WO2018027289A1 - Sistema e processo microfluídico para produção de nanopartículas de quitosana, nanopartícula de quitosana e uso da mesma - Google Patents

Sistema e processo microfluídico para produção de nanopartículas de quitosana, nanopartícula de quitosana e uso da mesma Download PDF

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WO2018027289A1
WO2018027289A1 PCT/BR2017/000089 BR2017000089W WO2018027289A1 WO 2018027289 A1 WO2018027289 A1 WO 2018027289A1 BR 2017000089 W BR2017000089 W BR 2017000089W WO 2018027289 A1 WO2018027289 A1 WO 2018027289A1
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chitosan
atp
nanoparticles
chi
microfluidic
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PCT/BR2017/000089
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Inventor
Lucimara Gaziola DE LA TORRE
Amanda PESSOA DA COSTA E SILVA DE NORONHA
Caroline DOS REIS CASAGRANDE SIPOLI
Ana Paula PEREIRA DUARTE
Original Assignee
Universidade Estadual De Campinas - Unicamp
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures

Definitions

  • the invention also describes the: chitosan nanoparticles obtained by said microfluidic process. Said chitosan nanoparticles hate to be employed in the medical and pharmaceutical fields, for example in nucleic acid delivery systems for gene therapy and vaccination.
  • Non-viral systems have been widely studied and employed in gene therapy because of their advantages such as high stability, high material availability and low cost.
  • nanoparticles obtained from cationic polymers because these polymers had the ability to interact electrostatically with nucleic acids, forming efficient nanoparticles in the application as non-viral gene release vectors.
  • Cationic polymeric nanoparticles can act as vectors in gene therapy from the formation of complexes with nucleic acids, called polyplexes. This association is based on the electrostatic interaction between the positively charged groups of cationic polymers and negatively charged nucleic acids, leading to charge neutralization and the compaction of genetic material. Thus, a structure with condensed nucleic acids is created that serves as a protective barrier against nucleases e.g. rnacrophages, reducing their degradation in the organism ..
  • Chitosan has aroused interest in gene therapy res because it is a biopolymer with outstanding biological characteristics such as biodegradability, low toxicity and low immunogenicity.
  • chitosan does not cause rejection of allergic reactions in living tissues and is characterized as one. polymer with excellent biocompatibility.
  • Chitosan's excellent ucohesivity is important for enhancing the ability of chitosan to penetrate epithelial cells, enabling the development of various colloidal systems with controlled release of drugs, peptides, proteins, vaccines, and DNA. Consequently, chitosan has been extensively studied for the development of nanoparticulate drug and nucleic acid release systems with therapeutic applications.
  • chitosan as a delivery system in gene therapy is attributed to its cationic character, which makes possible the electrostatic interaction of the polymer with. negatively charged nucleic acids, leading to spontaneous formation of polyplexes.
  • Microfluidics is a multidisciplinary field that uses devices that operate on the micrometer scale and process small amounts of fluids, performing continuous operation and laminar flow. Micro fluidic processes have the advantage of reproducibly generating nanopicks of physicochemical properties such as size, density index and potential arrow.
  • Microfluidic systems can be employed in different areas of research to streamline complex assay protocols, significantly reduce the volume of specimens investigated, reduce reagent costs, and offer benefits in the development and scaling of diagnostic processes. and research.
  • many advantages can be cited for the use of microfluidic devices such as flow and mixing uniformity, ease of process control and end product characteristics, high production efficiency and yield, continuous operation and low cost.
  • microfluidic platforms in the manufacture of nanopicules promotes greater reproducibility and greater control of si.st.ema parameters.
  • Microfluidics can be applied in the controlled synthesis of particles with specific morphologies and properties such as porous, metallic and inorganic, and organic particles such as liposomes and polymeric nanoparticles such as chitosan.
  • the document BR1020 ⁇ 12Q25 ⁇ H5 refers to a method based on a microfXuidic hydrodynamic focusing system that allows nanoparticles to be obtained in a single step and with refined control of the particle size of the asset.
  • the nanoparticles are obtained by a physical process of non-solvent nanoprecipitation (water ⁇ , guaranteeing particles with nanometric scale size, low polydispity and amorphous characteristic, contributing to the modification of the physicochemical properties. water or solution with erculsifying agents to favor self-organization of the nanoparticulate rifampicin molecule from the diffusion of the organic solvent into the water stream. This technique does not apply to the particle formation process from ionotropic gelation.
  • the principle of nanometer scale precipitation is ionic crosslinking from the positively charged polymer (chitosan) and negatively charged crosslinking agent.
  • chitosan positively charged polymer
  • crosslinking agent negatively charged crosslinking agent
  • the nanoparticles production process is characterized by the presence of 1001 active, which in this case is rifampicin.
  • the process of formation of this particle is accomplished by the recrystallization of the active, being that this one. It is dissolved in an organic solvent that is miscible with water.
  • the asset is then introduced into the central stream of the device and water or emulsifier solution is introduced into the side currents.
  • the organic solvent diffuses from the central stream to the side stream with water, the active tends to self-organize and form nanoarticles.
  • the central stream of the proposed invention is acidified water, while in SR102G12025445 the central stream has the particle-forming asset.
  • the purpose of the addition of the central stream is particle formation, preventing the accumulation of material at the boundary between the streams, so that the contact between the molecules is not completely direct.
  • the present invention differs from Dasbt ⁇ moghadam et al. In that it is not based on the use of lateral water currents to favor particle self-aggregation.
  • the invention utilizes a central stream of acidified water to provide balanced contact between chitosan and crosslinker by means of static elect interaction between the molecules, forming nanoparticles in reproducible processes.
  • WO201012005 relates to a system for producing nanoparticles which employs a water flow called carrier fluid in which the substance is insoluble. Thus, after contact with water, nanoparticles are formed by the nanoprecipitation method. using as a production apparatus an intravenous administration tube from a sterile intravenous infusion set.
  • the present invention differs from O201012005 mainly in that it employs a microfluidic system for chitosan nanoparticle production by the ionotropic gelation method without performing nanoprecipitation in water.
  • the invention utilizes a PDMS / glazing microfluidic device.
  • WO20071 & Q030 already refers to a micro liquid system which allows nanoparticles to be obtained by nanoprecipitation.
  • This document employs lateral water streams and a central polymer solution stream.
  • the present invention differs from O200715Q03Q mainly in that it does not employ nanoprecipitation for particle formation.
  • the invention utilizes the ionic crosslinking of polymer and crosslinker in one. same watery environment. Additionally, the present invention employs a central stream of acidified water to provide a diffusive path between the chitosan and crosslinker side streams in order to favor molecular diffusion between the water stream and nanoparticle production.
  • the present invention provides for the production of ; chitosan nanoparticles with. desirable size and polydispersity index for various medical and pharmaceutical applications.
  • the invention relates to a continuous flow microfluidic process of chitosan nanoparticle production utilizing said microfluidic system and comprises the formation of nanoparticles by ionic crosslinking with crosslinkers,
  • the invention further describes the chitosan nanoparticles obtained by said microfluidic process.
  • Microfluidic technology developed It enables the application of these chitosan nanoparticles in various areas, from agriculture, food, cosmetics to the medical field, in sustained release systems of biopharmaceuticals, including protein vetoes, anticancer agents and applications in gene therapy and vaccination.
  • Figure 1 depicts a scheme of the streams employed in a microfluidic process by applying the CHI Simple Focusing (FS) system to CPFHS Simple Hydrodynamic Focusing Device) for the production of CHI / ATP nanopicks.
  • FS CHI Simple Focusing
  • CPFHS Simple Hydrodynamic Focusing Device CPFHS Simple Hydrodynamic Focusing Device
  • C.:B: 0.5 mg / mL and Qon: - 25.
  • FIG. 3 shows the scheme of the streams employed in a microfluidic process by applying the Centrai Aqueous Current Focusing (FCAC) system to Simple Hydrodynamic Focusing Device (DFKS) for CHI / ATP nanopeak production.
  • FCAC Centrai Aqueous Current Focusing
  • DFKS Simple Hydrodynamic Focusing Device
  • the scheme shows the nomenclature used to refer to the total flow of the system (Qy), the flow rates of chitosan (QO IU ), acidified water (Qmo) and AP (QATP) the focused stream width (wt-) and final chitosan concentration after processing (dc) ⁇
  • Image (C) corresponds to the end of the microfluidic channel, length L - 3 ram from the hydrodynamic focusing region.
  • Figure 7 shows a scheme representing the geometries of the investigated microfluidic devices: [A; Simple Hydrodynamic Focusing Device (DFHS); (B) Elbow Projection Device (DPC); (C) Elbow and Barrier Projection Device (DPCB). All microchannels are 140 ⁇ m in size, except for (C) DPCB which also has 70 ⁇ m constriction regions in the microchannels.
  • DFHS Simple Hydrodynamic Focusing Device
  • DPC Elbow Projection Device
  • DPCB Elbow and Barrier Projection Device
  • Figure 9 shows the results of fluorescence assays for evaluation of dynamic mixing conditions in the three studied geometries: (a) DFHS, (B) DPC. and
  • FIG. 11 shows the comparison between microfluidic ( ⁇ > and conventional ⁇ foulk)
  • A methods for the production of CHI / ATP nanoparticles.
  • (*) represents significantly different values (p ⁇ 0.05) for the same mass ratio compared between bulk and microfluidic processes.
  • Figure 15 shows agarose gel electrophoresis (1.3%) for evaluation of DNA incorporation into CHI / ATP nanoparticles.
  • Control composed of free DNA and (DNA-) only CHI / AT particles, followed by nanoparticles of TM 1.7 complexed with 36% and 144% pDNA (w / w) and RCKJ / J-.T ? - 1.0 complexed with 363 ⁇ 4 DNA (m / m).
  • the invention further relates to a microfluidic process for chitosan nanoparticle production comprising the steps of producing polydimethylsiloxane (PD S) / glass or PDMS / PDMS microdevices, chitosan purification and production of chitosan nanoparticles through ionotropic gelation system in said microfluidic system.
  • PD S polydimethylsiloxane
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the chitosan purification step comprises dissolving the chitosan in acidic solution while stirring it, subjecting the mixture to a thermostatic bath, separating the supernatant and correcting its pH, centrifuging the precipitate, resuspending and centrifuging the precipitate to pH. near pure water, keep ultra-purified chitosan overnight and freeze the product for room temperature .
  • the chitosan nanoparticle production step comprises in the ionotropic gelation process, wherein the nanoparicules are produced by ionic crosslinking with crosslinking agent. preferably ATP, in the microfluidic devices of said microfluidic system.
  • crosslinking agent preferably ATP
  • the present invention has developed a process for producing low molar mass chitosan nanoparticles from crosslinker ionic crosslinking, preferably ad.encsine triphosphate (ATP) ⁇ where the process parameters have been evaluated. comparison with the conventional process (“buik”), as well as the influence of the concentration and the mass ratio between polymer and crosslinker to choose the best production conditions in terms of the physicochemical characteristics of the formed nanoparticles.
  • crosslinker ionic crosslinking preferably ad.encsine triphosphate (ATP)
  • the crosslinking agent comprises sodium tripolyphosphate (TPP) or adenosine triphosphate (ATP), preferably ATP.
  • the initial concentration of the chitosan side stream should be between 0.1 and 5.0 rag / mL, preferably between 0.5 and 2.5 mg / mL.
  • Central water stream should have a flow (QH20) between 20 and 90 ⁇ L / min, preferably 40 pL min and have width (wf) between 30 and 70 ⁇ , preferably 55 ⁇ m.
  • the concentration of the final chitosan stream should be between 0.1 and 0.75 mg / mL, preferably 0.14 mg / ml ..
  • the flow (QCHI) of the chitosan side stream should be between 15 and 80 ⁇ / rain, preferably 25 ⁇ L / min. While the lateral current flow (QATP) of ATE or TPP should be between 15 and 80 pL / min, preferably 25 pL / min. Total flow (QT) should be between 20 and 200 ul, / min,
  • the system should comprise a device configured to receive a central current and two side currents and not to allow the formation of the precipitate.
  • the device may be a Simple Hydrodynamic Focusing Device (DFHS).
  • the device comprises channels that do not chemically interact with chitosan or crosslinker.
  • the channels can be constructed of materials from the following: polydimethylsiloxane (PDMS). / glass or PDMS / PDMS.
  • the flow rate of the central aqueous stream is set to correspond to 12.5 to 501. of the total flow rate (QT) of the system, preferably 45%.
