WO2018234257A1 - Method for verifying the success of single cell seeding in nanowell arrays, and device and nanowell array - Google Patents
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Definitions
- the invention relates to a method and apparatus for verifying the success of single cell seeds in nanowellarravs and nanowellarravs.
- eukaryotic cells Many (recombinant) proteins, such as pharmaceutical agents, are produced in eukaryotic cells.
- prokaryotic expression systems are eukaryotic expression systems, such as yeasts, insect cells and
- Mammalian cells i.a. by their ability to make post-translational modifications that are crucial for the biological activity of a variety of proteins.
- the first step in the production of (recombinant) proteins on an industrial scale is the generation of stable production cell lines.
- Common production cells are hybridoma cells (production of monoclonal antibodies) or, for the production of recombinant proteins, genetically modified cells, such as Chinese hamster ovary (CHO) or human embryonic kidney cells (HEK-293 or HEK-293T).
- Hybridoma cells are fusions of plasma cells and immortalized myeloma cells that produce antibodies specific to the particular plasma cell.
- the plasma cells are obtained from the spleen of animals infected with an antigen of
- a transgene encoding the protein of interest is introduced into suitable cells, eg CHO or 293T (eg by transfection). Integration of the transgene occurs randomly into the genome of the host cell in conventional methods. The site of integration by neighboring endogenous regulatory elements (enhancer, silencer, chromatin structure, etc.) strongly influences the promoter activity and thus the transcription rate of the transgene. In addition, the copy number of the transgene in a cell (number of integrates after transfection or gene amplification) is crucial for its expression level. After transfection, therefore, one obtains a pool of cells of different specific productivity, ie cells which show an individually specific production of the desired product. Was the Transfection unsuccessful or was done so-called gene silencing, none of the desired products are produced and the specific productivity is zero.
- the producer cells must be a cell clone, i. cells that have been produced by cell division from a single parent cell and are genetically identical.
- the cell clone of interest should also be characterized by a high proliferation capacity and the stability of (recombinant) protein expression. According to the current state of the art, the following three methods are mainly used to generate new monoclonal cell lines:
- a suspension of hybridoma cells, genetically engineered cells (usually after selection for antibiotic resistance) or naturally a protein of interest producing cells is seeded at various dilution levels.
- the starting point for cell line production is the so-called limiting dilution, in which statistically a single or no cell is present per well of a 96- or 364-well plate.
- limiting dilution in which statistically a single or no cell is present per well of a 96- or 364-well plate.
- the individual cells are then allowed to grow under appropriate culture conditions cell clones, which are then characterized in terms of their (specific) productivity, growth rate and stability.
- the characterization can be carried out for example by an analysis of the cell culture supernatant by means of ELISA.
- Limiting dilution is very time-consuming and labor-intensive.
- cells in semi-solid medium such as
- Methylcellulose sown.
- the cells are immobilized in the viscous medium and can grow into colonies, which can then be isolated.
- a colony may have been formed from a single cell or may be due to two or more closely spaced cells, this method lacks unambiguous evidence of monoclonality.
- visualization of single cells on the day of sowing are difficult because, for example, not all cells in the focal plane of a
- the specific productivity of the producer cells can be easily characterized by suitable immunodiffusion tests. These are due to the precipitation of the product, which diffuses around the producer cell clone into the semi-solid medium. Characterization is possible, for example, using fluorochrome-conjugated antibody.
- the size of a precipitate ring forming around the producer cell correlates with the amount of secreted product and thus permits one
- individual cells are selectively isolated from a cell suspension using a sorter and then deposited separately in wells of a target plate.
- a single cell is introduced into each well, for example, a 96- or 384-well plate.
- the target cells are determined by their fluorescence on the Expression of reporter genes or staining of surface antigens with fluorochrome-conjugated antibodies may be differentiated from other cells.
- the individual cells then grow up to cell clones.
- An advantage of this method is the high throughput that can be achieved in the isolation of producer cells by the sorter. Up to 5 x 10 7 output cells can be sorted in 30 min.
- Single cell deposition can only be achieved by microscopic examination of the target plates. Without this combination of single cell cloning by flow cytometry with microscopy, no monoclonal detection is possible.
- the object of the invention is to propose a method which is improved over the prior art and which is suitable for the production of monoclonal cell lines.
- a device with which the method is executable is also proposed.
- the method according to the invention makes it possible to verify the success of
- Single cell seeds in nanowell arrays and comprises several steps.
- a nanowell array seeded with individual biological cells is illuminated, wherein the nanowell array has a number of nanowells in which, immediately after sowing, if appropriate afterward
- Nanowell array is illuminated with at least one illumination and / or excitation radiation.
- One caused by the illumination and / or excitation radiation is illuminated with at least one illumination and / or excitation radiation.
- Detection radiation is spatially resolved (2D) recorded as image data. It serves a
- Illumination radiation of the illumination of the nanowell array without changing the cells or their components.
- An excitation radiation is used to change excitable molecules and / or mixtures and, for example, to emit a
- a detection radiation can be given by reflected portions of the illumination radiation and / or the excitation radiation as well as by radiation which is emitted on the basis of the excitation processes. It is also possible to detect the detection radiation through the sample (transmitted light method).
- wells for receiving samples are referred to as nanowells if their volume is smaller than 1 mm 3 (1 ⁇ ).
- Wells for receiving samples such as those formed on 384-well microtiter plates (about 40 ⁇ volume per well) or 1536 (about 10 ⁇ volume per well), are referred to as wells or macrowells.
- Preceded by the method according to the invention may be the steps of sowing individual cells on the nanowell array and rinsing the nanowell array. The latter step serves to remove cells outside the nanowells and / or excess cells in the nanowells.
- the production cells may be any suitable production cells.
- the production cells may be any suitable production cells.
- Hybridoma cells by transfection, transduction or transformation genetically modified cells or naturally a protein of interest-expressing cells.
- the cells are present for sowing in suspension or, in the case of adherent cells, prior to sowing mechanically, enzymatically or with the aid of corresponding buffer detached and brought into suspension. Separation of the cells can also be achieved using sieve-like devices such as nylon nets. All available cells are seeded in the nanowell array. In further embodiments of the method, production cells can also be seeded on several nanowell arrays simultaneously. In this case, a plurality of nanowell arrays can be arranged and seeded and / or the cells washed away by one of the nanowell arrays are seeded on a different nanowell array.
- the seeding of the cells into the nanowell array can be done manually or with a device and include tilting and pivoting movements, centrifugation steps and washing steps.
- the device according to the invention described below can be designed for sowing cells on a nanowell array and, for example, via a
- the presence of at least one cell is expected after sowing, so that one can also speak of an expected range in each case.
- the gaps between the nanowells which are given for example by webs between the nanowells or by an edge of the nanowell array, do not provide any
- Probability distribution such as a Gaussian
- the expected number of one cell per nanowell corresponds to an ideal sowing. If nanowells with more than one cell and / or empty nanowells are present, an expected or desired occupancy of the nanowells with one cell each can subsequently be brought about by means of the correction steps outlined below.
- the loaded nanowell array is illuminated.
- the distribution of the cells is detected and analyzed, for example, by means of bright field illumination and, if appropriate, by means of fluorescence images.
- the nanowells themselves as well as single cells in the nanowells are detected.
- the image data obtained in this way are compared with respect to the position of the nanowell as well as the
- a spatially resolved detection of the detection radiation refers to a possible
- positions of those nanowells in which there is not exactly one cell and those interstices in which cells are present are stored and given an identity (in the following also briefly: ID), for example in the form of a number, a coordinate pair and optionally further ID. Parameters such as the experiment number, name of the cells, laboratory number of the experiment / cell, etc. In addition, the positions of those nanowells can be stored in which exactly one cell and / or no cell is present.
- nanowells without cells and / or nanowells having more than one cell and / or nanowells adjoining interstices in which cells have been detected are identified, their IDs are recorded and their positions are stored.
- the nanowells identified in this way are subsequently identified
- Evaluation unit (see below) excess cells, preferably individually, taken from the respective nanowells and / or interstices. With this procedure, incorrectly seeded nanowells and gaps can be detected and the respective sowing error corrected. The removed cells can be discarded. It is better, however, if the extracted cells can continue to be used. For this purpose, it is proposed that after sowing empty nanowells are identified and determined their position. Sampled cells are individually deposited in these hitherto empty nanowells.
- the stored positions of the nanowells without cells and / or nanowells having more than one cell and / or nanowells adjoining interstices in which cells have been detected are used to around depending on these positions
- control commands for controlling the removal device are adjusted accordingly.
- the nanowell array is advantageously maintained under culture conditions which allow the desired physiological responses of the cells.
- physiological reactions are, for example, the survival, growth and / or proliferation of the cells.
- expression and secretion of certain substances such as peptides, proteins, hormones,
- the cells lie after sowing and after a possible separation each alone in a nanowell.
- the nanowells with the cells can be covered with a medium, for example a nutrient medium, so that communication of the cells with one another is possible. Such communication can advantageously increase the proliferation rate and thus increase the efficiency of the method.
- the steps of the method may take place in a sterile environment adapted to the needs of the cells, for example by defining desired temperatures Gas contents such as a defined CO2 and / or 02 content and a certain humidity are regulated.
- the isolation of the cells is to be based on their specific productivity, the production of the protein of interest must be visualizable and be able to be assigned to the target cell.
- the detection can u.a. based on the additional production of reporter proteins by the target cells.
- the coding sequence of a reporter protein which is detected later, was previously introduced into the cell. The expression of both genes must correlate.
- the presence of the (secreted) protein is detected directly.
- surface proteins for example. B and T cell receptors, directly via immunological
- immobilization of the secreted (recombinant) protein occurs in close proximity to the producer cell (eg by coating the nanowell structure or via antigen-antibody or other protein-protein interactions).
- substances released from the cell and / or mixtures of substances in the well and / or next to the well are at least partially bound by means of binding partners specific for the substances and / or mixtures to be detected.
- Proteins can also have a tag that can be bound.
- the protein of interest can now be detected by immunological methods and results in a distinct, measurable signal (eg fluorescence, luminescence).
- a distinct, measurable signal eg fluorescence, luminescence
- the detection of the specific productivity of single cells may be based on the detection of the (secreted) (recombinant) protein.
- Suitable for this purpose are, for example, fluorochrome-coupled antibodies such as fluorochrome-coupled detection antibodies or unlabeled detection antibodies and fluorochrome-coupled secondary antibodies.
- fluorochrome-coupled antibodies such as fluorochrome-coupled detection antibodies or unlabeled detection antibodies and fluorochrome-coupled secondary antibodies.
- enzyme-linked antibodies enzyme-linked detection antibodies or unlabeled detection antibodies and enzyme-linked secondary antibodies
- enzyme-linked antibodies enzyme-linked detection antibodies or unlabeled detection antibodies and enzyme-linked secondary antibodies
- enzyme-linked Antibodies enzyme-linked antibodies
- chromogenic substrates is detected by an image capture device.
- the device can be quantitated by fluorescence signal intensity
- detection and evaluation of fluorescence signals and quantification of the productivity of cells or cell clones can take place shortly after sowing.
- an early evaluation of the signals of the seeded cells or the developing cell clones is possible.
- selected cells or cell clones resulting from a single cell are automatically removed from the respective wells and further cultured individually, so that monoclonal cell lines are obtained later.
- Such single cells or cell clones are advantageously selected based on their specific productivity, preferably automated, for the isolation process. Subsequently, the selected individual cells or cell clones are selectively isolated from the device and placed in a target vessel.
- the isolation process is advantageously documented by the recording of images before and after the harvest of the target cell and a harvest video.
- the target vessel may be, for example, another nanowell array or a conventionally used microtiter plate, for example a 96- or 384-well plate. It is advantageous if the target vessel was examined in advance to see whether it still contains no cells and its nanowells or wells are empty. Such a control can
- the physiological reactions can be documented, whereby growth and proliferation processes are recorded and measured, for example in the bright field.
- the cell density and the number and size of the cells or cell clones can be used as parameters.
- Production of substances by the cell or cell clone may be by labeled antibodies, in particular fluorochrome-labeled antibodies, enzyme-labeled antibodies, specific interactions of produced substances, nanobodies, single chain variable fragment antibodies (scFv), DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein) and / or metabolic processes of the respective cell are detected and evaluated.
- labeled antibodies in particular fluorochrome-labeled antibodies, enzyme-labeled antibodies, specific interactions of produced substances, nanobodies, single chain variable fragment antibodies (scFv), DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein) and / or metabolic processes of the respective cell are detected and evaluated.
- the proliferation of the single cell to the cell clone is documented by the acquisition of images at regular intervals (eg daily), for example by an image capture unit.
- the cell clone is then analyzed by means of suitable analysis methods regarding its specific productivity, the stability of the (recombinant)
- the method advantageously allows a comprehensive documentation of all executed steps. So in an automated documentation step in the same
- Sample container in particular in the same nanowell array, image acquisition, detection of monoclonality, the detection of proliferation and production, based on the selection and isolation of single cells or cell clones from the nanowells of the nanowell array and the transfer of the detected and by proliferation and / or Production criteria selected cells in a target vessel.
- the cell delivery into the target vessel and the proliferation of the single cell in the target vessel can be documented.
- the documentation can be done with the image capture unit or with an additional documentation unit, which is designed for image acquisition and storage of image data.
- Target vessel can be recorded before and after cell deposition.
- the immobilization of the (recombinant) protein in spatial proximity or at the producer cell is indispensable for the detection of the specific productivity of single cells. This can be done via:
- the corrugated structure preventing pathway diffusion of the (recombinant) protein from the nanowell; - Overlapping the nanowells with semi-solid medium, which prevents pathway diffusing the (recombinant) protein from the nanowells;
- - antigen or antibody including single-domain antibodies such as nanobodies
- artificial, antigen-binding proteins such as DARPins, scFv fragments, monobodies, affilins, anticalins, avimers, affibodies;
- bispecific antibodies that bind an antigen on the cell surface and the secreted protein
- AMS Antibody-membrane switch
- the object is further achieved with the device already mentioned.
- This serves to verify the success of single cell seeds in nanowell arrays and is intended to be used in a method of generating monoclonal cell lines.
- the device comprises an image acquisition unit which is designed to acquire image data of a nanowell array arranged in a sample area.
- a lighting unit for providing at least one illumination and / or excitation radiation and means for controlled illumination of the sample with the at least one illumination and / or excitation radiation are part of the device.
- Image capture unit is configured such that on the nanowell array
- Expected areas with an expected presence of each sample, in particular of each cell can be defined or verified by being able to evaluate acquired image data of the respective expected areas by means of an evaluation unit of the device. This includes the automatic detection of nanowells as areas of expectation.
- the image capture unit is designed in such a way that gaps can be defined, detected or verified on the nanowell array in which no samples are expected. After illuminating the nanowell array, a spatially resolved detection of one caused by the illumination and / or excitation radiation
- Detection radiation take place, for which purpose the image acquisition unit has a detector, in particular a two-dimensionally resolved detector, for example a matrix detector, a CCD or a CMOS camera.
- a detector in particular a two-dimensionally resolved detector, for example a matrix detector, a CCD or a CMOS camera.
- the image acquisition unit is further configured to acquire captured image data regarding the presence of exactly one cell in the respective nanowell and with regard to the
- the device may have an evaluation unit, which is connected to the image acquisition unit in a manner suitable for the exchange of data.
- the image acquisition unit can be designed to identify a nanowell array with regard to its type and to determine its position and spatial orientation or to detect all nanowells independently of the array.
- Each well of a nanowell array can be assigned an ID by means of the image acquisition unit and / or the evaluation unit.
- the image acquisition unit can be connected to a database in which data of customary nanowell arrays of various manufacturers and types are stored.
- a database in which data of customary nanowell arrays of various manufacturers and types are stored.
- its type and manufacturer can be determined by comparing the image data captured by the nanowell array.
- the relative type and manufacturer can be determined by comparing the image data captured by the nanowell array.
- Positioning of the relevant nanowell array can be determined in the sample space. With the type of nanowell array and its relative positioning in the sample space, the positions of the expected ranges and the positions and, if appropriate, the courses of the gaps can also be determined. For example, according to known positions and data about nanowells without cell, with more than one cell, and nanowells adjacent to cells located in a space, control commands may be generated for a pipetting unit that will respectively harvest the selected cells in the selected nanowells. Alternatively, by means of an evaluation unit connected to the image acquisition unit based on image-analytical detection steps, the dimensions and positions of all existing nanowells independent of a database more common
- Nanowell arrays are detected.
- the evaluation unit supplies a list of all recognized nanowells, including their size, position, outlines, edge regions, etc., so that no prior definition of expected ranges is necessary.
- Each nanowell is assigned a one-unambiguous ID, which enables subsequent assignment and retrieval. Based on the position and outlines of the detected nanowells can then be an assignment of the position of the detected cells and thus conclusions about e.g. the number of cells in the area of a nanowell take place.
- the device is advantageous for documenting the
- the device advantageously, for example, a camera, a
- the device can also have a unit by means of which selected cells can be transferred from an expected region, in particular a well, of the nanowell array into an area, for example a well, of a target vessel.
- a unit may be designed as a pipette unit.
- a previously determined monoclonal cell clone can be deposited separately in a delimited nanowell or well of a target vessel and further grow there.
- a selected individual cell can also be deposited separately in a delimited nanowell or well of a target vessel and grow there to a defined cell clone. Since the device stored in this case only one cell in a nanowell or well, it may be only a cell clone in the resulting cell line in the nanowell or well.
- the device interacts with other units.
- Such units may be modularly associated with the device and, for example, modules for
- Liquid handling, picker, incubator etc. include, preferably in one
- Clean room housing The method according to the invention is advantageously carried out using a nanowell array.
- a nanowell array is advantageously also used during operation of the device.
- the nanowell arrays can be present in a practically usable plate format, for example according to the SBS standard.
- a nanowell in possible embodiments of nanowell arrays is only slightly larger than the target cell itself, thus ensuring that only a single cell, but not several cells, can fit in a nanowell.
- the mean diameters of the cells are determined as 95% intervals of the cell diameter measured by FACS or microscopy in a new-build chamber or by means of the Casy Cell Counter. For various large cell types, therefore, nanowell arrays with nanowell size matched to the cell size are used.
- Loading protocol for example, including the washing steps to be performed, etc., tuned so that there is generally only one cell or no cell per nanowell.
- the geometry of the nanowell is designed such that the cell is also held in the nanowell during optional washing steps.
- the nanowell arrays may also have functionalized surfaces. For example, interaction partners for immobilization of secreted proteins or adhesion preventing
- the nanowell arrays may, for example, have a polyHEMA coating. Their effect prevents cells from adhering to the sidewalls of the nanowells and instead sinks into the nanowells and comes to lie approximately in the middle of the respective nanowell.
- the nanowells can be designed as round bottom wells.
- the wells may contain sieves on which the cell or cell clone is maintained by the action of a negative pressure.
- a negative pressure For example, the flow of a medium through one of the sieves creates a vacuum that can suck cells into the nanowell.
- nanowell arrays with nanowells of different sizes must be kept in stock when used in a laboratory
- the invention therefore also encompasses nanowell arrays and the use of such nanowell arrays having nanowells with a diameter that allows for the uptake of multiple cells.
- the advantages are that it allows the cell to grow into small clones within the nanowell. In addition, only one type of nanowell array needs to be kept.
- a nanowell array according to the invention at the bottom of each of the nanowells is one
- Such nanowells may, for example, have a diameter of 50 ⁇ m or more.
- the anchor structure may be formed, for example, in the form of a surface structuring of the material forming the nanowell and / or a coating with anchor molecules.
- Anchor molecules may for example be suitable proteins, lipids,
- Carbohydrates and / or polymers or mixtures thereof are examples of carbohydrates and / or polymers or mixtures thereof.
- an anchor structure results in an improved binding of the cell to the nanowell and reduces the risk of the cell being erroneously removed in a washing step.
- the anchor structure is advantageously dimensioned such that only one cell can bind to it, for example can adhere.
- Other cells despite the fact that they find room in the nanowell, do not bind to the material surface of the nanowell and are washed away. This effect is aided by a coating on the inside of the nanowell that prevents adhesion of cells to the inner wall of the nanowell.
- the background is the economically sensible production and use of larger wells. If the cells are in the middle of each well, the optical detection and analysis is also supported.
- at least one coating is additionally present inside and / or outside the wells in order to at least partially bind substances and / or mixtures released from the cell and / or a detection reaction for detecting the presence of the substance or mixture of substances and / or or to initiate the detection of a signal intensity of a detection radiation.
- the bottom of the nanowell may be optically transparent (transparent) in order to inversely screen the content of the nanowell, for example to be able to scan it. It can the
- Nanowell arrays may be, for example, plastic, glass, ceramic or silicon (chips), which may be formed by processes such as injection molding, etching, laser or
- Electron beam machining can be brought into the desired geometric shape.
- Optional coatings permit binding of the expected expressed compounds to the wall or bottom of the nanowell and their detection by means of imaging and image processing techniques.
- microtiter plates used can not be used for direct cell contact due to the use of the described nanowells, they do, however, have a connection via a medium which overlays the nanowell, as has already been described above.
- a nanowell array can also be designed in other embodiments without nanowells, wherein this then has only the anchor points and is otherwise essentially a plate.
- the plate may be, for example, the bottom of a petri dish or a slide.
- the anchor points are located on at least one of the surfaces of the nanowell array and are dimensioned so that only one cell can bind per anchor point.
- nanowells are present, but have a depth that is about equal to or less than the
- Diameter of the cell is.
- the advantages of the method and the device as well as the nanowell array are manifold. Clear evidence of monoclonality is achieved by sowing in nanowell arrays designed to have only one cell in a nanowell of the array. Different cell lines can be seeded in nanowell arrays with geometry adapted to them.
- the separation performed by means of imaging techniques in conjunction with an image processing is checked. A removal of a cell or a cell clone from a nanowell is documented by means of images before and after the harvest and / or a video from the harvesting process.
- a documentation can be made that a nanowell or well of a target vessel is empty before a harvested cell or a cell clone (in the following, for simplicity, only one cell is spoken) is placed in it.
- Identification of high producers is possible without additional genetic modification of the cells.
