WO2018054944A1 - Microscope illumination assembly for structured illumination - Google Patents

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WO2018054944A1
WO2018054944A1 PCT/EP2017/073729 EP2017073729W WO2018054944A1 WO 2018054944 A1 WO2018054944 A1 WO 2018054944A1 EP 2017073729 W EP2017073729 W EP 2017073729W WO 2018054944 A1 WO2018054944 A1 WO 2018054944A1
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WO
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microscope
rotation
angular positions
illumination
aperture wheel
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Application number
PCT/EP2017/073729
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German (de)
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Inventor
Christian Schumann
Cornell Peter Gonschior
Albrecht Weiss
Original Assignee
Leica Microsystems Cms Gmbh
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    • G02B7/00—Mountings, adjusting means, or light-tight connections, for optical elements
    • G02B7/006—Filter holders

Definitions

  • the invention relates to a microscope, an aperture wheel and a microscopy method according to the preambles of the independent claims.
  • US Pat. No. 6,376,818 B1 discloses a method which comprises generating a contrast-enhanced result image from a plurality of digital images superimposed with a periodic pattern in different phase positions.
  • the method includes the steps of illuminating an object with a light source and thereby projecting a substantially periodic pattern onto the object. After taking a first image, the phase of the pattern is changed and a second image of the object is taken. This is repeated at least once more. The recorded pictures will be charged in pairs. In this way, the periodic pattern can be computationally removed and a focused, i. be obtained by light from emitters outside the focal plane largely uninfluenced digital image.
  • the periodic pattern is generated according to US 6,376,818 B1 by using a suitable illumination mask which can be shifted to obtain the different phase positions.
  • a specific mechanical design is not disclosed in US Pat. No. 6,376,818 B1.
  • US 6,819,415 B2 and US 7,335,866 B2 disclose alternative methods of calculation.
  • US Pat. No. 6,819,415 B2 discloses a technical embodiment in which the different grating phases are produced by tilting a plane-parallel, structured plate in the illumination beam path in the plane of the field diaphragm. The structured plate is thereby tilted about an axis which is perpendicular to the optical axis of the illumination beam path.
  • No. 8,089,691 B2 discloses a combined illumination and detection system as an external module for a microscope.
  • US 8,089,691 B2 it is proposed to move a grid positioned in the field diaphragm plane of the microscope laterally with the aid of a piezoelectric actuator.
  • the invention is used in a microscope with a wide-field incident light unit defining a reflected-light illumination beam path with an optical axis, with a digital image recording unit and with a control unit in which a field diaphragm is introduced into the illumination beam path, which is based on a position specification of Control unit by means of a drive by rotating about an axis parallel to the optical axis axis of rotation in different angular positions positionable aperture wheel is formed.
  • a wide-field illumination unit thus differs from a scanning or scanning illumination unit by the planar (but, as explained below, possibly structured) illumination of an object in contrast to a punctiform illumination.
  • the field diaphragm in known wide-field incident light illumination devices for fluorescence excitation is often designed as a disk with different apertures, as also explained below with reference to FIG.
  • the aperture wheel is arranged in a field diaphragm plane and can thus be imaged into the specimen.
  • the appropriate drive for example a stepper motor or a DC motor with encoder, can be used
  • Aperture opening can be positioned in the illuminated field diaphragm plane in the illumination beam path.
  • a structural diaphragm in defined different positions or different structural diaphragms are positioned in the illumination beam path, to which the stepping motor is also used. This is possibly adjusted to achieve the required positioning accuracy or specifically controlled.
  • An essential advantage of the present invention is that the realization of the illumination grating or illumination pattern and the positioning for generating different phase positions is represented by the means which directly brings such a generic microscope, in particular a fluorescence microscope, with it. It is therefore possible to dispense with additional structures, diaphragms, drives and corresponding additional drive means.
  • the present invention provides that the aperture wheel carries one or more structural apertures which are designed and arranged on the aperture wheel or by their illumination by means of a light source of the wide-field incident light unit at two or more of the different angular positions by rotation or translation At least partially interconvertible illumination pattern can be generated in an object plane of the microscope.
  • the illumination patterns are "interconvertible by rotation” when a rotation of both patterns relative to one another about a common pivot point, which may also be outside the pattern, transforms the illumination patterns into one another or images them onto one another. if a corresponding transfer or mapping can be achieved by a linear shift.
  • the transfer of the illumination patterns into one another or their imaging onto one another takes place "at least partially", which means that the patterns need not be completely interconverted or brought into coincidence with each other, in particular, portions which are not interconvertible can also remain in marginal areas Concrete embodiments are discussed below which make it possible to generate correspondingly convertible illumination patterns by means of an aperture wheel.
  • phase position of a repetitive pattern or the change of a corresponding phase position
  • this is the displacement of the pattern with respect to one Original pattern or the displacement of two corresponding patterns understood to each other.
  • phase offset leads to an offset of the patterns to one another and thus to a phase offset.
  • a shift of the phase position of an illumination pattern can be effected only by rotating the aperture wheel.
  • Means for driving a corresponding aperture wheel are typically already present in a corresponding microscope, as mentioned above; Therefore, if necessary, only the scope of the control must be set and a synchronized with the adjustment of the aperture wheel image acquisition can be realized by a corresponding drive scheme. Even if a drive unit, such as a stepper motor, has to be replaced for use with the present invention, the present invention still provides the advantage that no additional components need to be provided.
  • control unit is thus set up to output position specifications to the drive, which cause the latter to position the aperture wheel in the two or more angular positions, and also to output image acquisition signals to the image acquisition unit, which cause them to to take at least one image at each of the two or more angular positions.
  • This activation takes place, as mentioned, by means already largely available; elaborate adaptations as in the prior art are not required.
  • the structural apertures are formed as grating lines, a "grating” being understood to mean any (partially) repetitive arrangement of lines, so that a “grating” is not restricted to arrangements with lines intersecting at certain angles or at certain angles ; Parallel or diverging or converging lines, parallel wave or serrated patterns and the like are also referred to herein as "gratings.”
  • structuring takes place through areas of lesser and greater light transmission, for example in the case of a (substantially) opaque line pattern On a particularly plane-parallel, transparent (glass) plate given ..
  • (essentially) opaque lines can also gradient be present or it may be only partially opaque.
  • the areas of lower light transmission are designed as line structures.
  • the one or more structural apertures are designed such that in the two or more angular positions in which the same structural aperture is illuminated, the illumination patterns that can be at least partially converted into one another by rotation can be generated. In this embodiment, therefore, the same structural panel is illuminated in defined, slightly different (rotational) positions or angular positions for generating illumination patterns of different phase angles.
  • a corresponding structural panel can be provided with straight, diverging lines which converge or whose extensions converge in the rotation axis of the aperture wheel.
  • a corresponding example is illustrated with reference to the attached Figure 2.
  • Corresponding straight lines can also be replaced, for example, by corrugated or jagged lines or supplemented by those which likewise produce illumination patterns which can be imaged onto one another by rotation about the rotation axis of the aperture wheel.
  • the one or more structural apertures may have radially diverging line structures with respect to the axis of rotation; As the shape of the lines (straight, wavy, jagged, etc.) is designed, the expert decides as needed.
  • the advantage of this embodiment is the free choice of the phase position (within the limits of the positioning accuracy) and insensitivity to the exact positioning of the rotation axis of the aperture wheel relative to the optical axis of the wide-field incident illumination unit and the Auflichtbeleuchtungsstrahlengangs. This simplifies assembly. However, in this embodiment, the demands on the precise controllability and the reproducible, exact positioning by the drive used are high.
  • two or more of the structural apertures may be formed such that in the two or more angular positions, in each case one This structure is illuminated, which can be generated by translation at least partially interconvertible illumination pattern.
  • different structure diaphragms are therefore used here for generating the illumination patterns of different phase positions.
  • FIG. An example of this is illustrated with reference to FIG.
  • circular arcs are provided, the center of which corresponds to the rotational axis of the diaphragm wheel, but which are slightly offset radially from one another in different grid apertures, that is, they have different radii. Again, it is not mandatory that only circular arcs are used.
  • corrugated lines may also be provided which, for example with a constant amplitude, follow a corresponding circular arc. It is therefore provided in total in this embodiment, when the two or more structural apertures have line structures that follow circular arcs about the axis of rotation and are radially offset from one another.
  • Advantage of this embodiment is the insensitivity to mispositioning of the drive, because an additional rotation of the aperture wheel does not necessarily change the phase position, if still the same aperture illuminated and imaged in the object plane.
  • the arcs discussed in relation to Figure 3 are extremely tolerant of such mispositioning.
  • the aforementioned embodiment requires that the individual diaphragm grids be precisely aligned with the rotation axis of the diaphragm plate and the latter precisely aligned with the optical axis of the illumination device.
  • the mentioned lines according to the explained alternatives need not be the only lines of a corresponding line grid. Rather, additional lines can be provided which intersect the lines mentioned, run between them, etc., but do not meet the criteria mentioned. Such lines may be provided, for example, to achieve further optical effects and are selected by the skilled person for this purpose.
