WO2018141313A2 - Uses of fgf-4 compounds - Google Patents

Abstract

The invention relates to uses of FGF-4 compounds. More specifically, it relates to the uses of FGF-4 compounds in the prevention and/or treatment of metabolic disorders.

Description

USES OF FGF-4 COMPOUNDS

TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION

The present invention relates to uses of FGF-4 compounds, especially the uses of FGF-4 compounds in the prevention and/or treatment of metabolic disorders.

INCORPORATION-BY-REFERENCE OF THE SEQUENCE LISTING

The Sequence Listing, entitled "SEQUENCE LISTING" , is 3, 114 bytes, was created on 30-March-2018 and is incorporated herein by reference.

BACKGROUND OF THE INVENTION

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) affects more than 400 million adults worldwide and is one of the leading mortalities. Though various therapeutics have been developed to normalize blood glucose, they are still limited on maintaining stable, durable glucose control and are associated with a range of side effects such as weight gain, hypoglycemia, bone loss, etc. Further exploration on identifying and developing new treatment with robust glucose normalization, reduced side effects and add-on benefits are in great need.

The fibroblast growth factor (FGF) family includes both autocrine/paracrine and endocrine acting members, which regulate a range of developmental/physiological processes including cell adhesion, differentiation, wound healing, angiogenesis, proliferation, etc (Izaguirre, M., et al., The Role and Potential Therapeutic Implications of the Fibroblast Growth Factors in Energy Balance and Type 2 Diabetes. Current Diabetes Reports, 2017. 17 (6) : p. 43. ) . The endocrine-acting FGF-19 subfamily member FGF-21 and FGF-19 have been shown to play key roles in energy homeostasis (Cuevas-Ramos, D., et al., The role of fibroblast growth factor 21 (FGF21) on energy balance, glucose and lipid metabolism. Curr Diabetes Rev, 2009. 5 (4) : p. 216-20; Wu, A.L., et al., FGF19 regulates cell proliferation, glucose and bile acid metabolism via FGFR4-dependent and independent pathways. PLoS One, 2011. 6 (3) : p. e17868. ) . FGF receptor agonistic Abs are also explored clinically on their potential to treat patients with diabetes/obesity (Harrison, C., Obesity and diabetes: an FGFR antibody with long-lasting effects. Nat Rev Drug Discov, 2012. 11 (2) : p. 106. ) . Furthermore, the endocrine-acting FGF-1 has recently been demonstrated to be a potent insulin sensitizer and is able to normalize blood glucose (BG) in diabetic rodent models. However, no BG reduction effect was observed for FGF-2, FGF-9 and FGF-10 by the same authors (Suh, J.M., et al., Endocrinization of FGF1 produces a neomorphic and potent insulin sensitizer. Nature,  2014. 513: p. 436. ) . These observations demonstrated intriguing yet complicated roles of FGF family proteins on the regulation of energy homeostasis.

SUMMARY OF INVENTION

The present invention relates to uses of FGF-4 compounds. In particular, the present invention relates to the uses of FGF-4 compounds in the prevention and/or treatment of metabolic disorders.

In one aspect, the invention relates to an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof, for use in the prevention and/or treatment of a metabolic disorder.

In one aspect, the invention relates to a method of prevention and/or treatment of a metabolic disorder comprising the step of administering a therapeutically effective amount of an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof to a subject in need thereof.

In one aspect, the invention relates to use of an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof in the manufacture of a medicament for the prevention and/or treatment of a metabolic disorder.

In some embodiments, the metabolic disorder is selected from the group consisting of elevated blood glucose (e.g., reduced ability to normalize glucose) , impaired glucose tolerance, insulin resistance, type II diabetes, type I diabetes, maturity onset diabetes of the young (MODY) , obesity, elevated percent body fat, and dyslipidemia.

In one aspect, the invention relates to an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof, for use in reducing fed blood glucose, reducing fasting blood glucose, improving insulin sensitivity, improving glucose tolerance, reducing body weight, or reducing food intake.

In one aspect, the invention relates to a method of reducing fed blood glucose, reducing fasting blood glucose, improving insulin sensitivity, improving glucose tolerance, reducing body weight, or reducing food intake, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof to a subject in need thereof.

In one aspect, the invention relates to use of an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof in the manufacture of a medicament for reducing fed blood glucose, reducing fasting blood glucose, improving insulin sensitivity, improving glucose tolerance, reducing body weight, or reducing food intake.

The invention also relates to a pharmaceutical composition comprising an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof, and one or  more pharmaceutically acceptable excipients. Therefore, in another aspect, the invention relates to use of the pharmaceutical composition of the invention in the prevention and/or treatment of metabolic disorders.

In some embodiments, the FGF-4 compound is a functional fragment of FGF-4.

In some embodiments, the FGF-4 compound is a functional analogue of FGF-4.

In some embodiments, the FGF-4 compound is a functional derivative of FGF-4.

In some embodiments, the FGF-4 compound is a human FGF-4 molecule.

In a particular embodiment, the FGF-4 compound has the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 2.

In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated for intravenous administration. In some embodiments, the pharmaceutical composition is formulated for subcutaneous or intraperitoneal administration.

BRIEF DISCRIPTION OF DRAWINGS

Fig. 1: SDS-PAGE of the purified hFGF-4.3ug and 6ug of the purified hFGF-4 was analyzed by SDS-PAGE using the 4-12%of NuPAGE gels at the reducing and non-reducing conditions.