  • the cross-linking ratio of CHI / crosslinker (RCHI / ATP or RCHI / TPPJ ranges from 0.25 to 6.0 m / m), and when the crosslinker is ATP the mass ratio PsCHI / ATP ranges from 0.5 to 2.0 si / m.
  • the .PDMS / glass microdevices used are preferably channel sized 140 ⁇ wide and 50 ⁇ m high.
  • the microfluidic process for producing chitosan / AF nanoparticles should be by ionotropic gelation using the system as defined, whereby nanoparticles are produced by ionic crosslinking with ATP or TfP crosslinking agent, Preferably treat ATP in the non-injured microfluidic wound.
  • Chitosan nanopicks produced according to the described process have a hydrodynamic diameter of 40 to 300 nm, preferably 100 nm, polydispersity index of 0.05 to 0.4, preferably below 0.2% and potential 10 to 60 mV, preferably above 30 mV.
  • the present invention further relates to chitosan nanoparticles obtained by said microfluidic process, as. which can be used in the production of nonviral vectors aiming at their use in the gene delivery area, more specifically for gene therapy and for drug delivery and delivery.
  • the chitosan nanoparticles produced by microfluidic method were selected to investigate the incorporation of DMAp into the nanoparticles by bulk method coraplexation.
  • PDMS / glass microfluidic devices were produced by drawing the channel geometry in the appropriate program, such as AutoCAD (Autodesk), while respecting the dimensions in which the devices would be constructed.
  • AutoCAD Autodesk
  • Three geometries for the production of CHI / AT nanoparticles were studied: a device based on simple hydrodynamic focusing, as well as devices with right angle obstacles (elbows and barriers) in the microchannels.
  • the resulting microchannel PDM3 plate and the glass base were subjected to oxidation in an oxygen plasma chamber.
  • an irreversible sealing was performed, resulting in the PDMS / glass microfluidic devices.
  • the PDMS / glass microdevices used in the present invention were constructed with channel sizes of. 140 ⁇ m in width and after approximately 50 pm in height.
  • the use of the microfiuidic device favors the determination of boundaries that allow direct contact between CHI and ATP molecules, with higher local concentrations of the molecules.
  • immediate cross-linking of the chitosan molecules closest to the ATP streams is promoted, allowing rapid neutralization of CHI charges and leading to precipitation in the microfluidic channel.
  • the acidic pH of the aqueous stream is a determining factor for the success of this technique because chitosan is a pH sensitive polymer and has solubility in aqueous acidic solutions and organic acids.
  • the central aqueous stream promotes gradual diffusion between two fluids in the formation of nanoparticles.
  • the FCAC system was established as an initial hypothesis in order to explore the diffusion control of CHI and ATP molecules in order to delay their mixing and eliminate the precipitation effect on the microfluidic channel.
  • Figure 4 shows the FCAC microbiolog system ligand the same conditions previously applied to the FS system ( Figure 3>, CR I U / AT; - 0, 5, concentration of chitosan C) of the input current 0.5 mg / mL, chitosan flow rate (Qcnf) of 25 ⁇ L / min and total system flow (Q) of 90 ⁇ L / min. Under these conditions, the final chitosan concentration (Cea.) After: 0.14 mg / mL processing was the same as the previous procedure. For this system, CHI / ATP nanoparticles of approximately 85 + 15 nm in diameter, IDF of 0.10 + 0.02 and zeta potential of 13 + 1 mV were formed.
  • the aqueous central current allows the gradual transverse diffusion of the CHI and ATP molecules from the side currents between the central acidified water stream, providing lower local concentrations of the molecules during CHI / ATP contact.
  • the central aqueous stream flow rate was set to be greater than the side stream flow rate to provide a focused (-) stream width ( Figure 3) sufficient to retard mixing and avoid direct contact between CHI and ATP.
  • this diffusive pathway (w ') played by the aqueous stream probably provided a more homogeneous distribution of CHI and ATP molecules in the microfluidic channel when compared to the FS system, and established greater control of the diffusive process for nanoparticle formation. from CHI / ATP.
  • FCAC system was selected for the study of CHI / ATP nanoparticle production in a microfluidic process.
  • the contact mode between CHI and ATP currents is presented as a fundamental aspect for the formation of films, leading to the accumulation of matter in the microfluidic channel.
  • the Elbow and Barrier Projection Device has constriction-to-expansion regions resulting from barriers constructed with different microfluidic channel widths of 70 to 140 ⁇ , which may favor chaotic advection, improving the mixture. of the system.
  • Figure 8 shows that the accumulation of precipitates on devices began at a channel length from the focusing region of approximately 105 mm. for DPC, approximately 45 mm for DPCB.
  • the zeta potential of CHI / ATP nanoparticles was obtained by measuring the electrophoretic mobility velocity of charged particles from the application of an electric field through the analyzed samples, using the technique of laser anemometry. Doppler Measurements were made triplicate for each sample in. water at 25 * C using appropriate equipment.
  • results for mean diameter, polydispersity index, and zeta potential of the formed nanoparticles were expressed as the mean of the triple drops: a ⁇ standard deviation (SD ⁇ . Statistical significance was determined using the two-tailed Student's t-test with p confidence 0, 05.
  • Fluorescence assays in; roicrofluidics were performed using the dye fluorescent Sulforodami a B (molar mass 580.65 g / moi), which has a maximum wavelength absorption ( ⁇ ) of 554 nm.
  • the dye was used at a concentration of 0.1M to mimetlzar as. CHI and ATP streams, focusing a central stream of ultrapure water, for different geometries of microfluidic devices. In these tests, a central stream of ultrapure water sulforhodamine B dye side streams (0.1 m) was employed.
  • Table 1 below provides an overview with. the microfluidic devices and the different mixing conditions evaluated in this invention.
  • the preferred chitosan nanoparticles produced in DFHS for Re * i w / w? 0.5 have the following physicochemical characteristics: hydrodynamic diameter from about 60 to about 100 ran, polydispersity index from about 0.08 to about 0.12 and potentiation from about 1.1.8 to about of 14.6. From this, the process configuration selected for the state of CHI / ATP nanoparticle formation was based on the FCAC system employing DFHS.
  • low molar chitosan was dissolved at a concentration of 0.05 g / mL in 21 (v / v) acetic acid solution and was stirred for 24 h. Thereafter, the mixture was subjected to terniostatic bath at 100 ° C for 15 min to denature and precipitate possible protein contaminants, followed by centrifugation at 2287 x g for 15 min.
  • microfluidic devices arouse interest in being able to automate production processes, minimize human factors and perform uniform product synthesis.
  • the use of microfluidic technologies in nanoparticle manufacturing can promote greater reproducibility and greater control of system parameters. It therefore makes it possible to overcome obstacles in conventional nanoparticle production methods, such as processes with reproduction of particle size and structure, particle index. system polydispersity, zeta potential and fluid density.
  • (.1) is the particle number weighted average hydrodynamic diameter
  • SD represents standard deviation for triplicates indepe den ⁇ : e.s.
  • the dynamic light scattering technique is based on measuring the bright motion of particles by calculating their hydrodynamic diameter from particle diffusion in the fluid system.
  • the constant intrinsic motion of the particles causes the variation of their relative positions, leading to continuous fluctuations of the scattered light intensity.
  • pDNA percentage is related to the chitosan mass in the system
  • composition prepared for poiiplexos CH i / 1 ATR, DNA 7 with 723 ⁇ 4 (OF CHI m / m) is not described anchor along the other formulations in Table 3 due to the formation of aggregates.
  • the zeta potential can be interpreted as indicative of colloidal stability in a suspension, with dispersions with potential ze above ⁇ 30 mV being considered stable.
  • Colloidal stability is governed by weak interactions of van der Waals, which performs an attractive force for similar particles. Due to the Brownia.no movement, which causes frequent collisions between particles. those with a surface charge close to neutrality may favor a predominance of atnative forces and lead to the generation of aggregates.
  • this phenomenon may be the cause of aggregation. observed for the DNAp (72 3 ⁇ 4) -CHI / ATP complexes, because the low zeta potential of nanoparticles in. Suspension together with the high polydispersity rate of the sample may be indicative that the presence of near-neutral surface charge particles has led to the attraction and formation of aggregates.
  • Figure 15 shows the presence of subtle pDNA bands in the gel at 144% condition. ⁇ 1.7% corresponding to the permeation of unincorporated DNA through the agarose gel. This test, therefore, corroborated the condition of excess pDNA for this formulation which may also be related to the results obtained from the high polydispersity index and potential negative arrow of the formed poiiplexes. However, despite the excess concentration of DNA in its formulation, complexation with nanoparticles also resulted in a high efficiency of DNA incorporation into CHI / ATP nanoparticles. 94.891 ⁇ 0.85 for the pDNA (144%) -CKI / ATP polyplexes.
  • PCAC Central Waterstream Focusing
  • incorporation assays have shown that CHI / ATP nanoparticulate polypexexes have high incorporation efficiency of pDNA, enabling their use in in vitro ro transfection.

Abstract

A presente invenção descreve um sistema microfluidico para produção de nanoparticulas de quitosana, em que este é um sistema microfluídico que compreende um dispositivo de focalização hidrodinâmica que emprega uma corrente central de água acidificada e duas correntes laterais compostas por quitosana e por agente de reticulaçâo, separadamente. A invenção descreve, ainda, um processo microfluídíco para produção de nanoparticulas de quitosana que compreende através da gelificação ionotrópica utilizando o referido sistema microfluídico, bem como à nanoparticula de quitosana obtída pelo referido processo microfluídico e seu uso na produção de vetores não virais para liberação gênica (gene delivery), mais especificamente para terapia gênica e para veiculação e liberação de fármacos.

Description

SISTEMA E PROCESSO MICROFLUÍOICO PA A PRODUÇÃO DE NANGPARTÍCUIAS' DE QUITOSANA.,. NANOPARTÍCULA DE QUITOSANA E
USO DA MESMA
Campo da Invenção :
[001] A invenção ora descrita se insere no campo da engenharia química, particularmente aplicada à nanobiotecnologia, e descreve um sistema microfluidico para produção de nanopartícuias de quitosana, bem como um processo microfluidico era regime continuo para produção de nanopartícuias de quitosana que emprega o referido sistema.
[002] Adicionalmente, a invenção descreve também as: nanopartícuias de quitosana obtidas pelo referido processo microfluidico . As referidas nanopartícuias de quitosana odeia ser empregadas nas áreas médicas e farmacêuticas, por exemplo, em sistemas de liberação de ácidos nuclèicos para terapia e vacinação gênica .
Funâsm&ntos da. Invenção :
[003] A técnica de terapia gênica vem sendo muito explorada visando o tratamento e a prevenção de doenças. Esta técnica se refere basicamente à transmissão de material genético para células e órgâos-alvo com um consequente expressão gênica terapêutica de interesse. Porém, o sucesso dessa técnica é limitado pela dificuldade da transfecçâo celular, ou seja, da entrega do gene de interesse no interior das céiuias-alvo . Um importante fator limítante para essa aplicação é a susceptibilidade dos ácidos nuclèicos livres a digestão enzimática por nucleases no organismo do paciente.
[004] Assim, tornou-se necessário o desenvolvimento de .sistemas de liberação de ácidos nuclèicos com capacidade de proteção do DNA e elevada eficiência de transfecçao. Os sistemas não virais têm sido amplamente estudados e empregados na terapia gênica por apresentarem vantagens co o alta estabilidade, grande disponibilidade de materiais e baixe custo. Dentre esses sistemas, pode-se destacar a aplicação de: nanoparticulas obtidas de polímeros ca tiónicos , pois estes polímeros apresentara a capacidade de interagir eletrostatícamente cora os ácidos nucléicos, formando nanoparticulas eficientes na aplicação como vetores não virais de liberação gênica.
[005] Nanoparticulas poliméricas catiônicas podem agir como vetores na terapia gênica a partir da formação de complexos com os ácidos nucléicos, denominados poliplexos. Essa associ ção se baseia na interação el trostática en re os grupos carregados positi amente dos polímeros cat iónicos e os ácidos nucléicos, carregados negativamente, levando è neutraliaação de cargas e à compactação do material genético. Logo, cria-se um estrutura com os ácidos nucléicos condensados que serve como barreira protetora contra nucleases e. rnacrófagos, reduzindo sua degradação no organismo..
