WO2018056527A1 - Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법 - Google Patents

Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2018056527A1
WO2018056527A1 PCT/KR2017/000200 KR2017000200W WO2018056527A1 WO 2018056527 A1 WO2018056527 A1 WO 2018056527A1 KR 2017000200 W KR2017000200 W KR 2017000200W WO 2018056527 A1 WO2018056527 A1 WO 2018056527A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell line
current
stably expressing
test substance
line stably
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/000200
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
최진성
최정희
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Publication of WO2018056527A1 publication Critical patent/WO2018056527A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0687—Renal stem cells; Renal progenitors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention provides a cell line stably expressing Nav1.5 (Homo sapiens sodium channel, voltage-gated, type V, alpha subunit (SCN5A), transcript variant 1), which is a sodium channel expressed in human heart muscle, and a method for drug screening using the same It is about.
  • Nav1.5 Homo sapiens sodium channel, voltage-gated, type V, alpha subunit (SCN5A), transcript variant 1
  • Cardiovascular disease-causing drugs account for a large portion of the evacuation drugs compiled in the last 15 years, and the need for safety pharmacological studies on the cardiovascular system has been raised.
  • the final competitiveness of most drugs discovered by new drug development depends on the 'safety' in humans.
  • many drugs have side effects such as ventricular repolarization and arrhythmia.
  • cardiac toxicity is a very important safety factor. Therefore, in the non-clinical phase of drug development, the safety of humans is predicted in advance through animal experiments. It may be different from the safety, so recently, the stability is measured by using a cell line expressing the main protein of human rather than the experimental animal.
  • the suppression of Nav1.5 current by new drugs may cause side effects such as acute heart attack. Therefore, the degree of suppression of current should be measured.
  • the current When the current is small, it may be caused by experimental error such as leak current or noise.
  • the lower the signal-to-noise (S / N) ratio the less reliable the measurement. Therefore, if the experimental machine does not exceed the maximum effective range that can be measured, the larger the current produced in the cell line, the higher the S / N ratio, and thus the more reliable experimental value can be obtained. Large enough cell lines are not being developed.
  • An object of the present invention is to provide a cell line stably expressing Nav1.5.
  • Another object of the present invention to provide a cardiotoxicity measurement method comprising the step of measuring the Nav1.5 current magnitude in the cell line.
  • Another object of the present invention to provide a cardiotoxic inhibitor screening method comprising the step of measuring the Nav1.5 current magnitude in the cell line.
  • the present invention provides a cell line stably expressing Nav1.5 in which the SCN5A gene (NCBI accession no. NM_198056) and the puromycin selection marker gene encoding human voltage-dependent sodium channel Nav1.5 are inserted in the chromosome of a host cell. To provide.