Fig. 2: SEC-HPLC Size of the purified hFGF-4. The purified hFGF-4 was analyzed by HPLC using a TSK G2000SWxl (Tosoh, Part#08540, 5μm, 300x7.8mm) + TSKgel guard column SWxl (Tosoh, Part#08543, 6.0x40mm) to evaluate the purity. The x-axis indicates retention time (min) , while the y-axis shows the absorbance at 280 nm (arbitrary units, mAU) . The main peak of pure hFGF-4 appeared at 20.835min.

Fig. 3: MW of purified hFGF-4 by LC-MS. MW of purified hFGF-4 was confirmed by intact LC-MS as 16786.4Da with N-terminal Met removal (Theoretical MW: 16786.5Da) .

Fig. 4: The 6-hour time course of blood glucose (Fig. 4A) , and daily blood glucose levels (Fig. 4B) of db/db mice receiving s.c. dosing of hFGF-4 or vehicle (PBS) . n=8 per group, and data is presented as mean ± SEM.

Fig. 5: The food intake (Fig. 5A) and body weight reduction (Fig. 5B) of db/db mice receiving s.c. dosing of hFGF-4 or vehicle (PBS) . n=8 per group, and data is presented as mean ± SEM.

Fig. 6: The daily blood glucose levels of db/db mice receiving daily s.c. dosing of hFGF-4 or vehicle (PBS) . n=10 per group, and data is presented as mean ± SEM.

Fig. 7: pERK activity of hFGF-4 on individual hFGFR expressing Baf3 cell lines.

Fig. 8: hFGF-4’s effects on 3T3-L1 adipocytes.

Fig. 9: hFGF-4’s effects on H4IIE hepatocytes.

DETAILED DESCRIPTION

The present invention provides the uses of FGF-4 compounds in the prevention and/or treatment of metabolic disorder. The inventors have shown that FGF-4 compounds have rapid and long-lasting effects, including normalizing blood glucose, reducing food intake and reducing body weight.

Unless defined otherwise, technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by a person of ordinary skill in the art. See, e.g., Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2nd ed., J. Wiley &Sons (New York, NY 1994) ; Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989) . Any methods, devices and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice of this invention. The following definitions are provided to facilitate understanding of certain terms used frequently herein and are not meant to limit the scope of the present disclosure.

FGF-4 compound

The term “FGF-4 compound” refers to FGF-4 or a variant thereof (FGF-4 fragment, FGF-4 portion, modified form of FGF-4, protein having substantial identity to FGF-4, FGF-4 analogue, FGF-4 derivative, etc. ) that retains at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%or higher percent activity compared to FGF-4. Thus, FGF-4 compounds include functional FGF-4 fragments, functional FGF-4 analogues, and functional FGF-4 derivatives. An example of an FGF-4 compound that is substantially identical to FGF-4 is a protein having at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, or 100%amino acid identity to FGF-4. In some embodiments, the FGF-4 compound comprises a polypeptide having, e.g., 95%, 98%, 99%or higher %identity to FGF-4, where the non-identities represent substitutions or additions or deletions that do not substantially change the activity. In one embodiment said substitution (s) is/are conservative substitution (s) .

The human FGF-4 protein is 176 amino acids in length (shown as below) , and the sequence is publically available at Uniprot with accession number P08620:

APTAPNGTLEAELERRWESLVALSLARLPVAAQPKEAAVQSGAGDYLLGIKRLRRLYCNVGI GFHLQALPDGRIGGAHADTRDSLLELSPVERGVVSIFGVASRFFVAMSSKGKLYGSPFFTDECTFKEI LLPNNYNAYESYKYPGMFIALSKNGKTKKGNRVSPTMKVTHFLPRL (SEQ ID NO: 1)

The term "FGF-4" refers to naturally-occurring, isolated, recombinant, or synthetically-produced proteins. FGF-4 also includes allelic variants and species homologs.

A functional FGF-4 fragment is a protein having less than the full length sequence of FGF-4 but retaining at least 25%, 50%, 80%, 85%, 90%, or 95%activity compared to FGF-4 (e.g., hFGF-4 24-176, SEQ ID NO: 2) . The functional FGF-4 fragment can have an amino acid sequence of any length up to the full length FGF polypeptide sequence (e.g. SEQ ID NO: 1) . In some embodiments, the functional FGF-4 fragment is at least 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 100%identical to FGF-4 over the covered portion of the full length sequence. In some embodiments, the functional FGF-4 fragment has greater than 90%, e.g., 95%, 98%>, 99%or higher %identity to FGF-4 1-176, where the non-identities represent substitutions or insertions or deletions that do not substantially change the activity. In one embodiment said substitution (s) is/are conservative substitution (s) .

A functional FGF-4 analogue is a modified or synthetic form of FGF-4 that retains at least 25, 50, 80%, 85%, 90%, or 95%activity compared to FGF-4. These modifications include substitutions, insertions, and/or deletions, alone or in combination. The FGF-4 analogue can include non-naturally occurring amino acids, or modified amino acids. The functional FGF-4 analogue can also be a functional FGF-4 variant, e.g., having greater than 90%, e.g., 95%, 98%, 99%or higher %identity to FGF-4.

A functional FGF-4 derivative means a chemically modified FGF-4 protein, in which one or more substituents have been covalently attached to the protein. A functional FGF-4 derivative retains at least 25, 50, or 80%activity compared to FGF-4.

A derivative of a FGF-4 analogue is thus a FGF-4 compound comprising at least one amino acid modification and at least one non-amino acid subtituent covalently attached that retains at least 25, 50, 80%, 85%, 90%, or 95%activity compared to FGF-4.