[006] Muitos polímeros cat iónicos vêm sendo estudado quanto à aplicação em terapia gênica, como a polilisina (PLL), a polietilenoimina (PEI), o polietilenogí ícol ;PEG) e a quitosaria (CHI) . A PLL é um polipeptideo biodegradável, capaz de condensar DNA em nanoparticulas positivamente carregadas, porém, após 30: anos sendo amplamente estudada e utilizada, tem se mostrado tóxica para as células, reduzindo sua aplicação: em terapia gênica. A PEI, um polímero catiônico sintético, é considerada um dos vetores poliméricas mais eficientes, pois possui uma alta densidade de grupos a ina capazes de absorver ótons è medida que o pfí diminui, conferindo às nanopartieulas u a capacidade de ta ponamento e levando a uma maior eficiência de transfecção. O PEG é um polímero hidrofílico bastante empregado na conjugação com quitosana e outras nanoparticulas, com o objetivo de aumenta a estabilidade, solubilidade e bioeompatibilidade das partículas formadas.
[007] A quitosana {CHI) tem despertado interesse na res da terapia gênica por ser um biopolí ero com características biológicas que se destacam, como biodegradabilidade, baixa toxicidade e baixa imunogenícidade . Além disso, a quitosana não ocasiona rejeição cu reações alérgicas em tecidos vivos, sendo caracterizada como um. polímero com excelente bi oc©rapatibi1ídade .
[008] A excelente ucoadesividade da quitosana e importante por aumentar a capacidade da quitosana em penetrar por e t e: as célula epiteliais, viabilizando o desenvolvimento de diversos sistemas coloidais cie liberação controlada de fármacos, peptideos, proteínas, vacinas e DNA. Consequentemente, a quitosana tem sido extensivamente estudada quanto ao desenvolvimento de sistemas nanoparticulados para liberação de fármacos e ácidos nucieicos com aplicações terapêuticas.
[009] O potenciai da quitosana como um sistema de veiculação em terapia gênica é atribuído a seu carát.er catíônico, o que torna possível a interação eletrostática do polímero com. os ácidos nucieicos negativamente carregados, levando à formação espontânea de poliplexos. O interesse no desenvolvimento de sistemas nanoparticulados de quitosana, quando comparado ao polímero em sua forma nativa, é. motivado ainda pelo fato de possibilitar a formação de um polímero menor, mais compacto e menos imunogênico, ampliand sua a licabilidade cientifica .
[010] A produção de nanopartículas de quitosana pode ser realizada por diferentes métodos, sendo a gelificação ionotrópica um dos mais aplicados. Esta técnica envolve a reticulação iônica do polímero através de ínteraçâo eietrostática com polieletrólítos de ícns de carga oposta, como os poliSnions tripoiífosfato de sódio (TPP) e adenosina trí fosfato (ATP) , empregados como agentes de reticulação da qui tosana .
[011] Messe método, a quitosana ê dissolvida em solução aquosa ácida e é misturada à solução de ret icul ante , levando a completação entre as espécies de cargas oposta e a formação de icro/nanopartí cuias esféricas de quitosana carregadas positivamente. Além da formação espontâne das partículas1 poiíméricas, outra vantagem desse método é que a reação ocorre em meio aquoso, evitando o emprego de solventes orgânico .
[012] Para aplicações de nanopartículas de quitosana em transfecções in vit.ro, fatores como o, tamanho, a polidispersidade e o potencial zeta são fundamentais para garantir a condição ideai para a entrada de poli.plexos CKI- DNA nas células. Uma alternativa promissora para um maior controle sobre o processo de produção de nanopartículas de quitosana é a área de micrcfiuidíca .
[013] Quando comparada às técnicas convencionais, utilização de dispositivos mícrofluídicos para a síntese de partículas possibilita avanços tecnológicos no emprego de métodos novos e aperfeiçoados para sua produção. A microfiuidica é um campo multidisciplinar que utiliza dispositivos que operam na escala micr©métrica e processam pequenas quantidades de fluidos, realizando a operação em regime contínuo e escoamento em regime laminar. Os processos micro fluídicos possuem a vantagem de gerar nanopa tícuias de propriedades físicc-quimicas de forma reprodutível, como tamanho, índice de pclidi spersídade e potencial seta.
[014] Qs sistemas microfiuíciicos podem ser empregados era diferentes áreas de pesquisa com o obietivo de agilizar o s protocolos de ensaios complexos, reduzir significantemente o volume de amostras investigadas, reduz r o custo comi reagentes e oferece benefícios no desenvolvimento e no escalonamento de processos de diagnóstico e de pesquisa. Além disso, muitas vantagens podem ser citadas quanto ao uso de dispositivos microfluídicos, como uniformização do fluxo e da mistura, facilidade de controle do processo e das características do produto final, alta eficiência e rendimento de produção, operação contínua e baixo custo.
[015] A utilização de sistemas de focalização hidrodinâmica, por exemplo, possibilita o aperfeiçoamento da mistura e promove parâmetros .teacionais homogéneos . Nesse sistema, a solução central é focalizada por correntes laterais, o que diminui o comprimento de difusão que ocorre em torno da corrente central, resultando em mistura- mais rápida e na formação de partículas e poliplexos mais homogéneos ,
[016] O emprego de plataformas microfluídicas na fabricação de nanopa ticulas promove maior reprodutibilidade e maior controle dos parâmetros do si.st.ema. A microfluídica pode ser aplicada na síntese controlada de partículas com morfologias e propriedades especificas, tais como partículas porosas, metálicas e inorgânicas, e orgânicas, como lipos omas e nanoparticulas poiiméricas, como quitosana.
[017] Tendo em vista os recentes estudos na área de produção de nanoparticulas de quitosana envolvendo microfl idica, torna-se evidente que. essa tecnologia apresenta um grande potencial a ser explorado.
Estado da técnica:
[018] Alguns documentos do estado da técnica descrevem sistemas microf luidicos baseados na utilização de focalização hidrodinâmica para síntese de nanoparticulas de quitosana. No entanto, nenhum deles se assemelha à invenção aqui proposta.
{019] 0 documento BR1020\12Q25<H5 se refere a um método baseado em um sistema microfXuidicc de focalização hidrodinâmica que permite a obtenção d nanoparticulas em uma única etapa e com ura controle refinado do tamanho de partícula do ativo. As nanoparticulas são obtidas por um processo físico de nanoprecipitação em não-solvente (água}, garantindo partículas com tamanhos em escala nanométríca, com baixo índice de polidíspe sidade e característica amorfas, contribuindo para a modificação das propriedades físico-químícas . Esse sistema utiliza correntes laterais de água ou solução com erculsificantes para. favorecer a auto- organização da molécula rifampicina em nanoparticulas a partir da difusão do solvente orgânico na corrente lateral de água. Esta técnica não se aplica ao processo de formação de partículas a partir da gelificação ionotrópica.
[020] Na presente invenção, o princípio de precipitação em escala nanométríca é a reticulação iônica a partir do polímero carregado positivamente (quitosana) e do agente reticuiante com carga negativa. No documento BR102012025445 ,
0 processo de produção das nanopartícuias se caracteriza elai presença de 1001 do ativo, que, no caso, é a rifampicina . O processo de formação desta partícula é realizado pela recristalização do ativo, sendo que este. se apresenta dissolvido em um solvente orgânico que é miscivei em água. O ativo é, então, introduzido na corrente central do dispositivo e a água ou a solução com emulsificante é introduzida nas correntes laterais. Deste modo, como o solvente orgânico se difunde da corrente central para a corrente lateral com água, o ativo tende a se auto-organizar e fo rmar nano artículas.
{021]. ft corrente centrai da invenção proposta é a água acidificada, enquanto que no SR102G12025445 a corrente central apresenta o ativo que formará a partícula. Na presente invenção, o objetivo da adição da corrente central é a formação da partícula,: evitando o acumulo de material na fronteira entre as correntes, de modo que o contato entre as moléculas não é completamente direto.
[022j O documento Yoo er. al., Síze Controlled Fabrícatio of Polyaniline ícrofibers Baseá on 3D Kydrodynairdc FOcusing Approach, Macromo! . Rapid Coramun. 2015, 36, 1272-1276, por sua vez, emprega tecnologia micro f luídica para produzir microfi ras de pclianiiina comi diâmetro de 16,2 a 39,4 utilizando duas correntes laterais de água no microdisposi t ivo . Ent etanto, essa tecnologia não é adequada para produção de partículas por gelifi.eaçáo
1 onotrópica..
[023] A presente invenção difere de Yoo et al principalmente peio fato cia utilização de água acidificada na corrente central, com o objetivo de promover a produção de partículas. O tamanho das microfib as formadas em Yoo et ai é na ordem de duas unidades de grandeza maior que as nanopartículas produzidas através do processo microfluidico da presente invenção. Além disso, o dispositivo microfluidico empregado tia presente invenção possui canais construídos em polidimetilsiloxano (PDMS) e não são utilizados capilares de vidro, como em Yoo et al.
[024] Thiele et al., Preparatíon of Monodísperse Elock Copclymer vesicles via Fla Fecusing ín Microfluidics, Langnruir 2010, 26(9), 6860-6863) estudaram o emprega de um dispositivo microfluidico para comprovar que, na focalização hidrodinâmica, as alterações nas taxas de fluxo de água e de etanol injetados nos canais, permitem obter partículas de 40 nm a 2 um de tamanho, sem etapas de processamento subsequentes de manipulação de tamanho. A água é injetada dentro dos canais laterais, para focalização hidrodinâmica da corrente alcoólica do polímero, levando a sua auto agregação em partículas. Ά invenção proposta difere desta documento principalmente pelo fato da utilização de corrente central de água acidificada entre as correntes laterais para permitir a produção de nanopartículas baseada na retícúiação iõnica entre polímero e agente reticulante, se . ocorrer o acúmulo de matéria no microcanai.
[025] O documento Dashtiraoghadam et al. , Microf iuidic sei f-assem.biy of polyieric nanoparticles with tunable compaçtness for controlled drug delivery, Poly er 54 (2013) 4&"2 a 4979)' se refere à síntese de nanopartículas de quitosana hídrefobicairiente modificada através de tecnologia microfXuidica de: focalização hidrodinâmica. Este documento emprega uma corrente central de polímero e correntes laterais de água com pH básico, A diferença de pH entre as correntes favorece a auto agregação e formação de partículas.
[026] A presente invenção difere de Dasbtímoghadam et ai p inci lmente peio fato de não se basear no emprego de correntes laterais de água para favorecer a auto agregação de partículas. A invenção utiliza uma corrente central de água acidificada para proporcionar o contato equilibrado entre a quitosana e o agente reticulante, por meio de interação elet estática entre as moléculas, formando nanoparticulas em processos reprodutíveis.
[027] O documento WO201012005 se refere a ura sistema para produzir nanoparticulas que emprega um fluxo de água denominado de fluído carreador, no qual a substância é insolúvel. Assim, após entrar em contato com a água, as nanoparticulas são formadas pelo método de nanoprecipitação. utilizando como aparato de produção um tubo de administração intravenosa proveniente de conjunto de infusão intravenosa esté il .
[028] Ά presente invenção difere de O201012005 principalmente pelo fato de empregar um sistema microfluidi co para produção de nanoparticulas de quitosana pelo método de gelif icaç-ão ionotrópica, sem realizar a nanoprecipitação em água. Além disso, a invenção utiliza ura disposi ivo microfluídico de PDMS/vidra.
[029] Já o documento WO20071&Q030 se refere a um sistema micro luidi co que permite a obtenção de nanoparticul s por nanopreci itação. Este docuirtènto emprega correntes laterais de água e uma corrente central de solução polimérica. [030] A presente invenção proposta difere do O200715Q03Q principalmente pelo fato de não empregar a nanoprecipitaçãc para formação de partículas. A invenção utiliza a retíoulação iôrxica entre polímero e agente reticulante em um. mesmo ambiente aquoso. Adicionalmente, a presente invenção emprega uma corrente central de água acidificada para proporcionar um caminho difusivo entre as correntes laterais d quitosaria e agente reticulante de forma a favorecer a difusão molecula por entre a corrente de água e a produção de nanoparticulas .
[031] Por fim, o documento Cetín et al. , Microfluidic device for synthesis of chitosan nanoparticies , Proceedirjgs of the ASME 2013 Fluida Engineering Division Summer Meeting, FE -SM2013:, Juiy 7-11, 2013, Incline Village, Nevada, USA) descreve u a simulação de um dispositivo microfluidi co para a. síntese de nanoparticulas de quitosana, onde canais com diferentes geometrias são analisados e comparados. A característica principal documento de Cetín et al... é a simulação para a mistura entre água e ácido (ACI D PLUS (+) KftTSB } , ref renciando as correntes laterais ácidas contendo quitosana e a corrente central contendo o agente reticulante em ág ua . A pz esente invenção difere dé Ceti n et a1 principalmente pelo fato de trabalha com uma corrente central de agua acidificada entre as correntes laterais de quitosana e agente reticulante, enquanto o trabalho de Cetin ei: al., não se utiliza corrente de água acidificada, é apenas estudada a mistura entre as correntes da polímero e de agente r ticulante ,
[032] Consequenteras-.nte, nenhum dos documentos do estado da técnica descreve a produção de nanoparticulas de quitosana em ura sistema raicrofluídico projetado de forma que a configuração do processo contenha uma corrente aquosa central ent e as correntes la erais cie quitosana e agen e reticulante, em que a referida corrente central aquosa controla o processo difusivo da quitosana com o agente reticulante, proporcionando a síntese de forma contínua e homogénea de nanoparticulas de quitosana COHI características uniformes, como tamanho e baixo Índice de polidispersidade. Além disso, a presente invenção possibilita a solução do problema de precipitação e acúmulo de quitosana nos canais microfluídicos .