  • the present invention (1) contacting the test substance to the cell line; And (2) provides a method for measuring the cardiotoxicity of the test substance comprising the step of measuring the Nav1.5 current in the cell line in contact with the test substance.
  • the present invention (1) contacting the test substance to the cell line; (2) measuring the Nav1.5 current magnitude in the cell line in contact with the test substance; And (3) provides a cardiotoxicity screening method comprising the step of selecting a test substance with an increased Nav1.5 current size compared to the control sample.
  • the present invention relates to a cell line stably expressing Nav1.5 and a drug screening method using the same.
  • the present inventors have found that the human embryonic kidney, hNav1.5 (human Nav1.5), a sodium channel mainly expressed in human cardiomyocytes A new cell line was developed that was stably expressed in 293 (HEK293) cells, enabling the measurement of drug toxicity using automated electrophysiological devices as well as traditional electrophysiological techniques. Therefore, the cell line of the present invention can be very useful for screening the cardiotoxicity of pharmaceutical products.
  • Figure 3 shows the results of inhibition of hNav1.5 current by lidocaine (Lidocaine) at a holding potential (HP) of -120 mV and -90 mV.
  • the present invention provides a cell line stably expressing Nav1.5 in which the SCN5A gene (NCBI accession no. NM_198056) and the puromycin selection marker gene encoding human voltage-dependent sodium channel Nav1.5 are inserted in the chromosome of a host cell. To provide.
  • the cell line stably expressing Nav1.5 may be accession number KCTC 13095BP, but is not limited thereto.
  • the cell line stably expressing Nav1.5 may have a current range of 5.5 to 19.6 nA, and more preferably, may have an average amount of current of 8.8 ⁇ 0.8 nA, but is not limited thereto.
  • the host cell may be human embryonic kidney 293 (HEK293), but is not limited thereto.
  • the "SCN5A gene encoding human voltage-dependent sodium channel Nav1.5" used in the present invention corresponds to transcript variant 1 (Q1077; NM_198056) among a total of six SCN5A transcript variants, with no mutations translated into 1406 amino acids. It is the longest variant (mRNA Refseq: NM_198056.1, Protein Refseq: NP_932173).
  • the present invention (1) contacting the test substance to the cell line; And (2) provides a method for measuring the cardiotoxicity of the test substance comprising the step of measuring the Nav1.5 current in the cell line in contact with the test substance.
  • the present invention (1) contacting the test substance to the cell line; (2) measuring the Nav1.5 current magnitude in the cell line in contact with the test substance; And (3) provides a cardiotoxic inhibitor screening method comprising the step of selecting a test substance with an increased Nav1.5 current size compared to the control sample.
  • test material refers to an unknown candidate material used in screening to examine whether it affects the Nav1.5 current magnitude of the cell line of the present invention.
  • the sample includes, but is not limited to, compounds, nucleotides, antisense-RNAs, small interference RNAs (siRNAs), and natural product extracts.