Substitutions: In one aspect amino acids may be substituted by conservative substitution. The term "conservative substitution" as used herein denotes that one or more amino acids are replaced by another, biologically similar residue. Examples include substitution of amino acid residues with similar characteristics, e.g. small amino acids, acidic amino acids, polar amino acids, basic amino acids, hydrophobic amino acids and aromatic amino acids.

In one aspect amino acids may be substituted by non-conservative substitution. The term "non-conservative substitution" as used herein denotes that one or more amino acids are replaced by another amino acid having different characteristics. Examples include substitution of a basic amino acid residue with an acidic amino acid residue, substitution of a polar amino acid residue with an aromatic amino acid residue, etc. In one aspect, the non-conservative substitution is substitution of a coded amino acid to another coded amino acid having different characteristics.

Deletions and Truncations: In one aspect, the FGF-4 compound may have one or more amino acid residues deleted from the amino acid sequence of FGF-4 (e.g. SEQ ID NO: 1) , alone or in combination with one or more insertions or substitutions.

Insertions: In one aspect, the FGF-4 compound may have one or more amino acid residues inserted into the amino acid sequence of FGF-4, alone or in combination with one or more deletions and/or substitutions.

In one aspect, the FGF-4 compound may include insertions of one or more unnatural amino acids and/or non-amino acids into the sequence of FGF-4.

The term “protein” or “polypeptide” , as e.g. used herein, refers to a compound which comprises a series of amino acids interconnected by amide (or peptide) bonds. Amino acids are molecules containing an amine group and a carboxylic acid group, and, optionally, one or more additional groups, often referred to as a side chain.

The term "amino acid" includes coded (or proteinogenic or natural) amino acids (amongst those the 20 standard amino acids) , as well as non-coded (or non-proteinogenic or non-natural) amino acids. Coded amino acids are those which are naturally incorporated into proteins. The standard amino acids are those encoded by the genetic code. Non-coded amino acids are either not found in proteins, or not produced by standard cellular machinery (e.g., they may have been subject to post-translational modification) . In what follows, all amino acids of the FGF-4 compound for which the optical isomer is not stated is to be understood to mean the L-isomer (unless otherwise specified) .

As is apparent from the above, amino acid residues may be identified by their full name, their one-letter code, and/or their three-letter code. These three ways are fully equivalent. For the reader's convenience, the single and three letter amino acid codes are provided below:

Glycine: G and Gly; Proline: P and Pro; Alanine: A and Ala; Valine: V and Val; Leucine: L and Leu; Isoleucine: I and Ile; Methionine: M and Met; Cysteine: C and Cys; Phenylalanine: F and Phe; Tyrosine: Y and Tyr; Tryptophan: W and Trp; Histidine: H and His; Lysine: K and Lys; Arginine: R and Arg; Glutamine: Q and Gin; Asparagine: N and Asn; Glutamic Acid: E and Glu; Aspartic Acid: D and Asp; Serine: S and Ser; and Threonine: T and Thr.

The words "protein" , "peptide" , and "polypeptide" are used interchangeably to denote an amino acid polymer or a set of two or more interacting or bound amino acid polymers.

The terms "identical" or percent "identity, " in the context of two or more nucleic acids, or two or more polypeptides, refer to two or more sequences or sub sequences that are the same or have a specified percentage of nucleotides, or amino acids, that are  the same (i.e., about 60%identity, preferably 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or higher identity over a specified region, when compared and aligned for maximum correspondence over a comparison window or designated region) as measured using a BLAST or BLAST 2.0 sequence comparison algorithms with default parameters described below, or by manual alignment and visual inspection. See e.g., the NCBI web site at ncbi. nlm. nih. gov/BLAST. Such sequences are then said to be "substantially identical. " This definition also refers to, or may be applied to, the compliment of a nucleotide test sequence. The definition also includes sequences that have deletions and/or additions, as well as those that have substitutions. Algorithms can account for gaps and the like. Identity generally exists over a region that is at least about 25 amino acids or nucleotides in length, or over a region that is 50-100 amino acids or nucleotides in length.

The polypeptide and coding sequences of FGF-4 are known for a number of animals and publically available from the NCBI website. FGF-4 compounds that can be used in the invention include full length human FGF-4, species homo logs thereof, and functional fragments thereof. Additional FGF-4 compounds that can be used include modified versions of FGF-4, functional analogues of FGF-4, and functional FGF-4 derivatives with substantial identity to FGF-4.

Pharmaceutically acceptable salt, amide, or ester

Salts are e.g. formed by a chemical reaction between a base and an acid, e.g. : 2NH ₃ + H ₂SO ₄ → (NH4)  ₂SO4.

The salt may be a basic salt, an acid salt, or it may be neither nor (i.e. a neutral salt) . Basic salts produce hydroxide ions and acid salts hydronium ions in water.

The salts may be formed with added cations or anions between anionic or cationic groups, respectively.

Non-limiting examples of anionic groups include free carboxylic groups. A peptide often includes a free carboxylic acid group at the C-terminus, and it may also include free carboxylic groups at internal acid amino acid residues such as Asp and Glu.

Non-limiting examples of cationic groups in a peptide include the free amino group at the N-terminus, if present, as well as any free amino group of internal basic amino acid residues such as His, Arg, and Lys.

The ester may, e.g., be formed by the reaction of a free carboxylic acid group with an alcohol or a phenol, which leads to replacement of at least one hydroxyl group by an alkoxy or aryloxy group. The ester formation may involve the free carboxylic group at the C-terminus of a peptide.