  • the present invention is used in particular in a fluorescence microscope. Therefore, if a "microscope” is mentioned here, this is advantageously designed such that it can be operated as a fluorescence microscope.
  • the technical means required for this purpose are known to the person skilled in the art and readily available.
  • the wide-field incident light unit in which the diaphragm wheel is arranged in a plane conjugate to the object plane, can provide Köhler or critical illumination. In both cases, the present invention unfolds the stated advantages.
  • the present invention also extends to a diaphragm wheel for a microscope.
  • This is designed for use as a field diaphragm for a microscope with a wide-field Auflichtiser, provided with an axis of rotation and is characterized according to the invention in that it carries one or more structural apertures, which have a structuring by areas of lesser and formed as a line structures areas of higher light transmission, wherein one or more of the structure diaphragms has or have radially diverging line structures with respect to the axis of rotation, and / or at least two of the structure diaphragms have line structures that follow circular arcs about the axis of rotation and are radially offset from one another. Details on corresponding line structures have already been discussed in detail before.
  • the features and advantages explained above with respect to the microscope relate equally to the aperture wheel which can be used in a corresponding microscope. In particular, such an aperture wheel is used in a microscope, as previously explained.
  • the microscopy method comprises positioning the aperture wheel in the two or more angular positions by illuminating by means of the light source of the wide field incident light unit at the two or more angular positions the illumination patterns at least partially interconvertible by rotation or translation generate the object plane of the microscope, and at least one image by means of the image pickup unit at each of the two or more angular positions.
  • the images are processed using an image processing algorithm, for example in accordance with the publications mentioned above.
  • image processing algorithm for example in accordance with the publications mentioned above.
  • FIG. 1 shows schematically a microscope according to a particularly preferred embodiment of the invention and designated overall by 1.
  • the microscope 1 which can be embodied in particular as a fluorescence microscope, comprises a wide-field incident light unit designated overall by 20, a tube unit designated as a whole by 20, a viewing unit designated overall by 30, a digital image acquisition unit designated as a whole by 40 and a control unit designated as a whole by ,
  • the wide-field incident light unit 10 defines an incident light beam path 1 1 illustrated here only in the form of the marginal rays of the orthoscopic beam path with an optical axis 12 drawn in dash-dotted lines.
  • Light of a light source 13 is focused in the reflected light beam path 1 1 by means of a lens or lens group 14 in the example shown.
  • a light beam diverging beyond the focal point of the lens or lens group 14 in the reflected light beam path 1 1 is collimated by means of a further lens or lens group 15 and can be irradiated via a dichroic beam splitter 16 into an objective 24 and focused into an object plane 23 of the objective 24 become.
  • the incident light unit 10 or its reflected light beam path 1 1 can by using suitable optics as Köhler illumination, be designed as critical lighting or as a mixed form of both types of lighting.
  • the field diaphragm plane which is conjugate to the object plane 23 and in which a here designated 100 aperture wheel is inserted, which can be positioned about a designated rotation axis 17 by means of a drive 18 in different angular positions.
  • the aperture wheel 100 carries one or more structural apertures formed and arranged on the aperture wheel such that they are illuminated by the light source 13 of the wide-field incident light unit 10 at two or more different angular positions
  • rotation or translation at least partially interconvertible illumination pattern in the object plane 23 of the microscope 1 and the lens 24 can be generated.
  • An observation beam path here likewise illustrated only in the form of the marginal rays of the orthoscopic beam path for better discrimination, is designated by 21. Its optical axis is shown in dashed lines and designated 22.
  • observation beam path 21 The elements in the observation beam path 21 are shown greatly simplified. This also applies to the reflected-light beam path 10. Additional elements may be present in each case or elements shown may be omitted. An inverted microscope 1 is illustrated, but the invention can also be used in a regular microscope.
  • Observation light passes through the dichroic beam splitter 16 in the example shown and is focused by means of optical elements 25 and then collimated again. A deflection takes place at deflecting elements 26 such as mirrors or prisms.
  • deflecting elements 26 such as mirrors or prisms.
  • the observation light is irradiated into an observation device 30 with eyepieces 31.
  • a part of the observation light can be coupled out, for example, at a prism 44 or another suitable decoupling device and coupled via an optical element 43 into the image acquisition unit 40 with a camera 41 with an image acquisition medium 42, for example a CCD chip.
  • FIG. 2 shows an aperture wheel 100 in which a structural panel 101 and two conventional panels 103, 104 are shown.
  • the aperture wheel 100 typically forms a full circle which can be rotated about the axis of rotation 17, which is also illustrated here, in the plane of the paper.
  • further apertures can be provided.
  • the structural panel 101 has radially diverging line structures with respect to the axis of rotation 17.
  • rotation e.g.
  • the drive 18 designed as a micro-stepping stepping motor for aperture positioning and accurate positioning about the rotation axis 17 of the aperture wheel 100
  • a phase of the structured illumination constant over the image field can thus be realized.
  • Advantage of this embodiment is, as already mentioned above, the free choice of the phase position (in the limits of positioning accuracy) and insensitivity to the exact positioning of the rotation axis 17 of the diaphragm disc relative to the optical axis of the illumination device. In this way, the assembly in the microscope 1 simplified.
  • a plurality of structural apertures 102a to 102c are provided, which each have grating lines with circular sections. The center of the circle sections corresponds in each case to the axis of rotation 17. These are also arranged on a (not shown here) aperture wheel 100 and can be pivoted by rotation of the aperture 100 in the reflected light beam path 1 1. At least three different phase positions with respect to the radial position are in the illustrated example at different positions of Aperture wheel 100 is provided. By positioning the grating of the respective phase position at the field diaphragm position, images of the different grating phases can be recorded.
  • Advantage of this embodiment is the insensitivity to incorrect positioning of the stepping motor, whereas, however, the individual aperture grids must be precisely aligned with the axis of rotation, and the latter precisely to the optical axis of the illumination device.
  • structural apertures may carry any gratings that accommodate the rotational symmetry of the movement of the aperture wheel.
  • the grid pattern must be convertible into itself by a rotation.
  • radially symmetric planks with edges along the radial and azimuthal direction of the aperture wheel, or not necessarily straight line patterns that result from rotation of a line around the center of the blend wheel, are conceivable.
  • the discussed illumination arrangement can be installed both in external epi-fluorescence illumination devices (eg as a module which can be coupled to an infinite beam path) and in integrated epi-fluorescence illumination devices.
  • a calculation of the optical sectional image can be carried out after recording the images with different phase position according to the billing rules mentioned several times.

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Abstract

The invention relates to a microscope (1) comprising a wide-field incident light unit (10) which defines an incident light illumination beam path (11) with an optical axis (12), a digital image capturing unit (40), and a control unit (50). A field diaphragm is introduced into the illumination beam path (11), said field diaphragm being designed as an aperture wheel (100) which can be positioned at different angular positions by being rotated about a rotational axis (17) lying parallel to the optical axis (12) by means of a drive (18) on the basis of a position specification of the control unit (50). The aperture wheel (100) has one or more structure apertures which is or are designed and arranged on the aperture wheel (100) such that illumination patterns which can be at least partly converted into one another by rotation or translation can be generated on an object plane (23) of the microscope (1) at two or more of the different angular positions by illuminating the structure apertures by means of a light source (13) of the wide-field incident light unit (10).

Description

Mikroskopbeleuchtungsanordnung zur strukturierten Beleuchtung  Microscope illumination arrangement for structured illumination
Beschreibung Die Erfindung betrifft ein Mikroskop, ein Blendenrad und ein Mikroskopieverfahren gemäß den Oberbegriffen der unabhängigen Patentansprüche. The invention relates to a microscope, an aperture wheel and a microscopy method according to the preambles of the independent claims.
Stand der Technik In der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie ist das Licht von Emittern außerhalb der Fokusebene ein entscheidender kontrastverringernder Faktor. Zur Kontrasterhöhung durch Reduktion solchen Lichts existiert eine Vielzahl von Verfahren auf der Grundlage der sogenannten strukturierten Beleuchtung (engl. Structured Illumination Microscopy, SIM). Ausgewählte Beispiele werden nachfolgend genannt. PRIOR ART In far-field fluorescence microscopy, the light from emitters outside the focal plane is a decisive contrast-reducing factor. To increase the contrast by reducing such light, there are a large number of methods based on the so-called structured illumination microscopy (SIM). Selected examples are listed below.
