WO2018101781A1 - Species identifying marker and primer set based on complete sequencing of chloroplast genome and nuclear ribosomal dna sequence of aloe vera, aloe saponaria, and aloe saengjang, and use thereof - Google Patents

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김권희
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김권희
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to complete translation based species identification markers and primer sets and use thereof of the chloroplast genome and nuclear ribosomal DNA sequences of Aloe vera, Aloe saponaria and Aloe growth.
  • Aloe is a succulent plant native to Africa. Aloe is a plant native to South Africa, Madagascar and Arabia, mainly in the African continent and neighboring islands. The leaves are thick, sword-shaped, with thorns on the edges, and have orange or pink flowers. Since it contains a large amount of ingredients useful for the human body such as alloin and saponin, it has been developed and used in medicine, health supplement foods, and cosmetics since ancient times. More than 600 species of Aloe are known, but currently edible aloe is on the order of Aloe vera (Aloe vera), aloe borane are sense (Aloe arborescens), aloe sand paper or Syrian (Aloe saponaria).
  • Plant species differentiation used to date include morphological characteristics, qualitative and quantitative analysis of components, and comparison of differences at the DNA level.
  • the morphological characteristics may show differences depending on the growth environment of the plant, which makes it difficult to identify the plant species.
  • taste sensor and nuclear magnetic resonance spectrometer were used to distinguish by component analysis.
  • this method has a limitation that components can be affected by the cultivation environment of the production site.
  • molecular biological plant species identification using polymorphism of DNA fragments such as random amplified polymorphic DNA (RAPD), sequence characterized amplified regions (SCAR), and amplified fragment length polymorphism (AFLP) has been attempted.
  • RAPD random amplified polymorphic DNA
  • SCAR sequence characterized amplified regions
  • AFLP amplified fragment length polymorphism
  • nrDNA-ITS internal transcribed spacer region of the Nuclear Ribosomal DNA (nrDNA) on the genome not only evolves faster than the coding regions of other genes, but also because of the advantages of generality, simplicity and reproducibility. It is known as a nucleotide sequence that is widely used for classification and searching for genetic variation between species.
  • the present inventors analyzed the chloroplast genome of Aloe vera, Aloe saponaria and Aloe growth and the entire sequence of 45S nrDNA, and compared the sequencing, thereby efficiently identifying eight aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth. Molecular markers have been developed.
  • Korean Patent No. 140207 discloses' mass spectrometry-based metabolite profiling and biomarkers thereof of various sizes of Aloe Vera '
  • Korean Patent No. 1508744 discloses' chloroplast DNA marker for cabbage and crop species determination. And a method for discriminating using the same, but a complete set of species identification markers and primer sets based on the aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth and nuclear ribosome DNA sequences of the present invention and their use are described. none.
  • the present invention was derived by the above-mentioned requirements, and the present inventors completed and analyzed the chloroplast genome and nuclear ribosomal DNA (nrDNA) whole sequences of aloe vera, aloe saponaria and aloe growth, and completed the sequence of the completed sequencing. A total of eight markers were prepared by comparing the information, and DNA samples were analyzed by preparing primer sets capable of amplifying the molecular markers. As a result, the molecular markers of the present invention were grown in aloe vera, aloe saponaria, and aloe. By confirming that can be clearly distinguished, the present invention was completed.
  • nrDNA chloroplast genome and nuclear ribosomal DNA
  • the present invention is an oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 1 and 2, oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 3 and 4, oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 5 and 6, oligo of SEQ ID NO: 7 and 8 Nucleotide primer set, oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 9 and 10, oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 11 and 12, oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 13 and 14, and oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 15 and 16
  • a primer set for distinguishing aloe vera, aloe saponaria and aloe growth comprising at least one primer set selected from is provided.
  • the present invention also provides a kit for distinguishing aloe vera, aloe saponaria and aloe growth, comprising the primer set and a reagent for carrying out the amplification reaction.
  • the present invention also provides a method for distinguishing aloe vera, aloe saponaria and aloe growth using the primer set.
  • Molecular markers of the present invention are found in an area where there are hundreds or thousands of copies in a cell, but very rarely exists in species variation, and can be verified very stable.Aloe vera and aloe are more cost-effective and efficient than conventional methods. Saponaria and aloe growth can be identified and its utilization is high. In addition, since raw materials can be discriminated from aloe grown products, it is possible to improve the value of aloe grown processed products, and can be used for maintaining the purity of aloe growth, protecting varieties, and resolving seed disputes.
  • Aloe vera Aloe vera
  • Aloe saponaria Aloe saponaria
  • Saeng Jang aloe grow.
  • Aloe vera Aloe saponaria and Aloe growth.
  • Aloe vera Aloe vera
  • Aloe saponaria Aloe saponaria
  • Saeng Jang aloe grow.
  • Figure 3 shows the results of excavation between the regions of the species through a comparative analysis of 45S nrDNA sequence of aloe vera, aloe saponaria and aloe growth.
  • Iris gate when the child (Iris gatesii) was used out of the group (outgroup).
  • 5 is a phylogenetic analysis of three aloes based on 45S nrDNA sequence.
  • Figure 6 shows the results of 45S nrDNA sequence comparison analysis of aloe vera, aloe growth, aloe saponaria.
  • Aloe_d_13 aloe vera specific markers
  • Aloe_d_5,17 Aloe growth specific marker.
  • Aloe_h_1 aloe saponaria specific markers
  • Aloe_h_10 Aloe vera specific marker.
  • the present invention provides a primer set for distinguishing aloe vera, aloe saponaria and aloe growth.
  • Aloe Vera (Aloe vera) belongs to the fastest growing section during 1-2 years after growing only deodiji two years, the flowers come up with a long spine, regardless of the season of the year smokes a yellow or reddish orange flowers. When eaten, the bitter taste is strong, and when peeled and eaten, it's tasteless and odorless.
  • Aloe saponaria is a small species of aloe that grows on the ground and has light leaves with white spots. Flower beds rise long and bloom red-colored flowers. The bark has no bitter taste, so only the thorns are used.