The amide may, e.g., be formed by the reaction of a free carboxylic acid group with an amine or a substituted amine, or by reaction of a free or substituted amino group with a carboxylic acid.

In a particular embodiment, the FGF-4 compound is in the form of a pharmaceutically acceptable salt. In another particular embodiment, the FGF-4 compound is in the form of a pharmaceutically acceptable amide, preferably with an amide group at the C-terminus of the peptide. In a still further particular embodiment, the FGF-4 compound is in the form a pharmaceutically acceptable ester.

Pharmaceutical compositions

Pharmaceutical compositions comprising a FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide, or ester thereof, and a pharmaceutically acceptable excipient may be prepared as is known in the art.

The term "excipient" broadly refers to any component other than the active therapeutic ingredient (s) . The excipient may be an inert substance, an inactive substance, and/or a not medicinally active substance.

The excipient may serve various purposes, e.g. as a carrier, vehicle, diluent, tablet aid, and/or to improve administration, and/or absorption of the active substance.

The formulation of pharmaceutically active ingredients with various excipients is known in the art, see e.g. Remington: The Science and Practice of Pharmacy (e.g. 19 ^th edition (1995) , and any later editions) .

Method of treatment

The FGF-4 compound described herein can be used to treat metabolic disorders, e.g., type 2 diabetes, insulin insensitivity, glucose intolerance, obesity, dyslipidaemia and conditions related thereto. Related to the obesity application, the FGF-4 compound can also be used to reduce percentage body fat, increase the percentage of lean mass, increase energy expenditure, treat bulimia and treat binge-eating in an individual. Related to the diabetes application, the FGF-4 compound can also be used to delay the progression from impaired glucose tolerance (IGT) to type 2 diabetes and delay the progression from type 2 diabetes to insulin-requiring diabetes in an individual.

The term "metabolic disorder" is used broadly herein to refer to the conditions, diseases, and disorders associated with insulin and/or glucose dysregulation. Metabolic disorders include type 2 diabetes, insulin insensitivity, glucose intolerance, elevated blood glucose levels, obesity, high percent body fat, dyslipidaemia, etc.

"Subject, " "patient, " "individual" and like terms are used interchangeably and refer to, except where indicated, mammals such as humans and non-human primates, as  well as livestock and companion animals. The term does not necessarily indicate that the subject has been diagnosed with a metabolic disorder, but typically refers to an individual under medical supervision. A patient can be an individual that is seeking treatment, monitoring, adjustment or modification of an existing therapeutic regimen, etc. The terms can refer to an individual that has been diagnosed, is currently following a therapeutic regimen, or is at risk of developing a metabolic disorder, e.g., due to family history, sedentary lifestyle, etc.

The terms "therapy, " "treatment, " and "amelioration" refer to any reduction in the severity of symptoms. In the case of treating metabolic disorders, the terms can refer to reducing blood glucose, increasing insulin sensitivity, reducing body weight, reducing percent body fat, increasing percent lean mass, reducing side effects of associated therapies, etc. As used herein, the terms "treat" and "prevent" are not intended to be absolute terms. Treatment can refer to any delay in onset, amelioration of symptoms, improvement in patient survival, increase in survival time or rate, etc. The effect of treatment can be compared to an individual or pool of individuals not receiving the treatment, or to the same patient prior to treatment or at a different time during treatment. In some aspects, the severity of disease is reduced by at least 10%, as compared, e.g., to the individual before administration or to a control individual not undergoing treatment. In some aspects the severity of disease is reduced by at least 25%, 50%, 75%, 80%, or 90%, or in some cases, no longer detectable using standard diagnostic techniques.

The terms "effective amount, " "effective dose, " "therapeutically effective amount" , etc. refer to that amount of the therapeutic agent sufficient to ameliorate a disorder, as described above. For example, for the given parameter, a therapeutically effective amount will show an increase or decrease of therapeutic effect at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, or at least 100%. Therapeutic efficacy can also be expressed as "-fold" increase or decrease. For example, a therapeutically effective amount can have at least a 1.2-fold, 1.5-fold, 2-fold, 5-fold, or more effect over a control.

Impaired glucose intolerance is defined as a two-hour glucose levels (glycemia) of about 140 to about 199 mg/dL (7.8 to 11.0 mmol) on the 75 g oral glucose tolerance test (according to WHO and ADA) . Glycemia of about 200 mg/dl or greater is considered diabetes mellitus.

Hyperglycemia, or high blood sugar, can be defined as a blood glucose level higher than about 7, about 10, about 15, or about 20 mmol/L.

Hypoglycemia, or low blood sugar, can be defined as preprandial blood glucose below about 4 or about 6 mmol/L (72 to 108 mg/dl) or 2-hour postprandial blood glucose below about 5 or about 8 mmol/L (90 to 144 mg/dl) .

Insulin resistance is defined as a state in which a normal amount of insulin produces a subnormal biologic response. Insulin resistance can be measured by the hyperinsulinemic euglycemic clamp technique, Homeostatic Model Assessment (HOMA) , or Quantitative insulin sensitivity check index (QUICKI) .

Generally, all subjects suffering from obesity are also considered to be suffering from overweight. In some embodiments the subject suffering from obesity is human, such as an adult human or a paediatric human (including infants, children, and adolescents) . Body mass index (BMI) is a measure of body fat based on height and weight. The formula for calculation is BMI = weight in kilograms/height in meters ². A human subject suffering from obesity has a BMI of ≥30; this subject may also be referred to as obese. In some embodiments the human subject suffering from obesity has a BMI of ≥35 or a BMI in the range of ≥30 to <40. In some embodiments the obesity is severe obesity or morbid obesity, wherein the human subject has a BMI of ≥40.

