WO2018066953A1 - Hanging drop cell culture device using porous membrane, method for manufacturing same, hanging drop cell culture method using same, and hanging drop cell culture automation device - Google Patents

Hanging drop cell culture device using porous membrane, method for manufacturing same, hanging drop cell culture method using same, and hanging drop cell culture automation device Download PDF

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WO2018066953A1
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cell culture
porous membrane
hydrophilic
droplets
hydrophilic portion
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Application number
PCT/KR2017/011043
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조윤경
김준영
아이작마이클
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울산과학기술원
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Definitions

  • Cellular cell culture apparatus using porous membrane, preparation method thereof, cell culture method using same, and cell culture automated apparatus
  • the present invention relates to a wise culture device, a method for producing the same, a wise cell culture method using the same, and a wise cell culture automation device using the same.
  • Embodiments of the present invention to provide a cultivated cell culture device capable of replacing the culture medium, a method for preparing the same, a cultivated cell culture method using the same, and an automatic cell culture automated device using the same.
  • the porous membrane A hydrophobic part located in the porous membrane; And a hydrophilic portion surrounded by the hydrophobic portion, wherein the droplet of the cell culture solution is suspended in the hydrophilic portion to perform cell culture, and the culture medium in the droplet formed in the hydrophilic portion through the porous membrane can be exchanged and injected with an external substance.
  • the porous membrane may have hydrophilicity.
  • the porous membrane may include paper, nitrocellulose, silk, cotton fiber, polymer porous membrane, or a combination thereof.
  • the porous membrane may have a pore diameter of 0.2 ⁇ or more and 10 ⁇ or less.
  • the porous membrane may have a thickness of 0.04 mm or more and 0.5 kPa or less.
  • the porous membrane may be one in which fibrous particles are randomly arranged.
  • the hydrophilic portion may be 0.5mm or more and 8mm or less in diameter.
  • the length of the droplets suspended in the hydrophilic portion may be more than 0.5 mm 3 and less than 7 mm.
  • Droplets deposited on the hydrophilic portion may have a contact angle of 20 ° or more and 120 ° or less.
  • the droplets suspended in the hydrophilic portion may have a volume of 10 ⁇ l or more and 100 ⁇ 1 or less.
  • Cells cultured in the droplets suspended in the hydrophilic portion is a three-dimensional spheroid, may be 50 ⁇ or more in diameter and 2000 ⁇ or less.
  • the hydrophobic portion may be coated with a hydrophobic polymer.
  • the hydrophobic polymer may be a wax, a teflon, a photoresist, a silane compound, a polytetrafluoroethylene, a wax, a polydimethylsiloxane, PDMS, silicone (si 1 i cone), It may be a metal nanoparticle, a metal oxide nanoparticle, a silica nanoparticle, a polymer nanoparticle or a combination thereof.
  • the distance between each of the hydrophobic portion may be 1 ⁇ or more and 9 mm or less.
  • the channel is to connect two or more hydrophilic portion, the channel may be to enable interaction between the hydrophilic portion.
  • the width of the channel may be 0.1 mm or more and 2.5 mm 3 or less.
  • the hydrophilic portion may further include a bio-pass ivat ion coating layer.
  • the bio-passivat ion coating layer may have a thickness of 1 nm or more and 10 nm or less.
  • the surface in which the droplet is suspended in the hydrophilic portion may be a surface having a reduced hydrophilicity compared to the other surface.
  • the cells contained in the cell culture medium may be any one selected from a single cell line (pr imary cel ll ine) of mammalian cells, a cont inuous eel line, stem cells, tumor cells, immune cells, bacteria and microorganisms. It may be.
  • Two or more cultivated cell culture units are stacked, and the cultivated cell culture units comprise a porous membrane; A hydrophobic part located in the porous membrane; And a hydrophilic part surrounded by the hydrophobic part, wherein the porous medium can be exchanged with the culture medium in the droplet formed in the hydrophilic part and foreign material can be injected into the hydrophilic part of the cell culture unit located at the bottom of the cell culture medium.
  • Droplets of the cultivation may be a cell culture.
  • the at least one culturing cell culture unit further comprises a channel located in the porous membrane, the channel is to connect two or more hydrophilic portion, the channel may be to enable interaction between the hydrophilic portion.
  • the preparing of the extensible cell culture unit may include forming a channel connecting the hydrophilic part.
  • the preparing of the conventional cell culture unit may be performed by printing a hydrophobic material on a hydrophilic porous membrane.
  • the step of stacking two or more wise cell culture unit may be to stack the wise cell culture unit by folding so that the hydrophilic portion of the upper layer and the lower layer of the fold cell culture unit overlap.
  • Preparing a cell culture unit by forming a hydrophilic part and a hydrophobic part on the porous membrane; and then surface treating the hydrophilic part; It may be to include more.
  • Culturing the cells; injecting an external material through the porous membrane; may be further included.
  • Said cultivating cell culture device comprises a channel, said channel connecting at least two hydrophilic parts, said channel enabling interaction between said hydrophilic parts, and forming droplets of said cell culture fluid; More than one species of cell culture solution is added to each of the hydrophilic parts connected to the channel to form droplets of the cell culture solution, and culturing the cells; the droplets of the cell culture solution through the channels between the respective cell spheroids Interactions may be made and the cells may be cultured.
  • a culture sheet comprising a plurality of modern cell culture units; A driving motor for moving the culture sheet; A cell culture solution injector disposed above the culture sheet, and dropping the cell culture solution into a hydrophilic part of the hanging cell culture unit;
  • each of the cultivated cell culture units comprises a porous membrane; A hydrophobic part located in the porous membrane; And a hydrophilic portion surrounded by the hydrophobic portion, wherein the droplet of the cell culture solution is suspended in the hydrophilic portion to perform cell culture, and the exchange of the culture medium in the droplet formed in the hydrophilic portion through the porous membrane and the injection of external material are possible. It provides phosphorus, automatic cell culture automation device.
  • the culture sheet has a conveyor belt structure, it may be to move in the form of a chain up and down.
  • the cell culture solution may be dropped into the hydrophilic portion of the culture unit to form droplets from the cell culture solution input device.
  • droplets formed on the hydrophilic portion of the culture unit may be suspended by gravity.
  • the reagent may be added to the droplets.
  • the culture medium can be exchanged, it is possible to culture the cells for a long time.
  • it is possible to inject foreign materials it is applicable to the study of cell changes by the influence of foreign materials.
  • Figure 1 shows the structure of a cell culture device, an embodiment of the present invention
  • Figure 2 is an embodiment of the present invention, an experimental schematic diagram of cell cultivation technology using a hydrophobic wax-printed vesicle cell culture device hydrophobic membrane.
  • 3 is a result showing the relationship between various diameters of the hydrophilic portion and thus the acceptable droplet volume of the droplets suspended in a paper-based suspension culture device (PHDC, Paper Hanging Drop Chip) according to an embodiment of the present invention.
  • 4 is a relationship between droplet volume and droplet length according to a hydrophilic portion having a specific diameter.
  • 5 is an experimental result of the droplet maximum receiving volume and droplet stability by measuring the droplet contact angle of the hydrophilic portion.
  • Figure 6 is the result of the concentration gradient formation over time in the channel of various widths in the channel formed PHDC (Net worked PHDC, N-PHDC).
  • FIG. 7 shows an image of a PHDC which is an embodiment of the present invention assembled to various kinds of dishes.
  • FIG. 8 is a schematic diagram of a cell injection, culture and analysis automation device using PHDC and N-PHDC which is an embodiment of the present invention.
  • 9 is a schematic diagram of a method for manufacturing a conventional cell culture device according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11 is a schematic diagram of a manufacturing process of a conventional cell culture device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a schematic view of the hydrophilic surface treatment step of a three-dimensional cell suspension culture apparatus using a hydrophobic polymer printed hydrophilic porous membrane. '
  • FIG. 13 shows experimental results of droplet retention time and degree of protein nonspecific binding after surface treatment on a hydrophilic part.
  • FIG. 14 is a schematic diagram of a method for culturing cells in accordance with an embodiment of the present invention.
  • Figure 15 is a chemotactic reaction in the concentration gradient of the three-dimensional spheroid in N-PHDC of one embodiment of the present invention.
  • FIG. 16 shows the results of experiments on general cells (CCD 1058sk) and tumor cells (MDA-MB 231) drug test and immuno reaction against anticancer drugs (5FU) using PHDC, which is an embodiment of the present invention.
  • 17 is an image of tumor spheroid formation in PHDC according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 18 is a comparison result between spheroids cultured in PHDC and spheroids cultured in Petr i-di sh, a conventional cultivation method.
  • FIG. 20 shows a case in which only breast cancer cells (MDA—MB 231) are monocultured and breast cancer cells (M-MB 231) and fibroblasts (MEF), which are manufactured by a lamination method and using a cell culture apparatus including a channel. Electron scanning microscopy images for comparison of cultured cell binding states when cultured in a mutually compatible state in the channel-formed hydrophilic region. [Specific contents to carry out invention]
  • the length of the drop (Height of drop) is used to mean the vertical length of the droplet relative to the surface of the porous membrane, it is used to mean the length of the vertical direction of the droplet suspended under the hydrophilic portion of the porous membrane Can be.
  • the width of the channel means a width of the channel in a length perpendicular to the direction in which the fluid moves.
  • the biggest difficulty with existing conventional culture techniques is the exchange of media from the droplets and the control of droplet size.
  • by printing a hydrophobic pattern, forming a limited hydrophilic space on the porous material, and microliterized cells including cells to be cultured The culture solution is suspended in a limited hydrophilic space by the strong capillary force of the porous membrane to form a three-dimensional spheroid.
  • periodic culture exchange is possible, and the culture period can be extended by removing cell waste and injecting a new culture solution.
  • the size of the droplets may be controlled by controlling the diameter of the hydrophilic portion of the porous membrane or by adding or removing a part of the culture solution through the porous membrane.
  • the present invention can be easily produced using a wax printing method for the channel that can interact with each droplet, there is an advantage that can be easily changed to the design according to the user's needs.
  • the injected foreign substance may be an experimental reagent, a fluorescent staining agent, a disease treatment agent such as an anticancer agent, an extracellular matrix protein such as a hydrogel, a cell, but is not limited thereto.
  • FIG. 1 shows a structure of a cell culture device, an embodiment of the present invention.
  • the present cell culture device may include a porous membrane (1), at least one hydrophobic portion (3) located in the porous membrane, and at least one hydrophilic portion (2) surrounded by the hydrophobic portion. More than 2 It may further comprise a channel (4) for connecting the hydrophilic portion to enable interaction.
  • Figure 2 is an experimental schematic diagram of cell cultivation technology using a hydrophobic wax-printed cultivation cell culture device hydrophobic membrane.
  • the hydrophobic portion pattern is printed on the hydrophilic porous membrane using wax printing. After dropping the cell culture onto the hydrophilic portion, turn the instrument upside down to suspend the cell culture droplets. The droplets are suspended in the hydrophilic region through the interaction of the capillary force of the porous membrane and the surface tension of the culture medium.
  • Periodic replacement of the culture medium through the upper portion of the porous material allows cell culture while supporting droplets for a longer period of time.
  • the porous membrane may be hydrophilic, specifically, paper, nitrocellulose, silk, cotton fiber, polystyrene, polytetrafluoroethylene
  • a polymer porous membrane may be made of any one selected from a porous membrane having a micro or nano-size pattern.
  • the porous membrane has a pore diameter of 0.2 ⁇ or more and 10 ⁇ or less, specifically, 0.5 ⁇ to 9 ⁇ , 0.7 ⁇ to 8 ⁇ , 1 ⁇ to 7 ⁇ , 3 ⁇ to 5 ⁇ , 0.7 ⁇ to 3 ⁇ , 4 ⁇ to 10 ⁇ , or 0.2 ⁇ to 6 ⁇ .
  • the pore diameter is too large, when the cell culture fluid is added to the hydrophilic part, the cells may be caught in the porous membrane, thereby reducing the number of cells used for spheroid formation. If the pore diameter is too small, it is difficult to exchange the nutrient medium through the porous membrane. Problems may occur, and if the pore range is satisfied, the cells may be prevented from being caught in the porous membrane, as well as the nutrient medium for cell culture, and the effect of facilitating reagent exchange for later assays. There is.
  • the porous membrane may have a thickness of 0.04 mm 3 or more and 0.5 mm 3 or less, and specifically, 0.05 mm or more and 0.4 mm or less, 0.07 mm or more and 0.3 mm or less, 0.1 mm or more and 0.2 mm.
  • the thickness of the porous membrane is thin, it is difficult to support more than a certain volume of droplets, and when the thickness of the porous membrane is too large, the volume of the solution that the porous membrane can absorb is too large. It can stably support the droplet volume required for cultivation, and it is possible to perform further analysis experiments even with a small reagent volume.
  • the porous membrane may be composed of f iber particles, for example, may be cellulose fibers. Specifically, silk fibers, cotton fibers and the like can be used.
  • the fibrous particles may be arranged in a line, but is not limited thereto, and may be in the form of randomly arranged fibrous particles.
  • fibrous particles having a random arrangement of fibrous particles there is an effect that signal communication between reagents and cells can be uniformly transmitted in all directions with uniform capillary force and diffusion without being affected by the direction of fiber arrangement.
  • Conventional cultivation technology has a problem that it is difficult to control the size of the droplets, according to one embodiment of the present invention by controlling the shape or diameter of the hydrophilic portion, it is possible to control the diameter, volume, contact angle, etc. of the droplets formed effectively effective cultivation This is possible.
  • the hydrophilic portion formed in the porous membrane may be 0.5mm or more and 8mm or less in diameter.
  • the droplets formed on the hydrophilic portion may have a volume of 10 ⁇ l or more and 100 ⁇ l or less, and specifically 10 ⁇ l or more and 90 ⁇ l or less, 10 ⁇ 1 or more and 80 ⁇ l or less, 20 ⁇ 1 or more. And 70 ⁇ l or less, 20 ⁇ l or more and 50 ⁇ l or less, 20 ⁇ l or more and 30 ⁇ l or less, 30 ⁇ l or more and 40 ⁇ 1 or less, 10 ⁇ l or more and 30 ⁇ l or less.
  • the volume of the droplets formed in the hydrophilic portion is related to the volume of the droplets, which is the space in which the cell is cultured.
  • the volume of the droplets formed in the hydrophilic portion is too large, due to the mass of the droplets, the droplets may not be stably formed in the hydrophilic portion, and if the volume of the droplets is too small, the cell culture may not be performed well. If the range is satisfied, the cell volume can be efficiently obtained by securing a sufficient volume of droplets, providing sufficient nutrients for cell culture, and preventing the culture liquid from drying out during the culture period, and through periodic culture medium exchange through a porous membrane. Stable droplet support for a long time
  • the diameter of the hydrophilic portion is related to the volume of droplets formed in the hydrophilic portion.
  • 3 is a paper-based suspension culture device (PHDC) which is an embodiment of the present invention Paper Hanging Drop Chip) was used to measure the volume of droplets that could be accommodated according to the diameter of the hydrophilic portion.
  • PHDC paper-based suspension culture device
  • the hydrophilic part is no longer supported by the hydrophilic part and separates and falls into water droplets.
  • it forms the most stable droplets for cultivation.
  • the diameter of the hydrophilic part is 3 ⁇ , the volume of the droplet is no longer supported by the hydrophilic part, but separates and falls into water droplets.
  • the diameter of the hydrophilic part is 4 mm, the volume of the droplet is no longer supported by the hydrophilic part and is separated. The droplet is dropped into the water droplet and forms the most stable droplet in the suspension culture at 30 ⁇ l. If the hydrophilic part is 5 mm in diameter, it forms the most stable droplet for suspension culture at 40 ⁇ l.
  • the volume of the droplets that can be seen increases, and the volume of droplets that is most stable for the culture of cultivation also increases.
  • the volume of the most stable droplets for culturing in the hydrophilic portion of a specific diameter is increased. It was confirmed that there is.
  • the longitudinal length of the droplet formed in the water-repellent part may be 0.5 mm or more and 7 mm or less, specifically, 0.5 mm or more and 4 mm or less, 0.5 mm or more and 3.7 mm or less, 0.5 mm or more and 3 mm or less, or 1.3 and at most 3 mm and at most 3 mm, at least 1.7 mm and at most 3 mm, at least 1.7 mm and at most 2.5 mm, or at least 0.5 mm and at most 4 mm.
  • Figure 4 shows the relationship between the volume of the droplets suspended in the hydrophilic portion and the longitudinal length of the droplets according to the diameter of the hydrophilic portion.
  • a droplet volume of 30 ⁇ showed a droplet length of about 4 mm at a diameter of 2 mm hydrophilic portion, and a droplet length of about 2 mm at a diameter of 5 mm hydrophilic portion.
  • the diameter of the droplets suspended in the hydrophilic portion is too large, the retention of the droplets may be unstable, and the problem of dropping and not supporting the hydrophilic portion may occur. There is a problem in that a sufficient space cannot be secured. Therefore, when the droplet diameter range is satisfied, stable droplets can be formed, and the droplets are divided. By securing the internal volume, not only the cell culture can be efficiently carried out by providing a rich nutrient to the cell culture and preventing the culture liquid from drying out during the culture period, but also the stable cell culture can be stable for a long time in the hydrophilic part.
  • Droplets deposited on the hydrophilic portion may have a contact angle of 20 ° or more and 120 ° or less.
  • the contact angle of the droplets deposited on the hydrophilic portion may vary depending on the diameter of the hydrophilic portion or the size of the droplets deposited, specifically, 20 ° or more and 120 ° or less, 40 ° or more and 110 ° or less, 60 ° or more and 110 ° or less, 80 ° or more and 110 ° or less, or 70 ° or more and 110 ° or less, 80 ° or more and 120 ° .
  • the maximum receiving volume and the stability of the droplet are shown by measuring the contact angle of the droplets suspended in the hydrophilic portion by varying the diameter of the hydrophilic portion according to the exemplary embodiment of the present invention.
  • the stability of the droplets in the various hydrophilic regions was shown by the conditions of the largest contact angle of the droplets, and the range of the droplets in the various hydrophilic conditions was also demonstrated by the conditions of the contact angle tendency.
  • the contact angle means a value ⁇ measured from the inside of the liquid to form an angle between the solid surface and the liquid surface as shown in FIG. 5B.
  • the contact angle of the droplets in the hydrophilic part is too large, the droplets may not be stably formed in the hydrophilic part, and cell culture may be difficult for a long time. If the contact angle is too small, the volume inside the formed droplets may be too small to be sufficient for culturing cell culture. There is a problem that cell culture cannot be effectively performed due to lack of space, and if the contact angle range of the droplet is satisfied, a sufficient volume of droplets can be stably formed in the cell culture, and a sufficient internal volume of the droplet can be secured for cell culture. By providing abundant nutrients to the cell and preventing the culture liquid from drying out during the culture period, not only can the cell culture be efficiently conducted, but also the cell culture can be stably maintained for a long time in the hydrophilic part.
  • Cells cultured in the droplets suspended in the hydrophilic portion is a three-dimensional spheroid, may be more than 50 im diameter and less than 2000 ⁇ . Specifically, 50 ⁇ ⁇ or more and 1800 ⁇ ⁇ or less, 50 ⁇ ⁇ or more, 1500 ⁇ ⁇ or less, 80 ⁇ ⁇ or more, 1000 ⁇ ⁇ or less, 50 im or more and 500 ⁇ ⁇ or less, or 50 ⁇ ⁇ or more and 1000 um or less It may be.
  • the hydrophilic portion formed in the porous membrane is formed in a circular shape, but is not limited thereto, and may be formed in various shapes such as a circle, a rectangle, and an oval. In addition, the hydrophilic portion may be one containing pores.
  • the hydrophobic portion formed in the porous membrane may be a hydrophobic polymer coated on the porous membrane, specifically, the hydrophobic polymer may be wax, Teflon, photoresist, silane compound, or polytetraflooroethylene, wax. , Poly dimethyl si loxane, silicon (si 1 i cone), metal nanoparticles, metal oxide nanoparticles, silica nanoparticles, polymer nanoparticles, or a combination thereof. It may be silver, copper, platinum, or the like. However, this is one embodiment of the present invention, and the present invention is not limited thereto, and a hydrophobic polymer that may be commonly used in the art suitable for the method of forming hydrophobic portions may be used.
  • One embodiment of the present invention discloses a method of printing a hydrophobic pattern on a porous membrane through a wax printing method as a hydrophobic polymer, but is not limited thereto.
  • the distance between each hydrophobic portion may be 1 mm or more and 9 mm or less, specifically 1 mm or more and 8 mm or less, 2 mm or more and 7 mm or less, 3 or more and 6 or less, 4 or more and 6 or less Or less than 4 mW and 9 mW or less, or 1 mW or more and 9 mW or less.
  • the distance between the hydrophobic regions is too narrow, there is a problem that the droplets located in the hydrophilic pattern are likely to collapse, and if the droplets are too wide, the number of droplets that can be formed per modern culture device is limited, so that high throughput analysis is possible.
  • the distance between the hydrophobic parts is satisfied, by securing the distance between the inside of the droplets, preventing the risk of overlap between the droplets, not only stable cell culture is possible, but also a large number of liquids. By forming enemies simultaneously, high throughput analysis is also available.
  • the present invention may further include a channel located in the porous membrane, the channel may be to have a hydrophilic, by connecting two or more hydrophilic portion is possible interaction between the hydrophilic portion and the droplet formed on the hydrophilic portion It may be to.
  • a conventional cell culture device including these channels By culturing the cells using a conventional cell culture device including these channels, it is possible to study the interaction of cultured cells inside different droplets.
  • the width of the channel may be greater than 0.1 mm 3 and less than 2.5 mm, specifically 0.1 mm or more and 1.5 mm or less, 0.1 mm or more and 1 mm or less, 0.3 mm or more and 2.0 mm or less, 0. It may be 1 mm or more and 0.7 mm or less, or 0.1 mm or more and 2.0 mm or less. If the width of the channel is too wide, it may be difficult to maintain the shape of the hydrophilic droplets due to the large capillary force, too narrow if the capillary force is difficult to move between fluids, if the above range is met, the appropriate capillary Due to the force, it is possible to maintain the shape of the hydrophilic droplets and to facilitate fluid-to-fluid movement through the channel.
  • PHDCXNet worked channel formed in accordance with an embodiment of the present invention Results in concentration gradient formation over time in channels of varying widths (PHDC, N-PHDC).
  • PHDC varying widths
  • N-PHDC interactable cell culture device
  • the concentration of fluorescent sodium salt can be determined by injecting a solution containing 0.5 mol / ml fluorescent sodium salt (f luorescein sodium sal t) into the central hydrophilic part (source part) and measuring the relative fluorescence intensity. This shows different diffusion coefficients through channels of various widths.
  • the length of the channel may be more than 0.5 mm 3 and less than 15 mm, by adjusting the length of the channel, it is possible to control the interaction between the hydrophilic portion and the droplet formed on the hydrophilic portion.