- the identification can take place via the detection of surface proteins or the immobilization of the secreted proteins close to the producer cell and their detection, for example analogously to an ELISA in prepared and coated nanowells. This is especially important for biopharmaceuticals in human therapy and theirs
- the cell does not have to express reporter genes, as is customary in flow cytometric methods, and can therefore be unmodified or modified only with the expression cassette of the recombinant protein (transgenic production cells).
- each nanowell array has significantly more nanowells than the number of wells on conventionally used 96 and 384 well plates, respectively. Furthermore, less cell culture medium is consumed ( ⁇ / ml instead of I) and less space needed in incubators. Furthermore, a reduction in the time required is achieved because several nanowell arrays can be processed in parallel.
- the method is used for cells which are eukaryotic cells, for example cells of yeasts, insect cells or mammalian cells.
- the cells are in a suspension for sowing as single cells. If necessary, the yeast cells are brought into suspension by means of suitable methods.
- the cells are genetically modified (transfected, transduced, transformed) in such a way that they contain an expression cassette with the sequence which codes for the target protein (optionally together with other sequences which can, for example, code for reporter proteins or selection markers). You can also
- the method can be carried out in the culture of tumor cells (eg, circulating tumor cells, CTCs).
- CTC circulating tumor cells
- the CTC are covered with a common medium.
- the method and the apparatus as well as the nanowell array can also be used, for example, for cultivating stem cells, self-cells (autologous cells) of genetically modified cells, tumor cells and for
- Fig. 1 is a table showing a comparison of single-cell cloning methods and the method of the invention
- FIG. 2 shows a schematic overview of the working steps up to the monoclonal cell line using the example of recombinant protein production in various methods
- Fig. 3 is a schematic overview of the method steps in the use of
- FIG. 4 shows a schematic representation of a corrugated plate in a clean-room housing during a first optional method step
- Fig. 5 is a schematic representation of a corrugated plate during a second
- Fig. 6 is a schematic representation of a corrugated plate during a third
- Fig. 7 is a schematic representation of a corrugated plate during a fourth
- Fig. 8 is a schematic representation of a corrugated plate during a fifth
- FIG. 9 is a schematic representation of a corrugated plate during a sixth optional method step.
- FIG. 10 is a schematic representation of a detail of a nanowell array with
- 1 1 is a schematic representation of a nanowell array in plan view
- FIG. 12 is a schematic representation of a first embodiment of a device according to the invention.
- FIG. 13 is a schematic representation of a second embodiment of a device according to the invention.
- 14 is a schematic representation of a section of an embodiment of a nanowell array with anchor points in each nanowell and
- Fig. 15 is a schematic representation of another embodiment of a
- Nanowell arrays with anchor points and without nanowells are described.
- Fig. 1 the prior art methods for generating single cell clones, already described above, are tabulated against the method of the invention in terms of some of its economic parameters. The process sequences of the methods are summarized and compared in FIG.
- FIG. 3 further illustrates essential method steps and processes of a method using nanowells 17 (see FIGS. 7 and following) with a large one
- Diameter which allows the inclusion of several cells 2 (upper row) and of
- FIG. 4 shows a corrugated plate 1 located in a clean room housing 5, for example a conventional 96-well plate in SBS format.
- the corrugated plate 1 are biological cells 2, which are covered by a medium 3.
- the medium 3 is sucked off (step A).
- Fig. 5 shows the corrugated plate 1 into which a washing solution in the form of, for example, a PBS solution (not shown) was placed.
- the corrugated plate 1 is pivoted and washed (symbolized by arrows), then the PBS solution is aspirated again (step B). It can also be added to a washing solution and removed again.
- the corrugated sheet 1 can be seen, in which the cells 2 with a prepared
- Suspension 6 are covered. After addition of an enzyme to cells 2, a medium is added by which the enzymatic reaction is stopped. This is done again by means of the pipetting unit 4 in a step C.
- the step D shown in FIG. 7 schematically shows the functionalization of a
- Nanowell Arrays 9 Four regions are formed on the nanowell array 9, each having a number of nanowells 17.
- the steps E and F illustrated in FIG. 8 comprise the steps of transferring cells 2 (not shown) from the corrugated sheet 1 to a nanowell array 9 (step E).
- the cells 2 are filtered by means of a filter 7 to obtain a single cell suspension.
- the cells 2 are seeded onto the nanowell array 9.
- the single cell suspension is evenly distributed by pivoting movements (symbolized by the arrows) before it is sucked off again.
- the nanowell array 9 or a number of submerged nanowell arrays 9 can or can be centrifuged in a step G by means of a centrifuge 10 in order, for example, to move the cells 2 into the nanowells 17 of the nanowell array 9 by the action of gravity / centrifugal force (FIG. 9).
- a lateral section through a section of a nanowell array 9 is shown in FIG. 10. In each case one cell 2 is contained in the two nanowells 17 shown.
- Interspace 18 between the two nanowells 17 is also a cell 2, which is sucked by means of the pipette 4 in a step H as excess cell 2.
- an anchor point 1 1 is optionally formed, to which the cell 2 is bound.
- the respective excess cell 2 can be deposited by means of the pipette 4 in a nanowell 17, which was previously recognized as empty.
- a nanowell array 9 is obtained in whose nanowells 17 ideally only one cell 2 is contained in each case and whose interspaces 18 do not contain any cells 2.
- Such a nanowell array 9 is shown by way of example in FIG. 11.
- a step I the nanowell array 9, or as shown in FIG.
- Nanowellarrays 9 by means of an image acquisition unit 14, which can also be viewed as a microscope, illuminated with an illumination and / or excitation radiation and a resulting detection radiation spatially resolved by means of a suitable detector (not shown) detected as image data.
- the spatial resolution refers to the possibility of indicating a position of a respective location, for example a nanowell 17, from which a detection radiation is detected as an event in the XY plane.
- the image capture unit 14 is configured such that it can be used to determine whether a respective nanowell 17 contains exactly one cell 2, whether cells 2 in FIG Gaps 18 are located and what degrees of specific productivity cells 2 in the respective nanowells 17 show, in which there is only one cell 2 and which are not adjacent to a gap 18 with a cell 2.
- the evaluation of the image data takes place by means of an evaluation unit 19. Depending on the evaluation, control commands are generated and the pipetting unit 4 is activated so that only cells 2 of selected nanowells 17 are picked up and transferred to a target vessel or a targetwell plate, for example in the form of a target nanowell array 15 ( Step I).
- the evaluation unit 19 is connected to a lighting unit 13 and with a
- the illumination unit 13 provides illumination and / or excitation radiation and permits targeted illumination of the nanowell array 9, for example in the form of a scanning movement. This can be the
- Lighting unit 13 include a scanner.
- the memory unit 12 serves, in particular, for storing the documentation of the method steps, the detected ID and associated productivities.
- the evaluation unit 19 is also designed to
- Lighting unit 13 to control.
- the cells 2 transferred to one of the target nanowell arrays 15 by means of the pipette unit 4 are further incubated and their growth, survival and / or production or
- step J Secretion of specific substances or mixtures monitored and documented (step J).
- the incubation takes place in an incubator 16 (FIG. 13).
- FIG. 14 An exemplary embodiment of a nanowell array 9 is shown in FIG. 14 as a detail and in a side sectional view.
- the nanowells 17 are substantially larger than the cells 2 and optionally have an anchor point 11 at their respective bottom.
- the anchor points 1 1 are each dimensioned so that only one cell 2 can bind to them. Excess cells 2 can therefore be washed away.
- the anchor points 1 1 are formed for example by a suitable coating, a local surface roughening or structuring.
- FIG. 9 Another embodiment of a nanowell array 9 is shown in FIG. On one of the surfaces anchor points 1 1 are formed.
- the nanowell array 9 has none
- shallow depressions may be provided as nanowells 17, in which the anchor points 11 are introduced.
- the wells have a depth that is less than a diameter of the cells 2.
- IFN- ⁇ interferon-gamma
- CHO-K1 cells are classically transfected with a plasmid having an IFN- ⁇ expression cassette. Subsequently, cells 2 are cultured for a few hours, for example at least 12 hours, for a maximum of 48 hours to allow expression of the transgene.
- a nanowell array 9 is selected in which the individual nanowells 17 of the nanowell array 9 are only slightly larger than the cells 2: With an average size of a CHO-K1 cell of approximately 12 ⁇ m to 15 ⁇ m, a nanowell array 9 with round 18 is ⁇ nanowells 17 suitable. The nanowells 17 are 18 ⁇ high. The array design thus ensures that only one cell 2 can be located in a nanowell 17. - Prepare the nanowell array
- the nanowell array 9 (analogous to a classic sandwich ELISA) is coated with capture antibody. Unspecific binding sites are blocked. The nanowell array 9 is then thoroughly washed three times with PBS.
- the transfected cells 2 are passed through a 40 ⁇ m cell strainer (filter 7) to dissolve any cell aggregates that may be present and one
- the single cell suspension is applied to the prepared nanowell array 9 by means of the device and distributed evenly by tilting movements. If necessary, several nanowell arrays 9 are connected in series or in parallel with the
- the nanowell array 9 is centrifuged for three minutes at 800 rpm. Subsequently, the nanowell array 9 is washed with fresh cell culture medium to remove cells 2 that are not in nanowells 17 from the gaps 18. These cells 2 are seeded in succession in a second nanowell array 9, so that they too are available for detection and isolation and are not lost.
- the transfected cells 2 are incubated after the seeding described above for at least 30 minutes in the nanowell array 9 to allow the secretion of IFN- ⁇ in the coated nanowells 17. Subsequently, the nanowell array 9 is optionally washed with fresh cell culture medium to remove unbound IFN- ⁇ from the nanowell 17. Nanowell array 9 is then probed with an Alexa Fluor 488-conjugated antibody against IFN- ⁇ (direct detection) or with an IFN- ⁇ detection antibody (after a washing step) followed by a directed Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibody (indirect detection for signal amplification ). After an optional washing step with fresh cell culture medium, the nanowell array 9 is scanned with the image capture unit 14 of the device. The images are taken in brightfield and fluorescence (Alexa Fluor 488). The cells 2 in the nanowells 17 are identified on the basis of the bright field images. In addition, the device checks whether cells 2 are present outside nanowells 17. If this is the case, neighboring
- Nanowells 17 are excluded from the isolation process in order to prevent further cells 2 are isolated in addition to the desired single cell in the same step.
- Bright field detection also makes it possible to make fundamental statements about the viability of a cell 2 in order to exclude dead or dying cells 2 from the isolation process.
- the fluorescence images serve to detect and quantify the specific productivity of a single cell 2, since secreted IFN- ⁇ is bound by an Alexa Fluor 488-conjugated antibody (directly via detection antibody or indirectly: detection antibody and antibody
- Image acquisition unit 14 to those defined in a preselection
- Nanowells 17 for example, a detection of a fluorescence or
- the detection of the cells 2 in the bright field to identify multiple cells 2 in a nanowell 17 can be. This control can be in two images or by switching between z.
- Single cells 2 or cell clones are individually isolated from the nanowells 17 of the nanowave array 9 with the aid of the pipetting unit 4. This is documented by taking pictures before and after the harvest, as well as a video of the actual harvesting process.
- the device checks image-analytically whether only one cell 2 was recorded at each individual isolation step. The cells 2 are dispensed separately into nanowells 17 of a 384-well plate. The device checks before cell delivery whether the target nanowells 17 are empty and ensures that the
- Cell delivery takes place exclusively in empty target nanowells 17. After the cell delivery, the device checks image-analytically that only one single cell per target nanowell 17 has been deposited.
- the pipetting unit 4 which has suitable capillaries, for example made of glass, ceramic or plastic, selected nanowells 17 are approached.
- the selection of the nanowells 17 can be based on the respective signal intensities of
- the pipetting unit 4 picks up the contents of the nanowell 17 or a cell 2 from a gap 18 and delivers them to a target nanowell 17.
- a documentation of the process by the image acquisition unit 14 is possible to provide a complete proof of the
- the proliferation of the high-producing single cells 2 to the cell clone is documented by the image acquisition unit 14 by the recording of images.
- Device can image analytically determine the confluence of the culture and inform the user if the cell clone should be transferred or split into a larger well format. This process can be automated using the device.
- the target nanowell arrays 15 can be removed from the device for longer incubation capped. Additional imaging scans or screenings at defined times can document the cell growth and expression level of a transgene, or the productivity of the resulting clones, and allow further selection of the most productive clones. These steps can be carried out within an appropriately optionally equipped device (integrated incubator 16) and the existing image capture unit 14. The transport of selected clones can also take place in the pipetting unit 4 of the device.
- the specific productivity (IFN- ⁇ secretion) of the individual cell clones is analyzed in a classical ELISA. These assays are performed repeatedly to assess the stability of IFN-v production of a cell clone over time. Stable high producers are identified in this way.
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Abstract
The invention relates to a method for verifying the success of single cell seeding in nanowell arrays (9), comprising the steps: - illumination of a nanowell array (9) seeded with individual biological cells (2), the nanowell array (9) having a number of nanowells (17) in which a maximum of one cell (2) should be contained after the seeding process, by means of at least one illumination- or stimulation beam and spatially-resolved recording, as image data, of a detection beam, caused by the illumination- and/or stimulation beam, - evaluation of the image data with regard to the presence of exactly one cell (2) in each nanowell (17), - evaluation of the image data with regard to the presence of cells (2) in spaces (18) between the nanowells (17), and - storage of the positions of those nanowells (17) in which there is not exactly one cell (2) and those spaces (18) in which cells (2) are present. The invention also relates to a device for carrying out the method and to nanowell arrays (9).
Description
Verfahren zur Verifizierung des Erfolgs von Einzelzellaussaaten in Nanowellarravs sowie Method for the verification of the success of single cell seeds in nanowellarravs as well as
Vorrichtung und Nanowellarrav Device and Nanowellarrav
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Vorrichtung zur Verifizierung des Erfolgs von Einzelzellaussaaten in Nanowellarravs sowie Nanowellarravs. The invention relates to a method and apparatus for verifying the success of single cell seeds in nanowellarravs and nanowellarravs.
Viele (rekombinante) Proteine, wie beispielsweise pharmazeutische Wirkstoffe, werden in eukaryotischen Zellen produziert. Im Gegensatz zu prokaryotischen Expressionssystemen zeichnen sich eukaryotische Expressionssysteme, wie Hefen, Insektenzellen und Many (recombinant) proteins, such as pharmaceutical agents, are produced in eukaryotic cells. In contrast to prokaryotic expression systems are eukaryotic expression systems, such as yeasts, insect cells and
Säugerzellen, u.a. durch ihre Fähigkeit aus, posttranslationale Modifikationen vorzunehmen, die von entscheidender Bedeutung für die biologische Aktivität einer Vielzahl von Proteinen sind. Mammalian cells, i.a. by their ability to make post-translational modifications that are crucial for the biological activity of a variety of proteins.
Der erste Schritt bei der Produktion (rekombinanter) Proteine im industriellen Maßstab ist die Generierung stabiler Produktionszelllinien. Gängige Produktionszellen sind Hybridomazellen (Produktion monoklonaler Antikörper) oder, zur Produktion rekombinanter Proteine, genetisch modifizierte Zellen, wie beispielsweise Ovarialzellen chinesischer Hamster (CHO) oder humane embryonale Nierenzellen (HEK-293 bzw. HEK-293T). Bei Hybridomazellen handelt es sich um Fusionen aus Plasmazellen und immortalisierten Myelomzellen, die den für die jeweilige Plasmazelle spezifischen Antikörper produzieren. Die Plasmazellen werden aus der Milz von Tieren gewonnen, die mit einem Antigen von The first step in the production of (recombinant) proteins on an industrial scale is the generation of stable production cell lines. Common production cells are hybridoma cells (production of monoclonal antibodies) or, for the production of recombinant proteins, genetically modified cells, such as Chinese hamster ovary (CHO) or human embryonic kidney cells (HEK-293 or HEK-293T). Hybridoma cells are fusions of plasma cells and immortalized myeloma cells that produce antibodies specific to the particular plasma cell. The plasma cells are obtained from the spleen of animals infected with an antigen of
Interesse immunisiert wurden. Nach der Fusion von Plasmazellen und Myelomzellen erhält man eine heterogene Population von Hybridomazellen, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität (gegen das zur Immunisierung verwendete Antigen) bzw. anderer Spezifität produzieren. Zudem unterscheiden sich die Zellen in ihrer Produktivität. Interest were immunized. Following the fusion of plasma cells and myeloma cells, a heterogeneous population of hybridoma cells are obtained which produce antibodies with the desired specificity (against the antigen used for immunization) or other specificity. In addition, the cells differ in their productivity.
Für die Produktion rekombinanter Proteine wird ein Transgen, welches das Protein von Interesse kodiert, in geeignete Zellen, z.B. CHO oder 293T, eingebracht (bspw. mittels Transfektion). Die Integration des Transgens erfolgt bei den konventionellen Verfahren zufällig in das Genom der Wirtszelle. Dabei beeinflusst der Integrationsort durch benachbarte endogene regulatorische Elemente (Enhancer, Silencer, Chromatinstruktur, etc.) stark die Promoteraktivität und somit die Transkriptionsrate des Transgens. Zudem ist die Kopienzahl des Transgens in einer Zelle (Zahl der Integrate nach der Transfektion beziehungsweise Gen-Amplifikation) entscheidend für dessen Expressionsstärke. Nach der Transfektion erhält man daher einen Pool von Zellen unterschiedlicher spezifischer Produktivität, d.h. Zellen, die eine individuell spezifische Produktion des gewünschten Produktes zeigen. War die
Transfektion erfolglos oder erfolgte ein sogenanntes Gen-Silencing, werden keine der gewünschten Produkte hergestellt und die spezifische Produktivität ist Null. For the production of recombinant proteins, a transgene encoding the protein of interest is introduced into suitable cells, eg CHO or 293T (eg by transfection). Integration of the transgene occurs randomly into the genome of the host cell in conventional methods. The site of integration by neighboring endogenous regulatory elements (enhancer, silencer, chromatin structure, etc.) strongly influences the promoter activity and thus the transcription rate of the transgene. In addition, the copy number of the transgene in a cell (number of integrates after transfection or gene amplification) is crucial for its expression level. After transfection, therefore, one obtains a pool of cells of different specific productivity, ie cells which show an individually specific production of the desired product. Was the Transfection unsuccessful or was done so-called gene silencing, none of the desired products are produced and the specific productivity is zero.
Um bei der biotechnologischen Herstellung des (rekombinanten) Proteins die maximale Ausbeute zu erzielen, ist es essentiell, aus dem Pool von Hybridomazellen bzw. transgener Zellen diejenigen Zellen mit hoher spezifischer Produktivität als Ausgangsmaterial für die Generierung einer Zelllinie zu selektieren. In order to achieve the maximum yield in the biotechnological production of the (recombinant) protein, it is essential to select from the pool of hybridoma cells or transgenic cells those cells with high specific productivity as starting material for the generation of a cell line.
Häufig besteht die Anforderung, dass es sich bei den Produzentenzellen um einen Zellklon handeln muss, d.h. um Zellen, die durch Zellteilung aus einer einzelnen Ausgangszelle hervorgegangen und genetisch identisch sind. Der Zellklon von Interesse sollte sich dabei zudem durch eine hohe Proliferationskapazität sowie die Stabilität der (rekombinanten) Proteinexpression auszeichnen. Nach derzeitigem Stand der Wissenschaft werden zur Generierung neuer monoklonaler Zelllinien hauptsächlich die nachfolgend erläuterten drei Verfahren genutzt: Often there is a requirement that the producer cells must be a cell clone, i. cells that have been produced by cell division from a single parent cell and are genetically identical. The cell clone of interest should also be characterized by a high proliferation capacity and the stability of (recombinant) protein expression. According to the current state of the art, the following three methods are mainly used to generate new monoclonal cell lines:
1 ) Einzelzellklonierung mittels Limiting Dilution, 1) single-cell cloning using limiting dilution,
2) Einzelzellklonierung in semi-solidem Medium und 2) single-cell cloning in semi-solid medium and
3) Einzelzellklonierung basierend auf Durchflusszytometrie. 3) Single cell cloning based on flow cytometry.