Mode of administration

The invention provides methods of treating, preventing, and/or ameliorating a metabolic disorder in a subject in need thereof. The course of treatment is best determined on an individual basis depending on the particular characteristics of the subject. The treatment can be administered to the subject on a daily, twice daily, every other day, bi-weekly, weekly, monthly or any applicable basis that is therapeutically effective.

The suitability of a particular route of administration will depend in part on the pharmaceutical composition, its components, and the disorder being treated. The route of administration may be any route which effectively transports a compound to the desired or appropriate place in the body, such as parenterally, for example, subcutaneously, intramuscularly or intraveneously. Alternatively, a compound can be administered orally, pulmonary, rectally, transdermally, buccally, sublingually, or nasally.

The dosage of a therapeutic agent administered to a patient will vary depending on a wide range of factors. For example, it would be necessary to provide substantially larger doses to humans than to smaller animals. The dosage will depend upon the size, age, sex, weight, medical history and condition of the patient, use of other therapies, the potency of the substance being administered, and the frequency of administration.

Production processes

The FGF-4 compound may be generated, isolated, and/or purified by any means known in the art. For standard recombinant methods, see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989) ; Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) ; Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982) .

The FGF-4 compound can be expressed recombinantly using routine techniques in the field of recombinant genetics. Standard techniques are used for cloning, DNA and RNA isolation, amplification and purification. Generally enzymatic reactions involving DNA ligase, DNA polymerase, restriction endonucleases and the like are performed according to the manufacturer's specifications. Basic texts disclosing the general methods of use in this invention include Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007 with updated through 2010) Current Protocols in Molecular Biology, among others known in the art.

Once the FGF-4 compound has been expressed in a host organism it may be recovered and purified to the required quality by conventional techniques. Non-limiting examples of such conventional recovery and purification techniques are centrifugation, solubilization, filtration, precipitation, ion-exchange chromatography, immobilized metal affinity chromatography (IMAC) , Reversed phase -High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) , gel-filtration and freeze drying.

The articles "a" and "an" are used herein to refer to one or to more than one (i.e., to at least one) of the grammatical object of the article.

PARTICULAR EMBODIMENTS

The invention is further described by the following non-limiting embodiments of the invention:

1. An FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof, for use in the prevention and/or treatment of a metabolic disorder.

2. The compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof according to embodiment 1, wherein the metabolic disorder is selected from the group consisting of elevated blood glucose, impaired glucose tolerance, insulin resistance, type II diabetes, type I diabetes, maturity onset diabetes of the young (MODY) , obesity, elevated percent body fat, and dyslipidemia.

3. The compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof according to  embodiment  1 or 2, wherein the metabolic disorder is type II diabetes.

4. The compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof according to  embodiment  1 or 2, wherein the metabolic disorder is obesity.

5. An FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof, for use in reducing fed blood glucose, reducing fasting blood glucose, improving insulin sensitivity, improving glucose tolerance, reducing body weight, or reducing food intake.

6. The compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof according to any one of embodiments 1-5, wherein the FGF-4 compound is a functional fragment of FGF-4.

7. The compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof according to any one of embodiments 1-6, wherein the FGF-4 compound is a functional analogue of FGF-4.

8. The compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof according to any one of embodiments 1-7, wherein the FGF-4 compound is a functional derivative of FGF-4.

9. The compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof according to any one of embodiments 1-8, wherein the FGF-4 compound is a human FGF-4 molecule.

10. The compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof according to embodiment 9, wherein the FGF-4 compound has the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 2.

11. A pharmaceutical composition comprising an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof, and one or more pharmaceutically acceptable excipients.

12. A method of prevention and/or treatment of a metabolic disorder comprising the step of administering a therapeutically effective amount of an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof to a subject in need thereof.

13. The method according to embodiment 12, wherein the metabolic disorder is selected from the group consisting of elevated blood glucose, impaired glucose tolerance, insulin resistance, type II diabetes, type I diabetes, maturity onset diabetes of the young (MODY) , obesity, elevated percent body fat, and dyslipidemia.

14. The method according to embodiment 12, wherein the metabolic disorder is type II diabetes.

15. The method according to embodiment 12, wherein the metabolic disorder is obesity.

16. A method of reducing fed blood glucose, reducing fasting blood glucose, improving insulin sensitivity, improving glucose tolerance, reducing body weight, or reducing food intake, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof to a subject in need thereof.

17. The method according to any one of embodiments 12-16, wherein the FGF-4 compound is a functional fragment of FGF-4.

18. The method according to any one of embodiments 12-17, wherein the FGF-4 compound is a functional analogue of FGF-4.

19. The method according to any one of embodiments 12-18, wherein the FGF-4 compound is a functional derivative of FGF-4.

20. The method according to any one of embodiments 12-19, wherein the FGF-4 compound is a human FGF-4 molecule.

21. The method according to any one of embodiments 12-20, wherein the FGF-4 compound has the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 2.

22. Use of an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof in the manufacture of a medicament for the prevention and/or treatment of a metabolic disorder.

23. The use according to embodiment 22, wherein the metabolic disorder is selected from the group consisting of elevated blood glucose, impaired glucose tolerance, insulin resistance, type II diabetes, type I diabetes, maturity onset diabetes of the young (MODY) , obesity, elevated percent body fat, and dyslipidemia.