  • FIG. 10 is a result of utilizing the concentration gradient and drug test using N—PHDC in which a plurality of hydrophilic units are connected by a channel, which is an embodiment of the present invention.
  • E using the various channel widths, the effect of the 5FT 5-FLU0R0URACIL) anticancer drug of the three-dimensional spheroid was confirmed using PHDC and N-PHDC at various concentrations. After incubation for 48 hours to form a three-dimensional spheroid to the surrounding hydrophilic part, 5FU of 1000 mMo l concentration was injected into the central hydrophilic part (source part).
  • the antitumor effect of the three-dimensional tumor spheroid was confirmed by confirming the viability of tumor cells (vi abi li ty) by treating 5FU of 100, 500, and 1000 Mol e for 24 hours.
  • Various levels of cell death were identified by various concentrations of anticancer agents from intermediate sources, the lowest cell viability in 2 mm wide channels for 5FU anticancer agents, and the highest viability at 0.5 ⁇ . Seemed.
  • N-PHD Networked Paper Hanging Drop
  • the hydrophilic portion may further include a bio-passivat ion coating layer.
  • Non-specific binding of the porous membrane of the hydrophilic part and the protein or extracellular matrix used in cell culture can be prevented.
  • the bio-passivat ion coating layer may be to form a coating layer on an area including the surface of the hydrophilic portion and the pore inner surface without closing the pores of the hydrophilic portion.
  • the bio-passivat ion coating layer is bovine serum albumin (Bovine Serum Albumin, BSA), polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide (poly (ethylene oxide)-poly (propylene oxide)-poly (ethylene oxide), PE0-PP0—PEO), polyethylene glycol (PEG), or agarose.
  • BSA bovine serum albumin
  • polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide poly (ethylene oxide)-poly (propylene oxide)-poly (ethylene oxide)
  • PE0-PP0—PEO polyethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • the bio-passivat ion coating layer may have a thickness of 1 nm or more and 10 nm or less. If the coating thickness is too thick, there is a problem of changing the material properties of the hydrophilic part, and if too thin, the effect of preventing nonspecific binding of the protein or extracellular matrix may be insignificant.
  • the surface of the droplet in the hydrophilic portion may be a surface having a reduced hydrophilicity compared to the other surface. This can be done by performing a step of irradiating the hydrophilic part with ultraviolet rays.
  • the cells cultured in a modern cell culture device is a single cell line (pr imary cel ll ine) of the mammalian cells, cont inuous cel ll ine, or stem cells, tumor cells, immune cells, It may be a bacterium or a microorganism, but is not limited thereto.
  • the design of the hydrophobic portion pattern it is possible to form 1 to 384 spheroids in one cultivation device, and after the cell spheroid formation through the cultivation, an optional single spheroid can be obtained. have.
  • the cell culture device according to an embodiment of the present invention can be used by assembling a variety of dishes such as 35, 60, 90, 100 mm Petri dishes, 6, 12, 24, 48, 96, 384 well plate have.
  • FIG. 7 shows an image of a PHDC assembled in various kinds of dishes. Images of PHDC assembled into PC holders, 384 and 96wels assembled into PC holders, 3x3 PHDCs assembled into 60 mm Petri dishes and droplet images formed thereon, which facilitate PHPHs of various designs. It shows that it can be manufactured and assembled.
  • a cultivated cell culture device in which two or more cultivated cell culture units are stacked.
  • two or more culturing cell culture units are stacked, and the culturing cell culture unit comprises a hydrophobic part located in the porous membrane and a hydrophilic part enclosed by the hydrophobic part, and is positioned at the bottom
  • a cell culture device capable of performing cell culture by droplets of cell culture fluid being deposited on a hydrophilic portion of a cell culture unit, and exchanging of the culture medium in the droplets formed on the hydrophilic portion and injecting foreign substances through the porous membrane.
  • Each modern cell culture unit may be one or more hydrophilic moieties, and one or more hydrophobic moieties.
  • the at least one cultivated cell culture unit further comprises a channel located in the porous membrane, wherein the channel connects two or more hydrophilic parts, and the channel is connected between the hydrophilic parts connected by the channel. It may be to enable the interaction.
  • It provides a method for producing a conventional cell culture device comprising the steps of preparing a porous membrane, forming a hydrophilic portion and a hydrophobic portion in the porous membrane to prepare a cultivated cell culture unit, and stacking two or more of the cultivated cell culture unit.
  • the spatial arrangement of the cells can be controlled, and it was difficult to spatially culture various types of cells through the spatial arrangement in the existing conventional culture apparatus, but one of the present invention By virtue of embodiments it is readily possible to simulate the biome.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of a method for manufacturing a conventional cell culture device according to an embodiment of the present invention.
  • the preparing of the extensible cell culture unit may include forming a channel connecting the hydrophilic part.
  • the stacking of two or more wise cell culture units may be to stack the wise cell culture unit by folding so that the hydrophilic portion of the upper layer and the lower layer of the fold cell culture unit overlap.
  • Existing cultivation Although it was difficult to demonstrate spatial culturing of various kinds of cells in a device through spatial arrangement, when using a conventional cell culture device according to an embodiment of the present invention, the spatial arrangement of cells can be controlled, and the interaction between cells can be simulated. You can do it more accurately.
  • the channel allows interaction between the hydrophilic portion and the droplets formed on the hydrophilic portion, thereby enabling the study of the interaction of cultured cells inside different droplets, as well as the study of the interaction between heterologous cells.
  • various types of cultivated cell culture devices can be manufactured, and can be utilized for various and effective cell interaction studies. .
  • the manufacturing of the cultivated cell culture unit may be performed by printing a hydrophobic part pattern on the porous membrane, and in one embodiment of the present invention, the method is used by printing wax on a paper that is a porous membrane having hydrophilicity.
  • the cell culture device was produced, and by the printing method, it is possible to easily manufacture the modern cell culture device.
  • the preparing of the cultivated cell culture unit comprises printing a pattern of a hydrophobic portion on a hydrophilic porous membrane using a hydrophobic polymer, heat-treating the porous membrane on which the hydrophobic polymer is printed, and culturing the cultivated cell on which the hydrophobic portion and the hydrophilic portion are formed. It may be through the step of obtaining a unit.
  • the heat treatment step; and further comprising the step of cutting the porous membrane can be.
  • FIG. 11 is a schematic diagram of the manufacturing process of the conventional cell culture device as an embodiment of the present invention.
  • Circular hydrophilic patterns with specific diameters of 2 ⁇ to 8 ⁇ are designed using commercially available software (corel draw x5).
  • the hydrophilic pattern is determined by the well plate (96 wells, 384 wells, 3x3 or 5x5) used in the experiment.
  • This design uses a Xerox solid wax printer (colorQube 8570) to print a hydrophobic polymer, Sol id wax, printed on the porous membrane according to the hydrophobic pattern, and to heat the solid wax printed porous membrane to melt the wax. To form a hydrophobic part through wax deformation.
  • the flowchart of the method for fabricating the conventional cell culture device of FIG. 11 is merely for illustrating the present invention, and the present invention is not limited thereto.
  • the hydrophilic portion surface treatment step may be further included after the step of washing the conventional cell culture unit.
  • the hydrophilic portion surface treatment step may be to treat the hydrophilic portion of the hydrophilic portion of the wise cell culture unit with 333 ⁇ 1011). This process can prevent non-specific adsorption of the biomaterial to the hydrophilic part.
  • the step of bio-passivation treatment is bovine serum albumin (Bovine Serum Albumin, BSA), polyethylene oxide—polypropylene oxide-polyethylene oxide (Poly (ethylene oxide) -IX) ly (propylene oxide) -poly (ethylene oxide), PP0—PE0 as PE, polyethylene glycol (PEG), agarose, and the like.
  • BSA bovine serum albumin
  • the hydrophilic portion surface treatment step is a hydrophilic portion of the conventional cell culture unit It may be ultraviolet irradiation. This process can control the hydrophilicity of the hydrophilic portion.
  • the hydrophilicity of the porous membrane can be adjusted.
  • the step of bio passivation (b i-pass ivat i on) and the step of irradiating ultraviolet light may be performed only one, or both steps may be performed.
  • the hydrophilicity of the hydrophilic portion can be increased by the step of bio passivation (bi o-pass ivat i on), and the hydrophilicity of the hydrophilic portion can be properly adjusted by reducing the hydrophilicity through ultraviolet irradiation. Therefore, when both the bio passivation treatment and the ultraviolet irradiation step are performed, the droplet retention time of the hydrophilic portion of the porous membrane may be significantly increased.
  • the hydrophilicity may be reduced by the ultraviolet irradiation treatment, when both the bio passivation treatment and the ultraviolet irradiation step are performed, the non-specific adsorption reduction effect of the biomaterial may also be remarkably improved.
  • FIG. 12 is a schematic view of the surface treatment step of the hydrophilic part according to an embodiment of the present invention, the step of sterilizing the cell culture unit with ethanol, bio passivation using the BSA solution in the hydrophilic part (bi o-pass i vat i on) processing, washing with PBS, and ultraviolet irradiation.
  • Preparing a cell culture device Preparing a cell culture device according to an embodiment of the present invention, dropping the cell culture medium containing the cells to be cultured to the hydrophilic portion to form a droplet of the cell culture medium, the cell culture medium dropping the culture medium is dropped Suspending droplets of cell culture, culturing the cells with droplets of cell culture,
  • the step of culturing the cells provides a cultivation method further comprising the step of exchanging the culture solution through the porous membrane.
  • FIG. 14 shows a schematic diagram of a method for culturing cells according to an embodiment of the present invention.
  • Another embodiment of the present invention may further comprise the step of injecting an external material through the porous membrane after the step of culturing the cells.
  • FIG. 15 shows the results of a chemotactic reaction in the concentration gradient of the three-dimensional spheroid in N-PHDC as an embodiment of the present invention.
  • FIG. Chemistry about the FBS of the three-dimensional spheroid was confirmed for 24 hours using N-PHDC, which is an embodiment of the present invention, through which the present invention can be used for experiments on spheroid changes caused by the influence of external chemicals. Confirmed that it can.
  • Figure 15 A the concentration gradient simulation results of the chemical reagents after 24 hours in a 0.5 ⁇ wide channel are shown. The quality of the solution was gradually blue, and the left area of the reagent injection was the highest red color, the middle area was blue, and the right area was dark blue.
  • 15B compares the experimental results and the simulation results of chemical reagents in channels 0.5 mm, 1.0 mm and 2.0 mm wide.
  • 15 C, D, E confirmed the chemotaxis of the cells according to the concentration gradient between 0% FBS and 10% FBS, showed a strong chemotaxis of the cells with a high concentration of FBS.
  • FIG. 16 shows the results of experiments on general cells (CCD 1058sk) and tumor cells (MDA-MB 231) drug test and immuno reaction against anticancer drugs (5FU) using PHDC, which is an embodiment of the present invention.
  • the bobbin cell culture device includes a channel, and forming droplets of the cell culture fluid is one or more. Dropping in to form droplets of the cell culture medium, and culturing the cells is a conventional cell culture method for culturing cells while interacting with each cell spheroid through the channel while the droplets of the cell culture solution are suspended. To provide.
  • a culture sheet including a plurality of culturing cell culture units, a driving motor for moving the culture sheet, and positioned above the culture sheet, A cell culture solution injecting device for dropping the cell culture solution into the hydrophilic part of the cell culture unit,
  • Each of the cultivated cell culture units includes a porous membrane, a hydrophobic portion located in the porous membrane, and a hydrophilic portion surrounded by the hydrophobic portion, and droplets of the cell culture solution are suspended in the hydrophilic portion to perform cell culture.
  • the present invention provides an automatic cell culture automation device capable of exchanging a culture solution in a droplet formed in the hydrophilic part and injecting an external substance through the porous membrane.
  • the culture sheet has a conveyor belt structure, it may be to move in the form of a chain up and down.
  • the cell culture solution may be dropped into the hydrophilic portion of the culture unit to form droplets from the cell culture solution input device.
  • droplets formed on the hydrophilic portion of the culture unit may be suspended by gravity and cell culture may be performed.
  • a reagent may be introduced into the droplets.
  • PHDC and N-PHDC can use a rotating system to automate imaging and analysis of cell injection, spheroid culture, and spheroid phenomena.
  • a small conveyor belt rotating pul ly
  • This system automates the movement and formation of droplets, and has a configuration that rotates from the upper layer to the lower layer, and from the lower layer to the upper layer, and drops the cell culture liquid onto the hydrophilic portion to form droplets.
  • Example 1 The present cell culture apparatus of Example 1, wherein the hydrophilic portion is patterned by printing with a wax as a hydrophobic polymer on a chromatographic filter paper, heating the wax at 120 0 C for 2 minutes, and forming a hydrophobic portion. was prepared.
  • Example 2 In order to control the hydrophilicity of the hydrophilic portion of Example 1 was carried out UV irradiation treatment for exposing the ultraviolet light of 18.52 mW / cm 2 intensity for 3 minutes to prepare a cell culture device of Example 2.
  • the hydrophilic part was applied in 1% bovine serum albumin (BSA), for one hour After treatment,-washed three times with phosphate-buffered saline (PBS) buffer, dried, and then to control the hydrophilicity of the hydrophilic part.
  • BSA bovine serum albumin
  • Ultraviolet irradiation treatment was performed for 3 minutes of ultraviolet light of 18.52 mW / cm 2 century to prepare a cell culture device of Example 3.
  • Cell culture droplets were then formed in the conventional cell culture device of each example and fixed in a 3D printed holder.
  • FIG. 12 shows a flow chart of the porous membrane treatment method for the cultivation of the cultivated cells, which is merely to illustrate the present invention, and the present invention is not limited thereto.
  • Fig. 13 shows the droplet retention time before and after the BSA and UV irradiation treatment on the hydrophilic part; And experimental results for protein nonspecific binding.
  • Example 1 in which the surface treatment of the hydrophilic portion was not performed, the droplet retention time was less than 1 minute, but when subjected to ultraviolet irradiation treatment (Example 2), the droplet retention time was increased to less than 10 minutes than before the ultraviolet irradiation treatment, and the BSA In the case where both treatment and ultraviolet irradiation treatment were performed (Example 3), it was confirmed that the droplet retention time was significantly improved by exceeding 10 minutes.
  • Example 4 in order to prevent protein-specific binding in a material that can interfere with nutrient supply through the medium and intercellular signal communication, the degree of protein nonspecific binding was confirmed using fluorescent streptavidin (st reptavidin).
  • st reptavidin fluorescent streptavidin
  • PHDC was prepared using a 200 ⁇ GE whatman Chrome 1 f i lter paper, and 2, 000 tumor cells were cultured in 30 ⁇ 1 droplets over 4 mm diameter to form tumor spheroids at various culture dates. 17 shows an example of tumor cell spheroid formation according to various culture dates using PHDC.
  • Example 7 is a schematic diagram of imaging a spheroid using a microscope, and shows a spheroid-specific image and fluorescence image of breast cancer cells at 1.25 magnification.
  • cells in the PHDC droplets can form three-dimensional spheroids. You can check it.
  • Example 5
  • MCF 10A Breast epithelial cells
  • MDA MB 231 breast cancer cells
  • MCF 10A DMEM F12 culture medium
  • MDA—MB 231 cells DMEM culture medium containing 10% FBS and 1% col lagen was used to remove 5 ⁇ 1 of the droplets per day. Spheroid formation for 5 days while injecting.
  • FIG. 18 is a comparison result between spheroids cultured in PHDC and spheroids cultured in Petr i-dish.
  • FIG. 18A Comparing the spheroids grown in Petri dish with one of the existing cultivation techniques and the spheroids grown in PHDC, similar trends in morphology and viability as shown in Figs. 18A and B are shown. Showed. Figure 18C confirmed the metastatic capacity of the spheroid cultured in PHDC through F-act in staining, a marker related to the viability of the spheroid cultured in PHDC through Calcein-am staining and tumor cell metastasis. As shown in FIG.
  • TGF- ⁇ secretion known as a growth factor of tumor cells As a result of comparing TGF- ⁇ secretion known as a growth factor of tumor cells according to the number of cells and the date of culture in PHDC, spheroids formed with a large number of cells over the culture date were formed with a small number of cells. It can be seen that the secretion of TGF- ⁇ is secreted over the culture date than spheroids.
  • MCF-7 tumor cells
  • CCD 1058 fibroblasts
  • the spheroid diameter according to the culture time was compared for 10 days at 2 days intervals, depending on the cell type, and According to the cell culture method, the tendency of the spheroid diameter change was confirmed.
  • a cultivated cell culture device comprising a channel prepared by a stacking method of folding so that the hydrophilic portion of the upper layer and the lower layer of the two cultivated cell culture units overlap.
  • Breast cancer cells (MDA-MB 231) are cultured in a single culture without interaction with other cells, and breast cancer cells (MDA—MB 231) are connected to one hydrophilic part that can be channeled and interact with fibroblasts (MDA-MB 231). Electron scanning microscope image for comparing the cultured cell binding state after the culture of MEF) is shown in Figure 20.
  • the first layer of culturing cell culture unit (B) had a hydrophilic and hydrophobic pattern for cell culturing, and the second layer of culturing cell culture unit (A) had a channel (X, y, z) connecting the hydrophilic part. Is further formed.
  • the two cultivated cell culture units (A, B) were folded and stacked so that the hydrophilic portions overlapped, and the hydrophilic portions (2, 5, 8) had breast cancer cells (MDA-MB 231) in the hydrophilic portion (1, 4, 7) cultivates fibroblasts (MEFs), each of which has a network that can induce interactions between heterogeneous spheroids. Formed.

Landscapes

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Abstract

Provided are a hanging drop cell culture device capable of exchanging a culture medium and injecting a foreign substance, a method for manufacturing the same, and a cell culture method using the same.

Description

【명세서】  【Specification】
【발명의 명칭】  [Name of invention]
다공성막을 이용한 현적 세포 배양 기기, 이의 제조 방법, 이를 이용한 현적 세포 배양 방법， 및 현적 세포 배양자동화 장치  Cellular cell culture apparatus using porous membrane, preparation method thereof, cell culture method using same, and cell culture automated apparatus
【기술분야】  Technical Field
본 발명은 현적 배양 기기, 이의 제조방법， 이를 이용한 현적 세포 배양 방법 , 및 이를 이용한 현적 세포 배양 자동화 장치에 관한 것이다.  The present invention relates to a wise culture device, a method for producing the same, a wise cell culture method using the same, and a wise cell culture automation device using the same.
【배경기술】 Background Art
2차원적 세포 배양에서 3차원적 세포 배양으로의 발전은 제약 개발 분야， 기초 생물 분야 및 바이오 프린팅 분야 둥의 발전에 엄청난 기여를 하였다. 현재 존재하는 3차원적 종양 스페로이드 형성 기술로서， 하이드로젤， 3차원적 지지체， 회전 배양 플라스크， 마이크로웰 스페로이드 배양 그리고 현적 배양 기기 둥 다양한 방법들이 있다. 이러한 방법들은 다양한 분야에 활용될 일정한 크기의 동종 스페로이드를 형성하기에 이상적인 기술이다.  The development from two-dimensional cell culture to three-dimensional cell culture has made a tremendous contribution to the development of pharmaceutical development, basic biology and bioprinting. Currently existing three-dimensional tumor spheroid formation technology, there are a variety of methods, such as hydrogel, three-dimensional support, rotary culture flask, microwell spheroid culture and modern culture equipment. These methods are ideal for forming homogeneous spheroids of uniform size for use in a variety of applications.
기존의 현적 배양 기술은 유리 또는 페트리 접시 위에 마이크로 리터 부피 (2으50 μ ΐ ) 의 세포 배양 미디어를 올리면서 시행된다. 그 후， 유리 또는 패트리 접시를 뒤집는다. 이 물방을은 표면장력 때문에 떨어짐이 방지되며， 배양액 안에 매달려 있는 세포들은 중력으로 인해 정착되며, 배양액 내부에 정착되어 있는 세포들은 인접한 세포들과 상호작용하여 결합을 이루면서 3차원 스페로이드 또는 3차원 마이크로 조직을 형성한다. 이러한 기술에서의 가장 큰 어려움은 액적 (Droplet ) 으로 부터의 배양액 교환과 액적 크기 조절이다.  Conventional conventional culture techniques are carried out by raising microliter volumes (2 50 μΐ) of cell culture media on glass or Petri dishes. After that, turn over the glass or the petri dish. The water droplets are prevented from falling off due to surface tension, and the cells suspended in the culture are settled by gravity, and the cells settled in the culture media interact with adjacent cells to form a three-dimensional spheroid or three-dimensional micro Form tissue The biggest difficulties with this technique are the exchange of media from the droplets and the control of droplet size.
.  .
【발명의 내용】  [Content of invention]
【해결하려는 과제】  [Problem to solve]
본 발명의 구현예는， 배양액의 교체가 가능한 현적 세포 배양 기기, 이의 제조방법, 이를 이용한 현적 세포 배양 방법， 및 이를 이용한 현적 세포 배양 자동화 장치를 제공하고자 한다. 【과제의 해결 수단】 Embodiments of the present invention, to provide a cultivated cell culture device capable of replacing the culture medium, a method for preparing the same, a cultivated cell culture method using the same, and an automatic cell culture automated device using the same. [Measures of problem]
본 발명의 일 구현예는 , 다공성막; 상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및 상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부 ;를 포함하고， 상기 친수성부에서 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지고， 상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것인 현적 세포 배양 기기를 제공한다.  One embodiment of the invention, the porous membrane; A hydrophobic part located in the porous membrane; And a hydrophilic portion surrounded by the hydrophobic portion, wherein the droplet of the cell culture solution is suspended in the hydrophilic portion to perform cell culture, and the culture medium in the droplet formed in the hydrophilic portion through the porous membrane can be exchanged and injected with an external substance. Provide an intrinsic cell culture device.
상기 다공성막은 친수성을 가지는 것일 수 있다.  The porous membrane may have hydrophilicity.
상기 다공성막은 종이， 나이트로샐를로오스, 실크， 면섬유, 중합체 다공성막， 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. /  The porous membrane may include paper, nitrocellulose, silk, cotton fiber, polymer porous membrane, or a combination thereof. Of
상기 다공성막은 기공 직경이 0.2 μηι 이상 및 10 μπι 이하인 것일 수 있다. ,  The porous membrane may have a pore diameter of 0.2 μηι or more and 10 μπι or less. ,
상기 다공성막은 두께가 0.04 mm 이상 및 0.5 隱 이하인 것일 수 있다.  The porous membrane may have a thickness of 0.04 mm or more and 0.5 kPa or less.
상기 다공성막은 섬유상 입자가 무작위 (random)로 배열된 것일 수 있다.  The porous membrane may be one in which fibrous particles are randomly arranged.
상기 친수성부는 직경이 0.5mm 이상 및 8mm 이하인 것일 수 있다. 상기 친수성부에 현적된 액적의 세로길이는 0.5 醒 이상 및 7 mm 이하인 것일 수 있다.  The hydrophilic portion may be 0.5mm or more and 8mm or less in diameter. The length of the droplets suspended in the hydrophilic portion may be more than 0.5 mm 3 and less than 7 mm.