  • Aloe growth (also used as a 'growing aloe') is a cultivated plant that combines aloe vera and aloe saponaria. It is a new breed that has grown naturally through inbred breeding by inducing natural hybrids and obtaining seedlings. Compared to aloe vera, the plant height is lower, the number of leaves is high, and there are white spots in the pale green leaves, and the leaves are thin and soft, so that the aloe leaves can be ground for drinking without removing the peel. In particular, new varieties of aloe may be difficult to distinguish from aloe vera or aloe saponaria by naked eyes during processing or distribution.
  • the present inventors have developed eight molecular markers that can efficiently identify aloe vera, aloe saponaria and aloe growth.
  • the marker consists of three insertion-deletion (Indel), three derived cleaved amplified polymorphic sequences (dCAPs) and two high resolution melting (HRM) marker types (see Table 6).
  • the primer sets of the present invention are oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2, oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 3 and 4, oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 5 and 6, oligonucleotide primers of SEQ ID NOs: 7 and 8 Set, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 9 and 10, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 11 and 12, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 13 and 14, and an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 15 and 16 It may comprise one or more primer sets.
  • the primer set of the present invention comprises (a) an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 1 and 2, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 3 and 4, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 5 and 6, and SEQ ID NOs: 13 and 14 At least one primer set selected from the group consisting of oligonucleotide primer sets of; (b) at least one primer set selected from the group consisting of oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 9 and 10 and oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 11 and 12; And (c) at least one primer set selected from the group consisting of oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 7 and 8 and oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 15 and 16; aloe vera, aloe saponaria and aloe growth comprising It may be a set of primers
  • the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 1 and 2 the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 3 and 4, the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 5 and 6 and the oligonucleotides of SEQ ID NO: 13 and 14
  • a primer set for distinguishing aloe saponaria from aloe vera and aloe growth comprising at least one primer set selected from the group consisting of primer sets, oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 7 and 8 and SEQ ID NOs: 15 and 16
  • a set of primers for distinguishing Aloe Vera from Aloe saponaria and Aloe growth comprising at least one primer set selected from the group consisting of oligonucleotide primer sets.
  • a primer set to distinguish growth from the aloe and aloe vera Aloe sand paper or Ria comprising at least one primer set of oligonucleotide SEQ ID NO: 11 and 12 selected from the group consisting of a nucleotide primer set.
  • the primer set of the present invention is an oligonucleotide primer set capable of amplifying a total of eight markers developed based on chloroplast genome complete sequence translation of aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth. 5, 7, 9, 11, 13 and 15 are forward primers and SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 and 16 are reverse primers.
  • the primers according to the sequence length of each primer SEQ ID NOs: 1 and 2; SEQ ID NOs: 3 and 4; SEQ ID NOs: 5 and 6; SEQ ID NOs: 7 and 8; SEQ ID NOs: 9 and 10; SEQ ID NOs: 11 and 12; SEQ ID NOs: 13 and 14; At least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25 in SEQ ID NOs 15 and 16, Oligonucleotides consisting of at least 26, at least 27, at least 28, at least 29 consecutive nucleotide segments.
  • the primers of SEQ ID NO: 1 may be at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, Oligonucleotides consisting of segments of at least 22, at least 23, at least 24 contiguous nucleotides.
  • the addition, deletion or substitution of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 15 and 16 may also be included.
  • primer refers to a single stranded oligonucleotide sequence complementary to the nucleic acid strand to be copied and may serve as a starting point for the synthesis of the primer extension product.
  • the length and sequence of the primers should allow to start the synthesis of extension products.
  • the specific length and sequence of the primer will depend on the primer utilization conditions such as temperature and ionic strength as well as the complexity of the DNA or RNA target required.
  • oligonucleotides used as primers may also include nucleotide analogues, such as phosphorothioate, alkylphosphothioate or peptide nucleic acid, or It may comprise an intercalating agent.
  • kits for distinguishing aloe vera, aloe saponaria and aloe growth comprising a primer set according to the invention and a reagent for carrying out an amplification reaction.
  • the reagent for performing the amplification reaction may include DNA polymerase, dNTPs, buffers and the like.
  • the kits of the present invention may further comprise a user guide describing the optimal reaction performance conditions.
  • the guide is a printed document that explains how to use the kit, such as how to prepare a PCR buffer, and the reaction conditions presented.
  • the instructions include brochures in the form of pamphlets or leaflets, labels affixed to the kits and instructions on the surface of the package containing the kits.
  • the guide includes information that is disclosed or provided through electronic media such as the Internet.
  • It provides a method for distinguishing aloe vera, aloe saponaria and aloe growth, comprising detecting the amplification product.
  • the methods of the present invention comprise the step of separating genomic DNA from aloe vera, aloe saponaria and suspected aloe growth samples.
  • a method for separating genomic DNA from the sample a method known in the art may be used.
  • the CTAB method may be used, or the Wizard prep kit (Promega, USA) may be used.
  • the target sequence may be amplified by performing an amplification reaction using a primer set according to an embodiment of the present invention as a primer.
  • PCR polymerase chain reaction
  • ligase chain reaction nucleic acid sequence-based amplification
  • transcription-based amplification systems There are any suitable methods for amplifying via strand displacement amplification or Q ⁇ replication or for amplifying nucleic acid molecules known in the art.
  • PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a pair of primers specifically binding to the target nucleic acid using a polymerase.
  • PCR methods are well known in the art, and commercially available kits may be used.
  • the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance.
  • the labeling material may be, but is not limited to, a material emitting fluorescence, phosphorescence, or radioactivity.
  • the labeling substance is Cy-5 or Cy-3.
  • PCR is performed by labeling Cy-5 or Cy-3 at the 5'-end of the primer to allow the target sequence to be labeled with a detectable fluorescent labeling substance.
  • the label using the radioactive material may add radioactive isotopes such as 32 P or 35 S to the PCR reaction solution when PCR is performed, and the amplification product may be incorporated into the amplification product while the amplification product is synthesized.
  • the primer set used to amplify the target sequence is as described above.
  • the method of the present invention includes detecting the amplification product. Detection of the amplification product may be performed through capillary electrophoresis, DNA chip, gel electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement, but is not limited thereto. As one of methods for detecting amplification products, gel electrophoresis may be performed, and gel electrophoresis may use acrylamide gel electrophoresis or agarose gel electrophoresis depending on the size of the amplification product. Capillary electrophoresis can also be performed. Capillary electrophoresis can be used, for example, with an ABI Genetic Analyzer.