24. The use according to embodiment 22, wherein the metabolic disorder is type II diabetes.

25. The use according to embodiment 22, wherein the metabolic disorder is obesity.

26. Use of an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof in the manufacture of a medicament for reducing fed blood glucose, reducing fasting blood glucose, improving insulin sensitivity, improving glucose tolerance, reducing body weight, or reducing food intake.

27. The use according to any one of embodiments 22-26, wherein the FGF-4 compound is a functional fragment of FGF-4.

28. The use according to any one of embodiments 22-27, wherein the FGF-4 compound is a functional analogue of FGF-4.

29. The use according to any one of embodiments 22-28, wherein the FGF-4 compound is a functional derivative of FGF-4.

30. The use according to any one of embodiments 22-29, wherein the FGF-4 compound is a human FGF-4 molecule.

31. The use according to any one of embodiments 22-30, wherein the FGF-4 compound has the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 2.

EXAMPLES

List of Abbreviations

FGF -fibroblast growth factor

hFGF-4 -human fibroblast growth factor

HPLC -High performance liquid chromatography

SDS-PAGE -Sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis

IMAC -immobilized metal affinity chromatography

SEC -size exclusion chromatography

MS -mass spectrometry

HFD -high fat diet

RT –room temperature

i.p. -intraperitoneal injection

s.c. -subcutaneous injection

p.o. -oral administration

i.v. -intravenous injection

In this description, Greek letters may be represented by their symbol or the corresponding written name, for example: α = alpha; β = beta; ε = epsilon; γ = gamma; ω = omega; Δ = delta; etc. Also, the Greek letter of μ may be represented by "u" , e.g. in μl=ul, or in μM=uM.

Statistical analysis: all values are given as means ± standard deviation (SD) (Table 6) or means ± standard error of the mean (SEM) (Table 1-5) . The t-test or ANOVA was used to assess the significance of data. Differences were considered to be statistically significant when P < 0.05.

Example-1: Production of the human FGF-4

The truncated protein human FGF-4 was produced according to the sequence shown as below:

SLARLPVAAQPKEAAVQSGAGDYLLGIKRLRRLYCNVGIGFHLQALPDGRIGGAHADTRDS LLELSPVERGVVSIFGVASRFFVAMSSKGKLYGSPFFTDECTFKEILLPNNYNAYESYKYPGMFIALSK NGKTKKGNRVSPTMKVTHFLPRL (SEQ ID NO: 2) .

Nucleic acid sequence encoding the truncated protein human FGF-4 was cloned onto pET11a expression vector, which has an extra methionine at the N-terminus. The methionine was removed later during expression. To express the protein, the plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3 knockout) strain. The bacteria was grown in TB (Terrific Broth) medium at 37℃ to OD600≈0.6-1 and the expression was induced with 0.5 mM IPTG for 4 hours at 37℃ before the cells were harvested by centrifugation. The  cell pellet was lysed in 20 mM PB, 5mM EDTA and 0.1%Tween pH 8.0. After cell disruption, 8M Urea was added to the final concentration of 2M and followed by clarification using high speed centrifugation. The clarified solution was applied to Q FF in flow through mode, and hFGF-4 was recovered from the flow through from Q FF purification, which was followed by Heparin affinity chromatography. The fraction pool from the Heparin affinity purification was further purified and buffer exchanged using SEC (size exclusion chromatography) column. 37mg of protein was produced from 2L shake flask culture. Fig. 1, Fig. 2 and Fig. 3 show SDS-PAGE, SEC-HPLC size and MW by LC-MS of the purified hFGF-4, respectively.

Example-2: 4-day study of blood glucose, body weight and food intake in db/db

11 weeks old diabetic db/db mice (BKS. Cg-Dockm +/+ Leprdb /J 000642, from Jackson Laboratory U.S.A. ) with fed blood glucose levels above 16mM were divided into 3 groups, and received daily s.c. injection of vehicle (PBS) or hFGF-4 at 1mg/kg or hFGF-4 at 3mg/kg (prepared according to Example-1) for 4 days. Daily fed blood glucose, body weight and food intake were measured prior to compound injection in the morning. For the 6-hour time course of blood glucose, blood glucose levels were measured prior to compound injection and 1, 2, 4, 6 hours after compound injection. Animals were group housed as 3-5 mice per cage, and food intake per mouse was calculated by dividing the food intake per cage by the number of mice in the cage.

Results: blood glucose (Fig. 4A and Fig. 4B, Table 1 and 2) and food intake (Fig. 5A, Table 3) of db/db mice were dose dependently reduced by hFGF-4 treatment of 4 days, and body weight (Fig. 5B, Table 4) was reduced by hFGF-4 at 3mg/kg.

Table 1: 6-hour blood glucose levels (mM) of db/db mice receiving hFGF-4

**p<0.01, ***p<0.001 vs. vehicle, two-way ANOVA, Dunnett's multiple comparisons test.

Table 2: The daily blood glucose levels (mM) of db/db mice receiving hFGF-4

***p<0.001 vs. vehicle, two-way ANOVA, Dunnett's multiple comparisons test.

Table 3: The daily food intake (g) of db/db mice receiving hFGF-4

***p<0.001 vs. vehicle, two-way ANOVA, Dunnett's multiple comparisons test

Table 4: The 4-day body weight (g) reduction of db/db mice receiving hFGF-4

Group	body weight reduction (g)
Vehicle (n=8)	0.57±0.07
FGF4 3mg/kg (n=8)	3.32±0.23***
FGF4 1mg/kg (n=8)	0.22±0.24

***p<0.001 vs. vehicle, one-way ANOVA, Dunnett's multiple comparisons test

Example-3: 2-week study of blood glucose in db/db

Methods: 11 weeks old diabetic db/db mice (BKS. Cg-Dockm +/+ Leprdb /J 000642, from Jackson Laboratory U.S.A. ) with fed blood glucose levels above 16mM were divided into 2 groups, and received daily s.c. injection of vehicle (PBS) or hFGF-4 (prepared according to Example-1) at 1mg/kg for 16 days. Morning fed blood glucose was measured three times a week prior to injection.