Limiting Dilution Limiting dilution
Bei diesem Verfahren wird eine Suspension von Hybridomazellen, genetisch veränderten Zellen (gewöhnlich nach Selektion auf Antibiotikaresistenz) oder natürlicherweise ein Protein von Interesse produzierender Zellen in verschiedenen Verdünnungsstufen ausgesät. Als Ausgangspunkt der Zelllinienherstellung dient die sogenannte Grenzverdünnung, bei der statistisch eine einzelne oder keine Zelle pro Well einer 96- oder 364-Well-Platte vorliegt. Nach der Transfektion der Zellen im gängigen Labormaßstab liegen ca. 107 Zellen zur Verteilung vor. Hieraus wird ersichtlich, welche große Anzahl an Well-Platten beschickt, kultiviert und ausgewertet werden müssen. Aus den Einzelzellen lässt man in Folge unter geeigneten Kulturbedingungen Zellklone wachsen, die anschließend hinsichtlich ihrer (spezifischen) Produktivität, Wachstumsrate und Stabilität charakterisiert werden. Die Charakterisierung kann dabei beispielsweise durch eine Analyse des Zellkulturüberstandes mittels ELISA erfolgen. Das Verfahren der Limiting-Dilution ist sehr zeit- und arbeitsaufwändig. Außerdem ist ein hoher Materialaufwand, beispielsweise von Zellkulturplatten und anderen In this method, a suspension of hybridoma cells, genetically engineered cells (usually after selection for antibiotic resistance) or naturally a protein of interest producing cells is seeded at various dilution levels. The starting point for cell line production is the so-called limiting dilution, in which statistically a single or no cell is present per well of a 96- or 364-well plate. After transfection of the cells in the usual laboratory scale, there are approximately 10 7 cells for distribution. From this it becomes clear which large number of well plates have to be charged, cultivated and evaluated. The individual cells are then allowed to grow under appropriate culture conditions cell clones, which are then characterized in terms of their (specific) productivity, growth rate and stability. The characterization can be carried out for example by an analysis of the cell culture supernatant by means of ELISA. Limiting dilution is very time-consuming and labor-intensive. In addition, a high cost of materials, such as cell culture plates and others
Verbrauchsmaterialien, Medien, etc. erforderlich. Um für die Zelllinienentwicklung, wie
gemeinhin vorgeschlagen, mindestens 1000 (genetisch modifizierte) Einzelzellen bzw. die daraus hervorgegangenen Zellklone screenen, d.h. identifizieren und analysieren, zu können, müssten bei der üblichen Aussaatdichte von 0,5 Zelle/Well in einem ersten Schritt beispielsweise mindestens 21 Platten mit 96 Wells oder sechs 384-Well-Platten befüllt werden. Oft wird auch eine Aussaatdichte von 0, 1 Zelle/Well gewählt, was die Zahl der benötigten Zellkulturplatten entsprechend steigert. Zudem erfolgt die Aussaat zumeist parallel in mehreren Verdünnungen. Alle ausgesäten Zellen werden in der Folge kultiviert und propagiert, da keine Charakterisierung und Selektion auf Einzelzellebene stattfindet. Ohne zusätzliche und nachvollziehbar dokumentierte mikroskopische Überwachung der Zellproliferation ab dem Zeitpunkt der Aussaat, müssen meist zwei Runden der Limiting Dilution durchgeführt werden, um beispielsweise die Anforderungen behördlicher Consumables, media, etc. required. In order for cell line development, how commonly proposed to screen, ie identify and analyze, at least 1000 (genetically modified) single cells or the resulting cell clones, at the usual sowing density of 0.5 cell / well in a first step, for example at least 21 plates with 96 wells or six 384-well plates are filled. Often, a sowing density of 0.1 cell / well is chosen, which increases the number of cell culture plates required accordingly. In addition, sowing usually takes place in parallel in several dilutions. All seeded cells are cultured and propagated in the sequence, since no characterization and selection takes place at the single cell level. Without additional and comprehensible documented microscopic monitoring of cell proliferation from the time of sowing, usually two rounds of limiting dilution must be carried out, for example, to meet the regulatory requirements
Zulassungsverfahren zu erfüllen. Dies ist nötig, da einzelne Wells nach der Aussaat der Zellsuspension mehr als eine Ausgangszelle enthalten können und dient dem Ausschluss daraus resultierender nicht-monoklonaler Zelllinien. To comply with the authorization procedure. This is necessary because individual wells may contain more than one parent cell after seeding the cell suspension and serves to exclude resulting non-monoclonal cell lines.
Einzelzellklonierung in semi-solidem Medium Single cell cloning in semi-solid medium
Bei diesem Ansatz werden Zellen in semi-solides Medium, wie beispielsweise In this approach, cells in semi-solid medium, such as
Methylzellulose, eingesät. Die Zellen werden in dem viskosen Medium immobilisiert und können zu Kolonien heranwachsen, die anschließend isoliert werden können. Da eine Kolonie aus einer Einzelzelle entstanden sein oder auch auf zwei oder mehrere eng benachbarte Zellen zurückgehen kann, fehlt bei dieser Methode jedoch ein eindeutiger Nachweis der Monoklonalität. Zudem sind Visualisierungen von Einzelzellen am Tag der Aussaat schwierig, da beispielsweise nicht alle Zellen in der Fokusebene einer zur Methylcellulose, sown. The cells are immobilized in the viscous medium and can grow into colonies, which can then be isolated. However, since a colony may have been formed from a single cell or may be due to two or more closely spaced cells, this method lacks unambiguous evidence of monoclonality. In addition, visualization of single cells on the day of sowing are difficult because, for example, not all cells in the focal plane of a
Erfolgskontrolle der Aussaat verwendeten optischen Vorrichtung liegen. Success control of sowing used optical device lie.
Die spezifische Produktivität der Produzentenzellen kann jedoch einfach durch geeignete Immundiffussionstests charakterisiert werden. Diese beruhen auf der Präzipitation des Produktes, welches um den Produzentenzellklon herum in das semi-solide Medium diffundiert. Eine Charakterisierung ist beispielsweise unter Einsatz Fluorochrom-konjugierter Antikörper möglich. Die Größe eines sich um die Produzentenzelle bildenden Präzipitatrings korreliert dabei mit der Menge des sekretierten Produktes und erlaubt demnach eineHowever, the specific productivity of the producer cells can be easily characterized by suitable immunodiffusion tests. These are due to the precipitation of the product, which diffuses around the producer cell clone into the semi-solid medium. Characterization is possible, for example, using fluorochrome-conjugated antibody. The size of a precipitate ring forming around the producer cell correlates with the amount of secreted product and thus permits one
Bewertung der Produktivität eines Zellklons unter Berücksichtigung der Größe des Zellklons. Evaluation of the productivity of a cell clone considering the size of the cell clone.
Einzelzellklonierung basierend auf Durchflusszytometrie Single cell cloning based on flow cytometry
In diesem Verfahren zur Einzelzellklonierung werden einzelne Zellen mit Hilfe eines Sorters gezielt aus einer Zellsuspension isoliert und anschließend separat in Kavitäten (Wells) einer Zielplatte abgelegt. Dabei wird eine Einzelzelle in jedes Well beispielsweise einer 96- bzw. 384-Well-Platte eingebracht. Die Zielzellen werden anhand ihrer Fluoreszenz, die auf der
Expression von Reportergenen bzw. Anfärbung von Oberflächen-Antigenen mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern beruhen kann, von anderen Zellen unterschieden. In den Wells der Zielplatten wachsen die Einzelzellen anschließend zu Zellklonen heran. Einen Vorteil dieses Verfahrens stellt der hohe Durchsatz dar, der bei der Isolation von Produzentenzellen durch den Sorter erzielt werden kann. Bis zu 5 x 107 Ausgangszellen können in 30 min sortiert werden. Zudem sind eine Fluoreszenz-basierte Auswertung der Produktivität der Zelle und die gezielte Isolation von Zellen mit gewünschten Eigenschaften möglich. Da das Verfahren allerdings nicht so schonend wie die vorher beschriebenen Alternativen ist, kann es zur Beeinträchtigung der Viabilität isolierter Zellen kommen. Zudem erfolgt die Zellsortierung nicht unter sterilen Bedingungen, sodass der Einsatz von Antibiotika unabdingbar ist, um das Kontaminationsrisiko zu verringern. Kritisch für den Erfolg des Verfahrens sind auch die vorgenommenen Einstellungen des verwendeten Sorters. Die als optimal angesehen Einstellungen (z. B. Gating, Kompensation, etc.) sind probenspezifisch und werden anhand eines Teils der vorliegenden Probe, beispielsweise der Zellsuspension, vorgenommen. Die darin befindlichen Zellen, möglicherweise auch die Zielzellen, werden verworfen, sodass sie weder für die Isolation noch für Folgeschritte zur Verfügung stehen. Aber auch nach der initialen Definition geeigneter Parameter gehen Zellen unwiederbringlich verloren. Der Verlust möglicher Zielzellen während des gesamten Sortiervorganges wird mit bis zu 50% angegeben. Eine weitere Schwierigkeit besteht darin sicherzustellen, dass wirklich Einzelzellen und keine Aggregate aus zwei oder mehreren Zellen bzw. mehrere Einzelzellen in einem Tropfen isoliert werden. Der Nachweis der erfolgreichen In this method for single-cell cloning, individual cells are selectively isolated from a cell suspension using a sorter and then deposited separately in wells of a target plate. In this case, a single cell is introduced into each well, for example, a 96- or 384-well plate. The target cells are determined by their fluorescence on the Expression of reporter genes or staining of surface antigens with fluorochrome-conjugated antibodies may be differentiated from other cells. In the wells of the target plates, the individual cells then grow up to cell clones. An advantage of this method is the high throughput that can be achieved in the isolation of producer cells by the sorter. Up to 5 x 10 7 output cells can be sorted in 30 min. In addition, a fluorescence-based evaluation of the productivity of the cell and the targeted isolation of cells with desired properties are possible. However, since the method is not as gentle as the previously described alternatives, the viability of isolated cells may be impaired. In addition, cell sorting is not done under sterile conditions, so the use of antibiotics is essential to reduce the risk of contamination. Critical to the success of the process are also the settings made by the sorter used. The settings considered optimal (eg gating, compensation, etc.) are sample-specific and are based on a part of the present sample, for example the cell suspension. The cells in it, possibly also the target cells, are discarded, so that they are not available for isolation or subsequent steps. But even after the initial definition of suitable parameters, cells are irretrievably lost. Loss of possible target cells throughout the sorting process is reported as up to 50%. Another difficulty is to ensure that truly single cells and no aggregates are isolated from two or more cells or multiple single cells in a drop. Proof of successful
Einzelzellablage kann nur durch die mikroskopische Betrachtung der Zielplatten erbracht werden. Ohne diese Kombination der Einzelzellklonierung mittels Durchflusszytometrie mit der Mikroskopie ist kein Monoklonalitätsnachweis möglich. Single cell deposition can only be achieved by microscopic examination of the target plates. Without this combination of single cell cloning by flow cytometry with microscopy, no monoclonal detection is possible.
Allen drei Standardverfahren ist gemein, dass die Monoklonalität der jeweiligen Zelllinie nicht eindeutig nachgewiesen werden kann. Außerdem ist der Zeit und Materialaufwand bei der Herstellung monoklonaler Zelllinien hoch. All three standard methods have in common that the monoclonality of the respective cell line can not be clearly established. In addition, the time and material cost of producing monoclonal cell lines is high.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde ein gegenüber dem Stand der Technik verbessertes Verfahren vorzuschlagen, das für die Herstellung monoklonaler Zelllinien geeignet ist. Außerdem soll mit der Erfindung eine Vorrichtung vorgeschlagen werden, mit der das Verfahren ausführbar ist. The object of the invention is to propose a method which is improved over the prior art and which is suitable for the production of monoclonal cell lines. In addition, to be proposed with the invention, a device with which the method is executable.
Die Aufgabe wird hinsichtlich des Verfahrens durch den Gegenstand des Anspruchs 1 und hinsichtlich der Vorrichtung durch die Merkmale des Anspruchs 12 gelöst. Ein in dem The object is achieved with regard to the method by the subject matter of claim 1 and with respect to the device by the features of claim 12. One in the
Verfahren verwendbares und mit der Vorrichtung nutzbares Nanowellarray ist Gegenstand
der Anspruchs 16. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der nebengeordneten und der abhängigen Ansprüche. Method usable and usable with the device nanowell array is the subject Claim 16. Advantageous developments are the subject of the independent and dependent claims.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Verifizierung des Erfolgs von The method according to the invention makes it possible to verify the success of
Einzelzellaussaaten in Nanowellarrays und umfasst mehrere Schritte. Single cell seeds in nanowell arrays and comprises several steps.
In einem Schritt erfolgt ein Beleuchten eines mit einzelnen biologischen Zellen besäten Nanowellarrays, wobei das Nanowellarray eine Anzahl von Nanowells aufweist, in denen unmittelbar nach der Aussaat, gegebenenfalls nach anschließend erfolgenden In one step, a nanowell array seeded with individual biological cells is illuminated, wherein the nanowell array has a number of nanowells in which, immediately after sowing, if appropriate afterward
Waschschritten, jeweils höchstens eine biologische Zelle enthalten sein soll. Das Washing steps, each containing at most one biological cell. The
Nanowellarray wird mit mindestens einer Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung beleuchtet. Eine durch die Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung bewirkte Nanowell array is illuminated with at least one illumination and / or excitation radiation. One caused by the illumination and / or excitation radiation
Detektionsstrahlung wird ortsaufgelöst (2D) als Bilddaten erfasst. Dabei dient eine Detection radiation is spatially resolved (2D) recorded as image data. It serves a
Beleuchtungsstrahlung der Beleuchtung des Nanowellarrays, ohne dabei die Zellen oder deren Bestandteile zu verändern. Eine Anregungsstrahlung dient dazu, anregbare Moleküle und/oder Stoffgemische zu verändern und beispielsweise zur Emission einer Illumination radiation of the illumination of the nanowell array, without changing the cells or their components. An excitation radiation is used to change excitable molecules and / or mixtures and, for example, to emit a
Fluoreszenzstrahlung anzuregen. Eine Detektionsstrahlung kann durch reflektierte Anteile der Beleuchtungsstrahlung und/oder der Anregungsstrahlung sowie durch Strahlung gegeben sein, die aufgrund der Anregungsvorgänge emittiert wird. Es ist auch möglich, die Detektionsstrahlung durch die Probe hindurch zu erfassen (Durchlichtverfahren). To excite fluorescence radiation. A detection radiation can be given by reflected portions of the illumination radiation and / or the excitation radiation as well as by radiation which is emitted on the basis of the excitation processes. It is also possible to detect the detection radiation through the sample (transmitted light method).
Im Sinne der Beschreibung werden Vertiefungen zur Aufnahme von Proben als Nanowells bezeichnet, wenn deren Volumen kleiner als 1 mm3 (1 μΙ) ist. Vertiefungen zur Aufnahme von Proben, wie diese beispielsweise auf 384-Well-Mikrotiterplatten (ca. 40 μΙ Volumen pro Well) oder 1536 (ca. 10 μΙ Volumen pro Well) ausgebildet sind, werden als Wells oder Makrowells bezeichnet. For the purposes of the description, wells for receiving samples are referred to as nanowells if their volume is smaller than 1 mm 3 (1 μΙ). Wells for receiving samples, such as those formed on 384-well microtiter plates (about 40 μΙ volume per well) or 1536 (about 10 μΙ volume per well), are referred to as wells or macrowells.
Dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgelagert können die Schritte des Aussäens von Einzelzellen auf dem Nanowellarray sowie das Spülen des Nanowellarrays sein. Der letztere Schritt dient dazu, Zellen außerhalb der Nanowells und/oder überzählige Zellen in den Nanowells zu entfernen. Preceded by the method according to the invention may be the steps of sowing individual cells on the nanowell array and rinsing the nanowell array. The latter step serves to remove cells outside the nanowells and / or excess cells in the nanowells.
In einem Schritt werden sogenannte Produktionszellen als Einzelzellen in dem In one step, so-called production cells as single cells in the
Nanowellarray ausgesät. Bei den Produktionszellen kann es sich beispielsweise um Seeded nanowell array. For example, the production cells may be
Hybridomazellen, durch Transfektion, Transduktion beziehungsweise Transformation genetisch veränderte Zellen oder natürlicherweise ein Protein von Interesse- exprimierende Zellen handeln. Die Zellen liegen für die Aussaat in Suspension vor oder werden, im Fall adhärenter Zellen, vor der Aussaat mechanisch, enzymatisch oder unter Zuhilfenahme
entsprechender Puffer abgelöst und in Suspension gebracht. Eine Vereinzelung der Zellen kann auch mithilfe siebartiger Vorrichtungen wie Netzen aus Nylon erreicht werden. Alle zur Verfügung stehenden Zellen werden im Nanowellarray ausgesät. In weiteren Ausgestaltungen des Verfahrens können simultan auch Produktionszellen auf mehreren Nanowellarrays ausgesät werden. Dabei können mehrere Nanowellarrays angeordnet und besät werden und/oder die von einem der Nanowellarrays weggewaschenen Zellen werden auf einem anderen Nanowellarray ausgesät. Die Aussaat der Zellen in den Nanowellarray kann manuell oder mit einer Vorrichtung erfolgen und Kipp- bzw. Schwenkbewegungen, Zentrifugationsschritte und Waschschritte umfassen. Die weiter unten beschriebene erfindungsgemäße Vorrichtung kann zur Aussaat von Zellen auf einem Nanowellarray ausgebildet sein und beispielsweise über eine Hybridoma cells, by transfection, transduction or transformation genetically modified cells or naturally a protein of interest-expressing cells. The cells are present for sowing in suspension or, in the case of adherent cells, prior to sowing mechanically, enzymatically or with the aid of corresponding buffer detached and brought into suspension. Separation of the cells can also be achieved using sieve-like devices such as nylon nets. All available cells are seeded in the nanowell array. In further embodiments of the method, production cells can also be seeded on several nanowell arrays simultaneously. In this case, a plurality of nanowell arrays can be arranged and seeded and / or the cells washed away by one of the nanowell arrays are seeded on a different nanowell array. The seeding of the cells into the nanowell array can be done manually or with a device and include tilting and pivoting movements, centrifugation steps and washing steps. The device according to the invention described below can be designed for sowing cells on a nanowell array and, for example, via a
Pipettiereinheit verfügen und mit einem Zellsieb in Verbindung stehen. Have a pipetting unit and communicate with a cell strainer.
In den jeweiligen Nanowells wird nach der Aussaat das Vorhandensein wenigstens einer Zelle erwartet, so dass jeweils auch von einem Erwartungsbereich gesprochen werden kann. Die Zwischenräume zwischen den Nanowells, die beispielsweise durch Stege zwischen den Nanowells oder durch einen Rand des Nanowellarrays gegeben sind, stellen keine In the respective nanowells, the presence of at least one cell is expected after sowing, so that one can also speak of an expected range in each case. The gaps between the nanowells, which are given for example by webs between the nanowells or by an edge of the nanowell array, do not provide any
Erwartungsbereiche dar. In der Praxis ergibt sich oft eine Verteilung der Nanowells mit einer Zelle, mit mehreren Zellen und mit leeren Zellen, die mittels einer Expected areas. In practice, often results in a distribution of the nanowell with a cell, with multiple cells and with empty cells, which by means of a
Wahrscheinlichkeitsverteilung, beispielsweise einer Gaußfunktion, beschrieben werden kann. Die erwartete Anzahl von einer Zelle je Nanowell entspricht einer idealen Aussaat. Sind Nanowells mit mehr als einer Zelle und/oder leere Nanowells vorhanden, kann eine erwartete oder erwünschte Belegung der Nanowells mit je einer Zelle nachträglich mittels der unten ausgeführten Korrekturschritte herbeigeführt werden. Probability distribution, such as a Gaussian, can be described. The expected number of one cell per nanowell corresponds to an ideal sowing. If nanowells with more than one cell and / or empty nanowells are present, an expected or desired occupancy of the nanowells with one cell each can subsequently be brought about by means of the correction steps outlined below.
Um zu bewerten, welche der Nanowells nur eine einzige Zelle beinhaltet, wird das beladene Nanowellarray beleuchtet. Die Verteilung der Zellen wird dabei beispielsweise mittels einer Hellfeldbeleuchtung und ggf. anhand von Fluoreszenzaufnahmen erfasst und analysiert. Im Hellfeld werden die Nanowells selbst als auch Einzelzellen in den Nanowells detektiert. Die so erhaltenen Bilddaten werden hinsichtlich der Position der Nanowells als auch des To evaluate which of the nanowells contains only a single cell, the loaded nanowell array is illuminated. The distribution of the cells is detected and analyzed, for example, by means of bright field illumination and, if appropriate, by means of fluorescence images. In the bright field, the nanowells themselves as well as single cells in the nanowells are detected. The image data obtained in this way are compared with respect to the position of the nanowell as well as the
Vorhandenseins genau einer Zelle in den jeweiligen Nanowells ausgewertet. Außerdem werden die Bilddaten hinsichtlich des Vorhandenseins von Zellen in Zwischenräumen zwischen den Nanowells ausgewertet.
Sollten sich Zellen in den Zwischenräumen zwischen den Nanowells befinden, werden auch diese in dem Schritt detektiert und benachbarte Nanowells können für die Isolation ausgeschlossen werden, um der Aufnahme von mehr als einer Zelle vorzubeugen. Eine ortsaufgelöste Erfassung der Detektionsstrahlung bezieht sich auf eine möglicheExistence of exactly one cell in the respective nanowells evaluated. In addition, the image data is evaluated for the presence of cells in interstices between the nanowells. Should cells be in the interstices between the nanowells, they will also be detected in the step and adjacent nanowells may be excluded for isolation to prevent the uptake of more than one cell. A spatially resolved detection of the detection radiation refers to a possible
Ermittlung und Angabe von zweidimensionalen Koordinaten eines jeweiligen Ortes, von dem ausgehende Detektionsstrahlung erfasst wurde. Insbesondere ist es möglich, Determination and specification of two-dimensional coordinates of a respective location from which outgoing detection radiation was detected. In particular, it is possible
zweidimensionale Koordinaten einer Detektionsstrahlung emittierenden Zelle zu erfassen und anzugeben. to capture and indicate two-dimensional coordinates of a detection radiation emitting cell.
Die Positionen derjenigen Nanowells, in denen nicht genau eine Zelle vorhanden ist sowie derjenigen Zwischenräume, in denen Zellen vorhanden sind, werden abgespeichert und erhalten eine Identität (nachfolgend auch kurz: ID), beispielsweise in Form einer Nummer, eines Koordinatenpaares und optional weiterer ID-Parameter wie Versuchsnummer, Bezeichnung der Zellen, Labornummer des Versuchs/ der Zelle etc.. Zusätzlich können die Positionen derjenigen Nanowells gespeichert werden, in denen genau eine Zelle und/oder keine Zelle vorhanden ist. The positions of those nanowells in which there is not exactly one cell and those interstices in which cells are present are stored and given an identity (in the following also briefly: ID), for example in the form of a number, a coordinate pair and optionally further ID. Parameters such as the experiment number, name of the cells, laboratory number of the experiment / cell, etc. In addition, the positions of those nanowells can be stored in which exactly one cell and / or no cell is present.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens werden Nanowells ohne Zellen und/oder Nanowells mit mehr als einer Zelle und/oder Nanowells, die an Zwischenräume angrenzen, in denen Zellen detektiert worden sind, identifiziert, deren ID erfasst und deren Positionen abgespeichert. Die so identifizierten Nanowells werden von nachfolgenden In an advantageous embodiment of the method, nanowells without cells and / or nanowells having more than one cell and / or nanowells adjoining interstices in which cells have been detected are identified, their IDs are recorded and their positions are stored. The nanowells identified in this way are subsequently identified
Verfahrensschritten ausgeschlossen. Dadurch ist vorteilhaft erreicht, dass weder leere Nanowells noch Nanowells mit mehr als einer Zelle für nachfolgende Schritte verwendet werden. Es werden daher Zustellbewegungen von Entnahmevorrichtungen zu leeren Nanowells vermieden beziehungsweise werden keine Nanowells angefahren, die mit Sicherheit nicht die Anforderungen an eine Monoklonalität ihres Inhalts erfüllen. Mit einer solchen Ausgestaltung werden Zeit, Energie und Verbrauchsmaterial wie Pipetten gespart. In einer möglichen Weiterbildung des Verfahrens werden Nanowells, in denen nach der Aussaat mehr als eine Zelle vorhanden ist, und/oder Zellen in Zwischenräumen eine Entnahmevorrichtung, z. B. eine Pipette, zugestellt. Mittels der Entnahmevorrichtung und einer entsprechende Ansteuerung derselben werden zuvor mittels einer Process steps excluded. As a result, it is advantageously achieved that neither empty nanowells nor nanowells with more than one cell are used for subsequent steps. Therefore, delivery movements of removal devices to empty nanowells are avoided or no nanowells are approached that certainly do not fulfill the requirements for monoclonality of their contents. With such a configuration, time, energy and consumables such as pipettes are saved. In a possible development of the method, nanowells, in which more than one cell is present after sowing, and / or cells in interspaces, a removal device, for. As a pipette delivered. By means of the removal device and a corresponding control of the same are previously by means of a
Auswerteeinheit (s.u.) überschüssige Zellen, vorzugsweise einzeln, aus den betreffenden Nanowells und/oder Zwischenräumen entnommen. Mit dieser Verfahrensausgestaltung können fehlerhaft angesäte Nanowells und Zwischenräume erkannt und der jeweilige Aussaatfehler korrigiert werden.
