これらのペプチドは、以下のペプチドに対応する；
（ｉ）配列番号：４（QMLSDLTLQLRQR）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、以下の（ａ）および（ｂ）の2対のアミノ酸残基が、それぞれ式（Ｉ）のステープル構造で置き換えられたペプチド；
（ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列のN末端から3番目（L）および7番目のアミノ酸残基（T）；ならびに
（ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列のN末端から8番目（L）および12番目のアミノ酸残基（Q）；あるいは、
（ｉｉ）配列番号：５（QMLSDLTLQLRQRQ）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、以下の（ｃ）および（ｄ）の2対のアミノ酸残基が、それぞれ式（Ｉ）のステープル構造で置き換えられたペプチド；
（ｃ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列のN末端から3番目（L）および7番目のアミノ酸残基（T）；ならびに
（ｄ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列のN末端から10番目（L）および14番目のアミノ酸残基（Q）。
　なお、本発明のペプチドは、N末端およびC末端のアミノ酸残基のいずれかまたは両方が修飾されたものも包含する。修飾の種類は、特に限定されないが、PHB2に対する親和性および細胞透過性に影響を与えないものであることが好ましい。好ましい修飾の例としては、例えば、N末端のアミノ酸残基のアセチル化、C末端のアミノ酸残基のアミド化、およびHAタグ、FLAGタグ等のタグペプチドの付加等を挙げることができる。また、本発明のペプチドの特に好ましい例としては、上記式（ＩＩ）で表されるペプチドにおいて、N末端のアミノ酸残基がアセチル化されており、C末端のアミノ酸残基がアミド化されているペプチドを挙げることができる。なお、N末端およびC末端のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基は修飾されていないことが好ましい。
　本発明のペプチドは、L-アミノ酸から構成されるものに限定されず、1つ以上のD-アミノ酸を含むものであってもよい。ペプチド中のL-アミノ酸とD-アミノ酸の構成比は特に限定されないが、αヘリックス構造維持のためには、全てのアミノ酸残基がL型であるか（以下「L型ペプチド」）、または全てのアミノ酸残基がD型である（以下「D型ペプチド」）ことが好ましい。したがって、上記の本発明のペプチドのいずれかにおいて、全てのアミノ酸残基がD型のアミノ酸残基に置き換えられたペプチドもまた、本発明のペプチドの好ましい態様として挙げられる。本発明のペプチドがD型ペプチドである場合、好ましいペプチドとしては、例えば、式（ＩＩ）で表されるペプチドにおいて、全てのアミノ酸残基がD型のアミノ酸残基で置き換えられたペプチドを挙げることができる。
　さらに本発明のペプチドは、上記の本発明のペプチドのいずれかのレトロインバース体であってもよい。レトロインバース体では、元のペプチドとはアミノ酸配列が逆になっており、全てのアミノ酸残基がD型のアミノ酸残基に置き換えられている。すなわち、レトロインバース体は、元のペプチドとは逆向きのアミノ酸配列を有するD型ペプチドである。したがって、上記の本発明のペプチドのいずれかのレトロインバース体であるペプチドもまた、本発明のペプチドの好ましい態様として挙げられる。本発明のペプチドがレトロインバース体である場合、好ましいペプチドとしては、例えば、式（ＩＩ）で表されるペプチドのレトロインバース体であるペプチドを挙げることができる。
　本発明のペプチドがD型ペプチドである場合には、上記したような方法において、Ｌ－アミノ酸に替えてD-アミノ酸を用いることにより、D型のステープルドERAPまたはshステープルドERAPを合成することができる。なお、D型のステープルドERAPまたはshステープルドERAPの合成においては、ステープリング構造形成のためのアミノ酸誘導体もまたD型のものを用いる。ステープリング構造形成に使用できるD型アミノ酸誘導体の幾つかは市販されているので、これら市販のD型アミノ酸誘導体を用いてもよい。
　また、図７のスキーム（Ｉ）により、D型のステープルドERAPを合成する場合には、ステープリングのためのアミノ酸誘導体として、式（ＩＩＩ）で表されるグルタミン誘導体のD型光学異性体（以下「式（ＩＩＩ）のD-グルタミン誘導体」）を用いればよい。式（ＩＩＩ）のD-グルタミン誘導体は、上記スキーム（ＩＩＩ）において、N-α-（tert-ブトキシカルボニル）-L-グルタミン酸αメチルエステル（化合物３）に替えてN-α-（tert-ブトキシカルボニル）-D-グルタミン酸αメチルエステルを用いることにより、合成することができる。そして、配列番号：４または配列番号：５に記載のアミノ酸配列において、ステープリング構造を形成したい位置のアミノ酸残基の対をそれぞれ式（ＩＩＩ）のD-グルタミン誘導体で置き換えて、D-アミノ酸を用いて標準的なFmoc固相ペプチド合成によりD型ペプチドを合成し、スキーム（Ｉ）に従ってオレフィンメタセシス反応を行うことにより、D型のステープルドERAPを得ることができる。なお、ステープルドERAPまたはshステープルドERAPのレトロインバース体を合成する場合には、配列番号：４または５に記載のアミノ酸配列またはその部分配列の逆向きのアミノ酸配列に基づいて、ペプチド固相合成を行えばよい。その際に、ステープリング構造を形成したい位置のアミノ酸残基の対をそれぞれ式（ＩＩ）のD-グルタミン誘導体で置き換え、ペプチド合成後にオレフィンメタセシス反応を行うことは上記と同様である。
　図８に示されるスキーム（ＩＩ）により、D型のステープルドERAPを合成する場合には、ステープリングのためのアミノ酸誘導体として、式（ＩＶ）で表されるグルタミン酸誘導体のD型光学異性体（以下「式（ＩＶ）のD-グルタミン酸誘導体」）および、式（Ｖ）で表されるグルタミン誘導体のD型光学異性体（以下「式（Ｖ）のD-グルタミン誘導体」）を用いればよい。式（ＩＶ）のD-グルタミン酸誘導体は、市販のものを用いることができる。また式（Ｖ）のD-グルタミン誘導体は、図１Ａで示されるスキーム（ＩＶ）において、N-α-（tert-ブトキシカルボニル）-L-グルタミン酸αメチルエステル（化合物３）に替えてN-α-（tert-ブトキシカルボニル）-D-グルタミン酸αメチルエステルを用いることにより、合成することができる。そして、配列番号：４または配列番号：５に記載のアミノ酸配列において、ステープリング構造を形成したい位置のアミノ酸残基の対をそれぞれ式（ＩＶ）のD-グルタミン酸誘導体および式（Ｖ）のD-グルタミン誘導体で置き換えて、D-アミノ酸を用いて標準的なFmoc固相ペプチド合成によりD型ペプチドを合成し、スキーム（ＩＩ）に従って分子内アミド化反応を行うことにより、D型のステープルドERAPを得ることができる。なお、ステープルドERAPのレトロインバース体を合成する場合には、配列番号：４または配列番号：５に記載のアミノ酸配列の逆向きのアミノ酸配列に基づいて、ペプチド固相合成を行えばよい。その際に、ステープリング構造を形成したい位置のアミノ酸残基の対をそれぞれ式（ＩＶ）のD-グルタミン酸誘導体および式（Ｖ）のD-グルタミン誘導体で置き換え、ペプチド合成後に分子内アミド化反応を行うことは上記と同様である。
　また本発明のペプチドは、塩の形態であってもよい。塩の形態は特に限定されないが、薬学的に許容される塩であることが好ましい。なお、本明細書において「薬学的に許容される塩」とは、ペプチドの薬理学的または薬学的な有効性および特性を保持する塩をさす。塩の好ましい例としては、アルカリ金属（リチウム、カリウム、ナトリウムなど）との塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウムなど）との塩、その他の金属（銅、鉄、亜鉛、マンガンなど）との塩、有機塩基との塩、アミンとの塩、有機酸（酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸など）との塩、および無機酸（塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸など）との塩等を挙げることができる。これらの塩は、公知の方法に従って調製することができる。
医薬組成物
　本発明のペプチドまたはその塩は、薬学的に許容される担体とともに、医薬組成物として製剤化することができる。
　本発明のペプチドは、PHB2に対する結合能を有し、BIG3-PHB2相互作用を競合的に阻害する。BIG3-PHB2複合体の形成は、エストロゲン依存性転写活性を亢進させ、がん細胞の増殖を導く。そのため、BIG3-PHB2相互作用を阻害してBIG3-PHB2複合体の形成を抑制する本発明のペプチドは、特にがんを治療するための医薬組成物として有用である。
　BIG3-PHB2複合体の形成によるエストロゲン依存性転写活性の亢進は、主にエストロゲン受容体陽性細胞において起こる。したがって、本発明のペプチドは、エストロゲン受容体陽性のがんを治療するための医薬組成物として特に有用である。そのようなエストロゲン受容体陽性のがんの例としては、乳がん、子宮体がん、卵巣がん、前立腺がん（Nelles JL, et al., Expert Rev Endocrinol Metab. 2011 May;6(3):437-451.）、肺がん（特に非小細胞肺がん）（Stabile LP, et al., Cancer Res. 2005 Feb 15;65(4):1459-70.; Marquez-Garban DC, et al., Steroids. 2007 Feb;72(2):135-43.）等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、本発明の医薬組成物を適用するがんは、BIG3およびPHB2を発現していることが好ましいが、エストロゲン受容体陽性のがんは、一般的に、BIG3およびPHB2を発現している。がんがエストロゲン受容体陽性か否かは、ELISA法や免疫組織化学染色法等の公知の方法により確認することができる。
　さらに、本発明のペプチドは、タモキシフェン耐性のエストロゲン受容体陽性のがんに対しても増殖抑制効果を有する。そのため、本発明の医薬組成物は、タモキシフェン耐性のエストロゲン受容体陽性のがんに適用してもよい。本発明の医薬組成物を適用するタモキシフェン耐性のエストロゲン受容体陽性のがんの例としては、例えば、タモキシフェン耐性エストロゲン受容体陽性乳がんが挙げられる。したがって、本発明の医薬組成物の好ましい投与対象の例として、タモキシフェン療法不応のエストロゲン受容体陽性乳がんを有する患者を挙げることができる。
　また本発明のペプチドは、エストロゲン受容体(ESR1)に変異を有する乳がん細胞においても増殖阻害作用を示した。ESR1の変異は、ホルモン療法に対する抵抗性の獲得機序の一つと考えられている。更には、トリプルネガティブの乳がん細胞においても、本発明のペプチドは優れた細胞増殖抑制作用を示した（図３０）。トリプルネガティブとは、一般に、乳がん細胞が、主要な薬物治療の標的因子である、HER2、エストロゲン受容体、およびプロゲステロン受容体の発現を欠くことを指す。そのため、トリプルネガティブの乳がんは、通常、薬物治療に抵抗性である。あるいは、本発明者らは、本発明のペプチドが、一般に悪性度の高い乳がんとして知られるHER2陽性の乳がん細胞に対しても、高い細胞増殖抑制効果を持つことを見出した。したがって、本発明のペプチドは、これらの治療抵抗性、あるいは悪性の乳がんの患者に投与するための医薬組成物として有用である。
　すなわち本発明は、本発明のペプチドを含む医薬組成物であって、薬物療法抵抗性の乳がん患者および悪性の乳がんのいずれかまたは両方に投与するための医薬組成物を提供する。また本発明は、薬物療法抵抗性の乳がん患者および悪性の乳がんのいずれかまたは両方の治療において使用するための、本発明のペプチドに関する。更に本発明は、本発明のペプチドの、薬物療法抵抗性の乳がん患者および悪性の乳がんのいずれかまたは両方の治療のための医薬組成物の製造における使用に関する。あるいは本発明は、薬物療法抵抗性の乳がん患者および悪性の乳がんのいずれかまたは両方を有する患者を選択する工程と、選択された患者に本発明のペプチドを投与する工程を含む、乳がんの治療方法をも提供する。
