WO2018091815A1 - Bioelectrode pour la detection et la mesure de metabolites, et procede de preparation - Google Patents

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WO2018091815A1
WO2018091815A1 PCT/FR2017/053108 FR2017053108W WO2018091815A1 WO 2018091815 A1 WO2018091815 A1 WO 2018091815A1 FR 2017053108 W FR2017053108 W FR 2017053108W WO 2018091815 A1 WO2018091815 A1 WO 2018091815A1
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poly
polypeptide
oxidase
enzyme
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PCT/FR2017/053108
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Roisin OWENS
Mary DONAHUE
Xenofon STRAKOSAS
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Association Pour La Recherche Et Le Developpement De Methodes Et Processus Industriels "Armines"
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    • G01N27/4146—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS involving nanosized elements, e.g. nanotubes, nanowires

Definitions

  • the present invention relates to the field of biosensors that provide a detectable electrochemical response after direct oxidation of a redox metabolite to the surface of an electrode.
  • the invention provides a novel bioelectrode for the continuous detection and measurement of metabolites at the interface of human or animal cells or tissues, without damaging their integrity or functioning.
  • the invention also relates to a method of manufacturing such a bioelectrode by deposition of successive layers, also called “bio-stack" method.
  • a device for detecting and / or measuring metabolites comprising a bioelectrode according to the invention also forms part of the invention.
  • Bio-functionalization techniques involve immobilizing a bio-recognition element on the active surface of a sensor to enable the detection of target molecules via the appearance of a transduction signal. These techniques make it possible to functionalize the surface of medical devices with biomolecules to improve biocompatibility and facilitate integration into living systems for in vitro and in vivo applications.
  • a bio-functionalization technique is described in the publication of X. Strakosas et al., Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2, 2537-2545. Other bio-functionalization strategies are summarized in the article by X. Strakosas et al., Journal of Materials Chemistry B, 2016, 4, 4952-4968.
  • No. 5,225,064 discloses biosensors using glucose oxidase (GOx) as the detection enzyme for detecting glucose.
  • biosensors comprise a layer of horseradish peroxidase (HRP) deposited directly on the conductive surface, then a layer of glucose oxidase (GOx).
  • HRP horseradish peroxidase
  • GOx glucose oxidase
  • the ion-electron transduction efficiency (electronic / ionic mixed conductivity) of biosensors has been improved through the use of conductive polymers.
  • D. Mackey et al. have for example described the bio-functionalization of electrodes by electrostatic adsorption of enzymes on their surface, the bioelectrodes being first coated with a conducting polymer PANI / PVS, then with a layer of glucose oxidase (GOx ), and a layer of reinforcing peroxidase (HRP) useful for converting the hydrogen peroxide released during the oxidation of glucose to gluconate (D.
  • the inventors have succeeded in improving this technique by integrating into the biosensor layers of intermediate polypeptides carrying ionic charges opposite to those of the oxidoreductase and peroxidase enzymes. They observed that these layers of intermediate polypeptides prevented interferences between the enzymes. The spacing between the enzymes created by the charged polypeptide layers prevents the activity of one enzyme from being impaired by the operation of another enzyme. This has the direct effect of improving the detection and measurement of metabolites. The inventors have also observed that the deposition of intermediate polypeptides renders the biosensor functional in ranges of concentrations much wider than those of existing biosensors, and allowed to widen their fields of application.
  • the subject of the present invention is a bioelectrode comprising:
  • a layer of a second polypeptide, having ionic charges opposite to those of the oxidoreductase enzyme is deposited on the layer (d)
  • a layer of peroxidase enzyme having ionic charges opposite to those of the second polypeptide, is deposited on the layer (e).
  • a peroxidase enzyme layer is deposited directly on the layer (d), without the intermediary of a second layer of ionic charge-bearing polypeptide (layer (e)).
  • the simultaneous presence of oxidoreductase and peroxidase enzymes on the biosensor of the invention allows the electrochemical detection of the metabolites that come into contact with the electrode, and the elimination of excess hydrogen peroxide formed in the medium. It is preferable to remove the excess hydrogen peroxide formed in the medium during in vitro and in vivo experiments, with hydrogen peroxide being extremely toxic to the surrounding cells.
  • the conductive substrate (a) advantageously comprises a conductive polymer, preferably having a mixed ionic / electronic conductivity.
  • the conductive polymer of the invention comprises sulphonated groups -SO 3 H.
  • the preferred conductive polymers are poly (3,4-ethylenedioxythiophene) -poly (styrenesulphonate) (PEDOT: PSS) and poly (3,4- ethylenedioxythiophene) tosylate (PEDOT: TOS).
  • the PEDOT: PSS has the advantage of being biocompatible, usable in solution, and to be a good ionic conductor (improved interface for biological applications), which makes it particularly advantageous.
  • the conductive substrate (a) comprises a conductive polymer and pendant hydroxyl-OH groups. Hydroxy-OH groups can be generated:
  • the conductive substrate (a) a mixture of conductive polymer and alcohol such as polyvinyl alcohol, and preferably a mixture of PEDOT: PSS and polyvinyl alcohol as described in the article by X. Strakosas et al., Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2, 2537-2545, or by surface treating, for example with an oxygen plasma, the conductive substrate (a) comprising a conductive polymer for generating hydroxy-OH groups (RX, He et al., Journal of Materials Chemistry, 2012, 22, 22072-22076). ).
  • the hydroxy-OH groups on the surface of the conductive substrate (a) allow the silanization, and thus the fixation of the organosilane compound of the layer (b) on the conductive substrate (a).
  • the platinum nanoparticles present in the conductive polymer have the effect of improving the electrocatalytic performance of the electrode by catalyzing the reaction between the hydrogen peroxide and the peroxidase enzyme (SB Hall et al., Electrochimica Acta, 43). (5), pp. 579-588, Lingane, Journal of Electroanalytical Chemistry (1959), 2 (4), pp. 296-309).
  • the presence of platinum nanoparticles within the conductive polymer improves the electron transfer between the upper layers and the conductive substrate (a).
  • the inventors have in particular observed that the topography of platinum nanoparticles makes it possible to promote the transport of electrons within the bioelectrode.
  • the organosilane compound used to form the layer (b) reacts with the functional groups of the first ionic charge-bearing polypeptide deposited on the layer (b).
  • the organosilane compound used to form the layer (b) has the formula RY-Si (X) 3 , in which:
  • R is a reactive organic group, preferably selected from vinyl, (meth) acrylate, epoxy, isocyanate, amino,
  • Y is an alkyl or aryl group
  • X is a hydrolyzable group which, once hydrolysed, is covalently bound to the conductive substrate (a), X being preferably a halogen atom or a group of the formula OR 'wherein R' is an alkyl group.
  • Alkyl a saturated, linear or branched, saturated hydrocarbon aliphatic group of C 1 -C 2 O, preferably C 1 -C 12, more preferably C 1 -C 6 and still more preferably C 1 -C 4.
  • branched means that at least one lower alkyl group such as methyl or ethyl is carried by a linear alkyl chain.
  • alkyl groups that may be mentioned include methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, t-butyl and n-pentyl.
  • Aryl any functional group or substituent derived from at least one aromatic ring; an aromatic ring corresponds to any planar mono- or polycyclic group comprising a delocalized ⁇ system in which each atom of the cycle comprises an orbital p, said orbital p overlapping each other; among such aryl groups there may be mentioned phenyl, biphenyl, naphthalene and anthracene groups.
  • the aryl groups of the invention preferably comprise from 4 to 12 carbon atoms, and even more preferably from 5 to 6 carbon atoms. Even more preferably, the aryl group of the invention is a phenyl group.
  • the organosilane compound used to form the layer (b) is chosen from 3-glycidyloxypropyltriethoxysilane, 3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane, 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane, aminoethylaminopropyltrimethoxysilane, vinyltriethoxysilane, tetramethoxysilane, tetraethoxysilane, methyltrimethoxysilane, or their mixture.
  • polypeptide means a chain of amino acids linked together by peptide bonds. Said polypeptide preferably comprises between 100 and 1500 amino acids.
  • the first ionic charge carrying polypeptide of layer (c) is preferably a positively charged polypeptide. It preferably has a molecular weight ranging from 50 ⁇ 10 3 to 150 ⁇ 10 3 g. mol "1.
  • it is chosen from poly-L-lysine, poly-D-lysine, poly-L-arginine or poly-D-arginine, and particularly advantageously is poly L-lysine
  • the ionic charge carrying polypeptide of layer (c) makes it possible to adjust the spacing between the oxidoreductase enzyme layer (d) and the conductive substrate (a).
  • the oxidoreductase enzyme of layer (d) is preferably an oxidase enzyme, an enzyme specific for the metabolite of interest.
  • the expression "metabolites” means the biological molecules produced by biological organisms during the metabolism.