Die entnommenen Zellen können verworfen werden. Besser ist es aber, wenn die entnommenen Zellen weiterverwendet werden können. Dazu wird vorgeschlagen, dass nach der Aussaat leer gebliebene Nanowells identifiziert und deren Position ermittelt werden. In diese bis dato leeren Nanowells werden entnommene Zellen einzeln abgelegt. Evaluation unit (see below) excess cells, preferably individually, taken from the respective nanowells and / or interstices. With this procedure, incorrectly seeded nanowells and gaps can be detected and the respective sowing error corrected. The removed cells can be discarded. It is better, however, if the extracted cells can continue to be used. For this purpose, it is proposed that after sowing empty nanowells are identified and determined their position. Sampled cells are individually deposited in these hitherto empty nanowells.
Die vorgenannten Ausgestaltungen des Verfahrens werden durch entsprechende The aforementioned embodiments of the method are by appropriate
Steuerprotokolle und Bild- und/oder Videoaufnahmen nachvollziehbar dokumentiert und so abgespeichert, dass eine nachträgliche Verifikation der ausgeführten Verfahrensschritte möglich ist und deren jeweilige Erfolge eindeutig nachvollzogen werden können. Control protocols and image and / or video recordings comprehensibly documented and stored so that a subsequent verification of the executed process steps is possible and their respective successes can be clearly understood.
Um die Vorteile der vorstehenden Verfahrensvarianten zu erzielen ist es vorteilhaft, wenn die abgespeicherten Positionen der Nanowells ohne Zellen und/oder Nanowells mit mehr als einer Zelle und/oder Nanowells, die an Zwischenräume angrenzen, in denen Zellen detektiert worden sind, dazu verwendet werden, um in Abhängigkeit von diesen Positionen In order to obtain the advantages of the above method variants, it is advantageous if the stored positions of the nanowells without cells and / or nanowells having more than one cell and / or nanowells adjoining interstices in which cells have been detected are used to around depending on these positions
Steuerbefehle für nachfolgende Verfahrensschritte zu generieren oder anzupassen. Generate control commands for subsequent process steps or adapt.
Beispielsweise werden die Steuerbefehle zur Ansteuerung der Entnahmevorrichtung entsprechend angepasst. Um bestimmte gewünschte physiologische Reaktionen der Zellen auszulösen oder zu unterstützen, wird das Nanowellarray vorteilhaft unter Kulturbedingungen gehalten, bei denen die gewünschten physiologischen Reaktionen der Zellen ermöglicht werden. Solche physiologischen Reaktionen sind beispielsweise das Überleben, das Wachstum und/oder die Proliferation der Zellen. Es können darüber hinaus oder stattdessen beispielsweise auch die Expression und Sekretion bestimmter Stoffe wie Peptide, Proteine, Hormone, For example, the control commands for controlling the removal device are adjusted accordingly. In order to induce or support certain desired physiological responses of the cells, the nanowell array is advantageously maintained under culture conditions which allow the desired physiological responses of the cells. Such physiological reactions are, for example, the survival, growth and / or proliferation of the cells. In addition, or instead, for example, the expression and secretion of certain substances such as peptides, proteins, hormones,
Wachstumsfaktoren und dergleichen als gewünschte physiologische Reaktionen ermöglicht und unterstützt werden. Growth factors and the like as desired physiological reactions are enabled and supported.
Die Zellen liegen nach der Aussaat und nach einer eventuellen Vereinzelung jeweils allein in einem Nanowell. Die Nanowells mit den Zellen können mit einem Medium, beispielsweise einem Nährmedium, überschichtet werden, so dass eine Kommunikation der Zellen untereinander möglich ist. Eine solche Kommunikation kann vorteilhaft die Proliferationsrate erhöhen und somit die Effizienz des Verfahrens steigern. Die Schritte des Verfahrens können in einem sterilen, den Bedürfnissen der Zellen angepassten Umfeld stattfinden, indem beispielsweise gewünschte Temperaturen, definierte
Gasgehalte wie ein definierter CO2- und/oder 02-Gehalt sowie eine bestimmte Luftfeuchte geregelt sind. The cells lie after sowing and after a possible separation each alone in a nanowell. The nanowells with the cells can be covered with a medium, for example a nutrient medium, so that communication of the cells with one another is possible. Such communication can advantageously increase the proliferation rate and thus increase the efficiency of the method. The steps of the method may take place in a sterile environment adapted to the needs of the cells, for example by defining desired temperatures Gas contents such as a defined CO2 and / or 02 content and a certain humidity are regulated.
Soll die Isolation der Zellen anhand ihrer spezifischen Produktivität erfolgen, muss die Produktion des Proteins von Interesse visualisierbar sein und der Zielzelle zugeordnet werden können. Im Fall produktiver transgener Zellen kann die Detektion dabei u.a. auf der zusätzlichen Produktion von Reporterproteinen durch die Zielzellen beruhen. Bei dieser Methode wurde vorab zusätzlich zu der Sequenz, die das rekombinante Protein kodiert, die kodierende Sequenz eines Reporterproteins, welches später detektiert wird, in die Zelle eingebracht. Die Expression beider Gene muss korrelieren. If the isolation of the cells is to be based on their specific productivity, the production of the protein of interest must be visualizable and be able to be assigned to the target cell. In the case of productive transgenic cells, the detection can u.a. based on the additional production of reporter proteins by the target cells. In this method, in addition to the sequence encoding the recombinant protein, the coding sequence of a reporter protein, which is detected later, was previously introduced into the cell. The expression of both genes must correlate.
Alternativ wird die Präsenz des (sekretierten) Proteins direkt nachgewiesen. Dabei können Oberflächenproteine, bspw. B- und T-Zell-Rezeptoren, direkt über immunologische Alternatively, the presence of the (secreted) protein is detected directly. In this case, surface proteins, for example. B and T cell receptors, directly via immunological
Verfahren nachgewiesen werden. Im Fall sekretierter Proteine erfolgt eine Immobilisierung des sekretierten (rekombinanten) Proteins in räumlicher Nähe der Produzentenzelle (bspw. durch eine Beschichtung der Nanowellstruktur oder über Antigen-Antikörper- oder andere Protein-Protein-Interaktionen). Be detected. In the case of secreted proteins, immobilization of the secreted (recombinant) protein occurs in close proximity to the producer cell (eg by coating the nanowell structure or via antigen-antibody or other protein-protein interactions).
Es ist möglich, dass von der Zelle abgegebene Stoffe und/oder Stoffgemische in dem Well und/oder neben dem Well mittels für die nachzuweisenden Stoffe und/oder Stoffgemische spezifischen Bindungspartnern wenigstens anteilig gebunden werden. Proteine können auch einen Tag aufweisen, der gebunden werden kann. Das Protein von Interesse kann nun mittels immunologischer Verfahren nachgewiesen werden und resultiert in einem distinkten, messbaren Signal (bspw. Fluoreszenz; Lumineszenz). Eine solche Immobilisierung der abgegebenen, beispielsweise sekretierten, Stoffe bzw. Stoffgemische in räumlicher Nähe der jeweiligen Zelle ermöglicht eine Bewertung der Produktivität der betreffenden Zelle oder eines aus der Zelle vorvorgegangenen Zellklons. It is possible that substances released from the cell and / or mixtures of substances in the well and / or next to the well are at least partially bound by means of binding partners specific for the substances and / or mixtures to be detected. Proteins can also have a tag that can be bound. The protein of interest can now be detected by immunological methods and results in a distinct, measurable signal (eg fluorescence, luminescence). Such immobilization of the released, for example, secreted, substances or substance mixtures in the spatial proximity of the respective cell makes it possible to evaluate the productivity of the relevant cell or a cell clone which has passed from the cell.
Die Detektion der spezifischen Produktivität von Einzelzellen, kann auf der Detektion des (sekretierten), (rekombinanten) Proteins beruhen. Dazu geeignet sind beispielsweise über Fluorochrom-gekoppelte Antikörper wie Fluorochrom-gekoppelte Detektionsantikörper oder unmarkierter Detektionsantikörper und Fluorochrom-gekoppelte Sekundärantikörper. Des Weiteren über Enzym-gekoppelte Antikörper (Enzym-gekoppelte Detektionsantikörper oder unmarkierter Detektionsantikörper und Enzym-gekoppelte Sekundärantikörper); über die Interaktion des Proteins von Interesse mit andere Bindungspartnern (bspw. dem Antigen, für das ein sekretierter Antikörper spezifisch ist) und deren Detektion (Fluorochrom-gekoppelte
Antikörper, Enzym-gekoppelte Antikörper) sowie über andere Detektionskaskaden, bspw. biotinylierter Detektionsantikörper und Enzym-gekoppeltes Avidin. The detection of the specific productivity of single cells may be based on the detection of the (secreted) (recombinant) protein. Suitable for this purpose are, for example, fluorochrome-coupled antibodies such as fluorochrome-coupled detection antibodies or unlabeled detection antibodies and fluorochrome-coupled secondary antibodies. Furthermore, via enzyme-linked antibodies (enzyme-linked detection antibodies or unlabeled detection antibodies and enzyme-linked secondary antibodies); on the interaction of the protein of interest with other binding partners (eg the antigen for which a secreted antibody is specific) and their detection (fluorochrome-coupled Antibodies, enzyme-linked antibodies) as well as other detection cascades, for example biotinylated detection antibodies and enzyme-coupled avidin.
Die Signalintensität der Zelle bzw. des Zellklons oder im Nanowell (Fluoreszenz, The signal intensity of the cell or of the cell clone or in the nanowell (fluorescence,
Chemilumineszenz, ein messbarer Farbumschlag bei enzymatischer Umsetzung Chemiluminescence, a measurable color change upon enzymatic conversion
chromogener Substrate) wird durch eine Bilderfassungsvorrichtung erfasst. Die chromogenic substrates) is detected by an image capture device. The
Signalintensität lässt Rückschlüsse auf die Menge des produzierten (rekombinanten) Proteins zu und wird analysiert, um Hochproduzenten von Produzenten und NichtProduzenten zu unterscheiden. Abhängig von der gewählten Detektionsmethode können Fluoreszenzaufnahmen die Signal intensity allows conclusions to be drawn on the amount of (recombinant) protein produced and is analyzed to distinguish high producers from producers and non-producers. Depending on the selected detection method, fluorescence images can be used
Detektion von Zielzellen, die das (rekombinante) Protein produzieren, ermöglichen. Da das Fluoreszenzsignal in diesem Fall mit der Menge des produzierten Zielproteins korreliert, kann die Vorrichtung durch eine Quantifizierung der Fluoreszenzsignalintensität Detection of target cells that produce the (recombinant) protein. Since the fluorescence signal in this case correlates with the amount of target protein produced, the device can be quantitated by fluorescence signal intensity
Hochproduzenten erkennen. In dem erfindungsgemäßen Verfahren beziehungsweise einer seiner Ausgestaltungen kann eine Erfassung und Auswertung von Fluoreszenzsignalen und die Quantifizierung der Produktivität von Zellen oder Zellklonen bereits kurz nach der Aussaat erfolgen. Dadurch ist eine frühzeitige Auswertung der Signale der ausgesäten Zellen bzw. der sich entwickelnden Zellklone möglich. In weiteren Schritten des Verfahrens werden ausgewählte Zellen oder aus einer einzelnen Zelle hervorgegangene Zellklone aus den jeweiligen Wells automatisiert entnommen und einzeln weiter kultiviert, so dass später monoklonale Zelllinien erhalten werden. Recognize high producers. In the method according to the invention or one of its embodiments, detection and evaluation of fluorescence signals and quantification of the productivity of cells or cell clones can take place shortly after sowing. As a result, an early evaluation of the signals of the seeded cells or the developing cell clones is possible. In further steps of the method, selected cells or cell clones resulting from a single cell are automatically removed from the respective wells and further cultured individually, so that monoclonal cell lines are obtained later.
Solche Einzelzellen oder Zellklone werden vorteilhaft anhand ihrer spezifischen Produktivität, vorzugsweise automatisiert, für den Isolationsprozess ausgewählt. Anschließend werden die ausgewählten Einzelzellen bzw. Zellklone gezielt von der Vorrichtung isoliert und in einem Zielgefäß abgelegt. Der Isolationsprozess wird dabei vorteilhaft durch die Aufnahme von Bildern vor und nach der Ernte der Zielzelle sowie eines Erntevideos dokumentiert. Bei dem Zielgefäß kann es sich bspw. um ein weiteres Nanowellarray oder eine konventionell genutzte Mikrotiterplatte bspw. 96- oder 384-Well-Platte handeln. Von Vorteil ist es, wenn das Zielgefäß vorab daraufhin untersucht wurde, ob dieses noch keine Zellen enthält und dessen Nanowells beziehungsweise Wells leer sind. Eine solche Kontrolle kann Such single cells or cell clones are advantageously selected based on their specific productivity, preferably automated, for the isolation process. Subsequently, the selected individual cells or cell clones are selectively isolated from the device and placed in a target vessel. The isolation process is advantageously documented by the recording of images before and after the harvest of the target cell and a harvest video. The target vessel may be, for example, another nanowell array or a conventionally used microtiter plate, for example a 96- or 384-well plate. It is advantageous if the target vessel was examined in advance to see whether it still contains no cells and its nanowells or wells are empty. Such a control can
beispielsweise unter Verwendung eines bildgebenden Verfahrens erfolgen und dokumentiert werden. Ist dies nicht der Fall, sind die Wells also nicht nachweislich leer, werden die entsprechenden Wells des Zielgefäßes als Zielwells ausgeschlossen.
Um den hohen Anforderungen an den Nachweis der Monoklonalitat von Zelllinien gerecht zu werden, können die physiologischen Reaktionen dokumentiert werden, wobei Wachstumsund Proliferationsprozesse beispielsweise im Hellfeld erfasst und gemessen werden. Dabei können die Zelldichte sowie die Anzahl und Größe der Zellen bzw. Zellklone als Parameter verwendet werden. Eine Produktion von Stoffen durch die Zelle bzw. den Zellklon kann anhand markierter Antikörper, insbesondere Fluorochrom-markierter Antikörper, Enzymmarkierter Antikörper, spezifischer Interaktionen von produzierten Stoffen, Nanobodies, scFv-Antikörper (single chain variable Fragment-Antikörper), DARPin (Designed Ankyrin Repeat Proteins) und/oder Stoffwechselvorgängen der jeweiligen Zelle erfasst und ausgewertet werden. for example, using an imaging method and documented. If this is not the case, then the wells are not demonstrably empty, the corresponding wells of the target vessel are excluded as target wells. In order to meet the high requirements for the detection of the monoclonality of cell lines, the physiological reactions can be documented, whereby growth and proliferation processes are recorded and measured, for example in the bright field. The cell density and the number and size of the cells or cell clones can be used as parameters. Production of substances by the cell or cell clone may be by labeled antibodies, in particular fluorochrome-labeled antibodies, enzyme-labeled antibodies, specific interactions of produced substances, nanobodies, single chain variable fragment antibodies (scFv), DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein) and / or metabolic processes of the respective cell are detected and evaluated.
Die Proliferation der Einzelzelle zum Zellklon wird durch die Aufnahme von Bildern in regelmäßigen Abständen (z. B. täglich) beispielsweise durch eine Bilderfassungseinheit dokumentiert. Der Zellklon wird anschließend mittels geeigneter Analysemethoden hinsichtlich seiner spezifischen Produktivität, der Stabilität der (rekombinanten) The proliferation of the single cell to the cell clone is documented by the acquisition of images at regular intervals (eg daily), for example by an image capture unit. The cell clone is then analyzed by means of suitable analysis methods regarding its specific productivity, the stability of the (recombinant)
Proteinproduktion und seiner Wachstumsrate charakterisiert. Characterized protein production and its growth rate.
Das Verfahren erlaubt vorteilhaft eine umfassende Dokumentation aller ausgeführten Schritte. So können in einem automatisierten Dokumentationsschritt im selben The method advantageously allows a comprehensive documentation of all executed steps. So in an automated documentation step in the same
Probenbehälter, insbesondere im selben Nanowellarray, die Bilderfassung, der Nachweis der Monoklonalität, die Detektion von Proliferation und Produktion, darauf basierend die Auswahl und Isolation von Einzelzellen oder Zellklonen aus den Nanowells des Nanowellarrays sowie der Transfer der detektierten und anhand von Proliferations- und/oder Produktionskriterien ausgewählten Zellen in ein Zielgefäß erfolgen. Ebenso kann die Zellabgabe in das Zielgefäß und die Proliferation der Einzelzelle im Zielgefäß dokumentiert werden. Die Dokumentation kann dabei mit der Bilderfassungseinheit oder mit einer zusätzlichen Dokumentationseinheit, die zur Bilderfassung und Speicherung von Bilddaten ausgebildet ist, erfolgen. Die Sample container, in particular in the same nanowell array, image acquisition, detection of monoclonality, the detection of proliferation and production, based on the selection and isolation of single cells or cell clones from the nanowells of the nanowell array and the transfer of the detected and by proliferation and / or Production criteria selected cells in a target vessel. Likewise, the cell delivery into the target vessel and the proliferation of the single cell in the target vessel can be documented. The documentation can be done with the image capture unit or with an additional documentation unit, which is designed for image acquisition and storage of image data. The
Einstellungen der Vorrichtung für die Detektion und Ernte werden automatisch gespeichert. Es können Bilder des Nanowellarrays vor und nach dem Picken (Isolation) und des Settings of the detection and harvesting device are automatically stored. Pictures of the nanowell array before and after picking (isolation) and the
Zielgefäßes vor und nach der Zellablage aufgenommen werden. Target vessel can be recorded before and after cell deposition.
Für die Detektion der spezifischen Produktivität von Einzelzellen ist im Fall sekretierter Proteine die Immobilisierung des (rekombinanten) Proteins in räumlicher Nähe bzw. an der Produzentenzelle unabdingbar. Dies kann geschehen über: In the case of secreted proteins, the immobilization of the (recombinant) protein in spatial proximity or at the producer cell is indispensable for the detection of the specific productivity of single cells. This can be done via:
- die Wellstruktur, die ein Wegdiffundieren des (rekombinanten) Proteins aus dem Nanowell verhindert;
- Überschichtung der Nanowells mit semi-solidem Medium, welches ein Wegdiffundieren des (rekombinanten) Proteins aus den Nanowells verhindert; the corrugated structure preventing pathway diffusion of the (recombinant) protein from the nanowell; - Overlapping the nanowells with semi-solid medium, which prevents pathway diffusing the (recombinant) protein from the nanowells;
- Beschichtung der Nanowells mit Interaktionspartnern des (rekombinanten) Proteins; - coating the nanowells with interaction partners of the (recombinant) protein;
- Antigen bzw. Antikörper; - antigen or antibody;
- antikörperbindende Proteine wie Protein L, Protein A, Protein G; - antibody binding proteins such as protein L, protein A, protein G;
- Antigen bzw. Antikörper (inklusive Einzeldomänenantikörper wie Nanobodies); - antigen or antibody (including single-domain antibodies such as nanobodies);
andere Interaktionspartner: other interaction partners:
- diverse Linker zwischen sekretiertem Protein und Produzentenzelle, ggf. auch nach Modifikation der Zielzelle; - diverse linkers between secreted protein and producer cell, possibly also after modification of the target cell;
- künstliche, antigen-bindende-Proteine, wie beispielsweise DARPins, scFv-Fragmente, Monobodies, Affiline, Anticaline, Avimere, Affibodies; artificial, antigen-binding proteins such as DARPins, scFv fragments, monobodies, affilins, anticalins, avimers, affibodies;
- Biotinylierung der Zellen und Avidin-gekoppelte Antikörper gegen das (rekombinante) Protein; Biotinylation of the cells and avidin-coupled antibodies to the (recombinant) protein;
- bispezifische Antikörper, die ein Antigen auf der Zelloberfläche und das sekretierte Protein binden; bispecific antibodies that bind an antigen on the cell surface and the secreted protein;
andere Linker: other linkers:
- induzierbarer Wechsel zwischen membrangebundener Form des Proteins und der sekretierten Form, wie dies beispielsweise aus den Publikationen von Yu et al. (2014; inducible change between membrane-bound form of the protein and the secreted form, as described, for example, by the publications of Yu et al. (2014;
Antibody-membrane switch (AMS) technology for facile cell line development. Protein Eng Des Sei (10):309-15) und Chuang et al. (2014; High-Throughput Sorting of the Highest Producing Cell via a Transiently Protein-Anchored System. PLoS ONE 9(7): e102569) bekannt ist. Antibody-membrane switch (AMS) technology for facile cell line development. Protein Eng Des Sei (10): 309-15) and Chuang et al. (2014; High-Throughput Sorting of the Highest Producing Cells via a Transiently Protein-Anchored System.PLS ONE 9 (7): e102569) is known.