　薬物療法抵抗性の乳がん患者は、一般的な薬物療法の後に、その治療成績を観察することで特定することができる。具体的には、治療によって、病巣の縮退が明確に観察されない場合に、治療抵抗性であることを知ることができる。なお病巣の拡大が阻止された状態は、病巣の縮退に含まれる。あるいは乳がんの悪性度を予測するマーカーが公知である。それらのマーカーが検出された場合に、患者が悪性度の高い乳がんを有することがわかる。たとえば、HER2は、乳がんの悪性度の指標の一つである。また、トリプルネガティブの乳がん患者も薬物療法に抵抗性を持つとされている。トリプルネガティブとは、前出のHER2に加えて、エストロゲン受容体とプロゲステロン受容体の発現を欠くことによって特徴付けられる乳がんである。これらの悪性度や薬物療法抵抗性のマーカーは、免疫染色や遺伝子発現解析によって定量的に評価することができる。たとえば、陰性対照と同程度の発現レベルに有る場合には、ネガティブと判断される。陰性対照には、これらのマーカーの発現を欠いた治療抵抗性のがん細胞株を用いることができる。
　本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドまたはその塩と、薬学的に許容される担体とを配合して、公知の製剤化技術を用いて製造することができる。なお、本明細書において「薬学的に許容される担体」とは、薬物のための希釈剤または溶媒剤として使用する不活性な物質をさす。本発明の医薬組成物に使用する薬学的に許容される担体は、調製する医薬組成物の剤形に応じて、一般的な医薬品に使用される担体を適宜選択すればよい。
　本発明の医薬組成物の剤形は、特に限定されず、液剤、錠剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の医薬品に一般的に使用される剤形を適宜選択することができる。また、選択した剤形に応じて、適宜、賦形剤、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤、溶解補助剤、pH調整剤、凝集抑制剤等の添加物を添加することができる。
　本発明の医薬組成物は、薬学的有効量の本発明のペプチドまたはその塩を含む。薬学的有効量は、医薬組成物の剤形、投与間隔、投与対象の年齢、性別、体重、体表面積、疾患の種類等に応じて、適宜選択することができる。例えば、本発明の医薬組成物における本発明のペプチドまたはその塩の含有量の例として、0.001mg～1000mg、0.01mg～100mg、0.1mg～30mg、0.1mg～10mg等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　また、本発明の医薬組成物は、任意で、他の薬剤を含んでもよい。他の薬剤の例としては、抗炎症剤、鎮痛剤、解熱剤、他のがん治療剤等が挙げられる。本発明の医薬組成物に使用できる他のがん治療剤は特に限定されないが、エストロゲン陽性のがんに使用する場合には、選択的ERαモジュレーター（例えば、タモキシフェン及びラロキシフェン）、ERαダウンレギュレーター（例えば、フルベストラント）、アロマターゼ阻害剤、LH-RHアゴニスト製剤、プロゲステロン製剤等のホルモン療法剤を挙げることができる。またこれらの薬剤は、プロドラッグや薬学的に許容される塩の形で配合してもよい。
　本発明の医薬組成物は、剤形に応じて、適宜適切な投与経路を選択して、対象に投与することができる。投与経路は、特に限定されないが、例えば、経口投与、ならびに皮内、皮下、筋肉内、骨内、腹膜および静脈内注射等を挙げることができる。また、全身投与および疾患部位の近傍への局所投与のいずれであってもよいが、局所投与が好ましい。より具体的には、がん組織やその近傍に注射等の手段によって本発明の医薬組成物を投与することができる。あるいは本発明の医薬組成物を、外科的にがん組織内やその近傍に投与することもできる。本発明の医薬組成物は、適当な担体と配合することによって徐放性製剤とすることもできる。
　本発明の医薬組成物の投与間隔もまた、投与対象の年齢、性別、体重、体表面積、および疾患の種類等、ならびに本医薬組成物の剤形および投与経路等に応じて、適宜選択することができる。投与間隔の例としては、例えば、毎日、4日毎、7日毎等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の医薬組成物の用量もまた、投与対象の年齢、性別、体重、体表面積、および疾患の種類等、ならびに本医薬組成物の剤形および投与経路等に応じて、適宜選択することができる。
　本発明のペプチドまたはその塩の用量の例としては、例えば、0.001～1000mg/kg/日、0.005～500mg/kg/日、0.01～250mg/kg/日等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　本発明の医薬組成物は、投与対象の状態に応じて、他の医薬品と併用してもよい。併用する医薬品は特に限定されないが、エストロゲン受容体陽性のがんに使用する場合には、選択的ERαモジュレーター（例えば、タモキシフェン及びラロキシフェン）、ERαダウンレギュレーター（例えば、フルベストラント）、アロマターゼ阻害剤、LH-RHアゴニスト製剤、プロゲステロン製剤等のホルモン療法剤を挙げることができる。これらのホルモン療法剤のうち、特に好ましいものとしては、タモキシフェンおよびフルベストラントを挙げることができる。
　本発明の医薬組成物をがんの治療のために使用する場合には、投与の前に、治療対象のがんがBIG3およびPHB2を発現しているか否かを調べてもよい。治療対象のがんがBIG3およびPHB2を発現しているか否かは、対象から採取された試料においてこれらの遺伝子の転写産物や翻訳産物を検出することにより確認することができる。検出方法には公知の方法を用いることができ、例えば、転写産物をプローブやPCR法により検出する方法（例えば、cDNAマイクロアレイ法、ノーザンブロット法、RT-PCR法など）、および翻訳産物を抗体等により検出する方法（例えば、ウェスタンブロット法、免疫染色法など）等を用いることができる。
　本発明はまた、本発明の医薬組成物を含む製品またはキットを提供する。本発明の製品またはキットは、本発明の医薬組成物を収容した容器を含み得る。適切な容器の例としては、ボトル、バイアル、および試験管が挙げられるが、これらに限定されない。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器には、ラベルが貼付されていてもよく、ラベルには、本発明の薬学的組成物が使用されるべき疾患または疾患の状態を記載することができる。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。
　本発明の製品またはキットは、本発明の医薬組成物を収容した容器に加えて、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第2の容器をさらに含み得る。本発明の製品またはキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明を記載した添付文書などの、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。
　本発明の医薬組成物はまた、必要に応じて、有効成分を含む1つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。
　別の態様において、本発明はまた、以下の使用および方法等を提供する：
（ａ）がんを治療するための医薬組成物の製造における、本発明のペプチドまたはその塩の使用；
（ｂ）がんの治療において用いるための本発明のペプチドまたはその塩；
（ｃ）がんを治療するための医薬組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドまたはその塩と、薬学的に許容される担体とを製剤化する段階を含む方法または工程；
（ｄ）がんを治療するための医薬組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドまたはその塩を薬学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程；および
（ｅ）本発明のペプチドまたはその塩を対象に投与することを含む、がんを治療するための方法。
　以下、実施例を参照して本発明をより詳細に記載する。しかしながら、以下の材料、方法および実施例は、本発明のある形態の作製および使用において当業者を支援するために役立ち得る一方、本発明の局面を説明するためのものにすぎず、したがって本発明の範囲を決して限定することを意図しない。当業者は、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができる。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
実施例１　ダブルステープルドペプチドの合成
ダブルステープルドERAP No.45（配列番号：２）およびステープルドERAP No.46（配列番号：３）の合成
　Rink Amide AMレジン（content:0.62mmolアミン/g）を用い、Fmoc型固相合成法によりペプチド鎖の伸張を行った。ダブルステープルドERAP No.45の前駆体配列QMX1SDLX2X1QLRX2R、ダブルステープルドERAP No.46の前駆体配列QMX1SDLX2LQX1RQRX2のステープル化に必要な箇所に非天然アミノ酸X(X1=Fmoc-Glu(OAllyl)-OH;X2=Fmoc-Glu(N(DMB)-CH2CH2CH2CH2-NH-Alloc)-OHを導入した。天然型アミノ酸についてはFmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OHをそれぞれ樹脂に対し3当量用いた。N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)中にO-ベンゾトリアゾリル-N’,N’,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU;アミノ酸に対し0.99当量)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA;アミノ酸に対し2当量)を用い、室温30秒活性化後、固相樹脂上のアミノ基に対し、室温2時間反応させた。非天然アミノ酸Xについては樹脂に対し1.5当量のアミノ酸を利用し、同じくHBTUを活性化剤として室温2時間反応させた。なお、Fmoc基の切断は20%ピペリジンDMF溶液により室温10分間の処理で行った。
　ステープル化についてはC末端側より一組のX1とX2が導入された時点で行った。すなわち、Nα-Fmoc保護ペプチド樹脂をAr雰囲気下、N-メチルモルホリン（10当量)/AcOH/CHCl3（0.5:2:37.5（v/v)）の混合溶媒中Pd(PPh3)4(3当量)を加え室温で12時間撹拌（2回行う）、アリル基及びアロック（Alloc）基の除去を行った。保護基除去後の樹脂の洗浄は、CHCl3、DMF、1Mジメチルジチオカルバミン酸ナトリウム/DMF（セミカルバジド溶液）、CHCl3、DMF、1M 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)・H2O/NMP（2回目の脱保護後のみ）の順に樹脂を洗浄した後、N-メチル-2-ピロリドン (NMP)中1M HOBt・H2O/NMP（10当量）、DIPCI（10当量）を加え室温で24時間反応を行い、分子内アミド結合形成を行った。なお、2つ目のステープル化については樹脂の伸張終了後、Nα-アセチル化樹脂に対し、上記と同様の手法で行った。また、N末端のアセチル化は(AcO)2O(アミノ酸に対し10当量)、DIPEA(アミノ酸に対し10当量)を用い行った。