상기 친수성부에 현적된 액적은 20° 이상 및 120° 이하의 접촉각을 갖는 것일 수 있다. Droplets deposited on the hydrophilic portion may have a contact angle of 20 ° or more and 120 ° or less.
상기 친수성부에 현적된 액적은 10 μ ΐ 이상 및 100 μ 1 이하의 부피를 갖는 것일 수 있다.  The droplets suspended in the hydrophilic portion may have a volume of 10 μl or more and 100 μ1 or less.
상기 친수성부에 현적된 액적에서 배양된 세포는 3차원적 스페로이드이고, 직경 50 μ ηι 이상 및 2000 μ ηι 이하인 것일 수 있다.  Cells cultured in the droplets suspended in the hydrophilic portion is a three-dimensional spheroid, may be 50 μηι or more in diameter and 2000 μηι or less.
상기 소수성부는 소수성 중합체로 코팅된 것일 수 있다.  The hydrophobic portion may be coated with a hydrophobic polymer.
상기 소수성 중합체는 왁스， 테플론， 포토레지스트， 실란계 화합물, 폴리테트라 플루오로에틸렌 (Polytetraf luoroethylene) , 왁스 (wax) , 폴리디메틸실록산 (Poly dimethyl si loxane, PDMS) , 실리콘 (si 1 i cone) , 금속 나노입자， 금속 산화물 나노입자, 실리카 나노입자， 중합체 나노 입자 또는 이들의 조합인 것일 수 있다. 상기 각각의 소수성부 간의 거리는 1 ■ 이상 및 9 mm 이하인 것일 수 있다. The hydrophobic polymer may be a wax, a teflon, a photoresist, a silane compound, a polytetrafluoroethylene, a wax, a polydimethylsiloxane, PDMS, silicone (si 1 i cone), It may be a metal nanoparticle, a metal oxide nanoparticle, a silica nanoparticle, a polymer nanoparticle or a combination thereof. The distance between each of the hydrophobic portion may be 1 ■ or more and 9 mm or less.
상기 다공성막에 위치하는 채널을 더 포함하고， 상기 채널은 2 이상의 친수성부를 연결하는 것이고， 상기 채널은 친수성부 사이의 상호작용이 가능하게 하는 것일 수 있다.  Further comprising a channel located in the porous membrane, the channel is to connect two or more hydrophilic portion, the channel may be to enable interaction between the hydrophilic portion.
상기 채널의 너비는 0. 1 mm 이상 및 2.5 隱 이하인 것일 수 있다. 상기 친수성부는 바이오 패시베이션 (bio-pass ivat ion)코팅층을 더 포함하는 것일 수 있다.  The width of the channel may be 0.1 mm or more and 2.5 mm 3 or less. The hydrophilic portion may further include a bio-pass ivat ion coating layer.
상기 바이오 패시베이션 (bio-passivat ion)코팅층은 두께가 1 nm 이상 및 10 nm 이하인 것일 수 있다.  The bio-passivat ion coating layer may have a thickness of 1 nm or more and 10 nm or less.
상기 친수성부에서 액적이 현적되는 면은 타면에 비해 친수성도가 감소된 표면인 것일 수 있다.  The surface in which the droplet is suspended in the hydrophilic portion may be a surface having a reduced hydrophilicity compared to the other surface.
상기 세포 배양액에 포함된 세포는 포유류 세포의 단일 세포계 (pr imary cel l l ine) , 무한 증식 세포계 (cont inuous eel 1 l ine) , 줄기 세포， 종양 세포, 면역 세포, 박테리아 및 미생물 중에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.  The cells contained in the cell culture medium may be any one selected from a single cell line (pr imary cel ll ine) of mammalian cells, a cont inuous eel line, stem cells, tumor cells, immune cells, bacteria and microorganisms. It may be.
2 이상의 현적 세포 배양 단위체가 적층되고， 상기 현적 세포 배양 단위체는 다공성막; 상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및 상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고， 상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것이: ， 가장 아래에 위치하는 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지는 것일 수 있다. Two or more cultivated cell culture units are stacked, and the cultivated cell culture units comprise a porous membrane; A hydrophobic part located in the porous membrane; And a hydrophilic part surrounded by the hydrophobic part, wherein the porous medium can be exchanged with the culture medium in the droplet formed in the hydrophilic part and foreign material can be injected into the hydrophilic part of the cell culture unit located at the bottom of the cell culture medium. Droplets of the cultivation may be a cell culture.
상기 1 이상의 현적 세포 배양 단위체는 상기 다공성막에 위치한 채널을 더 포함하고， 상기 채널은 2 이상의 친수성부를 연결하는 것이고， 상기 채널은 친수성부사이의 상호작용이 가능하게 하는 것일 수 있다. 다공성막을 준비하는 단계; 상기 다공성막에 친수성부 및 소수성부를 형성하여 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계 ; 및 상기 현적 세포 배양 단위체를 2 이상 적층하는 단계;를 포함하는 현적 세포 배양 기기 제조방법을 제공한다. The at least one culturing cell culture unit further comprises a channel located in the porous membrane, the channel is to connect two or more hydrophilic portion, the channel may be to enable interaction between the hydrophilic portion. Preparing a porous membrane; Preparing a cell culture unit by forming a hydrophilic part and a hydrophobic part on the porous membrane; And stacking two or more of the cultivated cell culture units. It provides a manufacturing method.
상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계는 상기 친수성부를 연결하는 채널을 형성하는 것을 포함하는 것일 수 있다.  The preparing of the extensible cell culture unit may include forming a channel connecting the hydrophilic part.
상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계는 친수성 다공성막에 소수성 물질을 인쇄하는 방식에 의해 수행되는 것일 수 있다.  The preparing of the conventional cell culture unit may be performed by printing a hydrophobic material on a hydrophilic porous membrane.
상기 현적 세포 배양 단위체를 2 이상 적층하는 단계 ;는 현적 세포 배양 단위체의 상층과 하층의 친수성부가 중첩되도록 접는 방식에 의하여 현적 세포 배양 단위체를 적층하는 것일 수 있다.  The step of stacking two or more wise cell culture unit; may be to stack the wise cell culture unit by folding so that the hydrophilic portion of the upper layer and the lower layer of the fold cell culture unit overlap.
상기 다공성막에 친수성부 및 소수성부를 형성하여 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계 ;이후에 상기 친수성부 표면처리 단계 ; 를 더 포함하는 것일 수 있다.  Preparing a cell culture unit by forming a hydrophilic part and a hydrophobic part on the porous membrane; and then surface treating the hydrophilic part; It may be to include more.
상기 친수성부 표면처리 단계;는 바이오 패시베이션 (bio- passivat ion) 처리하는 단계; 또는 자외선 조사하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.  Surface treatment step of the hydrophilic portion; Bio-passivation (bio-passivat ion) treatment step; Or ultraviolet irradiation.
상기 친수성부 표면처리 단계 ;는 바이오 패시베이션 (bi으 passivat ion) 처리하는 단계 ; 및 자외선 조사하는 단계 ;를 포함하는 것일 수 있다. 현적 세포 배양 단위체로 구성된 현적 세포 배양 기기를 준비하는 단계; 배양하려는 세포를 포함하는 세포 배양액을 친수성부에 적하하여 세포 배양액의 액적을 형성하는 단계; 세포 배양액이 적하된 현적 배양 기기를 뒤집어서 세포 배양액의 액적을 현적시키는 단계; 세포 배양액의 액적이 현적된 상태로 세포를 배양하는 단계;를 포함하고， 상기 세포를 배양하는 단계;는 다공성막을 통하여 배양액을 교환하는 단계를 더 포함하는 것이고, 상기 현적 세포 배양 단위체는 다공성막; 상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및 상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고， 상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것이고， 가장 아래에 위치하는 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지는 것일 수 있다. 상기 세포 배양액이 적하된 현적 배양 기기를 뒤집어서 세포 배양액의 액적을 현적시키는 단계; 이후에 상기 다공성막을 통해 배양액을 추가하거나 제거하여 액적의 크기를 조절하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. The hydrophilic surface treatment step; The bio passivation (bi passivat ion) treatment step; And ultraviolet irradiation. Preparing a cell culturing device composed of cell culturing units; Dropping the cell culture solution containing the cells to be cultured onto a hydrophilic part to form droplets of the cell culture solution; Inverting the dropwise culture medium onto which the cell culture solution has been loaded, thereby dropping the droplets of the cell culture solution; Culturing the cells in the form of droplets of cell culture solution; and culturing the cells; further comprising exchanging the culture solution through the porous membrane, wherein the present cell culture unit comprises a porous membrane; A hydrophobic part located in the porous membrane; And a hydrophilic portion surrounded by the hydrophobic portion, wherein the culture medium in the droplet formed in the hydrophilic portion through the porous membrane and foreign material injection are possible, and the cell culture solution of the cell culture unit located at the lowest Droplets may be cultivated to allow cell culture. Inverting the suspension of the culture medium onto which the cell culture solution has been dropped, thereby suspending droplets of the cell culture solution; Thereafter, the method may further include adjusting the size of the droplet by adding or removing the culture solution through the porous membrane.
상기 세포를 배양하는 단계 ;는 다공성막을 통하여 외부 물질을 투입하는 단계;를 더 포함하는 것일 수 있다.  Culturing the cells; injecting an external material through the porous membrane; may be further included.
상기 현적 세포 배양 기기는 채널을 포함하는 것이고， 상기 채널은 2 이상의 친수성부를 연결하는 것이고， 상기 채널은 친수성부 사이의 상호작용이 가능하게 하는 것이고， 상기 세포 배양액의 액적을 형성하는 단계;는 1종 이상 세포 배양액을 채널로 연결된 각각의 친수성부에 적하하여 세포 배양액의 액적을 형성하는 것이고， 상기 세포를 배양하는 단계;는 세포 배양액의 액적이 현적된 상태로 채널을 통해 각각의 세포 스페로이드 간의 상호 작용이 이루어지며 세포를 배양하는 것일 수 있다. 복수의 현적 세포 배양 단위체를 포함하는 배양 시트; 상기 배양 시트를 이동시키는 구동모터; 상기 배양 시트 상부에 위치하며， 상기 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 세포 배양액을 적하하는 세포 배양액 투입장치; 를 포함하고， 상기 각각의 현적 세포 배양 단위체는， 다공성막; 상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및 상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고， 상기 친수성부에서 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지고, 상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것인， 현적 세포 배양 자동화 장치를 제공한다.  Said cultivating cell culture device comprises a channel, said channel connecting at least two hydrophilic parts, said channel enabling interaction between said hydrophilic parts, and forming droplets of said cell culture fluid; More than one species of cell culture solution is added to each of the hydrophilic parts connected to the channel to form droplets of the cell culture solution, and culturing the cells; the droplets of the cell culture solution through the channels between the respective cell spheroids Interactions may be made and the cells may be cultured. A culture sheet comprising a plurality of modern cell culture units; A driving motor for moving the culture sheet; A cell culture solution injector disposed above the culture sheet, and dropping the cell culture solution into a hydrophilic part of the hanging cell culture unit; Wherein each of the cultivated cell culture units comprises a porous membrane; A hydrophobic part located in the porous membrane; And a hydrophilic portion surrounded by the hydrophobic portion, wherein the droplet of the cell culture solution is suspended in the hydrophilic portion to perform cell culture, and the exchange of the culture medium in the droplet formed in the hydrophilic portion through the porous membrane and the injection of external material are possible. It provides phosphorus, automatic cell culture automation device.
상기 배양 시트는 컨베이어 벨트 구조이며， 상하부로 체인 형태의 이동을 하는 것일 수 있다. 상기 배양 시트가 컨베이어 벨트 구조의 상부로 이동시， 상기 세포 배양액 투입장치로부터， 세포 배양액이 상기 배양 단위체의 친수성부에 적하되어 액적을 형성하는 것일 수 있다.  The culture sheet has a conveyor belt structure, it may be to move in the form of a chain up and down. When the culture sheet is moved to the upper portion of the conveyor belt structure, the cell culture solution may be dropped into the hydrophilic portion of the culture unit to form droplets from the cell culture solution input device.
상기 배양 시트가 컨베이어 벨트 구조의 하부로 이동시， 상기 배양 단위체의 친수성부에 형성된 액적이 중력에 의해 현적되는 것일 수 있다. 상기 현적된 액적이 다시 상부 컨베이어 벨트 구조로 이동될 때， 시약을 상기 액적으로 투입하는 것일 수 있다. When the culture sheet is moved to the lower portion of the conveyor belt structure, droplets formed on the hydrophilic portion of the culture unit may be suspended by gravity. When the suspended droplets are moved back to the upper conveyor belt structure, The reagent may be added to the droplets.
상기 시약이 투입된 액적이 다시 하부 컨베이어 벨트 구조로 이동될 때, 상기 액적 내부의 세포 분석이 이루어지는 것일 수 있다. 【발명의 효과】  When the droplet into which the reagent is added is moved back to the lower conveyor belt structure, a cell analysis inside the droplet may be performed. 【Effects of the Invention】
본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기는, 배양액의 교환이 가능하여， 장기간 세포 배양이 가능하다. 또한， 외부 물질 주입이 가능하여， 외부 물질의 영향에 의한 세포 변화 연구에도 적용 가능하다. 본 발명의 일' 구현예에 따른 현적 세포 배양 단위체를 다층으로 구성하여， 세포 간 상호작용 연구에 활용 가능하다. The conventional cell culture device according to an embodiment of the present invention, the culture medium can be exchanged, it is possible to culture the cells for a long time. In addition, it is possible to inject foreign materials, it is applicable to the study of cell changes by the influence of foreign materials. By configuring the hyeonjeok cell culture unit according to one 'embodiment of the invention in multiple layers, it is usable for inter-cell interaction studies.
【도면의 간단한 설명】 [Brief Description of Drawings]
도 1 에서 본 발명의 일 구현예인 현적 세포 배양 기기를 구조를 나타내었다  Figure 1 shows the structure of a cell culture device, an embodiment of the present invention
도 2 은 본 발명의 일 구현예로서， 친수성 재질의 다공성막에 소수성인 왁스 프린팅된 현적 세포 배양 기기를 이용한 세포 현적 배양 기술에 관한 실험 모식도이다.  Figure 2 is an embodiment of the present invention, an experimental schematic diagram of cell cultivation technology using a hydrophobic wax-printed vesicle cell culture device hydrophobic membrane.
도 3 은 본 발명의 일 구현예에 따른 종이 기반 현적 배양 기기 (PHDC , Paper Hanging Drop Chip)에 현적된 액적을 친수성부의 다양한 지름과 그에 따른 수용할수 있는 액적 부피 간의 관계를 나타낸 결과이다. 도 4 은 특정 지름을 가진 친수부에 따른 액적 부피와 액적 세로길이의 관계이다.  3 is a result showing the relationship between various diameters of the hydrophilic portion and thus the acceptable droplet volume of the droplets suspended in a paper-based suspension culture device (PHDC, Paper Hanging Drop Chip) according to an embodiment of the present invention. 4 is a relationship between droplet volume and droplet length according to a hydrophilic portion having a specific diameter.
도 5 은 친수성부의 액적 접촉각을 측정함으로써， 액적 최대 수용 부피 및 액적 안정성에 대한 실험결과이다.  5 is an experimental result of the droplet maximum receiving volume and droplet stability by measuring the droplet contact angle of the hydrophilic portion.
도 6 은 채널이 형성된 PHDC(Net worked PHDC, N-PHDC)에서의 다양한 너비의 채널에서의 시간에 따른 농도 구배 형성에 대한 결과 이다.  Figure 6 is the result of the concentration gradient formation over time in the channel of various widths in the channel formed PHDC (Net worked PHDC, N-PHDC).
도 7는 다양한 종류의 디쉬에 조립된 본 발명의 일 구현예인 PHDC의 이미지를 나타낸 것이다.  7 shows an image of a PHDC which is an embodiment of the present invention assembled to various kinds of dishes.
도 8 은 본 발명의 일 구현예인 PHDC 및 N-PHDC를 이용한 세포 주입， 배양 및 분석 자동화 기기에 관한 모식도이다. 도 9 은 본 발명 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기 제조방법의 개략도이다. 8 is a schematic diagram of a cell injection, culture and analysis automation device using PHDC and N-PHDC which is an embodiment of the present invention. 9 is a schematic diagram of a method for manufacturing a conventional cell culture device according to an embodiment of the present invention.
도 10 은 본 발명의 일 구현예인 복수개의 친수성부가 채널에 의해 연결되어 있는 N-PHDC 를 이용하여 농도 구배 형성 및 약물 검사에 활용한 결과이다.  10 is a result of utilizing the concentration gradient and drug test using N-PHDC is a plurality of hydrophilic portion is connected by a channel of an embodiment of the present invention.
도 11 은 본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기 제조과정의 모식도이다.  Figure 11 is a schematic diagram of a manufacturing process of a conventional cell culture device according to an embodiment of the present invention.
도 12 은 소수성 중합체 프린팅된 친수성 다공성막을 이용한 3차원 세포 현적 배양 장치의 친수성부 표면처리 단계의 개략도이다.'  12 is a schematic view of the hydrophilic surface treatment step of a three-dimensional cell suspension culture apparatus using a hydrophobic polymer printed hydrophilic porous membrane. '
도 13 은 친수성부에 표면 처리 수행 후, 액적 유지시간 및 단백질 비특이적 결합 정도에 대한 실험 결과이다. ' FIG. 13 shows experimental results of droplet retention time and degree of protein nonspecific binding after surface treatment on a hydrophilic part. FIG. '
도 14 은 본 발명 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 방법의 개략도이다  14 is a schematic diagram of a method for culturing cells in accordance with an embodiment of the present invention.
도 15 은 본 발명의 일 구현예인 N-PHDC에서의 3차원 스페로이드의 농도 구배 내에서의 화학주성 반웅 실험 결과이다.  Figure 15 is a chemotactic reaction in the concentration gradient of the three-dimensional spheroid in N-PHDC of one embodiment of the present invention.
도 16 은 본 발명의 일 구현예인 PHDC를 이용하여 항암제 (5FU)에 대한 일반 세포 (CCD 1058sk)와 종양 세포 (MDA-MB 231) 약물 검사 및 면역 반웅 관련 실험 결과이다.  FIG. 16 shows the results of experiments on general cells (CCD 1058sk) and tumor cells (MDA-MB 231) drug test and immuno reaction against anticancer drugs (5FU) using PHDC, which is an embodiment of the present invention.
도 17 은 본 발명의 일 구현예에 따른 PHDC 에서의 종양 스페로이드 형성 이미지이다.  17 is an image of tumor spheroid formation in PHDC according to an embodiment of the present invention.
도 18 은 PHDC에서 배양된 스페로이드와 기존 현적 배양 방법인 패트리 디쉬 (Petr i-di sh)에서 배양한 스페로이드와의 비교 결과이다.  FIG. 18 is a comparison result between spheroids cultured in PHDC and spheroids cultured in Petr i-di sh, a conventional cultivation method.
도 19 은 PHDC에서의 다양한 세포들을 공동 배양했을 경우 스페로이드의 직경 변화에 관한 실험 결과이다  19 is an experimental result of the diameter change of the spheroid when co-cultured various cells in PHDC
도 20 은 적층 방식에 의해 제조되고， 채널을 포함하는 현적 세포 배양 기기를 이용하여 유방암 세포 (MDA— MB 231)만 단일 배양한 경우와 유방암 세포 (M -MB 231) 및 섬유아세포 (MEF)를 채널이 형성된 친수성부에서 상호가능한 상태에서 배양한 경우 배양된 세포 결합 상태 비교를 위한 전자주사 현미경 이미지이다. 【발명을 실시하기 위한구체적인 내용】 FIG. 20 shows a case in which only breast cancer cells (MDA—MB 231) are monocultured and breast cancer cells (M-MB 231) and fibroblasts (MEF), which are manufactured by a lamination method and using a cell culture apparatus including a channel. Electron scanning microscopy images for comparison of cultured cell binding states when cultured in a mutually compatible state in the channel-formed hydrophilic region. [Specific contents to carry out invention]
본 명세서에서 사용되는 전문 용어는 단지 특정 실시 예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의마는 특정 특성， 영역, 정수, 단계， 동작， 요소 및 /또는 성분을 구체화하며， 다른 특성， 영역， 정수, 단계， 동작， 요소 및 /또는 성분의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다. 다르게 정의하지는 않았지만， 여기에 사용되는 기술용어 및 과학용어를 포함하는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 보통 사용되는 사전에 정의된 용어들은 관련기술문헌과 현재 개시된 내용에 부합하는 의미를 가지는 것으로 추가 해석되고， 정의되지 않는 한 이상적이거나 매우 공식적인 의미로 해석되지 않는다.  The terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting of the invention. As used herein, the singular forms “a,” “an,” and “the” include plural forms as well, unless the phrases clearly indicate the opposite. As used herein, the phrase "comprising" embodies a particular characteristic, region, integer, step, operation, element and / or component, and the presence of another characteristic, region, integer, step, operation, element and / or component or It does not exclude the addition. Although not defined otherwise, all terms including technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art. Commonly defined terms used are additionally interpreted to have a meaning consistent with the related technical literature and the presently disclosed contents, and are not interpreted in an ideal or very formal sense unless defined.
또한， 명세서 전체에서， 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때， 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서 전체에서， "〜상에" 라 함은 대상 부분의 위 또는 아래에 위치함을 의미하는 것이며， 반드시 중력 방향을 기준으로 상 측에 위치하는 것을 의미하는 것은 아니다.  In addition, throughout the specification, when a part "includes" a certain component, this means that it may further include other components, except to exclude other components unless otherwise stated. In addition, in the whole specification, "to on" means to be located above or below the target portion, and does not necessarily mean to be located above the gravity direction.
본 명세서에서 액적의 세로길이 (Height of drop)는 다공성막의 표면을 기준으로 액적의 수직방향 길이를 의미하는 것으로 사용되며， 다공성막의 친수성부 아래쪽에 현적된 액적의 수직방향의 길이를 의미하는 것으로 사용될 수 있다.  In the present specification, the length of the drop (Height of drop) is used to mean the vertical length of the droplet relative to the surface of the porous membrane, it is used to mean the length of the vertical direction of the droplet suspended under the hydrophilic portion of the porous membrane Can be.