  • a plasmid containing its gene SCN5A (transcript variant 1; Q1077; NM_198056) was obtained from OriGene Technologies, Inc. After amplification by PCR, the amplified gene was subcloned into pSF-CMV-puro vector (sigma), transfected into HEK293 cells, and selected for 3 weeks with puromycin. SCN5A stable cell lines were induced. Among the cell lines stably expressing Nav1.5 currents, electrophysiological methods were used to screen cell lines, such as hNav1.5 currents, in which the biophysical characteristics of Nav1.5 currents were transiently expressed.
  • hNav1.5 currents were measured using manual patch-clamp recording and automatic patch-clamp recording using Axopatch 200B from Molecular Devices and Patchliner Octo from Nanion, respectively.
  • the composition of the extracellular fluid (mM) was 140 NaCl, 3 KCl, 1 CaCl 2 , 1 MgCl 2 , 10 HEPES (pH 7.3, NaOH)
  • the composition of the intracellular solution (mM) was 140 CsF, 1 EGTA, 10 NaCl , 10 HEPES (pH 7.3, CsOH).
  • hNav1.5 current was recorded by attaching to the cell by the whole-cell configuration technique.
  • hNav1.5 currents were stored on a computer using the Digidata 1440A interface and recorded and analyzed using pClamp 10.5 software.
  • pClamp 10.5 software In order to minimize the distortion of the recorded hNav1.5 current, only cells with a series resistance of 1.5 M ⁇ or less were used in the whole-cell configuration. If the current was more than 5 nA, it was compensated by 80% compensation. Initiation of current recording was performed 5 minutes after the whole-cell configuration was established to obtain a stable current. The liquid junction potential was not corrected.
  • the perfusion pencil was used to continuously record the extracellular fluid or extracellular fluid including various concentrations of lidocaine (Lidocaine).
  • the voltage-dependent activation curve (Fig. 2, left axis) was calculated using the reversal potential obtained from the current-voltage curve, and the conductance (G) was divided by the maximum value and optimized according to the Boltzmann distribution equation below.
  • V 50 represents a voltage of 50% of the maximum value
  • V 50 of the Nav1.5 current was -47.15 ⁇ 0.59 mV.
  • the steady-state voltage-dependent deactivation curve (Figure 2, right axis) increases every 10 seconds from -180 mv to -10 mV in 10 mV increments every 10 seconds for 500 ms at a holding potential of -120 mV and then stimulates for 40 ms at -10 mV.
  • the resulting current was divided by the maximum value and optimized according to the Boltzmann distribution equation below.
  • V 50 indicates the voltage to be 50% of the maximum value V 50 of the steady-state voltage dependence curve of the disabled hNav1.5 current was -92.80 ⁇ 4.53 mV.
  • hNav1.5 current inhibition by Lidocaine was 775.64 ⁇ 37.10 ⁇ M at -120 mV ( Figure 3, bottom left),- 18.42 ⁇ 2.60 ⁇ M at 90 mV (FIG. 3, bottom right).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 사람의 심장근세포에서 주로 발현하고 있는 나트륨 통로인 hNav1.5 (human Nav1.5)를 human embryonic kidney 293 (HEK293)세포에 안정적으로 발현시켜 전통적인 전기생리학적 기법뿐만 아니라 자동화된 전기생리학적 기기를 사용하여 의약품의 독성을 측정 할 수 있도록 만든 새로운 세포주를 개발하였다. 따라서, 본 발명의 세포주는 의약품의 심장독성을 스크리닝하는데 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 20.01.2017]　NAV1.5를 안정적으로 발현하는 세포주 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법
본 발명은 사람의 심장근에서 발현되는 나트륨 통로인 Nav1.5(Homo sapiens sodium channel, voltage-gated, type V, alpha subunit (SCN5A), transcript variant 1)를 안정적으로 발현하는 세포주 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