In der US 6,376,818 B1 ist ein Verfahren offenbart, das umfasst, aus mehreren digitalen Bildern, die mit einem periodischen Muster in unterschiedlichen Phasenlagen überlagert wurden, ein Ergebnisbild mit erhöhtem Kontrast zu erzeugen. Das Verfahren umfasst die Schritte, ein Objekt mit einer Lichtquelle zu beleuchten und dabei ein im Wesentlichen periodisches Muster auf das Objekt zu projizieren. Nach Aufnahme eines ersten Bilds wird die Phasenlage des Musters geändert und es wird ein zweites Bild des Objekts aufgenommen. Dies wird wenigstens ein weiteres Mal wiederholt. Die aufgezeichneten Bilder werden jeweils paarweise miteinander verrechnet. Auf diese Weise kann das periodische Muster rechnerisch entfernt und ein fokussiertes, d.h. durch Licht von Emittern außerhalb der Fokusebene weitgehend unbeeinflusstes, digitales Bild erhalten werden. US Pat. No. 6,376,818 B1 discloses a method which comprises generating a contrast-enhanced result image from a plurality of digital images superimposed with a periodic pattern in different phase positions. The method includes the steps of illuminating an object with a light source and thereby projecting a substantially periodic pattern onto the object. After taking a first image, the phase of the pattern is changed and a second image of the object is taken. This is repeated at least once more. The recorded pictures will be charged in pairs. In this way, the periodic pattern can be computationally removed and a focused, i. be obtained by light from emitters outside the focal plane largely uninfluenced digital image.
Das periodische Muster wird gemäß US 6,376,818 B1 durch Verwendung einer geeigneten Beleuchtungsmaske erzeugt, die verschoben werden kann, um die unterschiedlichen Phasenlagen zu erhalten. Eine konkrete mechanische Ausgestaltung ist in der US 6,376,818 B1 allerdings nicht offenbart. ln der US 6,819,415 B2 und der US 7,335,866 B2 sind alternative Verrechnungsverfahren angegeben. Die US 6,819,415 B2 offenbart dabei zudem eine technische Ausgestaltung, bei dem die unterschiedlichen Gitterphasen durch Kippen einer planparalle- len, strukturierten Platte im Beleuchtungsstrahlengang in der Ebene der Leuchtfeldblende erzeugt werden. Die strukturierte Platte wird dabei um eine Achse gekippt, die senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsstrahlengangs steht. Die US The periodic pattern is generated according to US 6,376,818 B1 by using a suitable illumination mask which can be shifted to obtain the different phase positions. However, a specific mechanical design is not disclosed in US Pat. No. 6,376,818 B1. US 6,819,415 B2 and US 7,335,866 B2 disclose alternative methods of calculation. In addition, US Pat. No. 6,819,415 B2 discloses a technical embodiment in which the different grating phases are produced by tilting a plane-parallel, structured plate in the illumination beam path in the plane of the field diaphragm. The structured plate is thereby tilted about an axis which is perpendicular to the optical axis of the illumination beam path. The US
8,089,691 B2 offenbart ein kombiniertes Beleuchtungs- und Detektionssystem als externes Modul für ein Mikroskop. In der US 8,089,691 B2 wird vorgeschlagen, ein in der Leuchtfeldblendenebene des Mikroskops positioniertes Gitter seitlich mit Hilfe eines Piezostellers zu verschieben. No. 8,089,691 B2 discloses a combined illumination and detection system as an external module for a microscope. In US 8,089,691 B2 it is proposed to move a grid positioned in the field diaphragm plane of the microscope laterally with the aid of a piezoelectric actuator.
In der wissenschaftlichen und Patentliteratur sind ferner Systeme basierend auf Beugungsgittern in einer zum Bildfeld konjugierten Ebene bekannt, die zur auflösungsstei- gernden Verrechnung der Einzelbilder genutzt werden (siehe beispielsweise M. G. Gustafsson, J. Microscopy 198, 2000, 82-87). Systems based on diffraction gratings in a plane conjugated to the image field are also known in the scientific and patent literature, which are used for the resolution-increasing computation of the individual images (see, for example, M.G. Gustafsson, J. Microscopy 198, 2000, 82-87).
Sämtlichen erläuterten Realisierungen der strukturierten Beleuchtung im Stand der Technik sind der apparative Aufwand und damit die kostspielige Herstellung gemein. Wünschenswert wäre eine Realisierung mit minimalem apparativem Aufwand, die ohne aufwendige Adaptionen mit vorhandenen Mikroskopsystemen kombiniert werden kann. All explained realizations of the structured illumination in the prior art are the expenditure on equipment and thus the costly production in common. It would be desirable to realize this with minimal outlay on equipment, which can be combined without complex adaptations with existing microscope systems.
Offenbarung der Erfindung Erfindungsgemäß werden vor diesem Hintergrund ein Mikroskop, ein Blendenrad und ein Mikroskopieverfahren mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche vorgeschlagen. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung. Werden nachfolgend Merkmale und Vorteile des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Mikroskops erläutert, gelten diese grundsätzlich für das erfindungsgemäße Blendenrad und das Mikroskopieverfahren in gleicher Weise. Die Erfindung kommt in einem Mikroskop mit einer einen Auflichtbeleuchtungsstrah- lengang mit einer optischen Achse definierenden Weitfeld-Auflichteinheit, mit einer digitalen Bildaufnahmeeinheit und mit einer Steuereinheit zum Einsatz, bei dem in den Beleuchtungsstrahlengang eine Leuchtfeldblende eingebracht ist, die als ein auf Grundlage einer Positionsvorgabe der Steuereinheit mittels eines Antriebs durch Drehen um eine parallel zu der optischen Achse liegende Rotationsachse in unterschiedlichen Winkelstellungen positionierbares Blendenrad ausgebildet ist. DISCLOSURE OF THE INVENTION According to the invention, a microscope, an aperture wheel and a microscopy method are proposed with the features of the independent patent claims. Advantageous embodiments are the subject of the dependent claims and the following description. If features and advantages of the microscope proposed according to the invention are explained below, they apply in principle to the aperture wheel according to the invention and the microscopy method in the same way. The invention is used in a microscope with a wide-field incident light unit defining a reflected-light illumination beam path with an optical axis, with a digital image recording unit and with a control unit in which a field diaphragm is introduced into the illumination beam path, which is based on a position specification of Control unit by means of a drive by rotating about an axis parallel to the optical axis axis of rotation in different angular positions positionable aperture wheel is formed.
Sofern hier von einem„Weitfeld"-Mikroskop bzw. einer entsprechenden„Weitfeld"- Auflichteinheit die Rede ist, seien hierunter ein Mikroskop bzw. eine Auflichteinheit verstanden, in der Auflicht im Gegensatz zu einem scannenden bzw. abtastenden System in Form eines im Wesentlichen lagefesten Lichtbündels mit großem Querschnitt in die Objektebene eingestrahlt wird. Eine Weitfeld-Beleuchtungseinheit unterscheidet sich damit von einer scannenden bzw. abtastenden Beleuchtungseinheit durch die flächige (aber, wie nachfolgend erläutert, ggf. strukturierte) Beleuchtung eines Objekts im Gegensatz zu einer punktförmigen Beleuchtung. As far as a "wide-field" microscope or a corresponding "wide-field" incident light unit is mentioned here, a microscope or an incident light unit is understood to be in the reflected light in contrast to a scanning or scanning system in the form of a substantially fixed position Light beam is injected with a large cross section in the object plane. A wide-field illumination unit thus differs from a scanning or scanning illumination unit by the planar (but, as explained below, possibly structured) illumination of an object in contrast to a punctiform illumination.
Die Leuchtfeldblende in bekannten Weitfeld-Auflichtbeleuchtungseinrichtungen zur Fluoreszenzanregung ist häufig als Scheibe mit verschiedenen Blendenöffnungen aus- geführt, wie auch nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figur 2 erläutert. Diese wird hier auch als„Blendenrad" bezeichnet. Das Blendenrad ist in einer Leuchtfeldblen- denebene angeordnet und kann daher in die Probe abgebildet werden. Bereits in herkömmlichen Mikroskopen kann dabei durch einen geeigneten Antrieb, beispielsweise einen Schrittmotor oder einen Gleichstrommotor mit Encoder, die gewünschte Blen- denöffnung in der Leuchtfeldblendenebene im Beleuchtungsstrahlengang positioniert werden. The field diaphragm in known wide-field incident light illumination devices for fluorescence excitation is often designed as a disk with different apertures, as also explained below with reference to FIG. The aperture wheel is arranged in a field diaphragm plane and can thus be imaged into the specimen. <br /> <br /> Already in conventional microscopes, the appropriate drive, for example a stepper motor or a DC motor with encoder, can be used Aperture opening can be positioned in the illuminated field diaphragm plane in the illumination beam path.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden stattdessen oder zusätzlich zu konventionellen Blenden in einem derartigen Blendenrad entweder eine Strukturblende in de- finierten unterschiedlichen Positionen oder unterschiedliche Strukturblenden in dem Beleuchtungsstrahlengang positioniert, wozu ebenfalls der Schrittmotor verwendet wird. Dieser wird ggf. zur Erzielung der erforderlichen Positioniergenauigkeit angepasst oder speziell angesteuert. Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist der, dass die Realisierung des Beleuchtungsgitters bzw. Beleuchtungsmusters und die Positionierung zur Erzeugung verschiedener Phasenlagen mit dem Mitteln dargestellt wird, die ein derartiges gat- tungsgemäßes Mikroskop, insbesondere ein Fluoreszenzmikroskop, direkt mitbringt. Es kann daher auf zusätzliche Strukturen, Blenden, Antriebe und entsprechende zusätzliche Ansteuermittel verzichtet werden. In the context of the present invention, instead of or in addition to conventional diaphragms in such a diaphragm wheel, either a structural diaphragm in defined different positions or different structural diaphragms are positioned in the illumination beam path, to which the stepping motor is also used. This is possibly adjusted to achieve the required positioning accuracy or specifically controlled. An essential advantage of the present invention is that the realization of the illumination grating or illumination pattern and the positioning for generating different phase positions is represented by the means which directly brings such a generic microscope, in particular a fluorescence microscope, with it. It is therefore possible to dispense with additional structures, diaphragms, drives and corresponding additional drive means.