  • PCR is performed by labeling a fluorescent dye at the 5'-end of a primer, and a target sequence is labeled with a detectable fluorescent labeling material, and the labeled fluorescence can be measured using a fluorimeter.
  • radioactivity measuring method is to add a radioactive isotope such as 32 P or 35 S to the PCR reaction solution to label the amplification product when performing PCR, and then radioactive measuring apparatus, for example, Geiger counter or liquid flash The radioactivity can be measured using a liquid scintillation counter.
  • the 45S nuclear ribosomal DNA (NRS) sequences in the chloroplast genome and nucleus of Aloe vera, Aloe saponaria, and Aloe growth were assembled and analyzed using NGS (Next Generation Sequences) method.
  • the size of the fully detoxified chloroplast genome was 152,875 bp for aloe vera, 153,175 bp for aloe saponaria, and 152,879 bp for aloe growth (Table 1).
  • Three types of 45S nrDNA in the nucleus were identified in aloe vera, two types in saponaria, and four types in aloe growth. Table 1 shows representative 45S nrDNA type information.
  • chloroplast sequences of aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth were completed. Basic information and structure of the chloroplast completed in three plants are shown in Figure 2 and Table 2.
  • Aloe vera, aloe saponaria and aloe growths had chloroplast lengths of 152,875-153,175 bp.
  • Aloe vera and aloe growths had similar chloroplast lengths (Aloe vera: 152,875 bp, Aloe growth: 152,879 bp), but the chloroplast sequence lengths of these two species and saponaria differed, especially in the IR and SSC regions. Sequence length differences were shown.
  • the chloroplast sequences completed in aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth were compared and analyzed, respectively, to identify mutation regions in the three chloroplast sequences.
  • the 45S nrDNA sequences were compared between three aloes (Aloe vera, Aloe saponaria, Aloe growth).
  • the 45S nrDNA sequence is derived from the nucleus and the 45S nr DNA sequence of the offspring is mixed with the 45S nrDNA sequence of the parent and the minor. Comparing the 45S nrDNA sequences completed from the three aloes, the 45S nrDNA sequences of aloe growth (Aloe growth: 4 types) and aloe vera (Aloe vera: 3 types) are quite similar, whereas the aloe saponaria sequence (Aloe Saponaria: 2 types) showed differences with the nrDNA sequences of these two species (FIGS. 5 and 6).
  • markers were prepared by selecting regions that can distinguish aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth from the mutant regions obtained through comparative analysis of chloroplasts and 45S nrDNA sequences of three aloes. Two markers can be distinguished from two and aloe growth, and four markers can be distinguished from aloe saponaria.
  • the marker development region and primer information are shown in Table 6.
  • the molecular marker of the present invention was verified using the primer set. PCR analysis using DNA samples of aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth as a template revealed that three aloes could be clearly distinguished from chloroplasts and 45S nrDNA sequence-derived markers. It is thought to be useful to distinguish growth (Figs. 7-9).

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Abstract

The present invention relates to an origin species identifying marker and a primer set on the basis of complete sequencing of chloroplast genomes and nuclear ribosomal DNA sequences of Aloe vera, Aloe saponaria, and Aloe saengjang, and use thereof.

Description

알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 DNA 서열의 완전 해독 기반 종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도Complete translation-based species identification markers and primer sets and their use of the chloroplast genome and nuclear ribosomal DNA sequences of Aloe vera, Aloe saponaria, and Aloe growth
본 발명은 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 DNA 서열의 완전 해독 기반 종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to complete translation based species identification markers and primer sets and use thereof of the chloroplast genome and nuclear ribosomal DNA sequences of Aloe vera, Aloe saponaria and Aloe growth.
알로에는 아프리카 지방에 자생하는 백합과의 다육식물로, 알로에 속 식물 원산지는 아프리카 대륙 및 인근 군도를 중심으로 남아프리카, 마다가스카르 섬, 아라비아 지방으로 현재는 열대와 온대지방에 폭넓게 재배되고 있다. 잎은 두꺼운 칼모양이고 가장자리에 가시가 나 있으며, 주황색 또는 분홍색의 꽃이 핀다. 알로인, 사포닌 등 인체에 유용한 성분을 대량 함유하고 있어 예로부터 의약품, 건강보조식품, 화장품 등으로 개발·이용되어 왔으며, 연중 푸른 잎줄기를 감상할 수 있어 최근에는 관상용으로도 인기를 끌고 있다. 600 여종 이상의 알로에가 알려져 있으나 이 중 현재 식용 가능한 알로에는 알로에 베라(Aloe vera), 알로에 아르보레센스(Aloe arborescens), 알로에 사포나리아(Aloe saponaria) 정도이다.Aloe is a succulent plant native to Africa. Aloe is a plant native to South Africa, Madagascar and Arabia, mainly in the African continent and neighboring islands. The leaves are thick, sword-shaped, with thorns on the edges, and have orange or pink flowers. Since it contains a large amount of ingredients useful for the human body such as alloin and saponin, it has been developed and used in medicine, health supplement foods, and cosmetics since ancient times. More than 600 species of Aloe are known, but currently edible aloe is on the order of Aloe vera (Aloe vera), aloe borane are sense (Aloe arborescens), aloe sand paper or Syrian (Aloe saponaria).
한편, 최근 분자 생물학이 발달하면서 특정 DNA 염기 서열의 다형성을 탐색하고 이를 분자마커로 활용하는 기술은 환경의 영향을 받지 않고 연차간 변이가 거의 없기 때문에 유전자 지도 작성, 내병성 유전자의 맵핑(mapping), 품종 식별 등 다양한 분야에 활용 가능하게 되었다. 특히, 유전적 분자마커 기술 개발은 작물 육성에서 이용가치가 증가되고 있다.On the other hand, with the recent development of molecular biology, the technology of searching for polymorphisms of specific DNA sequences and using them as molecular markers is not influenced by the environment and there is little variation between them. Therefore, gene mapping, mapping of disease-resistant genes, It can be used in various fields such as breed identification. In particular, the development of genetic molecular marker technology is increasing the useful value in crop growth.