  • the metabolites of interest are usually proteins.
  • the oxidoreductase enzyme of layer (d) is preferably an oxidoreductase enzyme of class EC 1 (nomenclature IUBMB), and even more preferably an oxidase enzyme chosen from glucose oxidase enzymes.
  • glucose oxidase (GOx) and lactate oxidase (LOx) are the most preferred enzymes.
  • the oxidoreductase enzyme concentration of the layer (d) depends on the nature of the oxidoreductase enzyme used, and preferably varies from 0.2 to 10 gL -1 .
  • the second ionic charge bearing polypeptide of layer (e), if present, may be the same or different from the first ionic charge bearing polypeptide of layer (c). It preferably has a molecular weight ranging from 50 ⁇ 10 3 to 150 ⁇ 10 3 g. mol "1.
  • the second carrier of ionic charges of the layer polypeptide (e) is preferably selected from poly-L-lysine, poly-D-lysine, poly-L-arginine or poly-D-arginine. Particularly advantageously, it is poly-L-lysine.
  • the peroxidase enzyme of layer (f) converts hydrogen peroxide into a non-toxic product.
  • the peroxidase enzyme of layer (f) is preferably horseradish peroxidase (HRP) or catalase, and even more preferably horseradish peroxidase (HRP). These same peroxidases or catalases can serve as a layer (f) deposited directly on the layer (d) of oxidoreductase enzyme.
  • the invention also relates to a method for manufacturing a bioelectrode according to the invention comprising the following steps:
  • step (ii) depositing a layer of a first ionic charge carrying polypeptide (c) on the layer obtained at the end of step (i),
  • step (iv) optionally depositing a layer of a second ionic charge-bearing polypeptide (e) on the layer obtained at the end of step (iii),
  • step (v) optionally depositing a layer of peroxidase enzyme (f) having ionic charges opposite to that of the second polypeptide on the layer obtained at the end of step (iv), or optional deposition of a layer of peroxidase enzyme (f) on the layer obtained at the end of step (iii).
  • the conductive substrate (a) used during step (i) is prepared beforehand by depositing a conductive polymer on a substrate such as a substrate made of glass, silicon, metal oxide, or a polymeric substrate as for example a SU-8 resin substrate, and preferably on a glass substrate.
  • the conductive polymer is as defined above, it is advantageously chosen from poly (3,4-ethylenedioxythiophene) -poly (styrenesulphonate) (PEDOT: PSS) and poly (3,4-ethylenedioxythiophene) tosylate (PEDOT: TOS).
  • the conductive polymer is also advantageously used in a mixture with an alcohol such as polyvinyl alcohol, the incorporation of the alcohol into the conductive polymer can be carried out as described in the publication of X. Strakosas et al., Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2, 2537-2545.
  • the platinum nanoparticles can be added to the conductive polymer by electrodeposition.
  • the deposition step (i) may be carried out by applying an organosilane compound of formula RY-Si (X) 3 as described above to the conductive substrate (a), this deposition being preferably carried out by chemical deposition in the vapor phase (CVD).
  • the deposition step (i) is advantageously carried out at a temperature ranging from 50 to 150 ° C., and preferably from 80 to 120 ° C.
  • this deposition step is carried out for a period of 15 minutes to 2 hours, and preferably for a period of 30 to 90 minutes.
  • the organosilane compound of the layer (b) reacts with the amino function of the first ionic charge-bearing polypeptide.
  • the deposition of the first ionic charge-carrying polypeptide on the layer (b) comprising the organosilane compound can be carried out by chemical solution synthesis, electropolymerization or vapor phase polymerization. This deposit may be carried out for a period ranging from 30 minutes to 5 hours, and preferably for a period ranging from 1 to 3 hours.
  • the deposition of the first polypeptide on the organosilane compound is carried out at a temperature ranging from 15 to 27 ° C.
  • the step (iii) of binding the oxidoreductase enzyme (d) to the first ionic charge carrying polypeptide (c) is carried out by adding a carboxylic acid activator such as N-hydroxysuccinimide (NHS) or N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) mixed with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) (GT Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academy Press, San Diego, 1996).
  • a carboxylic acid activator such as N-hydroxysuccinimide (NHS) or N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) mixed with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) (GT Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academy Press, San Diego, 1996).
  • the oxidoreductase enzyme (d) is allowed to react on the
  • a step (iv) of depositing the second polypeptide layer (e) on the oxidoreductase enzyme layer (d) can be carried out, according to an advantageous embodiment of the invention, by depositing a solution comprising the second polypeptide (e) on the oxidoreductase enzyme layer (d) and allowing the oxidoreductase enzyme to react on the second polypeptide for a period of from 30 minutes to 5 hours, and preferably for a period of from 1 to 3 hours.
  • a step (v) of depositing the peroxidase enzyme (f) on the second ionic charge-carrying polypeptide (e) can then be carried out in the same way as in step (iii) by adding an activator of carboxylic acids such as N-hydroxysuccinimide (NHS) or N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) mixed with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC).
  • the peroxidase enzyme (f) is allowed to react on the second polypeptide (e) for a period of time ranging from 1 to 3 hours.
  • a deposition of the peroxidase enzyme (f) can be carried out directly on the oxidoreductase enzyme layer (d).
  • the bioelectrode obtained according to the process of the invention is then preferably stored under sterile conditions, for example in a phosphate buffered saline (PBS), at a temperature ranging from 0 to 10 ° C., and preferably from 2 to 60 ° C. vs.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Another object of the invention is a device for detecting and measuring metabolites capable of recognizing metabolites such as glucose, lactate, cholesterol, and more particularly glucose and lactate, said device comprising at least one bioelectrode according to the invention.
  • This device can be used to detect the presence of metabolites, or measure in situ the metabolic activity of living cells without damaging them.
  • the detection and measurement device of the invention can be used: for clinical applications, The. measures in electroencephalography (EEG) or electrocardiography (ECG), for example to understand the pathogens of hyper nutrient use with risk of epileptic seizure,
  • EoG electrocorticography
  • the detection and measurement device of the invention is advantageously an organic thin-film transistor (OTFT), and more particularly an organic electrochemical transistor (OECT) or an organic electro-field effect transistor controlled by an electrolyte (EGOFET).
  • OECT organic electrochemical transistor
  • EGOFET organic electro-field effect transistor controlled by an electrolyte
  • the detection and measurement device of the invention is an organic electrochemical transistor (OECT).
  • the gate is bio-functionalized (the platinum nanoparticles being deposited only on the gate).
  • Said OECT transistor can be manufactured according to the method described by D. Khodagholy et al., Nature Communications 4: 2133 (2013), DOI: 10.1038 / ncomms3133.
  • the invention also comprises other provisions which will emerge from the additional description which follows, which relates to the preparation of a bioelectrode according to the invention, and to Figures 1 to 9 which highlight the better sensitivity of the biolectrodes of the invention.
  • This example describes the manufacture of an organic electrochemical transistor (OECT) according to the invention. Preparation of the conductive substrate
  • the conductive substrate is manufactured according to the same method as that described by X. Strakosas et al. in Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2, 2537-2545.
  • Dodecylbenzenesulphonic acid (DBSA) at a concentration of 0.5 ⁇ L.mL -1 and ethylene glycol (Sigma Aldrich) at a concentration of 50 mL.mL -1 are added to the PEDOT: PSS (Heraeus, Clevios PH 1000) to improve film formation
  • the mixture is sonicated and filtered to remove aggregates.
  • the polyvinyl alcohol solution is then added to the PEDOT: PSS mixture.
  • a 25% by weight solution of PEDOT: PSS was prepared, mixed and filtered prior to spin coating on a glass substrate. The sample is heated at 140 ° C for 30 minutes, under atmospheric conditions.
  • the OECT transistor is manufactured as described in the article by D. Khodagholy et al., Nature Communications 4: 2133 (2013), DOI: 10.1038 / ncomms3133.
  • the source and drain contacts are positioned using a "lift-off” method and an S1813 photoresist, exposed to UV light through a SUSS MicroTec MJB4, and developed using an MF-developer. 26.
  • a layer of 5 nm of chromium and a layer of 100 nm of gold are successively deposited on the substrate using a thermal evaporator (BOC Edwards Auto 500).
  • the metal interconnects are isolated by depositing 2 ⁇ l of parylene C and 50 ⁇ l 3- (methacryloyloxy) propyltrimethoxysilane as a silane adhesion promoter with a SCS Labcoater ® 2.
  • a diluted solution of an industrial cleaner (Micro-90) is then spooled at a speed of 1500 rpm for 30 seconds.
  • a 5 ⁇ m layer of AZ9260 photoresist is then applied.
  • PEDOT: PSS / PVA in solution is applied to the spinning machine at a speed of 3000 rpm and then heated to 100 ° C. for 90 seconds.