　アミノ酸の伸張および側鎖ステープル化の終了した樹脂をTFA-チオアニソール-m-クレソール-1，2-エタンジチオール(EDT)-H2O(80:5:5:5:5(v/v), 樹脂1mgに対し脱保護反応液50μL)にて、室温2時間処理し、側鎖保護基の切断を行った。反応液を濃縮後、Et2Oを加え、粗ペプチドを沈殿させ、Et2O洗浄を3回行い、HPLC精製用サンプルを得た。ペプチドの精製条件ならびに質量分析結果は以下の通りである。
ダブルステープルドERAP No.45
Column:Cosmosil 5C18（10ｘ250mm）;Solvent:
A 0.1% TFA-H2O，B 0.1% TFA in CH3CN，
B（10%-45% over 30min）in solvent A;
Flow:3.0mL/min;Detect:220nm，
Retention time 24.5min 
MS m/z calcd for C76H130N26O23S［M+2H］＋ 904.5, 
found 904.6 
ダブルステープルドERAP No.46
Column:Cosmosil 5C18 (10ｘ250mm);Solvent:
A 0.1%TFA-H2O，
B 0.1%TFA in CH3CN， B(10%-45% over 30min)in solvent A;
Flow:3.0mL/min;Detect:220nm,
Retention time 19.8min
MS m/z calcd for C81H138N28O25S [M+2H]＋ 968.5, 
Found 968.6
非天然アミノ酸X1及びX2の構造 (X1=Fmoc-Glu（OAllyl）-OH；X2=Fmoc-Glu（N（DMB）- CH2CH2CH2CH2-NH-Alloc）-OH)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
実施例２　エストロゲン依存性乳がん細胞に対するダブルステープルドERAPの効果
材料と方法
細胞株および培養条件
　ヒト乳がん細胞株MCF-7はJCRB細胞バンク（大阪、日本）から、乳腺上皮細胞株MCF-10AはAmerican Type Culture Collection（ATCC，Manassas，VA，USA）から購入した。すべての細胞株は適切な培地で、5％CO2、37℃で細胞を維持した。
　細胞増殖アッセイには、各細胞48ウェルプレート（2×104細胞/200μL）を、免疫沈降法には各細胞10cmディッシュ（2×106細胞/10mL）を使用して播種した。
MCF-7細胞は、10％FBS（ニチレイバイオサイエンス、東京、日本）、1% Antibiotic/Antimycotic solution（Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA）、0.1mM NEAA（Thermo Fisher Scientific）、1mM ピルビン酸ナトリウム（Thermo Fisher Scientific）および10μg/mLインスリン（Sigma,St.Louis,MO,USA）を補充したMEM（Thermo Fisher Scientific）に播種した。MCF-10A細胞は、Single Quotsキット（BPE、ヒドロコルチゾン、hEGF、インスリン、ゲンタマイシン/アンホテリシンB）（Lonza,Walkersville,MD,USA）および100ng/mLコレラトキシンを補充したMEBM（Lonza）に播種した。MCF-7細胞については、17β-エストラジオール（エストロゲン、Sigma）刺激のために、播種の次の日に10％FBS、1% Antibiotic/Antimycotic solution、0.1mM NEAA、1mMピルビン酸ナトリウムおよび10μg/mLインスリンを補充したフェノールレッドフリーのDMEM/F12（Thermo Fisher Scientific）に培地を変更した。24時間後、10nMエストロゲンのみ、または10nMエストロゲンとペプチド（シングルステープルドERAP、ダブルステープルドERAP）で細胞を処理した。
細胞増殖アッセイ
　MCF-7およびMCF-10Aにおける細胞増殖アッセイは、Cell Counting Kit-8（CCK-8、同仁堂、熊本、日本）を用いて行った。データは3つの独立した実験の平均±標準偏差で示した。
キモトリプシン抵抗性
　キモトリプシン抵抗性は、緩衝液(50mM Tris-HCl;pH8.0,10mM CaCl2)中に1μgキモトリプシン(#C7761、Sigma)と5μgのダブルステープルドERAPを添加し、37℃で24時間反応させて、全量を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で解析した。HPLCは逆相カラム(Inertsil Peptides C18 250ｘ3.0mm I.D.、ジーエルサイエンス、東京、日本)を用い、A液(0.1%トリフルオロ酢酸)とB液（0.1%トリフルオロ酢酸/アセトニトリル)をグラジエント溶出（A/B=90/10(0-20min)、90/10-40/60(20-80min)）で流速0.3mL/minで行い、各ダブルステープルドERAPのクロマトグラムをUV210nMで検出した。
抗体およびイムノブロット解析
　イムノブロット解析は、SDS-PAGE後にタンパク質をブロットしたメンブレンを4%ブロックエース溶液（大日本製薬、大阪、日本）で3時間ブロッキングした後、BIG3（1:1,000）とPHB2（1:1,000、Abcam,Cambridge,UK）に対する抗体と12時間反応させた。その後、HRP標識二次抗体（BIG3は抗ラットIgG-HRP、1:5,000、PHB2は抗ウサギIgG-HRP、 1:1,000、Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX,USA）と1時間反応させ、ブロットを増強化学発光（ECL）システム（GE Healthcare,Buckinghamshire,UK）で展開し、Image Reader LAS-3000mini（富士フィルム、東京、日本）を用いてスキャンした。
免疫沈降
　免疫沈降解析は、細胞溶解緩衝液（50mM Tris-HCl;pH8.0,150mM NaCl,0.1% NP-40,and 0.5% CHAPS、0.1% protease inhibitor cocktail III）で溶解した細胞溶解物をラットIgG抗体とrec-Protein Gセファロース4B（Thermo Fisher Scientific）を用いて、4℃で3時間プレクリアした。その後、上清をBIG3に対する抗体5μgと4℃で12時間反応させた。次に、抗原抗体複合体をrec-Protein Gセファロース4B用いて4℃で1時間沈降した。免疫沈降されたタンパク質複合体を細胞溶解緩衝液で4回洗浄して、SDS-PAGEおよびイムノブロット解析を行った。
結果
ダブルステープルドERAPの合成（実施例１ダブルステープルドERAP合成方法を参照）
　シングルステープルドERAP（配列番号：１）は長期安定的にエストロゲン依存性の腫瘍増殖を抑制できたが、分子内架橋の数を増やすことで、さらなる安定性の亢進を試みた。分子内架橋の場所は、キモトリプシンに対する抵抗性を考慮してロイシン残基を架橋するように設計し、シングルステープルドERAPの位置（167Lと171T）に加えて、172Lと175Qの架橋（図１、ダブルステープルドERAP No.45）および174Lと178Qの架橋（図１、ダブルステープルドERAP No.46）を有したダブルステープルドERAPを合成した。
エストロゲン依存性増殖に対するダブルステープルドERAPの長期安定性
　シングルステープルドERAPの96時間処理は、エストロゲン依存性のMCF-7細胞の増殖を濃度依存的に抑制し、そのIC50は0.88μMであった。ダブルステープルドERAP No.45は、10μMの96時間処理でほぼ完全な抑制効果を持続していたが、1μMまではエストロゲン依存性の細胞増殖をほとんど抑制することができず、その抑制効果はシングルステープルドERAPより劣り（IC50=2.32μM、図２Ａ）、連続したステープリング立体構造が膜透過性などに影響をおよぼした可能性が示唆された。一方、ダブルステープルドERAP No.46は、ダブルステープルドERAP No.45と異なり、エストロゲン依存性増殖に対する抑制効果はシングルステープルドERAPよりも強く、1μMでも81%の抑制率を示し（図２Ｂ、シングルステープルドERAP：51%の抑制率、ダブルステープルドERAP No.45：21%の抑制率）、IC50は0.43μMとシングルステープルドERAPを2倍亢進していた（図２Ｃ）。
ダブルステープルドERAPのキモトリプシン耐性
　ダブルステープルドERAP No.45とNo.46の24時間のキモトリプシン処理に対する抵抗性を検討した。キモトリプシン処理によるタンパク質の分解は、図３の中の黒矢印で示す。その結果、ダブルステープルドERAP No.45はキモトリプシン処理による分解がいくつか観察されたのに対して（図３Ａ）、ダブルステープルドERAP No.46のキモトリプシン処理はその分解がほとんど認められなかった（図３Ｂ）。キモトリプシン処理によるタンパク質分解に対する抵抗性は、生体内でERAPが分解されにくいことを示唆し、エストロゲン依存性細胞増殖の長期安定的な抑制効果の維持に反映されると考えられた。
ダブルステープルドERAPの乳腺上皮細胞の増殖におよぼす影響
　ダブルステープルドERAP No.46の1μMおよび10μMを用いて、MCF-10A細胞の増殖におよぼす影響を検討した。MCF-10A細胞はERα、BIG3ともに陰性の正常な乳腺上皮細胞である。その結果、ダブルステープルドERAP No.46はERα、BIG3ともに陽性である乳がん細胞MCF-7において、エストロゲン依存性の細胞増殖を1μMと10μMで96時間後に79％、91％の抑制率を示していたが（図２Ｂ）、MCF-10A細胞の増殖には10μMまでほとんど影響せず（図４）、ダブルステープリング構造が正常な乳腺上皮細胞の機能に関与しないことが示唆された。
ダブルステープルドERAP No.46のBIG3-PHB2相互作用の結合阻害
　ダブルステープルドERAP No.46の1μMおよび10μMを24、96時間処理したとき、BIG3とPHB2の相互作用に対する阻害効果を検討した。その結果、24時間処理ではダブルステープルドERAPはBIG3とPHB2の結合を1μMでほぼ完全に阻害していたのに対して（図５Ａ）、シングルステープルドERAPは10μMでほぼ完全な阻害効果であったが、1μMで46％の阻害率と減弱していた（図５Ａ）。また、96時間処理ではダブルステープルドERAP No.46は1μMで60%、10μMで95％の阻害率と24時間処理と比べてわずかに減弱していたが（図５Ｂ）、強い抑制効果を持続していた。一方、シングルステープルドERAPは1μMで抑制効果はほとんど認められず、10μMで81%であった（図５Ｂ）。以上の事実から、ダブルステープルドERAP No.46はシングルステープルドERAPより低濃度でBIG3とPHB2の結合を阻害することができ、その結果、より低濃度で増殖抑制が可能であると判断された。
実施例３　ESR1変異体の乳がん細胞に対するstERAPの効果　
材料と方法
細胞株
　MCF-7細胞とHEK293T細胞はAmerican Type Culture Collection（ATCC, Manassa, VA, USA）から購入した。Y537SノックインMCF-7細胞はLaki Buluwela博士（Imperial College London，UK）から提供された。すべての細胞株は、それぞれの寄託者の推奨する条件下で培養された。
細胞培養