현재까지 사용되고 있는 식물종 감별법에는 형태학적 특징, 성분의 정성과 정량분석 및 DNA 수준에서의 차이점 비교 등이 있다. 형태학적 특징은 식물체의 생육환경에 따라 차이를 나타낼 수 있어 식물종 판별에 어려움이 있다. 또한 성분분석에 의한 구별을 위해 미각센서, 핵자기 공명분광기(NMR spectrometer) 등이 이용되었으나, 이 방법은 생산지의 재배환경에 따라 성분이 영향을 받을 수 있다는 한계점을 가지고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA), SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions), AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) 등 DNA 단편의 다형성을 이용한 분자생물학적 식물종 판별이 시도되고 있다. 또한 최근에는, 식물종 판별에 있어서 CBOL Plant Working Group이 제안한 DNA 바코드를 이용한 분류법이 그 유용성을 인정받고 있다. 특히 게놈 상에 존재하는 핵 리보솜 DNA(Nuclear Ribosomal DNA, nrDNA)의 nrDNA-ITS(internal transcribed spacer) 부위는 다른 유전자의 코딩 부위보다 빠르게 진화할 뿐만 아니라, 일반성, 단순성, 재현성 등의 이점으로 인해 계통분류나 종간 유전변이 탐색 등을 위해 널리 이용되는 염기서열로 알려져 있다.Plant species differentiation used to date include morphological characteristics, qualitative and quantitative analysis of components, and comparison of differences at the DNA level. The morphological characteristics may show differences depending on the growth environment of the plant, which makes it difficult to identify the plant species. In addition, taste sensor and nuclear magnetic resonance spectrometer (NMR spectrometer) were used to distinguish by component analysis. However, this method has a limitation that components can be affected by the cultivation environment of the production site. In order to solve this problem, molecular biological plant species identification using polymorphism of DNA fragments such as random amplified polymorphic DNA (RAPD), sequence characterized amplified regions (SCAR), and amplified fragment length polymorphism (AFLP) has been attempted. In recent years, the classification method using DNA barcodes proposed by CBOL Plant Working Group has been recognized for its usefulness in plant species identification. In particular, the nrDNA-ITS (internal transcribed spacer) region of the Nuclear Ribosomal DNA (nrDNA) on the genome not only evolves faster than the coding regions of other genes, but also because of the advantages of generality, simplicity and reproducibility. It is known as a nucleotide sequence that is widely used for classification and searching for genetic variation between species.
이에 본 발명자들은 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 엽록체 게놈과 45S nrDNA 전체서열을 분석하고 염기서열을 비교하여, 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 효율적으로 식별할 수 있는 8개의 분자마커를 개발하였다.Therefore, the present inventors analyzed the chloroplast genome of Aloe vera, Aloe saponaria and Aloe growth and the entire sequence of 45S nrDNA, and compared the sequencing, thereby efficiently identifying eight aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth. Molecular markers have been developed.
한편, 한국등록특허 제1402607호에는 '여러 크기의 알로에 베라의 질량 분광법 기반 대사체 프로파일링 및 그 바이오마커'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1508744호에는 '배추과 작물 종 판별을 위한 엽록체 DNA 마커 및 이를 이용한 판별 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 DNA 서열의 완전 해독 기반 종 식별 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도에 관해서는 기재된 바가 없다.Meanwhile, Korean Patent No. 140207 discloses' mass spectrometry-based metabolite profiling and biomarkers thereof of various sizes of Aloe Vera ', and Korean Patent No. 1508744 discloses' chloroplast DNA marker for cabbage and crop species determination. And a method for discriminating using the same, but a complete set of species identification markers and primer sets based on the aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth and nuclear ribosome DNA sequences of the present invention and their use are described. none.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 엽록체 게놈 및 핵 리보솜 DNA(nrDNA) 전체서열을 분석하여 완성하였고, 완성된 염기서열의 서열정보를 비교하여 총 8종의 마커를 제작하였으며 또한, 상기 분자마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 DNA 시료들을 분석한 결과, 본 발명의 분자마커들이 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 명확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived by the above-mentioned requirements, and the present inventors completed and analyzed the chloroplast genome and nuclear ribosomal DNA (nrDNA) whole sequences of aloe vera, aloe saponaria and aloe growth, and completed the sequence of the completed sequencing. A total of eight markers were prepared by comparing the information, and DNA samples were analyzed by preparing primer sets capable of amplifying the molecular markers. As a result, the molecular markers of the present invention were grown in aloe vera, aloe saponaria, and aloe. By confirming that can be clearly distinguished, the present invention was completed.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 15와 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention is an oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 1 and 2, oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 3 and 4, oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 5 and 6, oligo of SEQ ID NO: 7 and 8 Nucleotide primer set, oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 9 and 10, oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 11 and 12, oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 13 and 14, and oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 15 and 16 A primer set for distinguishing aloe vera, aloe saponaria and aloe growth comprising at least one primer set selected from is provided.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 구별하기 위한 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for distinguishing aloe vera, aloe saponaria and aloe growth, comprising the primer set and a reagent for carrying out the amplification reaction.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 구별하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for distinguishing aloe vera, aloe saponaria and aloe growth using the primer set.
본 발명의 분자마커들은 세포 내에서 카피수가 수백에서 수천 개 존재하면서도 종 내 변이가 매우 드물게 존재하는 지역에서 발굴한 것으로 매우 안정적인 검증이 가능하며, 기존의 방법들보다 저비용 및 고효율로 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 식별할 수 있어 그 활용성이 높다. 또한, 알로에 생장 가공제품에서도 원재료 판별이 가능하기 때문에 알로에 생장 가공제품의 가치를 향상시킬 수 있고, 알로에 생장의 순도 유지나 품종 보호, 그리고 종자 분쟁의 해결 등에도 이용될 수 있다.Molecular markers of the present invention are found in an area where there are hundreds or thousands of copies in a cell, but very rarely exists in species variation, and can be verified very stable.Aloe vera and aloe are more cost-effective and efficient than conventional methods. Saponaria and aloe growth can be identified and its utilization is high. In addition, since raw materials can be discriminated from aloe grown products, it is possible to improve the value of aloe grown processed products, and can be used for maintaining the purity of aloe growth, protecting varieties, and resolving seed disputes.