  • the parylene layer C is removed, and after rinsing with deionized water the substrate is again heated at 140 ° C for 30 minutes.
  • Platinum nanoparticles are deposited in the conductive polymer by electroplating.
  • three electrodes connected to a Metrohm potentiostat are immersed in a solution comprising 5 mM chloroplatinic acid (H 2 PtCl 6 ) and 50 mM sulfuric acid (H 2 SO 4 ).
  • the reference electrode is an Ag / AgCl electrode
  • the counter electrode is a platinum mesh electrode
  • the device is then soaked overnight in deionized water.
  • Figure 1 is a photograph of the platinum nanoparticles within the scanning electron microscope (SEM) conductive polymer (Cari Zeiss AG - Ultra 55) (magnification: 194.50 k X (194.500 x)).
  • SEM scanning electron microscope
  • GOPS 3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane
  • CVD chemical vapor deposition
  • a desiccator with an aluminum base is placed on top of a hot plate and heated to a temperature of 90 ° C.
  • the OECT transistor and 200 ⁇ L of GOPS are placed in the aluminum desiccator.
  • the deposition operation is carried out under vacuum continuously for one hour.
  • the device is then rinsed with deionized water, and the cooking step continued for a further 30 minutes at 90 ° C.
  • Figure 2 illustrates the steps of deposition of the organosilane compound layer and deposition of the intermediate polypeptide layer, described above.
  • a solution of 10X PBS (phosphate buffered saline) is then added to the mixture to bring the pH to 7.4.
  • 1 ⁇ l of the activated enzyme is added dropwise to the previously applied poly-L-lysine layer and allowed to react at room temperature for 3 hours (during which the S-NHS groups of the activated enzyme bind to -NH 2 groups of poly-L-lysine). Careful rinsing is performed (three rinses with 10X PBS, followed by three rinses with deionized water).
  • a solution of 10X PBS (phosphate buffered saline) is then added to the mixture to bring the pH to 7.4.
  • 1 ⁇ l of the activated enzyme is added dropwise to the previously applied poly-L-lysine layer and allowed to react at room temperature for 3 hours (during which the S-NHS groups of the activated enzyme bind to -NH 2 groups of poly-L-lysine). Careful rinsing is performed (three rinses with 10X PBS, followed by three rinses with deionized water).
  • Figure 3 illustrates the deposition steps of the oxidoreductase enzyme layer, the intermediate polypeptide layer and the peroxidase enzyme layer.
  • the OECT transistor is then connected to a National Instrument PXIe-1062Q system to perform the measurements.
  • An OECT transistor is manufactured in the same manner as in Example 1 except that the conductive polymer layer is not present.
  • a layer of platinum is applied to the gold layer, instead of the parylene layer.
  • a layer of glucose oxidase (GOx) is then directly deposited on the platinum layer.
  • the absence of conductive polymer prevents any attachment of the enzyme.
  • the OECT transistor does not detect the presence of glucose.
  • An OECT transistor is manufactured in the same manner as in Example 1 by evaporating a layer of gold, followed by a layer of a mixture of PEDOT: PSS and polyvinyl alcohol. Platinum nanoparticles are deposited by electroplating within the conductive polymer mixture. A layer of glucose oxidase (GOx) is then directly deposited on the conductive polymer layer.
  • GOx glucose oxidase
  • the OECT transistor is functional and detects the enzymatic activity.
  • the oxidoreductase enzyme is simply "stuck" in the device, and the device becomes less and less sensitive (see Figure 3).
  • An OECT transistor is manufactured in the same manner as in Example 1 by successive evaporations of a layer of gold, followed by a layer of a mixture of PEDOT: PSS and polyvinyl alcohol. Platinum nanoparticles are deposited by electroplating within the conductive polymer mixture. A layer of poly-L-lysine is then deposited directly on the conductive polymer layer. A layer of glucose oxidase (GOx) is then directly deposited on the layer of poly-L-lysine.
  • GOx glucose oxidase
  • Figure 4 shows that the presence of intermediate poly-L-lysine increases the sensitivity of the response to an identical concentration of metabolite.
  • the presence of the ionic charge-bearing intermediate polypeptide optimally spaced the conductive polymer layer from that of the glucose oxidase enzyme (GOx) so that their respective functions do not interact with each other.
  • GOx glucose oxidase enzyme
  • Figure 5 shows a better stability of the OECT transistor and a better reproducibility of the measurements.
  • Figure 5 shows that the bioelectrode reacts reproducibly and stably at identical and progressive concentrations, and that the rinsing steps do not suppress the enzyme.
  • This example investigates the effect of the second ionic charge carrier polypeptide layer and the peroxidase enzyme layer used to neutralize the hydrogen peroxide diffused upon glucose oxidation.
  • An OECT transistor is prepared as described in Example 4.
  • a layer of poly-L-lysine is deposited directly on the glucose oxidase layer (GOx) of the OECT transistor of Example 4, and then a layer of horseradish peroxidase ( HRP) is then directly deposited on the poly-L-lysine layer.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the second layer of poly-L-lysine and the layer of horseradish peroxidase (HRP) are deposited as described in Example 1.
  • Figure 6 shows that the use of horseradish peroxidase (HRP) makes it possible to convert the diffused hydrogen peroxide and to control the reproducibility of the measurement.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the amount of hydrogen peroxide converted was also measured with the functionalized OECT transistor in the absence and presence of intermediate poly-L-lysine under the horseradish peroxide (HRP) layer.
  • the measured values are as follows:
  • FIG. 7 also shows that the presence of intermediate poly-L-lysine (device B) between the oxidoreductase enzyme and the reinforcing peroxide (HRP) improves the sensitivity of the OECT transistor with respect to the device A, which does not include any intermediate poly-L-lysine (the normalized NR response is substantially decreased in the presence of intermediate poly-L-lysine between the glucose oxidase (GOx) and peroxidase enzyme (HRP) layers).
  • device B intermediate poly-L-lysine
  • HRP reinforcing peroxide
  • An OECT transistor is prepared as described in Example 5, by varying the enzyme oxidoreductase / peroxidase enzyme ratio. This example examines the effect of concentration ratio between the oxidoreductase enzyme (GOx or LOx) and the peroxidase enzyme (HRP).
  • the purpose of this example is to validate the use of the bioelectrode of the invention for the in vitro measurement of the metabolic activity of cells originating from the renal epithelial cell line Madin-Darby Canine Kidney (MDCK1) (from (Institute of Cellular and Molecular Pharmacology, Valbonne, France).
  • MDCK1 Madin-Darby Canine Kidney
  • the OECT transistor used to carry out this measurement is the same as that described in Example 4, with the exception that the glucose oxidase (GOx) is replaced by lactate oxidase (LOx).
  • Gel is added between the different layers to prevent the MDCK1 cells from growing on the gate of the OECT transistor.
  • the gel used is prepared as follows: 10% by weight of polyethylene glycol diacrylate (PEG-DA, M w ⁇ 6000) is mixed with deionized water, then sonicated for 10 minutes until a clear solution is obtained. 2% by weight of the initiator 2-hydroxy-2-methylpropiophenone (Sigma Aldrich) is then added to the solution and mixed.
  • 1 ⁇ l of the formed hydrogel is then added dropwise to the OECT transistor and photopolymerized under a UV lamp at 405 nm for 3 minutes.
  • the addition of PEG-DA serves to prevent cell growth.
  • the device is rinsed once with PBS and once with deionized water, and then stored in PBS at a temperature of 4 ° C.
  • the MDCK1 cells are seeded on the OECT transistor, in a well which surrounds the active surface of the OECT transistor. They are then maintained at a temperature of 37 ° C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 and in DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, 10% fetal calf serum, and Pen / Step (5000 [U / mL] penicillin-5000 [pg / mL] streptomycin) The MDCK1 cells are incubated at a density of 6.10 4 cells / Transwell ® support (pore size: 0.4 ⁇ m, and area: 0.33 cm 2 ).
  • the bioelectrode of the invention is then immersed in the MDCK1 cell solution, as well as a control bioelectrode prepared in the same way as that of the invention, with the exception that the oxidoreductase enzyme and the peroxide of strength (HRP) are replaced at identical concentration by BSA (bovine serum albumin).
  • BSA bovine serum albumin

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Abstract

La présente invention se rapporte au domaine des biocapteurs qui fournissent une réponse électrochimique détectable après oxydation directe d'un métabolite rédox sur la surface de l'électrode. L'invention concerne plus particulièrement une nouvelle bioélectrode pour la détection et la mesure en continu de métabolites comprenant des couches de polypeptides intermédiaires porteurs de charges ioniques. L'invention vise également une méthode de fabrication d'une telle bioélectrode par dépôt de couches successives. Un dispositif de détection et/ou de mesure de métabolites comprenant une bioélectrode selon l'invention fait également partie de l'invention.