Die Aufgabe wird ferner mit der bereits erwähnten Vorrichtung gelöst. Diese dient zur Verifizierung des Erfolgs von Einzelzellaussaaten in Nanowellarrays und ist dafür vorgesehen, in einem Verfahren zur Generierung monoklonaler Zelllinien verwendet zu werden. Die Vorrichtung umfasst eine Bilderfassungseinheit, die zur Erfassung von Bilddaten eines in einem Probenbereich angeordneten Nanowellarrays ausgebildet ist. Weiterhin sind eine Beleuchtungseinheit zur Bereitstellung wenigstens einer Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung und Mittel zur gesteuerten Beleuchtung der Probe mit der wenigstens einen Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung Teil der Vorrichtung. Die The object is further achieved with the device already mentioned. This serves to verify the success of single cell seeds in nanowell arrays and is intended to be used in a method of generating monoclonal cell lines. The device comprises an image acquisition unit which is designed to acquire image data of a nanowell array arranged in a sample area. Furthermore, a lighting unit for providing at least one illumination and / or excitation radiation and means for controlled illumination of the sample with the at least one illumination and / or excitation radiation are part of the device. The
Bilderfassungseinheit ist derart konfiguriert, dass auf dem Nanowellarray Image capture unit is configured such that on the nanowell array
Erwartungsbereiche mit erwartetem Vorhandensein je einer Probe, insbesondere je einer Zelle, festgelegt oder verifiziert werden können, indem erfasste Bilddaten der betreffenden Erwartungsbereiche mittels einer Auswerteeinheit der Vorrichtung ausgewertet werden können. Dies umfasst die automatische Detektion der Nanowells als Erwartungsbereiche.
Außerdem ist die Bilderfassungseinheit derart ausgebildet, dass auf dem Nanowellarray Zwischenräume festgelegt, detektiert oder verifiziert werden können, in denen keine Proben erwartet werden. Nach dem Beleuchten des Nanowellarrays kann eine ortsaufgelöste Erfassung einer durch die Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung bewirkten Expected areas with an expected presence of each sample, in particular of each cell, can be defined or verified by being able to evaluate acquired image data of the respective expected areas by means of an evaluation unit of the device. This includes the automatic detection of nanowells as areas of expectation. In addition, the image capture unit is designed in such a way that gaps can be defined, detected or verified on the nanowell array in which no samples are expected. After illuminating the nanowell array, a spatially resolved detection of one caused by the illumination and / or excitation radiation
Detektionsstrahlung erfolgen, wozu die Bilderfassungseinheit einen Detektor, insbesondere einen zur zweidimensional aufgelösten Detektor, beispielsweise einen Matrixdetektor, eine CCD-oder eine CMOS-Kamera aufweist. Detection radiation take place, for which purpose the image acquisition unit has a detector, in particular a two-dimensionally resolved detector, for example a matrix detector, a CCD or a CMOS camera.
Die Bilderfassungseinheit ist weiterhin dazu ausgebildet, erfasste Bilddaten hinsichtlich des Vorhandenseins genau einer Zelle in den jeweiligen Nanowells und hinsichtlich des The image acquisition unit is further configured to acquire captured image data regarding the presence of exactly one cell in the respective nanowell and with regard to the
Vorhandenseins von Zellen in Zwischenräumen zwischen den Nanowells auszuwerten und abzuspeichern. Dazu kann die Vorrichtung eine Auswerteeinheit aufweisen, die mit der Bilderfassungseinheit in einer für den Austausch von Daten geeigneten Weise verbunden ist. Zusätzlich ist es möglich, die Positionen derjenigen Nanowells, in denen nicht genau eine Zelle vorhanden ist sowie derjenigen Zwischenräume, in denen Zellen vorhanden sind, abzuspeichern. Existence of cells in interstices between the nanowells to evaluate and store. For this purpose, the device may have an evaluation unit, which is connected to the image acquisition unit in a manner suitable for the exchange of data. In addition, it is possible to store the positions of those nanowells in which there is not exactly one cell and those gaps in which cells are present.
Die Bilderfassungseinheit kann in weiteren Ausführungsbeispielen dazu ausgebildet sein, ein Nanowellarray hinsichtlich seines Typs zu identifizieren und dessen Position und räumliche Ausrichtung zu bestimmen bzw. sämtliche Nanowells unabhängig vom Array zu erfassen. Jedem Well eines Nanowellarrays kann mittels der Bilderfassungseinheit und/oder der Auswerteeinheit eine ID zugeordnet werden. In further exemplary embodiments, the image acquisition unit can be designed to identify a nanowell array with regard to its type and to determine its position and spatial orientation or to detect all nanowells independently of the array. Each well of a nanowell array can be assigned an ID by means of the image acquisition unit and / or the evaluation unit.
Dazu kann die Bilderfassungseinheit mit einer Datenbank verbunden sein, in der Daten üblicher Nanowellarrays verschiedener Hersteller und Typen abgelegt sind. Anhand wenigstens eines Bildes eines in dem Probenraum, beispielsweise auf einem Probentisch, angeordneten Nanowellarrays kann durch Vergleich der von dem Nanowellarray erfassten Bilddaten dessen Typ und Hersteller ermittelt werden. Zugleich kann die relative For this purpose, the image acquisition unit can be connected to a database in which data of customary nanowell arrays of various manufacturers and types are stored. On the basis of at least one image of a nanowell array arranged in the sample space, for example on a sample table, its type and manufacturer can be determined by comparing the image data captured by the nanowell array. At the same time, the relative
Positionierung des betreffenden Nanowellarrays in dem Probenraum ermittelt werden. Mit dem Typ des Nanowellarrays und dessen relativer Positionierung in dem Probenraum sind auch die Positionen der Erwartungsbereiche und die Positionen und gegebenenfalls die Verläufe der Zwischenräume ermittelbar. Entsprechend der bekannten Positionen und den Daten über Nanowells ohne Zelle, mit mehr als einer Zelle und Nanowells benachbart zu Zellen, die sich in einem Zwischenraum befinden, können Steuerbefehle beispielsweise für eine Pipettiereinheit generiert werden, die entsprechend die ausgewählten Zellen in den ausgewählten Nanowells ernten.
Alternativ kann durch eine mit der Bilderfassungseinheit verbundene Auswerteeinheit anhand von bildanalytischen Detektionsschritten auch die Dimensionen und Positionen sämtlicher vorhandener Nanowells unabhängig von einer Datenbank üblicher Positioning of the relevant nanowell array can be determined in the sample space. With the type of nanowell array and its relative positioning in the sample space, the positions of the expected ranges and the positions and, if appropriate, the courses of the gaps can also be determined. For example, according to known positions and data about nanowells without cell, with more than one cell, and nanowells adjacent to cells located in a space, control commands may be generated for a pipetting unit that will respectively harvest the selected cells in the selected nanowells. Alternatively, by means of an evaluation unit connected to the image acquisition unit based on image-analytical detection steps, the dimensions and positions of all existing nanowells independent of a database more common
Nanowellarrays erkannt werden. Die Auswerteeinheit liefert hierbei eine Liste sämtlicher erkannter Nanowells inkl. deren Größe, Position, Umrisse, Randbereiche etc. so dass keine vorherige Definition von Erwartungsbereichen notwendig ist. Jedes Nanowell wird hierbei eine ein-eindeutige ID zugeordnet, welche eine spätere Zuordnung und ein Wiederauffinden ermöglicht. Anhand der Position und Umrisse der detektierten Nanowells kann dann eine Zuordnung der Position der erkannten Zellen erfolgen und somit Rückschlüsse über z.B. die Anzahl der Zellen im Bereich eines Nanowells erfolgen. Nanowell arrays are detected. In this case, the evaluation unit supplies a list of all recognized nanowells, including their size, position, outlines, edge regions, etc., so that no prior definition of expected ranges is necessary. Each nanowell is assigned a one-unambiguous ID, which enables subsequent assignment and retrieval. Based on the position and outlines of the detected nanowells can then be an assignment of the position of the detected cells and thus conclusions about e.g. the number of cells in the area of a nanowell take place.
Um eine Dokumentation aller Verfahrensschritte und relevanter Ereignisse während des Verfahrens zu erlauben, ist die Vorrichtung vorteilhaft zur Dokumentation des In order to allow a documentation of all process steps and relevant events during the process, the device is advantageous for documenting the
Nanowellarrays und/oder von auswählbaren Verfahrensschritten und Verfahrensstadien ausgebildet. Dazu weist die Vorrichtung vorteilhaft beispielsweise eine Kamera, eineNanowellarrays and / or formed of selectable process steps and process stages. For this purpose, the device advantageously, for example, a camera, a
Speichereinheit und optional zusätzliche Dokumentationsspeicher auf. Zusätzlich kann eine Verbindung zu einer Auswerteeinheit oder Rechnereinheit bestehen. Storage unit and optionally additional documentation storage on. In addition, there may be a connection to an evaluation unit or computer unit.
Die Vorrichtung kann außerdem eine Einheit aufweisen, mittels der ausgewählte Zellen von einem Erwartungsbereich, insbesondere einem Well, des Nanowellarrays in einen Bereich, beispielsweise ein Well, eines Zielgefäßes übertragbar ist. Eine solche Einheit kann als eine Pipettiereinheit ausgebildet sein. The device can also have a unit by means of which selected cells can be transferred from an expected region, in particular a well, of the nanowell array into an area, for example a well, of a target vessel. Such a unit may be designed as a pipette unit.
Mittels der Vorrichtung, insbesondere mittels der Entnahmevorrichtung, kann ein zuvor bestimmter monoklonaler Zellklon separat in ein abgegrenztes Nanowell beziehungsweise Well eines Zielgefäßes abgelegt werden und dort weiter heranwachsen. By means of the device, in particular by means of the removal device, a previously determined monoclonal cell clone can be deposited separately in a delimited nanowell or well of a target vessel and further grow there.
Alternativ kann mittels der Vorrichtung auch eine ausgewählte Einzelzelle separat in ein abgegrenztes Nanowell beziehungsweise Well eines Zielgefäßes abgelegt werden und dort definiert zu einem Zellklon heranwachsen. Da die Vorrichtung hierbei gesichert nur eine Zelle in ein Nanowell beziehungsweise Well abgelegt, kann es sich bei der resultierenden Zelllinie in dem Nanowell beziehungsweise Well nur um einen Zellklon handeln. Alternatively, by means of the device, a selected individual cell can also be deposited separately in a delimited nanowell or well of a target vessel and grow there to a defined cell clone. Since the device stored in this case only one cell in a nanowell or well, it may be only a cell clone in the resulting cell line in the nanowell or well.
Es ist ferner möglich, dass die Vorrichtung mit weiteren Einheiten interagiert. Solche Einheit können modular der Vorrichtung zuordenbar sein und beispielsweise Module zum It is also possible that the device interacts with other units. Such units may be modularly associated with the device and, for example, modules for
Liquidhandling, Picker, Brutschrank etc. umfassen, vorzugsweise in einem Liquid handling, picker, incubator etc. include, preferably in one
Reinraumgehäuse.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhafterweise unter Nutzung eines Nanowellarrays durchgeführt. Ein solches Nanowellarray wird vorteilhaft auch beim Betrieb der Vorrichtung eingesetzt. Clean room housing. The method according to the invention is advantageously carried out using a nanowell array. Such a nanowell array is advantageously also used during operation of the device.
Die Nanowellarrays können im praktisch zu handhabenden Plattenformat, beispielsweise nach SBS-Standard, vorliegen. The nanowell arrays can be present in a practically usable plate format, for example according to the SBS standard.
Ein Nanowell ist in möglichen Ausführungen von Nanowellarrays nur wenig größer als die Zielzelle selbst, sodass gewährleistet wird, dass nur eine einzelne Zelle, nicht aber mehrere Zellen, in einem Nanowell Platz finden. Die mittleren Durchmesser der Zellen werden als 95%-lntervall der mittels FACS oder Mikroskopie in einer Neubauerkammer gemessenen Zelldurchmesser oder mittels Casy Cell Counter bestimmt. Für verschiedene große Zelltypen werden daher Nanowellarrays mit auf die Zellgröße abgestimmter Nanowellgroße eingesetzt. A nanowell in possible embodiments of nanowell arrays is only slightly larger than the target cell itself, thus ensuring that only a single cell, but not several cells, can fit in a nanowell. The mean diameters of the cells are determined as 95% intervals of the cell diameter measured by FACS or microscopy in a new-build chamber or by means of the Casy Cell Counter. For various large cell types, therefore, nanowell arrays with nanowell size matched to the cell size are used.
Neben der Geometrie des Nanowellarrays werden auch Zellzahl und das In addition to the geometry of the nanowell array are also cell number and the
Beladungsprotokoll, beispielsweis inklusive der durchzuführenden Waschschritte etc., so abgestimmt, dass sich im Allgemeinen nur eine Zelle oder keine Zelle pro Nanowell befindet. Die Geometrie der Nanowells ist so ausgebildet, dass die Zelle auch während optional erfolgender Waschschritte in dem Nanowell festgehalten wird. Die Nanowellarrays können zudem funktionalisierte Oberflächen aufweisen. Zum Beispiel können Interaktionspartner für eine Immobilisierung sekretierter Proteine oder eine die Adhäsion verhindernde Loading protocol, for example, including the washing steps to be performed, etc., tuned so that there is generally only one cell or no cell per nanowell. The geometry of the nanowell is designed such that the cell is also held in the nanowell during optional washing steps. The nanowell arrays may also have functionalized surfaces. For example, interaction partners for immobilization of secreted proteins or adhesion preventing
Beschichtung bei stark adhärenten Zellen vorhanden sein. Die Nanowellarrays können beispielsweise eine polyHEMA-Beschichtung aufweisen. Durch deren Wirkung wird verhindert, dass sich Zellen an den Seitenwänden der Nanowells festsetzen und stattdessen in die Nanowells sinken und etwa in der Mitte des betreffenden Nanowells zu liegen kommen. Außerdem können die Nanowells als Rundbodenwells ausgebildet sein. Coating be present in strongly adherent cells. The nanowell arrays may, for example, have a polyHEMA coating. Their effect prevents cells from adhering to the sidewalls of the nanowells and instead sinks into the nanowells and comes to lie approximately in the middle of the respective nanowell. In addition, the nanowells can be designed as round bottom wells.
In weiteren Ausführungen können die Wells Siebe enthalten, auf denen durch Wirkung eines Unterdrucks die Zelle oder der Zellklon gehalten wird. Beim Durchfluss beispielsweise eines Mediums durch eines der Siebe entsteht ein Unterdruck, der Zellen in das betreffende Nanowell einsaugen kann. In further embodiments, the wells may contain sieves on which the cell or cell clone is maintained by the action of a negative pressure. For example, the flow of a medium through one of the sieves creates a vacuum that can suck cells into the nanowell.
Während auf die Größe der Produktionszellen abgestimmte Nanowells Vorteile bei der Sicherstellung nur einer Zelle je Nanowell aufweisen, müssen Nanowellarrays mit unterschiedlich großen Nanowells vorgehalten werden, wenn in einem Labor mit While nanowells tuned to the size of the production cells have advantages in ensuring only one cell per nanowell, nanowell arrays with nanowells of different sizes must be kept in stock when used in a laboratory
unterschiedlich großen Produktionszellen gearbeitet werden soll.
Die Erfindung umfasst daher auch Nanowellarrays und die Verwendung solcher Nanowellarrays, die Nanowells mit einem Durchmesser aufweisen, der die Aufnahme von mehreren Zellen erlaubt. Die Vorteile liegen darin, dass ein Wachstum der Zelle zu kleinen Klonen innerhalb des Nanowells ermöglicht ist. Außerdem muss nur ein Typ Nanowellarrays vorgehalten werden. to work in different sized production cells. The invention therefore also encompasses nanowell arrays and the use of such nanowell arrays having nanowells with a diameter that allows for the uptake of multiple cells. The advantages are that it allows the cell to grow into small clones within the nanowell. In addition, only one type of nanowell array needs to be kept.
Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass nach einer Aussaat und den nachfolgenden Waschschritten nur jeweils eine Zelle je Nanowell vorliegt, ist in einer möglichen Ausführung eines erfindungsgemäßen Nanowellarrays auf dem Grund jedes der Nanowells eine In order to increase the probability that only one cell per nanowell is present after sowing and the subsequent washing steps, in one possible embodiment of a nanowell array according to the invention at the bottom of each of the nanowells is one
Ankerstruktur zur Bindung nur einer Zelle vorhanden. Anchor structure for binding only one cell present.
Solche Nanowells können dabei beispielsweise einen Durchmesser von 50 μηη und mehr aufweisen. Die Ankerstruktur kann beispielsweise in Form einer Oberflächenstrukturierung des das Nanowell bildenden Materials und/oder eine Beschichtung mit Ankermolekülen ausgebildet sein. Ankermoleküle können beispielsweise geeignet Proteine, Lipide, Such nanowells may, for example, have a diameter of 50 μm or more. The anchor structure may be formed, for example, in the form of a surface structuring of the material forming the nanowell and / or a coating with anchor molecules. Anchor molecules may for example be suitable proteins, lipids,
Kohlenhydrate und/oder Polymere oder deren Gemische sein. Carbohydrates and / or polymers or mixtures thereof.
Eine solche Ankerstruktur bewirkt eine verbesserte Bindung der Zelle an das Nanowell und verringert die Gefahr, dass die Zelle bei einem Waschschritt irrtümlicherweise entfernt wird. Zudem ist die Ankerstruktur vorteilhaft so dimensioniert, dass nur eine Zelle an diese binden, beispielsweise adhärieren kann. Weitere Zellen können trotz des Umstands, dass diese im dem Nanowell Platz finden, nicht an der Materialoberfläche des Nanowells binden und werden weggewaschen. Diese Wirkung wird durch eine Beschichtung der Innenseite des Nanowells unterstützt, die eine Adhäsion von Zellen an der inneren Wand des Nanowells verhindert. Such an anchor structure results in an improved binding of the cell to the nanowell and reduces the risk of the cell being erroneously removed in a washing step. In addition, the anchor structure is advantageously dimensioned such that only one cell can bind to it, for example can adhere. Other cells, despite the fact that they find room in the nanowell, do not bind to the material surface of the nanowell and are washed away. This effect is aided by a coating on the inside of the nanowell that prevents adhesion of cells to the inner wall of the nanowell.
Werden größere Nanowells verwendet, gegebenenfalls in Verbindung mit einer Larger nanowells are used, possibly in conjunction with a
Beschichtung die sicherstellt, dass Zellen sich nur im Zentrum der Nanowells ansiedeln, hat dies eine Reihe Vorteile. Hier kann wie bei bisherigen Verfahren durch statistische Coating which ensures that cells settle only in the center of the nanowells, this has a number of advantages. Here, as in previous methods by statistical
Verdünnung die Zellsuspension ausgesät und bildanalytisch sichergestellt und dokumentiert, dass nur Nanowells mit nur einer Zelle für alle weiteren Untersuchungen und Dilution of the cell suspension seeded and confirmed by image analysis and documented that only nanowells with only one cell for all further investigations and
Selektionsschritte beachtet werden. Hintergrund ist die ökonomisch sinnvolle Herstellung und Verwendung größerer Wells. Sind die Zellen in der Mitte des jeweiligen Wells, wird zudem die optische Erfassung und Analyse unterstützt.
In weiteren möglichen Ausführungsformen des Nanowellarrays ist zusätzlich wenigstens eine Beschichtung innerhalb und/oder außerhalb der Wells vorhanden, um von der Zelle abgegebene Stoffe und/oder Stoffgemische wenigstens anteilig zu binden und/oder eine Nachweisreaktion zum Nachweis des Vorhandenseins des Stoffs beziehungsweise des Stoffgemischs und/oder der Erfassung einer Signalintensität einer Detektionsstrahlung zu initiieren. Selection steps are observed. The background is the economically sensible production and use of larger wells. If the cells are in the middle of each well, the optical detection and analysis is also supported. In further possible embodiments of the nanowell array, at least one coating is additionally present inside and / or outside the wells in order to at least partially bind substances and / or mixtures released from the cell and / or a detection reaction for detecting the presence of the substance or mixture of substances and / or or to initiate the detection of a signal intensity of a detection radiation.
Der Boden der Nanowells kann optisch durchsichtig (transparent) sein, um invers den Inhalt der Nanowells screenen, beispielsweise abscannen, zu können. Dabei kann die The bottom of the nanowell may be optically transparent (transparent) in order to inversely screen the content of the nanowell, for example to be able to scan it. It can the
Vereinzelung der Zellen geprüft und der Transport einzelner Zellen dokumentiert werden. DieSeparation of the cells tested and the transport of individual cells are documented. The
Nanowellarrays können beispielsweise aus Kunststoff, Glas, Keramik oder Silizium(-chips,) sein, welche durch Verfahren wie Spritzguss, Ätzen, Laser- oder Nanowell arrays may be, for example, plastic, glass, ceramic or silicon (chips), which may be formed by processes such as injection molding, etching, laser or
Elektronenstrahlbearbeitung in die gewünschte geometrische Form gebracht werden. Electron beam machining can be brought into the desired geometric shape.
Optionale Beschichtungen erlauben die Bindung der erwarteten exprimierten Verbindungen an der Wand oder dem Boden des Nanowells und deren Detektion mittels bildgebender und bildverarbeitender Verfahren. Optional coatings permit binding of the expected expressed compounds to the wall or bottom of the nanowell and their detection by means of imaging and image processing techniques.
Auf Grund der Separierung der einzelnen Zellen durch deren Platzierung in den Nanowells wird sichergestellt, dass die Zellen im gesamten Prozess identifizierbar bleiben. In der Zellkultur ist bekannt, dass das Wachstum und die Lebensfähigkeit von Zellen auch maßgeblich vom direkten Zellkontakt zu den Nachbarzellen und durch Kommunikation der Zellen über die umgebenden Medien bestimmt werden. Im Gegensatz zu bisher Separating the individual cells by placing them in the nanowells ensures that the cells remain identifiable throughout the process. In cell culture, it is known that the growth and viability of cells are also largely determined by the direct cell contact to the neighboring cells and by communication of the cells via the surrounding media. Unlike previously
eingesetzten Mikrotiterplatten kann durch die Verwendung der beschriebenen Nanowells zwar kein direkter Zellkontakt stattfinden, wohl aber eine Verbindung über ein die Nanowells überschichtendes Medium, wie diese bereits oben beschrieben wurde. Although the microtiter plates used can not be used for direct cell contact due to the use of the described nanowells, they do, however, have a connection via a medium which overlays the nanowell, as has already been described above.