Hierzu sieht die vorliegende Erfindung vor, dass das Blendenrad eine oder mehrere Strukturblenden trägt, die derart ausgebildet und auf dem Blendenrad angeordnet ist oder sind, dass durch deren Beleuchten mittels einer Lichtquelle der Weitfeld- Auflichteinheit bei zwei oder mehr der unterschiedlichen Winkelstellungen durch Rotation oder Translation zumindest teilweise ineinander überführbare Beleuchtungsmuster in einer Objektebene des Mikroskops erzeugbar sind. For this purpose, the present invention provides that the aperture wheel carries one or more structural apertures which are designed and arranged on the aperture wheel or by their illumination by means of a light source of the wide-field incident light unit at two or more of the different angular positions by rotation or translation At least partially interconvertible illumination pattern can be generated in an object plane of the microscope.
Die Beleuchtungsmuster sind dabei„durch Rotation ineinander überführbar", wenn eine Drehung beider Muster zueinander um einen gemeinsamen Drehpunkt, der insbesondere auch außerhalb des Musters liegen kann, die Beleuchtungsmuster ineinander überführt bzw. aufeinander abbildet. Die Beleuchtungsmuster sind hingegen„durch Translation ineinander überführbar", wenn eine entsprechende Überführung bzw. Abbildung aufeinander durch eine lineare Verschiebung erzielt werden kann. Die Überführung der Beleuchtungsmuster ineinander bzw. deren Abbildung aufeinander erfolgt „wenigstens teilweise", was bedeutet, dass die Muster nicht vollständig ineinander überführt bzw. miteinander zur Deckung gebracht werden können müssen. Insbeson- dere können in Randbereichen auch nicht ineinander überführbare Anteile verbleiben. Weiter unten werden konkrete Ausgestaltungen diskutiert, die es ermöglichen, entsprechend ineinander überführbare Beleuchtungsmuster mittels eines Blendenrads zu erzeugen. Ist zuvor und nachfolgend von einer„Phasenlage" eines repetitiven Musters oder von der Veränderung einer entsprechenden Phasenlage die Rede, sei hierunter die Verschiebung des Musters gegenüber einem Ursprungsmuster oder die Verschiebung zweier entsprechender Muster zueinander verstanden. Beispielsweise weisen zwei ineinander überführbare Muster eine identische Phasenlage auf, wenn diese aufeinander abgebildet werden. Jede Verschiebung führt zu einem Versatz der Muster zueinander und damit zu einem Phasenversatz. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann eine Verschiebung der Phasenlage eines Beleuchtungsmusters lediglich durch Drehen des Blendenrads bewirkt werden. Mittel zur Ansteuerung eines entsprechenden Blendenrads sind in einem entsprechenden Mikroskop, wie zuvor angesprochen, typischerweise bereits vorhanden; daher muss lediglich ggf. der Umfang der Ansteuerung eingestellt und eine mit der Verstellung des Blendenrads synchronisierte Bildaufnahme durch ein entsprechendes Ansteuerschema realisiert werden. Selbst wenn eine Ansteuereinheit, beispielsweise ein Schrittmotor, zum Einsatz für die vorliegende Erfindung ersetzt werden muss, schafft die vorliegende Erfindung dennoch den Vorteil, dass keine zusätzlichen Bauteile vorgesehen werden müssen. The illumination patterns are "interconvertible by rotation" when a rotation of both patterns relative to one another about a common pivot point, which may also be outside the pattern, transforms the illumination patterns into one another or images them onto one another. if a corresponding transfer or mapping can be achieved by a linear shift. The transfer of the illumination patterns into one another or their imaging onto one another takes place "at least partially", which means that the patterns need not be completely interconverted or brought into coincidence with each other, in particular, portions which are not interconvertible can also remain in marginal areas Concrete embodiments are discussed below which make it possible to generate correspondingly convertible illumination patterns by means of an aperture wheel. If one mentions previously and subsequently a "phase position" of a repetitive pattern or the change of a corresponding phase position, this is the displacement of the pattern with respect to one Original pattern or the displacement of two corresponding patterns understood to each other. For example, have two interconvertible patterns have an identical phase position when they are imaged onto each other. Each shift leads to an offset of the patterns to one another and thus to a phase offset. In the context of the present invention, a shift of the phase position of an illumination pattern can be effected only by rotating the aperture wheel. Means for driving a corresponding aperture wheel are typically already present in a corresponding microscope, as mentioned above; Therefore, if necessary, only the scope of the control must be set and a synchronized with the adjustment of the aperture wheel image acquisition can be realized by a corresponding drive scheme. Even if a drive unit, such as a stepper motor, has to be replaced for use with the present invention, the present invention still provides the advantage that no additional components need to be provided.
Vorteilhafterweise ist also in dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Mikroskop die Steuereinheit dazu eingerichtet, Positionsvorgaben an den Antrieb auszugeben, die diesen dazu veranlassen, das Blendenrad in den zwei oder mehr Winkelstellungen zu positionieren, und ferner Bildaufnahmesignale an die Bildaufnahmeeinheit auszuge- ben, die diese dazu veranlassen, bei jeder der zwei oder mehr Winkelstellungen zumindest ein Bild aufzunehmen. Diese Ansteuerung erfolgt, wie erwähnt, mittels bereits weitgehend vorhandener Mittel; aufwendige Adaptionen wie im Stand der Technik sind nicht erforderlich. Advantageously, in the microscope proposed according to the invention, the control unit is thus set up to output position specifications to the drive, which cause the latter to position the aperture wheel in the two or more angular positions, and also to output image acquisition signals to the image acquisition unit, which cause them to to take at least one image at each of the two or more angular positions. This activation takes place, as mentioned, by means already largely available; elaborate adaptations as in the prior art are not required.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Strukturblenden als Strichgitter ausgebildet sind, wobei unter einem„Gitter" jegliche (teil-)repetitive Anordnung von Linien verstanden wird. Ein„Gitter" ist also nicht auf Anordnungen mit sich kreuzweise oder in bestimmten Winkeln schneidenden Linien beschränkt; auch parallel oder divergierend bzw. konvergierend verlaufende Linien, parallel angeordnete Wellen- oder Zackenmuster und dergleichen werden hier als„Gitter" bezeichnet. Bei einem Strichgitter erfolgt eine Strukturierung durch Bereiche geringerer und höherer Lichtdurchlässigkeit. Diese ist beispielsweise bei einem (im Wesentlichen) lichtundurchlässigen Linienmuster auf einer insbesondere planparallelen, transparenten (Glas-)Platte gegeben. Neben scharf begrenzten, (im Wesentlichen) lichtundurchlässigen Linien können auch Gradienten vorhanden sein oder es kann eine nur teilweise Lichtundurchlässigkeit vorliegen. In sämtlichen Fällen sind die Bereiche geringerer Lichtdurchlässigkeit als Linienstrukturen ausgebildet. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist die eine oder sind die mehreren Strukturblenden derart ausgebildet, dass in den zwei oder mehr Winkelstellungen, in denen dieselbe Strukturblende beleuchtet wird, die durch Rotation zumindest teilweise ineinander überführbaren Beleuchtungsmuster erzeugbar sind. In dieser Ausgestaltung wird also zur Erzeugung von Beleuchtungsmustern unterschiedlicher Phasenlage die- selbe Strukturblende in definierten, leicht voneinander abweichenden (Dreh- )Positionen bzw. Winkelstellungen beleuchtet. It is particularly advantageous if the structural apertures are formed as grating lines, a "grating" being understood to mean any (partially) repetitive arrangement of lines, so that a "grating" is not restricted to arrangements with lines intersecting at certain angles or at certain angles ; Parallel or diverging or converging lines, parallel wave or serrated patterns and the like are also referred to herein as "gratings." In the case of a grating, structuring takes place through areas of lesser and greater light transmission, for example in the case of a (substantially) opaque line pattern On a particularly plane-parallel, transparent (glass) plate given .. In addition to sharply defined, (essentially) opaque lines can also gradient be present or it may be only partially opaque. In all cases, the areas of lower light transmission are designed as line structures. In a particularly preferred embodiment, the one or more structural apertures are designed such that in the two or more angular positions in which the same structural aperture is illuminated, the illumination patterns that can be at least partially converted into one another by rotation can be generated. In this embodiment, therefore, the same structural panel is illuminated in defined, slightly different (rotational) positions or angular positions for generating illumination patterns of different phase angles.