　MCF-7細胞は10% FBS（ニチレイバイオサイエンス、東京、日本）と1% Antibiotic/Antimycotic solution（Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA）、0.1mM NEAA（Thermo Fisher Scientific）、1mM ピルビン酸ナトリウム（Thermo Fisher Scientific）および10μg/mLインスリン（Sigma,St.Louis,MO,USA）を添加したMEM（Thermo Fisher Scientific）で、HEK293T細胞は10% FBSと1% antibiotic/antimycotic solutionを添加したDMEM（Sigma）で、Y537SノックインMCF-7細胞は10% FBS、1% antibiotic/antimycotic solution、0.1mM NEAAを添加したDMEM（Sigma）で培養した。各細胞は、48ウェルプレート（2×104cells/0.2mL）、6ウェルプレート（5×105cells/2mL）、10cm dish (2×106cells/10mL)に播種し、5%CO2、37℃でインキュベートして24時間後にstERAPなどの阻害剤で処理した。
化合物と阻害剤
　BIG3-PHB2の結合阻害ペプチドは、WO2017/12646に記載されるシングルのステープルドERAP（stERAP、stapled ERAP）を用いた。タモキシフェンはSigmaから、フルベストラントはLKT laboratories社（St.Paul,MN,USA）、エベロリムスはCell Signaling Technology（Danvers,MA,USA）から購入し、staurosporineとwortmanninはオンコセラピー・サイエンス社（神奈川,日本）と佐々木卓也博士（徳島大学、徳島、日本）から提供された。
ウェスタンブロット解析
　細胞を0.1% protease inhibitor cocktail III（Calbiochem,San Diego,CA,USA）を含む溶解緩衝液（50mM Tris-HCl: pH8.0,150mM NaCl,0.1% NP-40,0.5% CHAPS）で溶解した。細胞溶解物を電気泳動し、ニトロセルロースメンブレンにブロットし、4% BlockAce solution（大日本製薬、大阪、日本）で3時間ブロッキングした。メンブレンを、抗FLAGタグ抗体（M2）（Sigma）；抗PHB2抗体（Abcam,Cambridge,UK）；抗PKCα抗体 (H-7) 、抗PI3-kinase p85α(U13)（Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, CA, USA)；抗リン酸化PI3K p85/p55抗体（Tyr458/Tyr199）、抗リン酸化PKCα/βII抗体（Thr638/Thr641）(Cell Signaling Technology)；抗ERα抗体 (SP1)（Thermo Fisher Scientific）；抗リン酸化PHB2精製抗体（Ser39）(株式会社スクラム,東京,日本）の存在下で12時間インキュベートした。HRP結合二次抗体（Santa Cruz Biotechnology）の存在下で1時間インキュベートした後、メンブレンをenhanced chemiluminescence system（GE Healthcare, Buckinghamshire, UK）で展開した。ブロットは、Image Reader LAS-3000 mini（富士フィルム、東京、日本）を用いてスキャンした。
免疫沈降
　「ウェスタンブロット解析」の項で述べたように、細胞を0.1% NP-40溶解緩衝液で溶解し、Normal IgGおよびrec-Protein G Sepharose 4B（Thermo Fisher Scientific）を用いて、4℃で3時間、細胞溶解物をプレクリーンした。遠心分離後、上清を5μgの抗PKCα抗体、抗ERα抗体、および抗FLAGタグ抗体の存在下で4℃、12時間インキュベートした。その後、rec-Protein G Sepharose 4Bを添加して4℃、1時間インキュベートすることで、抗原－抗体複合体を沈降させた。免疫沈降されたタンパク質複合体を溶解緩衝液で3回洗浄し、SDS-PAGEにより分離した。その後、ウェスタンブロット解析を行った。
PKCα(Protein Kinase C alpha)活性
　PKCαの活性は、PKCαの免疫沈降物をキナーゼ緩衝液（25mM Hepes,pH7.2、25mM MgCl2、5mM EDTA、5mM EGTA、0.25mM DTT）下で基質Ser39を含むPHB2ペプチド（YGVRESVFTVE (配列番号：１７)）および0.5mM ATPと30℃、30分間反応させ、ADP-Glo kinase assay Kit (Promega,Fitchburg,WI,USA)を用いて測定した。
細胞増殖アッセイ
　Cell-Counting Kit-8（CCK-8,同仁堂、熊本、日本）を用いて細胞増殖アッセイを行った。細胞を2×104cells/wellで48ウェルプレートに播種し、5% CO2存在下のインキュベーター（37℃）で維持した。指示された時点で、10倍希釈したCCK-8溶液を添加して30分間インキュベートし、450nmの吸光度を測定して生存細胞の数を計算した。
ルシフェラーゼ・レポーターアッセイ
　EREレポーターアッセイのために、MCF-7細胞にEREレポーター（SABiosciences,Frederick,MD,USA）をトランスフェクションして16時間後に、培地をアッセイ培地（Opti-MEM、10% FBS、0.1mM NEAA、1mM Sodium pyruvate、10μg/mL インスリン）に交換し、8時間後にエストロゲンおよびstERAPを24時間処理した。細胞溶解物をPromega dual luciferase reporter assay (プロメガ、東京、日本)を用いて、ルシフェラーゼ活性およびRenilla-ルシフェラーゼ活性を評価した。トランスフェクション効率を考慮して、全てのデータをRenilla-ルシフェラーゼ活性により標準化した。
統計解析
　試験群間の差異の統計的有意性を決定するためにスチューデントのt検定を使用し、P値 < 0.05で有意とみなした。
結果
ESR1変異体の乳がん細胞株はエストロゲン非依存的にPI3Kと結合する
　乳がんの70％はエストロゲン受容体（ERα）を発現しており、この大部分はERαの抑制に感受性である。しかしながら、ERα陽性の進行乳がんでは、リガンド結合ドメインにERα遺伝子（ESR1）の突然変異を認め、このような遺伝子変異がリガンド非依存性に活性化され、内分泌療法に対して抵抗性を有する可能性が示唆されている（Nat Genet,45,1439,2013、Nat Genet,45,1446,2013）。また、ERα陽性乳がんではエストロゲン・シグナルに加え、PI3K（phosphatidylinositol 3-kinase）/AKT（protein kinase B）/mTOR（mammalian target of rapamycin）経路が極めて重要な働きをしており、内分泌療法の耐性機序に関与していることが報告されている（Cancer Discov. 2011 Sep;1(4):338-51、Nature, e2012 Oct 4;490(7418):61-70、Cancer Lett.2012 Oct 1;323(1):77-87、Clin Breast Cancer.2015 Jun;15(3):197-203）。まず、ESR1の野生型（WT）と変異型（Y537S）がPI3Kと結合するかどうかを検討した。その結果、WTをトランスフェクションしたMCF-7細胞はエストロゲン未処理ではERαとPI3Kの結合はまったく認められなかったが、エストロゲン存在下ではERαとPI3Kの結合ならびにPI3Kのリン酸化が観察された（図９Ａ）。一方、Y537SをトランスフェクションしたMCF-7細胞では、WTとは異なり、未処理でもPI3KがY537Sに結合してリン酸化され、PKCαの活性化（Thr638/Thr641のリン酸化）も認められた（図９Ｂ）。これは、ESR1の変異による構造変化がエストロゲン非依存的にESR1変異体とPI3Kの結合を可能にし、耐性獲得の要因になっている可能性を示唆するものである。さらに、10μM stERAPを処理すると、BIG3から遊離したPHB2がエストロゲン非存在下でもY537Sに新たに結合し、stERAP処理後1時間で最大のPHB2量の結合を認めたが、そのあとにPI3KならびにPKCαのリン酸化は減少していった（図９Ｂ）。興味深いことに、PHB2のSer39のリン酸化はstERAP処理後すぐに誘導され、3時間までに最大のリン酸化強度を示したが、それ以降の強度はPI3Kリン酸化の減少のため減弱していた（リン酸化PHB2のネガティブ制御、図９Ｂ）。しかしながら、PI3KならびにPKCαのリン酸化強度と比べると、PHB2（Ser39）のリン酸化はある程度の強度を維持していたことから（図９Ｂ）、stERAPはERα-Y537Sの耐性細胞に対する抑制効果を有していると考えられた。
ESR1変異体の乳がん細胞株はエストロゲン非依存的に高いPKCα活性を有している
　ESR1変異体がPI3Kに結合することから、PI3Kの下流分子であるPKCを活性化することが考えられる（Biochem Biophys Res Commun,310, 720, 2004）。また、ERα陽性乳がんではエストロゲン刺激を介したPKCαの活性化がPHB2のSer39をリン酸化することを明らかにしてきたので（Nat Commun,8,15427,2017）、ESR1変異体の乳がん細胞株におけるPKCαの活性状態を評価した。実験は、各ESR1変異体をトランスフェクションしたHEK293T細胞およびMCF-7細胞にPKCα阻害剤staurosporineを24時間処理したあと、抗PKCα抗体で免疫沈降して、Ser39を含むPHB2ペプチド（YGVRESVFTVE (配列番号：１７)）を基質としてPKCα活性を測定した。その結果、ESR1変異体細胞はmockやWTと比較して顕著なPKCα活性を示したのに対して（図１０Ａ）、staurosporine処理はその活性をほぼ完全に抑制したことから（図１０Ａ）、ESR1変異体細胞のPKCα活性はPI3K由来の可能性が考えられた。
そこで、各ESR1変異体をトランスフェクションしたMCF-7細胞に対して、PI3K阻害剤wortmanninを24時間処理したときのPKCα活性およびリン酸化PI3Kを評価した。その結果、各ESR1変異体をトランスフェクションした細胞のPKCαの活性はwortmannin処理により有意に抑制された（図１０Ｂ）。さらに、ESR1変異体をトランスフェクションした細胞は、PKCαおよびPI3Kのリン酸化がWTより顕著に誘導されたが、その各リン酸化はwortmanninでほぼ完全に阻害されていたことから（図１０Ｃ）、PI3Kの下流にPKCαの活性化が存在していることが示唆された。さらに、各ESR1変異体細胞株のPKCα活性とリン酸化PKCαの強度がほぼ相関しており、Y537Sをトランスフェクションした細胞株がもっとも高いPKCαの活性化とリン酸化を示した。
ESR1変異体の乳がん細胞株の増殖に対するstERAPと抗エストロゲン剤との併用効果
　ESR1変異体を過剰発現させたMCF-7細胞の増殖に対するstERAPと既存のホルモン剤（タモキシフェン、フルベストラント）および分子標的薬（mTOR阻害剤エベロリムス）の併用効果を、96時間反応で検討した。実験は、エストロゲン非存在下で各ESR1変異体をトランスフェクションしたあと、10μM stERAP、1μM タモキシフェン、2μM フルベストラントおよび0.5μM エベロリムス処理を行った。その結果、96時間のstERAP単独処理はESR1変異体のトランスフェクション細胞の増殖を有意に抑制し、特にY537Sの変異体で49%の抑制率を示した（図１１）。さらに、タモキシフェン、フルベストラントならびにエベロリムスとの併用は、ESR1変異体の細胞増殖を相乗的に抑制することができ、すべての変異体細胞株の増殖に対して80%以上の抑制率を示した（図１１）。
エストロゲン存在下のESR1変異体の乳がん細胞株の増殖に対するstERAPの抑制効果