도 1은 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장 사진이다. Aloe vera, 알로에 베라; Aloe saponaria, 알로에 사포나리아; Saeng Jang, 알로에 생장.1 is a picture of aloe vera, aloe saponaria and aloe growth. Aloe vera , Aloe vera; Aloe saponaria , Aloe saponaria ; Saeng Jang, aloe grow.
도 2는 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 완성된 엽록체 게놈 지도이다. Aloe vera, 알로에 베라; Aloe saponaria, 알로에 사포나리아; Saeng Jang, 알로에 생장.2 is a complete chloroplast genome map of Aloe vera, Aloe saponaria and Aloe growth. Aloe vera , Aloe vera; Aloe saponaria , Aloe saponaria ; Saeng Jang, aloe grow.
도 3은 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 45S nrDNA 서열 비교 비교 분석을 통한 종간 변이지역 발굴 결과이다. Figure 3 shows the results of excavation between the regions of the species through a comparative analysis of 45S nrDNA sequence of aloe vera, aloe saponaria and aloe growth.
도 4는 엽록체 서열 기반 3종의 알로에의 계통수 분석 결과이다. 아이리스 가테시아이(Iris gatesii)는 아웃그룹(outgroup)으로 사용하였다.4 is a phylogenetic analysis of three aloes based on chloroplast sequence. Iris gate when the child (Iris gatesii) was used out of the group (outgroup).
도 5는 45S nrDNA 서열 기반 3종의 알로에의 계통수 분석 결과이다.5 is a phylogenetic analysis of three aloes based on 45S nrDNA sequence.
도 6은 알로에 베라, 알로에 생장, 알로에 사포나리아의 45S nrDNA 서열 비교 분석 결과이다. Figure 6 shows the results of 45S nrDNA sequence comparison analysis of aloe vera, aloe growth, aloe saponaria.
도 7은 본 발명의 InDel 마커을 통하여 알로에 사포나리아의 구별 결과이다. 7 is a result of distinguishing Aloe saponaria through the InDel marker of the present invention.
도 8은 본 발명의 dCAPs 마커를 이용한 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 식별 결과이다. Aloe_d_13: 알로에 베라 특이 마커; Aloe_d_5,17: 알로에 생장 특이 마커.8 is a result of identification of aloe vera, aloe saponaria and aloe growth using the dCAPs marker of the present invention. Aloe_d_13: aloe vera specific markers; Aloe_d_5,17: Aloe growth specific marker.
도 9는 본 발명의 HRM 마커를 이용한 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 식별 결과이다. Aloe_h_1: 알로에 사포나리아 특이 마커; Aloe_h_10: 알로에 베라 특이 마커.9 is a result of identification of aloe vera, aloe saponaria and aloe growth using the HRM marker of the present invention. Aloe_h_1: aloe saponaria specific markers; Aloe_h_10: Aloe vera specific marker.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 구별하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a primer set for distinguishing aloe vera, aloe saponaria and aloe growth.
알로에 베라(Aloe vera)는 1~2년 동안은 성장이 더디지만 2년이 지나면 성장이 빠른 편에 속하며, 꽃은 일년 중 계절에 관계없이 긴 꽃대가 올라와 노랑 또는 적등색 꽃을 피운다. 껍질째 먹으면 쓴맛이 강하며 껍질을 벗기고 먹게 되면 무미(無味) 무취(無臭)의 젤리 질이 많은 품종이기에 껍질을 벗겨서 사용하는데 많이 쓰인다.Aloe Vera (Aloe vera) belongs to the fastest growing section during 1-2 years after growing only deodiji two years, the flowers come up with a long spine, regardless of the season of the year smokes a yellow or reddish orange flowers. When eaten, the bitter taste is strong, and when peeled and eaten, it's tasteless and odorless.
알로에 사포나리아(Aloe saponaria)는 알로에 중에서 소형종에 속하며 땅에 붙어 자라고 잎이 연하면서 하얀 점이 있다. 꽃대는 길게 위로 올라오며 적등색의 꽃을 피운다. 껍질에 쓴맛이 없어 가시만 따내고 껍질째 많이 사용한다. Aloe saponaria is a small species of aloe that grows on the ground and has light leaves with white spots. Flower beds rise long and bloom red-colored flowers. The bark has no bitter taste, so only the thorns are used.
알로에 생장('생장알로에'로 혼용하여 쓰기도 함)은 알로에 베라와 알로에 사포나리아를 혼합식재하는 방식으로 재배한 것으로, 자연교잡종을 유도하고 실생묘를 획득해 무성번식을 통해 계통 육성한 신품종으로 알로에 베라에 비해 식물체 높이가 낮고, 잎 수가 많으며, 연녹색의 잎 내에 흰색 반점을 가지며, 잎의 껍질이 얇고 가시가 부드러워 껍질을 제거하지 않고 알로에 잎을 껍질째 갈아 음용할 수 있다. 특히 알로에 신품종의 경우 어린 새순이나 가공 유통시 육안으로 알로에 베라 또는 알로에 사포나리아 등과 구분이 어려울 수 있다.Aloe growth (also used as a 'growing aloe') is a cultivated plant that combines aloe vera and aloe saponaria. It is a new breed that has grown naturally through inbred breeding by inducing natural hybrids and obtaining seedlings. Compared to aloe vera, the plant height is lower, the number of leaves is high, and there are white spots in the pale green leaves, and the leaves are thin and soft, so that the aloe leaves can be ground for drinking without removing the peel. In particular, new varieties of aloe may be difficult to distinguish from aloe vera or aloe saponaria by naked eyes during processing or distribution.
이에 본 발명자는 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 효율적으로 식별할 수 있는 8종의 분자마커를 개발하였다. 상기 마커는 3개의 Indel(insertion-deletion), 3개의 dCAPs(derived cleaved amplified polymorphic sequence) 및 2개의 HRM(high resolution melting) 마커 타입으로 구성되어 있다(표 6 참조). Therefore, the present inventors have developed eight molecular markers that can efficiently identify aloe vera, aloe saponaria and aloe growth. The marker consists of three insertion-deletion (Indel), three derived cleaved amplified polymorphic sequences (dCAPs) and two high resolution melting (HRM) marker types (see Table 6).