In einer besonders einfachen Ausgestaltung kann eine entsprechende Strukturblende mit geraden, divergierende Linien, die oder deren Verlängerungen in der Rotationsach- se des Blendenrads zusammenlaufen, versehen sein. Ein entsprechendes Beispiel ist unter Bezugnahme auf die beigefügte Figur 2 veranschaulicht. Entsprechende gerade Linien können auch beispielsweise durch gewellte oder gezackte Linien ersetzt oder um solche ergänzt sein, die ebenfalls Beleuchtungsmuster erzeugen, die durch eine Rotation um die Rotationsachse des Blendenrads aufeinander abbildbar sind. Grund- sätzlich können die oder die eine der mehreren Strukturblenden in Bezug auf die Rotationsachse radial divergierende Linienstrukturen aufweisen; wie die Form der Linien (gerade, gewellt, gezackt usw.) gestaltet ist, entscheidet der Fachmann nach Bedarf. In a particularly simple embodiment, a corresponding structural panel can be provided with straight, diverging lines which converge or whose extensions converge in the rotation axis of the aperture wheel. A corresponding example is illustrated with reference to the attached Figure 2. Corresponding straight lines can also be replaced, for example, by corrugated or jagged lines or supplemented by those which likewise produce illumination patterns which can be imaged onto one another by rotation about the rotation axis of the aperture wheel. In principle, the one or more structural apertures may have radially diverging line structures with respect to the axis of rotation; As the shape of the lines (straight, wavy, jagged, etc.) is designed, the expert decides as needed.
Der Vorteil dieser Ausführungsform ist die freie Wahl der Phasenlage (in den Grenzen der Positioniergenauigkeit) und eine Unempfindlichkeit gegenüber der genauen Positionierung der Rotationsachse des Blendenrads relativ zur optischen Achse der Weit- feld-Auflichtbeleuchtungseinheit bzw. des Auflichtbeleuchtungsstrahlengangs. Auf diese Weise vereinfacht sich die Montage. Allerdings sind in dieser Ausführungsform die Anforderungen an die präzise Ansteuerbarkeit und die reproduzierbare, exakte Positio- nierung durch den verwendeten Antrieb hoch. The advantage of this embodiment is the free choice of the phase position (within the limits of the positioning accuracy) and insensitivity to the exact positioning of the rotation axis of the aperture wheel relative to the optical axis of the wide-field incident illumination unit and the Auflichtbeleuchtungsstrahlengangs. This simplifies assembly. However, in this embodiment, the demands on the precise controllability and the reproducible, exact positioning by the drive used are high.
Alternativ dazu oder zusätzlich können auch zwei oder mehr der Strukturblenden derart ausgebildet sein, dass in den zwei oder mehr Winkelstellungen, in denen jeweils eine dieser Strukturblenden beleuchtet wird, die durch Translation zumindest teilweise ineinander überführbaren Beleuchtungsmuster erzeugbar sind. Im Gegensatz zu der zuvor erläuterten Ausgestaltung werden also hier zur Erzeugung der Beleuchtungsmuster unterschiedlicher Phasenlagen unterschiedliche Strukturblenden verwendet. Ein Bei- spiel hierfür ist unter Bezugnahme auf die Figur 3 veranschaulicht. Hier sind Kreisbögen vorgesehen, deren Mittelpunkt der Rotationsachse des Blendenrads entspricht, die jedoch in unterschiedlichen Gitterblenden leicht radial zueinander versetzt sind, die also unterschiedliche Radien aufweisen. Auch hier ist es nicht zwingend erforderlich, dass lediglich Kreisbögen verwendet werden. Es können beispielsweise auch gewellte Linien vorgesehen sein, die, beispielsweise mit einer konstanten Amplitude, einem entsprechenden Kreisbogen folgen. Es ist also insgesamt in dieser Ausführungsform vorgesehen, wenn die zwei oder mehr Strukturblenden Linienstrukturen aufweisen, die Kreisbögen um die Rotationsachse folgen und radial zueinander versetzt sind. Vorteil dieser Ausführungsform ist die Unempfindlichkeit gegenüber Fehlpositionierungen des Antriebs, weil eine zusätzliche Rotation des Blendenrads die Phasenlage nicht notwendigerweise ändert, sofern noch dieselbe Blende beleuchtet und in der Objektebene abgebildet wird. Insbesondere die in Bezug auf Figur 3 diskutierten Kreisbögen sind bezüglich einer derartigen Fehlpositionierung ausgesprochen tolerant. Die ge- nannte Ausführungsform erfordert jedoch, dass die einzelnen Blendengitter präzise zur Rotationsachse der Blendenscheibe und letztere präzise zur optischen Achse der Beleuchtungseinrichtung ausgerichtet werden. Alternatively, or in addition, two or more of the structural apertures may be formed such that in the two or more angular positions, in each case one This structure is illuminated, which can be generated by translation at least partially interconvertible illumination pattern. In contrast to the embodiment explained above, different structure diaphragms are therefore used here for generating the illumination patterns of different phase positions. An example of this is illustrated with reference to FIG. Here, circular arcs are provided, the center of which corresponds to the rotational axis of the diaphragm wheel, but which are slightly offset radially from one another in different grid apertures, that is, they have different radii. Again, it is not mandatory that only circular arcs are used. For example, corrugated lines may also be provided which, for example with a constant amplitude, follow a corresponding circular arc. It is therefore provided in total in this embodiment, when the two or more structural apertures have line structures that follow circular arcs about the axis of rotation and are radially offset from one another. Advantage of this embodiment is the insensitivity to mispositioning of the drive, because an additional rotation of the aperture wheel does not necessarily change the phase position, if still the same aperture illuminated and imaged in the object plane. In particular, the arcs discussed in relation to Figure 3 are extremely tolerant of such mispositioning. However, the aforementioned embodiment requires that the individual diaphragm grids be precisely aligned with the rotation axis of the diaphragm plate and the latter precisely aligned with the optical axis of the illumination device.
Die erwähnten Linien gemäß der erläuterten Alternativen müssen nicht die einzigen Linien eines entsprechenden Liniengitters sein. Vielmehr können auch zusätzliche Linien vorgesehen sein, die die genannten Linien schneiden, zwischen diesen verlaufen usw., die aber den genannten Kriterien nicht entsprechen. Derartige Linien können beispielsweise zur Erzielung weiterer optischer Effekte vorgesehen sein und werden vom Fachmann zu diesem Zweck ausgewählt. The mentioned lines according to the explained alternatives need not be the only lines of a corresponding line grid. Rather, additional lines can be provided which intersect the lines mentioned, run between them, etc., but do not meet the criteria mentioned. Such lines may be provided, for example, to achieve further optical effects and are selected by the skilled person for this purpose.
Wie bereits erwähnt, kommt die vorliegende Erfindung insbesondere in einem Fluoreszenzmikroskop zum Einsatz. Ist daher hier von einem„Mikroskop" die Rede, ist dieses vorteilhafterweise derart ausgebildet, dass es als Fluoreszenzmikroskop betreibbar ist. Die hierzu erforderlichen technischen Mittel kennt der Fachmann und stellt sie ohne weiteres bereit. As already mentioned, the present invention is used in particular in a fluorescence microscope. Therefore, if a "microscope" is mentioned here, this is advantageously designed such that it can be operated as a fluorescence microscope. The technical means required for this purpose are known to the person skilled in the art and readily available.
In einem entsprechenden Mikroskop kann die Weitfeld-Auflichteinheit, in der das Blen- denrad in einer zur Objektebene konjugierten Ebene angeordnet ist, eine köhlersche oder eine kritische Beleuchtung bereitstellen. In beiden Fällen entfaltet die vorliegende Erfindung die genannten Vorteile. In a corresponding microscope, the wide-field incident light unit, in which the diaphragm wheel is arranged in a plane conjugate to the object plane, can provide Köhler or critical illumination. In both cases, the present invention unfolds the stated advantages.