　ESR1変異体をトランスフェクションした細胞株の増殖に対して、stERAP処理はエストロゲン非存在下で40～50%の抑制率を示したので（図１１）、エストロゲン存在下でのstERAPの抑制効果が亢進するかどうかを検討した。その結果、エストロゲン非存在下でのstERAPの単独処理はmockとWTの細胞増殖をほとんど抑制しなかったのに対して、S463P,Y537S,D538G,S463P/D538Gの変異体の細胞増殖では各24%,44%,39%,40%の抑制率を示した（図１２）。一方、エストロゲン存在下のstERAP処理は、mockとWTではエストロゲン刺激による増殖をほぼ完全に抑制することができ、各ESR1変異体では1nM以上のエストロゲンが共存することでstERAPの抑制効果が相乗的に亢進し、S463P,Y537S,D538G,S463P/D538Gで各62%,80%,75%,77%の抑制率を示した（図１２）。さらに、10nM エストロゲン共存下では76%,82%,84%,83%とさらなる抑制率の亢進が認められた（図１２）。これはエストロゲン・シグナルが追加されたことで、stERAPの作用点が多くなり、相乗的な抑制効果を引き起こした可能性が考えられた。
ESR1変異体の乳がん細胞株のERα転写活性に対するstERAPの抑制効果
　ESR1変異体（S463P, Y537S, D538G, S463P+D538G）のERα転写活性に対するstERAPの抑制効果を検討した。実験は、ERE-ルシフェラーゼと各FLAGタグ化ESR1変異体をトランスフェクションしたMCF-7細胞を、各エストロゲン濃度（0.1,1,10nM）の共存下でstERAPを24時間処理したときのERE-ルシフェラーゼ活性（ERα転写活性）を測定した。その結果、WTのFLAGタグ化ERαをトランスフェクションした細胞ではERE-ルシフェラーゼ活性が0.1nM以上のエストロゲンで濃度依存的に増加したが、その活性はstERAP処理によりほぼ完全に抑制された（図１３）。一方、各ESR1変異体のトランスフェクション細胞ではエストロゲン非存在下でもERE-ルシフェラーゼ活性が顕著に誘導され（S463P：2.3倍、Y537S：7.5倍、D538G：5.0倍、S463P/D538G：6.6倍）、特に、Y537Sのトランスフェクション細胞はWTの10nM エストロゲン刺激と同程度の活性化が誘導されていた（図１３）。さらに、WTのエストロゲン刺激と同様に、stERAPはいずれの条件でもERE-ルシフェラーゼ性を顕著に抑制することが可能であった。
Y537SノックインMCF-7細胞の増殖に対するstERAPの抑制効果
　ESR1のY537SをノックインしたMCF-7細胞を用いて、24時間のstERAP処理が細胞増殖に及ぼす影響を検討した。その結果、stERAP処理はエストロゲン非存在下でも濃度依存的に細胞増殖を抑制し、10μMで有意な抑制効果を示し（図１４）、IC50（50%阻害濃度）は1.57μMであった。さらに、エストロゲン存在下ではエストロゲン・シグナルの追加によりstERAPの抑制率は顕著に亢進し、IC50は0.78μMであった。
実施例４　トラスツズマブ耐性HER2陽性乳がん細胞におけるstERAPの効果
材料と方法
細胞株
　ヒト乳がん細胞株（MCF-7、BT-474、SK-BR-3）はAmerican Type Culture Collection（ATCC, Rockville, MD, USA）から購入した。KPL-4は物質移動合意書の下で紅林淳一博士(川崎医科大学, 岡山, 日本)から、トラスツズマブ耐性SK-BR-3は神崎浩孝博士（岡山大学，岡山，日本）から提供された。すべての細胞株は、それぞれの寄託者の推奨する条件下で培養された。
細胞培養
　SK-BR-3細胞は10% FBS（ニチレイバイオサイエンス、東京、日本）と1% antibiotic/antimycotic solution（Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA）を添加したMcCoy’A（Thermo Fisher Scientific）で、KPL-4細胞、BT-474細胞、トラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞は10% FBSと1% antibiotic/antimycotic solutionを添加したDMEM（Sigma,St.Louis,MO,USA）で培養した。細胞の播種は、48ウェルプレート（2×104cells/0.2mL）、6ウェルプレート（5×105cells/2mL）、10cm dish (2×106cells/10mL)に播種した。細胞は、5% CO2、37℃でインキュベートし、24時間後にstERAPなどの阻害剤で処理した。
化合物と阻害剤
　BIG3-PHB2の結合阻害ペプチドは、WO2013/018690に記載されるシングルのステープルドERAP（stERAP）を用いた。リコンビナントPHB2はAbnova（Taipei, Taiwan）から、リコンビナントTTKとリコンビナントMK5はSignalChem（Richmond, Canada）から、TTK阻害剤AZ3146はSanta Cruz Biotechnologyから購入した。
ウェスタンブロット解析
　細胞を0.1% protease inhibitor cocktail III（Calbiochem, San Diego,CA,USA）を含む溶解緩衝液（50mM Tris-HCl: pH8.0,150mM NaCl,0.1% NP-40,0.5% CHAPS）で溶解した。細胞溶解物を電気泳動し、ニトロセルロースメンブレンにブロットし、4% BlockAce solution（大日本製薬、大阪、日本）で3時間ブロッキングした。メンブレンを、抗BIG3精製抗体（抗hA7322(His13),Sigma）;抗HAタグ抗体 (3F10,Roche,Mannheim,Germany);抗PHB2抗体、抗NcoR抗体（Abcam, Cambridge,UK）;抗PKAα cat 抗体 (C-20), 抗PKCα抗体 (H-7), 抗PP1Cα抗体（FL-18）、抗 HDAC1抗体（H-51）（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)；抗HER2抗体（Merck,Darmstadt,Germany）；抗HER3抗体（1B2E）、抗TTK抗体（D-8）、抗MK5抗体（D70A10）、抗CHK1抗体（G-4）、抗リン酸化Shc（Y239/Y240）、抗p38抗体、抗リン酸化p38抗体（T180/Y182）、抗NF-κB p65抗体 抗IκB抗体（L35A5）、抗リン酸化IκB抗体（S32/S36、5A5）(Cell Signaling Technology, Danvers,MA,USA)；抗Shc抗体（BD, Franklin Lakes, NJ, USA）；抗リン酸化PHB2精製抗体（Ser39）、抗リン酸化BIG3精製抗体 (Ser305)、抗リン酸化BIG3抗体 (Ser1208、株式会社スクラム、東京、日本）；抗リン酸化スレオニン抗体（Thermo Fisher Scientific）の存在下で12時間インキュベートした。HRP結合二次抗体（Santa Cruz Biotechnology）の存在下で1時間インキュベートした後、メンブレンをenhanced chemiluminescence system（GE Healthcare, Buckinghamshire, UK）で展開した。ブロットは、Image Reader LAS-3000 mini（富士フィルム、東京、日本）を用いてスキャンした。
Phos-tag SDS-PAGE
　キナーゼによるPHB2のダイレクトなリン酸化を評価するために、precast SuperSep gels (50μM phos-tag acrylamide and 100μM ZnCl2,和光ケミカル、大阪、日本)を用いてPhos-tag SDS-PAGEに供した。分子量マーカーはWIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III (和光ケミカル)を使用した。リン酸化効率は、トータルPHB2バンドに対するリン酸化PHB2バンドの比率により算出した。
免疫沈降
　「ウェスタンブロット解析」の項で述べたように、細胞を0.1% NP-40溶解緩衝液で溶解し、Normal IgGおよびrec-Protein G Sepharose 4B（Thermo Fisher Scientific）を用いて、4℃で3時間、細胞溶解物をプレクリーンした。遠心分離後、上清を5μgの抗BIG3抗体、抗PHB2抗体、抗HER2抗体、抗PKCαおよび抗HAタグ抗体の存在下で4℃、12時間インキュベートした。その後、rec-Protein G Sepharose 4Bを添加して4℃、1時間インキュベートすることで、抗原－抗体複合体を沈降させた。免疫沈降されたタンパク質複合体を溶解緩衝液で3回洗浄し、SDS-PAGEにより分離した。その後、ウェスタンブロット解析を行った。
in vivo腫瘍増殖阻害
　KPL-4細胞懸濁液およびトラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞懸濁液（1×107 cells/mouse）を等量のMatrigel（BD）と混合し、5週齢メスBALB/cヌードマウス（チャールス・リバー・ラボラトリーズ、東京、日本）の乳房脂肪体に注射した。マウスは、12時間明期/12時間暗期のサイクルで無菌の隔離施設で飼育し、げっ歯類飼料と水を自由給餌した。腫瘍は、約100mm3（1/2×（幅×長さ2）として算出）のサイズに達するまで1週間にわたって発育させた。その後、マウスを各実験群（5個体/群）に無作為に分けた。stERAP処理は150μg/kgを7日毎に尾静脈注射により、マウスに投与した。腫瘍体積は、ノギスを用いて4日毎に4週間にわたって測定した。すべての試験は徳島大学の動物施設の指針に従って行った。
キナーゼ反応
　PKA(Protein Kinase A)とPKCα(Protein Kinase C alpha)の活性は、BIG3およびPKCαの免疫沈降物を、キナーゼ緩衝液（25mM Hepes, pH7.2、25mM MgCl2、5mM EDTA、5mM EGTA、0.25mM DTT）下で合成基質CREBtide（KRREILSRRPSYR）と0.5mM ATPと30℃、30分間反応させ、ADP-Glo kinase assay Kit (Promega, Fitchburg, WI, USA)を用いて測定した。
PP1Cα活性
　PP1Cαのホスファターゼ活性は、Protein Phosphatase Assay Kit（AnaSpec, Fremont, CA, USA）を用いて行った。細胞溶解液を基質（p-Nitrophenyl phosphate）と室温で60分間インキュベートした後、反応を停止させ、405nmの吸光度を測定した。PP1Cα活性（μmole/min）は、1分間当たり1μmoleの基質を触媒する酵素量として定義した。
細胞増殖アッセイ
　Cell-Counting Kit-8（CCK-8,同仁堂、熊本、日本）を用いて細胞増殖アッセイを行った。細胞をハーベストし、2 × 104 cells/wellで48ウェルプレートにプレートし、5% CO2存在下のインキュベーター（37℃）で維持した。指示された時点で、10倍希釈したCCK-8溶液を添加して30分間インキュベートし、450nmの吸光度を測定して生存細胞の数を計算した。
リアルタイムPCR
　リアルタイムPCRによりBIG3の発現を評価した。各細胞からNucleoSpin RNA（Macherey-Nagel, Germany）を用いて全RNAを抽出し、Superscript II reverse transcriptase（Thermo Fisher Scientific）、oligo dT primer（Thermo Fisher Scientific）および25mM dNTP Mixture（Thermo Fisher Scientific）を用いてcDNAに逆転写した。SYBR Premix Ex Taq（Thermo Fisher Scientific）を用いた7500 Real Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）でのリアルタイムPCRによりcDNAを解析した。各サンプルは、β2-MGのmRNA含量で標準化した。増幅のために使用したプライマーは以下の通りである；
BIG3　：　5’-CTTGACAAGGCCTTTGGAGT-3’  （配列番号：１８）と