Description

BIOELECTRODE POUR LA DETECTION ET LA MESURE DE
METABOLITES, ET PROCEDE DE PREPARATION
La présente invention se rapporte au domaine des biocapteurs qui fournissent une réponse électrochimique détectable après oxydation directe d'un métabolite rédox à la surface d'une électrode. L'invention fournit une nouvelle bioélectrode pour la détection et la mesure en continu de métabolites à l'interface de cellules ou de tissus humains ou animaux, sans endommager leur intégrité, ni leur fonctionnement. L'invention concerne également une méthode de fabrication d'une telle bioélectrode par dépôt de couches successives, aussi appelée méthode « bio-stack ». Un dispositif de détection et/ou de mesure de métabolites comprenant une bioélectrode selon l'invention fait également partie de l'invention.
ETAT DE L'ART ANTÉRIEUR ET BUT DE L'INVENTION
Les techniques de bio-fonctionnalisation consistent à immobiliser un élément de bio-reconnaissance sur la surface active d'un capteur pour permettre la détection de molécules cibles via l'apparition d'un signal de transduction. Ces techniques permettent de fonctionnaliser la surface de dispositifs médicaux avec des biomolécules pour en améliorer la biocompatibilité et faciliter l'intégration dans des systèmes vivants pour des applications in vitro et in vivo. Une technique de bio-fonctionnalisation est décrite dans la publication de X. Strakosas et ai, Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2, 2537-2545. D'autres stratégies de bio-fonctionnalisation sont résumées dans l'article de X. Strakosas et ai., Journal of Materials Chemistry B, 2016, 4, 4952-4968.
Le transfert direct d'électrons entre une enzyme et la surface d'une électrode est d'un grand intérêt puisqu'il permet d'effectuer des mesures électrochimiques sans addition d'un médiateur à la solution d'analyte. Toutefois, l'électrochimie des protéines s'avère difficile du fait de la faible vitesse de transport (masse trop élevée) et la forte adsorption des protéines à la surface de l'électrode.
Bien qu'il existe des exemples de réponse électrochimique détectable basée sur l'oxydation directe d'une protéine rédox à la surface d'une électrode, la détection reste difficile. Il a également été suggéré que le transfert direct d'électrons puisse être facilité sur des surfaces d'électrodes présentant un environnement similaire à celui de la protéine d'oxydo-réduction à détecter, mais cette pratique a jusqu'à présent eu un succès limité du fait de la dénaturation des protéines.
US 5,225,064 décrit des biocapteurs utilisant la glucose oxydase (GOx) comme enzyme de détection pour détecter le glucose. Ces biocapteurs comprennent une couche de peroxydase de raifort (HRP) déposée directement sur la surface conductrice, puis une couche de glucose oxydase (GOx). Ces électrodes permettent un transfert direct des électrons entre la solution d'analyte et la surface de l'électrode, mais les taux de transfert s'avèrent trop faibles pour permettre une détection électrochimique efficace.
L'efficacité de transduction ion-électron (conductivité mixte électronique/ionique) des biocapteurs a été améliorées grâce à l'utilisation de polymères conducteurs. D. Mackey et al. ont par exemple décrit la bio- fonctionnalisation d'électrodes par adsorption électrostatique d'enzymes à leur surface, les bio-électrodes étant tout d'abord revêtues d'un polymère conducteur PANI/PVS, puis d'une couche de glucose oxydase (GOx), et d'une couche de peroxydase de raitfort (HRP) utile pour convertir le peroxyde d'hydrogène libéré lors de l'oxydation du glucose en gluconate (D. Mackey et al., Dublin Institute of Technology, 2007, Optimising the ratio of horseradish peroxidase and glucose oxidase on a bienzyme électrode: comparison of a theoretical and expérimental approach). La bio- fonctionnalisation par adsorption électrostatique présente l'inconvénient de ne pas être stable, notamment à concentrations élevées. Elle peut aussi modifier la conformation, et donc l'activité, des protéines.
De manière surprenante, les Inventeurs ont réussi à améliorer cette technique en intégrant dans le biocapteur des couches de polypeptides intermédiaires porteurs de charges ioniques opposées à celles des enzymes oxydoréductase et peroxydase. Ils ont observé que ces couches de polypeptides intermédiaires permettaient d'éviter les interférences entre les enzymes. L'espacement entre les enzymes créé par les couches de polypeptides chargées évite que l'activité d'une enzyme ne soit altérée par le fonctionnement d'une autre enzyme. Ceci a pour effet direct une amélioration de la détection et de la mesure des métabolites. Les Inventeurs ont également observé que le dépôt de polypeptides intermédiaires rendait le biocapteur fonctionnel dans des gammes de concentrations beaucoup plus larges que celles des biocapteurs existants, et permettait d'élargir leurs domaines d'application.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet une bioélectrode comprenant :
(a) un substrat conducteur comprenant des nanoparticules de platine,
(b) une couche d'au moins un composé organosilane déposée sur le substrat
(a),
(c) une couche d'un premier polypeptide porteur de charges ioniques, déposée sur la couche (b),
(d) une couche d'enzyme oxydoréductase ayant des charges opposées à celle du premier polypeptide, déposée sur la couche (c).
Selon un mode de réalisation avantageux, (e) une couche d'un deuxième polypeptide, ayant des charges ioniques opposées à celles de l'enzyme oxydoréductase, est déposée sur la couche (d), et (f) une couche d'enzyme peroxydase, ayant des charges ioniques opposées à celles du deuxième polypeptide, est déposée sur la couche (e). Selon ce mode de réalisation, l'invention propose donc une bioélectrode comprenant :
(a) un substrat conducteur comprenant des nanoparticules de platine,
(b) une couche d'au moins un composé organosilane déposée sur le substrat
(a),
(c) une couche d'un premier polypeptide porteur de charges ioniques, déposée sur la couche (b),
(d) une couche d'enzyme oxydoréductase ayant des charges ioniques opposées à celles du premier polypeptide, déposée sur la couche (c),
(e) une couche d'un deuxième polypeptide ayant des charges ioniques opposées à celles de l'enzyme oxydoréductase, déposée sur la couche (d), et
(f) une couche d'enzyme peroxydase ayant des charges ioniques opposées à celles du deuxième polypeptide, déposée sur la couche (e). Selon un autre mode de réalisation avantageux, (f) une couche d'enzyme peroxydase, est déposée directement sur la couche (d), sans l'intermédiaire d'une deuxième couche de polypeptide porteur de charges ioniques (couche (e)).
La présence simultanée d'enzymes oxydoréductase et peroxydase sur le biocapteur de l'invention permet la détection électrochimique des métabolites qui entrent en contact avec l'électrode, et l'élimination du peroxyde d'hydrogène formé en excès dans le milieu. Il est préférable de supprimer le peroxyde d'hydrogène en excès formé dans le milieu, lors des expériences in vitro et in vivo, le peroxyde d'hydrogène s'avérant extrêmement toxique pour les cellules environnantes.
Avantageusement dans la présente invention, les différentes couches (a), (b),
(c), (d), et si présentes (e) et (f) ou (f), constituant la bioélectrode de l'invention, sont liées les unes aux autres par des liaisons covalentes.
Le substrat conducteur (a) comprend avantageusement un polymère conducteur, de préférence ayant une conductivité mixte ionique/électronique. Le paramètre qui décrit cette relation est la transconductance, définie par gm = MJisSIq, où gm est la transconductance, AId est le changement de courant de drain, et AVg est le changement de potentiel au niveau de la grille (D. Khodagholy et al., Nature communications 4: 2133 (2013), DOI : 10.1038/ncomms3133). Avantageusement, le polymère conducteur de l'invention comprend des groupes sulfonés -S03H. Les polymères conducteurs préférés sont le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) - poly(styrènesulfonate) (PEDOT : PSS) et le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) - tosylate (PEDOT : TOS). Le PEDOT : PSS présente l'avantage d'être biocompatible, utilisable en solution, et d'être un bon conducteur ionique (interface améliorée pour les applications biologiques), ce qui le rend particulièrement avantageux.
Selon un mode de réalisation préféré, le substrat conducteur (a) comprend un polymère conducteur et des groupes hydroxy -OH pendants. Les groupes hydroxy -OH peuvent être générés :
soit en appliquant sur le substrat conducteur (a) un mélange de polymère conducteur et d'alcool tel que l'alcool polyvinylique, et de préférence un mélange de PEDOT : PSS et d'alcool polyvinylique comme décrit dans l'article de X. Strakosas et al., Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2, 2537-2545, soit en traitant en surface, par exemple avec un plasma oxygène, le substrat conducteur (a) comprenant un polymère conducteur pour générer des groupes hydroxy -OH (R-X. He et al., Journal of Materials Chemistry, 2012, 22, 22072- 22076).