본 명세서에서 채널의 너비란， 유체가 이동하는 방향과 수직된 방향의 길이로 채널의 폭을 의미한다. 기존의 현적 배양 기술에서의 가장 큰 어려움은 액적 (Droplet )으로 부터의 배양액 교환과 액적 크기 조절이다. 그러나， 본 발명의 일 구현예에 따르면， 소수성 패턴을 인쇄 방법에 의하여， 다공성 재질에 제한된 친수성 공간을 형성하고, 배양할 세포들을 포함한 마이크로 리터 정도의 세포 배양액이 다공성막의 강한 모세관힘 (Capi l l ary force)에 의해 제한된 친수성 공간에 현적되어 3차원 스페로이드가 형성된다. 이러한 다공성막을 사용함으로써， 주기적 배양액 교환이 가능하며 , 세포 노폐물 제거와 새로운 배양액 주입을 통해 배양 기간을 연장할 수 있다. 또한， 다공성막의 친수성부의 직경을 제어하거나， 다공성막을 통한 배양액의 일부 추가 또는 제거를 통해 액적의 크기 조절이 가능하다. 또한, 본 발명의 일 구현예에서는 각 액적 간의 상호 작용이 가능한 채널을 간편하게 왁스 프린팅 방식을 이용하여 제작할 수 있으며， 사용자의 필요에 따라 디자인을 용이하게 변경하여 제작할 수 있는 이점이 있다. 이하， 본 발명의 구현예를 상세히 설명하기로 한다. 다만， 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 현적 세포 배양기기 In the present specification, the width of the channel means a width of the channel in a length perpendicular to the direction in which the fluid moves. The biggest difficulty with existing conventional culture techniques is the exchange of media from the droplets and the control of droplet size. However, according to one embodiment of the present invention, by printing a hydrophobic pattern, forming a limited hydrophilic space on the porous material, and microliterized cells including cells to be cultured The culture solution is suspended in a limited hydrophilic space by the strong capillary force of the porous membrane to form a three-dimensional spheroid. By using such a porous membrane, periodic culture exchange is possible, and the culture period can be extended by removing cell waste and injecting a new culture solution. In addition, the size of the droplets may be controlled by controlling the diameter of the hydrophilic portion of the porous membrane or by adding or removing a part of the culture solution through the porous membrane. In addition, in one embodiment of the present invention can be easily produced using a wax printing method for the channel that can interact with each droplet, there is an advantage that can be easily changed to the design according to the user's needs. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. However, this is presented as an example, whereby the present invention is not limited and the present invention is defined only by the scope of the claims to be described later. Modern cell culture equipment
본 발명의 일 구현 예에서는,  In one embodiment of the invention,
다공성막 및 상기 다공성막에 위치하는 소수성부 및 상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부를 포함하고， 상기 친수성부에서 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지고， 상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것인 현적 세포 배양 기기를 제공한다.  A porous membrane and a hydrophobic portion located in the porous membrane and a hydrophilic portion surrounded by the hydrophobic portion, and droplets of the cell culture solution are suspended in the hydrophilic portion to form a cell culture, and the culture solution in the droplet formed in the hydrophilic portion through the porous membrane It provides a cell culture device capable of exchanging and injecting foreign substances.
상기 주입되는 외부 물질은 실험 시약， 형광 염색제， 항암제와 같은 질병 치료제， 하이드로젤과 같은 세포 외 기질 단백질， 세포 일 수 있으며， 이에 한정되는 것은 아니다.  The injected foreign substance may be an experimental reagent, a fluorescent staining agent, a disease treatment agent such as an anticancer agent, an extracellular matrix protein such as a hydrogel, a cell, but is not limited thereto.
도 1 에서 본 발명의 일 구현예인 현적 세포 배양 기기를 구조를 나타내었다. 본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기는 다공성막 ( 1) , 다공성막에 위치하는 1이상의 소수성부 (3)， 및 소수성부로 둘러싸인 1이상의 친수성부 (2)를 포함할 수 있다. 또한, 2이상의 친수성부를 연결하여 상호작용이 가능하게 하는 채널 (4)을 더 포함하는 것일 수 있다. In Figure 1 shows a structure of a cell culture device, an embodiment of the present invention. The present cell culture device according to one embodiment of the present invention may include a porous membrane (1), at least one hydrophobic portion (3) located in the porous membrane, and at least one hydrophilic portion (2) surrounded by the hydrophobic portion. More than 2 It may further comprise a channel (4) for connecting the hydrophilic portion to enable interaction.
앞서 언급한 바와 같이 기존의 현적 배양 기술에서는 액적으로부터 배양액 교환이 어려운 문제가 있다.  As mentioned above, there is a problem in exchanging the culture solution from the droplets in the existing conventional culture technology.
그러나， 본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기의 경우 다공성막을 통해 주기적인 배양액의 \교환이 가능할 뿐만 아니라， 이러한 배양액 교체를 통해 1일에서 30일까지도 세포 배양이 가능하므로， 세포 배양 기간을 연장 가능한 이점아 있다. 또한， 다공성막을 통해 외부 물질 주입이 가능하므로, 외부 물질의 영향에 의한 스페로이드 변화 연구에도 적용 가능하며， 다공성막을 통해 배양액의 일부 추가 및 제거가 가능하므로， 액적 크기 조절이 용이하다는 장점이 있다. However, since not only be a \ exchange of periodic culture solution through a porous membrane for hyeonjeok cell culture device according to one embodiment of the present invention, Is from 1 to 30 through these culture replaceable on the map the cell culture, cell culture period There is a possible advantage to extend it. In addition, since the external material can be injected through the porous membrane, it is applicable to the spheroid change study by the influence of the external material, and the addition and removal of a part of the culture medium through the porous membrane has the advantage of easy droplet size control.
본 발명의 일 구현예로서, 도 2은 친수성 재질의 다공성막에 소수성인 왁스 프린팅된 현적 세포 배양 기기를 이용한 세포 현적 배양 기술에 관한 실험 모식도이다. 왁스 프린팅을 이용하여 친수성 다공성막 위에 소수성부 패턴을 프린팅한다. 세포 배양액을 친수성부 위에 떨어뜨린 후， 세포 배양 액적을 현적 (suspend)시키기 위해 기기를 뒤집는다. 다공성막의 모세관 힘과 배양액의 표면장력의 상호작용을 통해 친수성부에 액적이 현적된다.  As an embodiment of the present invention, Figure 2 is an experimental schematic diagram of cell cultivation technology using a hydrophobic wax-printed cultivation cell culture device hydrophobic membrane. The hydrophobic portion pattern is printed on the hydrophilic porous membrane using wax printing. After dropping the cell culture onto the hydrophilic portion, turn the instrument upside down to suspend the cell culture droplets. The droplets are suspended in the hydrophilic region through the interaction of the capillary force of the porous membrane and the surface tension of the culture medium.
다공성 재질 윗부분을 통해 주기적인 배양액 교체가 가능하므로， 보다 장기적인 기간 동안 액적 지지하면서 세포 배양이 가능하다.  Periodic replacement of the culture medium through the upper portion of the porous material allows cell culture while supporting droplets for a longer period of time.
다공성막을 통하여 배양액을 일부 추가하거나， 일부 제거하는 것이 가능하므로， 형성되는 액적의 크기 조절이 가능하다. 그러나， 이는 본 발명의 일 구현예에 불과하며， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에서는 상기 다공성막은 친수성을 가지는 것일 수 있으며, 구체적으로 종이， 나이트로셀를로오스， 실크， 면섬유， 폴리스타일렌 (Polystyrene) , 폴리테트라플루오로에틸렌 Since it is possible to add or remove some of the culture medium through the porous membrane, it is possible to control the size of the droplets formed. However, this is only one embodiment of the present invention, but is not limited thereto. In one embodiment of the present invention, the porous membrane may be hydrophilic, specifically, paper, nitrocellulose, silk, cotton fiber, polystyrene, polytetrafluoroethylene
(Polytetraf luoroetylene) , 중합체 다공성막， 마이크로 또는 나노 사이즈의 패턴이 있는 다공성막 중에서 선택된 어느 하나로 이루어진 것일 수 있다. 또한， 본 발명의 일 구현예에서는 상기 다공성막은 기공 직경이 0.2 μπι 이상 및 10 μπι 이하인 것일 수 있으며， 구체적으로， 0.5 μπι 내지 9 μιη, 0.7 μηι 내지 8 μιη, 1 μιη 내지 7 μηι, 3 μπι 내지 5 μηι, 0.7 μηι 내지 3 μπι , 4 μπι 내지 10 μπι, 또는 0.2 μηι 내지 6 μηι 일 수 있다. 기공 직경이 너무 큰 경우 세포 배양액을 친수성부에 적하할 때에 세포들이 다공막에 걸려 스페로이드 형성에 이용되는 세포 수가 감소할 문제가 있고， 기공 직경이 너무 작은 경우 다공성막을 통해 영양 배지 교환에 어려움을 갖는 문제가 발생할 수 있으며， 상기 기공 범위를 만족하는 경우 세포가 다공성막에 걸리는 문제를 방지할 수 있으며， 세포 배양을 위한 영양 배지 뿐만 아니라， 추후 분석 실험을 위한 시약 교환을 용이하게 할 수 있는 효과가 있다. (Polytetraf luoroetylene), a polymer porous membrane, may be made of any one selected from a porous membrane having a micro or nano-size pattern. In addition, in one embodiment of the present invention, the porous membrane has a pore diameter of 0.2 μπι or more and 10 μπι or less, specifically, 0.5 μπι to 9 μιη, 0.7 μηι to 8 μιη, 1 μιη to 7 μηι, 3 μπι to 5 μηι, 0.7 μηι to 3 μπι, 4 μπι to 10 μπι, or 0.2 μηι to 6 μηι. If the pore diameter is too large, when the cell culture fluid is added to the hydrophilic part, the cells may be caught in the porous membrane, thereby reducing the number of cells used for spheroid formation. If the pore diameter is too small, it is difficult to exchange the nutrient medium through the porous membrane. Problems may occur, and if the pore range is satisfied, the cells may be prevented from being caught in the porous membrane, as well as the nutrient medium for cell culture, and the effect of facilitating reagent exchange for later assays. There is.
상기 다공성막은 두께가 0.04 匪 이상 및 0.5 隱 이하인 것일 수 있으며， 구체적으로 0.05 睡 이상 및 0.4 mm 이하， 0.07 議 이상 및 0.3 瞧 이하， 0. 1 mm 이상 및 0.2 mm 일 수 있다. 다공성막의 두께가 얇은 경우 특정 부피 이상의 액적을 지지하는데 어려움이 있고， 두꺼운 경우 다공성막이 흡수할 수 있는 용액 부피가 너무 커, 추후 분석 실험이 어려운 문제가 있으며， 상기 다공성막의 두께 범위를 만족하는 경우 세포 배양에 필요한 액적 부피를 안정적으로 지지할 수 있고， 적은 시약 부피를 이용하여서도 추후 분석 실험이 가능한 효과가 있습니다.  The porous membrane may have a thickness of 0.04 mm 3 or more and 0.5 mm 3 or less, and specifically, 0.05 mm or more and 0.4 mm or less, 0.07 mm or more and 0.3 mm or less, 0.1 mm or more and 0.2 mm. When the thickness of the porous membrane is thin, it is difficult to support more than a certain volume of droplets, and when the thickness of the porous membrane is too large, the volume of the solution that the porous membrane can absorb is too large. It can stably support the droplet volume required for cultivation, and it is possible to perform further analysis experiments even with a small reagent volume.
상기 다공성막은 섬유형 (f iber ) 입자로 구성된 것일 수 있으며， 예를 들어 셀를로오스 섬유일 수 있다. 구체적으로， 비단 섬유， 면 섬유 등이 사용될 수 있다.  The porous membrane may be composed of f iber particles, for example, may be cellulose fibers. Specifically, silk fibers, cotton fibers and the like can be used.
상기 섬유형 입자가 일렬로 배열된 것일 수도 있으나， 이에 한정되는 것은 아니며， 섬유형 입자가 무작위 (random)로 배열된 형태일 수도 있다. 섬유상 입자의 배열이 무작위로 배열된 섬유형 입자의 경우， 시약이나 세포간의 신호 교신이 섬유 배열 방향에 영향을 받지 않고 균일한 모세관 힘과 확산으로 모든 방면으로 균일하게 전달될 수 있다는 효과가 있다. 종래 현적 배양 기술은 액적의 크기를 조절하기 어려운 문제점이 있었으나， 본 발명의 일 구현예에 따르면 친수성부의 형태 또는 직경을 제어함으로써， 형성되는 액적의 직경， 부피, 접촉각 등을 제어 가능하여 효과적으로 현적 배양이 가능하다. 상기 다공성막에 형성된 친수성부는 직경이 0.5mm 이상 및 8mm 이하인 것일 수 있다. 구체적으로， 2誦 이상 및 8醒 이하, 2 mm 이상 및 6 隱이하, 2 瞧 이상 및 5 瞧 이하, 3 瞧 이상 및 5 瞧 이하， 4 画 이상 및 5 誦 이하, 2 画 이상 및 4 隱 이하， 5誦 이상 및 6mm 이하 또는 0.5 隱 이상 및 6 mm 이하 일 수 있다. 친수성부의 직경이 너무 작은 경우 현적될 수 있는 액적의 부피가 너무 작아 세포 배양이 효과적으로 이루어지지 않을 수 있으며， 직경이 너무 큰 경우 적절한 액적 접촉각을 형성하기 위해 많은 양의 용액이 필요하고， 이로 인한 표면 면적이 넓어지면 액적 증발이 심해지는 문제가 있다. 따라서， 상기 직경범위를 만족하는 경우 적절한 부피의 액적이 안정적으로 현적되어 세포 배양에 충분한 영양분 제공할 수 있고， 배양 기간 동안 배양액이 마르는 문제를 방지함으로써， 효과적으로 세포 배양이 가능하다. 상기 친수성부에 형성된 액적은 10 μ ΐ 이상 및 100 μ 1 이하의 부피를 갖는 것일 수 있으며， 구체적으로 10 μ ΐ 이상 및 90 μ ΐ 이하， 10 μ 1 이상 및 80 μ ΐ 이하， 20 μ 1 이상 및 70 μ 1 이하， 20 μ 1 이상 및 50 μ 1 이하， 20 μ 1 이상 및 30 μ 1 이하, 30 μ 1 이상 및 40 μ 1 이하， 10 μ ΐ 이상 및 30 μ ΐ 이하 인 것일 수 있다. 현적 세포 배양 기기를 통해 세포를 배양하는 경우 친수성부에 형성된 액적의 부피는 세포 배양이 이루어지는 공간인 액적 내부 부피와 관련된다. 친수성부에 형성된 액적의 부피가 너무 큰 경우 액적의 질량 때문에 친수성부에 액적이 안정적으로 형성될 수 없고， 액적의 부피가 너무 작은 경우 세포 배양이 잘 이루어지지 않는 문제가 발생할 수 있으며， 상기 액적 부피 범위를 만족하는 경우 층분한 액적 내부 부피를 확보하고， 세포 배양에 충분한 영양분 제공 및 배양 기간동안 배양액이 마르는 문제를 방지함으로써 효율적으로 세포 배양이 이루어질 수 있을 뿐만 아니라, 다공성막을 통한 주기적 배양액 교환을 통해 오랜 기간 동안 안정적인 액적 지지가 가능하다， The fibrous particles may be arranged in a line, but is not limited thereto, and may be in the form of randomly arranged fibrous particles. In the case of fibrous particles having a random arrangement of fibrous particles, there is an effect that signal communication between reagents and cells can be uniformly transmitted in all directions with uniform capillary force and diffusion without being affected by the direction of fiber arrangement. Conventional cultivation technology has a problem that it is difficult to control the size of the droplets, according to one embodiment of the present invention by controlling the shape or diameter of the hydrophilic portion, it is possible to control the diameter, volume, contact angle, etc. of the droplets formed effectively effective cultivation This is possible. The hydrophilic portion formed in the porous membrane may be 0.5mm or more and 8mm or less in diameter. Specifically, 2 誦 or more and 8 醒 or less, 2 mm or more and 6 하 or less, 2 瞧 or more and 5 瞧 or less, 3 瞧 or more and 5 瞧 or less, 4 画 or more and 5 誦 or less, 2 画 or more and 4 隱 or less 5 mm or more and 6 mm or less or 0.5 mm or more and 6 mm or less. If the diameter of the hydrophilic part is too small, the volume of droplets that can be suspended may be too small to effectively cultivate the cell, and if the diameter is too large, a large amount of solution is required to form an appropriate droplet contact angle, and thus the surface If the area is widened, there is a problem that the droplet evaporation becomes severe. Therefore, when the diameter range is satisfied, droplets of an appropriate volume are stably loaded to provide sufficient nutrients for cell culture, and the cell culture can be effectively prevented by preventing the culture liquid from drying out during the culture period. The droplets formed on the hydrophilic portion may have a volume of 10 μl or more and 100 μl or less, and specifically 10 μl or more and 90 μl or less, 10 μ1 or more and 80 μl or less, 20 μ1 or more. And 70 μl or less, 20 μl or more and 50 μl or less, 20 μl or more and 30 μl or less, 30 μl or more and 40 μ1 or less, 10 μl or more and 30 μl or less. In the case of culturing cells through a modern cell culture device, the volume of the droplets formed in the hydrophilic portion is related to the volume of the droplets, which is the space in which the cell is cultured. When the volume of the droplets formed in the hydrophilic portion is too large, due to the mass of the droplets, the droplets may not be stably formed in the hydrophilic portion, and if the volume of the droplets is too small, the cell culture may not be performed well. If the range is satisfied, the cell volume can be efficiently obtained by securing a sufficient volume of droplets, providing sufficient nutrients for cell culture, and preventing the culture liquid from drying out during the culture period, and through periodic culture medium exchange through a porous membrane. Stable droplet support for a long time
친수성부의 직경은 그 친수성부에 형성되는 액적의 부피와 관련된다. 도 3 에서는 본 발명의 일 구현예인 종이 기반 현적 배양 기기 (PHDC Paper Hanging Drop Chip)에 친수성부의 직경에 따른 수용할 수 있는 액적의 부피를 측정하였다ᅳ 친수성부의 직경이 2mm인 경우 액적의 부피가The diameter of the hydrophilic portion is related to the volume of droplets formed in the hydrophilic portion. 3 is a paper-based suspension culture device (PHDC) which is an embodiment of the present invention Paper Hanging Drop Chip) was used to measure the volume of droplets that could be accommodated according to the diameter of the hydrophilic portion.
40 μ ΐ되는 경우 더 이상 친수성부에 지지되지 못하고 분리되어 물방울로 떨어지게 되며, 10 μ ΐ에서 현적 배양에 가장 안정적인 액적을 형성한다. 친수성부의 직경이 3隱인 경우 액적의 부피가 60 μ 1되는 경우 더 이상 친수성부에 지지되지 못하고 분리되어 물방울로 떨어지게 되며， 20 μ ΐ에서 현적 배양에 가장 안정적인 액적을 형성한다. 친수성부의 직경이 4mm인 경우 액적의 부피가 80 μ ΐ되는 경우 더 이상 친수성부에 지지되지 못하고 분리되어 물방을로 떨어지게 되며, 30 μ ΐ에서 현적 배양에 가장 안정적인 액적을 형성한다. 친수성부의 직경이 5圆인 경우 40 μ ΐ에서 현적 배양에 가장 안정적인 액적을 형성한다. 즉， 친수성부의 직경이 증가함에 따라 현적 가능한 액적의 부피도 증가하게 되며， 현적 배양에 가장 안정적인 액적 부피도 증가함을 알 수 있으며， 이처럼 특정 지름의 친수성부에서 현적 배양하기에 가장 안정적인 액적 부피가 있음을 확인하였다. At 40 μΐ, it is no longer supported by the hydrophilic part and separates and falls into water droplets. At 10 μΐ, it forms the most stable droplets for cultivation. If the diameter of the hydrophilic part is 3 隱, the volume of the droplet is no longer supported by the hydrophilic part, but separates and falls into water droplets. At 20 μl, it forms the most stable droplet for cultivation. If the diameter of the hydrophilic part is 4 mm, the volume of the droplet is no longer supported by the hydrophilic part and is separated. The droplet is dropped into the water droplet and forms the most stable droplet in the suspension culture at 30 μl. If the hydrophilic part is 5 mm in diameter, it forms the most stable droplet for suspension culture at 40 μl. In other words, as the diameter of the hydrophilic portion increases, the volume of the droplets that can be seen increases, and the volume of droplets that is most stable for the culture of cultivation also increases. As such, the volume of the most stable droplets for culturing in the hydrophilic portion of a specific diameter is increased. It was confirmed that there is.
상기 찬수성부에 형성된 액적의 세로길이는 0.5 誦 이상 및 7 mm 이하인 것일 수 있으며， 구체적으로, 0.5 隱 이상 및 4 mm 이하， 0.5 隱 이상 및 3.7 隱 이하， 0.5 mm 이상 및 3 隱 이하， 또는 1.3 mm 이상 및 3 mm 이하， 1.7 誦 이상 및 3 瞧 이하, 1.7 隱 이상 및 2.5 謹 이하， 또는 0.5 mm 이상 및 4 mm 이하 일 수 있다.  The longitudinal length of the droplet formed in the water-repellent part may be 0.5 mm or more and 7 mm or less, specifically, 0.5 mm or more and 4 mm or less, 0.5 mm or more and 3.7 mm or less, 0.5 mm or more and 3 mm or less, or 1.3 and at most 3 mm and at most 3 mm, at least 1.7 mm and at most 3 mm, at least 1.7 mm and at most 2.5 mm, or at least 0.5 mm and at most 4 mm.
도 4 는 친수성부의 지름에 따른 친수성부에 현적된 액적의 부피 및 액적의 세로길이의 관계를 나타낸다. 똑같은 액적 부피에서 친수성부의 지름이 클수록, 액적의 세로길이는 작은 것을 볼 수 있으며， 더 많은 액적 부피를 유지할 수 있음을 보여준다. 예를 들어， 30 μ ΐ의 액적 부피는, 2 mm 친수성부 지름에서 약 4 mm 의 액적 세로길이를 보였으며， 5 隱 친수성부 지름에서는 약 2 隱 의 액적 세로길이를 보였다.  Figure 4 shows the relationship between the volume of the droplets suspended in the hydrophilic portion and the longitudinal length of the droplets according to the diameter of the hydrophilic portion. The larger the diameter of the hydrophilic portion in the same droplet volume, the smaller the longitudinal length of the droplet can be seen, indicating that more droplet volume can be maintained. For example, a droplet volume of 30 μΐ showed a droplet length of about 4 mm at a diameter of 2 mm hydrophilic portion, and a droplet length of about 2 mm at a diameter of 5 mm hydrophilic portion.
친수성부에 현적된 액적의 지름이 너무 큰 경우 액적의 유지가 불안정할 수 있고， 친수성부에 지지되지 못하고 떨어니지는 문제가 발생할 수 있고, 너무 작은 경우 형성되는 액적의 크기가 너무 작아 현적 배양에 층분한 공간을 확보할 수 없는 문제가 있다. 따라서， 상기 액적 지름 범위를 만족하는 경우 안정적인 액적을 형성할 수 있으며， 층분한 액적 내부 부피를 확보함으로써, 세포 배양에 층분한 영양분 제공하고， 배양 기간 동안 배양액이 마르는 문제를 방지함으로써 효율적으로 세포 배양이 이루어질 수 있을 뿐만 아니라, 친수성부에 오랜 기간 동안 안정적인 현적 세포 배양이 가능하다. If the diameter of the droplets suspended in the hydrophilic portion is too large, the retention of the droplets may be unstable, and the problem of dropping and not supporting the hydrophilic portion may occur. There is a problem in that a sufficient space cannot be secured. Therefore, when the droplet diameter range is satisfied, stable droplets can be formed, and the droplets are divided. By securing the internal volume, not only the cell culture can be efficiently carried out by providing a rich nutrient to the cell culture and preventing the culture liquid from drying out during the culture period, but also the stable cell culture can be stable for a long time in the hydrophilic part.