최근 15년간 집계된 퇴출의약품 가운데 심혈관계 질환을 유발시키는 의약품들이 많은 부분을 차지하고 있는 것으로 조사되어 심혈관계에 대한 안전성약리시험의 필요성이 제기되고 있다. 신약개발로 발굴된 대부분 약물들의 최종 경쟁력은 사람에게서의 '안전성'에 달려있는데, 현재 많은 약물에서 심실 재분극 및 부정맥 등의 부작용이 발견되고 있다. 특히 급성독성으로서 심장 독성은 매우 중요한 안전성 인자이므로 신약개발 과정 중 비임상단계에서 동물실험을 통해 사람에서의 안전성을 미리 예측하고 있으나, 이러한 동물을 이용한 독성실험은 동물실험의 윤리적 문제를 고려해야 하고 사람에 대한 안전성과는 다를 수 있어 최근에는 실험 동물보다는 사람의 주요 단백질을 발현시킨 세포주를 사용하여 안정성을 측정하고 있다.
약물 개발에 있어서 신약에 의한 Nav1.5 전류의 억제는 급성 심장마비와 같은 부작용을 야기할 수 있으므로 전류의 억제 정도를 측정하여야 하는데, 전류의 크기가 작을 경우 leak current나 노이즈와 같은 실험적 오차에 의해 signal-to-noise (S/N)의 비율이 낮아져 측정치의 신뢰도가 낮아지게 된다. 따라서 실험 기계가 측정할 수 있는 최대 유효 범위를 넘어가지 않는다면, 세포주에서 생산되는 전류의 크기가 클수록 S/N 비율이 높아져 더욱 신뢰할 수 있는 실험치를 얻을 수 있는데, 아직까지는 Nav1.5의 전류 크기가 충분히 큰 세포주는 개발되지 않고 있다.
본 발명의 목적은 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포주에서 Nav1.5 전류 크기를 측정하는 단계를 포함하는 심장독성 측정 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포주에서 Nav1.5 전류 크기를 측정하는 단계를 포함하는 심장독성 억제제 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 인간 전압의존성 나트륨 통로 Nav1.5를 코딩하는 SCN5A 유전자(NCBI accession no. NM_198056) 및 퓨로마이신(puromycin) 선별 마커 유전자가 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 있는 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 상기 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 (2) 상기 시험물질을 접촉한 세포주에서 Nav1.5 전류 크기를 측정하는 단계를 포함하는 시험물질의 심장독성 측정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 상기 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 세포주에서 Nav1.5 전류 크기를 측정하는 단계; 및 (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 Nav1.5 전류 크기가 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 심장독성 억제제 스크리닝 방법를 제공한다.
본 발명은 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 사람의 심장근세포에서 주로 발현하고 있는 나트륨 통로인 hNav1.5 (human Nav1.5)를 human embryonic kidney 293 (HEK293)세포에 안정적으로 발현시켜 전통적인 전기생리학적 기법뿐만 아니라 자동화된 전기생리학적 기기를 사용하여 의약품의 독성을 측정 할 수 있도록 만든 새로운 세포주를 개발하였다. 따라서, 본 발명의 세포주는 의약품의 심장독성을 스크리닝하는데 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 hNav1.5 전류와 전류-전압 곡선을 나타낸다.
도 2는 전압의존성 활성화 곡선 및 안정상태의 전압의존성 비활성화 곡선을 나타낸다.
도 3은 -120 mV와 -90 mV의 holding potential(HP)에서 리도카인(Lidocaine)에 의한 hNav1.5 전류의 억제 결과를 나타낸다.
본 발명은 인간 전압의존성 나트륨 통로 Nav1.5를 코딩하는 SCN5A 유전자(NCBI accession no. NM_198056) 및 퓨로마이신(puromycin) 선별 마커 유전자가 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 있는 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주를 제공한다.
바람직하게는, 상기 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주는 수탁번호 KCTC 13095BP일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주는 전류 크기가 5.5 내지 19.6 nA 범위일 수 있고, 보다 바람직하게는, 8.8±0.8 nA의 평균 전류량을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 숙주세포는 인간배아신장유래세포 293(human embryonic kidney 293; HEK293)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용한 "인간 전압의존성 나트륨 통로 Nav1.5를 코딩하는 SCN5A 유전자"는 총 6개의 SCN5A transcript variant 중에서 transcript variant 1(Q1077; NM_198056)에 해당하는 것으로서, 1406개의 아미노산으로 번역되는 돌연변이가 일어나지 않은 가장 긴 형태의 variant이다(mRNA Refseq : NM_198056.1, Protein Refseq : NP_932173).
또한, 본 발명은 (1) 상기 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 (2) 상기 시험물질을 접촉한 세포주에서 Nav1.5 전류 크기를 측정하는 단계를 포함하는 시험물질의 심장독성 측정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 상기 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 세포주에서 Nav1.5 전류 크기를 측정하는 단계; 및 (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 Nav1.5 전류 크기가 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 심장독성 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 본 발명 세포주의 Nav1.5 전류 크기에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화합물, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예> Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주 제작