[033] Além disso, a presente invenção provê- a produção de; nanoparticulas de quitosana com. tamanho e índice de polidispersidade desejáveis para diversas aplicações médicas e farmacêuticas .
Breye descrição da invenção:
[034] A invenção se refere a um sistema microfluidico para a produção de nanoparticulas de quitosana que compreende um dispositivo de focalização hidrodinâmica que emprega uma corrente centrai de água acidificada e duas correntes laterais compostas po quitosana e por agente reticulante,
[035] Adicionalmente, a invenção se refer a um processo microfluidico de produção em regime contínuo de nanoparticulas de quitosana que utiliza o referido sistema microfluidico e compreende a formação das nanoparticulas através de retículação íôníca com agentes reticulantes ,
[036] Além disso, a invenção descreve ainda as nanoparticulas de quitosana obtidas através do referido processo microfluidico .
[037] A tecnologia microfluídica desenvolvida possibilita a aplicação dessas nanoparticuias de quitosana em várias áreas, desde a agrícola, alimentos, cosmética, atè a área médica, em sistemas de liberação sustentada de biofârmacos, incluindo vetares de proteínas, de agentes anticancerígenos e aplicações em terapia e vacinação gênicas.
Rreve descrição das figuras:
[038] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.
[039] A Figura 1 descreve um esquema das correntes empregadas em processo raicrofluídico aplicando o sistema de Focalização Simples de CHI (FS) em Dispositivo de Focalização Hidrodinâmica Simples CPFHS ) para produção de nanopa ticuias de CHI /ATP.
[040] A Figura 2 mostra imagens de microscópio (aumento de lOx) de formação de filmes CHI/ATF resultante da focalização simples de uma corrente central de quitosana (C.:B: = 0, 5 mg/mL e Qon: - 25 pL/min} por duas correntes laterais de ATP (Cw - 0, 38 mg/mL e Q/.-PF- = 32, 5 }iL/min), para C:;EI - 0, 5. As imagens foram realizadas em diferentes tempos, a saber, (A) t=0, (B) t~3 min, (C) t*7 min e, (D) t=10 min e as barras de escala co espondem a 100 μπι,
[041] A Figura 3 mestra o esquema das correntes empregadas em processo microfluídico aplicando o sistema de Focalização com Corrente Aquosa Centrai (FCAC) em Dispositivo de Focalização Hidrodinâmica Simples (DFKS) para produção de nanopa ticuias de CHI/ATP. O esquema apresenta a nomenclatura utilizada para referenciar a vazão total do sistema í.Q.y) , as vazões das correntes de quitosana (QOÍU) , água acidificada {Qmo) e A P (QATP) a largura da corrente focalizada (wt-) e a concentração final de quitosana apôs processamento (dc ) ·
[042] A Figura 4 mostra imagens de microscópio (aumento de IGx) do processo de produção de nanopartioulas de CHI/ATP através do sistema FCAC para Ra Mr;- = 0, 5, cora representação das correntes aplicadas, obtidas em diferentes tempos de processo: (A) t~0; (B) e (C) t~10 min, A imagem (C) corresponde ao fim do canal microfluídico, com comprimento de L - 3 ram a partir da região de focalização hidrodinâmica. Sistema FCAC realizando a focalização de corrente aquosa central :( QHCO = 40 ;aL/min e pH: 4, 0) por correntes laterais de CHI (Ceio « 0, 5 mg /ml e QCHS ~ 25 μΐ,/min) e ATP fC??t- = 1, 0 lug/mL e QAO - 25 yL rain.) . As barras de escala correspondem a 100 um.
[043] A Figura 5 mostra a influência da razão entre taxas de fluxo ( FRR) no Diâmetro (A) e PDI (□) das nanoparticulas de CHI /ATP formadas em sistema FCAC. Para todas as FRR estudadas, a relação raássica CHI /A P (R ! ;■..?? - 0, 5 ) e a concentração final de CHI (Cf ! := 0, 14 mg/mL) após processamento foram mantidas constantes- (*) representa valores: de diâmetro significativamente diferentes (p<0, 05} quando comparados à condição de FRR - 1, 3. As barras de erro correspondem ao desvio padrão de tripiicatas independentes.
[044] A Figura 6 mostra imagens de microscópio (aumento lOx) de formação: de filmes CHI / TP obtidas após 10 min de processamento, para o sistema FCAC para R ÍÍÍ ΑΪ? d 0, 5, para as razões entre taxas de fluxo de (A) FRR = 8, 0 (QH. O = 10 μΐ/min e Q.;:^ = Q?,rt- - 40 pL/min) e (B! FRR - 17, 0 (Q.;, - = 5 uL/mí.n e fc : = GÂI ~ 42, 5 pL/rnin) . As barras de escala 201
14/56 correspondem a 100 μηι,
[045] A Figura 7 mostra um esquema representando as geometrias dos dispositivos microfluidicos investigados: [A; Dispositivo de Focalização Hidrodinâmica Simples (DFHS); (B) Dispositivo com Projeção de Cotovelos (DPC) ; (C) Dispositivo com Projeção de Cotovelos e Barreiras (DPCB) . Todos os microcanais apresentam dimensões de 140 um, exoeto para (C) DPCB que também possui regiões de constrição de 70 um nos microcanais .
[046] A Figura 8 mostra o acúmulo de precipitados nos canais microfluidicos durante o processo de produção de nancparticul.as de CHI /A P para RÇ-H f ATF de 0,5 pelo sistema PCftC para: (A) e (B) Dispositivo com Projeção de Cotovelos (DPC); (C) e (D) Dispositivo com Projeção de Cotovelos e Barreiras íDPCB) . Imagens de microscópio dos canais microfluidicos obtidas em diferentes tempos: (Α· e (C) t-0
(B) e (D) t-15 min. Condições de FRR - 1,3: focalização de corrente aquosa central ÍQ»:O; = 40 uL/min e pH 4,0) por correntes laterais de CHI (Crni = 0,5 mg/mL e Q ; = 25 pL/min) e ATP ÍC¾r - 1,0 mg/mL e QATÍ- - 25 μΐ,/min) . As barras de escala correspondem a 100 pm.
1047] A Figura 9 mostra os resultados de ensaios de fluorescência para avaliação das condições dinâmicas de mistura nas três geometrias estudadas: (a) DFHS, (B) DPC. e
(C) DPCB. Os comprimentos de canal referentes a cada imagem, estão apresentados na figura. O processo consistiu na focalização hidrodinâmica de corrente central de água acidificada (Q;J ~ 40 pL/min) por duas correntes laterais do corante sulforodamina B ÍQR V - 25 μη/πύη) .
[048] A Figura 10 mostra a influencia cia concentração de quitosana e ATP ( Q ti j - krp ~ 25 L/min) na formação de nanoparticuias de CHI / por processo microfluidico, empregando sistema de focalização cora corrente aquosa central (QH.K> ~ 40 μΐ,/min} . As condições RUU/.M c ~ 0,5 e C.-«r ~ 0,5 mg/mL,* Kc-;;.c/Arí? - 1/0 Ce w s - 1,0 mg/mL; :,¾··;>■ := 1,5 e .Co s..': - 1,5 mg/mL, correspondem às nanoparticuias referentes à utilização de G¾T<? - 1,0 mg/mL, também estudadas posteriormente na Figura 11. (+ ) representa valores significativamente diferentes (p<0,05) entre os pares.
[049] A Figura 11 mostra a comparação entre os métodos microf luidico (·> e convencional {foulk) ( A ) para a produção de nanoparticuias de CHI/ATP. Caracte ização fisico-quimica quanto a: (a) Diâmetro hidrodinâmico, (b) índice de Pclidí spersidatíe e (c) Potenciai Zeta. Para todas as relações mássicas, as nanoparticuias: de CHI /ATP foram produzidas por sistema microfluidico FCAC em dispositivo DFI-iS empregando Qr = 40 ΐί/κιίη e QCH.Í = QKÍV - 25 p:L/min, variando--se nas correntes de entrada a concentração de quitosana em função da concentração de ATP fixa em 1,0 mg/mL. As barras de erros correspondem ao desvio padrão de triplieatas independentes. (*) representa valores signi icativamente diferentes (p<0,05) para uma mesma relação mássica comparados entre os processos bulk e microfluidico■■·
[050] A Figura 12 mostra a distribuição de tamanho por intensidade e número de nanoparticuias de CHI /ATP para relações mássicas de: (a) RCHI/JVTP = 1,0 e (b) R;:B :,¾-[■? = 1,7. Nanoparticuias de CHI/ATP produzidas por sistema microfluidico FCAC em dispositivo DFHS empregando A:Ú ~ 40 μΐ/min e Q -:: - QATÍ - 25 pL/min. As linhas representam dist ribuições de tamanho para três experimentos independentes .
[051] A Figura 13 mostra imagens obtidas por microscopia eietrônica de transmissão ΪΜΕΤ) , operando a 60 kV e. com magnificação de lGO.OOQx, das nanoparticulas d CHI /ATP formadas para as relações mássicas: (A-C) R ÍU/A-Í = 1,00; (D- F) R ÍU T;- - 1,7. Nanopa rticulas de CHI /ATP produzidas por sistema microfluidico FCAC em DFHS empregando Qs>o = 40 pL/min e QCKX = Q«TÍ ~ 25 pL/min. As imagens representam nanoparticulas de CHI/ATP cie tripiicatas independentes. As barras de escala correspondem s 200 nm.
[052] A Figura 14 mostra os: perfis de distribu ção de tamanho- por espalhamento de luz dinâmico, para intensidade e número de partículas dos pcliplexos formados por: (a] RCKX/ATP = 1,0 e DNAp ( 36% ) -CHI /ATP ; íb) , HX/ATP = 1,7 e DNAp. (36%) -CHI/ATP; (c) R,:HWTT = 1,7 e DNAp ( 144 %} -CHI/ATP . As linhas representam distribuições de tamanho para três experimentos independentes .
[053] A Figura 15 mostra a eletroforese em gel de agarose (1,3%) para avaliação da incorporação de DNA nas nanoparticulas de CHI /ATP. Controle ( DNA +) composto por DNA livre e (DNA-) somente partículas CHI /AT , seguidos par nanopa ticulas de
Figure imgf000018_0001
™ 1,7 complexadas com 36% e 144% de DNAp (m/m) e por nanoparticulas de RCKJ/J-.T? - 1,0 complexadas com 36¾ DNA (m/m) .
Descz-lção detalhada, da Invenção :
[054] A invenção se refere a ura sistema, microfluidico para produção de nanopa ticulas de quitosana que compreende focalização hidrodinâmica, na qual urna corrente central composta por água ultrapura acidificada è hidrodinamica ente comprimida por duas correntes laterais compostas por soluções de quitosana e agente de reticulação, tal como TPP ou ATP, separadamente. formação de nanoparticulas é monitorada em microscópio invertido, cóin o emprego de bombas seringas .
[055] No sistema microfluidico para produção de nanoparticulas de quitosana, foi avaliada a dinâmica de mistura no processo microfluidico d produção de nanoparticulas de quitosana para investigar a melhor configuração do processo.
[056] A invenção se refere, ainda, a um processo microfluidico para produção de nanoparticulas de quitosana que compreende as etapas de produção dos microdispositivos de polidimetilsiloxano ÍPD S) /vidro ou PDMS/PDMS, purificação da quitosana e produção das nanoparticulas de quitosana através de gelificação ionotrópicá no referido sistema microfluidico .
[Q57] A etapa de produção dos mic odispositivos de PDMS/vidro ou PDMS/PD S compreende desenhar a geometria dos canais, imprimir os desenhos projetadús, construir a máscara e empregar a máscara no processo de litografi macia para construção de microdispositivos de PDMS/vidro ou PDMS/PDMS, submeter a placa resultante à oxidação em câmara de plasma de oxigénio e realizar uma selagem irreversível .