상기 친수성부에 현적된 액적은 20° 이상 및 120° 이하의 접촉각을 갖는 것일 수 있다. 친수성부에 현적된 액적의 접촉각은 친수성부의 직경 또는 현적되는 액적의 크기에 따라 달라질 수 있으며， 구체적으로 20° 이상 및 120° 이하， 40° 이상 및 110° 이하， 60° 이상 및 110° 이하, 80° 이상 및 110° 이하, 또는 70° 이상 및 110° 이하， 80° 이상 및 120° 인 것일 수 있다. Droplets deposited on the hydrophilic portion may have a contact angle of 20 ° or more and 120 ° or less. The contact angle of the droplets deposited on the hydrophilic portion may vary depending on the diameter of the hydrophilic portion or the size of the droplets deposited, specifically, 20 ° or more and 120 ° or less, 40 ° or more and 110 ° or less, 60 ° or more and 110 ° or less, 80 ° or more and 110 ° or less, or 70 ° or more and 110 ° or less, 80 ° or more and 120 ° .
도 5A에서는 본 발명의 일 구현예에 따라 친수성부의 직경을 달리하여 친수성부에 현적된 액적의 접촉각을 측정함으로써， 액적의 최대 수용 부피 및 액적의 안정성을 보여주고 있다. 가장 큰 액적 접촉각을 보이는 조건을 통해， 다양한 친수성부에서 액적의 안정성을 보여주었으며， 또한 접촉각 경향을 보이는 조건을 통해， 다양한 친수성부 조건에서의 액적의 수용범위 또한 보여주었다.  In FIG. 5A, the maximum receiving volume and the stability of the droplet are shown by measuring the contact angle of the droplets suspended in the hydrophilic portion by varying the diameter of the hydrophilic portion according to the exemplary embodiment of the present invention. The stability of the droplets in the various hydrophilic regions was shown by the conditions of the largest contact angle of the droplets, and the range of the droplets in the various hydrophilic conditions was also demonstrated by the conditions of the contact angle tendency.
본 명세서에서 접촉각은 도 5B와 같이 고체 표면과 액체 표면이 이루는 각도를 액체 안쪽에서 측정한 값 ( Θ )을 의미한다.  In the present specification, the contact angle means a value Θ measured from the inside of the liquid to form an angle between the solid surface and the liquid surface as shown in FIG. 5B.
친수성부에 현적된 액적의 접촉각이 너무 큰 경우 친수성부에 액적이 안정적으로 형성되지 못하고， 장기간 세포 배양이 어려울 수 있으몌 접촉각이 너무 작은 경우 형성된 액적 내부의 부피가 너무 작아 현적 세포 배양에 층분한 공간을 확보하지 못하여 세포 배양이 효과적으로 수행될 수 없는 문제가 있으며， 상기 액적의 접촉각 범위를 만족하는 경우 세포 배양에 충분한 부피의 액적을 안정적으로 형성 가능하며， 충분한 액적 내부 부피를 확보함으로써， 세포 배양에 층분한 영양분을 제공하고， 배양 기간 동안 배양액이 마르는 문제를 방지함으로써 효율적으로 세포 배양이 이루어질 수 있을 뿐만 아니라， 친수성부에 오랜 기간 동안 안정적으로 현적 세포 배양이 가능하다.  If the contact angle of the droplets in the hydrophilic part is too large, the droplets may not be stably formed in the hydrophilic part, and cell culture may be difficult for a long time. If the contact angle is too small, the volume inside the formed droplets may be too small to be sufficient for culturing cell culture. There is a problem that cell culture cannot be effectively performed due to lack of space, and if the contact angle range of the droplet is satisfied, a sufficient volume of droplets can be stably formed in the cell culture, and a sufficient internal volume of the droplet can be secured for cell culture. By providing abundant nutrients to the cell and preventing the culture liquid from drying out during the culture period, not only can the cell culture be efficiently conducted, but also the cell culture can be stably maintained for a long time in the hydrophilic part.
상기 친수성부에 현적된 액적에서 배양된 '세포는 3차원적 스페로이드이고， 직경 50 i m 이상 및 2000 μ ιη 이하인 것일 수 있다. 구체적으로 50 μ ιιι 이상 및 1800 μ ιιι 이하， 50 μ ηι 이상 및 1500 μ ηι 이하， 80 μ ηι 이상 및 1000 μ ηι 이하， 50 i m 이상 및 500 μ ηι 이하， 또는 50 μ πι 이상 및 1000 u m 이하인 것일 수 있다. 상기 스페로이드의 직경이 너무 큰 경우， 스페로이드 중간에 위치하는 세포들이 영양분， 산소, 또는 이산화탄소에 대한 접근이 어려워 심각한 괴사 상태가 발생하는 문제가 있고, 너무 작은 경우, 3차원 스페로이드 형성의 목적인， 생체 내 ( in vivo) 모방에 차이를 보일 수 있다는 문제가 있으며ᅳ 상기 범위를 만족하는 경우， 다양한 질병 사례를 생체내 ( in vivo)와 가장 비슷하게 모방할 수 있는 효과가 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 다공성막에 형성된 친수성부의 형태는 원형으로 형성된 것이지만， 이에 한정되는 것은 아니며， 원형， 사각형， 타원형 등 다양한 모양으로 형성될 수 있다. 또한， 친수성부는 기공을 포함하는 것일 수 있다. ' Cells cultured in the droplets suspended in the hydrophilic portion is a three-dimensional spheroid, may be more than 50 im diameter and less than 2000 μιη. Specifically, 50 μ ιιι or more and 1800 μ ιιι or less, 50 μ ηι or more, 1500 μ ηι or less, 80 μ ηι or more, 1000 μ ηι or less, 50 im or more and 500 μ ηι or less, or 50 μ πι or more and 1000 um or less It may be. If the diameter of the spheroid is too large, the cells located in the middle of the spheroid is difficult to access nutrients, oxygen, or carbon dioxide, causing a serious necrosis state, if too small, the purpose of the three-dimensional spheroid formation ， There is a problem that can show a difference in the in vivo imitation and 경우 If the above range is satisfied, there is an effect that can mimic various disease cases most similar to in vivo (in vivo). In one embodiment of the present invention, the hydrophilic portion formed in the porous membrane is formed in a circular shape, but is not limited thereto, and may be formed in various shapes such as a circle, a rectangle, and an oval. In addition, the hydrophilic portion may be one containing pores.
하나의 친수성부에는 1종의 세포만을 배양할 수도 있으며， 2종 이상의 세포를 공동 배양하는 것도 가능하다 . 상기 다공성막에 형성된 소수성부는 다공성막에 소수성 중합체가 코팅된 것일 수 있으며， 구체적으로 소수성 중합체는 왁스， 테플론, 포토레지스트， 실란계 화합물， 또는 폴리테트라 플루오로에틸렌 (Polytetraf luoroethylene) , 왁스 (wax) , 피디엠에스 (Poly dimethyl s i loxane) , 실리콘 (si 1 i cone)， 금속 나노입자， 금속 산화물 나노입자, 실리카 나노입자， 중합체 나노 입자， 또는 이들이 조합된 것일 수 있으며, 금속 나노 입자는 구체적으로 금， 은， 구리， 백금 등일 수 있다. 그러나, 이는 본 발명의 일 구현예이며， 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며， 소수성부 형성 방법에 적합한 해당 기술분야에서 통상적으로 사용될 수 있는 소수성 중합체가사용될 수 있다.  Only one cell may be cultured in one hydrophilic part, and two or more cells may be co-cultured. The hydrophobic portion formed in the porous membrane may be a hydrophobic polymer coated on the porous membrane, specifically, the hydrophobic polymer may be wax, Teflon, photoresist, silane compound, or polytetraflooroethylene, wax. , Poly dimethyl si loxane, silicon (si 1 i cone), metal nanoparticles, metal oxide nanoparticles, silica nanoparticles, polymer nanoparticles, or a combination thereof. It may be silver, copper, platinum, or the like. However, this is one embodiment of the present invention, and the present invention is not limited thereto, and a hydrophobic polymer that may be commonly used in the art suitable for the method of forming hydrophobic portions may be used.
본 발명의 일 구현예에서는 소수성 중합체로서 왁스를 인쇄 방식을 통하여 다공성막에 소수성 패턴을 프린팅하는 방법을 개시하고 있으나， 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 각각의 소수성부 간의 거리는 1 隱 이상 및 9 mm 이하인 것일 수 있으며， 구체적으로 1 mm 이상 및 8 mm 이하， 2 mm 이상 및 7 mm 이하， 3 瞧 이상 및 6 國 이하， 4 讓 이상 및 6 隱 이하, 4 誦 이상 및 9 隱 이하 또는 1 隱 이상 및 9 隱 이하인 것일 수 있다. 소수성부 간의 거리가 너무 좁은 경우, 친수성 패턴에 위치한 액적이 합쳐져 액적이 무너질 가능성이 높은 문제가 있고ᅳ 너무 넓은 경우, 현적 배양 기기 하나당 형성할 수 있는 액적 수가 제한적이어서， 대량 신속 처리 (highthroughput ) 분석에 한계를 가질 문제가 있으며， 상기 소수성부 간의 거리를 만족하는 경우， 층분한 액적 내부 간의 거리를 확보함으로써， 액적 간의 증첩될 위험을 방지하여， 안정적인 현적 세포 배양이 가능할 뿐만 아니라, 많은 수의 액적을 동시에 형성할 수 있음으로， 대량 신속 처리 (highthroughput ) 분석 또한 활용 가능하다. 본 발명의 일 구현예에서는 다공성막에 위치하는 채널을 더 포함할 수 있으며， 상기 채널은 친수성을 가지는 것일 수 있으며， 2 이상의 친수성부를 연결하여 친수성부 및 친수성부에 형성된 액적 사이의 상호작용이 가능하도록 하는 것일 수 있다. 이러한 채널을 포함하는 현적 세포 배양 기기를 이용하여 세포를 배양함으로써， 서로 다른ᅳ 액적 내부의 배양 세포의 상호작용 연구가 가능하다. 또한， 채널로 연결된 각각의 친수성부에 종류가 다른 세포를 배양하는 경우 이종 세포 간의 상호작용 연구에도 활용 가능하다는 장점이 있다. One embodiment of the present invention discloses a method of printing a hydrophobic pattern on a porous membrane through a wax printing method as a hydrophobic polymer, but is not limited thereto. The distance between each hydrophobic portion may be 1 mm or more and 9 mm or less, specifically 1 mm or more and 8 mm or less, 2 mm or more and 7 mm or less, 3 or more and 6 or less, 4 or more and 6 or less Or less than 4 mW and 9 mW or less, or 1 mW or more and 9 mW or less. If the distance between the hydrophobic regions is too narrow, there is a problem that the droplets located in the hydrophilic pattern are likely to collapse, and if the droplets are too wide, the number of droplets that can be formed per modern culture device is limited, so that high throughput analysis is possible. When the distance between the hydrophobic parts is satisfied, by securing the distance between the inside of the droplets, preventing the risk of overlap between the droplets, not only stable cell culture is possible, but also a large number of liquids. By forming enemies simultaneously, high throughput analysis is also available. In one embodiment of the present invention may further include a channel located in the porous membrane, the channel may be to have a hydrophilic, by connecting two or more hydrophilic portion is possible interaction between the hydrophilic portion and the droplet formed on the hydrophilic portion It may be to. By culturing the cells using a conventional cell culture device including these channels, it is possible to study the interaction of cultured cells inside different droplets. In addition, there is an advantage that can be utilized in the study of interaction between heterologous cells when culturing cells of different types to each hydrophilic part connected by the channel.
상기 채널의 너비는 0. 1 瞧 이상 및 2.5 mm 이하인 것일 수 있으며， 구체적으로 0. 1 mm 이상 및 1.5 mm 이하， 0. 1 mm 이상 및 1 隱 이하， 0.3 mm 이상 및 2.0 mm 이하， 0. 1 mm 이상 및 0.7 隱 이하， 또는 0. 1 mm 이상에서 2.0 mm 이하인 것일 수 있다. 채널의 너비가 너무 넓으면， 모세관 힘이 커져서 친수성부 액적의 형태를 유지하기 어려을 수 있고， 너무 좁으면 모세관 힘이 작아져서 유체간 이동에 어려운 문제가 있으며, 상기 범위를 만족하는 경우에는 적당한 모세관 힘으로 인해 친수성부 액적 모양 유지도 가능하며, 채널을 통한 유체간 이동도 원활하게 이루어질 수 있다. 도 6 은 본 발명의 일 구현예에 따른 채널이 형성된 PHDCXNet worked PHDC , N-PHDC)에서의 다양한 너비의 채널에서의 시간에 따른 농도 구배 형성에 대한 결과 이다. 본 발명에서는 3개의 친수성부가 채널로 연결되어 상호작용 가능한 현적 세포 배양 기기 (N-PHDC)를 제작하였으며， 채널 너비를 0.5隱와 1隱로 다양하게 하여 시간의 흐름에 따른 농도 구배가 형성됨을 확인하였다. 이 실험을 통해, 모세간힘 및 확산 작용에 의해， 증간 원천부로부터 다양한 채널 너비에 따른 다양한 농도 구배 형성이 가능함을 보여주었다. 이 실험에서는, 0.5 Mo l e/ml 형광 소디움 염 ( f luorescein sodium sal t )을 포함한 용액을 중심에 위치한 친수성부 (원천부)에 주입하고 상대적인 형광 세기를 측정함으로써 형광 소디움 염의 농도를 구할 수 있으몌 이를 통해 다양한 너비의 채널을 통해 다른 확산 계수를 가짐을 볼 수 있었다. The width of the channel may be greater than 0.1 mm 3 and less than 2.5 mm, specifically 0.1 mm or more and 1.5 mm or less, 0.1 mm or more and 1 mm or less, 0.3 mm or more and 2.0 mm or less, 0. It may be 1 mm or more and 0.7 mm or less, or 0.1 mm or more and 2.0 mm or less. If the width of the channel is too wide, it may be difficult to maintain the shape of the hydrophilic droplets due to the large capillary force, too narrow if the capillary force is difficult to move between fluids, if the above range is met, the appropriate capillary Due to the force, it is possible to maintain the shape of the hydrophilic droplets and to facilitate fluid-to-fluid movement through the channel. 6 is a PHDCXNet worked channel formed in accordance with an embodiment of the present invention Results in concentration gradient formation over time in channels of varying widths (PHDC, N-PHDC). In the present invention, three hydrophilic units were connected to each other to produce a interactable cell culture device (N-PHDC), and the channel width was varied to 0.5 隱 and 1 隱, confirming that a concentration gradient was formed over time. It was. Through this experiment, it was shown that by capillary force and diffusion action, it is possible to form various concentration gradients according to various channel widths from the additional source. In this experiment, the concentration of fluorescent sodium salt can be determined by injecting a solution containing 0.5 mol / ml fluorescent sodium salt (f luorescein sodium sal t) into the central hydrophilic part (source part) and measuring the relative fluorescence intensity. This shows different diffusion coefficients through channels of various widths.
상기 채널의 길이는 0.5 瞧 이상 및 15 mm 이하인 것일 수 있으며， 채널의 길이를 조절함으로써， 친수성부 및 친수성부에 형성된 액적 간의 상호 작용을 조절할 수 있다.  The length of the channel may be more than 0.5 mm 3 and less than 15 mm, by adjusting the length of the channel, it is possible to control the interaction between the hydrophilic portion and the droplet formed on the hydrophilic portion.
도 5， 및 도 10을 살펴보면， 상기 채널의 너비 및 길이를 조절함으로써， 다양한 시약의 농도 구배를 형성할 수 있으며， 이를 이용한 다양한 실험， 예를 들어 화학주성， 세포 이동， 조직 개조， 약물 검사 등에 활용 가능하다.  5 and 10, by adjusting the width and length of the channel, it is possible to form a concentration gradient of various reagents, and various experiments using the same, for example, chemotaxis, cell migration, tissue remodeling, drug testing, etc. It can be utilized.
도 10 은 본 발명의 일 구현예인 복수개의 친수성부가 채널에 의해 연결되어 있는 N— PHDC 를 이용하여 농도 구배 형성 및 약물 검사에 활용한 결과이다. 이를 활용하여 도 IOC , E에서 보듯이， 다양한 채널 너비를 이용하여， 3차원 스페로이드의 5FT 5-FLU0R0URACIL)항암제 효과를 다양한 농도에서 PHDC와 N-PHDC를 이용하여 확인하였다. 주변 친수성부에 3차원 스페로이드 형성을 위해 48 시간동안 배양한 후， 중심에 있는 친수성부 (원천부)에 1000 mMo l 농도의 5FU 를 주입하였다. 또한 100， 500， 1000 Mol e 의 5FU 을 24 , 시간동안 처리하여 종양 세포의 생존력 (vi abi l i ty)를 확인함으로써， 3차원 종양 스페로이드의 항암 효과를 확인하였다. 중간 원천으로부터의 다양한 농도의 항암제에 의해， 다양한 세포 죽음 정도를 확인하였으며， 5FU 항암제에 대한 2 mm 너비의 채널에서 가장 낮은 세포 생존력을 보였으며， 0.5 瞧에서는 가장 높은 생존력을 보였다. 이를 통해， 본 발명의 일 구현예에 따른 채널이 형성된 종이 기반의 현적 배양 기기 (N-PHD, Networked Paper Hanging Drop) 가 시약의 다양한 농도 구배를 형성할 수 있으며， 이를 다양한 주제에 활용할 수 있음을 확인하였다. 10 is a result of utilizing the concentration gradient and drug test using N—PHDC in which a plurality of hydrophilic units are connected by a channel, which is an embodiment of the present invention. As shown in Figure IOC, E, using the various channel widths, the effect of the 5FT 5-FLU0R0URACIL) anticancer drug of the three-dimensional spheroid was confirmed using PHDC and N-PHDC at various concentrations. After incubation for 48 hours to form a three-dimensional spheroid to the surrounding hydrophilic part, 5FU of 1000 mMo l concentration was injected into the central hydrophilic part (source part). In addition, the antitumor effect of the three-dimensional tumor spheroid was confirmed by confirming the viability of tumor cells (vi abi li ty) by treating 5FU of 100, 500, and 1000 Mol e for 24 hours. Various levels of cell death were identified by various concentrations of anticancer agents from intermediate sources, the lowest cell viability in 2 mm wide channels for 5FU anticancer agents, and the highest viability at 0.5 瞧. Seemed. Through this, a paper-based paper culture device (N-PHD, Networked Paper Hanging Drop) in which a channel is formed according to an embodiment of the present invention can form various concentration gradients of reagents, and it can be used for various subjects. Confirmed.
이와 같이， 본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기를 이용하는 경우 액적이 현적된 상태에서 스페로이드 내의 현상을 명시야 또는 형광 이미지를 통해 분석이 가능하다. 본 발명의 일 구현예에서 상기 친수성부는 바이오 패시베이션 (bio- passivat ion)코팅층 을 더 포함하는 것일 수 있다. 친수성부의 다공성 막과 세포 배양에서 사용되는 단백질이나 세포외 기질의 비특이성 결합을 방지할 수 있다. 상기 바이오 패시베이션 (bio-passivat ion)코팅층 은 친수성부의 기공을 폐쇄시키지 않고， 친수성부 표면 및 기공 내부 표면을 포함하는 면적에 코팅층을 형성되는 것일 수 있다. 따라서， 상기 바이오 패시베이션 (bio-pass ivat ion)코팅층이 존재하더라도 친수성부의 기공은 여전히 개방된 것일 수 있으며, 친수성부 다공성막 상부를 통해 배양액 교환， 외부물질의 주입이나 제거가 가능하다. 상기 바이오 패시베이션 (bio-passivat ion)코팅층은 소혈청 알부민 (Bovine Serum Albumin, BSA) , 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드- 폴리에틸렌옥사이드 (Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)- poly(ethylene oxide) , PE0-PP0— PEO)， 폴리에틸렌글리콜 (PEG) , 또는 아가로즈 (Agarose) 로 구성된 것일 수 있다.  As such, in the case of using the cell culture apparatus according to the embodiment of the present invention, the phenomenon in the spheroid in the state where the droplets are suspended may be analyzed through bright field or fluorescence images. In one embodiment of the present invention, the hydrophilic portion may further include a bio-passivat ion coating layer. Non-specific binding of the porous membrane of the hydrophilic part and the protein or extracellular matrix used in cell culture can be prevented. The bio-passivat ion coating layer may be to form a coating layer on an area including the surface of the hydrophilic portion and the pore inner surface without closing the pores of the hydrophilic portion. Therefore, even if the bio-pass ivat ion coating layer is present, the pores of the hydrophilic portion may still be open, and the culture solution may be exchanged through the upper portion of the hydrophilic portion porous membrane, and the foreign material may be injected or removed. The bio-passivat ion coating layer is bovine serum albumin (Bovine Serum Albumin, BSA), polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide (poly (ethylene oxide)-poly (propylene oxide)-poly (ethylene oxide), PE0-PP0—PEO), polyethylene glycol (PEG), or agarose.
상기 바이오 패시베이셨 (bio-passivat ion)코팅층은 두께가 1 nm 이상 10 nm 이하일 수 있다. 코팅 두께가 너무 두꺼운 경우 친수성부에 재질 특성을 변화시킬 문제가 있고， 너무 얇은 경우 단백질이나 세포외 기질의 비특이성 결합을 방지 효과가 미미할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 상기 친수성부에서 액적의 현적되는 면은 타면에 비해 친수성도가 감소된 표면일 수 있다. 이는, 친수성부를 자외선 조사하는 단계를 수행함으로써 이루어질 수 있다. 친수성을 조절함으로써， 액적이 다공성막에 짧은시간 안에 흡수되는 것을 방지하여， 다공상막에 오랜시간동안 액적이 유지될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 현적 세포 배양 기기에서 배양되는 세포는 포유류 세포의 단일 세포계 (pr imary cel l l ine) , 무한 증식 세포계 (cont inuous cel l l ine) , 또는 줄기 세포， 종양 세포， 면역 세포， 박테리아 또는 미생물일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 소수성부 패턴의 설계에 따라 하나의 현적 배양 기기에서 1 내지 384 개의 스페로이드 형성이 가능하며， 현적 배양을 통한 세포 스페로이드 형성 이후， 선택적 단일 스페로이드를 수득할 수 있다. The bio-passivat ion coating layer may have a thickness of 1 nm or more and 10 nm or less. If the coating thickness is too thick, there is a problem of changing the material properties of the hydrophilic part, and if too thin, the effect of preventing nonspecific binding of the protein or extracellular matrix may be insignificant. In one embodiment of the present invention, the surface of the droplet in the hydrophilic portion may be a surface having a reduced hydrophilicity compared to the other surface. This can be done by performing a step of irradiating the hydrophilic part with ultraviolet rays. By controlling hydrophilicity, By preventing the droplets from being absorbed into the porous membrane in a short time, the droplets can be retained in the porous membrane for a long time. In one embodiment of the present invention the cells cultured in a modern cell culture device is a single cell line (pr imary cel ll ine) of the mammalian cells, cont inuous cel ll ine, or stem cells, tumor cells, immune cells, It may be a bacterium or a microorganism, but is not limited thereto. According to one embodiment of the present invention, according to the design of the hydrophobic portion pattern, it is possible to form 1 to 384 spheroids in one cultivation device, and after the cell spheroid formation through the cultivation, an optional single spheroid can be obtained. have.