Les groupes hydroxy -OH à la surface du substrat conducteur (a) permettent la silanisation, et donc la fixation du composé organosilane de la couche (b) sur le substrat conducteur (a).
Les nanoparticules de platine présentes dans le polymère conducteur ont pour effet d'améliorer les performances électro-catalytiques de l'électrode en catalysant la réaction entre le peroxyde d'hydrogène et l'enzyme peroxydase (S.B. Hall et al., Electrochimica Acta, 43(5), pp. 579-588 ; JJ. Lingane, Journal of Electroanalytical Chemistry (1959), 2(4), pp. 296-309). La présence de nanoparticules de platine au sein du polymère conducteur permet d'améliorer le transfert d'électrons entre les couches supérieures et le substrat conducteur (a). Les Inventeurs ont en particulier observé que la topographie des nanoparticules de platine permettait de promouvoir le transport des électrons au sein de la bioélectrode.
Le composé organosilane utilisé pour former la couche (b) réagit avec les groupes fonctionnels du premier polypeptide porteur de charges ioniques déposé sur la couche (b). Avantageusement, le composé organosilane utilisé pour former la couche (b) répond à la formule R-Y-Si(X)3, dans laquelle :
R est un groupe organique réactif, de préférence choisi parmi les groupes vinylique, (méth)acrylate, époxy, isocyanate, amino,
Y est un groupe alkyle ou aryle, et
X est un groupe hydrolysable qui, une fois hydrolysé, se lie de manière covalente au substrat conducteur (a), X étant de préférence un atome d'halogène ou un groupe de formule OR' dans lequel R' est un groupe alkyle.
Au sens de la présente invention, on entend par :
Alkyle : un groupe aliphatique hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié, en Ci-C2o, de préférence en C1-C12, plus préférentiel lement en CrC6, et encore plus préférentiellement en C1-C4. Le terme « ramifié » signifie qu'au moins un groupe alkyle inférieur tel qu'un méthyle ou un éthyle est porté par une chaîne alkyle linéaire. A titre de groupe alkyle, on peut mentionner par exemple les groupes méthyle, éthyle, n- propyle, i-propyle, n-butyle, t-butyle et n-pentyle.
Aryle : tout groupe fonctionnel ou substituant dérivé d'au moins un cycle aromatique ; un cycle aromatique correspond à tout groupe mono- ou polycyclique plan comportant un système π délocalisé dans lequel chaque atome du cycle comporte une orbitale p, lesdites orbitales p se recouvrant les unes les autres ; parmi de tels groupes aryle, on peut mentionner les groupes phényle, biphényle, naphthalène et anthracène. Les groupes aryles de l'invention comprennent de préférence de 4 à 12 atomes de carbone, et de manière encore plus préférée de 5 ou 6 atomes de carbone. De manière encore plus préférée, le groupe aryle de l'invention est un groupe phényle.
Selon un mode de réalisation préféré, le composé organosilane utilisé pour former la couche (b) est choisi parmi le 3-glycidyloxypropyltriéthoxysilane, le 3- glycidyloxypropyltriméthoxysilane, le 3-méthacryloxypropyltriméthoxysilane, l'aminoéthylaminopropyltriméthoxysilane, le vinyltriéthoxysilane, le tétraméthoxysilane, le tétraéthoxysilane, le méthyltriméthoxysilane, ou leur mélange.
Au sens de l'invention, on entend par polypeptide une chaîne d'acides aminés reliés entre eux par des liaisons peptidiques. Ledit polypeptide comprend de préférence entre 100 et 1500 acides aminés.
Le premier polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (c) est de préférence un polypeptide chargé positivement. Il a de préférence une masse moléculaire allant de 50.103 à 150.103 g. mol"1. Avantageusement, il est choisi parmi la poly-L-lysine, la poly-D-lysine, la poly-L-arginine ou la poly-D-arginine. De manière particulièrement avantageuse, il s'agit de la poly-L-lysine. Le polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (c) permet d'ajuster l'espacement entre la couche d'enzyme oxydoréductase (d) et le substrat conducteur (a).
L'enzyme oxydoréductase de la couche (d) est de préférence une enzyme oxydase, enzyme spécifique du métabolite d'intérêt. Au sens de l'invention, on entend par métabolites les molécules biologiques produites par des organismes biologiques pendant le métabolisme. Les métabolites d'intérêt sont généralement des protéines. L'enzyme oxydoréductase de la couche (d) est de préférence une enzyme oxydoréductase de classe EC 1 (nomenclature IUBMB), et encore plus préférentiellement une enzyme oxydase choisie parmi les enzymes glucose oxydase (GOx), cholestérol oxydase, xanthine oxydase (XO), amino-acide oxydase (AAO), lactate oxydase (LOx), glycolate oxydase, pyridoxal-4-oxydase, sorbose oxydase, gluconolactone oxydase ou galactose oxydase. Les enzymes glucose oxydase (GOx) et lactate oxydase (LOx) sont les enzymes les plus préférées.
Avantageusement, la concentration en enzyme oxydoréductase de la couche (d) dépend de la nature de l'enzyme oxydoréductase utilisée, et varie de préférence de 0,2 à 10 g.L"1.
Le deuxième polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (e), si présent, peut être le même ou différent du premier polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (c). Il a de préférence une masse moléculaire allant de 50.103 à 150.103 g. mol"1. Le deuxième polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (e) est de préférence choisi parmi la poly-L-lysine, la poly-D-lysine, la poly-L-arginine ou la poly-D-arginine. De manière particulièrement avantageuse, il s'agit de la poly-L-lysine.
L'enzyme peroxydase de la couche (f) transforme le peroxyde d'hydrogène en un produit non toxique. L'enzyme peroxydase de la couche (f) est de préférence la peroxydase de raifort (HRP) ou la catalase, et encore plus préférentiellement la peroxydase de raifort (HRP). Ces mêmes peroxydases ou catalases peuvent servir de couche (f), déposée directement sur la couche (d) d'enzyme oxydoréductase.
L'invention vise également un procédé de fabrication d'une bioélectrode selon l'invention comprenant les étapes suivantes :
(i) dépôt d'une couche d'au moins un composé organosilane (b) sur un substrat conducteur (a),
(ii) dépôt d'une couche d'un premier polypeptide porteur de charges ioniques (c) sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (i),
(Ni) dépôt d'une couche d'enzyme oxydoréductase (d) ayant des charges ioniques opposées à celles du premier polypeptide sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (ii),
(iv) dépôt éventuel d'une couche d'un deuxième polypeptide porteur de charges ioniques (e) sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (iii),
(v) dépôt éventuel d'une couche d'enzyme peroxydase (f) ayant des charges ioniques opposées à celle du deuxième polypeptide sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (iv), ou dépôt éventuel d'une couche d'enzyme peroxydase (f) sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (iii)..
Le substrat conducteur (a) mis en œuvre lors de l'étape (i) est préparé au préalable par dépôt d'un polymère conducteur sur un substrat tel qu'un substrat en verre, en silicium, en oxyde métallique, ou un substrat polymérique comme par exemple un substrat en résine SU-8, et de préférence sur un substrat en verre. Le polymère conducteur est tel que défini ci-dessus, il est avantageusement choisi parmi le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) - poly(styrènesulfonate) (PEDOT : PSS) et le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) - tosylate (PEDOT : TOS). Le polymère conducteur est par ailleurs avantageusement utilisé en mélange avec un alcool tel que l'alcool polyvinylique, l'incorporation de l'alcool au sein du polymère conducteur pouvant être réalisée comme décrit dans la publication de X. Strakosas et al., Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2, 2537-2545.
Les nanoparticules de platine peuvent être ajoutées au polymère conducteur par électrodéposition.
L'étape (i) de dépôt peut être réalisée par application d'un composé organosilane de formule R-Y-Si(X)3 tel que décrit ci-dessus sur le substrat conducteur (a), ce dépôt étant de préférence réalisée par dépôt chimique en phase vapeur (CVD). L'étape (i) de dépôt est avantageusement réalisée à une température allant de 50 à 150°C, et de préférence de 80 à 120°C. Avantageusement cette étape de dépôt est réalisée pendant une durée de 15 minutes à 2 heures, et de préférence pendant une durée de 30 à 90 minutes.
Durant l'étape (ii) de dépôt, le composé organosilane de la couche (b) réagit avec la fonction aminé du premier polypeptide porteur de charges ioniques. Avantageusement, le dépôt du premier polypeptide porteur de charges ioniques sur la couche (b) comprenant le composé organosilane peut être réalisé par synthèse chimique en solution, électropolymérisation ou polymérisation en phase vapeur. Ce dépôt peut être réalisé pendant une durée allant de 30 minutes à 5 heures, et de préférence pendant une durée allant de 1 à 3 heures. Avantageusement, le dépôt du premier polypeptide sur le composé organosilane est réalisé à une température allant de 15 à 27°C. L'étape (iii) de liaison de l'enzyme oxydoréductase (d) sur le premier polypeptide porteur de charges ioniques (c) est réalisée par ajout d'un activateur d'acides carboxyliques tel que le N-hydroxysuccinimide (NHS) ou le N- hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) en mélange avec le l-éthyl-3-(3- diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) (G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Académie Press, San Diego, 1996). L'enzyme oxydoréductase (d) est laissée à réagir sur le premier polypeptide (c) pendant une durée pouvant aller de 1 à 3 heures.