[058] A etapa de purificação de quitosana compreende dissolver a quitosana em solução ácida mantendo--a sob agitação, submeter a mistura a um banho termostático, separar o sobrenadante e corrigir seu pH, centrifugar o precipitado, r¾ssuspender e centrifugar o precipitado até pH próximo ao da água pura, manter a quitosana purificada em ultra-f eezer overnight e iiofilizar o produto para armazenamento em temperatura ambiente .
[059] A etapa de produção de nanopartículas de quitosana compreende no processo de gelificação ionotrópica, em que as nanopar ticula.s são produzidas por reticuiação iônica com agente reticulante,. preferencialmente ATP, nos dispositivos mxcrofluidicos do referido sistema raicrofluídico .
[060] Neste sentido, a presente invenção desenvolveu um processo de produção: de nanopartículas de quitosana de baix massa molar a partir da reticuiação iônica com agente reticulante, preferencialmente, ad.encsina trifosfato (ATP) < onde foram avaliados os parâmetros de processo em comparação com o processo convencional ("buik") , bem como a influência da concentração e da relação mássica entre polímero e agente reticulante para escolha das melhores condições de produção em termos de características £isico-químícas das nanopartículas formadas .
[061] No sistema da presente invenção a corrente centrai de água compreende água ultrapura acidificada, em que o pí-I da mesma é entre 4 e 6, pre erencialmente 4.
[062] O agente de reticuiação compreende tripolifosfato de sódio (TPP) ou adenosina trifosfato (ATP), prefe eneia 1mente ATP .
[063] A concentração inicial da corrente lateral de quitosana, deve estar entre 0,1 e 5,0 rag/mL, preferencialmente entre 0, 5 e 2,5 mg/mL.
[064] corrente central de água deve ter fluxo (QH20) entre 20 e 90 uL/min, preferencia Imente 40 pL mín e ter largura (wf) entre 30 e 70 μτη, preferencialmente 55 um.
[065] A concentração da corrente final de quitosana, deve estar entre 0,1 e 0,75 mg/mL, preferencialmente 0,14 mg/ml..
[066] A concentração da corrente lateral cie ATP ou TPP,. deve estar entre 0,1 e 5,0 mg/mL, preferencialmente 1,0
[067] O fluxo (QCHI) da corrente lateral de quitosana, deve estar entre 15 e 80 μΐ,/rain, preferencialmente 25 liL/rnin. Enquanto o fluxo (QATP) da corrente lateral d ATE ou TPP, deve estar entre 15 e 80 pL/min, preferencialmente 25 pL/min. A vazão total (QT) deve estar entre 20 e 200 ul,/min,
[ 0 81 O sistema, deve compreender um dispositivo configurado para receber uma corrente centrai e duas correntes laterais e não permitir a formação do precipitado. Sendo que o dispositivo pode ser ura Dispositivo de Focalização Hidrodinâmica Simples (DFHS ) .
[069] O dispositivo compreende canais que não interagem quimicamente com quitosana ou agente reticulante. Sendo que os canais podem ser construídos de materiais dentre os seguintes: polidimetilsiloxano ÍPDMS). /vidro ou PDMS/PDMS.
[070] A vazão da corrente aquosa central é estabelecida para corresponder entre 12,5 a 501. da vazão total (QT) do sistema, preferencialmente 45%.
[071] Ά variação da razão entre taxas de fluxo (FRR) do sistema microfluídico, definida de acordo com a equação 3. , é menor ou igual a 8, prefe ivelmente de 1,3.
Qcentral Qma
[072] A relação ássica de CHI /agente reticulante (RCHI/ATP ou RCHI/TPPJ varia de 0,25 a 6, 0 m/m. Sendo que quando o agente reticulante è o ATP a relação mássica PsCHI/ATP varia entre 0,5 a 2,0 si/m.
[073] Os microdispositivos de .PDMS/vídro utilizados possuem pre rencialmente canais de dimensões de 140 μπι de largura e 50 um de altura.
[074] O processo microfluidico para produção de nanoparticulas de quitosana/A F (CHI/ATP) deve ser através de gelificação ionotropica utilizando o sistema conforme definido, sendo -que as-, nanoparticulas são produzidas por reticulação iônicá cem agente reticuiante ATP ou TfP, ρrefe rericiaimente ATP, no r ferido di spositi o microfluidico .
[075] As nanopa ticuia de quitosana, produzidas de acordo com a o processo descrito possui diâmetro hidrodinâmico de 40 a 300 nm, preferencialmente 100 na, índice de polidispersidade de 0,05 a 0,4, preferencialmente abaixo de 0,2> e potencial zeta de 10 a 60 mV, preferencialmente acima de 30 mV.
[076] A presente invenção se refere, ainda, ás nanoparticulas de quitosana obtidas pelo referido processo microfluidico , as. quais podem ser utilizadas na produção de vetores não virais visando o emprego destes na área de liberação gênica (gene delivery) , mais especificamente para terapia gênica e por ser para veiculação e liberação de fármacos .
[077] A partir da determinação das melhores condições- de processo, as nanoparticulas de quitosana produzidas por método microf luidico foram selecionadas para investigar a incorporação de DMAp nas nanoparticulas através de coraplexação por método bulk.
Exemplos Prod ção_ os microdi sposítivo.s
[078] A produção dos dispositivos m crof luidicos de PDMS/vidro foi realizada desenhando a geometria dos canais no programa apropriado, tal como o AutoCAD 'Autodesk) , respeitando as dimensões em que os dispositivos seriam construídos. Foram estudadas três geometrias para a produção de nanopartícuias de CHI /AT : dispositivo baseado em focalização hidrodinâmica simples, assim come dispositivos com obstáculos em ângulo reto (cotovelos e barreiras) nos microcanais .
[079] Sm seguida, os desenhos projetados foram impressos em fotolito e utilizados para construção da máscara. Esta, por fim, foi empregada no processo de litografia macia para a construção de microdlspositi os de PDMS/vidro.
[080·] A placa resultante de PDM3 com microcanais e a base de vidro, geralmente uma lâmina de microscopia, foram submetidas á oxidação em câmara de plasma de oxigénio. Colocando as superfícies em contato imediatamente após o tratamento com plasma, reaiizou-se uma selagem irreversível, resultando nos dispositivos microfluidicos de PDMS/vidro. Os mierodísposit ivos de PDMS/vidro utilizados na presente invenção foram construídos com canais de dimensões de. Í4Q um de largura e ap oximadamente 50 pm de altura.
Configuração do sistema de produção de nanopart i cuias _de CHI /ATP
[081] Para determinar a melhor configuração de processo microfluídico quanto á composição das correntes aplicadas para a formação de nanopartícuias de CHI /A P, um sistema de Focalização Simples de quítcsana ( FS ) foi primeiramente estudado em Dispositivo de Focalização Hidrodinâmica Simples (DFHS5, coroo apresentado na Figura 1. Na referida figura, o esquema apresenta a nomenclatura utilizada para referenciar a vazão total do sistema (Q,. ) , as vazões das correntes de quitosana (Qc„r) e ATP ÍQATP) , a largura da corrente focalizada
(wr:) e a concentração final de quitosana após processamento
Sistema de Focali zação Siiaples de Quitosana
[082] Experimentos foram realizados testando o sistema de Focalização Simples (FS). de quitosana por duas correntes laterais de ATP, empregando o DFf-IS (Figura 1) , para relação mássica CHI/A P {RCHI/A?;V de 0,5.
[083] Nessa configuração de processo, entretanto, foi observada a geração de filmes nas fronteiras entre os fluxos de CHI e ATP, que se formaram na região de focalização hidrodinâmica após alguns minutos de processamento e se estenderam ao longo de todo o canal mic ofiuidico . A formação de filmes CHI /ATP ocorreu para a R HÍ/.-Í?:- de 0,5 sob as condições de concentração de quitosana (ϋ ~;) na corrente de entrada de 0,5 mg/m,L, vazão de quitosana ÍQ HI) de 25 }:L/min, vazão total do sistema íQ ) de 90 uL/min e concentração final de quitosana (CÍCH ) de 0,14 mg/mL (Figura 2).
[084] No sistema FS, a utilização do dispositivo microfiuidico: favorece a determinação de fronteiras que permitem um contato direto entre as moléculas cie CHI e ATP, com maiores concentrações locais das moléculas. Assim, promove-se a reticulaçâo imediata das moléculas de quitosana mais próximas ás correntes de ATP, permitindo uma rápida neutralização de cargas da CHI e levando à precipitação no canal microfIuidico .
[085] Dessa forma, esse sistema provavelmente proporciona uma distribuição não homogénea das moléculas, levando à interaçãc desbaianceada entre CHI e ATP e ao continuo acúmulo de precipitado nas regiões de fronteira entrç os fluxos. Observa-se, na Figura 2, a elevação da quantidade de precipitado ao longo do tempo. Este fato sugere que è medida que o ATP: e a CHI se difundem no sentido transversal ao escoamento (sentido do gradiente de concentração) , essas moléculas precisam cruzar o filme retido no microcanal e, por consequência, intensificam o processo de neutralização de cargas das moléculas retidas e levando ao acúmulo de precipitados.
[086] Outros fatores que podem influenciar nesse fenómeno são o pH ácido da quitosana (pH - 4,0), no qual as cadeias poliniéricas provavelmente apresentam u a forma mais estendida devido à repulsão elétrostática, e o cisalhamento entre as correntes de CHI e ATP proporcionado peia focalização hidrodinâmica, que pode influenciar eventualmente na disposição das cadeias poiiméricas predominantemente de forma paralela ao fluxo. Dessa forma, pressupondo que na fronteira CHI /ATP entre os fluxos a quitosana esteja em u a conformação mais estendida, o modo de contafco entre os fluidos provavelmente favorece a formação de filmes CHI /A P no sistema FS .
[OS ] Concomitantemente a formação de filmes CHI /ATP no canal microfluidico, o sistema F'S também resultou na formação de nanoparticulas de CHI/ATP. No sistema FS, a formação de nanopa icuias ocorre em processo simultâneo com a formação de filmes, devido à difusão e interação ao longo do canal das moléculas excedentes de CHI e ATP, que não acumularam nos filmes formados. [ 0 8 8 j Para o sistema apresentado na Figura 2 , de R I- .Í .-VVÍ- de 0 , 5 , as nanopar iculas de CHI /ATP formadas apresentaram aproximadamente 1 9±18. nm de diâmetro hídrodinâmico, C , 12±0 , 03 de índice de pclidispersidade e 1 2 ±1 mV de potencial zeta. Porem, devido à variabilidade do termo de acúmulo de matéria no filme CHI/ATP formado dentro do micrccanal , torna-se bastante difícil realizar o controle do processo de produção de nanoparticulas de CHI /ATP nó sistema FS . A condição de relação mássica RCH:: /.¾T;> de 0,5, por exemplo, não será mantida nesse sistema em decorrência do acúmulo das moléculas de CHI e ATP no filme precipitado. Assim, no sistema FS serão formadas partículas sem controle das c aractexistícas fi na i s .
[ 0 8 9 ] Dessa forma, essa configuração de processo não se mostrou adequada para a investigação da produção de nanoparticulas de CHI /ATP era processo microfluídico . Logo, como alternativa para eliminar a formação de precipitados, estabe.leceu~se o estudo da formação de nanoparticulas de CHI/ATP em um sistema no qual se promove o escoamento em paralelo de correntes de CHI e ATP, com a inserção de uma corrente aquosa central (pH 4) .
Sist ma de ffocalização com: Co rente Aquosa Centr l {FCAC)_
[090] Para superar a precipitação no canal microfluídico e avaliar o efeito tía mistura na produção de nanoparticulas de CHI / TP, estudou-se um sistema de Focalização com Corrente Aquosa Central (FCAC) (Figura 3 ) . Assim, a produção de nanoparticulas de CHI /ATP foi baseada n focalização hidrodinâmica de uma corrente central de água acidificada (ρΗ 4) comprimida hidrcdinamicamente por duas correntes laterais compostas por quitosana e ATP, ambas as soluções 5/56 também em ρΗ 4, em microdispositivc DFHS, como apresentado na Figura 3.
[091] O pH ácido da corrente aquosa é um fator determinante para o sucesso dessa técnica, devido á quitosana ser um polímero sensível ao pH e apresentar solubilidade em soluções aquosas ácidas e em ácidos orgânicos.
[092] A corrente aquosa central promove a difusão gradual entre dois fluidos na formação de nanopartícuias . O sistema FCAC foi estabelecido como hipótese iniciai com o objetivo de explorar o controle da difusão das moléculas de CHI e ATP, de forma a retardar sua mistura e eliminar o efeito d© precipitação no canal microf luídico .