또한， 본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기를 35， 60， 90， 100 mm 페트리 디쉬， 그리고 6， 12 , 24, 48， 96 , 384 웰플레이트 등 다양한종류의 디쉬에 조립하여 사용할 수 있다.  In addition, the cell culture device according to an embodiment of the present invention can be used by assembling a variety of dishes such as 35, 60, 90, 100 mm Petri dishes, 6, 12, 24, 48, 96, 384 well plate have.
도 7는 다양한 종류의 디쉬에 조립된 PHDC의 이미지를 나타낸 것이다. 각각 PHDC 가 PC 홀더에 조립된 이미지, 384 와 96 wel l 이 PC 홀더에 조립된 이미지, 60 mm 페트리 접시에 조립된 3x3 PHDC와 그 위에 형성된 액적 이미지이며, 이를 통해， 다양한 디자인의 PHDC를 용이하게 제작 및 조립하여 사용할수 있음을 보여주고 있다.  7 shows an image of a PHDC assembled in various kinds of dishes. Images of PHDC assembled into PC holders, 384 and 96wels assembled into PC holders, 3x3 PHDCs assembled into 60 mm Petri dishes and droplet images formed thereon, which facilitate PHPHs of various designs. It shows that it can be manufactured and assembled.
2 이상의 현적 세포 배양 단위체가적층된 현적 세포 배양 기기 A cultivated cell culture device in which two or more cultivated cell culture units are stacked.
본 발명의 다른 일 구현예에서는 2 이상의 현적 세포 배양 단위체가 적층되고, 상기 현적 세포 배양 단위는 다공성막 상기 다공성막에 위치하는 소수성부 및 상기 소수성부로 들러싸인 친수성부를 포함하고， 가장 아래에 위치하는 현적 세포 배양 단위의 친수성부에 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지고, 상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 현적 세포 배양 기기를 제공한다. 상기 현적 세포 배양 단위체를 2이상 적층하는 경우， 세포의 공간적 배치를 통제할 수 있어， 기존 기기에서 실현하기 어려웠던 생체 모사를 하는데 용이하다 . In another embodiment of the present invention, two or more culturing cell culture units are stacked, and the culturing cell culture unit comprises a hydrophobic part located in the porous membrane and a hydrophilic part enclosed by the hydrophobic part, and is positioned at the bottom Provided is a cell culture device capable of performing cell culture by droplets of cell culture fluid being deposited on a hydrophilic portion of a cell culture unit, and exchanging of the culture medium in the droplets formed on the hydrophilic portion and injecting foreign substances through the porous membrane. When stacking two or more of the conventional cell culture units, it is possible to control the spatial arrangement of the cells, which was difficult to realize in existing equipment It is easy to perform bio simulation.
각각의 현적 세포 배양 단위체는 1 이상의 친수성부， 및 1 이상의 소수성부를 포함하는 것일 수 있다.  Each modern cell culture unit may be one or more hydrophilic moieties, and one or more hydrophobic moieties.
상기 적층된 2 이상의 현적 세포 배양 단위체 중에서， 1 이상의 현적 세포 배양 단위체는 상기 다공성막에 위치한 채널을 더 포함하고， 상기 채널은 2 이상의 친수성부를 연결하는 것이고, 상기 채널은 채널로 연결된 친수성부 사이의 상호작용이 가능하게 하는 것일 수 있다.  Among the stacked two or more cultivated cell culture units, the at least one cultivated cell culture unit further comprises a channel located in the porous membrane, wherein the channel connects two or more hydrophilic parts, and the channel is connected between the hydrophilic parts connected by the channel. It may be to enable the interaction.
이러한 세포 배양 단위체의 적층 구조와 채널이 형성된 세포 배양 단위체를 효과적으로 설계하여 적층함으로써， 다양한 구조를 갖는 현적 세포 배양 기기를 구성할 수 있으며, 다양한 세포 배양 조건을 설계하여， 다양하고 효과적인 세포 배양 연구 또는 세포 간 상호작용 연구에 활용 가능하다. 현적 세포 배양 기기의 제조 방법  By effectively designing and stacking the cell culture unit formed with the stacked structure and the channel formed cell culture unit, it is possible to construct a modern cell culture device having a variety of structures, by designing a variety of cell culture conditions, various and effective cell culture research or It can be used to study intercellular interactions. Manufacturing method of modern cell culture device
본 발명의 다른 일 구현예에서는  In another embodiment of the present invention
다공성막을 준비하는 단계， 상기 다공성막에 친수성부 및 소수성부를 형성하여 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계 , 및 상기 현적 세포 배양 단위체를 2 이상 적층하는 단계를 포함하는 현적 세포 배양 기기 제조방법을 제공한다. 현적 세포 배양 단위체를 2 개 이상 적층하는 경우， 세포의 공간적 배치를 조절할 수 있어， 기존 현적 배양 기기에서 다양한 종류의 세포들을 공간적 배치를 통해 공간 배양하는 것이 시현하기 어려웠지만, 이와 같은 본 발명의 일 구현예에 의하는 경우 용이하게 생체 모사가 가능하다.  It provides a method for producing a conventional cell culture device comprising the steps of preparing a porous membrane, forming a hydrophilic portion and a hydrophobic portion in the porous membrane to prepare a cultivated cell culture unit, and stacking two or more of the cultivated cell culture unit. . In the case of stacking two or more conventional cell culture units, the spatial arrangement of the cells can be controlled, and it was difficult to spatially culture various types of cells through the spatial arrangement in the existing conventional culture apparatus, but one of the present invention By virtue of embodiments it is readily possible to simulate the biome.
도 9 은 본 발명 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기 제조방법의 개략도이다. 9 is a schematic diagram of a method for manufacturing a conventional cell culture device according to an embodiment of the present invention.
상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계는 상기 친수성부를 연결하는 채널이 형성되는 것을 포함할수 있다.  The preparing of the extensible cell culture unit may include forming a channel connecting the hydrophilic part.
상기 현적 세포 배양 단위체를 2 개 이상 적층하는 단계;는 현적 세포 배양 단위체의 상층과 하층의 친수성부가 중첩되도록 접는 방식에 의하여 현적 세포 배양 단위체를 적층하는 것일 수 있다. 기존 현적 배양 기기에서 다양한 종류의 세포들을 공간적 배치를 통해 공간 배양하는 것을 시현하기 어려웠지만, 본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기를 이용하는 경우 세포의 공간적 배치를 조절할 수 있어， 세포 간의 상호 작용을 모사할 수 있고 , 생체 모사를 더욱 정확하게 할수 있다 . The stacking of two or more wise cell culture units; may be to stack the wise cell culture unit by folding so that the hydrophilic portion of the upper layer and the lower layer of the fold cell culture unit overlap. Existing cultivation Although it was difficult to demonstrate spatial culturing of various kinds of cells in a device through spatial arrangement, when using a conventional cell culture device according to an embodiment of the present invention, the spatial arrangement of cells can be controlled, and the interaction between cells can be simulated. You can do it more accurately.
상기 채널을 통해 친수성부 및 친수성부에 형성된 액적 간의 상호 작용이 가능하며, 이를 통해 서로 다른 액적 내부의 배양 세포의 상호작용 연구가 가능할 뿐만 아니라 이종 세포 간의 상호작용 연구에도 활용 가능하다. 또한, 상기 현적 세포 배양 단위체의 적층 및 채널을 포함하는 현적 세포 배양 단위체를 적절하게 설계하여 조립함으로써， 다양한 형태의 현적 세포 배양 기기를 제조할 수 있으며， 다양하고 효과적인 세포 상호작용 연구에 활용 가능하다.  The channel allows interaction between the hydrophilic portion and the droplets formed on the hydrophilic portion, thereby enabling the study of the interaction of cultured cells inside different droplets, as well as the study of the interaction between heterologous cells. In addition, by appropriately designing and assembling the cultivated cell culture unit including the stack and the channel of the cultivated cell culture unit, various types of cultivated cell culture devices can be manufactured, and can be utilized for various and effective cell interaction studies. .
구체적으로， 도 10a와 같이 적층 구조를 통해 채널이 외부에 노출되지 않고 내부에 형성된 현적 세포 배양 기기를 제조 가능하다. 내부의 네트워크 형성을 할 수 있어， 단일 입구를 통해 많은 부분으로 용액을 전달할 수 있으며, 이는 제한적인 용액 조작 단계에서 유용하게 활용될 수 있다. 상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계는 다공성막에 소수성부 패턴을 프린팅하는 방식에 의해 이루어질 수 있으며， 본 발명의 일 구현예에서는 친수성을 갖는 다공성막인 종이에 왁스를 프린팅하는 방식을 이용하여 현적 세포 배양 기기를 제작하였으며， 이러한 인쇄 방식에 의하는 경우 현적 세포 배양 기기를 간편하게 제작이 가능하다. 또한， 사용자의 필요에 따라 현적 세포 배양 기기의 디자인을 용이하게 변경하여 제작할 수 있는 이점이 있다. 다만， 이는 본 발명의 일 구현예에 해당하며， 소수성부 패턴을 형성하는 방식이 이에 한정되는 것은 아니다.  Specifically, through the laminated structure as shown in Figure 10a it is possible to manufacture a cell culture device is formed inside the channel is not exposed to the outside. Internal network formation allows the solution to be delivered in large portions through a single inlet, which can be useful in limited solution manipulation steps. The manufacturing of the cultivated cell culture unit may be performed by printing a hydrophobic part pattern on the porous membrane, and in one embodiment of the present invention, the method is used by printing wax on a paper that is a porous membrane having hydrophilicity. The cell culture device was produced, and by the printing method, it is possible to easily manufacture the modern cell culture device. In addition, there is an advantage that can be easily changed to manufacture the design of the modern cell culture device according to the needs of the user. However, this corresponds to an embodiment of the present invention, and the manner of forming the hydrophobic part pattern is not limited thereto.
상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계는 친수성 다공성막에 소수성부의 패턴을 소수성 중합체를 이용하여 인쇄하는 단계， 상기 소수성 증합체가 인쇄된 다공성막을 열처리하는 단계, 및 소수성부 및 친수성부가 형성된 현적 세포 배양 단위체를 수득하는 단계를 통해 이루어질 수 있다. 상기 열처리 하는 단계 ;이후에 상기 다공성막을 컷팅하는 단계를 더 포함할 수 있다. The preparing of the cultivated cell culture unit comprises printing a pattern of a hydrophobic portion on a hydrophilic porous membrane using a hydrophobic polymer, heat-treating the porous membrane on which the hydrophobic polymer is printed, and culturing the cultivated cell on which the hydrophobic portion and the hydrophilic portion are formed. It may be through the step of obtaining a unit. The heat treatment step; and further comprising the step of cutting the porous membrane Can be.
도 11에서는 본 발명의 일 구현예로서 현적 세포 배양 기기의 제조 과정에 대한 모식도이다. 2隱 내지 8画의 특정 지름을 가진 원형 친수성 패턴을 상용화된 소프트웨어 (corel draw x5) 를 이용하여 디자인한다. 친수성 패턴 같은 경우는 실험에 사용한 well plate (96 well, 384 well, 3x3 또는 5x5) 에 따라 결정된다. 이 디자인은 Xerox solid wax printer (colorQube 8570)를 이용하여 소수성 중합체인 솔리드 (Sol id) 왁스가 다공성막에 소수성부 패턴에 따라 프린팅되고， 솔리드 (Solid) 왁스가 프린팅된 다공성막을 왁스를 녹이기 위해 가열하여 왁스 변형을 통해 소수성부를 형성한다. 도 11의 현적 세포 배양 기기 제작 방법의 순서도는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며， 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 상기 현적 세포 배양 단위체를 쎄조하는 단계 이후에 상기 친수성부 표면처리 단계를 더 포함할 수 있다.  Figure 11 is a schematic diagram of the manufacturing process of the conventional cell culture device as an embodiment of the present invention. Circular hydrophilic patterns with specific diameters of 2 隱 to 8 디자인 are designed using commercially available software (corel draw x5). The hydrophilic pattern is determined by the well plate (96 wells, 384 wells, 3x3 or 5x5) used in the experiment. This design uses a Xerox solid wax printer (colorQube 8570) to print a hydrophobic polymer, Sol id wax, printed on the porous membrane according to the hydrophobic pattern, and to heat the solid wax printed porous membrane to melt the wax. To form a hydrophobic part through wax deformation. The flowchart of the method for fabricating the conventional cell culture device of FIG. 11 is merely for illustrating the present invention, and the present invention is not limited thereto. The hydrophilic portion surface treatment step may be further included after the step of washing the conventional cell culture unit.
상기 친수성부 표면처리 단계는 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 바이오 패시베이션와으 333^^1011) 처리하는 것일 수 있다. 이 과정을 통해 친수성부에 바이오 물질의 비특이적인 흡착 등을 방지할 수 있다.  The hydrophilic portion surface treatment step may be to treat the hydrophilic portion of the hydrophilic portion of the wise cell culture unit with 333 ^^ 1011). This process can prevent non-specific adsorption of the biomaterial to the hydrophilic part.
구체적으로 상기 바이오 패시베이션 (bio-passivation) 처리하는 단계는 소혈청 알부민 (Bovine Serum Albumin, BSA), 폴리에틸렌옥사이드— 폴리프로필렌옥사이드 -폴리에틸렌옥사이드 (Poly(ethylene oxide)- IX) ly (propylene oxide)-poly(ethylene oxide) , PE으 PP0—PE0), 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 아가로즈 (Agarose) 등을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면， BSA용액을 표면에 도포함으로써， 다공성막 표면에 소혈청 알부민 (BSA)이 흡착되어， 친수성부에 바이오 패시베이션 (bio— passivation)코팅층을 형성하게 된다. 따라서 친수성부에 다른 단백질이나， 세포 등의 무작위적 결합 (Non-specific binding)을 방지할수 있다. 상기 친수성부 표면처리 단계는 현적 세포 배양 단위체의 친수성부를 자외선 조사하는 것일 수 있다. 이 과정을 통해 친수성부의 친수성도가 조절될 수 있다. Specifically, the step of bio-passivation treatment is bovine serum albumin (Bovine Serum Albumin, BSA), polyethylene oxide—polypropylene oxide-polyethylene oxide (Poly (ethylene oxide) -IX) ly (propylene oxide) -poly (ethylene oxide), PP0—PE0 as PE, polyethylene glycol (PEG), agarose, and the like. According to one embodiment of the present invention, by applying the BSA solution to the surface, bovine serum albumin (BSA) is adsorbed on the surface of the porous membrane, thereby forming a bio-passivation coating layer on the hydrophilic portion. Therefore, non-specific binding of other proteins or cells to the hydrophilic part can be prevented. The hydrophilic portion surface treatment step is a hydrophilic portion of the conventional cell culture unit It may be ultraviolet irradiation. This process can control the hydrophilicity of the hydrophilic portion.
대기 분위기 하에서 다공성막에 자외선을 조사하는 경우, 다공성막에 존재하는 일부의 C-0H 기가 C-0-기로 바뀔 수 있고， 일부의 C = 07} 0-C- 0기로 바뀔 수 있다. 이에 따라， 다공성막의 친수성도가 조절될 수 있다. 자외선 조사를 통해， 친수성부 표면의 친수성도를 감소시킴으로써， 친수성부에 위치한 액적이 짧은 시간에 다공성막에 흡수되지 않도록 하여, 오랜기간동안 액적이 다공성막에 유지될 수 있다. 상기 친수성부 표면처리 단계에서 바이오 패시베이션 (b i o- pass ivat i on) 처리하는 단계와 자외선 조사하는 단계는 어느 하나만 수행될 수도 있고， 두 가지 단계가모두 수행될 수도 있다.  When ultraviolet rays are irradiated to the porous membrane under an atmospheric atmosphere, some of the C-0H groups present in the porous membrane may be changed to C-0-groups, and some of C = 07} 0-C-0 groups. Accordingly, the hydrophilicity of the porous membrane can be adjusted. By irradiating ultraviolet light, by reducing the hydrophilicity of the surface of the hydrophilic portion, the droplets located in the hydrophilic portion are not absorbed by the porous membrane in a short time, the droplets can be retained in the porous membrane for a long time. In the hydrophilic surface treatment step, the step of bio passivation (b i-pass ivat i on) and the step of irradiating ultraviolet light may be performed only one, or both steps may be performed.
바이오 패시베이션 (bi o-pass ivat i on) 처리하는 단계에 의해 친수성부의 친수성도가 증가될 수 있으며， 자외선 조사를 통해 친수성도를 감소시킴으로써， 친수성부의 친수성도를 적절하게 조절 가능하다. 따라서， 바이오 패시베이션 처리와 자외선 조사 단계를 모두 수행한 경우에는 다공성막 친수성부의 액적 유지 시간이 현저히 증가될 수 있다,  The hydrophilicity of the hydrophilic portion can be increased by the step of bio passivation (bi o-pass ivat i on), and the hydrophilicity of the hydrophilic portion can be properly adjusted by reducing the hydrophilicity through ultraviolet irradiation. Therefore, when both the bio passivation treatment and the ultraviolet irradiation step are performed, the droplet retention time of the hydrophilic portion of the porous membrane may be significantly increased.
또한， 자외선 조사 처리에 의하여 친수성이 감소될 수 있으므로， 바이오 패시베이션 처리와 자외선 조사 단계를 모두 수행한 경우에는 바이오 물질의 비특이적인 흡착 감소 효과도 현저히 향상될 수 있다.  In addition, since the hydrophilicity may be reduced by the ultraviolet irradiation treatment, when both the bio passivation treatment and the ultraviolet irradiation step are performed, the non-specific adsorption reduction effect of the biomaterial may also be remarkably improved.
이와 같이， 본원의 일 구현예에서는 바이오 패시베이션 (b. )- pass ivat i on) 처리하는 단계와 자외선 조사 처리 단계 수행에 의해 친수성도를 조절하면서， 효과적으로 바이오 물질의 비특이적인 흡착을 방지 가능한 최적의 조건을 제공할 수 있다. 도 12에는 본 발명의 일 구현예에 따른 친수성부 표면처리 단계의 개략도를 살펴보면, 현적 세포 배양 단위체를 에탄올을 이용하여 멸균 처리하는 단계， 친수성부에 BSA용액을 이용하여 바이오 패시베이션 (b i o-pass i vat i on) 처리하는 단계， PBS를 이용하여 세척하는 단계， 및 자외선 조사하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 현적 세포 배양 방법 As such, in one embodiment of the present application, while controlling the hydrophilicity by performing a bio passivation (b. Condition can be provided. 12 is a schematic view of the surface treatment step of the hydrophilic part according to an embodiment of the present invention, the step of sterilizing the cell culture unit with ethanol, bio passivation using the BSA solution in the hydrophilic part (bi o-pass i vat i on) processing, washing with PBS, and ultraviolet irradiation. Cellular cell culture method
본 발명의 일 구현예에서는，  In one embodiment of the present invention,
본 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 기기를 준비하는 단계, 배양하려는 세포를 포함하는 세포 배양액을 친수성부에 적하하여 세포 배양액의 액적을 형성하는 단계, 세포 배양액이 적하된 현적 배양 기기를 뒤집어서 세포 배양액의 액적을 현적시키는 단계， 세포 배양액의 액적이 현적된 상태로 세포를 배양하는 단계를 포함하고，  Preparing a cell culture device according to an embodiment of the present invention, dropping the cell culture medium containing the cells to be cultured to the hydrophilic portion to form a droplet of the cell culture medium, the cell culture medium dropping the culture medium is dropped Suspending droplets of cell culture, culturing the cells with droplets of cell culture,
상기 세포를 배양하는 단계는 다공성막을 통하여 배양액을 교환하는 단계를 더 포함하는 것인 현적 배양 방법을 제공한다.  The step of culturing the cells provides a cultivation method further comprising the step of exchanging the culture solution through the porous membrane.
도 14에서 본 발명 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 방법의 개략도를 나타내었다.  14 shows a schematic diagram of a method for culturing cells according to an embodiment of the present invention.
본 발명의 다른 일 구현예에서는 상기 세포를 배양하는 단계 이후에 다공성막을 통하여 외부 물질을 투입하는 단계를 더 포함할수 있다.  Another embodiment of the present invention may further comprise the step of injecting an external material through the porous membrane after the step of culturing the cells.
다공성막 상부를 통하여 세포 배양액의 교환이 가능하므로， 기존 현적 배양 기술의 문제점을 극복하고， 주기적인 배양액 교체를 통해 오랜 기간 동안 세포 배양이 가능하다는 장점이 있으며， 다공성막 상부를 통하여 외부 물질 주입이 용이하므로， 외부 물질에 대한 스페로이드 변화를 연구하는 데에도 적용 가능하다. 본 발명의 일 구현예에서는 상기 세포 배양액이 적하된 현적 배양 기기를 뒤집어서 세포 배양액의 액적을 현적시키는 단계; 이후에 상기 다공성막을 통해 배양액을 추가하거나 제거하여 액적의 크기를 조절하는 단계를 더 포함할수 있다.  Since the exchange of cell culture solution through the upper part of the porous membrane is possible, it overcomes the problems of conventional culture techniques, and has the advantage of allowing cell culture for a long period of time by periodically changing the medium, and injecting foreign substances through the upper part of the porous membrane. Because of its ease, it is also applicable to studying spheroid changes to foreign materials. In one embodiment of the present invention, the step of inverting the drop culture cell dropping the cell culture medium dropping the droplets of the cell culture medium; Thereafter, the method may further include adjusting the size of the droplet by adding or removing the culture solution through the porous membrane.