Results: blood glucose of db/db mice was normalized and maintained during hFGF-4 treatment of 16 days (Fig. 6, Table 5) .

Table 5: The daily blood glucose levels (mM) of db/db receiving daily dosing of hFGF-4

*p<0.05, ***p<0.001 vs. vehicle, two-way ANOVA, Sidak's multiple comparisons test.

Example 4: activity of hFGF-4 on individual FGF receptors

Seven BaF3 stable cell lines expressing each of the FGF receptor (FGFR) splicing variants, including FGFR1c (NM_015850.3) , FGFR2c (NM_000141.4) , FGFR3c (NM_000142.4) , FGFR1b (J Biol Chem. 1994 Apr 15; 269 (15) : 11620-7) , FGFR2b (NM_022970.3) , FGFR3b (NM_001163213.1) and FGFR4 (NM_002011.4) , were generated. FGFR4 sequence used was a chimeric receptor sequence comprising FGFR4 extra cellular domain fused with FGFR1c transmembrane and intracellular domain.

The receptor activation potency was characterized by measurement of ERK phosphorylation signal on individual FGF receptor expressing Baf3 cell line after 15 min treatment. The EC ₅₀ was employed to compare receptor activation potency. The study demonstrated that hFGF-4 could potently activate all FGF receptors except for FGFR3b (Fig. 7) . A summary table of EC ₅₀ of FGF-4 on individual FGF receptor is demonstrated in Table 1.

The day before experiment, cells were seeded at 300,000 cells/well with 50 μl phenol free RPMI1640 medium (Gibco, cat no: 11835) supplemented with 0.02%Tween20 (Merck, cat no: S6386784206) and 10 μg/ml Heparin (Sigma, cat no: H3149) in 96-well plates (Falcon, cat no: 353072) . The cells were treated by 50 μl of hFGF-4 (prepared according to Example 1) at a series of concentrations (5 fold serial dilution titrated down from 5×10 ^-7 M) in assay medium for 15 min at 37℃. Cells were then lysed with 25 μl of 5xLysis buffer and agitated on a plate shaker (～350 rpm) for 30 minutes. The lysate was analyzed for ERK phosphorylation signal using AlphaScreen Surefire kit (PerkinElmer, cat no: TGRES10K) following recommended protocol by manufacturer. Specifically, 4 μL of the lysate was transferred to a 384-well Proxiplate (PerkinElmer, cat no:6008289) and mixed with 7μl of reaction mix (60 parts Reaction buffer + 10 parts Activation Buffer + 1 part Donor beads + 0.5 part Acceptor beads) . The plate was sealed with TopSeal-A adhesive film (PerkinElemer, cat no: 6050173. ) , agitated gently on plate shaker for 5 min, and then incubated at RT for 4 h (protected from light) before reading on an Envision plate reader (PerkinElemer, cat no: 2104-0010A) . Data were analysed with GraphPad Prism version 7. Concentrations were log transformed and the data were fitted with non-linear curve fit log [agonist] vs response (four parameters) to obtain log (EC ₅₀) values. EC ₅₀ values were calculated based on log (EC ₅₀) values (Table 6) .

Table 6: pERK activity of hFGF-4 on FGFRs

Note: all values are averaged from 3 independent experiments.

Example 5: metabolic effects of hFGF-4 on adipocytes

Differentiated 3T3-L1 MBX adipocytes (

CRL-3242 ^TM) in 96-well plate were treated overnight with hFGF-4 (prepared according to Example 1) at indicated concentrations in phenol red free, glucose free, glutamine-free DMEM (Gibco, #A1443001) supplemented with 1%PS and 5 μg/ml heparin.

Glucose uptake was measured by Glucose Uptake-Glo ^TM Assay kit (Promega, #J1343) following recommended protocol by manufacturer. Briefly, cells were incubated with 0.5 mM 2DG in 50 μl PBS for 10 min at RT before the addition of 25 μl stop buffer. The plate was shortly shaken before the addition of 25 μl neutralization buffer. Then the plate was shortly shaken again followed by the addition of 100 μl 2DG6P detection reagent. After that, the plate was shortly shaken and then incubated for 1 hour at RT before reading on an Envision plate reader (PerkinElemer, #2104-0010A) . Data were analysed with GraphPad Prism version 7. The assay result (Fig. 8A) showed that hFGF-4 stimulated glucose uptake in differentiated 3T3-L1 adipocytes.

Glut1 mRNA level was measured by Power

Green Cells-to-CT ^TM Kit (Thermofisher, #4402955) following recommended protocol by manufacturer. Briefly, cells were lysed in 50 μl lysis solution and the lysate was shaked for 5-10 min at RT. 5 μl stop solution was added to each well and the lysate was shaked for another 2 min at RT. 10 μl cell lysate was added to 40 μl reverse transcription mix (25 parts RT buffer + 2.5 parts RT enzyme + 12.5 parts nuclase-free water) . Then the plate was incubated at 37℃ for 60 min before the reaction was terminated by heating at 95℃ for 5 min. 2 μl RT product was added to 8 μl PCR reaction mix (5 parts 2 x SYBRGreen PCR mix + 0.5 parts primer with final concentration at 500 nM + 2.5 parts ddH2O) . qPCR was run by Applied Biosystems ViiA7 instrument and data were analysed with GraphPad Prism version 7. Data in Fig. 8B showed that hFGF-4 upregulated Glut1 expression in 3T3-L1 differentiated adipocytes.