[093] A Figura 4 apresenta o sistema FCAC inves igando as mesmas condições aplicadas anteriormente para o sistema FS (Figura 3> , de RCÍU/AT;- de 0, 5, concentração de quitosana C, ) na corrente de entrada de 0, 5 mg/raL, vazão de quitosana {Qcnf) de 25 uL/min e vasao total (Q ) do sistema de 90 uL/min. Nessas condições, a concentração final de quitosana {Ceais.) após: processamento de 0, 14 mg/mL foi a mesma do procedimento anterior. Para este sistema, foram formadas nanoparticulas de CHI /ATP de aproximadamente 85+15 nm de diâmetro, FDI de 0, 10+0, 02 e potencial zeta de 13+1 mV.
[094] Mo sistema FCAC, a corrent central aquosa permite a difusão transversal gradativa das moléculas de CHI e ATP das correntes laterais por entre a corrente centrai de água acidificada, proporcionando menores concentrações locais das moléculas durante o contato CHI /ATP . Dessa forma, torna-se possível evitar a reticulação imediata de quitosana na fronteira dos fluxos e seu consecutivo acúmulo no dispositivo microf luidico, come verificado no sistema F3 {Figura 2) . [095] No sistema FCAC,. a vazão da corrente aquosa central foi estabelecida para ser maior que a vazão das correntes laterais para proporcionar uma largura da corrente focalizada ( -.) (Figura 3) suficiente para retardar a mistura e evitar o contato diret© entre CHI e ATP. Assim, a presença desse caminho difusivo (w?) desempenhado pela corrente aquosa provavelmente proporcionou u a distribuição mais homogénea das moléculas de CHI e ATP no canal microfluidico, quando comparado ao sistema FS, e estabeleceu um maior controle do processo difusivo para a formação de nanoparticulas de CHI /ATP.
[096] Além disso, ao retardar a mistura entre CHI e ATP, há indícios de que o sistema 'FCAC favoreceu a ocorrência de associações entre CHI e ATP de forma mais balanceada e em proporções molares mais uniformes, proporcionando a formação das nanoparticulas, em detrimento à de filmes. Dessa forma, a corrente aquosa central permitiu o estabelecimento de um processo contínuo e homogéneo de produção de nanoparticulas de CHI /ATP.
[097] Portanto, observa-se que o modo de contato entre as soluções de CHI e ATP exerce papel fundamental na formação de filmes CHI /ATP.
[0 8] A partir disso, selecionou-se o sistema FCAC para o estudo da produção de nanoparticulas de CHI/ATP era processo microfluidico .
Influência da Corrente Aquosa Central no Sistema FCAC:
[0991 Conforme exposto acima, o modo de contato entre as correntes de CHI e ATP se apresenta como um aspecto fundamental para a formação de f lmes , levando ao acúmulo de matéria no canal microfluidico . Com isso, foram avaliados os efeitos cia diminuição da vazão da corrente aquosa central sobre a formação de filmes e nanopartículas de CHI. /ATP no sistema FCAC, considerando cue quanto menor a influência da corrente aquosa central, menor é o caminho difusivo (wj entre as correntes, e maior a tendência em proporcionar um modo de conta o semelhante ao sistema FS .
[100] Para essa avaliação,, foram mantidas as mesmas condições que nos procedimentos anteriores (Figura 2 e Figura 4), de R HI;¾-;'P de 0,5, Q~ = 90 uL/nrin e concentração final de quitosana após o processamento ( C fcss t ) de 0,14 mg/mL. No entanto, rliminuíu--se a vazão d corrente aquosa centrai e, para manter as condições finais de processo idênticas aos testes anteriores, as vazões e concentrações de CHI (C¾» s ) e ATP (CATE) nas correntes de entrada foram ajustadas.
[101] Logo, esse estudo envolveu a variação da razão entre taxas de fluxo do sistema mlcrofluidico, a qual pode se definida de acordo com a equação 1.
FRR - - ** *& (Equação L)
Figure imgf000029_0001
[102] Dessa forma, mantendo-se a. vazão total do sistem (QT 0 μΙ,/mir-J , a diminuição da vazão da corrente aquosa central leva a um, aumento d FRR (Figura 5) .
[103] A condição de FRR - 1,3 corresponde à condição anteriormente apresentada para o sistem FCAC (Figura 4} com a maior vazão estudada, para corrente aquosa central de Ciro - 40 uL/min sendo, focalizada por dua« correntes laterais de quitosana e ATP sob vazões de Q;:;;: - Qs?;- "~ 25 pL/mín (C.H- = 0,5 mg/mL e
Figure imgf000029_0002
~ 1, mg/mL) . Por fim, a condição de FRR - 17,0 se refere ao emprego da menor vazão estudada para a corrente aquosa central, de Q;;;:'> = 5 pL/mín e Q H; - Q.¾T ~
Figure imgf000030_0001
[104] Como é possível observar pela Figura 5, o tamanho das nanopartículas de CHI/ATP foi estatisticamente diferente da condição d maior vazão da corrente aquosa (FRR = 1,3) apenas para as condições de FRR ≥ 8,0, para as quais foram obtidas nanopartículas de diâmetros acima de 105 nm. Os resultados para potencial zeta das nanopartículas de CHI /ATP sugeriram u a diminuição com o aumento da FRR, variando de 13 para aproximadamente 11 mV para as condições de FRR ≥ 8,0, as quais apresentaram diferença estatística quando comparadas à condição de FRR - 1,3,
[105] As condições cie maior FRR correspondem ao emprego das maiores vazões para as correntes laterais e, portanto, essas condições apresentam um maior efeito de focalização hidrodinâmica no sistema, o que promove a diminuição do comprimento de difusão (wt) que ocorre em corno da corrente central, resultando em mistura mais rápida para esses sistemas. A partir disso, pode--se verificar pela Figura 6 que as condições de FRR ≥ 8, ou seja, de Q^.u ≤ 10 L/min, resultaram, na formação de filmes CHI/ATP nos microcanais . Provando o papel fundamental da corrente de água acidificada era evitar a formação de filmes e de acúmulo de precipitados no canal microfluidico
[1061 Corno consequência do aumento da FRR, a redução da largura da corrente focalizada (WÍ) leva à diminuição do tempo necessário para a. difusão das moléculas das correntes laterais por entre a corrente central. Dessa forma, a reduzida vazão da corrente central proporciona um modo de contato entre as moléculas de CHI e ATP que tende ao sistema de Focalização- Simples (FS) {Figura 2), favorecendo sua precipitação e acúmulo no sistema microfluidico - Esses fatores, portanto, podem estar relacionados á diferenç estatística encontrada quanto ao tamanho das nanoparticulas para as condições de FRR ≥ 8. corrobora-se, assim, a função da corrente aquosa central em retardar a mistura entre CHI e ATP e evitar a formação de precipitados nos microcanais .
[107] A partir disso, fixou-se o estudo da produção de nanoparticulas de CHI"/ATP em sistema FCAC empregando a condição de FRR = 1,3, para a qual se utiliza a maior vazão de água na corrente central, com o objetivo d impedir a formação de filmes e a acúmulo de matéria nos microcanais e realizar a produção de nanoparticulas de modo mais uniforme, bem como a Q? = 90 uL/min.
[108] Nessas condições, sabendo as dimensões do rnicrocanal (140 pra de largura por 50 um de altura} e a velocidade de escoamento do sistema para a condição de Q? = 90 pL/min ( ^ = 214 mm/s) pode-se calcular o número de Reynolds de trabalho para o dispositivo empregado. Conside ando a densidade e a viscosidade próximas à da água, para o DFH5 obteve-se Re = 17,5, característico de operação em regime laminar em. microcanais.
[109] Tendo em vista a influência do modo de contato entre as moléculas na precipitação de CHI e ATP em sistemas micro-flu dicos , buscou-se avaliar, em seguida, o efeito de diferentes condições de mistura na formação de nanopa ticulas de CHI/A P para o sistema FCAC, mediante o emprego de diferentes geometrias microfluídicas .
Avaliação das Condições de Mistura no sistema FCAC
[110] Para melhor investigar os parâmetros envolvidos na produção de nanopartícuias de CHI /ATP em microfluídica, foi realizado um estudo comparativo empregando três geometrias micror iuídicas, com o objetivo de avaliar as diferentes condições de mistura em microcanais.
[111] Logo, além. do Dispositivo de Focalização Hidrodinâmica Simples (DFHS) ante iormen e apresentado, foram construidos outros dois tipos de microdispositivos de PDMS/vidro, que serão denotados como: (i) Dispositivo com Projeção de Cotovelos (DPC) ; e (ií) Dispositivo com Projeção de Cotovelos e Barreiras (DPCB) no canal microfluidico (Figura 7) .
[112] 0 Dispositivo com Projeção de Cotovelos (DPC) (Figura 7B) foi construído com a finalidade de verificar a influência do emprego de obstáculos promotores de advecção caótica no ap imoramento da mistura de processo microf luídico de. produção de nanopartículas de CHI/ATP. A partir da projeção de cotovelos, a modificação da geometria microfluídica pode gerar componentes de fluxo transversal provenientes da advecção caótica, aumentando a área interfacial entre os fluidos e a rimorando a mistura do sistema. Assim, é possível avaliar e comparar os efeitos da mistura sobre as características fí sico-químicas finais das nanopartículas produzidas .
1113] O Dispositivo com Projeção de Cotovelos e Barreiras (DPCB) possuí regiões de constrição a expansão, decorrentes das barreiras construídas com diferentes larguras do canal microfluídico de 70 a 140 μπι, que podem favorecer a ocorrência de advecção caótica, aprimorando a mi s tura do sistema.
[114] A partir disso, a produção de nanopartículas de CHI/ATP foi investigada mantendo as mesmas condições dos estudos anteriores (.Sistema .FCAC, F'RP == 1,3, RO-Í IT ~ 0, 5;
~ 40 μΐ/min e Q.- r ::: Q.cri- ~ 25 μΐ/πύπ) para as quatro geometrias microfluidicas apresentadas .
1115] Enquanto a geometria DFHS- não resultou em precipitação (Figura 4 e. 3, respectivamente), pára os dispositivos com presença de obstáculos (DPC e DPCB 5 foi possível verificar a formação e acúmulo de precipitados ao longo dos canais microfluidlcos , como apresentado na Figura 8.
[116] Os precipitados observados para os dispositivos DPC e DPCB são relacionados aos distúrbios no escoamento provenientes dos obstáculos em ângulo reto construídos nos microcanaís, tanto os cotovelos quanto as barreiras em regadas .
[117] Logo, os obstáculos em ângulo reto empregados no DPC e DPCB podem promover a sobreposição das correntes de fluxo, propiciando um desbalanceamento das concentrações locais das moléculas e a ocorrência de interações eletrostáticas em concentrações molares descompensadas. Consequentemente, podem-se formar partículas com carga líquida próxima à neutralidade, as quais são mais propensas a precipitar no microcanal. A partir disso, com o tempo, pode-se favorecer o desenvolvimento de associações intermoleculares , entre as nanopartícuias e sua vizinhança, levando ao acúmulo de precipitados no canais microfluidicos {Figura 8B e D).
[118] A Figura 8 apresenta que o acúmulo de precipitados nos dispositivos se iniciou em um comprimento de canal, a partir da região de focalização, de ap oximadamente 105 mm para o DPC, aproximadamente 45 mm para o DPCB.
[119] A diferença referente ao comprimento de inicio da precipitação de CKI/ATP nestes dispositivos está relacionada a u a maior contribuição convectiva no DPCB devido a maior quantidade de obstáculos, aprimorando as condições de mistura e favorecendo a précipitação em um menor comprimento de canal quando comparado ao DPC.
[120] Pode-se notar, ainda, que a precipitação verificada para estes dispositivos (Figura 8) é diferente da formação de filmes observada quando empregado o sistema de focalização simples (FS) {Figura 2). Isso se deve principalmente ao modo de contatc entre CHI e ATP no sistema FCAC, no qual a corrente aquosa central propicia u contato conduzido intrinsicamente pela difusão e pela associação eletrostáti ca das moléculas. Consequentemente, evita~se a reticulação imediata de quitosana e a formação e acúmulo d.e filmes nos icrocanais .
Diâmetro Hidrodinâmico Médio e índice _ _ de
Pol i dispersidade
[121] O diâmetro hidrodinâmico médio e o índice de poiidispersidade das nanopartículas obtidas foram, medidos utilizando equipamento adequado através da técnica de espalhamento de luz dinâmico {Dy amíc Light Scat ering - DLS} . As medidas foram realizadas utilizando laser He-Ne a 633 nrc e: fonte de energia de 4,0 mW, com detecção em ângulo de espalhamento de 173" (backscatté ing) .