본 발명의 프라이머 세트는 구체적으로 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 15와 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.Specifically, the primer sets of the present invention are oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2, oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 3 and 4, oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 5 and 6, oligonucleotide primers of SEQ ID NOs: 7 and 8 Set, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 9 and 10, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 11 and 12, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 13 and 14, and an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 15 and 16 It may comprise one or more primer sets.
바람직하게는 본 발명의 프라이머 세트는 (a) 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트; (b) 서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트; 및 (c) 서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 15와 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트;를 포함하는 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 구별하기 위한 프라이머 세트일 수 있다.Preferably, the primer set of the present invention comprises (a) an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 1 and 2, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 3 and 4, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 5 and 6, and SEQ ID NOs: 13 and 14 At least one primer set selected from the group consisting of oligonucleotide primer sets of; (b) at least one primer set selected from the group consisting of oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 9 and 10 and oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 11 and 12; And (c) at least one primer set selected from the group consisting of oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 7 and 8 and oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 15 and 16; aloe vera, aloe saponaria and aloe growth comprising It may be a set of primers to distinguish.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 알로에 베라 및 알로에 생장으로부터 알로에 사포나리아를 구별하기 위한 프라이머 세트이고, 서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 15와 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 알로에 사포나리아 및 알로에 생장으로부터 알로에 베라를 구별하기 위한 프라이머 세트이며, 서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 알로에 베라 및 알로에 사포나리아로부터 알로에 생장을 구별하기 위한 프라이머 세트이다.According to one embodiment of the invention, the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 1 and 2, the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 3 and 4, the oligonucleotide primer set of SEQ ID NO: 5 and 6 and the oligonucleotides of SEQ ID NO: 13 and 14 A primer set for distinguishing aloe saponaria from aloe vera and aloe growth comprising at least one primer set selected from the group consisting of primer sets, oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 7 and 8 and SEQ ID NOs: 15 and 16 A set of primers for distinguishing Aloe Vera from Aloe saponaria and Aloe growth comprising at least one primer set selected from the group consisting of oligonucleotide primer sets. And a primer set to distinguish growth from the aloe and aloe vera Aloe sand paper or Ria comprising at least one primer set of oligonucleotide SEQ ID NO: 11 and 12 selected from the group consisting of a nucleotide primer set.
본 발명의 프라이머 세트는, 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 엽록체 게놈 완전 서열 해독에 기반하여 개발한 총 8종의 마커를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15는 정방향 프라이머이며, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16은 역방향 프라이머이다.The primer set of the present invention is an oligonucleotide primer set capable of amplifying a total of eight markers developed based on chloroplast genome complete sequence translation of aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth. 5, 7, 9, 11, 13 and 15 are forward primers and SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 and 16 are reverse primers.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(25개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.The primers according to the sequence length of each primer, SEQ ID NOs: 1 and 2; SEQ ID NOs: 3 and 4; SEQ ID NOs: 5 and 6; SEQ ID NOs: 7 and 8; SEQ ID NOs: 9 and 10; SEQ ID NOs: 11 and 12; SEQ ID NOs: 13 and 14; At least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24, at least 25 in SEQ ID NOs 15 and 16, Oligonucleotides consisting of at least 26, at least 27, at least 28, at least 29 consecutive nucleotide segments. For example, the primers of SEQ ID NO: 1 (25 oligonucleotides) may be at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20, at least 21, Oligonucleotides consisting of segments of at least 22, at least 23, at least 24 contiguous nucleotides. In addition, the primers SEQ ID NO: 1 and 2; SEQ ID NOs: 3 and 4; SEQ ID NOs: 5 and 6; SEQ ID NOs: 7 and 8; SEQ ID NOs: 9 and 10; SEQ ID NOs: 11 and 12; SEQ ID NOs: 13 and 14; The addition, deletion or substitution of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 15 and 16 may also be included.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.In the present invention, "primer" refers to a single stranded oligonucleotide sequence complementary to the nucleic acid strand to be copied and may serve as a starting point for the synthesis of the primer extension product. The length and sequence of the primers should allow to start the synthesis of extension products. The specific length and sequence of the primer will depend on the primer utilization conditions such as temperature and ionic strength as well as the complexity of the DNA or RNA target required.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.As used herein, oligonucleotides used as primers may also include nucleotide analogues, such as phosphorothioate, alkylphosphothioate or peptide nucleic acid, or It may comprise an intercalating agent.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,In order to achieve another object of the present invention, the present invention,
본 발명에 따른 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 구별하기 위한 키트를 제공한다.Provided are kits for distinguishing aloe vera, aloe saponaria and aloe growth, comprising a primer set according to the invention and a reagent for carrying out an amplification reaction.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.In the kit of the present invention, the reagent for performing the amplification reaction may include DNA polymerase, dNTPs, buffers and the like. In addition, the kits of the present invention may further comprise a user guide describing the optimal reaction performance conditions. The guide is a printed document that explains how to use the kit, such as how to prepare a PCR buffer, and the reaction conditions presented. The instructions include brochures in the form of pamphlets or leaflets, labels affixed to the kits and instructions on the surface of the package containing the kits. In addition, the guide includes information that is disclosed or provided through electronic media such as the Internet.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은,In order to achieve another object of the present invention, the present invention,
알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;Isolating genomic DNA from aloe vera, aloe saponaria, and aloe suspicious samples;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 다형성 뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및Amplifying polymorphic nucleotides by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the oligonucleotide primer set of the present invention; And
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 구별하는 방법을 제공한다.It provides a method for distinguishing aloe vera, aloe saponaria and aloe growth, comprising detecting the amplification product.