Wie erwähnt, erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Blendenrad für ein Mikroskop. Dieses ist zur Verwendung als Leuchtfeldblende für ein Mikroskop mit einer Weitfeld-Auflichteinheit ausgebildet, mit einer Rotationsachse versehen und zeichnet sich erfindungsgemäß dadurch aus, dass es eine oder mehrere Strukturblenden trägt, die eine Strukturierung durch Bereiche geringerer und als Linienstrukturen ausgebildete Bereiche höherer Lichtdurchlässigkeit aufweisen, wobei eine oder mehrere der Strukturblenden in Bezug auf die Rotationsachse radial divergierende Linienstrukturen aufweist oder aufweisen und/oder zumindest zwei der Struktur-blenden Linienstrukturen aufweisen, die Kreisbögen um die Rotationsachse folgen und radial zueinander versetzt sind. Details zu entsprechenden Linienstrukturen wurden bereits zuvor ausführlich diskutiert. Wie erwähnt, betreffen die oben bezüglich des Mikroskops erläuterten Merkmale und Vorteile das Blendenrad, das in einem entsprechenden Mikroskop eingesetzt werden kann, in gleicher weise. Insbesondere ein derartiges Blendenrad wird in einem Mikroskop eingesetzt, wie es zuvor erläutert wurde. As mentioned, the present invention also extends to a diaphragm wheel for a microscope. This is designed for use as a field diaphragm for a microscope with a wide-field Auflichteinheit, provided with an axis of rotation and is characterized according to the invention in that it carries one or more structural apertures, which have a structuring by areas of lesser and formed as a line structures areas of higher light transmission, wherein one or more of the structure diaphragms has or have radially diverging line structures with respect to the axis of rotation, and / or at least two of the structure diaphragms have line structures that follow circular arcs about the axis of rotation and are radially offset from one another. Details on corresponding line structures have already been discussed in detail before. As mentioned above, the features and advantages explained above with respect to the microscope relate equally to the aperture wheel which can be used in a corresponding microscope. In particular, such an aperture wheel is used in a microscope, as previously explained.
Dies gilt, wie ebenfalls bereits erwähnt, auch für das erfindungsgemäß vorgeschlagene Mikroskopieverfahren. Dieses zeichnet sich erfindungsgemäß dadurch aus, dass ein Mikroskop eingesetzt wird, wie es zuvor erläutert wurde. Das Mikroskopieverfahren umfasst vorteilhafterweise, das Blendenrad in den zwei oder mehr Winkelstellungen zu positionieren, durch Beleuchten mittels der Lichtquelle der Weitfeld-Auflichteinheit bei den zwei oder mehr Winkelstellungen die durch Rotation oder Translation zumindest teilweise ineinander überführbaren Beleuchtungsmuster in der Objektebene des Mikroskops zu erzeugen, und mittels der Bildaufnahmeeinheit bei jeder der zwei oder mehr Winkelstellungen zumindest ein Bild aufzunehmen. This also applies, as already mentioned, for the microscopy method proposed according to the invention. This is inventively characterized in that a microscope is used, as explained above. Advantageously, the microscopy method comprises positioning the aperture wheel in the two or more angular positions by illuminating by means of the light source of the wide field incident light unit at the two or more angular positions the illumination patterns at least partially interconvertible by rotation or translation generate the object plane of the microscope, and at least one image by means of the image pickup unit at each of the two or more angular positions.
Vorteilhafterweise werden die Bilder unter Verwendung eines Bildbearbeitungsalgo- rithmus bearbeitet, beispielsweise gemäß den eingangs erwähnten Druckschriften. Auf diese Weise können im Rahmen der vorliegenden Erfindung kontrastverbesserte Fluoreszenzbilder erhalten werden. Advantageously, the images are processed using an image processing algorithm, for example in accordance with the publications mentioned above. In this way, in the context of the present invention, contrast-enhanced fluorescence images can be obtained.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläu- tert, welche jeweils unterschiedliche Aspekte gemäß bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung veranschaulichen. The invention will be explained in more detail with reference to the attached drawings, which illustrate different aspects according to preferred embodiments of the invention.
Figurenbeschreibung In Figur 1 ist ein Mikroskop gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schematisch veranschaulicht und insgesamt mit 1 bezeichnet. FIG. 1 shows schematically a microscope according to a particularly preferred embodiment of the invention and designated overall by 1.
Das Mikroskop 1 , das insbesondere als Fluoreszenzmikroskop ausgebildet sein kann, umfasst eine insgesamt mit 10 bezeichnete Weitfeld-Auflichteinheit, eine insgesamt mit 20 bezeichnete Tubuseinheit, eine insgesamt mit 30 bezeichnete Beobachtungseinheit, eine insgesamt mit 40 bezeichnete digitale Bildaufnahmeeinheit und eine insgesamt mit 50 bezeichnete Steuereinheit. The microscope 1, which can be embodied in particular as a fluorescence microscope, comprises a wide-field incident light unit designated overall by 20, a tube unit designated as a whole by 20, a viewing unit designated overall by 30, a digital image acquisition unit designated as a whole by 40 and a control unit designated as a whole by ,
Die Weitfeld-Auflichteinheit 10 definiert einen hier nur in Form der Randstrahlen des orthoskopischen Strahlengangs veranschaulichten Auflichtstrahlengang 1 1 mit einer strichpunktiert gezeichneten optischen Achse 12. Licht einer Lichtquelle 13 wird im dargestellten Beispiel in dem Auflichtstrahlengang 1 1 mittels einer Linse oder Linsengruppe 14 fokussiert. Ein jenseits des Brennpunkts der Linse oder Linsengruppe 14 in dem Auflichtstrahlengang 1 1 divergent verlaufendes Lichtbündel wird im dargestellten Beispiel mittels einer weiteren Linse oder Linsengruppe 15 kollimiert und kann über einen dichroitischen Strahlteiler 16 in ein Objektiv 24 eingestrahlt und in eine Objektebene 23 des Objektivs 24 fokussiert werden. Die Auflichteinheit 10 bzw. deren Auflichtstrahlengang 1 1 kann durch Einsatz geeigneter Optiken als Köhler-Beleuchtung, als kritische Beleuchtung oder auch als Mischform beider Beleuchtungsarten ausgeführt sein. The wide-field incident light unit 10 defines an incident light beam path 1 1 illustrated here only in the form of the marginal rays of the orthoscopic beam path with an optical axis 12 drawn in dash-dotted lines. Light of a light source 13 is focused in the reflected light beam path 1 1 by means of a lens or lens group 14 in the example shown. In the illustrated example, a light beam diverging beyond the focal point of the lens or lens group 14 in the reflected light beam path 1 1 is collimated by means of a further lens or lens group 15 and can be irradiated via a dichroic beam splitter 16 into an objective 24 and focused into an object plane 23 of the objective 24 become. The incident light unit 10 or its reflected light beam path 1 1 can by using suitable optics as Köhler illumination, be designed as critical lighting or as a mixed form of both types of lighting.
Im Brennpunkt der Linse oder Linsengruppe 14 liegt die Leuchtfeldblendenebene, die zu der Objektebene 23 konjugiert ist und in die ein hier mit 100 bezeichnetes Blendenrad eingebracht ist, welches um eine mit 17 bezeichnete Rotationsachse mittels eines Antriebs 18 in unterschiedlichen Winkelstellungen positionierbar ist. At the focal point of the lens or lens group 14 is the field diaphragm plane, which is conjugate to the object plane 23 and in which a here designated 100 aperture wheel is inserted, which can be positioned about a designated rotation axis 17 by means of a drive 18 in different angular positions.
Wie auch unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Figuren veranschaulicht, trägt das Blendenrad 100 eine oder mehrere Strukturblenden die derart ausgebildet und auf dem Blendenrad angeordnet ist oder sind, dass durch deren Beleuchten mittels der Lichtquelle 13 der Weitfeld-Auflichteinheit 10 bei zwei oder mehr der unterschiedlichen Winkelstellungen durch Rotation oder Translation zumindest teilweise ineinander überführbare Beleuchtungsmuster in der Objektebene 23 des Mikroskops 1 bzw. des Objektivs 24 erzeugbar sind. As also illustrated with reference to the following figures, the aperture wheel 100 carries one or more structural apertures formed and arranged on the aperture wheel such that they are illuminated by the light source 13 of the wide-field incident light unit 10 at two or more different angular positions By rotation or translation at least partially interconvertible illumination pattern in the object plane 23 of the microscope 1 and the lens 24 can be generated.
Ein Beobachtungsstrahlengang, hier ebenfalls nur in Form der Randstrahlen des orthoskopischen Strahlengangs der besseren Unterscheidung halber punktiert veranschaulicht, ist mit 21 bezeichnet. Seine optische Achse ist gestrichelt gezeigt und mit 22 bezeichnet. An observation beam path, here likewise illustrated only in the form of the marginal rays of the orthoscopic beam path for better discrimination, is designated by 21. Its optical axis is shown in dashed lines and designated 22.
Die Elemente im Beobachtungsstrahlengang 21 sind stark vereinfacht gezeigt. Dies gilt auch für den Auflichtstrahlengang 10. Es können jeweils zusätzliche Elemente vorhanden sein oder gezeigte Elemente wegfallen. Es ist ein Umkehrmikroskop 1 veran- schaulicht, die Erfindung kann jedoch auch in einem regulären Mikroskop zum Einsatz kommen. The elements in the observation beam path 21 are shown greatly simplified. This also applies to the reflected-light beam path 10. Additional elements may be present in each case or elements shown may be omitted. An inverted microscope 1 is illustrated, but the invention can also be used in a regular microscope.