Une étape (iv) de dépôt de la couche de deuxième polypeptide (e) sur la couche d'enzyme oxydoréductase (d) peut être réalisée, selon un mode avantageux de mise en œuvre de l'invention, en déposant une solution comprenant le deuxième polypeptide (e) sur la couche d'enzyme oxydoréductase (d) et en laissant l'enzyme oxydoréductase réagir sur le deuxième polypeptide pendant une durée allant de 30 minutes à 5 heures, et de préférence pendant une durée allant de 1 à 3 heures.
Une étape (v) de dépôt de l'enzyme peroxydase (f) sur le deuxième polypeptide porteur de charges ioniques (e) peut ensuite être réalisée de la même façon qu'à l'étape (iii) par ajout d'un activateur d'acides carboxyliques tel que le N- hydroxysuccinïmide (NHS) ou le N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) en mélange avec le l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC). L'enzyme peroxydase (f) est laissée à réagir sur le deuxième polypeptide (e) pendant une durée pouvant aller de 1 à 3 heures. Selon un autre mode de réalisation, un dépôt de l'enzyme peroxydase (f) peut être réalisée directement sur la couche d'enzyme oxydoréductase (d).
La bioélectrode obtenue selon le procédé de l'invention est ensuite de préférence stockée dans des conditions stériles, par exemple dans un tampon phosphate salin (PBS), à une température allant de 0 et 10°C, et de préférence de 2 à 60°C.
Un autre objet de l'invention vise un dispositif de détection et de mesure de métabolites capable de reconnaître des métabolites tels que le glucose, le lactate, le cholestérol, et plus particulièrement le glucose et le lactate, ledit dispositif comprenant au moins une bioélectrode selon l'invention. Ce dispositif peut être utilisé pour détecter la présence de métabolites, ou mesurer in situ l'activité métabolique de cellules vivantes sans les endommager. Le dispositif de détection et de mesure de l'invention peut être utilisé : pour des applications cliniques, Le. mesures en électroencéphalographie (EEG) ou en électrocardiographie (ECG), par exemple pour comprendre les pathoogies d'hyper utilisation de nutriments avec risque de crise d'épilepsie,
pour des mesures in vitro, Le. intégrité de barrière cellulaire, monitoring de métabolites pour des suivis toxicologiques, de diagnostic,
pour des mesures in vivo, Le. mesures en électrocorticographie (ECoG), monitoring de métabolites pour des suivis toxicologiques, de diagnostic, et
pour des mesures in toto (stimulation électrique d'un réseau neuronal). Le dispositif de détection et de mesure de l'invention est avantageusement un transistor organique à couche mince (OTFT), et plus particulièrement un transistor électrochimique organique (OECT) ou un transistor organique à effet de champ commandé par un électrolyte (EGOFET). De manière préférée, le dispositif de détection et de mesure de l'invention est un transistor électrochimique organique (OECT). Dans le dispositif de détection et de mesure de l'invention, c'est la grille qui est bio- fonctionnalisée (les nanoparticules de platine étant déposées uniquement sur la grille). Ledit transistor OECT peut être fabriqué selon la méthode décrite par D. Khodagholy et al., Nature communications 4: 2133 (2013), DOI : 10.1038/ncomms3133.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront du complément de description qui suit, qui se rapporte à la préparation d'une bioélectrode selon l'invention, et aux Figures 1 à 9 qui mettent en évidence la meilleure sensibilité des biolélectrodes de l'invention.
EXEMPLES Exemple 1 :
Cet exemple décrit la fabrication d'un transistor électrochimique organique (OECT) selon l'invention. Préparation du substrat conducteur :
Le substrat conducteur est fabriqué selon la même méthode que celle décrite par X. Strakosas et al. dans Journal of Materials Chemistry B, 2014, 2, 2537-2545.
De l'acide dodécylbenzènesulfonique (DBSA) à une concentration de 0,5 pL.mL'1 et de l'éthylène glycol (Sigma Aldrich) à une concentration de 50 mL.mL"1 sont ajouté au PEDOT : PSS (Heraeus, Clevios PH 1000) pour améliorer la formation du film. Le mélange est soumis à une sonication et filtré pour éliminer les agrégats.
Une solution à 5% en poids d'alcool polyvinylique (Mw moyenne = 130 000 g. mol'1) est chauffé pendant 30 secondes au four à micro-ondes jusqu'à obtention d'une solution claire. La solution d'alcool polyvinylique est ensuite ajoutée au mélange de PEDOT : PSS. Une solution à 25% en poids de PEDOT : PSS a été préparée, mélangée et filtrée avant dépôt par spin-coating sur un substrat en verre. L'échantillon est chauffé à 140°C pendant 30 minutes, sous conditions atmosphériques. Fabrication du transistor OECT :
Le transistor OECT est fabriqué comme décrit dans l'article de D. Khodagholy et al., Nature communications 4: 2133 (2013), DOI : 10.1038/ncomms3133.
Sur une lame de verre, sont déposés successivement de l'or, du parylène et le substrat conducteur PEDOT : PSS/PVA précédemment préparé.
Tout d'abord, les contacts de source et de drain sont positionnés en utilisant un procédé « lift-off » et une résine photorésistante S1813, exposé à la lumière UV à travers un appareil SUSS MicroTec MJB4, et développé en utilisant un développeur MF- 26.
Une couche de 5 nm de chrome et une couche de 100 nm d'or sont successivement déposées sur le substrat en utilisant un évaporateur thermique (BOC Edwards Auto 500). Les interconnexions métalliques sont isolées en déposant dessus 2 pm de parylène C et 50 pL 3-(méthacryloyloxy)propyltriméthoxysilane comme promoteur d'adhésion silané, avec un SCS Labcoater® 2. Une solution diluée d'un nettoyant industriel (Micro-90) est ensuite déposé à la tournette à une vitesse de 1500 tours/minute pendant 30 secondes. Une couche de 5 pm d'une résine photorésistante AZ9260 est ensuite appliquée. Ensuite, une couche de PEDOT : PSS/PVA en solution est appliquée à la tournette à une vitesse de 3000 tours/minute, puis chauffé à 100°C pendant 90 secondes. La couche de parylène C est enlevée, puis après rinçage à l'eau déionisée le substrat est à nouveau chauffé à 140°C pendant 30 minutes.
Dépôt des nanoparticules de platine :
Des nanoparticules de platine sont déposées au sein du polymère conducteur par électrodéposition. Pour se faire, trois électrodes reliées à un potentiostat Metrohm sont plongées dans une solution comprenant 5 mM d'acide chloroplatinique (H2PtCI6) et 50 mM d'acide sulfurique (H2S04). L'électrode de référence est une électrode Ag/AgCI, la contre-électrode est une électrode à mailles en platine, la grille plane du transistor OECT jouant le rôle d'électrode de travail. La méthode voltampérométrique est utilisée avec un potentiel initial Voff = + 0,7 vs Ag/AgCI pendant 60 secondes, puis un potentiel final Von = - 0,2 vs Ag/AgCI est appliqué pendant 10 secondes au cours desquelles se produit le dépôt des nanoparticules de platine. Le dispositif est ensuite mis à tremper pendant une nuit dans de l'eau déionisée.
La Figure 1 est une photographie des nanoparticules de platine au sein du polymère conducteur prise au microscope électronique à balayage (SEM) (Cari Zeiss AG - Ultra 55) (grossissement : 194,50 k X (194,500 x)).
Dépôt de la couche de composé organosilane :
200 pL de 3-glycidyloxypropyltriméthoxysilane (GOPS) (Sigma Aldrich) est déposé par dépôt chimique en phase vapeur (CVD) sur le substrat conducteur préparé précédemment. Un dessiccateur avec une base aluminium est placé en haut d'une plaque chauffante et chauffé à une température de 90°C. Le transistor OECT ainsi que 200 pL de GOPS sont placé dans le dessiccateur en aluminium. L'opération de dépôt est réalisée sous vide en continue, pendant une heure. Le dispositif est ensuite rincé à l'eau déionisée, et l'étape de cuisson poursuivie pendant 30 minutes supplémentaires à 90°C.