　　　　　5’-CAATATGCTTTTCCCGCTTT-3’  （配列番号：１９）、
β2-MG：　5’-AACTTAGAGGTGGGGAGCAG-3’  （配列番号：２０）と
　　　　　5’-CACAACCATGCCTTACTTTATC-3’（配列番号：２１）。
細胞質と核の単離
　細胞質画分と核画分はNE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagent（Thermo Fisher Scientific）を用いて単離した。
細胞周期
　細胞を冷70%エタノールで固定し、20μg/mL ヨウ化プロピジウム（Sigma）及び1mg/mL リボヌクレアーゼA（Sigma）で細胞を染色し、FACSCalibur（BD, Franklin Lakes,NJ,USA）により解析し、CellQuest software (BD, Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて細胞周期を評価した。
統計解析
　試験群間の差異の統計的有意性を決定するためにスチューデントのt検定を使用し、P値 < 0.05で有意とみなした。
結果
HER2陽性乳がん細胞株でのBIG3はAKAPとして機能する
　本発明者らは、エストロゲン受容体（ERα）陽性の乳がん細胞ではBIG3はAKAP（A kinase anchor protein）として機能することを、WO2013/018690 およびNat Commun. 2017 May 30;8:15427にて報告しているが、今回はHER2（human epidermal growth factor receptor 2）陽性乳がん細胞株でもBIG3はAKAPとして機能するかどうかを検討した。まず、HER2陽性乳がん細胞株におけるBIG3の発現を、リアルタイムPCRで評価した。その結果、各HER2陽性乳がん細胞株（BT-474細胞、SK-BR-3細胞、KPL-4細胞）はBIG3の顕著な発現亢進を認め（図１５Ａ）、ERα陽性乳がん細胞のMCF-7細胞より高い発現を示した。
　そこで、HER2陽性乳がん細胞でもERα陽性乳がん細胞と同様に、BIG3がAKAPとして機能する可能性を考えた。その結果、HER2陽性乳がん細胞株のSK-BR-3細胞およびKPL-4細胞はBIG3の免疫沈降物に対してPKA、PP1Cα、PHB2と強く結合することが明らかになり（図１５Ｂ）、BIG3はHER2陽性乳がん細胞でもPKAおよびprotein phosphataseと複合体を形成することで、AKAPとして機能する可能性が考えられた。
　次に、HER2陽性乳がん細胞でのBIG3の活性化機構を評価するために、HER2シグナルおよびEGFR（Epidermal Growth Factor Receptor）シグナルの下流にPKAとPP1Cαが存在するかどうかを、HER2阻害剤トラスツズマブとEGFR阻害剤ラパチニブを用いてBIG3のPKA活性およびPP1Cα活性に及ぼす影響を検討した。その結果、BIG3の免疫沈降物はPKA阻害剤H-89およびトラスツズマブ処理によりPKA活性が各100%、88%の抑制率を、PP1Cα活性は各96%、88%の抑制率を示した（図１５Ｃ）。一方、ラパチニブ処理はPKA活性とPP1Cα活性に対して約15%の減少しか認めなかったことから（図１５Ｃ）、BIG3はHER2シグナルを介して活性化されることが示唆された。
HER2陽性乳がん細胞株でのBIG3の活性化機構
　BIG3の活性化にはSer305およびSer1208のリン酸化が必要であるので（Nat Commun, 8,15427,2017）、HER2陽性乳がん細胞でのBIG3のリン酸化を検討した。その結果、SK-BR-3細胞およびKPL-4細胞ではBIG3は各リン酸化（Ser305とSer1208）を恒常的に誘導されていることが認められ（図１６）、HER2陽性乳がん細胞ではBIG3は常に活性化されていると考えられた。一方、PKA阻害剤H-89、HER2阻害剤トラスツズマブおよびEGFR阻害剤ラパチニブによる影響を検討したところ、SK-BR-3細胞とKPL-4細胞で活性化されたBIG3の各リン酸化（Ser305とSer1208）はH-89およびトラスツズマブ処理によりほぼ完全に抑制されたのに対して、ラパチニブ処理はBIG3リン酸化の抑制にあまり関与していなかったことから（図１６）、BIG3はHER2シグナル由来のPKAを介して活性化される可能性が示唆された。
HER2陽性乳がん細胞株でのBIG3がPHB2の抑制活性を制御する
　これまでに本発明者らはPKAにより活性化されたBIG3のリン酸化が、PP1Cαのホスファターゼ活性を亢進し、PP1Cαの調節ユニットであるBIG3に結合しているがん抑制因子PHB2（Prohibitin 2）のSer39のリン酸化を脱リン酸化することで、乳がん細胞の増殖に大きく関与していることを明らかにしてきた（Nat Commun,8,15427,2017）。さらに、本発明者らは、BIG3とPHB2の相互作用を標的とするドミナント・ネガティブ・ペプチドであるERAPを設計し（Nat Commun,4,2443,2013）、長期安定性やBIG3-PHB2相互作用の阻害に対して高感受性を有するように生物学的な改善を試み、ステープルドERAP（stERAP）を作製した（Sci Rep,7,1821,2017）。実際に、stERAPを乳がん細胞株に投与すると、BIG3とPHB2の結合が完全に阻害され、BIG3から遊離したPHB2は迅速にSer39をリン酸化されることで、抑制活性を有することを示した（Sci Rep,7,1821,2017）。そこで、stERAPがHER2陽性乳がん細胞のBIG3とPHB2に及ぼす影響を検討した。その結果、SK-BR-3細胞およびKPL-4細胞にstERAP処理したとき、BIG3とPHB2の相互作用はほぼ完全に阻害されることが観察された（図１７Ａ）。さらに、stERAP処理によりBIG3より遊離したPHB2はSer39およびスレオニンのリン酸化が迅速に誘導されることが認められ（図１７Ａ）、BIG3がPHB2のリン酸化（抑制活性化）を制御していることが示唆された。
　次に、HER2陽性乳がん細胞でのPHB2の活性化機構を評価した。実験は、BIG3の活性化を抑制するためにsiRNA法によるPKAの発現抑制、ならびにHER2阻害剤トラスツズマブとEGFR阻害剤ラパチニブを用いてPHB2のリン酸化を検討した。その結果、PHB2（Ser39）のリン酸化はsiPKA処理およびトラスツズマブ処理でもほとんど減少傾向は認められなかったのに対して、ラパチニブ処理によりほぼ完全に抑制されたことから（図１７Ｂ）、PHB2（Ser39）のリン酸化は主にEGFRシグナルによるものであると考えられた。
　一方、PHB2のスレオニン・リン酸化はHER2シグナルおよびEGFRシグナルに非依存性であったことから（図１７Ｂ）、Ser39のリン酸化とはまったく異なる活性化機構が存在していると考えられた。
PKCα依存性PHB2（Ser39）のリン酸化
　これまでに、ERα陽性乳がんではPKCαがPHB2のSer39をリン酸化することを明らかにしてきたので（Nat Commun,8,15427,2017）、siRNA法によるPKCαの発現抑制がPHB2（Ser39）のリン酸化に及ぼす影響を検討した。その結果、stERAP処理により誘導されたPHB2（Ser39）のリン酸化はsiPKCα処理で顕著に抑制された（図１８Ａ）。さらに、SK-BR-3細胞でのPKCαの免疫沈降物のPKCα活性は、ラパチニブ処理により約80%の活性阻害を示したことから（図１８Ｂ）、PHB2（Ser39）はEGFRシグナルによるPKCαの活性化を介してリン酸化されることが示唆された。
リン酸化PHB2（Ser39）は核内の転写活性を抑制する
　PHB2（Ser39）のリン酸化が転写活性の抑制に関与することを、PHB2のリン酸化変異体を用いて評価した。実験は、siRNA法によりPHB2の発現を抑制したSK-BR-3細胞にHAタグ化したPHB2コンストラクトおよびSer39のアラニン変異体（S39A）をトランスフェクションして、48時間後に24時間のstERAP処理を行い、その核画分を単離してHA抗体で免疫沈降した。その結果、stERAP処理により核内に移行したHAタグ化PHB2は、転写抑制因子NcoRとHDAC1との結合を顕著に認め（図１９Ａ）、転写活性を抑制できる可能性を示唆した。一方、S39Aをトランスフェクションした細胞では、HAタグ化S39Aに対するNcoRとHDAC1の結合は減弱していたことから（図１９Ａ；NcoR：82%、HDAC1：54%の減少率）、PHB2のセリン・リン酸化、特にSer39のリン酸化が転写活性の抑制に大きく関与していることが示唆された。さらに、S39Eの疑似リン酸化プラスミドを用いて、Ser39のリン酸化が転写活性の抑制に及ぼす影響を検討したところ、S39Eの疑似リン酸化をトランスフェクションした細胞ではWTと同じようにNcoRとHDAC1が強く結合しており（図１９Ａ）、PHB2のSer39のリン酸化が転写活性の抑制に重要であると考えられた。
　次に、PHB2（Ser39）のリン酸化がHER2-HER3およびHER2-Shcの相互作用に及ぼす影響を検討した。その結果、stERAP単独処理によりBIG3から遊離したPHB2はSer39がリン酸化されることを認め、HER2に結合することでHER2とHER3およびHER2とShcの相互作用をともに83%まで阻害することを示した（図１９Ｂ）。一方、stERAP存在下でのラパチニブ処理は、前述と同様に（図１７Ｂ）、PHB2（Ser39）のリン酸化をほとんど認めなかったが、HER2-HER3およびHER2-Shcの相互作用を各62%、74%と顕著に阻害することができ、PHB2（Ser39）のリン酸化はHER2シグナルの抑制に影響していないと考えられた。一方、PHB2はstERAP処理によりスレオニン・リン酸化も誘導することが観察され（図１９Ｂ）、このリン酸化はHER2シグナルおよびEGFRシグナルに非依存性であったことから（図１７Ｂ、図１９Ｂ）、PHB2のスレオニン・リン酸化がHER2シグナルの抑制に大きく関与している可能性が示唆された。
PHB2のスレオニン・リン酸化とその活性化機構
　PHB2のスレオニン・リン酸化の活性化機構を検討した。まず、Ser39のリン酸化と同様にPKCαの関与を想定して、siRNA法によりPKCαを発現抑制したときのPHB2のスレオニン・リン酸化を評価したところ、stERAP処理により誘導されたPHB2のスレオニン・リン酸化はトラスツズマブ処理およびsiPKCα処理した細胞でも強く維持されており（図２０Ａ）、PHB2のスレオニン・リン酸化はPKCα以外のキナーゼにより活性化されることが示唆された。
　stERAP処理によりBIG3から遊離したPHB2はSer39のリン酸化のほかにスレオニン・リン酸化を誘導することが示唆されたので（図１７Ｂ、図１９Ｂ）、公共データベースからPHB2のスレオニン・リン酸化部位を予測した。その結果、NetPhos 3.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）ではThr155とThr169が高いスコアを示し（各0.849、0.992；表1Ａ）、ともにPHB2のERα転写活性の抑制ドメイン（19-49aa、150-174aa；Proc Natl Acad Sci USA,96,6947,1999）に存在していたが、Thr169のリン酸化がPKC以外のキナーゼによる可能性が示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 　次に、Group-based Prediction System（GPS3.0；http://gps.biocuckoo.org/）を用いて、PHB2のスレオニン残基のリン酸化に関するキナーゼを予測したところ、Thr42のリン酸化に対するTKKが他のものと比べて顕著に高いスコア（62.64）を示した（表1Ｂ）。以上の予測結果から、PHB2のThr42およびThr169をスレオニン・リン酸化部位と予測し、そのキナーゼとしてThr42はTTK、Thr169はCHK1とMK5に着目した。