1. Stable cell line 제작
사람의 전압의존성 나트륨 통로 Nav1.5(hNav1.5)를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주를 만들기 위해 그 유전자인 SCN5A(transcript variant 1; Q1077; NM_198056)를 포함하고 있는 플라스미드(plasmid)를 OriGene Technologies, Inc.으로부터 구입하여 PCR로 증폭하였고, 증폭된 유전자를 pSF-CMV-puro vector (sigma)에 subcloning한 후 HEK293 세포에 형질감염(transfection)하여 퓨로마이신(puromycin)으로 3주간 selection하며 단일세포로부터 유래한 SCN5A stable 세포주를 유도하였다. Nav1.5 전류를 안정적으로 발현하는 세포주들 중 전기생리학적인 방법을 사용하여 Nav1.5 전류의 생물리학적 특징이 일시적으로 발현시킨 hNav1.5 전류와 같은 세포주를 스크리닝(screening) 하여 확립하였다.
2. 전기생리학
hNav1.5 전류의 전기생리학적 분석을 위해 Molecular Devices사의 Axopatch 200B와 Nanion사의 Patchliner Octo를 이용하여 각각 수동식 patch-clamp 기록법과 자동식 patch-clamp 기록법으로 전류를 측정하였다. 이때 사용한 세포 외액의 조성(mM)은 140 NaCl, 3 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES (pH 7.3, NaOH)이었고, 세포내액의 조성(mM)은 140 CsF, 1 EGTA, 10 NaCl, 10 HEPES (pH 7.3, CsOH)이었다.
(1) 수동식 patch-clamp 기록
수평형 microlectrode puller를 사용하여 세포내액을 넣었을 때 저항 값이 0.7-1.5 MΩ인 유리전극을 만들어 whole-cell configuration 기법으로 세포에 부착하여 hNav1.5 전류를 기록하였다. hNav1.5 전류는 Digidata 1440A interface를 사용하여 컴퓨터에 저장하였고 pClamp 10.5 software를 사용하여 기록 및 분석하였다. 기록되는 hNav1.5 전류의 왜곡을 최소화하기 위해 whole-cell configuration시 직렬저항이 1.5 MΩ 이하인 세포만을 사용하였고, 만약 전류가 5 nA 이상인 경우에는 80% compensation을 하여 보정하였다. 전류 기록의 시작은 안정된 전류를 얻기 위해 whole-cell configuration을 만든 후 5분 후에 진행하였으며, liquid junction potential은 교정하지 않았다. 리도카인(Lidocaine)의 약리학적 효과를 검증하기 위해 perfusion pencil을 이용하여 세포외액이나 다양한 농도의 리도카인(Lidocaine)을 포함한 세포외액을 지속적으로 관류하며 기록하였다.
(2) 자동식 patch-clamp 기록
두 개의 EPC 10 quadro patch-clamp amplifier를 사용하는 NPC-16 Patchliner Octo platform (Nanion Technologies GmbH)에 낮은 저항(1.5-2.0 MΩ)을 갖는 NPC®-16 chip을 사용하여 세포로부터 hNav1.5 전류를 기록 및 저장하였다. 전류의 기록은 PatchControlHT software를 사용하여 자동으로 기록하게 하였고, 기록된 전류는 Patchmaster software를 이용하여 분석하였다.
3. hNav1.5 전류의 생물리학적 특성
먼저 hNav1.5 전류의 생물리학적 특성을 정확히 확인하기 위해 수동식 patch-clamp 기록법을 사용하였다. 세포가 만들어 낼 수 있는 최대 전류량을 측정하기 위해 holding potential을 -120 mV로 사용하고 매 10 초마다 40 ms동안 -90 mV에서부터 +40 mV까지 5 mV의 간격으로 탈분극시켜 자극 후 세포에서 발생하는 전류를 기록하였다(도 1). 측정된 모든 세포(n=12)에서 최소 5.5 nA에서 최대 19.6 nA까지 전류가 발생하였으며 평균전류량은 8.8 ± 0.8 nA이었다. 세포의 크기에 따른 전류량의 차이를 없애기 위해 측정된 전류의 양을 세포의 단위면적(세포의 capacitance)으로 나누어 전류밀도를 측정하였다. 전류밀도는 최소 319 pA/pF부터 최대 921 pA/pF로 나타났으며 평균 전류밀도가 556 ± 45 pA/pF이었다. 각 전압에서의 전류량을 알아보기 위해 전류-전압 곡선(도 1, 오른쪽)을 그려보면 최대 전류는 -30 mV에서 나타나고 reversal potential은 +57.7 mV로 나트륨 전류의 평형전위와 비슷하게 나타났다.
전압의존성 활성화 곡선(도 2, 왼쪽 축)은 전류-전압 곡선으로부터 구한 reversal potential을 사용하여 conductance (G)를 구한 후 최댓값으로 나누어 아래의 Boltzmann distribution식에 따라 최적화하였다.
Figure PCTKR2017000200-appb-I000001
이때 V50은 최댓값의 50%가 되는 전압을 나타내며 Nav1.5 전류의 V50은 -47.15 ± 0.59 mV이었다.
안정상태의 전압의존성 비활성화 곡선(도 2, 오른쪽 축)은 -120 mV의 holding potential에서 500 ms 동안 -180 mv부터 -10 mV까지 10 mV씩 10초마다 증가시킨 후 -10 mV에서 40 ms 동안 자극시켜 나오는 전류를 최댓값으로 나누어 아래의 Boltzmann distribution식에 따라 최적화하였다.
Figure PCTKR2017000200-appb-I000002
이때 V50은 최댓값의 50%가 되는 전압을 나타내며 hNav1.5 전류의 안정상태의 전압의존성 비활성화 곡선에서의 V50은 -92.80 ± 4.53 mV 이었다.
리도카인(Lidocaine)에 의한 hNav1.5 전류의 억제를 측정하기 위하여 hNav1.5 전류가 비활성화되지 않는 -120 mV의 holding potential (도 3, 왼쪽 위)과 심장근의 안정막전위와 비슷한 -90 mV의 holding potential (도 3, 오른쪽 위)로부터 -20 mV로 매 5초마다 40 ms동안 탈분극시켜 hNav1.5 전류를 기록하며 여러 가지 농도의 리도카인(Lidocaine)을 흘려 넣어 전류의 최고점이 억제되는 정도를 측정하였다. 억제된 전류의 크기를 Hill 방정식으로 최적화 후 50% 억제되는 농도를 계산한 결과 리도카인(Lidocaine)에 의한 hNav1.5 전류 억제는 -120 mV에서 775.64 ± 37.10 μM(도 3, 왼쪽 아래)이었고, -90 mV에서 18.42 ± 2.60 μM(도 3, 오른쪽 아래)이었다.
Figure PCTKR2017000200-appb-I000003