도 15 은 본 발명의 일 구현예인 N-PHDC에서의 3차원 스페로이드의 농도 구배 내에서의 화학 주성 반응 실험 결과이다. 본 발명의 일 구현예인 N-PHDC를 활용하여 3차원 스페로이드의 FBS에 관한 화학 주성을 24 시간동안 확인하였으며， 이를 통해 본 발명이 외부 화학 물질의 영향에 의한 스페로이드 변화에 관한 실험에 활용될 수 있음을 확인하였다. 도 15 A 같은 경우, 0. 5 醒 너비의 채널에서의 24 시간 후 화학 시약의 농도 구배 시물레이션 결과를 보여주며， 농도가 높은 곳을 붉은색, 낮은 곳으로 갈수록 질은 청색을 띄는 것으로 표시하였으며， 시약을 주입한 왼쪽 영역은 가장 붉은 색으로 농도가 가장 높으며， 중간 영역은 청색， 오른쪽 영역으로 갈수록 짙은 청색으로 시약의 농도 구배 시뮬레이션 결과를 확인할 수 있다. 도 15 B는 0.5 靈， 1.0 mm 와 2.0 mm 너비의 채널에서의 화학 시약의 실험 농도와 시뮬레이션 결과를 비교하였다. 도 15 C, D, E 는 0 % FBS와 10 % FBS 사이에서의 농도 구배에 따른 세포의 주화성을 확인하였으며， 높은 농도의 FBS로 세포의 강한 화학 주성을 보였다. FIG. 15 shows the results of a chemotactic reaction in the concentration gradient of the three-dimensional spheroid in N-PHDC as an embodiment of the present invention. FIG. Chemistry about the FBS of the three-dimensional spheroid was confirmed for 24 hours using N-PHDC, which is an embodiment of the present invention, through which the present invention can be used for experiments on spheroid changes caused by the influence of external chemicals. Confirmed that it can. In the case of Figure 15 A, the concentration gradient simulation results of the chemical reagents after 24 hours in a 0.5 醒 wide channel are shown. The quality of the solution was gradually blue, and the left area of the reagent injection was the highest red color, the middle area was blue, and the right area was dark blue. FIG. 15B compares the experimental results and the simulation results of chemical reagents in channels 0.5 mm, 1.0 mm and 2.0 mm wide. 15 C, D, E confirmed the chemotaxis of the cells according to the concentration gradient between 0% FBS and 10% FBS, showed a strong chemotaxis of the cells with a high concentration of FBS.
도 16 은 본 발명의 일 구현예인 PHDC를 이용하여 항암제 (5FU)에 대한 일반 세포 (CCD 1058sk)와 종양 세포 (MDA-MB 231) 약물 검사 및 면역 반웅 관련 실험 결과이다. 다공성막에 서로 다른 친수성부 간의 채널을 형성하는 기술을 활용함으로써， 외부 물질 및 세포 주입이 용이하여， 외부 물질에 대한 스페로이드 변화뿐만 아니라, 항암제 처리 후， 제 2세포인 면역세포를 주입함으로써， 외부 물질에 의한 세포 간의 상호작용 변화 연구에 대해서도 적용할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 다른 일 구현예에서는，  FIG. 16 shows the results of experiments on general cells (CCD 1058sk) and tumor cells (MDA-MB 231) drug test and immuno reaction against anticancer drugs (5FU) using PHDC, which is an embodiment of the present invention. By utilizing the technology of forming channels between the different hydrophilic parts in the porous membrane, it is easy to inject foreign substances and cells, as well as the spheroid change to the foreign substances, by injecting immune cells, which are the second cells after the anticancer agent treatment, It was confirmed that the present invention can also be applied to the study of changes in the interaction between cells by foreign substances. In another embodiment of the present invention,
봅 발명의 일 구현예에 따른 현적 세포 배양 방법으로서， 상기 현적 세포 배양 기기는 채널을 포함하는 것이고， 상기 세포 배양액의 액적을 형성하는 단계는 1종 이상.세포 배양액을 채널로 연결된 각각의 친수성부에 적하하여 세포 배양액의 액적을 형성하는 것이고， 상기 세포를 배양하는 단계는 세포 배양액의 액적이 현적된 상태로 채널을 통해 각각의 세포 스페로이드 간의 상호 작용이 이루어지며 세포를 배양하는 현적 세포 배양 방법을 제공한다.  In a bobbin cell culture method according to an embodiment of the present invention, the bobbin cell culture device includes a channel, and forming droplets of the cell culture fluid is one or more. Dropping in to form droplets of the cell culture medium, and culturing the cells is a conventional cell culture method for culturing cells while interacting with each cell spheroid through the channel while the droplets of the cell culture solution are suspended. To provide.
이 경우 같은 종류 세포간의 상호작용 뿐만 아니라， 서로 다른 종류 간의 이종 세포간의 상호작용에 대한 연구가가능한 이점이 있다. 현적 세포 배양자동화장치  In this case, as well as the interaction between cells of the same type, there is an advantage that can study the interaction between heterogeneous cells between different types. Advanced cell culture automation device
본 발명의 또다른 일 구현예로서，  As another embodiment of the present invention,
복수의 현적 세포 배양 단위체를 포함하는 배양 시트， 상기 배양 시트를 이동시키는 구동모터， 상기 배양 시트 상부에 위치하며， 상기 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 세포 배양액을 적하하는 세포 배양액 투입장치를 포함하고， A culture sheet including a plurality of culturing cell culture units, a driving motor for moving the culture sheet, and positioned above the culture sheet, A cell culture solution injecting device for dropping the cell culture solution into the hydrophilic part of the cell culture unit,
상기 각각의 현적 세포 배양 단위체는 다공성막, 상기 다공성막에 위치하는 소수성부, 및 상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부를 포함하고， 상기 친수성부에서 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지고,  Each of the cultivated cell culture units includes a porous membrane, a hydrophobic portion located in the porous membrane, and a hydrophilic portion surrounded by the hydrophobic portion, and droplets of the cell culture solution are suspended in the hydrophilic portion to perform cell culture.
상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것인 현적 세포 배양 자동화 장치를 제공한다. 상기 배양 시트는 컨베이어 벨트 구조이며， 상하부로 체인 형태의 이동을 하는 것 일 수 있다.  The present invention provides an automatic cell culture automation device capable of exchanging a culture solution in a droplet formed in the hydrophilic part and injecting an external substance through the porous membrane. The culture sheet has a conveyor belt structure, it may be to move in the form of a chain up and down.
상기 배양 시트가 컨베이어 벨트 구조의 상부로 이동시에 상기 세포 배양액 투입장치로부터， 세포 배양액이 상기 배양 단위체의 친수성부에 적하되어 액적을 형성하는 것일 수 있다.  When the culture sheet is moved to the upper portion of the conveyor belt structure, the cell culture solution may be dropped into the hydrophilic portion of the culture unit to form droplets from the cell culture solution input device.
상기 배양 시트가 컨베이어 벨트 구조의 하부로 이동시에 상기 배양 단위체의 친수성부에 형성된 액적이 중력에 의해 현적되고 세포 배양이 이루어지는 것일 수 있다.  When the culture sheet is moved to the lower portion of the conveyor belt structure, droplets formed on the hydrophilic portion of the culture unit may be suspended by gravity and cell culture may be performed.
상기 현적된 액적이 다시 상부 컨베이어 벨트 구조로 이동될 때, 시약을 상기 액적으로 투입하는 것일 수 있다.  When the suspended droplets are moved back to the upper conveyor belt structure, a reagent may be introduced into the droplets.
상기 시약이 투입된 액적이 다시 하부 컨베이어 벨트 구조로 이동될 때， 상기 액적 내부의 세포 분석이 이루어지는 것일 수 있다.  When the droplet into which the reagent is added is moved back to the lower conveyor belt structure, a cell analysis inside the droplet may be performed.
도 8 은 본 발명의 일 구현예인 PHDC 및 N-PHDC를 이용한 세포 주입 , 배양 및 분석 자동화 기기에 관한 모식도이다. 도 8와 같이, PHDC와 N- PHDC는 회전 (Rotat ing) 시스템을 이용하여， 세포 주입， 스페로이드 배양 및 스페로이드 현상을 이미징， 분석을 자동화할 수 있다. 구체적으로， 친수성 다공성 막을 이용한 현적기기에 소형 컨베이어 벨트 (rotat ing pul ly)를 결합한 것이다. 이 시스템은 액적의 이동 및 형성을 자동화한 것으로써， 상층부에서 하층부로， 하층부에서 ᅵ다시 상층부로 회전 이동하는 구성을 가지며, 상층부에서 세포 배양액을 친수성부에 적하하여 액적 형성을 하고， 회전하여 하층부로 이동하며 하층부에서 액적이 적하되고， 스페로이드 형성이 이루어진다. 배양 조건인 37 °C , 5% 이산화탄소 조건에서 배양이 가능할 뿐만 아니라， 영양 배지와 시약 주입 및 흡광도 측정과 같은 추후 분석도 자동적으로 수행될 수 있다. 이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 실시예 1 내지 3 8 is a schematic diagram of a cell injection, culture and analysis automation device using PHDC and N-PHDC which is an embodiment of the present invention. As shown in FIG. 8, PHDC and N-PHDC can use a rotating system to automate imaging and analysis of cell injection, spheroid culture, and spheroid phenomena. Specifically, a small conveyor belt (rotating pul ly) is coupled to a suspension device using a hydrophilic porous membrane. This system automates the movement and formation of droplets, and has a configuration that rotates from the upper layer to the lower layer, and from the lower layer to the upper layer, and drops the cell culture liquid onto the hydrophilic portion to form droplets. It rotates and moves to the lower layer, and droplets are dropped at the lower layer, and spheroid formation takes place. In addition to culturing at 37 ° C., 5% carbon dioxide conditions, the subsequent analysis such as nutrient medium and reagent injection and absorbance measurement can be performed automatically. Hereinafter, preferred examples and comparative examples of the present invention are described. However, the following examples are only preferred examples of the present invention and the present invention is not limited to the following examples. Examples 1 to 3
크로마토그래픽 필터 종이 (chromatographic f i lter paper ) 위에 소수성 중합체로서 왁스를 이용하여 프린팅하고， 왁스를 120 0C에서 2 분 동안 가열하여， 소수성부을 형성함으로써， 친수성부가 패터닝된 실시예 1의 현적 세포 배양 기기를 제조하였다. The present cell culture apparatus of Example 1, wherein the hydrophilic portion is patterned by printing with a wax as a hydrophobic polymer on a chromatographic filter paper, heating the wax at 120 0 C for 2 minutes, and forming a hydrophobic portion. Was prepared.
상기 실시예 1의 친수성부의 친수성 조절을 위하여 18.52 mW/cm2 세기의 자외선을 3분간 쬐어주는 자외선 조사 처리를 수행하여 실시예 2의 현적 세포 배양 기기를 제조하였다. In order to control the hydrophilicity of the hydrophilic portion of Example 1 was carried out UV irradiation treatment for exposing the ultraviolet light of 18.52 mW / cm 2 intensity for 3 minutes to prepare a cell culture device of Example 2.
상기 실시예 1의 현적 세포 배양 기기를 살균하기 위해 100 % 에탄올에 30 분간 넣은 후， 친수성 부에 비특이적 단백질 결합을 막기 위해 친수성부를 1% 소혈청 알부민 (Bovine serum albumin, BSA) 내에 도포하여， 한시간 처리 후， - 인산염완층식염수 (Phosphate-buf fered sal ine , PBS) 버퍼로 3회 세척하고, 건조 시킨 후， 친수성부의 친수성도 조절을 위하여 In order to sterilize the present cell culture apparatus of Example 1 in 100% ethanol for 30 minutes, in order to prevent non-specific protein binding to the hydrophilic part, the hydrophilic part was applied in 1% bovine serum albumin (BSA), for one hour After treatment,-washed three times with phosphate-buffered saline (PBS) buffer, dried, and then to control the hydrophilicity of the hydrophilic part.
18.52 mW/cm2 세기의 자외선를 3분간 쬐어주는 자외선 조사 처리를 수행하여 실시예 3의 현적 세포 배양 기기를 제조하였다. Ultraviolet irradiation treatment was performed for 3 minutes of ultraviolet light of 18.52 mW / cm 2 century to prepare a cell culture device of Example 3.
이후 각각의 실시예의 현적 세포 배양 기기에 세포 배양액 액적을 형성하여， 3D프린팅된 홀더에 고정시켰다.  Cell culture droplets were then formed in the conventional cell culture device of each example and fixed in a 3D printed holder.
도 12의 현적 세포 배양을 위한 다공성막 처리 방법의 순서도를 나타내고 있으며 이는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며， 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다.  12 shows a flow chart of the porous membrane treatment method for the cultivation of the cultivated cells, which is merely to illustrate the present invention, and the present invention is not limited thereto.
도 13 은 친수성부에 BSA와 자외선 조사 처리 전 후의 액적 유지시간 및 단백질 비특이적 결합에 대한 실험 결과이다. Fig. 13 shows the droplet retention time before and after the BSA and UV irradiation treatment on the hydrophilic part; And experimental results for protein nonspecific binding.
친수성부의 표면 처리가 수행되지 않은 실시예 1의 경우 액적 유지 시간은 1분 미만이지만， 자외선 조사 처리를 거친 경우 (실시예 2)에는 액적 유지 시간이 10분 미만으로 자외선 조사 처리 전보다 증가하였으며, BSA처리와 자외선 조사 처리를 모두 행한 경우 (실시예 3)의 경우 액적 유지 시간이 10분을 초과하는 것으로 현저히 향상됨을 확인하였다.  In Example 1 in which the surface treatment of the hydrophilic portion was not performed, the droplet retention time was less than 1 minute, but when subjected to ultraviolet irradiation treatment (Example 2), the droplet retention time was increased to less than 10 minutes than before the ultraviolet irradiation treatment, and the BSA In the case where both treatment and ultraviolet irradiation treatment were performed (Example 3), it was confirmed that the droplet retention time was significantly improved by exceeding 10 minutes.
또한, 배지를 통한 영양 공급 및 세포 간 신호 교신을 방해할 수 있는 재질에서의 단백질 비특이성 결합을 방지하기 위해, 형광 스트렙타비딘 ( st rept avi di n)을 이용하여 단백질 비특이성 결합 정도를 확인한 결과， 친수성부 표면 처리가 이루어지지 않은 실시예 1의 경우 친수성부 다공성막과 단백질의 비특이성 결합 정도가 매우 높은 것으로 확인되나， 자외선 조사 처리를 거친 경우 (실시예 2)에는 단백질 비특이성 결합 정도가 일부 감소하였으며.， BSA처리와 자외선 조사 처리를 모두 행한 경우 (실시예 3)의 경우는 단백질 비특이성 결합 정도가 실시예 2의 경우보다도 절반 이하로 현저히 감소하였음을 확인하였다. 실시예 4  In addition, in order to prevent protein-specific binding in a material that can interfere with nutrient supply through the medium and intercellular signal communication, the degree of protein nonspecific binding was confirmed using fluorescent streptavidin (st reptavidin). As a result, in Example 1 where the hydrophilic part surface treatment was not performed, it was confirmed that the nonspecific binding degree of the hydrophilic part porous membrane and the protein was very high, but when the UV irradiation treatment was performed (Example 2), the degree of nonspecific binding of the protein was observed. In the case of both BSA treatment and UV irradiation treatment (Example 3), it was confirmed that the degree of protein nonspecific binding was significantly reduced to less than half of that of Example 2. Example 4
두께 200 μ ιη GE whatman Chrome 1 f i l ter paper를 이용하여 PHDC 를 제작하였으며, 4 mm 지름 위, 30 μ 1 액적 안에서 2 , 000 개의 종양 세포들을 배양하여, 다양한 배양 날짜로 종양 스페로이드를 형성하였다. 도 17 은 PHDC를 이용하여， 다양한 배양 날짜에 따른 종양세포 스페로이드 형성을 이미징한 예이다.  PHDC was prepared using a 200 μιη GE whatman Chrome 1 f i lter paper, and 2, 000 tumor cells were cultured in 30 μ 1 droplets over 4 mm diameter to form tumor spheroids at various culture dates. 17 shows an example of tumor cell spheroid formation according to various culture dates using PHDC.
도 7 는 현미경을 이용하여 스페로이드를 이미징하는 모식도이며, 1.25 배율의 유방암 세포의 스페로이드 명시 야상과 형광 이미지를 보여주고 있으며， 이처럼 PHDC 액적 안에서 세포들이 3차원적 스페로이드 형성을 할 수 있음을 확인할 수 있다. 실시예 5  7 is a schematic diagram of imaging a spheroid using a microscope, and shows a spheroid-specific image and fluorescence image of breast cancer cells at 1.25 magnification. Thus, cells in the PHDC droplets can form three-dimensional spheroids. You can check it. Example 5
유방 상피 세포 (MCF 10A)와 유방암 세포 (MDA MB 231) 를 PHDC 기기 위에서 5일간 현적 배양하여 도 17B에 나타내었다. MCF 10A 배양의 경우 DMEM F12 배양액을 이용하였으며， MDA— MB 231 세포의 경우 10 % FBS and 1 % col lagen 가 포함된 DMEM 배양액을 이용하여， 1일에 액적의 5 μ 1 배양액을 제거하고， 10 μ ΐ 새로운 배양액을 주입하면서 5일 간 스페로이드 형성하였다. Breast epithelial cells (MCF 10A) and breast cancer cells (MDA MB 231) were cultivated five days on a PHDC instrument and shown in FIG. 17B. For MCF 10A culture DMEM F12 culture medium was used. For MDA—MB 231 cells, DMEM culture medium containing 10% FBS and 1% col lagen was used to remove 5 μ1 of the droplets per day. Spheroid formation for 5 days while injecting.
다공성막을 이용한 PHDC 같은 경우 액적 부피의 약 0.5 ~ 50 % 배양액을 정기적으로 교환할 수 있음을 보여주고 있으며, 그 결과로, 세포 노폐물 제거와 새로운 배양액 주입을 통한 장기간 세포 배양을 할 수 있음을 확인 할수 있다. 실시예 6  In the case of PHDC using porous membrane, it is shown that about 0.5 to 50% of the liquid volume can be exchanged regularly, and as a result, it can be confirmed that long-term cell culture can be achieved by removing cell waste and injecting new medium. have. Example 6
도 18 은 PHDC에서 배양된 스페로이드와 기존 현적 배양 방법인 패트리 디쉬 (Petr i-dish)에서 배양한 스페로이드와의 비교 결과이다.  FIG. 18 is a comparison result between spheroids cultured in PHDC and spheroids cultured in Petr i-dish.
기존 현적 배양 기술 중 하나인 패트리 디쉬 (Petri-di sh)에서 배양했을 때의 스페로이드와 PHDC에서 배양된 스페로이드를 비교해보았을 때, 도 18A, B에 보이는 것과 같이 형태학적으로나 생존 능력 관해서 비슷한 경향을 보였다. 도 18C는 Calcein-am 염색을 통해 PHDC에서 배양된 스페로이드의 생존 능력과 종양 세포 전이와 관련 있는 마커인 F-act in 염색을 통해 PHDC에서 배양된 스페로이드의 전이 능력을 확인하였다. 도 18D 같은 경우， 종양 세포의 성장인자로 알려진 TGF-βΙ 분비 정도를 PHDC에서 세포 수와 배양 날짜에 따라 비교한 결과， 배양 날짜가 지남에 따라 많은 세포수로 형성된 스페로이드가 적은 세포수로 형성된 스페로이드 보다 배양 날짜가 지남에 따라 더 많은 양의 TGF-β Ι을 분비하는 것을 확인할수 있다. 실시예 7  Comparing the spheroids grown in Petri dish with one of the existing cultivation techniques and the spheroids grown in PHDC, similar trends in morphology and viability as shown in Figs. 18A and B are shown. Showed. Figure 18C confirmed the metastatic capacity of the spheroid cultured in PHDC through F-act in staining, a marker related to the viability of the spheroid cultured in PHDC through Calcein-am staining and tumor cell metastasis. As shown in FIG. 18D, as a result of comparing TGF-βΙ secretion known as a growth factor of tumor cells according to the number of cells and the date of culture in PHDC, spheroids formed with a large number of cells over the culture date were formed with a small number of cells. It can be seen that the secretion of TGF-β is secreted over the culture date than spheroids. Example 7
도 19 은 PHDC에서의 하나의 친수성부에서 다양한 세포들을 공동으로 배양하여 스페로이드를 형성한 경우 스페로이드의 직경 변화에 관한 실험 결과이다  19 is an experimental result of the diameter change of the spheroid when the spheroid was formed by co-cultivating various cells in one hydrophilic part in PHDC
도 19에서는， 종양 세포와 일반 세포를 하나의 친수성부에서 공동 배양함으로써， 스페로이드 직경 변화를 확인하였으며， 이를 통해， 하나의 친수성부에서 1종의 세포를 단일 배양한 경우 (단일 배양) 뿐만 아니라, 하나의 친수성부에서 2종 이상의 세포를 공동 배양하여 스페로이드를 형성하는 것 (공동 배양)이 가능함을 확인하였다. In Figure 19, by co-culturing tumor cells and normal cells in one hydrophilic part, the spheroid diameter change was confirmed, through which one It was confirmed that not only a single culture of one cell in the hydrophilic part (single culture), but also co-culture of two or more cells in one hydrophilic part to form a spheroid (co-culture).
종양 세포 (MCF— 7)과 일반 세포인 섬유 아세포 (CCD 1058)를 단일 배양과 공동 배양했을 경우에 배양 시간에 따른 스페로이드 직경을 2 일 간격으로 10 일 동안 비교하여， 세포 종류에 따른， 그리고 세포 배양 방법에 따라 스페로이드 직경 변화의 경향성을 확인하였다.  When tumor cells (MCF-7) and fibroblasts (CCD 1058), which are normal cells, were co-cultured with a single culture, the spheroid diameter according to the culture time was compared for 10 days at 2 days intervals, depending on the cell type, and According to the cell culture method, the tendency of the spheroid diameter change was confirmed.
본 실험에서, 종양 세포 (MCF-7) 단일 배양일 경우， 시간이 지남에 따라 스페로이드 직경이 커지는 경향이 있었고， 섬유 아세포 (CCD 1058) 단일 배양일 경우, 시간이 지남에 따라 세포들이 웅집하여 스페로이드 직경이 작아지는 경향이 있었다. 종양 세포 (MCF-7) 와 섬유아세포 (CCD1058)를 섞어 공동 배양 (Cocul ture)했을 경우의 스페로이드 직경 변화는 섬유아세포 단일 배양 경우의 직경 변화와 좀 더 유사하다는 것을 확인하였습니다. 실시예 8  In this experiment, the single cell culture of tumor cells (MCF-7) tended to increase in spheroid diameter over time, and in the case of single cell culture of fibroblasts (CCD 1058), cells were congested over time. The spheroid diameter tended to be small. It was confirmed that the spheroid diameter change when co-culture of tumor cells (MCF-7) and fibroblasts (CCD1058) was more similar to that of single fibroblast culture. Example 8
본 발명의 일 구현예에 따른 2개의 현적 세포 배양 단위체의 상층과 하층의 친수성부가 중첩되도록 접는 적층 방식에 의해 제조되는 채널을 포함하는 현적 세포 배양 기기를 이용하였다. 유방암 세포 (MDA-MB 231)를 다른 세포와의 상호 작용 없이 단일 배양한 경우와 채널로 연결되어 상호작용이 가능한 하나의 친수성부에는 유방암 세포 (MDA— MB 231)를 다른 친수성부에는 섬유아세포 (MEF)를 배양한 후 배양된 세포 결합 상태 비교를 위한 전자주사 현미경 이미지를 도 20에 나타내었다.  According to one embodiment of the present invention was used a cultivated cell culture device comprising a channel prepared by a stacking method of folding so that the hydrophilic portion of the upper layer and the lower layer of the two cultivated cell culture units overlap. Breast cancer cells (MDA-MB 231) are cultured in a single culture without interaction with other cells, and breast cancer cells (MDA—MB 231) are connected to one hydrophilic part that can be channeled and interact with fibroblasts (MDA-MB 231). Electron scanning microscope image for comparing the cultured cell binding state after the culture of MEF) is shown in Figure 20.