Pptencial Ze ta ( ζ )
[122] O potencial zeta das nanopartículas de CHI /ATP foi obtido através da medida da velocidade de mobilidade eietroforética das partículas carregadas a partir da aplicação de um campo elétrico através das amostras analisadas, utilizando a técnica de anemometría a laser. Doppler. As medidas foram realizadas era triplic ta para cada amostra, em. água a 25 *C, utilizando o equipamento adequado.
Mor fologia
[123] A morfologia das nanoparticulas de CHI/ATP foi investigada por Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) . Suportes metálicos (200 mesh; de cobre com revestimento de carbono com filme de coiódio foram expostos a urna gota de nanoparticulas de CHI /AT? por 5 min à temperatura ambiente. Uma gota de solução de acetato de uranila 1% (m/v) foi utilizada como corante negativo por 1 min e, em seguida, o excesso foi removido. As amostras foram examinadas em microscópio eletrônico de transmissão operando 3: 60 kv e aumento de 100.000 vezes. Os diâmetros médios das nanopa ticulas foram mensurados empregando o softv/are ImageJ (National Institute of Health, EUA] .
Análise Estatística
[124] Os resultados para diâmetro médio, índice de polidispersidade e potencial zeta das nanoparticulas formadas foram expressos em média das tripl cai: as ± desvio padrão (DP} . A significância estatística foi determinada empregando o teste t de Student bieaudal, com nível de confiança de p 0, 05.
Ensa los d _ Fluorescêncla
[125] Para melhor investigar as condições dinâmicas de mistura nos dispositivos mrcrofluídícos, foram realizados ensaios de fluorescência para as três geometrias.
[126] Os ensaios de fluorescência nos; cana s roicrof luidicos foram realizados empregando o corante fluorescente Sulforodami a B {Massa molar de 580,65 g/moi), o qual apresenta, absorção máxima em comprimento de onda (λ) de 554 nm. o corante foi utilizado na concentração de 0, iroM, com o objetivo de mimetlzar as. correntes de CHI e ATP, focalizando uma corrente centrai de água ultrapura, para diferentes geometrias de dispositivos microfluidí cos . Nestes ensaios, empregou-se uma corrente central de água ultrapura correntes laterais de corante sulforodamina B {0,1 m ) .
[127] Foram exploradas as mesmas condições que os ensaios previamente apresentados: Ǿ: de 90 pL/min e razão entre taxas de fluxo de FRR de 1,3. Logo, realizou-se a focalização de uma corrente aquosa central na vazão de QH20 = 40 μΐ/min por correntes laterais de sulforadamina B na vazão de Qrsot' ~ 25 pL/min. As imagens foram obtidas por microscópio de epifiuorescência e estão apresentadas na Figura 9.
[128] Pode-se verificar pela Figura 9¾ que, no DFÍIS, devido à mistura dos fluidos ser baseada predominantemente no gradiente difusivo do corante por entre a corrente central de água, foi possível verificar uma mistura parcial das moléculas de corante por entre a corrente aquosa central {Figura 9ΑΪ .
[129] Para o DPC (Figura 9B) , o ap imoramento da mistura se mostrou sutil, verifiçando-se a ocorrência de mistura completa dos fluidos a parti do comprimento de aproximadamente 105 mm, próximo à região onde se iniciou o acúmulo de precipitados {Figura 8). Messe caso, a condição dinâmica de mistura mais aprimorada que o DFHS se deve, provavelmente, às projeções de cotovelos, os quais podem proporcionar a ocorrência de choques e acarretar uma maior influência de contribuições convectivas na mistura do sistema, tanto pela velocidade de escoamento quanto pelos obstáculos do canal.
[130] Por fim, para o DPCB, foi possível observar que o caminho difusivo desempenhado pela corrente centrai de água sofreu uma redução de sua largura (w;;) a partir do momento em que os fluidos entraram na região com barreiras, evidenciando o desenvolvimento de uma mistura mais eficiente e aperfeiçoada para esse sistema. De fato, para esse sistema, considerando o maior diâmetro hidráulico do sistema devida a projeção dos obstáculos, obteve-se um. maior valor para o número de Reynolds, de Re - 26,3, sugerindo um aumento da mistura do sistema, quando comparado ao DFHS, sem causar a transição do regime laminar de escoamento. Além disso, em comprimento próximo de 45: mm, no qual foi observada a precipitação de CHI/ATP no microcanal (Figura 8), o corante se apresentava totalmente difundido no microcanal (Figura SC), sugerindo a ocorrência de uma mistura completa entre CHI e ATP a parti desse comprimento de canal microf luidíco .
[131] A partir da análise das condições dinâmicas de mistura nesses sistemas, pode-se verificar que as regiões que demonstraram apresentar uma mistura completa do corante com a corrente aquosa acarretaram n precipitação de nanopartí cuias para os dispositivos com obstáculos {DPC e DPCB) - Essas geometrias mic ofluídicas p omoveram, uma associação não homogénea e ineficaz entre as moléculas de CHI e ATP, resultando em um termo de acúmulo de matéria nesses sistemas.
[132] Assim, essa análise demonstrou que os dispositivos DPC e DPCB não foram adequados para a produção de nanoparticulas cie CHI por gelificaçâo ionotrópica com ATP devido às condições dinâmicas de mistura nesses sistemas. Por fim, o controle sobre a mistura do sistema se mostrou um fator fundamental para o sucesso do processo microfluidico de formação de nanoparticulas de quitosana.
[133] A Tabela 1 abaixo apresenta um quadro geral com. os dispositivos microfluídicos e as diferentes condições de mist ra avaliadas na presente in enção.
Tabela 1 - Quadro gerai resumindo os dispositivos microfluídicos e as condições de mistura ava 1 iadas
Figure imgf000038_0001
[134] Tendo em vista a Tabela 1, pode-se observai: que o dispositivo mais adequado para a produção de nanoparticulas de quíto&ana foi o de focalização hidrodinâmica- simples (DFHS), empregando o sistema FCAC, no qual a mistura é influenciada fortemente peia difusão das moléculas- de CHI e ATP por entre uma corrente aquosa centrai. Considerando as características físico-químicas das nanoparti cuias obtidas para este dispositivo, o sistema resultou em populações monodispersas e se mostrou apropriado para a produção de nanoparticulas de CHI /ATP em mícrof luidica . Logo, po ser uma geometria micrafluidica típica e amplamente empregada, o DFHS foi selecionado para a subsequente avaliação dos parâmetros envolvidos na produção de nanoparticulas de CHI/ATP em dispositivos microf luidícos .
[135]. Nesse sentido, as nanopar iculas de quitosana preferenciais produzidas em DFHS para Re* i p/p? de 0,5 possuem as seguintes características físi eo-químicas : diâmetro hidrodinâmica de cerca 60 a cerca de 100 ran, índice de polídispersidade de cerca de 0,08 a cerca de 0,12 e potenciai zeta de cerca de 1.1,8 a cerca de 14,6. A parti disso, a configuração de processo selecionada para o estado da formação de nanoparticulas de CHI /ATP foi baseada no sistema FCAC empregando o DFHS .
Purificação da quitosana
[136] Para a etapa de purificação, quitosana de baixa massa molar foi dissolvida na concentração de 0,05 g/mL em solução de ácido acético 21 (v/v) e foi mantida sob agitação por 24 h. Em seguida, a mistura foi submetida a banho terniostãtico a 100 °C por 15 min para desnaturar e precipitar possíveis contaminantes proteicos, seguido por centrifugação a 2287 x g por 15 min..
[137] O sobrenadante foi separado e seu pH foi corrigido 3.8/56 para 9 utilizando solução de hidróxido de sódio { aOH) (1 M) , para precipitar a quitosana da fase aquosa, e o precipitado foi centrifugado a 2237 χ g por 15 min. Posteriormente, o precipitado de quitosana foi ressuspenso em água (pH .9) e centrifugado a 2287 * g por 15 min, por duas vezes consecutivas. Esse procedimento de lavagem foi repetido utilizando água uitrapura até qu se alcançasse o pH próximo ao da água pura. A quitosana purificada foi mantida em ultra-freezer (- 86 °C) overníght e liof.1.1 izada para armazenamento em temperatura ambiente. 0 rendimento do processo de- purificação foi de aproximadamente 70% .
Produção de nanop rtlculas de qui tosana
Avaliação dos parâmetros do processo de produção de nanopartículas de CHI/ATP
[138] A partir da seleção da co-n figuração de processo microfluidico baseado na Focalização com Corrente Aquosa Central ( CAC) , empregando o DFHS, a próxima etapa foi direcionada para a avaliação dos parâmetros de processo, coroo concentração e relação mássica de quitosana e ATP. Essa etapa tem como- ofo tlvo fornecer uma visão gerai da formação de nanopartículas de CHI/ATP, de modo a possibilitar a análise, otimização e seleção das melhores condições de processo .
[139] Após a avaliação prévia das vazões de processo a serem estudadas (Figura 5), estabeleceu-se a manutenção do processo microfluidico empregando FRR = 1,3, no qual uma corrente central de água acidificada (pH 4,0) na vazão de Q;:..?o - 40 uL/raín é hidrodinamicamente comprimida por correntes laterais de CHI e ATP nas vazões de Qom ~ Q;-.^> - 25 μη/min.
Influência da concent ação de_ Q itosana na Formação de Wano aχticuias
[140] isando a determinação das concentrações de CHI e ATP a serem empregadas no processo de produção de nanoparticulas de CHI/ATP, investigou-se a influência do aumento de concentração de qui osaria- nas características fi-s co-químicas das nanoparticulas resultantes .
[1 1] Para isso, fora produzidas por processo microfluídico nanoparticulas para três relações mássicas selecionadas de RCSI STP = 0,5, 1,0 e 1,5. Para avaliar a influência da concentr ção, foram empregadas três concentrações distintas: de quitosana de Ce::: = 0,5, 1,0 e 1,5 mg/m.L e foram preparadas soluções de ATP na concent ação necessária para resultar nas relações mássicas de interesse. Para todas as condições, o processo microfluídico foi realizado- no sistem FCAC, empregando corrente central de água acidificada na vazão cie 40 pL/iuin, sendo hidrodínamicamente comprimida por correntes laterais de CHI e ATP nas vazões de 25 pL/min.
[142] Verificou-se que o aumento da concentração de quitosana no sistema acarreta em um aumento da concentração de ATP a ser empregada, de forma a manter a relação mássica estudada. Dessa forma, eleva-se a concentração total do sistema na produção de nanoparticulas para uma mesma condição de relação mássica CHI /ATP .
[143] Logo, os efeitos no tamanho, índice de pciidíspersidade e potencial zeta das nanoparticulas poderá ser compreendidos como decorrência do aumento da concentração total do sistema. As características físico- .químicas das nanoparticulas de CHI,/A P obtidas estão representadas graficamente na Figura 10. [144] Analisando a Figura 10a, ve ifica-se que o aumento da concentração total do sistema levou ao aumento do tamanho das nanopa tículas para todas: as RCHI./ÂTP estudadas. Esse aumento no tamanho das nanopartícula pode ser justificado pelas diferentes interações pol imero-polimero resultantes do aumento da concentração do sistema. O aumento da concentração também reflete em como o sistema se complexa.. Na presença de cadeias polimèricas mais interligadas, o agente reticulante- será capaz de complexar uma proporção mais alta de polimero por partícula, levando ao aumento do tamanho das nanopartículas observadas .
[145] Esse fenómeno também pode justificar o aumento do PDI (Figura 10b} em condições de mesma Ro!¾■; >;\T?r pois para. soluções mais concentradas e, consequentemente, polímeros mais associados, a compiexação entre quitosana e AT? será menos uniforme, resultando em populações mais heterogéneas. Exceto para a condição de EÍ::;.ÍVÍ;V - 1,5 e Com = 0,5 mg/mL, para a qual, devido à formação de agregados no tubo de cole a, ocorreu um aumento do PDI e, consequentemente, da heterogeneidade das nanopartículas desta condição.
[146] o potencial zeta ( Figura 10c) apresentou um incremento linear proporcional ao aumento da ΚΠ;Γ-ΛΤ", resultado esperado pelo maior conteúdo de cargas positivas de quitosana nas partículas. Porém, o aumento da concentração total cio sistema para uma mesma relação ássica revelou causar a diminuição do potencial zeta, com exceção da condição de agregação anteriormente comentada (R-H · ΥΓΓ = lr 5. C:;Í; - 0,5 mg/mL) . Essa redução do potenciai zeta também pode ser atribuída ao modo de compiexação CHI /ATP em sistemas mais concentrados. Provavelmente, o aumento da interaeão polirtierO~pcliJTie.ro pode ter levado à menor exposição das aminas protonadas provenientes da quitosana no arranjo final da nancpartícula CHI /ATP , acarretando era cargas superficiais ligeiramente inferiores .