Claims (7)

  1. 인간 전압의존성 나트륨 통로 Nav1.5를 코딩하는 SCN5A 유전자(NCBI accession no. NM_198056) 및 퓨로마이신(puromycin) 선별 마커 유전자가 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 있는 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주는 수탁번호 KCTC 13095BP인 것을 특징으로 하는 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주는 전류 크기가 5.5 내지 19.6 nA 범위인 것을 특징으로 하는 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주.
  4. 제3항에 있어서, 상기 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주는 8.8±0.8 nA의 평균 전류량을 갖는 것을 특징으로 하는 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 인간배아신장유래세포 293(human embryonic kidney 293; HEK293)인 것을 특징으로 하는 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주.
  6. (1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
    (2) 상기 시험물질을 접촉한 세포주에서 Nav1.5 전류 크기를 측정하는 단계를 포함하는 시험물질의 심장독성 측정 방법.
  7. (1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 세포주에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (2) 상기 시험물질을 접촉한 세포주에서 Nav1.5 전류 크기를 측정하는 단계; 및
    (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 Nav1.5 전류 크기가 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 심장독성 억제제 스크리닝 방법.
PCT/KR2017/000200 2016-09-22 2017-01-06 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법 WO2018056527A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160121472A KR101857523B1 (ko) 2016-09-22 2016-09-22 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법
KR10-2016-0121472 2016-09-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018056527A1 true WO2018056527A1 (ko) 2018-03-29