　そこで、siRNA法によりTTK、CHK1およびMK5の発現を抑制してstERAP処理したときのPHB2のスレオニン・リン酸を評価した。その結果、stERAP処理で誘導されたPHB2のスレオニン・リン酸化は、siTTK処理およびsiMK5処理により79%と74%の抑制効果を示した（図２０Ｂ）。また、siCHK1処理もPHB2のスレオニン・リン酸化に対して33%の抑制率であったが、TTKおよびMK5がPHB2のスレオニン・リン酸化に大きく関与していると判断した。
　興味深いことに、p38がTTKの基質として報告されていることから（JP4647456B2）、TTKとp38の関係を調査したところ、p38のリン酸化がsiTTK処理により約25%まで抑制され（図２０Ｂ）、TTKの下流にp38が存在することが示唆された。さらに、p38はMK5を活性化することから（Cell Signal,22,1185,2010）、TTKに活性化されたp38を介してMK5が活性化される経路が存在することが示唆された。以上の結果から、TTKがPHB2のThr42およびThr169のリン酸化を制御していること、およびMK5がThr169のリン酸化に関与していることが考えられた。
TTKおよびMK5によるPHB2のスレオニン・リン酸化がHER2シグナルに及ぼす影響
　HER2-HER3およびHER2-Shcの相互作用に及ぼすTTK、MK5およびCHK1の影響を調べるために、それぞれをsiRNAにより発現抑制したあと、HER2抗体で免疫沈降した。その結果、SK-BR-3細胞に1μM stERAP処理したとき、HER2に対するHER3およびShcの結合は93%、90%まで阻害されたのに対して、TTKおよびMK5の発現を抑制するとその結合阻害は回避された（図２１Ａ；siTTK：阻害率23%と9%、siMK5：阻害率48%と31%）。また、TTKとMK5の発現抑制はstERAP処理によるPHB2のスレオニン・リン酸化の各87%、46%を抑制していた（図２１Ａ）。他のHER2陽性乳がん細胞株KPL-4細胞でも同様な結果が得られたことから（図２１Ｂ）、TTKおよびMK5によるPHB2のスレオニン・リン酸化がHER2シグナル・カスケードの制御に重要であると考えられた。一方、SK-BR-3細胞およびKPL-4細胞でCHK1の発現抑制は、stERAP処理によるHER2-HER3とHER2-Shcの結合阻害を回避できなかったことから、HER2シグナルにほとんど関与していないと考えられた。
　次に、TTK阻害剤AZ3146を用いて、PHB2のスレオニン・リン酸化およびHER2シグナルに及ぼす影響を検討した。その結果、stERAP単独処理によりHER2-HER3およびHER2-Shcの相互作用が顕著に阻害されることが再現されたのに対して（各96%、91%の阻害率）、AZ3146はその阻害効果をほぼ完全にキャンセルした（図２０Ｃ）。さらに、AZ3146はPHB2のスレオニン・リン酸化を23%に阻害したことから（図２０Ｃ）、TTKの活性化によるPHB2のスレオニン・リン酸化がHER2シグナルの阻害に関与していることが示唆された。
PHB2のスレオニン・リン酸化部位の同定
　PHB2のスレオニン・リン酸化部位がThr42とThr169であることを検討した。実験は、HAタグ化したPHB2コンストラクト（WT）、Thr42のアラニン変異体（T42A）、Thr169のアラニン変異体（T169A）、Thr42とThr169のダブル・アラニン変異体（T42A+ T169A）を、siRNA法により内在性PHB2を発現抑制したSK-BR-3細胞にトランスフェクションし、24時間のstERAP処理したあと、抗HA抗体で免疫沈降した。その結果、WTのトランスフェクション細胞でstERAP処理により誘導されたPHB2のスレオニン・リン酸化は、T42AおよびT169Aで各50%、20%の減弱が観察され、T42A+T169Aのダブル変異体では76%のスレオニン・リン酸化が抑制された（図２２Ａ）。
　次に、PHB2のThr42とThr169の各リン酸化がHER2シグナルの抑制に及ぼす影響を検討した。実験は、siRNA法により内在性PHB2を発現抑制したSK-BR-3細胞に、各HAタグ化PHB2（野生型WT、Ser39のアラニン変異体S39A、Thr42とThr169のダブル・アラニン変異体T42A+ T169A）をトランスフェクションしたあと、24時間のstERAP処理をして、抗HER2抗体および抗BIG3抗体で免疫沈降した。その結果、stERAPの未処理でもHER2に各HAタグ化PHB2がダイレクトに結合していたが、stERAP処理によりBIG3と各HAタグ化PHB2との結合がほぼ完全に阻害され（図２２Ｂ、BIG3の免疫沈降物）、それに伴ってHER2へのHAタグ化PHB2の結合量が増加したことから、stERAP処理下ではHAタグ化PHB2がBIG3に結合しない条件が成立していると判断した。
　そこで、この条件下でHER2-HER3およびHER2-Shcの相互作用に対する各HAタグ化PHB2の影響を評価したところ、HER2に結合したPHB2-WTはHER2-HER3およびHER2-Shcの相互作用をほぼ完全に阻害していたのに対して（図２２Ｂ；HER2-HER3：98%、HER2-Shc：93%の阻害率）、PHB2-S39Aの変異体はHER3およびShcとの結合を各95%、85%まで阻害され（図２２Ｂ）、WTの阻害効果とほとんど同じであった。一方、T42A + T169Aのスレオニン・ダブル変異体ではPHB2のSer39がリン酸化されているにも関わらず、PHB2の抑制機能が顕著に失われ（HER2-HER3：15%、HER2-Shc：15%の阻害率）、HER2シグナルに対するPHB2の抑制機能はThr42とThr169の各リン酸化が大きく関与していることが示唆された。
TTKおよびMK5によるPHB2のスレオニン・リン酸化
　TTKとPHB2が結合するかどうかを、24時間のstERAP処理したSK-BR-3細胞に対して抗TTK抗体および抗PHB2抗体で免疫沈降して検討した。その結果、両抗体による免疫沈降によりTTKとPHB2は強く相互作用することが認められ（図２３Ａ）、TTKがダイレクトにPHB2をリン酸化していることが示唆された。
　次に、TTKおよびMK5がPHB2をダイレクトにスレオニン・リン酸化する可能性をPhos-tagを用いたSDS-PAGEにより評価した。実験は、リコンビナントPHB2とリコンビナントTTKもしくはリコンビナントMK5とATP存在下で30℃、30分間反応させたあと、Phos-tag SDS-PAGEに供した。その結果、リコンビナントTTKはPHB2とのモル比1：1のときにリン酸化バンドが僅かに確認されたが（28%のリン酸化）、PHB2：TTK = 1：2以上のモル比では75%のリン酸化バンドが顕著に検出された（図２３Ｂ）。また、抗リン酸化スレオニン抗体でイムノブロットしてもほぼ同じ位置にリン酸化バンドが認められた（図２３Ｂ）。さらに、リン酸化Thr42とリン酸化Thr169に対する免疫血清をイムノブロットしたところ、リン酸化Thr42の検出が高感受性であったが、PHB2とTTKのモル比に応じて各リン酸化バンドが顕著に認められ（図２３Ｂ）、TTKはPHB2のThr42とThr169をダイレクトにリン酸化できる可能性が示唆された。
　リコンビナントMK5はモル比PHB2：MK5 = 1：0.25からリン酸化バンドが僅かに確認され（6.5%のリン酸化）、モル比に応じてリン酸化効率が増加し、PHB2：MK = 1：2以上のモル比では75%のリン酸化バンドが検出され、抗リン酸化スレオニン抗体のイムノブロットと同じ位置であった（図２３Ｃ）。さらに、上記同様に免疫血清をイムノブロットしたところ、リン酸化Thr42の血清もわずかに反応していたが、リン酸化Thr169血清が抗リン酸化スレオニン抗体とほぼ同じリン酸化の挙動を示し、Thr169がMK5によるPHB2のリン酸化部位として強く示唆された。
HER2陽性乳がん細胞株の増殖に及ぼすstERAPの抑制効果
　HER2陽性乳がん細胞株におけるstERAPの増殖抑制効果について検討した（図２４）。その結果、stERAPは各HER2陽性乳がん細胞株（SK-BR-3細胞、BT-474細胞、KPL-4細胞）の増殖に対して容量依存的な抑制効果を認め、各細胞株に対するIC50（50%阻害濃度）は0.054μM、0.58μM、0.02μMであった。さらに、SK-BR-3細胞およびKPL-4細胞はエストロゲン受容体（ERα）陰性であることから、stERAPはBIG3が発現していれば、HER2陽性乳がん細胞およびERα陰性細胞においても顕著な増殖抑制効果を示すことが明らかになった。
stERAPはHER2-HER3ならびにHER2-Shcの相互作用を阻害する
　各HER2陽性乳がん細胞株の増殖に対するstERAPのIC50と完全抑制濃度を用いて（SK-BR-3細胞：0.05μMと1μM、BT-474細胞：0.5μMと10μM、KPL-4細胞：0.01μMと1μM）、各細胞株のHER2-HER3およびHER2-Shcの相互作用に及ぼす影響、ならびにトラスツズマブとの併用効果について検討した。その結果、トラスツズマブはHER2とHER3およびShcとの結合をほとんど阻害できなかったのに対して、stERAPの単独処理は強い阻害効果を得ることができ（図２５）、細胞増殖に対する完全抑制濃度ではHER2-HER3およびHER2-Shcの相互作用をほぼ完全に阻害することが可能であった。また、stERAPのIC50でもトラスツズマブと併用することで、劇的な阻害率の亢進を認めた（図２５）。
　さらに、stERAP処理はHER2（Y877）のリン酸化およびShcのリン酸化（Y239/Y240）に対しても同様な阻害効果を示した（図２５）。また、stERAP処理はHER2に対するPHB2の結合量を濃度依存的に誘導していたが、トラスツズマブと併用してもPHB2の結合量は変化しなかった（図２５）。
トラスツズマブ耐性HER2陽性乳がん細胞株に対するstERAPの抑制効果
　トラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞におけるstERAPの増殖抑制効果について検討した。その結果、トラスツズマブの単独投与はトラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞の増殖をまったく抑制できなかったのに対して、stERAP処理はトラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞の増殖を容量依存的な抑制効果を認め、トラスツズマブ感受性SK-BR-3細胞のIC50（0.054μM、図２４）と比べてIC50は10.64μMと高かったが（図２６Ａ）、stERAPは耐性および感受性細胞に関わらず有意な抑制効果を有していることが明らかになった。
　次に、stERAPがトラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞のHER2-HER3ヘテロダイマーおよびHER2-Shcの結合に及ぼす影響を検討した。その結果、stERAPは感受性および耐性細胞株におけるHER2-HER3とHER2-Shcの結合およびShcのリン酸化（Y239/Y240）をほぼ完全に阻害することが可能であった（図２６Ｂ）。また、stERAP処理することでBIG3から遊離したPHBがHER2に結合することが観察され、PHB2がHER2-HER3やHER2-Shc複合体の阻害に関与していることが示唆された。一方、ハーセプチン単独処理はHER2-HER3とHER2-Shcの結合にほとんど影響を及ぼさなかった。
トラスツズマブ耐性HER2陽性乳がん細胞株のNF-κBシグナルに及ぼすstERAPの影響
　HER2陽性乳がん細胞におけるNF-κBシグナルの活性化が、化学放射線療法の耐性を生じる可能性が報告されている（Anticancer Res,26,4235,2006、Breast Cancer Res,13,221,2011）。そこで、stERAPがHER2陽性乳がん細胞株のNF-κBシグナルに及ぼす影響を検討した。その結果、親株のSK-BR-3細胞と比較して、トラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞では多くのNF-κB p65が核に移行していることが観察され、このシグナルがトラスツズマブ治療に対する耐性に関与することが示唆された（図２７）。一方、stERAPの投与はトラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞におけるNF-κB p65の核移行を顕著に阻害していた（図２７）。さらに、stERAPはトラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞のみで活性化されるIκBαのリン酸化をほぼ完全に阻害することで、NF-κB p65の核移行を制御していることも明らかになった（図２７）。以上より、stERAPはIκBαのリン酸化およびNF-κB p65の核移行を抑制することで、トラスツズマブ治療に対する耐性を回避できることを示唆するものである。