본 발명의 방법은 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega, 미국)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.The methods of the present invention comprise the step of separating genomic DNA from aloe vera, aloe saponaria and suspected aloe growth samples. As a method for separating genomic DNA from the sample, a method known in the art may be used. For example, the CTAB method may be used, or the Wizard prep kit (Promega, USA) may be used. Using the isolated genomic DNA as a template, the target sequence may be amplified by performing an amplification reaction using a primer set according to an embodiment of the present invention as a primer. Methods for amplifying target nucleic acids include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-based amplification systems, There are any suitable methods for amplifying via strand displacement amplification or Qβ replication or for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among these, PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a pair of primers specifically binding to the target nucleic acid using a polymerase. Such PCR methods are well known in the art, and commercially available kits may be used.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.In the method of the present invention, the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance. In one embodiment, the labeling material may be, but is not limited to, a material emitting fluorescence, phosphorescence, or radioactivity. Preferably, the labeling substance is Cy-5 or Cy-3. When amplifying the target sequence, PCR is performed by labeling Cy-5 or Cy-3 at the 5'-end of the primer to allow the target sequence to be labeled with a detectable fluorescent labeling substance. In addition, the label using the radioactive material may add radioactive isotopes such as 32 P or 35 S to the PCR reaction solution when PCR is performed, and the amplification product may be incorporated into the amplification product while the amplification product is synthesized. The primer set used to amplify the target sequence is as described above.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Genetic Analyzer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 형광염료를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.The method of the present invention includes detecting the amplification product. Detection of the amplification product may be performed through capillary electrophoresis, DNA chip, gel electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement, but is not limited thereto. As one of methods for detecting amplification products, gel electrophoresis may be performed, and gel electrophoresis may use acrylamide gel electrophoresis or agarose gel electrophoresis depending on the size of the amplification product. Capillary electrophoresis can also be performed. Capillary electrophoresis can be used, for example, with an ABI Genetic Analyzer. In addition, in the fluorescence measurement method, PCR is performed by labeling a fluorescent dye at the 5'-end of a primer, and a target sequence is labeled with a detectable fluorescent labeling material, and the labeled fluorescence can be measured using a fluorimeter. In addition, radioactivity measuring method is to add a radioactive isotope such as 32 P or 35 S to the PCR reaction solution to label the amplification product when performing PCR, and then radioactive measuring apparatus, for example, Geiger counter or liquid flash The radioactivity can be measured using a liquid scintillation counter.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.
실시예 1. 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 NGS 분석Example 1 NGS Analysis of Aloe Vera, Aloe Saponaria and Aloe Growth
알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 엽록체 게놈 및 핵 내 45S nrDNA(nuclear ribosomal DNA) 서열은 NGS(Next Generation Sequences) 방법을 이용하여 조립 및 완전분석하였다. 완전해독된 엽록체 게놈의 크기는 알로에 베라가 152,875bp, 알로에 사포나리아가 153,175bp, 알로에 생장이 152,879bp였다(표 1). 핵 내 45S nrDNA는 알로에 베라에서 3개의 타입, 사포나리아에서 2개의 타입, 알로에 생장에서 4개의 타입이 확인되었다. 표 1에는 대표 45S nrDNA 타입 정보를 명시하였다.The 45S nuclear ribosomal DNA (NRS) sequences in the chloroplast genome and nucleus of Aloe vera, Aloe saponaria, and Aloe growth were assembled and analyzed using NGS (Next Generation Sequences) method. The size of the fully detoxified chloroplast genome was 152,875 bp for aloe vera, 153,175 bp for aloe saponaria, and 152,879 bp for aloe growth (Table 1). Three types of 45S nrDNA in the nucleus were identified in aloe vera, two types in saponaria, and four types in aloe growth. Table 1 shows representative 45S nrDNA type information.
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실시예Example 2. 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 엽록체 및 nrDNA 서열 완성  2. Completion of Chloroplasts and nrDNA Sequences of Aloe Vera, Aloe Saponaria, and Aloe Growth
본 발명에서 알로에 베라, 알로에 사포나리아, 알로에 생장의 엽록체 염기서열을 완성하였다. 3종의 식물에서 완성된 엽록체의 기본 정보와 구조는 도 2 및 표 2와 같다.In the present invention, chloroplast sequences of aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth were completed. Basic information and structure of the chloroplast completed in three plants are shown in Figure 2 and Table 2.
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알로에 베라, 알로에 사포나리아, 알로에 생장은 152,875-153,175bp 사이의 엽록체 길이를 가지고 있었다. 알로에 베라와 알로에 생장은 비슷한 엽록체 길이를 보였으나(알로에 베라: 152,875bp, 알로에 생장: 152,879bp) 이들 두 종과 사포나리아의 엽록체 서열 길이는 차이를 보였는데 특히 IR 지역과 SSC 지역에서 이들 종간 서열 길이 차이를 보였다.Aloe vera, aloe saponaria and aloe growths had chloroplast lengths of 152,875-153,175 bp. Aloe vera and aloe growths had similar chloroplast lengths (Aloe vera: 152,875 bp, Aloe growth: 152,879 bp), but the chloroplast sequence lengths of these two species and saponaria differed, especially in the IR and SSC regions. Sequence length differences were shown.
또한, NGS 서열을 이용하여 알로에 베라, 알로에 사포나리아, 알로에 생장에서 45S nrDNA 서열을 완성하였다(표 3, 도 3). 3종의 알로에 모두 2가지 이상의 45S nr DNA가 존재함을 확인하였다(알로에 베라: 3 types, 알로에 사포나리아: 2 types, 알로에 생장: 4 types).In addition, 45S nrDNA sequences were completed in Aloe vera, Aloe saponaria, and Aloe growth using NGS sequences (Table 3, FIG. 3). All three aloes were confirmed to have at least two 45S nr DNAs (Aloe Vera: 3 types, Aloe Saponaria: 2 types, Aloe Growth: 4 types).
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실시예Example 3. 알로에 베라, 알로에 사포나리아, 알로에 생장의 엽록체 및  3. Aloe vera, aloe saponaria, chloroplasts of aloe growth and nrDNAnrDNA 서열 비교 분석 Sequence comparison analysis
알로에 베라, 알로에 사포나리아, 알로에 생장에서 완성된 엽록체 서열을 각각 비교 분석하여 3종의 엽록체 서열 내 변이지역을 확인하였다. 알로에 베라와 알로에 생장 간에는 62개의 SNP(single nucleotide polymorphism)(전체 서열대비 0.04%)와 65개의 InDel(전체 서열 대비 0.04%)을 가지고 있었으며, 알로에 사포나리아와 알로에 생장 간에는 875개의 SNP(전체 서열 대비 0.57%)와 138개의 InDel(전체 서열 대비 0.09%)을 가지고 있었다(표 4 및 5).The chloroplast sequences completed in aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth were compared and analyzed, respectively, to identify mutation regions in the three chloroplast sequences. There were 62 single nucleotide polymorphisms (SNP) (0.04% of the total sequence) and 65 InDel (0.04% of the total sequence) between Aloe vera and Aloe growth, and 875 SNPs (a complete sequence) between Aloe saponaria and Aloe growth. 0.57%) and 138 InDel (0.09% of total sequence) (Tables 4 and 5).