Um eine ungehinderte Kommunikation zwischen den Zellen, beispielsweise über ein überschichtetes Medium, zu ermöglichen, kann ein Nanowellarray in weiteren Ausführungen auch ohne Nanowells ausgebildet sein, wobei dieses dann lediglich die Ankerpunkte aufweist und ansonsten im Wesentlichen eine Platte ist. Die Platte kann beispielsweise der Boden einer Petrischale oder ein Objektträger sein. Die Ankerpunkte befinden sich auf wenigstens einer der Oberflächen des Nanowellarrays und sind so dimensioniert, dass nur eine Zelle je Ankerpunkte binden kann. In weiteren Ausführungen sind Nanowells vorhanden, die jedoch eine Tiefe aufweisen, die etwa gleich oder geringer als der In order to enable unimpeded communication between the cells, for example via an over-coated medium, a nanowell array can also be designed in other embodiments without nanowells, wherein this then has only the anchor points and is otherwise essentially a plate. The plate may be, for example, the bottom of a petri dish or a slide. The anchor points are located on at least one of the surfaces of the nanowell array and are dimensioned so that only one cell can bind per anchor point. In other embodiments, nanowells are present, but have a depth that is about equal to or less than the
Durchmesser der Zelle ist.
Die Vorteile des Verfahrens und der Vorrichtung sowie des Nanowellarrays sind vielgestaltig. Ein eindeutiger Nachweis der Monoklonalität wird durch eine Aussaat in Nanowellarrays erreicht, die so konzipiert sind, dass sich nur eine Zelle in einem Nanowell des Arrays befindet. Dabei können verschiedene Zelllinien in Nanowellarrays mit auf sie abgestimmter Geometrie ausgesät werden. Zusätzlich wird die erfolgte Vereinzelung mittels bildgebender Verfahren in Verbindung mit einer Bildverarbeitung überprüft. Eine Entnahme einer Zelle oder eines Zellklons aus einem Nanowell wird mittels Bildern vor und nach der Ernte und/oder einem Video vom Ernteprozess dokumentiert. Außerdem kann eine Dokumentation darüber erfolgen, dass ein Nanowell beziehungsweise Well eines Zielgefäßes leer ist, bevor eine geerntete Zelle oder ein Zellklon (im Folgenden wird der Einfachheit halber nur von einer Zelle gesprochen) in diese abgelegt wird. Diameter of the cell is. The advantages of the method and the device as well as the nanowell array are manifold. Clear evidence of monoclonality is achieved by sowing in nanowell arrays designed to have only one cell in a nanowell of the array. Different cell lines can be seeded in nanowell arrays with geometry adapted to them. In addition, the separation performed by means of imaging techniques in conjunction with an image processing is checked. A removal of a cell or a cell clone from a nanowell is documented by means of images before and after the harvest and / or a video from the harvesting process. In addition, a documentation can be made that a nanowell or well of a target vessel is empty before a harvested cell or a cell clone (in the following, for simplicity, only one cell is spoken) is placed in it.
Eine Identifikation von Hochproduzenten ist ohne zusätzliche genetische Modifikation der Zellen möglich. Die Identifikation kann über die Detektion von Oberflächenproteinen bzw. die Immobilisierung der sekretierten Proteine nahe der Produzentenzelle und deren Detektion, beispielsweise analog eines ELISAs in vorbereiteten und beschichteten Nanowells, erfolgen. Dies ist besonders wichtig für Biopharmazeutika in der Humantherapie und deren Identification of high producers is possible without additional genetic modification of the cells. The identification can take place via the detection of surface proteins or the immobilization of the secreted proteins close to the producer cell and their detection, for example analogously to an ELISA in prepared and coated nanowells. This is especially important for biopharmaceuticals in human therapy and theirs
Zulassungen (nationale Zulassungsbehörden, EMA, FDA, etc.). Die Zelle muss keine Reportergene exprimieren, wie dies bei durchflusszytometrischen Verfahren üblich ist, und kann somit unmodifiziert bzw. nur mit der Expressionskassette des rekombinanten Proteins modifiziert sein (transgene Produktionszellen). Approvals (national regulatory agencies, EMA, FDA, etc.). The cell does not have to express reporter genes, as is customary in flow cytometric methods, and can therefore be unmodified or modified only with the expression cassette of the recombinant protein (transgenic production cells).
Die Gesamtheit aller (genetisch modifizierten) Zellen wird auf ihre spezifische Produktivität untersucht. Die spezifische Produktivität wird quantifiziert und alle Zellen können The totality of all (genetically modified) cells is examined for their specific productivity. Specific productivity is quantified and all cells can
dahingehend miteinander verglichen werden. Darauf basierend werden aus allen Zellen geeignete Hoch- und Mittelproduzenten ausgewählt. Es besteht keine Gefahr, produktive Einzelzellen oder Zellklone zu verlieren. be compared to each other. Based on this, suitable high and medium producers are selected from all cells. There is no danger of losing productive single cells or cell clones.
Im Gegensatz dazu treten bei der Limiting Dilution Verluste von Zellen auf, da nicht alle Zellen ausgesät und analysiert werden können (Material- und Platzbedarf zu groß). Bei durchflusszytometrischen Verfahren treten Verluste von Zellen während der Definition optimaler Sortiereinstellungen und während des Sortiervorgangs auf. In contrast, limiting dilution causes cell losses because not all cells can be sown and analyzed (material and space requirements too large). In flow cytometric methods, losses of cells occur during the definition of optimal sorting settings and during the sorting process.
Es können ferner optimale Kulturbedingungen während des Zellhandlings erreicht werden. Alle Arbeiten mit der Vorrichtung erfolgen unter sterilen Bedingungen. Kulturbedingungen (Parameter) wie Temperatur, Luftfeuchte, CO2- und 02-Gehalt können an die Bedürfnisse der Zellen angepasst werden.
Es wird eine Reduktion des Materialaufwands erreicht, da jedes Nanowellarray wesentlich mehr Nanowells aufweist, als die Zahl der Wells auf konventionell genutzte 96- bzw. 384- Well-Platte beträgt. Ferner wird weniger Zellkulturmedium verbraucht (μΙ/ml statt I) und weniger Platz in Inkubatoren benötigt. Weiterhin ist eine Reduktion des Zeitaufwands erreicht, da mehrere Nanowellarrays parallel prozessiert werden können. It can also be achieved optimal culture conditions during cell handling. All work with the device is done under sterile conditions. Culture conditions (parameters) such as temperature, humidity, CO2 and 02 content can be adapted to the needs of the cells. A reduction in material cost is achieved since each nanowell array has significantly more nanowells than the number of wells on conventionally used 96 and 384 well plates, respectively. Furthermore, less cell culture medium is consumed (μΙ / ml instead of I) and less space needed in incubators. Furthermore, a reduction in the time required is achieved because several nanowell arrays can be processed in parallel.
Eine Identifizierung von Hochproduzenten kann bereits auf der Einzelzellebene erfolgen. Dabei werden nur vielversprechende Einzelzellen weiterkultiviert. Eine Wiederholung von Prozessen, wie etwa bei Limiting Dilution, ist nicht nötig, da die Monoklonalität einwandfrei nachgewiesen werden kann. Identification of high producers can already take place on the single cell level. Only promising single cells are cultivated further. A repetition of processes, such as in limiting dilution, is not necessary, since the monoclonality can be detected properly.
Das Verfahren wird für Zellen angewandt, die eukaryotische Zellen sind, beispielsweise Zellen von Hefen, Insektenzellen oder Säugerzellen. Die Zellen liegen für die Aussaat als Einzelzellen in einer Suspension vor. Bei Bedarf werden die Hefezellen mittels geeigneter Methoden in Suspension gebracht. Die Zellen sind genetisch so verändert (transfiziert, transduziert, transformiert), dass sie eine Expressionskassette mit der Sequenz, die das Zielprotein kodiert (ggf. zusammen mit weiteren Sequenzen, die bspw. für Reporterproteine oder Selektionsmarker kodieren können) enthalten. Sie können auch The method is used for cells which are eukaryotic cells, for example cells of yeasts, insect cells or mammalian cells. The cells are in a suspension for sowing as single cells. If necessary, the yeast cells are brought into suspension by means of suitable methods. The cells are genetically modified (transfected, transduced, transformed) in such a way that they contain an expression cassette with the sequence which codes for the target protein (optionally together with other sequences which can, for example, code for reporter proteins or selection markers). You can also
antikörperproduzierende Hybridomazellen sein. Möglich sind auch Zellen, die be antibody-producing hybridoma cells. Also possible are cells that
natürlicherweise, ohne genetische Modifikation, ein Protein von Interesse produzieren. Dabei kann es sich um sekretierte Proteine, aber auch um Oberflächenproteine, wie beispielsweise B- oder T-Zell-Rezeptoren, handeln. Ferner kann das Verfahren bei der Kultivierung von Tumorzellen (z. B. zirkulierender Tumorzellen, CTCs) ausgeführt werden. Die CTC sind dabei mit einem gemeinsamen Medium überschichtet. Das Verfahren und die Vorrichtung sowie das Nanowellarray können beispielsweise auch zur Kultivierung von Stammzellen, Eigenzellen (autologe Zellen) genetisch modifizierter Zellen, Tumorzellen sowie für Of course, without genetic modification, produce a protein of interest. These may be secreted proteins, but also surface proteins such as B or T cell receptors. Furthermore, the method can be carried out in the culture of tumor cells (eg, circulating tumor cells, CTCs). The CTC are covered with a common medium. The method and the apparatus as well as the nanowell array can also be used, for example, for cultivating stem cells, self-cells (autologous cells) of genetically modified cells, tumor cells and for
Interaktionsstudien zwischen Zellen verwendet werden. Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Abbildungen und Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen: Interaction studies between cells are used. The invention will be explained in more detail with reference to figures and embodiments. Show it:
Fig. 1 eine Tabelle mit einem Vergleich von Einzelzellklonierungsverfahren und dem erfindungsgemäßen Verfahren; Fig. 1 is a table showing a comparison of single-cell cloning methods and the method of the invention;
Fig. 2 eine schematische Übersicht der Arbeitsschritte bis zur monoklonalen Zelllinie am Beispiel rekombinanter Proteinproduktion bei verschiedenen Verfahren;
Fig. 3 eine schematische Übersicht der Verfahrensschritte bei der Verwendung von2 shows a schematic overview of the working steps up to the monoclonal cell line using the example of recombinant protein production in various methods; Fig. 3 is a schematic overview of the method steps in the use of
Nanowells mit einem Fassungsvermögen für mehrere Zellen (oben) beziehungsweise für nur eine Zelle (unten); Nanowells with a capacity for several cells (top) or for only one cell (bottom);
Fig. 4 eine schematische Darstellung einer Wellplatte in einem Reinraumgehäuse während eines ersten optionalen Verfahrensschritts; 4 shows a schematic representation of a corrugated plate in a clean-room housing during a first optional method step;
Fig. 5 eine schematische Darstellung einer Wellplatte während eines zweiten Fig. 5 is a schematic representation of a corrugated plate during a second
optionalen Verfahrensschritts; optional method step;
Fig. 6 eine schematische Darstellung einer Wellplatte während eines dritten Fig. 6 is a schematic representation of a corrugated plate during a third
optionalen Verfahrensschritts; Fig. 7 eine schematische Darstellung einer Wellplatte während eines vierten optional method step; Fig. 7 is a schematic representation of a corrugated plate during a fourth
optionalen Verfahrensschritts; optional method step;
Fig. 8 eine schematische Darstellung einer Wellplatte während eines fünften Fig. 8 is a schematic representation of a corrugated plate during a fifth
optionalen Verfahrensschritts; optional method step;
Fig. 9 eine schematische Darstellung einer Wellplatte während eines sechsten optionalen Verfahrensschritts; 9 is a schematic representation of a corrugated plate during a sixth optional method step;
Fig. 10 eine schematische Darstellung eines Ausschnitts eines Nanowellarrays mit 10 is a schematic representation of a detail of a nanowell array with
Zellen; cells;
Fig. 1 1 eine schematische Darstellung eines Nanowellarrays in der Draufsicht; 1 1 is a schematic representation of a nanowell array in plan view;
Fig. 12 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung; 12 is a schematic representation of a first embodiment of a device according to the invention;
Fig. 13 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung; Fig. 14 eine schematische Darstellung eines Ausschnitts eines Ausführungsbeispiels eines Nanowellarrays mit Ankerpunkten in jedem Nanowell und
Fig. 15 eine schematische Darstellung eines weiteren Ausführungsbeispiels eines13 is a schematic representation of a second embodiment of a device according to the invention; 14 is a schematic representation of a section of an embodiment of a nanowell array with anchor points in each nanowell and Fig. 15 is a schematic representation of another embodiment of a
Nanowellarrays mit Ankerpunkten und ohne Nanowells. Nanowell arrays with anchor points and without nanowells.
Die Abbildungen zeigen schematisch und vereinfachend Elemente der Vorrichtungen und illustrieren Verfahrensschritte. Dabei bezeichnen gleiche Bezugszeichen gleiche technische Elemente beziehungsweise gleiche Verfahrensschritte. The figures show schematically and simply elements of the devices and illustrate process steps. In this case, the same reference numerals designate the same technical elements or the same method steps.
In der Fig. 1 werden die bereits oben beschriebenen Verfahren des Standes der Technik zur Generierung von Einzelzellklonen dem erfindungsgemäßen Verfahren hinsichtlich einiger ihrer ökonomischen Parameter tabellarisch gegenübergestellt. Die Verfahrensabläufe der Verfahren sind in der Fig. 2 zusammengefasst und gegenüber gestellt. In Fig. 1, the prior art methods for generating single cell clones, already described above, are tabulated against the method of the invention in terms of some of its economic parameters. The process sequences of the methods are summarized and compared in FIG.
Fig. 3 veranschaulicht noch wesentliche Verfahrensschritte und Prozesse eines Verfahrens unter Verwendung von Nanowells 17 (siehe Fig. 7 und folgende) mit einem großen FIG. 3 further illustrates essential method steps and processes of a method using nanowells 17 (see FIGS. 7 and following) with a large one
Durchmesser, der die Aufnahme mehrerer Zellen 2 erlaubt (obere Reihe) und von Diameter, which allows the inclusion of several cells 2 (upper row) and of
Nanowells 17, deren Durchmesser nur die Aufnahme einer Zelle 2 erlaubt (untere Reihe). Die Schritte der Erfassung nach einer Aussaat fehlerhaft besetzter Nanowells 17 erfolgt nach der Identifikation von Nanowells 17 mit Einzelzellen (mit EZ bezeichnet). In der Fig. 4 ist eine in einem Reinraumgehäuse 5 befindliche Wellplatte 1 , beispielsweise eine übliche 96-Well-Platte im SBS-Format, dargestellt. In der Wellplatte 1 befinden sich biologische Zellen 2, die von einem Medium 3 überschichtet sind. Mittels einer Absaug- und/oder Pipettiereinheit 4 wird das Medium 3 abgesaugt (Schritt A). Fig. 5 zeigt die Wellplatte 1 , in die eine Waschlösung in Form beispielsweise einer PBS- Lösung (nicht gezeigt) gegeben wurde. Die Wellplatte 1 wird geschwenkt und gewaschen (durch Pfeile symbolisiert), anschließend wird die PBS-Lösung wieder abgesaugt (Schritt B). Es kann auch eine Waschlösung zugefügt und wieder entfernt werden. In der Fig. 6 ist die Wellplatte 1 zu sehen, bei der die Zellen 2 mit einer präparierten Nanowells 17, whose diameter allows only the inclusion of a cell 2 (bottom row). The steps of detection after a sowing of incorrectly occupied nanowells 17 take place after the identification of nanowells 17 with individual cells (denoted by EZ). FIG. 4 shows a corrugated plate 1 located in a clean room housing 5, for example a conventional 96-well plate in SBS format. In the corrugated plate 1 are biological cells 2, which are covered by a medium 3. By means of a suction and / or pipetting unit 4, the medium 3 is sucked off (step A). Fig. 5 shows the corrugated plate 1 into which a washing solution in the form of, for example, a PBS solution (not shown) was placed. The corrugated plate 1 is pivoted and washed (symbolized by arrows), then the PBS solution is aspirated again (step B). It can also be added to a washing solution and removed again. In Fig. 6, the corrugated sheet 1 can be seen, in which the cells 2 with a prepared
Suspension 6 überdeckt werden. Nach Zugabe eines Enzyms zu den Zellen 2 wird ein Medium zugefügt, durch das die enzymatische Reaktion abgestoppt wird. Dies geschieht wieder mittels der Pipettiereinheit 4 in einem Schritt C. Der in der Fig. 7 dargestellte Schritt D zeigt schematisch die Funktionalisierung einesSuspension 6 are covered. After addition of an enzyme to cells 2, a medium is added by which the enzymatic reaction is stopped. This is done again by means of the pipetting unit 4 in a step C. The step D shown in FIG. 7 schematically shows the functionalization of a
Nanowellarrays 9. Auf dem Nanowellarray 9 sind vier Bereiche ausgebildet, die jeweils eine Anzahl Nanowells 17 aufweisen.
Die in der Fig. 8dargestellten Schritte E und F umfassen die Schritte des Übertragens von Zellen 2 (nicht gezeigt) von der Wellplatte 1 auf ein Nanowellarray 9 (Schritt E). Die Zellen 2 werden dabei mittels eines Filters 7 gefiltert um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Nanowell Arrays 9 Four regions are formed on the nanowell array 9, each having a number of nanowells 17. The steps E and F illustrated in FIG. 8 comprise the steps of transferring cells 2 (not shown) from the corrugated sheet 1 to a nanowell array 9 (step E). The cells 2 are filtered by means of a filter 7 to obtain a single cell suspension.
Anschließend wird deren Zellzahl mit einer Messeinrichtung 8 zur Messung der optischen Dichte bestimmt. Die Zellen 2 werden auf das Nanowellarray 9 ausgesät. Dabei wird die Einzelzellsuspension durch Schwenkbewegungen (durch die Pfeile symbolisiert) gleichmäßig verteilt, bevor sie wieder abgesaugt wird. Das Nanowellarray 9 beziehungsweise eine Anzahl besäter Nanowellarrays 9 kann beziehungsweise können in einem Schritt G mittels einer Zentrifuge 10 zentrifugiert werden, um beispielsweise die Zellen 2 durch Wirkung der Schwerkraft/Fliehkraft in die Nanowells 17 des Nanowellarrays 9 zu bewegen (Fig. 9). Ein seitlicher Schnitt durch einen Ausschnitt eines Nanowellarrays 9 ist in Fig. 10 dargestellt. In den beiden gezeigten Nanowells 17 ist jeweils eine Zelle 2 enthalten. In einem Subsequently, their cell count is determined by a measuring device 8 for measuring the optical density. The cells 2 are seeded onto the nanowell array 9. The single cell suspension is evenly distributed by pivoting movements (symbolized by the arrows) before it is sucked off again. The nanowell array 9 or a number of submerged nanowell arrays 9 can or can be centrifuged in a step G by means of a centrifuge 10 in order, for example, to move the cells 2 into the nanowells 17 of the nanowell array 9 by the action of gravity / centrifugal force (FIG. 9). A lateral section through a section of a nanowell array 9 is shown in FIG. 10. In each case one cell 2 is contained in the two nanowells 17 shown. In one
Zwischenraum 18 zwischen den beiden Nanowells 17 befindet sich ebenfalls eine Zelle 2, die mittels der Pipettiereinheit 4 in einem Schritt H als überschüssige Zelle 2 abgesaugt wird. Am Boden jedes Nanowells 17 ist optional ein Ankerpunkt 1 1 ausgebildet, an dem die Zelle 2 gebunden ist. Die jeweilige überschüssige Zelle 2 kann mittels der Pipettiereinheit 4 in ein Nanowell 17 abgelegt werden, das zuvor als leer erkannt wurde. Interspace 18 between the two nanowells 17 is also a cell 2, which is sucked by means of the pipette 4 in a step H as excess cell 2. At the bottom of each nanowell 17 an anchor point 1 1 is optionally formed, to which the cell 2 is bound. The respective excess cell 2 can be deposited by means of the pipette 4 in a nanowell 17, which was previously recognized as empty.
Im Ergebnis wird ein Nanowellarray 9 erhalten, in dessen Nanowells 17 idealerweise jeweils nur eine Zelle 2 enthalten ist und dessen Zwischenräume 18 keine Zellen 2 enthalten. As a result, a nanowell array 9 is obtained in whose nanowells 17 ideally only one cell 2 is contained in each case and whose interspaces 18 do not contain any cells 2.
Ein solches Nanowellarray 9 ist beispielhaft in Fig. 1 1 dargestellt. Such a nanowell array 9 is shown by way of example in FIG. 11.
In einem Schritt I wird das Nanowellarray 9, oder wie in Fig. 12 dargestellt mehrere In a step I, the nanowell array 9, or as shown in FIG
Nanowellarrays 9, mittels einer Bilderfassungseinheit 14, die auch als ein Mikroskop angesehen werden kann, mit einer Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung beleuchtet und eine resultierende Detektionsstrahlung ortsaufgelöst mittels eines geeigneten Detektors (nicht gezeigt) als Bilddaten erfasst. Die Ortsauflösung bezieht sich auf die Möglichkeit zur Angabe einer Position eines jeweiligen Ortes, beispielsweise eines Nanowells 17, von dem eine Detektionsstrahlung als ein Ereignis in der X- Y-Ebene erfasst wird. Nanowellarrays 9, by means of an image acquisition unit 14, which can also be viewed as a microscope, illuminated with an illumination and / or excitation radiation and a resulting detection radiation spatially resolved by means of a suitable detector (not shown) detected as image data. The spatial resolution refers to the possibility of indicating a position of a respective location, for example a nanowell 17, from which a detection radiation is detected as an event in the XY plane.