첫번째 층의 현적 세포 배양 단위체 (B)는 세포 현적 배양을 위한 친수성부 및 소수성부 패턴이 형성되어 았으며， 두번째 층의 현적 세포 배양 단위체 (A)는 친수성부를 연결하는 채널 (X , y, z)이 더 형성되어 있다. 2 개의 현적 세포 배양 단위체 (A, B)는 친수성부가 중첩되도록 접혀져 적층된 형태로 구성되었으며, 친수성부 (2 , 5， 8)에는 유방암 세포 (MDA-MB 231)를 친수성부 ( 1， 4 , 7)에는 섬유아세포 (MEF)를 각각 배양하여, 종류가 다른 이종의 스페로이드 간의 상호작용을 유도할 수 있는 네트워크를 형성하였다. 2일간 상호 작용된 유방암 세포 (MDA-MB 231)와 섬유아세포 (MEF)의 전자 주사 현미경 이미지를 보면， 섬유아세포 (MEF)와의 상호작용을 통한 유방암 스페로이드 (MM-MB 231) (도 20 md)가 단일 배양된 유방암 스페로이드 (MDA-MB 231) (도 20 mc)보다 좀 더 강한 세포간의 ᅳ결합을 가짐을 확인할수 있었다. 본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며， 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 '기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. The first layer of culturing cell culture unit (B) had a hydrophilic and hydrophobic pattern for cell culturing, and the second layer of culturing cell culture unit (A) had a channel (X, y, z) connecting the hydrophilic part. Is further formed. The two cultivated cell culture units (A, B) were folded and stacked so that the hydrophilic portions overlapped, and the hydrophilic portions (2, 5, 8) had breast cancer cells (MDA-MB 231) in the hydrophilic portion (1, 4, 7) cultivates fibroblasts (MEFs), each of which has a network that can induce interactions between heterogeneous spheroids. Formed. Electron scanning microscopy images of breast cancer cells (MDA-MB 231) and fibroblasts (MEF) interacted for 2 days showed that breast cancer spheroids (MM-MB 231) through interaction with fibroblasts (MEF) (FIG. 20 md). ) Has a stronger binding between cells than single cultured breast cancer spheroids (MDA-MB 231) (FIG. 20 mc). The present invention is not limited to the above embodiments, but may be manufactured in various forms, and a person of ordinary skill in the art to which the present invention pertains does not change the technical spirit or essential features of the present invention. It will be appreciated that the present invention may be practiced as. Therefore, embodiments described in the above examples should be understood to be illustrative and non-restrictive in every respect.
【부호의 설명】 [Explanation of code]
1 다공성막 2 친수성부 3 소수성부 4 채널  1 porous membrane 2 hydrophilic part 3 hydrophobic part 4 channel

Claims

【청구범위】 [Claim]
【청구항 1】  [Claim 1]
다공성막;  Porous membrane;
상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및  A hydrophobic part located in the porous membrane; And
상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고，  Includes; hydrophilic portion surrounded by the hydrophobic portion,
상기 친수성부에서 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지고,  Drops of the cell culture solution in the hydrophilic portion is suspended, the cell culture is made,
상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것인，  It is possible to exchange the culture medium in the droplet formed in the hydrophilic portion and the foreign material injection through the porous membrane,
현적 세포 배양 기기.  Modern cell culture instruments.
【청구항 2】 [Claim 2]
제 1항에서，  In paragraph 1,
상기 다공성막은 친수성을 가지는 것인，  The porous membrane is hydrophilic,
현적 세포 배양 기기.  Modern cell culture instruments.
【청구항 3] [Claim 3]
제 1항에서，  In paragraph 1,
상기 다공성막은 종이， 나이트로셀를로오스, 실크， 면섬유， 중합체 다공성막， 또는 이들의 조합을 포함하는 것인，  The porous membrane comprises paper, nitrocellulose, silk, cotton fiber, polymer porous membrane, or a combination thereof,
현적 세포 배양 기기.  Modern cell culture instruments.
【청구항 4] [Claim 4]
제 1항에서，  In paragraph 1,
상기 다공성막은 가공 직경이 0.2 μηι 이상 및 10 μηι 이하인 것인 현적 세포 배양 기기.  The porous membrane is a cell culture device of the processing diameter is 0.2 μηι or more and 10 μηι or less.
【청구항 5】 [Claim 5]
제 1항에서,  In claim 1,
상기 다공성막은 두께가 0.04 mm 이상 및 0.5 隱 이하인 것인， 현적 세포 배양 기기. The porous membrane has a thickness of 0.04 mm or more and 0.5 kPa or less, Modern cell culture instruments.
【청구항 6】 [Claim 6]
제 1항에서，  In paragraph 1,
상기 다공성막은 섬유상 입자가무작위 ( r andom)로 배열된 것인， 현적 세포 배양 기기.  The porous membrane is that the fibrous particles are arranged in a random (r andom), modern cell culture device.
【청구항 7】 [Claim 7]
제 1항에서，  In paragraph 1,
상기 친수성부는 직경이 0.5隱 이상 및 8隱 이하인 것인，  The hydrophilic portion is 0.5 것 인 or more and 8 隱 or less in diameter,
현적 세포 배양 기기.  Modern cell culture instruments.
【청구항 8】 [Claim 8]
제 1항에서，  In paragraph 1,
상기 친수성부에 현적된 액적의 세로길이는 0.5 匪 이상 및 7 mm 이하인 것인, " The longitudinal length of the droplets suspended in the hydrophilic portion is greater than 0.5 mm 3 and less than 7 mm, "
현적 세포 배양 기기.  Modern cell culture instruments.
【청구항 9] [Claim 9]
제 1항에서，  In paragraph 1,
상기 친수성부에 현적된 액적은 20° 이상 및 120° 이하의 접촉각을 갖는 것인， The droplets deposited on the hydrophilic portion have a contact angle of 20 ° or more and 120 ° or less,
현적 세포 배양 기기.  Modern cell culture instruments.
[청구항 10】 [Claim 10]
제 1항에서，  In paragraph 1,
상기 친수성부에 현적된 액적은 10 μ ΐ 이상 및 100 μ 1 이하의 부피를 갖는 것인，  The droplets suspended in the hydrophilic portion has a volume of 10 μl or more and 100 μ1 or less,
현적 세포 배양 기기. Modern cell culture instruments.
[청구항 11】 [Claim 11]
제 1항에서，  In paragraph 1,
상기 친수성부에 현적된 액적에서 배양된 세포는 3차원적 스페로이드이고, 직경 50 μ πι 이상 및 2000 p m 이하인 것인，  Cells cultured in the droplets suspended in the hydrophilic part is a three-dimensional spheroid, 50 μπι in diameter and more than 2000 pm,
현적 세포 배양 기기 .  Modern cell culture equipment.
【청구항 12] [Claim 12]
제 1항에서，  In paragraph 1,
상기 소수성부는 소수성 중합체로 코팅된 것인，  The hydrophobic portion is coated with a hydrophobic polymer,
현적 세포 배양 기기.  Modern cell culture instruments.
【청구항 13】 [Claim 13]
제 1항에서，  In paragraph 1,
상기 소수성 중합체는 왁스， 테플론, 포토레지스트， 실란계 화합물， 폴리테트라 플루오로에틸렌 (Polytetraf luoroethylene) , 왁스 (wax) , 폴리디메틸실록산 (Poly dimethyl s i loxane , PDMS) , 실리콘 (si 1 i cone)， 금속 나노입자， 금속 산화물 나노입자， 실리카 나노입자， 중합체 나노 입자 또는 이들의 조합인 것인，  The hydrophobic polymer may be a wax, a teflon, a photoresist, a silane compound, a polytetraf fluoroethylene, a wax, a polydimethylsiloxane, PDMS, silicone (si 1 i cone), Metal nanoparticles, metal oxide nanoparticles, silica nanoparticles, polymer nanoparticles or a combination thereof,
현적 세포 배양 기기.  Modern cell culture instruments.
【청구항 14] [Claim 14]
제 1항에서,  In claim 1,
상기 각각의 소수성부 간의 거리는 1 瞧 이상 및 9 mm 이하인 것인， 현적 세포 배양 기기.  The distance between each hydrophobic portion is greater than 1 mm 3 and less than 9 mm, cultivated cell culture device.
【청구항 15】 [Claim 15]
제 1항에서,  In claim 1,
상기 다공성막에 위치하는 채널을 더 포함하고，  Further comprising a channel located in the porous membrane,
상기 채널은 2 이상의 친수성부를 연결하는 것이고,  The channel connects two or more hydrophilic moieties,
상기 채널은 친수성부 사이의 상호작용이 가능하게 하는 것인, 현적 세포 배양 기기 . The channel allows for interaction between hydrophilic moieties, Modern cell culture equipment.
【청구항 16] [Claim 16]
제 15항에서,  The method of claim 15,
상기 채널의 너비는 0.1 mm 이상 및 2.5 mm 이하인 것인,  The width of the channel is 0.1 mm or more and 2.5 mm or less,
현적 세포 배양 기기.  Modern cell culture instruments.
【청구항 17] [Claim 17]
제 1항에서，  In paragraph 1,
상기 친수성부는 바이오 패시베이션 (bio-passivation)코팅층을 더 포함하는 것인，  The hydrophilic portion further comprises a bio-passivation coating layer,
현적 세포 배양 기기.  Modern cell culture instruments.
【청구항 18】 [Claim 18]
제 17항에서,  The method of claim 17,
상기 바이오 패시베이션 (bio-passivation)코팅층은 두께가 1 nm 이상 및 10 nm 이하인 것인，  The bio-passivation coating layer has a thickness of 1 nm or more and 10 nm or less,
현적 세포 배양 기기.  Modern cell culture instruments.
【청구항 19】 [Claim 19]
제 1항에서,  In claim 1,
상기 친수성부에서 액적이 현적되는 면은 타면에 비해 친수성도가 감소된 표면인 것인,  The surface of the droplet is suspended in the hydrophilic portion is a surface having a reduced hydrophilicity compared to the other surface,
현적 세포 배양 기기.  Modern cell culture instruments.
【청구항 20】 [Claim 20]
제 1항에서，  In paragraph 1,
상기 세포 배양액에 포함된 세포는 포유류 세포의 단일 세포계 (primary cell line), 무한 증식 세포계 (continuous cell line), 줄기 세포， 종양 세포， 면역 세포， 박테리아 및 미생물 중에서 선택된 어느 하나인 것인, The cells contained in the cell culture medium may be any one selected from a single cell line, a continuous cell line, a stem cell, a tumor cell, an immune cell, a bacteria and a microorganism of a mammalian cell. One,
현적 세포 배양 기기.  Modern cell culture instruments.
【청구항 21】 [Claim 21]
2 이상의 현적 세포 배양 단위체가 적층되고,  Two or more cultivated cell culture units are stacked,
상기 현적 세포 배양 단위체는  The conventional cell culture unit is
다공성막;  Porous membrane;
상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및  A hydrophobic part located in the porous membrane; And
상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고，  Includes; hydrophilic portion surrounded by the hydrophobic portion,
상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것이고，  Through the porous membrane it is possible to exchange the culture medium in the droplet formed in the hydrophilic portion and to inject foreign substances,
가장 아래에 위치하는 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지는 것인，  The droplets of the cell culture solution are suspended in the hydrophilic portion of the most cultivated cell culture unit, the cell culture is performed,
현적 세포 배양 기기.  Modern cell culture instruments.
【청구항 22】 [Claim 22]
제 21항에서,  The method of claim 21,
상기 1 이상의 현적 세포 배양 단위체는  The one or more cultivated cell culture units are
상기 다공성막에 위치한 채널을 더 포함하고，  Further comprising a channel located in the porous membrane,
상기 채널은 2 이상의 친수성부를 연결하는 것이고，  The channel connects two or more hydrophilic moieties,
상기 채널은 친수성부사이의 상호작용이 가능하게 하는 것인， 현적 세포 배양 기기.  Wherein said channel enables interaction between hydrophilic portions.
【청구항 23】 [Claim 23]
다공성막을 준비하는 단계 ;  Preparing a porous membrane;
상기 다공성막에 친수성부 및 소수성부를 형성하여 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계 ; 및  Preparing a cell culture unit by forming a hydrophilic part and a hydrophobic part on the porous membrane; And
상기 현적 세포 배양 단위체를 2 이상 적층하는 단계 ;를 포함하는 현적 세포 배양 기기 제조방법 . Stacking two or more of said cultivating cell culture unit; Method of manufacturing a cultivating cell culture device comprising a.
【청구항 24] [Claim 24]
제 23항에서，  In claim 23,
상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계는  Preparing the conventional cell culture unit is
상기 친수성부를 연결하는 채널을 형성하는 것을 포함하는  Forming a channel connecting the hydrophilic portion
현적 세포 배양 기기 제조방법 .  Method of manufacturing conventional cell culture apparatus.
【청구항 25】 [Claim 25]
제 23항에서,  The method of claim 23,
상기 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계는  Preparing the conventional cell culture unit is
친수성 다공성막에 소수성 물질을 인쇄하는 방식에  To print a hydrophobic material on a hydrophilic porous membrane
것인， Which
현적 세포 배양 기기 제조방법 .  Method of manufacturing conventional cell culture apparatus.
【청구항 26] [Claim 26]
제 23항에서，  In claim 23,
상기 현적 세포 배양 단위체를 2 이상 적층하는 단계;는  Stacking two or more of the cultivated cell culture units;
현적 세포 배양 단위체의 상층과 하층의 친수성부가 중첩되도록 접는 방식에 의하여 현적 세포 배양 단위체를 적층하는 것인，  To stack the cultivated cell culture unit by folding the hydrophilic portion of the upper and lower layers of the cultivated cell culture unit so as to overlap,
현적 세포 배양 기기 제조방법 .  Method of manufacturing conventional cell culture apparatus.
【청구항 27] [Claim 27]
제 23항에서，  In claim 23,
상기 다공성막에 친수성부 및 소수성부를 형성하여 현적 세포 배양 단위체를 제조하는 단계 ;이후에  Forming a hydrophilic portion and a hydrophobic portion in the porous membrane to prepare a cultivated cell culture unit;
상기 친수성부 표면처리 단계;  Surface treatment of the hydrophilic part;
를 더 포함하는  Containing more
현적 세포 배양 기기 제조방법 .  Method of manufacturing conventional cell culture apparatus.
【청구항 28] [Claim 28]
제 27항에서 상기 친수성부 표면처리 단계;는 In paragraph 27 Surface treatment step of the hydrophilic portion;
바이오 패시베이션 (bio-pass ivat ion) 처리하는 단계; 또는 자외선 조사하는 단계;를 포함하는 것인,  Bio-pass ivat ion treatment; Or ultraviolet irradiation;
현적 세포 배양 기기 제조방법 .  Method of manufacturing conventional cell culture apparatus.
【청구항 29] [Claim 29]
제 27항에서，  In paragraph 27,
상기 친수성부 표면처리 단계;는  Surface treatment step of the hydrophilic portion;
바이오 패시베이션 (bio-passivat ion) 처리하는 단계; 및  Bio-passivat ion treatment; And
자외선 조사하는 단계;를 포함하는 것인,  Irradiating ultraviolet rays; comprising;
현적 세포 배양 기기 제조방법 .  Method of manufacturing conventional cell culture apparatus.
【청구항 30】 [Claim 30]
현적 세포 배양 단위체로 구성된 현적 세포 배양 기기를 준비하는 단계；  Preparing a cultivated cell culture device consisting of cultivated cell culture units;
배양하려는 세포를 포함하는 세포 배양액을 친수성부에 적하하여 세포 배양액의 액적을 형성하는 단계;  Dropping the cell culture solution containing the cells to be cultured onto a hydrophilic part to form droplets of the cell culture solution;
세포 배양액이 적하된 현적 배양 기기를 뒤집어서 세포 배양액의 액적을 현적시키는 단계;  Inverting the dropwise culture medium onto which the cell culture solution has been loaded, thereby dropping the droplets of the cell culture solution;
세포 배양액의 액적이 현적된 상태로 세포를 배양하는 단계 ;를 포함하고，  Culturing the cells with the droplets of the cell culture being suspended;
상기 세포를 배양하는 단계 ;는  Culturing the cells;
다공성막을 통하여 배양액을 교환하는 단계를 더 포함하는 것이고， 상기 현적 세포 배양 단위체는  The method further comprises the step of exchanging the culture medium through the porous membrane, the culturing cell culture unit is
다공성막;  Porous membrane;
상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및  A hydrophobic part located in the porous membrane; And
상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고  And a hydrophilic portion surrounded by the hydrophobic portion.
상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것이고,  Through the porous membrane it is possible to exchange the culture medium in the droplet formed in the hydrophilic portion and to inject foreign substances,
가장 아래에 위치하는 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지는 것인， 현적 배양 방법 . Cells in the hydrophilic part of the lowest culturing cell culture unit Droplet of the culture solution is cultivated cell culture, the cultivation method.
【청구항 31】 [Claim 31]
제 30항에서,  The method of claim 30,
상기 세포 배양액이 적하된 현적 배양 기기를 뒤집어서 세포 배양액의 액적을 현적시키는 단계; 이후에  Inverting the suspension of the culture medium onto which the cell culture solution has been dropped, thereby suspending droplets of the cell culture solution; Since the
상기 다공성막을 통해 배양액을 추가하거나 제거하여 액적의 크기를 조절하는 단계를 더 포함하는 것인  It further comprises the step of adjusting the size of the droplets by adding or removing the culture medium through the porous membrane
현적 배양 방법 .  Cultivation method.
【청구항 32】 [Claim 32]
제 30항에서，  In paragraph 30,
상기 세포를 배양하는 단계 ;는  Culturing the cells;
다공성막을 통하여 외부 물질을 투입하는 단계;를 더 포함하는 것인, 현적 배양 방법 .  Injecting an external material through the porous membrane; It further comprises, Hyunsik culture method.
【청구항 33] [Claim 33]
제 30항에서，  In paragraph 30,
상기 현적 세포 배양 기기는 채널을 포함하는 것이고，  The conventional cell culture device comprises a channel,
상기 채널은 2 이상의 친수성부를 연결하는 것이고，  The channel connects two or more hydrophilic moieties,
상기 채널은 친수성부사이의 상호작용이 가능하게 하는 것이고， 상기 세포 배양액의 액적을 형성하는 단계;는  The channel is to enable the interaction between the hydrophilic portion, and forming a droplet of the cell culture;
1종 이상 세포 배양액을 채널로 연결된 각각의 친수성부에 적하하여 세포 배양액의 액적을 형성하는 것이고，  One or more cell culture fluids are dropped in each of the hydrophilic portions connected to the channel to form droplets of the cell culture fluids,
상기 세포를 배양하는 단계 ;는  Culturing the cells;
세포 배양액의 액적이 현적된 상태로 채널을 통해 각각의 세포 스페로이드 간의 상호 작용이 이루어지며 세포를 배양하는 것인,  In the state in which the droplets of the cell culture are suspended, the interaction between the respective cell spheroids is made through the channel, and the cells are cultured.
현적 배양 방법 . Cultivation method.
【청구항 34】 [Claim 34]
복수의 현적 세포 배양 단위체를 포함하는 배양 시트;  A culture sheet comprising a plurality of modern cell culture units;
상기 배양 시트를 이동시키는 구동모터 ;  A drive motor for moving the culture sheet;
상기 배양 시트 상부에 위치하며， 상기 현적 세포 배양 단위체의 친수성부에 세포 배양액을 적하하는 세포 배양액 투입장치;  A cell culture solution injector disposed above the culture sheet, and dropping the cell culture solution into a hydrophilic part of the hanging cell culture unit;
를 포함하고，  Including
상기 각각의 현적 세포 배양 단위체는,  Each of the conventional cell culture units,
다공성막;  Porous membrane;
상기 다공성막에 위치하는 소수성부; 및  A hydrophobic part located in the porous membrane; And
상기 소수성부로 둘러싸인 친수성부;를 포함하고，  Includes; hydrophilic portion surrounded by the hydrophobic portion,
상기 친수성부에서 세포 배양액의 액적이 현적되어 세포 배양이 이루어지고，  The droplets of the cell culture solution is suspended in the hydrophilic portion to perform cell culture,
상기 다공성막을 통해 상기 친수성부에 형성된 액적 내 배양액의 교환 및 외부 물질 주입이 가능한 것인，  It is possible to exchange the culture medium in the droplet formed in the hydrophilic portion and the foreign material injection through the porous membrane,
현적 세포 배양자동화 장치 .  Automated Cell Culture Automation System.
【청구항 35】 [Claim 35]
제 34항에 있어서，  The method of claim 34,
상기 배양 시트는 컨베이어 벨트 구조이며，  The culture sheet has a conveyor belt structure,
상하부로 체인 형태의 이동을 하는 것인，  To move in the form of a chain up and down ，
현적 세포 배양자동화 장치 .  Automated Cell Culture Automation System.
【청구항 36】 [Claim 36]
제 35항에 있어서，  The method of claim 35,
상기 배양 시트가 컨베이어 벨트 구조의 상부로 이동시，  When the culture sheet is moved to the top of the conveyor belt structure,
상기 세포 배양액 투입장치로부터, 세포 배양액이 상기 배양 단위체의 친수성부에 적하되어 액적을 형성하는 것인，  From the cell culture solution input device, the cell culture solution is dropped into the hydrophilic portion of the culture unit to form droplets,
현적 세포 배양 자동화 장치 .  Automatic cell culture automation equipment.
【청구항 37】 제 35항에 있어서, [Claim 37] The method of claim 35, wherein
상기 배양 시트가 컨베이어 벨트 구조의 하부로 이동시 ,  When the culture sheet is moved to the bottom of the conveyor belt structure,
상기 배양 단위체의 친수성부에 형성된 액적이 중력에 의해 현적되는 것인，  The droplet formed in the hydrophilic part of the culture unit is suspended by gravity,
현적 세포 배양 자동화 장치 .  Automatic cell culture automation equipment.
【청구항 38】 [Claim 38]
제 36항에 있어서，  The method of claim 36,
상기 현적된 액적이 다시 상부 컨베이어 벨트 구조로 이동될 때， 시약을 상기 액적으로 투입하는것인，  When the suspended droplets are moved back to the upper conveyor belt structure, to introduce a reagent into the droplets,
현적 세포 배양 자동화 장치 .  Automatic cell culture automation equipment.
【청구항 39】 [Claim 39]
- 제 38항에 있어서，  -According to claim 38,
상기 시'약이 투입된 액적이 다시 하부 컨베이어 벨트 구조로 이동될 때， 상기 액적 내부의 세포 분석이 이루어지는 것인， When moved to the city "around the droplets are injected back bottom conveyor belt structure, would the cell analysis within the droplets formed,
현적 세포 배양 자동화 장치 .  Automatic cell culture automation equipment.
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