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알로에 베라, 알로에 사포나리아, 알로에 생장에서 완성된 엽록체 서열을 기반으로 3종의 알로에간 근연관계를 확인했다. 알로에 베라와 알로에 생장이 같은 계통군을 형성하였으며 알로에 사포나리아는 두 종의 알로에와는 다른 계통군을 형성하였다. 알로에 생장과 알로에 베라의 엽록체 서열간에 일부 서열 변이차이가 있었지만, 모계유전을 하는 엽록체의 서열 기반 계통수 분석을 통해 이들 두 종의 모본이 같음을 확인하였다(도 4). Based on the chloroplast sequences completed in aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth, the relationship between the three aloes was confirmed. Aloe vera and aloe growth formed the same lineage, and aloe saponaria formed a different lineage from the two species of aloe. Although there was some sequence variation between the aloe growth and the chloroplast sequences of Aloe vera, sequence-based phylogenetic analysis of the chloroplasts in maternal inheritance confirmed that the two mothers were identical (FIG. 4).
3종의 알로에(알로에 베라, 알로에 사포나리아, 알로에 생장)간에 45S nrDNA 서열을 비교 분석하였다. 45S nrDNA 서열은 핵에서 유래된 서열로 자식세대의 45S nr DNA 서열은 모본과 부본의 45S nrDNA 서열과 혼재되어 나타난다. 3종의 알로에에서 완성된 45S nrDNA 서열을 비교해 보면 알로에 생장(알로에 생장: 4 types)와 알로베 베라(알로에 베라: 3 types)의 45S nrDNA 서열이 상당히 유사한 반면, 알로에 사포나리아 서열은(알로에 사포나리아: 2 types) 이들 두 종의 nrDNA 서열과 차이를 보였다(도 5 및 6).The 45S nrDNA sequences were compared between three aloes (Aloe vera, Aloe saponaria, Aloe growth). The 45S nrDNA sequence is derived from the nucleus and the 45S nr DNA sequence of the offspring is mixed with the 45S nrDNA sequence of the parent and the minor. Comparing the 45S nrDNA sequences completed from the three aloes, the 45S nrDNA sequences of aloe growth (Aloe growth: 4 types) and aloe vera (Aloe vera: 3 types) are quite similar, whereas the aloe saponaria sequence (Aloe Saponaria: 2 types) showed differences with the nrDNA sequences of these two species (FIGS. 5 and 6).
실시예Example 4. 알로에 베라, 알로에 사포나리아, 알로에 생장의 엽록체 및  4. Aloe vera, aloe saponaria, chloroplasts of aloe growth and nrDNAnrDNA 서열 유래 종간 구별  Distinguishing between sequence-derived species 마커Marker 개발 Development
3종의 알로에의 엽록체와 45S nrDNA 서열 비교 분석을 통해 얻은 변이지역 중 알로에 베라, 알로에 사포나리아, 알로에 생장을 구별할 수 있는 지역을 선정하여 총 8종의 마커를 제작하였는데, 알로에 베라 구별 마커 2개와 알로에 생장을 특이적으로 구별할 수 있는 마커 2개, 그리고 알로에 사포나리아를 구별할 수 있는 마커 4개를 개발하였으며 마커 개발 지역 및 프라이머 정보는 표 6과 같다.A total of eight markers were prepared by selecting regions that can distinguish aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth from the mutant regions obtained through comparative analysis of chloroplasts and 45S nrDNA sequences of three aloes. Two markers can be distinguished from two and aloe growth, and four markers can be distinguished from aloe saponaria. The marker development region and primer information are shown in Table 6.
Figure PCTKR2017013977-appb-T000006
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상기 프라이머 세트를 이용하여 본 발명의 분자마커를 검증하였다. 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장의 DNA 시료를 주형으로 하여 PCR 분석을 수행한 결과, 엽록체와 45S nrDNA 서열 유래 마커를 통해 3종의 알로에를 명확하게 구별할 수 있었으며, 생리 활성이 뛰어난 알로에 생장을 구별하는데 유용하게 사용될 것이라 사료된다(도 7 내지 9).The molecular marker of the present invention was verified using the primer set. PCR analysis using DNA samples of aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth as a template revealed that three aloes could be clearly distinguished from chloroplasts and 45S nrDNA sequence-derived markers. It is thought to be useful to distinguish growth (Figs. 7-9).

Claims (4)

  1. 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 15와 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 구별하기 위한 프라이머 세트.Oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 1 and 2, oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 3 and 4, oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 5 and 6, oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 7 and 8, SEQ ID NOs: 9 and 10 One or more primer sets selected from the group consisting of an oligonucleotide primer set, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 11 and 12, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 13 and 14, and an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 15 and 16 A set of primers to distinguish aloe vera, aloe saponaria and aloe growth.
  2. 제1항에 있어서, The method of claim 1,
    (a) 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트;(a) from the group consisting of an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 1 and 2, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 3 and 4, an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 5 and 6, and an oligonucleotide primer set of SEQ ID NOs: 13 and 14 One or more primer sets selected;
    (b) 서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트; 및 (b) at least one primer set selected from the group consisting of oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 9 and 10 and oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 11 and 12; And
    (c) 서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 15와 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트;를 포함하는 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 구별하기 위한 프라이머 세트.(c) one or more primer sets selected from the group consisting of oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 7 and 8 and oligonucleotide primer sets of SEQ ID NOs: 15 and 16; distinguishing aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth Primer set to
  3. 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 구별하기 위한 키트.A kit for distinguishing aloe vera, aloe saponaria and aloe growth, comprising the primer set of claim 1 or 2 and a reagent for carrying out an amplification reaction.
  4. 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;Isolating genomic DNA from aloe vera, aloe saponaria, and aloe suspicious samples;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 다형성 뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및Amplifying polymorphic nucleotides by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the oligonucleotide primer set of claim 1; And
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 알로에 베라, 알로에 사포나리아 및 알로에 생장을 구별하는 방법.Detecting the amplification product; aloe vera, aloe saponaria, and aloe growth.
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