Family

ID=61617508

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2017/000200 WO2018056527A1 (ko) 2016-09-22 2017-01-06 Nav1.5를 안정적으로 발현하는 세포주 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법

Country Status (3)

Country Link
US (1) US10481148B2 (ko)
KR (1) KR101857523B1 (ko)
WO (1) WO2018056527A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003080570A2 (en) * 2002-03-20 2003-10-02 Transmolecular, Inc. Recombinant expression vectors for functional nav1.9 sodium channels
US20110312533A1 (en) * 2009-02-02 2011-12-22 Chromocell Corporation CELL LINES EXPRESSING NaV AND METHODS OF USING THEM
WO2016026732A1 (en) * 2014-08-21 2016-02-25 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Method and kit for assessment of sodium channel-related anti- or pro-arrhythmic potential of compounds

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60326267D1 (de) * 2002-08-02 2009-04-02 Wisconsin Alumni Res Found Natriumkanal-alpha-untereinheitsvarianten
US7087374B2 (en) * 2003-06-26 2006-08-08 The Research Foundation Of State University Of New York Screen for sodium channel modulators
CA2745371C (en) 2008-12-22 2016-01-05 Universite Laval Methods, reagents and kits for the identification of modulators of voltage-gated sodium channels

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003080570A2 (en) * 2002-03-20 2003-10-02 Transmolecular, Inc. Recombinant expression vectors for functional nav1.9 sodium channels
US20110312533A1 (en) * 2009-02-02 2011-12-22 Chromocell Corporation CELL LINES EXPRESSING NaV AND METHODS OF USING THEM
WO2016026732A1 (en) * 2014-08-21 2016-02-25 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Method and kit for assessment of sodium channel-related anti- or pro-arrhythmic potential of compounds

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ERDEMLI: "Cardiac safety implications of hNavl.5 blockade and a framework for pre-clinical evaluation", FRONTIERS IN PHARMACOLOGY, vol. 3, no. 6, 26 January 2012 (2012-01-26), pages 1 - 9, XP055603627, ISSN: 1663-9812, DOI: 10.3389/fphar.2012.00006 *
ROOK: "Biology of cardiac sodium channel Navl.5 expression", CARDIOVASCULAR RESEARCH, 2012, pages 12 - 23, XP055130908, DOI: doi:10.1093/cvr/cvr252 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20180080924A1 (en) 2018-03-22
KR101857523B1 (ko) 2018-05-14
KR20180032362A (ko) 2018-03-30
US10481148B2 (en) 2019-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. SWELL1 is a regulator of adipocyte size, insulin signalling and glucose homeostasis
Mejhert et al. Partitioning of MLX-family transcription factors to lipid droplets regulates metabolic gene expression
Wang et al. Mitochondria-localised ZNFX1 functions as a dsRNA sensor to initiate antiviral responses through MAVS
Benninger et al. The physiological role of β-cell heterogeneity in pancreatic islet function
Liu et al. Nuclear-resident RIG-I senses viral replication inducing antiviral immunity
Ficker et al. Novel characteristics of a misprocessed mutant HERG channel linked to hereditary long QT syndrome
Bao et al. Mechanism of regulation of the gap junction protein connexin 43 by protein kinase C-mediated phosphorylation
Orthmann-Murphy et al. Two distinct heterotypic channels mediate gap junction coupling between astrocyte and oligodendrocyte connexins
Illek et al. Defective function of the cystic fibrosis-causing missense mutation G551D is recovered by genistein
Onohara et al. TRPC3 and TRPC6 are essential for angiotensin II‐induced cardiac hypertrophy
Sepulveda et al. Differential roles of NMDA receptor subtypes NR2A and NR2B in dendritic branch development and requirement of RasGRF1
Wang et al. Exome sequencing reveals mutation in GJA1 as a cause of keratoderma-hypotrichosis-leukonychia totalis syndrome
Liang et al. Severe neuropathy with leaky connexin32 hemichannels
Barbuti et al. A caveolin-binding domain in the HCN4 channels mediates functional interaction with caveolin proteins
O'Grady et al. Chloride and potassium channel function in alveolar epithelial cells
Ren et al. HTLV-1 Tax deregulates autophagy by recruiting autophagic molecules into lipid raft microdomains
Lin et al. Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control
Jin et al. PAQR10 and PAQR11 mediate Ras signaling in the Golgi apparatus
Hong et al. Cch1 restores intracellular Ca2+ in fungal cells during endoplasmic reticulum stress
Baines et al. Oxygen‐evoked Na+ transport in rat fetal distal lung epithelial cells
Béziau et al. Complex Brugada syndrome inheritance in a family harbouring compound SCN5A and CACNA1C mutations
Watanabe Gap junction in the teleost fish lineage: duplicated connexins may contribute to skin pattern formation and body shape determination
Choi et al. Oxidant‐resistant LRRC8A/C anion channels support superoxide production by NADPH oxidase 1
You et al. Two novel Brugada syndrome-associated mutations increase KV4. 3 membrane expression and function
Mo et al. Glycoprotein E of varicella-zoster virus enhances cell-cell contact in polarized epithelial cells

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17853241

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17853241

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1