Example 6: metabolic effects of hFGF4 in hepatocytes

H4IIE cells were seeded in 96-well plate at 30000 cells/well in DMEM GlutaMAX medium (Gibco #10569010) supplemented with 10%FBS and 1%PS.

For glucose output assay, cells were cultured for 1 day before starved overnight in DMEM GlutaMAX medium (Gibco #10569010) supplemented with 1M Sodium lactate, 100 mM sodium pyruvate and 1%PS. After that, cells were treated with hFGF-4 in freshly changed starvation medium for 24 hours and the glucose accumulation in the medium was quantified with Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit (Invitrogen, #A22189) following recommended protocol by manufacturer. Briefly, 400 mM glucose stock solution was diluted by 1X reaction buffer to get a serial dilutions of glucose  standard from 0 to 200 μM. 50 μL Amplex Red working solution (100 μM

Red reagent, 0.2 U/ml HRP and 2 U/ml glucose oxidase) was mixed with 50 μl glucose standard or experimental medium in a black microplate. The plate was incubated at RT for 30 minutes (protected from light) before the fluorescence emission was detected at 590 nm. The glucose concentration was calculated from the standard curve and data were analysed with GraphPad Prism version 7. The result (fig. 9A) demonstrated that FGF4 suppressed glucose production in H4IIE hepatoytes.

Pck1 and G6pc expression was then measured by qPCR. H4IIE cells were cultured for 1 day before starved overnight in DMEM GlutaMAX medium (Gibco #10569010) supplemented with 0.1%FBS and 1%PS. The cells were treated with hFGF-4 in freshly changed starvation medium for 6 hours and the Pck1 mRNA level was measured by Power

Green Cells-to-CT ^TM Kit (Thermofisher, #4402955) following recommended protocol by manufacturer. Briefly, cells were lysed in 25 μl lysis solution and the lysate was shaked for 5-10 min at RT. 2.5 μl stop solution was added to each well and the lysate was shaked for another 2 min at RT. 5 μl cell lysate was added to 20 μl reverse transcription mix (25 parts RT buffer + 2.5 parts RT enzyme + 12.5 parts nuclase-free water) . Then the plate was incubated at 37℃ for 60 min before the reaction was terminated by heating at 95℃ for 5 min. 2 μl RT product was added to 8 μl PCR reaction mix (5 parts 2 x SYBRGreen PCR mix + 0.5 parts primer with final concentration at 500 nM + 2.5 parts ddH ₂O) . qPCR was run by Applied Biosystems ViiA7 instrument and data were analysed with GraphPad Prism version 7. hFGF-4 clearly suppresed Pck1 and G6pc expression in H4IIE hepatocytes in a dose dependent manner (Fig. 9B, 9C) .

Claims (15)

1. An FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof, for use in the prevention and/or treatment of a metabolic disorder.
2. The compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof according to claim 1, wherein the metabolic disorder is selected from the group consisting of elevated blood glucose, impaired glucose tolerance, insulin resistance, type II diabetes, type I diabetes, maturity onset diabetes of the young (MODY) , obesity, elevated percent body fat, and dyslipidemia.
3. An FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof, for use in reducing fed blood glucose, reducing fasting blood glucose, improving insulin sensitivity, improving glucose tolerance, reducing body weight, or reducing food intake.
4. The compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof according to any one of claims 1-3, wherein the FGF-4 compound is a functional fragment of FGF-4.
5. The compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof according to any one of claims 1-4, wherein the FGF-4 compound is a functional analogue of FGF-4.
6. The compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof according to any one of claims 1-5, wherein the FGF-4 compound is a functional derivative of FGF-4.
7. The compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof according to any one of claims 1-6, wherein the FGF-4 compound is a human FGF-4 molecule.
8. The compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof according to claim 7, wherein the FGF-4 compound has the amino acid sequence shown as SEQ ID NO: 2.
9. A pharmaceutical composition comprising an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof, and one or more pharmaceutically acceptable excipients.
10. A method of prevention and/or treatment of a metabolic disorder comprising the step of administering a therapeutically effective amount of an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof to a subject in need thereof.
11. The method according to claim 10, wherein the metabolic disorder is selected from the group consisting of elevated blood glucose, impaired glucose tolerance, insulin resistance, type II diabetes, type I diabetes, maturity onset diabetes of the young (MODY) , obesity, elevated percent body fat, and dyslipidemia.
12. A method of reducing fed blood glucose, reducing fasting blood glucose, improving insulin sensitivity, improving glucose tolerance, reducing body weight, or reducing food intake, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof to a subject in need thereof.
13. Use of an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof in the manufacture of a medicament for the prevention and/or treatment of a metabolic disorder.
14. The use according to claim 13, wherein the metabolic disorder is selected from the group consisting of elevated blood glucose, impaired glucose tolerance, insulin resistance, type II diabetes, type I diabetes, maturity onset diabetes of the young (MODY) , obesity, elevated percent body fat, and dyslipidemia.
15. Use of an FGF-4 compound or a pharmaceutically acceptable salt, amide or ester thereof in the manufacture of a medicament for reducing fed blood glucose, reducing fasting blood glucose, improving insulin sensitivity, improving glucose tolerance, reducing body weight, or reducing food intake.

Images