Beobachtungslicht durchtritt im dargestellten Beispiel den dichroitischen Strahlteiler 16 und wird mittels optischer Elemente 25 fokussiert und anschließend wieder kollimiert. Eine Umlenkung erfolgt an Umlenkelementen 26 wie Spiegeln oder Prismen. Mittels einer Tubuslinse 27 wird das Beobachtungslicht in eine Beobachtungseinrichtung 30 mit Okularen 31 eingestrahlt. Ein Teil des Beobachtungslichts kann beispielsweise an einem Prisma 44 oder einer anderen geeigneten Auskoppeleinrichtung ausgekoppelt und über ein optisches Element 43 in die Bilderfassungseinheit 40 mit einer Kamera 41 mit einem Bilderfassungsmedium 42, beispielsweise einem CCD-Chip, eingekoppelt werden. Observation light passes through the dichroic beam splitter 16 in the example shown and is focused by means of optical elements 25 and then collimated again. A deflection takes place at deflecting elements 26 such as mirrors or prisms. By means of a tube lens 27, the observation light is irradiated into an observation device 30 with eyepieces 31. A part of the observation light can be coupled out, for example, at a prism 44 or another suitable decoupling device and coupled via an optical element 43 into the image acquisition unit 40 with a camera 41 with an image acquisition medium 42, for example a CCD chip.
Die Ansteuerung des Mikroskops, insbesondere der Bildaufnahmeeinheit 40 und des Antriebs 18 des Blendenrads 100, erfolgt mittels der Steuereinrichtung 50 in der bereits zuvor erläuterten Weise. Figur 2 zeigt ein Blendenrad 100, in dem eine Strukturblende 101 und zwei konventionelle Blenden 103, 104 gezeigt sind. Das Blendenrad 100 bildet typischerweise einen Vollkreis, der um die Rotationsachse 17, die auch hier veranschaulicht ist, in der Papierebene gedreht werden kann. Neben den gezeigten Blenden können weitere Blenden vorgesehen sein. The control of the microscope, in particular the image recording unit 40 and the drive 18 of the aperture wheel 100, by means of the control device 50 in the manner already explained above. FIG. 2 shows an aperture wheel 100 in which a structural panel 101 and two conventional panels 103, 104 are shown. The aperture wheel 100 typically forms a full circle which can be rotated about the axis of rotation 17, which is also illustrated here, in the plane of the paper. In addition to the apertures shown, further apertures can be provided.
Die Strukturblende 101 weist in Bezug auf die Rotationsachse 17 radial divergierende Linienstrukturen auf. Durch eine Drehung, z.B. mittels des als mikroschrittfähigem Schrittmotor zur Blendenpositionierung ausgebildeten Antriebs 18 und genaue Positionierung um die Rotationsachse 17 des Blendenrads 100 lässt sich damit eine über das Bildfeld konstante Phase der strukturierten Beleuchtung realisieren. Vorteil dieser Ausführungsform ist, wie bereits oben erwähnt, die freie Wahl der Phasenlage (in den Grenzen der Positioniergenauigkeit) und eine Unempfindlichkeit gegenüber der genauen Positionierung der Rotationsachse 17 der Blendenscheibe relativ zur optischen Achse der Beleuchtungseinrichtung. Auf diese Weise vereinfacht sich die Montage in dem Mikroskop 1 . The structural panel 101 has radially diverging line structures with respect to the axis of rotation 17. By rotation, e.g. By means of the drive 18 designed as a micro-stepping stepping motor for aperture positioning and accurate positioning about the rotation axis 17 of the aperture wheel 100, a phase of the structured illumination constant over the image field can thus be realized. Advantage of this embodiment is, as already mentioned above, the free choice of the phase position (in the limits of positioning accuracy) and insensitivity to the exact positioning of the rotation axis 17 of the diaphragm disc relative to the optical axis of the illumination device. In this way, the assembly in the microscope 1 simplified.
In einer weiteren Ausführungsform, die in Figur 3 veranschaulicht ist, sind mehrere Strukturblenden 102a bis 102c vorgesehen, die jeweils Strichgitter mit Kreisabschnitten aufweisen. Der Mittelpunkt der Kreisabschnitte entspricht jeweils der Rotationsachse 17. Auch diese sind auf einem (hier nicht veranschaulichten) Blendenrad 100 angeordnet und können durch Drehung des Blendenrads 100 in den Auflichtstrahlengang 1 1 eingeschwenkt werden. Mindestens drei unterschiedliche Phasenlagen bezüglich der radialen Position sind im dargestellten Beispiel an unterschiedlichen Positionen des Blendenrads 100 vorgesehen. Durch Positionierung des Gitters der jeweiligen Phasenlage an der Leuchtfeldblendenposition können Bilder der unterschiedlichen Gitterphasen aufgenommen werden. Es handelt sich hier also um drei Strukturblenden 102a bis 102c, die Linienstrukturen aufweisen, die Kreisbögen um die Rotationsachse 17 folgen und radial zueinander versetzt sind. Vorteil dieser Ausführungsform ist die Unempfindlichkeit gegenüber Fehlpositionierungen des Schrittmotors, wohingegen jedoch die einzelnen Blendengitter präzise zur Rotationsachse ausgerichtet werden müssen, und letztere präzise zur optischen Achse der Beleuchtungseinrichtung. In a further embodiment, which is illustrated in FIG. 3, a plurality of structural apertures 102a to 102c are provided, which each have grating lines with circular sections. The center of the circle sections corresponds in each case to the axis of rotation 17. These are also arranged on a (not shown here) aperture wheel 100 and can be pivoted by rotation of the aperture 100 in the reflected light beam path 1 1. At least three different phase positions with respect to the radial position are in the illustrated example at different positions of Aperture wheel 100 is provided. By positioning the grating of the respective phase position at the field diaphragm position, images of the different grating phases can be recorded. In other words, these are three structural apertures 102a to 102c which have line structures which follow circular arcs about the axis of rotation 17 and are radially offset from one another. Advantage of this embodiment is the insensitivity to incorrect positioning of the stepping motor, whereas, however, the individual aperture grids must be precisely aligned with the axis of rotation, and the latter precisely to the optical axis of the illumination device.
In weiteren Ausführungsformen können Strukturblenden beliebige Gitter tragen, die der Rotationssymmetrie der Bewegung des Blendenrades Rechnung tragen. Das Gittermuster muss durch eine Rotation in sich selbst überführbar sein. Vorstellbar sind bei- spielsweise radialsymmetrische Karogitter mit Kanten entlang der radialen und azimutalen Richtung des Blendenrades, oder nicht notwendigerweise gerade Linienmuster, die durch Rotation einer Linie um die Mitte des Blenderades entstehen. Entsprechendes wurde bereits erläutert. Die diskutierte Beleuchtungsanordnung kann sowohl in externen Auflichtfluoreszenzbe- leuchtungseinrichtungen (z. B. als Modul, das an einen Unendlichstrahlengang ankoppelbar ist), als auch in integrierten Auflichtfluoreszenzbeleuchtungseinrichtungen eingebaut werden. Eine Berechnung des optischen Schnittbildes kann nach Aufnahme der Bilder mit unterschiedlicher Phasenlage gemäß den mehrfach erwähnten Verrech- nungsvorschriften erfolgen. In further embodiments, structural apertures may carry any gratings that accommodate the rotational symmetry of the movement of the aperture wheel. The grid pattern must be convertible into itself by a rotation. For example, radially symmetric planks with edges along the radial and azimuthal direction of the aperture wheel, or not necessarily straight line patterns that result from rotation of a line around the center of the blend wheel, are conceivable. The same has already been explained. The discussed illumination arrangement can be installed both in external epi-fluorescence illumination devices (eg as a module which can be coupled to an infinite beam path) and in integrated epi-fluorescence illumination devices. A calculation of the optical sectional image can be carried out after recording the images with different phase position according to the billing rules mentioned several times.