Dépôt de la première couche de polypeptide intermédiaire :
1 pL d'une solution de poly-L-lysine à 0,1% en poids (Sigma Aldrich) est coulé au goutte-à-goutte sur la couche de 3-glycidyloxypropyltriméthoxysilane précédemment déposée. La réaction entre les deux couches se fait pendant 3 heures, puis le dispositif est placé sous haute pression de vapeur pour évaporer les gouttelettes restantes. Le dispositif est ensuite rincé avec de l'eau déionisée.
La Figure 2 illustre les étapes de dépôt de la couche de composé organosilane et de dépôt de la couche de polypeptide intermédiaire, décrites ci-dessus.
Dépôt de la couche d'enzyme oxydoréductase :
10 mg/mL de glucose oxydase (GOx) (Sigma Aldrich) sont mélangés avec 50 mM d'hydrochlorure de N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC) et de sulfo-NHS (Sigma Aldrich) dans une solution tampon d'acide 2-(N- morpholino)éthanesulfonique (MES). Le pH de la solution tampon est porté à 6 en ajoutant de la soude (NaOH). Le mélange est laissé à température ambiante pendant une heure, le temps de laisser les fonctions acides carboxyliques des polypeptides s'activer et s'estérifier avec le sulfo-NHS. Une solution de PBS 10X (solution saline tamponnée au phosphate) est ensuite ajoutée au mélange pour porter le pH à 7,4. Enfin, 1 pL de l'enzyme activée est ajouté au goutte-à-goutte sur la couche de poly-L- lysine appliquée précédemment, et laissé à réagir à température ambiante pendant 3 heures (pendant lesquelles les groupes S-NHS de l'enzyme activée se lient aux groupes -NH2 de la poly-L-lysine). Un rinçage minutieux est réalisé (trois rinçages au PBS 10X, suivis de trois rinçages à l'eau déionisée).
Dépôt de la deuxième couche de polypeptide intermédiaire :
1 μί d'une solution de poly-L-lysine à 0,1% en poids (Sigma Aldrich) est coulé au goutte-à-goutte sur la couche de 3-glycidyloxypropyltriméthoxysilane précédemment déposée. La réaction entre les deux couches se fait pendant 3 heures, puis le dispositif est placé sous haute pression de vapeur pour évaporer les gouttelettes restantes. Le dispositif est ensuite rincé avec de l'eau déionisée.
Dépôt de la couche d'enzyme peroxydase :
10 mg/mL d'enzyme peroxydase (Sigma Aldrich) sont mélangés avec 50 mM d'hydrochlorure de N-(3-diméthylaminopropyl)-N'-éthylcarbodiimide (EDC) et de sulfo- NHS (Sigma Aldrich) dans une solution tampon d'acide 2-(N- morpholino)éthanesulfonique (MES). Le pH de la solution tampon est porté à 6 en ajoutant de la soude (NaOH). Le mélange est laissé à température ambiante pendant une heure, le temps de laisser les fonctions acides carboxyliques des polypeptides s'activer et s'estérifier avec le sulfo-NHS. Une solution de PBS 10X (solution saline tamponnée au phosphate) est ensuite ajoutée au mélange pour porter le pH à 7,4. Enfin, 1 pL de l'enzyme activée est ajouté au goutte-à-goutte sur la couche de poly-L- lysine appliquée précédemment, et laissé à réagir à température ambiante pendant 3 heures (pendant lesquelles les groupes S-NHS de l'enzyme activée se lient aux groupes -NH2 de la poly-L-lysine). Un rinçage minutieux est réalisé (trois rinçages au PBS 10X, suivis de trois rinçages à l'eau déionisée).
La Figure 3 illustre les étapes de dépôt de la couche d'enzyme oxydoréductase, de la couche de polypeptide intermédiaire et de la couche d'enzyme peroxydase.
Le transistor OECT est ensuite relié à un système National Instrument PXIe- 1062Q pour effectuer les mesures.
Exemple 2 :
Un transistor OECT est fabriqué de la même manière qu'à l'exemple 1, sauf que la couche de polymère conducteur n'est pas présente. Une couche de platine est appliquée sur la couche d'or, en lieu et place de la couche de parylène. Une couche de glucose oxydase (GOx) est ensuite directement déposée sur la couche de platine.
L'absence de polymère conducteur empêche tout attachement de l'enzyme. Le transistor OECT ne détecte aucunement la présence de glucose.
Exemple 3 :
Un transistor OECT est fabriqué de la même manière qu'à l'exemple 1 par évaporations d'une couche d'or, suivie d'une couche d'un mélange de PEDOT : PSS et d'alcool polyvinylique. Des nanoparticules de platine sont déposées par électrodéposition au sein du mélange de polymère conducteur. Une couche de glucose oxydase (GOx) est ensuite directement déposée sur la couche de polymère conducteur.
Dans ce cas, le transistor OECT est fonctionnel et détecte l'activité enzymatique. Toutefois, l'enzyme oxydoréductase est simplement « coincée » dans le dispositif, et le dispositif devient de moins en moins sensible (voir la Figure 3).
Exemple 4 :
Un transistor OECT est fabriqué de la même manière qu'à l'exemple 1 par évaporations successives d'une couche d'or, suivie d'une couche d'un mélange de PEDOT : PSS et d'alcool polyvinylique. Des nanoparticules de platine sont déposées par électrodéposition au sein du mélange de polymère conducteur. Une couche de poly-L- lysine est ensuite déposée directement sur la couche de polymère conducteur. Une couche de glucose oxydase (GOx) est ensuite directement déposée sur la couche de poly-L-lysine.
La Figure 4 montre que la présence de poly-L-lysine intermédiaire augmente la sensibilité de la réponse à une concentration identique en métabolite. La présence du polypeptide intermédiaire porteur de charges ioniques permet d'espacer de façon optimale la couche de polymère conducteur de celle de l'enzyme de glucose oxydase (GOx) afin que leurs fonctions respectives nlnteragissent pas entre elles.
Enfin, la Figure 5 met en évidence une meilleure stabilité du transistor OECT et une meilleure reproductibilité des mesures. La Figure 5 montre que la bioélectrode réagit de manière reproductible et stable à des concentrations identiques et évolutives, et que les étapes de rinçage ne suppriment pas l'enzyme. Exemple 5 :
Cet exemple étudie l'effet de la couche de deuxième polypeptide porteur de charges ioniques et de la couche d'enzyme peroxydase utilisée pour neutraliser le peroxyde d'hydrogène diffusé lors de l'oxydation du glucose.
Un transistor OECT est préparé comme décrit à l'exemple 4. Une couche de poly-L-lysine est déposée directement sur la couche de glucose oxydase (GOx) du transistor OECT de l'exemple 4, puis une couche de peroxydase de raifort (HRP) est ensuite directement déposée sur la couche de poly-L-lysine. La deuxième couche de poly-L-lysine et la couche de peroxydase de raifort (HRP) sont déposées comme décrit à l'exemple 1.
La Figure 6 montre que l'utilisation de peroxydase de raifort (HRP) permet de convertir le peroxyde d'hydrogène diffusé et de contrôler la reproductibilité de la mesure. Sur la Figure 6a (sans HRP), une différence de courant ΔΙ existe et correspond au peroxyde d'hydrogène diffusé qui se consomme. Plusieurs concentrations d'analyte (glucose) ont été testées (a = 2 μΜ, b = 4 μΜ, c = 8 μΜ, d = 15 μΜ, e = 30 μΜ, f = 62 μΜ, g = 125 uM, h = 250 u , i = 500 uM, j = 1 mM, k = 5 mM). La Figure 6b (avec HRP) montre que le peroxyde d'hydrogène a été consommé et que les mesures sont reproductibles. En l'absence de peroxyde de raifort (HRP), le peroxyde d'hydrogène risque de diffuser dans le milieu et d'endommager les tissus/cellules vivantes.
La quantité de peroxyde d'hydrogène converti a également été mesurée avec le transistor OECT fonctionnalisé en l'absence et en présence de poly-L-lysine intermédiaire sous la couche de peroxyde de raifort (HRP). Les valeurs mesurées sont les suivantes :
- en l'absence de poly-L-lysine : 53,5% d'H202 converti, et
- en présence de poly-L-lysine : 73,6% d'H202 converti.
Ces résultats montrent que la couche de poly-L-lysine intermédiaire sous la couche de peroxyde de raifort (HRP) améliore l'efficacité de neutralisation du peroxyde d'hydrogène.
La Figure 7 montre également que la présence de poly-L-lysine intermédiaire (dispositif B) entre l'enzyme oxydoréductase et le peroxyde de raitfort (HRP) améliore la sensibilité du transistor OECT par rapport au dispositif A, qui lui ne comprend pas de poly-L-lysine intermédiaire (la réponse normalisée NR est sensiblement diminuée en présence de poly-L-lysine intermédiaire entre les couches de glucose oxydase (GOx) et d'enzyme peroxydase (HRP)).