トラスツズマブ耐性HER2陽性乳がん細胞株の細胞周期に及ぼすstERAPの影響(図２８)
　stERAP投与によるトラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞の細胞周期に与える影響を調べた。その結果、トラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞の細胞周期がG2/M期に顕著に進行していたが、トラスツズマブの投与はほとんど細胞周期を停止させることができなかったのに対して、stERAPの単独投与はG0/G1期における細胞周期の停止が観察された。さらに、20μM stERAPおよび100μg/mL トラスツズマブを併用すると、sub-G1期の細胞が顕著に増加して、細胞死が認められた。以上より、stERAPはG1期停止を誘導することで細胞増殖抑制効果を導き、作用機序の異なるトラスツズマブと併用することで細胞死を促進することがわかった。
トラスツズマブ耐性HER2陽性乳がん細胞におけるstERAPのin vivo抗腫瘍効果（図２９）
　stERAPによるin vivo抗腫瘍効果について検討した。KPL-4およびトラスツズマブ耐性SK-BR-3細胞をBALB/cヌードマウス乳腺へ同所性移植し、腫瘍が約100mm3に到達したときにstERAPの尾静脈投与を開始し、以後、7日ごとに投与して抗腫瘍効果を調べた。その結果、KPL-4腫瘍およびトラスツズマブ耐性SK-BR-3腫瘍は経時的に増殖したのに対して、150μg/kgのstERAPは投与後すぐに腫瘍径の減少傾向を認め、7日毎の投与であっても有意な阻害効果を持続し、28日後には腫瘍の縮小が観察された。また、stERAP投与による毒性および有意な体重減少は観察されなかったことから、治療的観点から優れた治療指数を示唆するものである。
実施例５　ダブルstERAPの効果
材料と方法
細胞株および培養条件
　3種類のヒト乳がん細胞株SK-BR-3、BT-20、MDA-MB-231およびヒト滑膜肉腫細胞株SW982は、American Type Culture Collection（ATCC,Manassas,VA,USA）から購入した。
　SK-BR-3細胞はMcCoy's 5A培地（Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA）、BT-20はEMEM培地（Thermo Fisher Scientific）を用いて、5%CO2、37℃で培養した。MDA-MB-231細胞およびSW982細胞は、Leibovitz's L-15 培地（Thermo Fisher Scientific）を用いて、CO2濃度調節なし、37℃で培養した。全ての培地は、10% FBS（Thermo Fisher Scientific）、1%抗生物質-抗真菌剤溶液（和光純薬,大阪,日本）を補充して使用した。
細胞増殖アッセイ
　細胞播種は、SK-BR-3細胞、BT-20細胞、MDA-MB-231細胞では48ウェルプレートに1×104細胞/200μL in well、SW982細胞では0.5×104細胞/200μL in wellで行った。48時間後、各ウェルの培地をペプチド（シングルstERAPとダブルstERAP#46：20μMから3倍の系列希釈、ダブルstERAP#45：50μMから2倍の系列希釈）を加えた培地と交換し、さらに96時間培養後、Cell Counting Kit-8（同仁堂、熊本、日本）を用いて細胞増殖レベルを測定した。データは3つの独立した実験より取得し、グラフ作成・データ解析ソフトウェアSigmaPlot（Systat Software,San Jose,CA,USA）を用いてグラフ作成（平均±標準偏差）および細胞増殖に対するペプチドの50%阻害濃度（IC50）の算出を行った。
細胞周期解析
　SK-BR-3細胞とMDA-MB-231細胞をそれぞれ5×105細胞/10cm dishに播種した。72時間後、培地を5μMのペプチドを加えた新しい培地と交換し、48時間、72時間、96時間後にトリプシン処理により細胞を回収し、70%エタノール溶液を加えて-20℃で一晩以上固定した。細胞懸濁液の溶液を70%エタノールからPropidium Iodide(PI)/RNase Staining Solution（Cell Signaling Technologies,Danvers,MA,USA）に置き換え、室温、暗所にて15分間反応させた後、セルストレイナー（BD biosciences, Franklin Lakes,NJ,USA）により細胞凝集塊を除去した。次に、各細胞サンプルの細胞周期の比率をFACS array(BD biosciences)と解析ソフトウェアFlowJo (FLOWJO LCC,Ashland,OR,USA)により解析した。
結果
stERAPによる乳がん細胞株および滑膜肉腫細胞株の増殖抑制効果
　3種類の乳がん細胞株（SK-BR-3、BT-20、MDA-MB-231）および滑膜肉腫細胞株SW982に対して、3種類のstERAPが及ぼす細胞増殖への影響を調べた。その結果、図３０に示すように全ての細胞株で各stERAPによる濃度依存的な細胞増殖抑制効果が観察された。また、表２に各ペプチドの50%阻害濃度（IC50）を示した。3種類のペプチドの中では、ダブルstERAP#46の増殖阻害効果が最も高く、悪性度の高いトリプルネガティブ乳がん由来の細胞株（BT-20とMDA-MB-231）や滑膜肉腫由来の細胞株SW982においても強い増殖抑制効果が観察された。
stERAPの乳がん細胞株（SK-BR-3とMDA-MB-231）の細胞周期に与える影響
　2種類の乳がん細胞株（SK-BR-3とMDA-MB-231）に対して、細胞増殖抑制効果の著しい2種類のペプチド（シングルstERAPとダブルstERAP#46）が細胞周期に与える影響をフローサイトメトリー解析にて検討した。その結果、図３１Ａに示すように、SK-BR-3細胞においては、両ペプチド添加により、それぞれ陰性対照のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）添加と比べて、G2/M期の細胞数の減少を認める一方、G1期の細胞数の増加を認め、このことから、G1期の細胞周期停止が観察された。この効果はペプチド添加96時間後においても維持されていた。一方、MDA-MB-231細胞においては、図３１Ｂに示すように、G1期の細胞数減少、かつS期の細胞数増加を認め、S期の細胞周期停止が観察され、この効果は96時間後においても維持されていた。これらの結果は、2種類のペプチド（シングルstERAPとダブルstERAP#46）による細胞増殖阻害効果はどちらも細胞周期停止を導く可能性を示唆している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　本発明は、BIG3-PHB2相互作用に対する阻害効果の持続期間がより長いペプチドを提供する。本発明のペプチドまたはその塩を含む医薬組成物は、がん、特にエストロゲン受容体陽性のがんや、エストロゲン受容体陰性の乳がんおよび前立腺がんを治療するために使用することができる。

Claims (15)

  1. 　配列番号：４または配列番号：５に記載のアミノ酸配列において、少なくとも２対のアミノ酸残基が、同数のステープリング構造で置き換えられたアミノ酸配列を含むペプチド、またはその塩。
  2. 　２対のアミノ酸残基が、２個のステープリング構造で置き換えられた請求項１に記載のペプチド、またはその塩。
  3. 　２対のアミノ酸残基が、以下の（ａ）および（ｂ）である、請求項１または２に記載のペプチド、またはその塩：
    （ａ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列のＮ末端から３番目および７番目のアミノ酸残基；
    （ｂ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列のＮ末端から８番目および１２番目のアミノ酸残基。
  4. 　２対のアミノ酸残基が、以下の（ｃ）および（ｄ）である、請求項１または２に記載のペプチド、またはその塩：
    （ｃ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列のＮ末端から３番目および７番目のアミノ酸残基；
    （ｄ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１０番目および１４番目のアミノ酸残基。
  5. 　ステープリング構造が下記式（Ｉ）で表される、請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、実線と点線の二重線は単結合または二重結合を示す。）
    またはその塩。
  6. 　ステープリング構造が下記式（ＩＩ）で表される、請求項５に記載のペプチド、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、実線と点線の二重線は単結合または二重結合であり；
    Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４およびＡ５の組み合わせは以下から選択される：
    　　Ａ１＝ＱＭ、Ａ２＝ＳＤＬ、Ａ３＝－、Ａ４＝ＱＬＲ、Ａ５＝Ｒ
    　　Ａ１＝ＱＭ、Ａ２＝ＳＤＬ、Ａ３＝ＬＱ、Ａ４＝ＲＱＲ、Ａ５＝ＯＨ
    ここで「－」はアミノ酸残基が無くペプチド結合（すなわち2個のステープリング構造は連結）であることを示し；
    また「ＯＨ」は、上記ステープリング構造の一端がペプチド誘導体のＣ末端を構成することを示す）
    またはその塩。
  7. 　Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸残基のいずれかまたは両方が修飾されている、請求項１～６のいずれか一項に記載のペプチド、またはその塩。
  8. 　Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸残基のいずれかまたは両方が、アセチル化、アミド化およびＨＡタグ付加のいずれかまたはこれらの組み合わせにより修飾されている、請求項７に記載のペプチド、またはその塩。
  9. 　Ｎ末端のアミノ酸残基がアセチル化されており、かつＣ末端のアミノ酸残基がアミド化されている、請求項８に記載のペプチド、またはその塩。
  10. 　全てのアミノ酸残基がＤ型のアミノ酸残基に置き換えられた、請求項１～９のいずれか一項に記載のペプチド、またはその塩。
  11. 　請求項１～９のいずれか一項に記載のペプチドのレトロインバース体であるペプチド、またはその塩。
  12. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載のペプチド、またはその塩と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  13. 　がん治療用である、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 　がんが乳がんまたは前立腺がんである、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 　がんがエストロゲン受容体陽性のがんである、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
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