Bezugszeichenliste LIST OF REFERENCE NUMBERS
I Mikroskop I microscope
10 Weitfeld-Auflichteinheit10 wide-field incident light unit
20 Tubuseinheit 20 tube unit
30 Beobachtungseinheit 30 observation unit
40 Bildaufnahmeeinheit40 image acquisition unit
50 Steuereinheit 50 control unit
I I AuflichtstrahlengangI I reflected light beam
12 optische Achse 12 optical axis
13 Lichtquelle  13 light source
14 Linse oder Linsengruppe 14 lens or lens group
15 Linse oder Linsengruppe15 lens or lens group
16 dichroitischer Strahlteiler16 dichroic beam splitter
17 Rotationsachse 17 rotation axis
18 Antrieb  18 drive
Beobachtungsstrahlengang optische Achse Observation beam optical axis
Objektebene  object level
Objektiv  lens
optisches Element optical element
Umlenkelement deflecting
Tubuslinse  tube lens
Okulare eyepieces
Kamera camera
Bilderfassungsmedium optisches Element Auskoppelelement Steuereinheit Blendenrad Image acquisition medium optical element outcoupling element Control unit aperture wheel
Strukturblendea Strukturblendeb Strukturblendec Strukturblende  Structural Blendea Structural Blende Structural Blend Structural Blend
konventionelle Blende konventionelle Blende  conventional aperture conventional aperture

Claims

Patentansprüche claims
Mikroskop (1 ) mit einer einen Auflichtbeleuchtungsstrahlengang (1 1 ) mit einer optischen Achse (12) definierenden Weitfeld-Auflichteinheit (10), mit einer digitalen Bildaufnahmeeinheit (40) und mit einer Steuereinheit (50), wobei in den Beleuchtungsstrahlengang (1 1 ) eine Leuchtfeldblende eingebracht ist, die als ein auf Grundlage einer Positionsvorgabe der Steuereeinheit (50) mittels eines Antriebs (18) durch Drehen um eine parallel zu der optischen Achse (12) liegende Rotationsachse (17) in unterschiedlichen Winkelstellungen positionierbares Blendenrad (100) ausgebildet ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Blendenrad (100) eine oder mehrere Strukturblenden (101 , 102a-102c) trägt, die derart ausgebildet und auf dem Blendenrad (100) angeordnet ist oder sind, dass durch deren Beleuchten mittels einer Lichtquelle (13) der Weitfeld-Auflichteinheit (10) bei zwei oder mehr der unterschiedlichen Winkelstellungen durch Rotation oder Translation zumindest teilweise ineinander überführbare Beleuchtungsmuster in einer Objektebene (23) des Mikroskops (1 ) erzeugbar sind. Microscope (1) having a wide field incident light unit (10) defining an incident light illumination beam path (1 1) with an optical axis (12), having a digital image recording unit (40) and a control unit (50), wherein the illumination beam path (1 1) a field diaphragm is formed, which is formed as a based on a position specification of the control unit (50) by means of a drive (18) by rotating about an axis parallel to the optical axis (12) rotation axis (17) positionable in different angular positions aperture wheel (100) , characterized in that the aperture wheel (100) carries one or more structural apertures (101, 102a-102c) formed and arranged on the aperture wheel (100) such that by illuminating them by means of a light source (13) the wide field -Auflichteinheit (10) at two or more of the different angular positions by rotation or translation at least partially merge into one another Are illumination pattern in an object plane (23) of the microscope (1) can be generated.
Mikroskop (1 ) nach Anspruch 1 , bei dem die Steuereinheit (50) dazu eingerichtet ist, Positionsvorgaben an den Antrieb (18) auszugeben, die diesen dazu veranlassen, das Blendenrad (100) in den zwei oder mehr Winkelstellungen zu positionieren, und ferner Bildaufnahmesignale an die Bildaufnahmeeinheit (40) auszugeben, die diese dazu veranlassen, bei jeder der zwei oder mehr Winkelstellungen zumindest ein Bild aufzunehmen. The microscope (1) of claim 1, wherein the control unit (50) is adapted to output positional presets to the drive (18) causing it to position the aperture wheel (100) in the two or more angular positions, and further including image acquisition signals to output to the image pickup unit (40) causing them to pick up at least one image at each of the two or more angular positions.
Mikroskop (1 ) nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die eine oder die mehreren Strukturblenden (101 , 102a-102c) eine Strukturierung durch Bereiche geringerer und höherer Lichtdurchlässigkeit aufweisen. - 2 - A microscope (1) according to any one of the preceding claims, wherein the one or more structural apertures (101, 102a-102c) have structuring by regions of lesser and greater translucency. - 2 -
4. Mikroskop (1 ) nach Anspruch 3, bei dem die Bereiche geringerer Lichtdurchlässigkeit als Linienstrukturen ausgebildet sind. 4. A microscope (1) according to claim 3, wherein the areas of lower light transmittance are formed as line structures.
5. Mikroskop (1 ) nach Anspruch 4, bei dem die oder eine der mehreren Struktur- blenden (101 ) derart ausgebildet ist oder sind, dass in den zwei oder mehr Winkelstellungen, in denen dieselbe Strukturblende (101 ) beleuchtet wird, die durch Rotation zumindest teilweise ineinander überführbaren Beleuchtungsmuster erzeugbar sind. 5. Microscope (1) according to claim 4, wherein the or one of the plurality of structural apertures (101) is or are formed so that in the two or more angular positions in which the same structural shutter (101) is illuminated by rotation At least partially interconvertible illumination pattern can be generated.
6. Mikroskop (100) nach Anspruch 5, bei dem die oder die eine der mehreren Strukturblenden (101 ) in Bezug auf die Rotationsachse (17) radial divergierende Linienstrukturen aufweist oder aufweisen. 6. A microscope (100) according to claim 5, wherein the one or more of the plurality of structural apertures (101) with respect to the axis of rotation (17) radially diverging line structures or have.
7. Mikroskop (1 ) nach Anspruch 4, bei dem zwei oder mehr der Strukturblenden (102a-102c) derart ausgebildet sind, dass in den zwei oder mehr Winkelstellungen, in denen jeweils eine dieser Strukturblenden (102a-102c) beleuchtet wird, die durch Translation zumindest teilweise ineinander überführbaren Beleuchtungsmuster erzeugbar sind. 7. Microscope (1) according to claim 4, wherein two or more of the structural apertures (102a-102c) are formed such that in the two or more angular positions, in each of which one of these structural apertures (102a-102c) is illuminated by Translation at least partially interconvertible illumination pattern can be generated.
8. Mikroskop (1 ) nach Anspruch 7, bei dem die zumindest zwei Strukturblenden8. A microscope (1) according to claim 7, wherein the at least two structural apertures
(102a-102c) Linienstrukturen aufweisen, die Kreisbögen um die Rotationsachse (17) folgen und radial zueinander versetzt sind. (102a-102c) have line structures that follow circular arcs about the axis of rotation (17) and are radially offset from one another.
9. Mikroskop (1 ) nach einem der vorstehenden Ansprüche, das derart ausgebildet ist, dass es als Fluoreszenzmikroskop betreibbar ist. 9. A microscope (1) according to any one of the preceding claims, which is designed such that it can be operated as a fluorescence microscope.
10. Mikroskop (1 ) nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Auflichteinheit (10) köhlersche oder kritische Beleuchtung bereitstellt. 10. Microscope (1) according to one of the preceding claims, wherein the incident light unit (10) provides Köhlersche or critical illumination.
1 1 . Blendenrad (100), das zur Verwendung als Leuchtfeldblende für ein Mikroskop1 1. Aperture wheel (100) for use as a field diaphragm for a microscope
(1 ) mit einer Weitfeld-Auflichteinheit (10) ausgebildet ist, mit einer Rotationsachse (17), dadurch gekennzeichnet, dass das Blendenrad (100) eine oder mehrere Strukturblenden (101 , 102a-102c) trägt, die eine Strukturierung durch Bereiche - 3 - geringerer und als Linienstrukturen ausgebildete Bereiche höherer Lichtdurchlässigkeit aufweisen, wobei eine oder mehrere der Strukturblenden (101 ) in Bezug auf die Rotationsachse (17) radial divergierende Linienstrukturen aufweist oder aufweisen und/oder zumindest zwei der Strukturblenden (102a-102c) Linien- strukturen aufweisen, die Kreisbögen um die Rotationsachse (17) folgen und radial zueinander versetzt sind. (1) is formed with a wide-field incident light unit (10), with a rotation axis (17), characterized in that the aperture wheel (100) carries one or more structural apertures (101, 102a-102c), which structuring by areas - 3 - lower and formed as a line structures areas of higher light transmittance, wherein one or more of the structural apertures (101) with respect to the axis of rotation (17) radially diverging line structures or have and / or at least two of the structural apertures (102a-102c) line have structures that follow circular arcs about the axis of rotation (17) and are radially offset from each other.
12. Mikroskopieverfahren, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroskop (1 ) nach einem der Ansprüche 1 bis 10 verwendet wird. 12. microscopy method, characterized in that a microscope (1) according to one of claims 1 to 10 is used.
13. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 12, das umfasst, das Blendenrad (100) in den zwei oder mehr Winkelstellungen zu positionieren, durch Beleuchten des Blendenrads (100) mittels der Lichtquelle (13) der Weitfeld-Auflichteinheit (10) bei den zwei oder mehr Winkelstellungen die durch Rotation oder Translation zumin- dest teilweise ineinander überführbaren Beleuchtungsmuster in der ObjektebeneThe microscopy method of claim 12, including positioning the aperture wheel (100) in the two or more angular positions by illuminating the aperture wheel (100) by the light source (13) of the wide field incident light unit (10) at the two or more angular positions the illumination pattern in the object plane that can be at least partially converted into one another by rotation or translation
(23) des Mikroskops (1 ) zu erzeugen, und mittels der Bildaufnahmeeinheit (40) bei jeder der zwei oder mehr Winkelstellungen zumindest ein Bild aufzunehmen. (23) of the microscope (1) and to record at least one image at each of the two or more angular positions by means of the image acquisition unit (40).
14. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 13, das umfasst, die Bilder unter Verwen- dung eines Bildbearbeitungsalgorithmus zu bearbeiten. 14. The microscopy method according to claim 13, which comprises processing the images using an image processing algorithm.
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