Die Bilderfassungseinheit 14 ist derart konfiguriert, dass mit dieser ermittelt werden kann, ob ein betreffendes Nanowell 17 genau eine Zelle 2 enthält, ob sich Zellen 2 in
Zwischenräumen 18 befinden und welche Grade spezifischer Produktivitäten Zellen 2 in den jeweiligen Nanowells 17 zeigen, in denen nur eine Zelle 2 vorliegt und die nicht benachbart zu einem Zwischenraum 18 mit einer Zelle 2 liegen. Die Auswertung der Bilddaten erfolgt mittels einer Auswerteeinheit 19. In Abhängigkeit der Auswertung werden Steuerbefehle generiert und die Pipettiereinheit 4 so angesteuert, dass nur Zellen 2 ausgewählter Nanowells 17 aufgenommen und auf ein Zielgefäß oder eine Zielwellplatte, beispielsweise in Form eines Zielnanowellarrays 15, übertragen werden (Schritt I). The image capture unit 14 is configured such that it can be used to determine whether a respective nanowell 17 contains exactly one cell 2, whether cells 2 in FIG Gaps 18 are located and what degrees of specific productivity cells 2 in the respective nanowells 17 show, in which there is only one cell 2 and which are not adjacent to a gap 18 with a cell 2. The evaluation of the image data takes place by means of an evaluation unit 19. Depending on the evaluation, control commands are generated and the pipetting unit 4 is activated so that only cells 2 of selected nanowells 17 are picked up and transferred to a target vessel or a targetwell plate, for example in the form of a target nanowell array 15 ( Step I).
Die Auswerteeinheit 19 steht mit einer Beleuchtungseinheit 13 und mit einer The evaluation unit 19 is connected to a lighting unit 13 and with a
Speichereinheit 12 in Verbindung. Die Beleuchtungseinheit 13 stellt eine Beleuchtungsund/oder Anregungsstrahlung zur Verfügung und erlaubt eine gezielte Beleuchtung des Nanowellarrays 9 beispielsweise in Form einer Abtastbewegung. Dazu kann die Storage unit 12 in conjunction. The illumination unit 13 provides illumination and / or excitation radiation and permits targeted illumination of the nanowell array 9, for example in the form of a scanning movement. This can be the
Beleuchtungseinheit 13 einen Scanner umfassen. Die Speichereinheit 12 dient insbesondere dem Speichern der Dokumentationen der Verfahrensschritte, der erfassten ID und zugehöriger Produktivitäten. Die Auswerteeinheit 19 ist ferner dazu ausgebildet, Lighting unit 13 include a scanner. The memory unit 12 serves, in particular, for storing the documentation of the method steps, the detected ID and associated productivities. The evaluation unit 19 is also designed to
Steuerbefehle zu generieren und beispielsweise die Pipettiereinheit 4 und die Generate control commands and, for example, the pipette 4 and the
Beleuchtungseinheit 13 anzusteuern. Lighting unit 13 to control.
Die mittels der Pipettiereinheit 4 auf eines der Zielnanowellarrays 15 übertragenen Zellen 2 werden weiter inkubiert und deren Wachstum, Überleben und/oder Produktion bzw. The cells 2 transferred to one of the target nanowell arrays 15 by means of the pipette unit 4 are further incubated and their growth, survival and / or production or
Sekretion spezifischer Stoffe oder Stoffgemische überwacht und dokumentiert (Schritt J). Die Inkubation erfolgt dabei in einem Inkubator 16 (Fig. 13). Secretion of specific substances or mixtures monitored and documented (step J). The incubation takes place in an incubator 16 (FIG. 13).
Ein Ausführungsbeispiel eines Nanowellarrays 9 ist in Fig. 14 als Ausschnitt und in einer seitlichen Schnittdarstellung gezeigt. Die Nanowells 17 sind wesentlich größer als die Zellen 2 und weisen an ihrem jeweiligen Boden optional je einen Ankerpunkt 1 1 auf. Die Ankerpunkte 1 1 sind jeweils so dimensioniert, dass nur jeweils eine Zelle 2 an diesen binden kann. Überschüssige Zellen 2 können daher weggewaschen werden. Die Ankerpunkte 1 1 sind beispielsweise durch eine geeignete Beschichtung, eine lokale Oberflächenaufrauung oder -strukturierung gebildet. An exemplary embodiment of a nanowell array 9 is shown in FIG. 14 as a detail and in a side sectional view. The nanowells 17 are substantially larger than the cells 2 and optionally have an anchor point 11 at their respective bottom. The anchor points 1 1 are each dimensioned so that only one cell 2 can bind to them. Excess cells 2 can therefore be washed away. The anchor points 1 1 are formed for example by a suitable coating, a local surface roughening or structuring.
Eine weitere Ausführung eines Nanowellarrays 9 ist in Fig. 15 dargestellt. Auf einer der Oberflächen sind Ankerpunkte 1 1 ausgebildet. Das Nanowellarray 9 weist keine Another embodiment of a nanowell array 9 is shown in FIG. On one of the surfaces anchor points 1 1 are formed. The nanowell array 9 has none
Nanowells 17 auf, so dass an den Ankerpunkten 1 1 gebundene Zellen 2 über ein überschichtendes Medium (nicht gezeigt) ungehindert miteinander kommunizieren können.
In weiteren Ausführungen des Nanowellarrays 9 können flache Mulden als Nanowells 17 vorgesehen sein, in denen die Ankerpunkte 1 1 eingebracht sind. Die Mulden weisen eine Tiefe auf, die geringer als ein Durchmesser der Zellen 2 ist. Ausführungsbeispiel - Generierung, Identifizierung und Isolation eines Nanowells 17, so that at the anchor points 1 1 bound cells 2 via a superimposed medium (not shown) can communicate with each other unhindered. In further embodiments of the nanowell array 9, shallow depressions may be provided as nanowells 17, in which the anchor points 11 are introduced. The wells have a depth that is less than a diameter of the cells 2. Embodiment - Generation, Identification and Isolation of a
Hochproduzenten high producers
Folgender Abriss soll am Beispiel von an Suspensionswachstum adaptierten CHO-K1-Zellen die einzelnen Arbeitsschritte illustrieren, die bis zur Isolation eines Interferon-gamma (IFN-γ)- Hochproduzenten notwendig sind: The following outline is intended to illustrate the individual steps necessary for the isolation of an interferon-gamma (IFN-γ) high producer using the example of CHO-K1 cells adapted to suspension growth:
- Transfektion - Transfection
CHO-K1 Zellen werden klassisch mit einem Plasmid, das eine IFN-v- Expressionskassette aufweist, transfiziert. Anschließend werden die Zellen 2 für einige Stunden, beispielsweise mindestens 12 Stunden, maximal 48 Stunden, kultiviert, um die Expression des Transgens zu erlauben. CHO-K1 cells are classically transfected with a plasmid having an IFN-γ expression cassette. Subsequently, cells 2 are cultured for a few hours, for example at least 12 hours, for a maximum of 48 hours to allow expression of the transgene.
- Auswahl des Nanowellarrays - Selection of the nanowell array
Es wird ein Nanowellarray 9 ausgewählt, bei dem die einzelnen Nanowells 17 des Nanowellarrays 9 nur wenig größer als die Zellen 2 sind: Bei einer durchschnittlichen Größe einer CHO-K1-Zelle von rund 12 μηη bis 15 μηη, ist ein Nanowellarray 9 mit runden 18 μηη Nanowells 17 geeignet. Die Nanowells 17 sind 18 μηη hoch. Das Arraydesign stellt somit sicher, dass sich nur eine Zelle 2 in einem Nanowell 17 befinden kann. - Vorbereiten des Nanowellarrays A nanowell array 9 is selected in which the individual nanowells 17 of the nanowell array 9 are only slightly larger than the cells 2: With an average size of a CHO-K1 cell of approximately 12 μm to 15 μm, a nanowell array 9 with round 18 is μηη nanowells 17 suitable. The nanowells 17 are 18 μηη high. The array design thus ensures that only one cell 2 can be located in a nanowell 17. - Prepare the nanowell array
Für die Detektion von IFN-v-Hochproduzenten wird das Nanowellarray 9 (analog einem klassischen Sandwich-ELISA) mit Fangantikörper beschichtet. Unspezifische Bindestellen werden blockiert. Der Nanowellarray 9 wird anschließend dreimal gründlich mit PBS gewaschen. For the detection of IFN-v high producers, the nanowell array 9 (analogous to a classic sandwich ELISA) is coated with capture antibody. Unspecific binding sites are blocked. The nanowell array 9 is then thoroughly washed three times with PBS.
- Aussaat der Zellen in Nanowellarrays - Sowing the cells in nanowell arrays
Die transfizierten Zellen 2 werden durch einen 40 μηη Cell Strainer (Filter 7) gegeben, um möglicherweise vorhandene Zellaggregate aufzulösen und eine The transfected cells 2 are passed through a 40 μm cell strainer (filter 7) to dissolve any cell aggregates that may be present and one
Einzelzellsuspension zu erhalten. To obtain single cell suspension.
Die Einzelzellsuspension wird auf den vorbereiteten Nanowellarray 9 mittels der Vorrichtung aufgetragen und durch Kippbewegungen gleichmäßig verteilt.
Bei Bedarf werden mehrere Nanowellarrays 9 seriell oder parallel mit den The single cell suspension is applied to the prepared nanowell array 9 by means of the device and distributed evenly by tilting movements. If necessary, several nanowell arrays 9 are connected in series or in parallel with the
transfizierten Zellen 2 bestückt. Nach einer Inkubation von fünf Minuten, wird das Nanowellarray 9 drei Minuten bei 800 rpm zentrifugiert. Anschließend wird das Nanowellarray 9 mit frischem Zellkulturmedium gewaschen, um Zellen 2, die sich nicht in Nanowells 17 befinden, aus den Zwischenräumen 18 zu entfernen. Diese Zellen 2 werden in Folge in einem zweiten Nanowellarray 9 ausgesät, sodass auch sie für Detektion und Isolation zur Verfügung stehen und nicht verloren gehen. transfected cells 2 equipped. After an incubation of five minutes, the nanowell array 9 is centrifuged for three minutes at 800 rpm. Subsequently, the nanowell array 9 is washed with fresh cell culture medium to remove cells 2 that are not in nanowells 17 from the gaps 18. These cells 2 are seeded in succession in a second nanowell array 9, so that they too are available for detection and isolation and are not lost.
Zellen 2, die in einem Nanowell 17 lokalisiert sind, werden durch den Waschschritt nicht aus dieser entfernt. Cells 2 located in a nanowell 17 are not removed from it by the washing step.
Detektion von Hochproduzenten in Nanowellarrays Detection of high producers in nanowell arrays
Die transfizierten Zellen 2 werden nach der oben beschriebenen Aussaat für mindestens 30 Minuten im Nanowellarray 9 inkubiert, um die Sekretion von IFN-γ in die beschichteten Nanowells 17 zu erlauben. Anschließend wird das Nanowellarray 9 optional mit frischem Zellkulturmedium gewaschen, um nicht gebundenes IFN-γ aus den Nanowells 17 zu entfernen. Der Nanowellarray 9 wird nun mit einem Alexa Fluor 488-konjugierten Antikörper gegen IFN-γ (direkte Detektion) oder mit einem IFN-γ- Detektionsantikörper (nach einem Waschschritt) gefolgt von einem dagegen gerichteten Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörper (indirekte Detektion zur Signalamplifikation) inkubiert. Nach einem optionalen Waschschritt mit frischem Zellkulturmedium wird das Nanowellarray 9 mit der Bilderfassungseinheit 14 der Vorrichtung gescannt. Dabei werden Aufnahmen in Hellfeld und Fluoreszenz (Alexa Fluor 488) gemacht. Anhand der Hellfeldaufnahmen werden die Zellen 2 in den Nanowells 17 identifiziert. Zudem überprüft die Vorrichtung, ob Zellen 2 außerhalb von Nanowells 17 vorliegen. Sollte dies der Fall sein, können benachbarte The transfected cells 2 are incubated after the seeding described above for at least 30 minutes in the nanowell array 9 to allow the secretion of IFN-γ in the coated nanowells 17. Subsequently, the nanowell array 9 is optionally washed with fresh cell culture medium to remove unbound IFN-γ from the nanowell 17. Nanowell array 9 is then probed with an Alexa Fluor 488-conjugated antibody against IFN-γ (direct detection) or with an IFN-γ detection antibody (after a washing step) followed by a directed Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibody (indirect detection for signal amplification ). After an optional washing step with fresh cell culture medium, the nanowell array 9 is scanned with the image capture unit 14 of the device. The images are taken in brightfield and fluorescence (Alexa Fluor 488). The cells 2 in the nanowells 17 are identified on the basis of the bright field images. In addition, the device checks whether cells 2 are present outside nanowells 17. If this is the case, neighboring
Nanowells 17 vom Isolationsprozess ausgeschlossen werden, um zu verhindern, dass zusätzlich zu der gewünschten Einzelzelle noch weitere Zellen 2 im gleichen Schritt isoliert werden. Die Hellfelddetektion erlaubt es zudem, grundsätzliche Aussagen über die Viabilität einer Zelle 2 zu treffen, um tote oder sterbende Zellen 2 vom Isolationsprozess auszuschließen. Die Fluoreszenzbilder dienen der Detektion und relativen Quantifizierung der spezifischen Produktivität einer Einzelzelle 2, da sekretiertes IFN-γ von einem Alexa Fluor 488-konjugierten Antikörper gebunden wird (direkt über Detektionsantikörper oder indirekt: Detektionsantikörper und Nanowells 17 are excluded from the isolation process in order to prevent further cells 2 are isolated in addition to the desired single cell in the same step. Bright field detection also makes it possible to make fundamental statements about the viability of a cell 2 in order to exclude dead or dying cells 2 from the isolation process. The fluorescence images serve to detect and quantify the specific productivity of a single cell 2, since secreted IFN-γ is bound by an Alexa Fluor 488-conjugated antibody (directly via detection antibody or indirectly: detection antibody and antibody
Sekundärantikörper). Alle Aufnahmen werden bei der gleichen Belichtungszeit gemacht, sodass die Signalintensität die Menge sekretierten IFN-γ wiederspiegelt. Die Signale werden nach Fluoreszenzintensität sortiert und damit Hoch-, Mittel- und Niedrigproduzenten bzw. Zellen 2 ohne spezifische Produktivität identifiziert.
Nach den Waschschritten, eventuell erfolgenden Färbesch ritten (analog zu den Waschschritten), erfolgt in einem weiteren bildgebenden Schritt durch die Secondary antibody). All images are taken at the same exposure time, so that the signal intensity reflects the amount of secreted IFN-γ. The signals are sorted by fluorescence intensity to identify high, medium and low producers or cells 2 without specific productivity. After the washing steps, possibly taking Färbesch rode (analogous to the washing steps), takes place in a further imaging step by the
Bilderfassungseinheit 14 an den im Rahmen einer Vorauswahl definierten Image acquisition unit 14 to those defined in a preselection
Nanowells 17 beispielsweise eine Detektion eines Fluoreszenz- oder Nanowells 17, for example, a detection of a fluorescence or
Lumineszenzsignals eines jeweiligen Nanowells 17 und der darin befindlichen Zelle 2. In einem weiteren Schritt erfolgt die Detektion der Zellen 2 im Hellfeld, um mehrere Zellen 2 in einem Nanowell 17 identifizieren zu können. Diese Kontrolle kann in zwei Bildaufnahmen oder durch Umschalten zwischen z. B. Fluoreszenz- und Hellfeldkanal in einer Aufnahmeposition erfolgen. Ebenso sind zusätzliche Detektionsebenen durch Luminescence signal of a respective nanowell 17 and the cell 2 therein. In a further step, the detection of the cells 2 in the bright field to identify multiple cells 2 in a nanowell 17 can be. This control can be in two images or by switching between z. B. Fluorescence and bright field channel in a recording position. Likewise, additional detection levels are through
Multifluoreszenzkanäle anwendbar. Multifluoreszenzkanäle applicable.
Isolation von Hochproduzenten aus Nanowellarravs und Ablage in Zielstrukturen Isolation of high producers from nanowellarravs and deposition in target structures
Identifizierte Hochproduzenten und einige Mittelproduzenten werden von der Identified high producers and some middle producers are from the
Vorrichtung automatisiert für die Isolation ausgewählt und vom Nutzer bestätigt. Device automatically selected for isolation and confirmed by the user.
Einzelzellen 2 oder Zellklone werden mit Hilfe der Pipettiereinheit 4 einzeln aus den Nanowells 17 des Nanowellarravs 9 isoliert. Dies wird durch die Aufnahme von Bildern vor und nach der Ernte sowie durch ein Video des eigentlichen Erntevorgangs dokumentiert. Zudem überprüft die Vorrichtung bildanalytisch, ob bei jedem einzelnen Isolationsschritt nur eine Zelle 2 aufgenommen wurde. Die Zellen 2 werden separat in Nanowells 17 einer 384-Well-Platte abgegeben. Die Vorrichtung überprüft vor der Zellabgabe, ob die Zielnanowells 17 leer vorliegen und stellt sicher, dass die Single cells 2 or cell clones are individually isolated from the nanowells 17 of the nanowave array 9 with the aid of the pipetting unit 4. This is documented by taking pictures before and after the harvest, as well as a video of the actual harvesting process. In addition, the device checks image-analytically whether only one cell 2 was recorded at each individual isolation step. The cells 2 are dispensed separately into nanowells 17 of a 384-well plate. The device checks before cell delivery whether the target nanowells 17 are empty and ensures that the
Zellabgabe ausschließlich in leere Zielnanowells 17 erfolgt. Nach der Zellabgabe überprüft die Vorrichtung bildanalytisch, dass nur eine Einzelzelle pro Zielnanowell 17 abgelegt wurde. Cell delivery takes place exclusively in empty target nanowells 17. After the cell delivery, the device checks image-analytically that only one single cell per target nanowell 17 has been deposited.
Durch die Pipettiereinheit 4, welche geeignete Kapillaren beispielsweise aus Glas, Keramik oder Kunststoff aufweist, werden ausgewählte Nanowells 17 angefahren. Die Auswahl der Nanowells 17 kann anhand der jeweiligen Signalintensitäten der By means of the pipetting unit 4, which has suitable capillaries, for example made of glass, ceramic or plastic, selected nanowells 17 are approached. The selection of the nanowells 17 can be based on the respective signal intensities of
Detektionsstrahlung und/oder durch einen Nutzer erfolgen. Die Pipettiereinheit 4 nimmt den Inhalt des Nanowells 17 oder eine Zelle 2 von einem Zwischenraum 18 auf und gibt sie in ein Zielnanowell 17 ab. Eine Dokumentation des Vorgangs durch die Bilderfassungseinheit 14 ist möglich, um einen lückenlosen Nachweis der Detection radiation and / or done by a user. The pipetting unit 4 picks up the contents of the nanowell 17 or a cell 2 from a gap 18 and delivers them to a target nanowell 17. A documentation of the process by the image acquisition unit 14 is possible to provide a complete proof of the
Monoklonalität zu erhalten.
- Vermehrung der Einzelzelle zum Zellklon To obtain monoclonality. - Propagation of the single cell to the cell clone
Die Proliferation der hochproduzierenden Einzelzellen 2 zum Zellklon wird von der Bilderfassungseinheit 14 durch die Aufnahme von Bildern dokumentiert. Die The proliferation of the high-producing single cells 2 to the cell clone is documented by the image acquisition unit 14 by the recording of images. The
Vorrichtung kann bildanalytisch die Konfluenz der Kultur bestimmen und teilt dem Nutzer mit, wenn der Zellklon in ein größeres Wellformat transferiert oder gesplittet werden sollte. Dieser Prozess kann mit Hilfe der Vorrichtung automatisiert werden. Device can image analytically determine the confluence of the culture and inform the user if the cell clone should be transferred or split into a larger well format. This process can be automated using the device.
Hierzu können die Zielnanowellarrays 15 gedeckelt von der Vorrichtung zur längeren Inkubation entnommen werden. Weitere bildgebende Scans oder Screenings zu definierten Zeiten können das Zellwachstum und die Expressionsstärke eines Transgens oder die Produktivität der entstehenden Klone dokumentieren und eine weitere Auswahl der produktivsten Klone ermöglichen. Diese Schritte können innerhalb einer entsprechend optional ausgestatteten Vorrichtung (integrierter Brutschrank 16) und der vorhandenen Bilderfassungseinheit 14 erfolgen. Der Transport ausgewählter Klone kann ebenso der Pipettiereinheit 4 der Vorrichtung erfolgen. For this purpose, the target nanowell arrays 15 can be removed from the device for longer incubation capped. Additional imaging scans or screenings at defined times can document the cell growth and expression level of a transgene, or the productivity of the resulting clones, and allow further selection of the most productive clones. These steps can be carried out within an appropriately optionally equipped device (integrated incubator 16) and the existing image capture unit 14. The transport of selected clones can also take place in the pipetting unit 4 of the device.
- Test spezifische Produktivität Zellklon - Test specific productivity cell clone
Anschließend wird in einem klassischen ELISA die spezifische Produktivität (IFN-γ Sekretion) der einzelnen Zellklone analysiert. Diese Tests werden wiederholt durchgeführt, um die Stabilität der IFN-v-Produktion eines Zellklons über die Zeit beurteilen zu können. Stabile Hochproduzenten werden so identifiziert.
Subsequently, the specific productivity (IFN-γ secretion) of the individual cell clones is analyzed in a classical ELISA. These assays are performed repeatedly to assess the stability of IFN-v production of a cell clone over time. Stable high producers are identified in this way.