Exemple 6 :
Un transistor OECT est préparé comme décrit à l'exemple 5, en faisant varier le ratio enzyme oxydoréductase / enzyme peroxydase. Cet exemple étudie l'effet du ratio de concentration entre l'enzyme oxydoréductase (GOx ou LOx) et l'enzyme peroxydase (HRP).
Les résultats obtenus sont représentés sur la Figure 8 et montrent que le ratio de concentration entre l'enzyme oxydoréductase et l'enzyme peroxydase agit sur la sensibilité du biocapteur.
Exemple 7 :
Cet exemple a pour objectif de valider l'utilisation de la bioélectrode de l'invention pour la mesure in vitro de l'activité métabolique de cellules provenant de la lignée cellulaire de l'épithélium rénal Madin-Darby Canine Kidney (MDCK1) (en provenance de (Institut de Pharmacologie Cellulaire et Moléculaire, Valbonne, France).
Le transistor OECT utilisé pour réaliser cette mesure est le même que celui décrit à l'exemple 4, à l'exception du fait que la glucose oxydase (GOx) est remplacée par du lactate oxydase (LOx). Du gel est ajouté entre les différentes couches pour éviter que les cellules MDCK1 ne poussent sur la grille du transistor OECT. Le gel utilisé est préparé comme suit : 10% en poids de polyéthylène glycol diacrylate (PEG-DA, Mw ~ 6000) est mélangé avec de l'eau déionisée, puis soniqué pendant 10 minutes jusqu'à obtention d'une solution claire. 2% en poids de l'initiateur 2-hydroxy-2- méthylpropiophénone (Sigma Aldrich) est ensuite ajouté à la solution, puis mélangé. 1 pL de l'hydrogel formé est ensuite ajouté au goutte-à-goutte sur le transistor OECT et photo-polymérisé sous une lampe UV à 405 nm pendant 3 minutes. L'ajout de PEG-DA sert à empêcher la croissance des cellules. Enfin, le dispositif est rincé une fois avec du PBS et une fois avec de l'eau déionisée, puis stocké dans du PBS à une température de 4°C.
Les cellules MDCK1 sont ensemencées sur le transistor OECT, dans un puit qui entoure la surface active du transistor OECT. Elles sont ensuite maintenues à une température de 37°C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de C02 et en milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium, 10% de sérum de veau foetal, et Pen/Step (5000 [U/mL] pénicilline - 5000 [pg/mL] streptomycine). Les cellules MDCK1 sont incubées à une densité de 6.104 cellules/support Transwell® (taille des pores : 0,4 pm, et surface : 0,33 cm2). La bioélectrode de l'invention est ensuite plongée dans la solution de cellules MDCK1, ainsi qu'une bioélectrode de contrôle préparée de la même façon que celle de l'invention, à l'exception du fait que l'enzyme oxydoréductase et le peroxyde de raitfort (HRP) sont remplacés à concentration identique par du BSA (albumine de sérum bovin).
La différence de courant entre le dispositif de contrôle et le dispositif fonctionnalisé de l'invention, telle qu'elle apparaît sur la Figure 9, marque la mesure du métabolite relargué lors de la croissance cellulaire.

Claims

REVENDICATIONS
1. Bioélectrode caractérisée en ce qu'elle comprend :
(a) un substrat conducteur comprenant des nanoparticules de platine,
(b) une couche d'au moins un composé organosilane déposée sur le substrat
(a),
(c) une couche d'un premier polypeptide porteur de charges ioniques, déposée sur la couche (b), et
(d) une couche d'enzyme oxydoréductase ayant des charges opposées à celle du premier polypeptide, déposée sur la couche (c).
2. Bioélectrode selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre :
(e) une couche d'un deuxième polypeptide porteur de charges ioniques ayant des charges opposées à celles de l'enzyme oxydoréductase, déposée sur la couche (d), et
(f) une couche d'enzyme peroxydase ayant des charges opposées à celles du deuxième polypeptide, déposée sur la couche (e).
3. Bioélectrode selon la revendication 1 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre :
(f) une couche d'enzyme peroxydase, déposée sur la couche (d).
4. Bioélectrode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les différentes couches (a), (b), (c), (d), et si présentes (e) et (f) ou (f), constituant la bioélectrode de l'invention, sont liées les unes aux autres par des liaisons covalentes.
5. Bioélectrode selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisée en ce que le substrat conducteur (a) comprend un polymère conducteur, ledit polymère conducteur étant de préférence choisi parmi le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) poly(styrènesulfonate) (PEDOT : PSS) ou le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) - tosylate (PEDOT : TOS).
6. Bioélectrode selon la revendication 5 caractérisée en ce que le substrat conducteur (a) comprend un polymère conducteur et des groupes hydroxy -OH pendants.
7. Bioélectrode selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que le composé organosilane de la couche (b) répond à la formule R-Y-Si(X)3 dans laquelle :
Y est un groupe alkyle ou aryle,
R est un groupe organique réactif, de préférence choisi parmi les groupes vinylique, (méth)acrylate, époxy, isocyanate, amino, et
X est un groupe hydrolysable qui peut être hydrolysé pour former des liaisons covalentes avec le substrat conducteur (a), et de préférence X est un atome d'halogène ou un groupe de formule OR' dans lequel R' est un groupe alkyle en CrC6.
8. Bioélectrode selon la revendication 7 caractérisée en ce que le composé organosilane de la couche (b) est choisi parmi le 3-glycidyloxypropyltriéthoxysilane, le 3-glycidyloxypropyltriméthoxysilane, le 3-méthacryloxypropyltriméthoxysilane, raminoéthylaminopropyltriméthoxysilane, le vinyltriéthoxysilane, le tétraméthoxysilane, le tétraéthoxysilane, le méthyltriméthoxysilane, ou leur mélange.
9. Bioélectrode selon l'une des revendications 1 à 8 caractérisée en ce que le premier polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (c) est un polypeptide chargé positivement.
10. Bioélectrode selon la revendication 9 caractérisée en ce que le premier polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (c) est choisi parmi la poly-L- lysine, la poly-D-lysine, la poly-L-arginine ou la poly-D-arginine, et de préférence est la poly-L-lysine.
11. Bioélectrode selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisée en ce que l'enzyme oxydoréductase de la couche (d) est une enzyme oxydase, de préférence choisie parmi les enzymes glucose oxydase (GOx), cholestérol oxydase, xanthine oxydase (XO), amino-acide oxydase (AAO), lactate oxydase (LOx), glycolate oxydase, pyridoxal-4-oxydase, sorbose oxydase, gluconolactone oxydase ou galactose oxydase, et encore plus préférentiellement est l'enzyme glucose oxydase (GOx) ou l'enzyme lactate oxydase (LOx).
12. Bioélectrode selon l'une des revendications 2 ou 4 à 11 caractérisée en ce que le deuxième polypeptide porteur de charges ioniques de la couche (e) est choisi parmi la poly-L-lysine, la poly-D-lysine, la poly-L-arginine ou la poly-D-arginine, et de préférence est la poly-L-lysine.
13. Bioélectrode selon l'une des revendications 2 à 12 caractérisée en ce que l'enzyme peroxydase de la couche (f) ou (f) est la peroxydase de raifort (HRP).
14. Procédé de fabrication d'une bioélectrode selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
(i) dépôt d'une couche d'au moins un composé organosilane (b) sur un substrat conducteur (a) comprenant des nanoparticules de platine, ledit dépôt étant réalisé de préférence par dépôt chimique en phase vapeur (CVD),
(ii) dépôt d'une couche d'un premier polypeptide porteur de charges ioniques (c) sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (i),
(iii) dépôt d'une couche d'enzyme oxydoréductase (d) ayant des charges opposées à celles du premier polypeptide sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (ii),
(iv) dépôt éventuel d'une couche d'un deuxième polypeptide porteur de charges ioniques (e) sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (iii),
(v) dépôt éventuel d'une couche d'enzyme peroxydase (f) ayant des charges opposées à celles du deuxième polypeptide éventuellement présentsur la couche obtenue à l'issue de l'étape (iv), ou dépôt éventuel d'une couche d'enzyme peroxydase (f) sur la couche obtenue à l'issue de l'étape (iii).
15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que le substrat conducteur (a) mis en œuvre lors de l'étape (i) est obtenu par dépôt d'un polymère conducteur sur un substrat, ledit dépôt étant de préférence réalisé par synthèse chimique en solution, électropolymérisation ou polymérisation en phase vapeur.
16. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement au dépôt du polymère conducteur sur le substrat, une étape d'électrodéposition de nanoparticules de platine au sein du polymère conducteur.
17. Dispositif de détection et de mesure de métabolites comprenant au moins une bioélectrode selon l'une des revendications 1 à 13 ou obtenue selon l'une des revendications 14 à 15, ledit dispositif étant de préférence un transistor électrochimique organique (OECT).
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