Bezugszeichen reference numeral
1 Wellplatte 1 corrugated plate
2 Zelle 2 cell
3 Medium 3 medium
4 Pipettiereinheit 4 pipetting unit
5 Reinraumgehäuse 5 clean room housings
6 Zellsuspension 6 cell suspension
7 Filter 7 filters
8 Messeinrichtung 8 measuring device
9 Nanowellarray 9 nanowell array
10 Zentrifuge 10 centrifuge
1 1 Ankerpunkt 1 1 anchor point
12 Speichereinheit 12 storage unit
13 Beleuchtungseinheit 13 lighting unit
14 Bilderfassungseinheit 14 image capture unit
15 Zielnanowellarray 15 target nanowell array
16 Inkubator 16 incubator
17 Nanowell 17 Nanowell
18 Zwischenraum 18 gap
19 Auswerteeinheit 19 evaluation unit
A Absaugung Nährmedium A suction nutrient medium
B Waschen und Absaugen der Waschlösung B Washing and aspirating the washing solution
C Zugabe von Enzym und Medium C addition of enzyme and medium
D Filtervorgang und Zellzahlbestimmung D Filtering process and cell count
E Coating, Funktionalisierung E coating, functionalization
F Umlagerung in Nanowellarray F rearrangement in nanowell array
G Zentrifugation G centrifugation
H optionaler Waschschritt H optional wash step
I Bilderfassung, Auswertung und Umlagerung in ZielgefäßI image acquisition, evaluation and rearrangement in destination vessel
J Überwachung der Produzentenzellen
J Monitoring of the producer cells
Claims
1. Verfahren zur Verifizierung des Erfolgs von Einzelzellaussaaten in Nanowellarrays (9), umfassend die Schritte: 1. A method for verifying the success of single cell seeds in nanowell arrays (9), comprising the steps of:
- Beleuchten eines mit einzelnen biologischen Zellen (2) besäten Nanowellarrays (9), wobei das Nanowellarray (9) eine Anzahl von Nanowells (17) aufweist, in denen nach der Aussaat jeweils höchstens eine biologische Zelle (2) enthalten sein soll, mit mindestens einer Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung und ortsaufgelöstes Erfassen einer durch die Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung bewirkten Detektionsstrahlung als Bilddaten, Illuminating a nanowell array (9) seeded with individual biological cells (2), the nanowell array (9) having a number of nanowells (17) in which, after sowing, at most one biological cell (2) is to be contained, with at least an illumination and / or excitation radiation and spatially resolved detection of a detection radiation caused by the illumination and / or excitation radiation as image data,
- Auswerten der Bilddaten hinsichtlich des Vorhandenseins genau einer Zelle (2) in den jeweiligen Nanowells (17), Evaluating the image data for the presence of exactly one cell (2) in the respective nanowells (17),
- Auswerten der Bilddaten hinsichtlich des Vorhandenseins von Zellen (2) in Evaluating the image data for the presence of cells (2) in
Zwischenräumen (18) zwischen den Nanowells (17), und Interspaces (18) between the nanowells (17), and
- Abspeichern der Positionen derjenigen Nanowells (17), in denen nicht genau eine Zelle (2) vorhanden ist sowie derjenigen Zwischenräume (18), in denen Zellen (2) vorhanden sind. - Storing the positions of those nanowells (17) in which not exactly one cell (2) is present and those spaces (18) in which cells (2) are present.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Nanowells (17), in denen nach der Aussaat mehr als eine Zelle (2) vorhanden ist, und/oder Zellen (2) in 2. The method according to claim 1, characterized in that nanowells (17), in which after sowing more than one cell (2) is present, and / or cells (2) in
Zwischenräumen (18) eine Entnahmevorrichtung (z. B. Pipette) zugestellt und überschüssige Zellen (2) (einzeln) entnommen werden. Gaps (18) a sampling device (eg., Pipette) delivered and excess cells (2) (individually) are removed.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Aussaat leer gebliebene Nanowells (17) identifiziert und deren Position ermittelt wird und entnommene Zellen (2) in diese Nanowells (17) einzeln abgelegt werden. 3. The method according to claim 2, characterized in that after sowing empty nanowells (17) identified and their position is determined and removed cells (2) are stored individually in these nanowells (17).
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Nanowells (17) ohne 4. The method according to claim 1, characterized in that nanowells (17) without
Zellen (2) und/oder Nanowells (17) mit mehr als einer Zelle (2) und/oder Nanowells (17), die an Zwischenräume (18) angrenzen, in denen Zellen (2) detektiert worden sind, identifiziert, deren Positionen abgespeichert und von nachfolgenden Verfahrensschritten ausgeschlossen werden. Cells (2) and / or nanowells (17) with more than one cell (2) and / or nanowells (17) adjoining interstices (18) in which cells (2) have been detected, whose positions are stored and excluded from subsequent process steps.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Abhängigkeit der abgespeicherten Positionen Steuerbefehle für nachfolgende 5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that in dependence of the stored positions control commands for subsequent
Verfahrensschritte generiert oder angepasst werden.
Process steps are generated or adapted.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Nanowellarray (9) unter Kulturbedingungen gehalten wird, wobei die Kulturbedingungen gewünschte physiologische Reaktionen der Zellen (2) ermöglichen. 6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the nanowell array (9) is maintained under culture conditions, wherein the culture conditions allow desired physiological reactions of the cells (2).
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die physiologischen 7. The method according to claim 6, characterized in that the physiological
Reaktionen dokumentiert werden, wobei Wachstums- und Proliferationsprozesse aufgrund einer Signalintensität der Detektionsstrahlung oder Änderung der Zellmorphologie im Bild erfasst und gemessen werden und/oder eine Produktion von Stoffen durch die Zelle (2) anhand markierter Antikörper, insbesondere Fluorochrom-markierter Antikörper, Enzym- markierter Antikörper, bispezifischer Antikörper, spezifischer Interaktionen von produzierten Stoffen und/oder Stoffwechselvorgängen der jeweiligen Zelle (2) erfasst und ausgewertet werden. Reactions are documented, wherein growth and proliferation processes are detected and measured on the basis of a signal intensity of the detection radiation or change in cell morphology in the image and / or production of substances by the cell (2) using labeled antibodies, in particular fluorochrome-labeled antibodies, enzyme-labeled Antibodies, bispecific antibodies, specific interactions of produced substances and / or metabolic processes of the respective cell (2) are recorded and evaluated.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass von der Zelle (2) abgegebene Stoffe und/oder Stoffgemische in dem Nanowell (17) und/oder neben dem Nanowell (17) mittels für die nachzuweisenden Stoffe und/oder Stoffgemische spezifischen Bindungspartnern wenigstens anteilig gebunden werden. 8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that emitted by the cell (2) substances and / or mixtures in the nanowell (17) and / or next to the nanowell (17) by means of the substances to be detected and / or mixtures Binding partners are at least partially bound.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ausgewählte Zellen (2) oder aus einer einzelnen Zelle (2) hervorgegangene Zellklone aus den jeweiligen Nanowells (17) isoliert und einzeln weiter kultiviert werden, so dass monoklonale Zelllinien erhalten werden. 9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that selected cells (2) or from a single cell (2) resulting cell clones are isolated from the respective nanowells (17) and further cultured individually, so that monoclonal cell lines are obtained.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass automatisiert 10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that automated
- Nanowells (17) mit genau einer Zelle (2) erkannt werden und die Positionen dieser Nanowells (17) abgespeichert werden, - Nanowells (17) are detected with exactly one cell (2) and the positions of these nanowells (17) are stored,
- die Nanowells 17 über mehrere Tage kultiviert und auf dem System beobachtet und bildanalytisch ausgewertet werden, the nanowells 17 are cultivated over several days and observed on the system and analyzed by image analysis,
- auf den Auswertungen basierend Proliferations- / Vitalitätsdaten der Zellen (2) generiert werden, - based on the evaluations based on proliferation / vitality data of the cells (2),
- optional eine Detektion von sekretierten Proteinen / Oberflächenproteinen oder internen Markern erfolgt, optionally a detection of secreted proteins / surface proteins or internal markers,
- anhand der Kombination der gewonnenen Daten automatisiert diejenigen Nanowells (17) ausgewählt werden, in denen sich monoklonale, gut proliferierende, produktionsstarke Klone befinden,
- aus diesen Nanowells (17) zum Zwecke der weiteren Expansion der Zelllinien automatisiert gepickt wird und - the nanowells (17) containing monoclonal, well-proliferating, high-production clones are automatically selected on the basis of the combination of the data obtained, - From these nanowells (17) for the purpose of further expansion of the cell lines is automatically picked and
- alle diese Schritte dokumentiert werden. - all these steps are documented.
1 1. Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass, vorzugsweise automatisiert, 1 1. A method, characterized in that, preferably automated,
- Bilddaten eines in einem Probenbereich angeordneten Nanowellarrays (9) mit einer Bilderfassungseinheit (14) und einer Beleuchtungseinheit (12) zur Bereitstellung wenigstens einer Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung und Mittel zur gesteuerten Beleuchtung des Nanowellarrays (9) mit der wenigstens einen Beleuchtungs- und/oder Image data of a nanowell array (9) arranged in a sample area with an image acquisition unit (14) and a lighting unit (12) for providing at least one illumination and / or excitation radiation and means for controlled illumination of the nanowell array (9) with the at least one illumination and /or
Anregungsstrahlung erfasst werden; Excitation radiation are detected;
- durch Auswertung dieser Bilddaten Nanowells (17) in Größe, Form und/oder Position innerhalb des in einem Probenbereich angeordneten Nanowellarrays (9) erkannt werden; - By evaluation of these image data nanowells (17) in size, shape and / or position within the arranged in a sample area nanowell array (9) are detected;
- die Positionen dieser erkannten Nanowells (17) mit einer Identität versehen und - Identify the positions of these detected nanowells (17) with an identity and
abgespeichert werden; be stored;
- anhand der Bilddaten sämtliche Zellen (2) innerhalb des in einem Probenbereich angeordneten Nanowellarrays (9) unabhängig erkannt werden; - Based on the image data, all cells (2) within the nanowell array (9) arranged in a sample area are independently detected;
- die Positionen sowie bildanalytisch erfassten Parameter (Form, spektrale Daten, Umrisse, Morphologie) dieser erkannten Zellen (2) abgespeichert werden; - The positions and image-analytically recorded parameters (shape, spectral data, outlines, morphology) of these recognized cells (2) are stored;
- eine 2D-Überlagerung (X/Y) der Positionen und Formen der gespeicherten Nanowells (17) und der erkannten Zellen (2) durchgeführt wird, eine Zuordnung von Nanowells (17) mit den in den Nanowells (17) enthaltenen Zellen (2) ermöglicht wird und gespeicherte a 2D overlay (X / Y) of the positions and shapes of the stored nanowells (17) and of the detected cells (2) is performed, an association of nanowells (17) with the cells (2) contained in the nanowells (17) is enabled and stored
bildanalytische Parameter der Zellen (2) hierbei den bereits zuvor gespeicherten Daten der Nanowells (17) zugeordnet werden und eine resultierende Liste der Nanowells (17) und der bildanalytischen Parameter erstellt wird; image-analytical parameters of the cells (2) are assigned to the previously stored data of the nanowells (17) and a resulting list of the nanowells (17) and the image-analytical parameters is created;
- die resultierende Liste optional auf Nanowells (17), welche genau eine Zelle (2) enthalten gefiltert wird; optionally, the resulting list is filtered on nanowells (17) containing exactly one cell (2);
- die Nanowells (17) mit den Zellen (2) über mehrere Tage kultiviert und auf dem System beobachtet und bildanalytisch ausgewertet werden; - The nanowells (17) are cultivated with the cells (2) over several days and observed on the system and analyzed by image analysis;
- auf den Auswertungen basierend Proliferations- und/oder Vitalitätsdaten der Zellen (2) generiert werden; - generated based on the evaluations based on proliferation and / or vitality data of the cells (2);
- optional eine Detektion von sekretierten Proteinen und/oder Oberflächenproteinen und/oder internen Markern erfolgt; optionally a detection of secreted proteins and / or surface proteins and / or internal markers takes place;
- anhand der Kombination der gewonnenen Daten diejenigen Nanowells (17) ausgewählt werden, in denen sich monoklonale, gut proliferierende, produktionsstarke Klone befinden; - aus diesen ausgewählten Nanowells (17) zum Zwecke der weiteren Expansion der Zelllinien, vorzugsweise automatisiert, gepickt wird und - selecting from the combination of the data obtained those nanowells (17) containing monoclonal, well-proliferating, high-production clones; - From these selected nanowells (17) for the purpose of further expansion of the cell lines, preferably automated, is picked, and
- alle diese Schritte, vorzugsweise automatisiert, dokumentiert werden.
- All these steps, preferably automated, documented.
12. Vorrichtung zur Verifizierung des Erfolgs von Einzelzellaussaaten in Nanowellarrays (9), umfassend eine Bilderfassungseinheit (14) zur Erfassung von Bilddaten eines in einem Probenbereich angeordneten Nanowellarrays (9) und einer Beleuchtungseinheit (12) zur Bereitstellung wenigstens einer Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung und Mittel zur gesteuerten Beleuchtung des Nanowellarrays (9) mit der wenigstens einen Beleuchtungsund/oder Anregungsstrahlung, wobei die Bilderfassungseinheit (14) derart konfiguriert ist, dass 12. An apparatus for verifying the success of single cell seeds in nanowell arrays (9), comprising an image acquisition unit (14) for acquiring image data of a nanowell array (9) arranged in a sample area and a lighting unit (12) for providing at least one illumination and / or excitation radiation and means for controlled illumination of the nanowell array (9) with the at least one illumination and / or excitation radiation, wherein the image capture unit (14) is configured such that
- auf dem Nanowellarray (9) Erwartungsbereiche mit erwartetem Vorhandensein je einer Zelle (2), festgelegt, detektiert oder verifiziert werden können, indem erfasste Bilddaten der betreffenden Erwartungsbereiche mittels einer Auswerteeinheit (19) der Vorrichtung ausgewertet werden können; - Expected areas with expected presence of each cell (2), can be set, detected or verified on the nanowell array (9) by being able to evaluate acquired image data of the relevant expected areas by means of an evaluation unit (19) of the device;
- auf dem Nanowellarray (9) Zwischenräume (18) festgelegt, detektiert oder verifiziert werden können, in denen keine Zellen erwartet werden; - can be fixed, detected or verified on the nanowell array (9) spaces (18) in which no cells are expected;
- nach dem Beleuchten des Nanowellarrays (9) eine ortsaufgelöste Erfassung einer durch die Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung bewirkten Detektionsstrahlung erfolgen kann und - After the illumination of the nanowell array (9) a spatially resolved detection of a caused by the illumination and / or excitation radiation detection radiation can be carried out and
- Auswerten der Bilddaten hinsichtlich des Vorhandenseins genau einer Zelle (2) in den jeweiligen Nanowells (17), Evaluating the image data for the presence of exactly one cell (2) in the respective nanowells (17),
- Auswerten der Bilddaten hinsichtlich des Vorhandenseins von Zellen (2) in Evaluating the image data for the presence of cells (2) in
Zwischenräumen (18) zwischen den Nanowells (17), und Interspaces (18) between the nanowells (17), and
- Abspeichern der Positionen derjenigen Nanowells (17), in denen nicht genau eine Zelle (2) vorhanden ist sowie derjenigen Zwischenräume (18), in denen Zellen (2) vorhanden sind, möglich ist. - Storing the positions of those nanowells (17) in which not exactly one cell (2) is present as well as those spaces (18) in which cells (2) are present, is possible.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die 13. The apparatus according to claim 12, characterized in that the
Bilderfassungseinheit (14) ausgebildet ist, ein Nanowellarray (9) hinsichtlich seines Typs zu identifizieren und dessen Position und räumliche Ausrichtung zu bestimmen. Image detection unit (14) is adapted to identify a nanowell array (9) in terms of its type and to determine its position and spatial orientation.
14. Vorrichtung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass diese zur14. The apparatus according to claim 12 or 13, characterized in that this for
Dokumentation des Nanowellarrays (9) und/oder von auswählbaren Verfahrensschritten und Verfahrensstadien ausgebildet ist. Documentation of the nanowell array (9) and / or of selectable process steps and process stages is formed.
15. Vorrichtung, umfassend 15. Device comprising
- eine Bilderfassungseinheit (14) zur Erfassung von Bilddaten eines in einem Probenbereich angeordneten Nanowellarrays (9) und einer Beleuchtungseinheit (12) zur Bereitstellung wenigstens einer Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung und Mittel zur gesteuerten
Beleuchtung des Nanowellarrays (9) mit der wenigstens einen Beleuchtungs- und/oder Anregungsstrahlung erfasst werden können; - An image detection unit (14) for detecting image data of a nanowell array (9) arranged in a sample area and a lighting unit (12) for providing at least one illumination and / or excitation radiation and means for controlled Illumination of the nanowell array (9) can be detected with the at least one illumination and / or excitation radiation;
- eine Auswerteeinheit (19) konfiguriert zur Auswertung dieser Bilddaten und zur Erkennung von Nanowells (17) hinsichtlich ihrer Größe, Form und Position innerhalb des in einem Probenbereich angeordneten Nanowellarrays (9); an evaluation unit (19) configured to evaluate said image data and to detect nanowells (17) with regard to their size, shape and position within the nanowell array (9) arranged in a sample area;
- wobei die Auswerteeinheit (19) derart konfiguriert ist, dass - wherein the evaluation unit (19) is configured such that
- die Positionen dieser erkannten Nanowells (17) mit einer ID versehen und abgespeichert werden, the positions of these detected nanowells (17) are provided with an ID and stored,
- anhand derselben Bilddaten sämtliche Zellen (2) innerhalb des in einem - Using the same image data all cells (2) within the in one
Probenbereich angeordneten Nanowellarrays (9) unabhängig voneinander erkannt werden, Sample area arranged nanowell arrays (9) are recognized independently,
- die Positionen sowie sämtliche bildanalytisch erfassten Parameter, insbesondere Form, spektrale Daten, Umrisse und/oder Morphologie, dieser erkannten Zellen (2) abgespeichert werden - The positions and all image-analytically acquired parameters, in particular form, spectral data, outlines and / or morphology of these recognized cells (2) are stored
- Durch 2D-Überlagerung (X/Y) der Positionen und Formen der gespeicherten Nanowells (17) und der erkannten Zellen (2) eine Zuordnung von Nanowells (17) mit den in den Nanowells (17) enthaltenen Zellen (2) ermöglicht wird und die - By 2D superposition (X / Y) of the positions and shapes of the stored nanowells (17) and the detected cells (2) an assignment of nanowells (17) with the cells (2) contained in the nanowells (17) is enabled and the
gespeicherten bildanalytischen Parameter der Zellen (2) hierbei den bereits zuvor gespeicherten Daten der Nanowells (17) zugeordnet werden stored image analytical parameters of the cells (2) are assigned to the previously stored data of the nanowells (17)
- Die dadurch resultierende Liste optional auf Nanowells (17), welche genau eine Zelle (2) enthalten gefiltert werden kann Optionally, the resulting list may be filtered on nanowells (17) containing exactly one cell (2)
- die Nanowells (17) über mehrere Tage kultiviert und auf dem System beobachtet und bildanalytisch ausgewertet werden, - The nanowells (17) are cultivated over several days and observed on the system and analyzed by image analysis,
- auf den Auswertungen basierend Proliferations- und/oder Vitalitätsdaten der Zellen (2) generiert werden, - based on the evaluations based on proliferation and / or vitality data of the cells (2),
- optional eine Detektion von sekretierten Proteinen und/oder Oberflächenproteinen und/oder internen Markern erfolgt, optionally a detection of secreted proteins and / or surface proteins and / or internal markers takes place,
- anhand der Kombination der gewonnenen Daten automatisiert diejenigen - Automated by the combination of the data obtained
Nanowells (17) ausgewählt werden, in denen sich monoklonale, gut proliferierende, produktionsstarke Klone befinden, Nanowells (17) containing monoclonal, well-proliferating, high-production clones,
- eine Pipettiereinheit (4) vorhanden ist, mittels der aus diesen Nanowells (17) zum Zwecke der weiteren Expansion der Zelllinien automatisiert gepickt werden können, wobei alle diese Schritte automatisiert dokumentiert werden. - A pipetting unit (4) is present, by means of which these nanowells (17) for the purpose of further expansion of the cell lines can be picked automatically, all of these steps are automatically documented.
16. Nanowellarray (9) aufweisend Nanowells (17) mit einem Durchmesser, der die Aufnahme von mehreren Zellen (2) erlaubt und auf dem Grund jedes der Nanowells (17) eine 16. Nanowell array (9) comprising nanowells (17) with a diameter that allows the uptake of multiple cells (2) and at the bottom of each of the nanowells (17)
Ankerstruktur (1 1 ) zur Bindung nur einer Zelle (2) vorhanden ist.
Anchor structure (1 1) for binding only one cell (2) is present.
17. Nanowellarray (9) nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch eine Ankerstruktur (1 1 ) in Form einer Oberflächenstrukturierung und/oder einer Beschichtung mit Ankermolekülen. 17. nanowell array (9) according to claim 16, characterized by an anchor structure (1 1) in the form of a surface structuring and / or a coating with anchor molecules.
18. Nanowellarray (9) nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich wenigstens eine Beschichtung innerhalb und/oder außerhalb der Nanowells (17) vorhanden ist, um von der Zelle (2) sekretierte /sezernierte Stoffe und/oder Stoffgemische wenigstens anteilig zu binden und/oder eine Nachweisreaktion zum Nachweis des Vorhandenseins des Stoffs beziehungsweise des Stoffgemischs und/oder der Erfassung einer Signalintensität einer Detektionsstrahlung zu initiieren. 18. nanowell array (9) according to claim 16 or 17, characterized in that additionally at least one coating inside and / or outside of the nanowell (17) is present in order to at least partially from the cell (2) secreted / secreted substances and / or mixtures to bind and / or initiate a detection reaction to detect the presence of the substance or the mixture of substances and / or the detection of a signal intensity of a detection radiation.
19. Nanowellarray (9) nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Boden der Nanowells (17) als Sieb oder durchlässige Membran ausgebildet ist, um über Unterdruck einen Sog der Zellen (2) in die Nanowells (17) zu unterstützen. 19. Nanowellarray (9) according to any one of claims 16 to 18, characterized in that the bottom of the nanowell (17) is designed as a sieve or permeable membrane to a negative pressure suction of the cells (2) in the nanowells (17) support.
20. Nanowellarray (9) ohne Nanowells (17) mit Ankerstrukturen (1 1 ) auf mindestens einer seiner Oberflächen, wobei durch jede der Ankerstrukturen (1 1 ) nur eine Zelle (2) gebunden werden kann. 20. nanowell array (9) without nanowells (17) with anchor structures (1 1) on at least one of its surfaces, wherein by each of the anchor structures (1 1) only one cell (2) can be bound.
21 . Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 15 und/oder eines Nanowellarrays (9) nach einem der Ansprüche 16 bis 20 zur Kultivierung von Stammzellen, Eigenzellen, genetisch modifizierten Zellen oder Tumorzellen.
21. Use of the device according to one of claims 12 to 15 and / or a nanowell array (9) according to one of claims 16 to 20 for culturing stem cells, self-cells, genetically modified cells or tumor cells.
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