[1.47] Os menores diâmetros encontrados para as nanoparticulas de R HÍ/STE1 = 1,0, quando comparados às
Figure imgf000043_0001
- 0,5 e 1,5, foram posteriormente confirmados com a avaliação da variação de relações mássicas na formação de nanoparticulas de CHI /ATP .
[148] Por fim, para minimizar efeitos de aumento de concentração total do sistema e possibilitar o estudo da variação das ROHÍ/¾?» na produção de nanoparticulas de CHI /A P, fixou-se a concentração de AT? em 1,0 mg/mL. A partir disso, reali zou-se um estudo comparativo quanto à produção de nanoparticulas de quitosana através dos processos microfluidico e bulk, quanto ao efeito da variação de relação más sica CHI /ATP.
Compara ão_ entre o Processo Microf1uídico e Bulk
[149] A investigação das condições de produção de nanoparticulas de CHI/AT P foi realizada fixando-se a concentração de ATP em 1,0 mg/mL e variando a concentração de entrada de quitosana de 0,25 a 2,5 mg/mL, para os processos bulk e microf luidico . Dessa forma, foram avaliadas as características f í sico-quimicas das nanoparticulas de CHI /ATP formadas entre as relações mássicas CHI/ATP (R::u /;v:v) de 0,25 a 2,5 (m/m) ,
[150] Os resultados para diâmetro hidrodinâmico médio (ponderado por número de partículas), Índice de polidispersidade (PDT) e potencial zeta das nanoparticulas produzidas estão apresentados na Figura 1.1. [151] Em geral, observa-se pela Figura 11 que os resultados obtidos para as nanopartiçulas de CHI /ATP produzidas por foulk e iar ofluidica foram bastante semelhantes. Kc entanto, pode-se destacar que a polidi.spersidade (Figura 11b) do sistema microfluidi ço se mostrou estatisticamente menor para RÇ;;Í ATP entre 1,25 e 2,0. Para o sistema microfluidico, apenas as nanopartiçulas obtidas para a maior relação mássica (RCHI/ATP = 2,5) obtiveram PDI superior a 0,3, o que pode ser verificado no processo buik a partir de R ÍÍT R F :- 1,·5. Evidencia-se, portanto, que o proce.sso microfluidico foi capaz de gerar nanopartiçulas mais homogéneas era condições de maior relação mássica CHI /A P .
[152] Esse. é um aspecto importante tendo em vista a aplicação das nanopar içulas como vetores não virais de liberação gênica, para a qual a carga superficial positiva da partícula desempenha um papel importante na adesão à membrana celular negativa. Como é possível observar peia Figura 11c, o potencial zeta das partículas aumenta proporcionalmente com o aumento da relação mássica, para ambos os processos, apresentando valores superiores a 30 mV a partir de Rrju/í rt- = 1,25. Dessa forma, para as nanopartiçulas de relações mássicas superiores R ::i/?np - 1,25 produzidas pelo processo microfluidico, os valores de PDI significativamente inferiores tornam-se fatores determinantes na seleção da melhor configuração para a produção de nanopartiçulas de CHI /ATP com características adequadas par ensaios biológicos.
[153] Quanto ao tamanho dás nanopartiçulas, pode-se observar a diminuição do diâmetro hidrodinâmico das partículas com o aumento da RCÍIÍ AI até um valor crítico em torno de 45 nm, encontrado para R u/z = 1,0, após a qual o aumenta da relação mâssica leva à geração de nanopa t iculas maiores ,
[154] 0 aumento do tamanho e a presença de aspecto leitoso para as menores relações mássicas ::UV.->T!-- foram verificados experimentalmente no presente estudo, tanto para as amostras produzidas em bulk quanto em ícrofluídica . No entanto, não foram formados agregados macroscópicos para as re1açò\es más s icas estudad s .
[155] Apesar do processo de produção de nanopartícúlas de CHI /ATP em bulk. ter se mostrado reprodutível, este método è realizado manualmente de forma pouco controlada e se basei na mistura caótica entre as moléculas de uitosaria e RT . Logo, além de estar -susceptível à experiência do operador, este processo pode levar a variações entre bateladas e depende da realização de uma metodologia bem estabelecida para garantir a reprodutibilidade do processo.
[156] Por outro lado, os dispositivos microf iuidicos despertam interesse por serem capazes de automatizar os processos de produção, mínimí zárido fatores humanos e realizando a síntese de produtos com uniformidade. Desse modo, além de permitir elevada produtividade por se tratar de ura processo contínuo, o emprego de tecnologias microfluídicas na fabricação de nanopartícúlas pode promover maior reprodutibilidade e maior controle dos parâmetros do sistema. Torna—s-β possível, portanto, a superação de obstáculos existentes nos métodos convencionais íbulk) de produção de nanopartícúlas, como processos com reprodução do tamanho e estrutura de partícula, do índice de polidispersidade, do potencial zeta e da fluidodi â ica do sistema .
[157] Portanto, os experimentos realizados demonstraram a viabilidade de produção de nanoparticulas de CHI /ATP por. processo microfluidico em dispositivo de focalização hidrodinâmica simples (DFHS) empregando o sistema de focalização cora corrente aquosa central (FC&C) .
Seleção de Nanoparticulas de CHI /A P
[1583 Após a avaliação dos parâmetros de processo para produção de nanoparticulas de CHI/ATP, foram selecionadas nanoparticulas obtidas pelo sistema microfluidico de duas relações mássicas distintas, RCHCATF - l/G e 1,7, para estudos posteriores de análise de incorporação de DNA .
[159] As partículas de R HIA CIP ~ 1, apresentaram as melhores características f isico-qu.im.icas (Tabela 2) para avaliação cie incorporação de DNA, principalmente pelo potenciai zeta elevado pelo diâmetro em uma faixa adequada para posterior liberação génica.
[160] A seleção das partículas de R?RI ;.:■;.· = 1,0 foi motivada pela realização de ura estudo comparativo quanto ao tamanho e potencial seta das nanoparticulas na formação de poliplexos DWAp-CHI/ATP . A Tabela 2 apresenta as características f ísico-quirnícas das nanoparticulas selecionadas .
Tabela 2 - Caracterização físico-química das nanoparticulas de CHI/ATP selecionadas para incorporação do D.NAp
RCHI/ΆΤΡ Diâmetro (i)
ζ (mV±DP)
(m/m) (nin±DP)
1, Q0 46, 8 ± 4, 9 0,22 ± 0,01 23,7 ± 0,6
1,70 181 ,4 ± 58, 7 0,28 ± 0,01 43,8 ± 1 , 2 Sm que:
(.1) é o .diâmetro hidrodinâmico médio ponderado por número de partículas
{DP) representa o desvio padrão para triplicatas indepe dení: e.s .
[161] Com o propósito de investigar a distribuição e tamanho obtida pela técnica de espalhamento de luz dinâmico para as duas condições de nanopsttícuias de CHI/A P selecionadas , realizou—se uma comparação entre as distribuições por intensidade e número de partículas, como apresentado na Figura 12.,
[162] A técnica de espalhamento de luz dinâmico se baseia na medida do movimento Brcwníano das partículas, calculando seu diâmetro hidrodinâmico a parti da difusão da partícula no sistema fluido. Dessa forma, o movimento constante intrínseco às partículas acarreta a variação de suas posições relativas, levando a contínuas flutuações da intensidade de luz espalhada.
[163] Além disso, como a intensidade de luz espalhada é proporcional ao diâmetro elevado à sexta potência, essa análise reflet-e principalmente na presença de partículas. No entanto, a ponderação dessa análise para dis ribuição por número de partículas, o qual é díretaraente proporcional ao diâmetro, permite a verificação das populações relevantes na solução .
[164] Dessa forma, observando as distribuições apresentadas na Figura 12, pode-se verificar que â condição de CK:■:,··?.'■·?■ - 1,0 promoveu a formação de partículas mais uniformes, tanto pela análise por i tensidade quanta por número, o que refiete no valar mais baixo de índice de polidíspersidade (Tabela 2). â condição de R-in v f = 1,7, por outro lado, apresentou a formação de maiores agregados, o que pode ser verificado peles picos em maiores diâmetros na análise por intensidade de luz espalhada, acarretando o índice de pol idispersidade mais elevado. Porém, a distribuição por número de partículas para essa condição {Figura 12b) , demonstra que a população relevante se dá em partículas na faixa de 180 nm, como descrito na Tabela 2. Análise Morfológica das Nanoparticulas de CHI /ATP
[165] Comi o objetiyo de complementar a caracterização das nanopa ticulas formadas em processo microfluídico para Rau/AT? ~ 1,0 e R HÍ ATF « 1, 1, a morfologia das nanoparticulas de CHI /ATP foi investigada por microscopia eletrênica de transmissão (MET) . Ά análise por microscopia pode fornecer informações quanto â verificação de tamanho e determinação da forma e estrutura das nanopa ticulas produzidas, como apresentado na Figura 13:.
[166} A partir da Figura 13, foi possível observar que as nanoparticulas apresentaram forma arredondada e diâmetros médio de 68,4 nm e 155,8 nm, para as relações mássicas (P.,;;.; ; ATC; de 1,0 e 1,7, respectí amente . Os diâmetros médios das nanoparticulas foram mensuradas a partir da utilização do software ImageJ. Assim, as faixas de tamanho verificadas por microscopia apresentaram uma boa correlação com os resultados obtidos por espalhamento de luz dinâmico para as referidas relações mássicas (Tabela 2) .
[167] Esta análise permitiu a verificação da morfologia predominantemente arredondada das nanoparticulas de CHI/ATP formadas pelo processo microfluídico empregando sistem FCAC e I3FHS. A partir disso, as nanoparticulas de ambas as relações mássícas foram direcionadas para a realização de ensaios de incorporação de DNAp.
Areplif ic âo_ do plasmideo
[168] A amplificação e purificação do plasmideo comercial pBGFP-Nl, DNA codificante para proteine verde fluorescente (GFP) , foi realizada conforme Radaic, Paula e Jesus (2014) e Sipoli et al . (2015b). As bactérias transformadas foram.: incubadas em meio Luria-Ber tani (LB) na presença do antibiótico de seleção: canamicina. 0 plasmideo foi isolado e purificado utilizando o kit PureLink™ HiPure Plasmid DNA Purification Kit-Maxiprep K21.00-07 ( Invit ogen,. EUA) . A concentração final de plasmideo foi determinada por espectrofotômetro a 260 nm (A260) . O nível de purificação do plasmideo foi determinado pei razão A26Q/A280 entre absorbâncias medidas a 260 nm. e 280 nm.
Preparo de oliplexos pEGFP- l-CHI/ATP
[169] As motivações para estudar a incorporação de DNA nas nanopa ticulas de quitosana abrangem vantagens oferecidas pelos carreadores catíônicos, como proteção do DNAp livre contra degradação i:n vivo, domínio sobre a carga superficial da partícula para aprimorar a iateração com superfícies biológicas e maio controle sobre o processo de liberação de ácidos nucíeicos. Além disso, os carreadores catíônicos são bastante empregados em terapia gênica devido à sua carga superficial positiva que, além de possibilitar a interação com os ácidos nucíeicos, também facilitam sua adesão à membrana celular negativa no momento da transfecção.
[170] A incorporação de DNAp em na.napa.tt ícuias de CHI /A foi investigada a partir do preparo de poliplexos pEGFP-Nl~CHI/ATP utilizando nanopart ículas de Pirc /,¾n> de 1,0 e 1,7. 0 plasmídeo pEGFP- l (330 ug mL) foi misturado às nanoparticulas de CHI/ÃTP nas proporções de 36, 72 e 144% da massa de quítosana. A. mistura foi submetida a agitação em agitador do tipo vórtex por 1 min à temperatura ambiente. Para a concentração de DNA de 144$, o volume d.e plasmídeo foi adicionado em duas etapas. A caracterização físico- quí ica dos poiiplexos foi realizada dentro de Ih após sua formação, considerando a determinação de tamanho,. índice de poiidispe sidade e potencial zeta.
Propriedades Pisico-Químicas dos Poiiplexos
[171] Após a produção das nanoparticulas de CHI/ATP em dispositivos microfluidicos e a seieção das melhores condições d processo, foram definidas as nanopa ticulas cie Reiu/AT» - 1, 0 e 1,7 (Tabela Z) para avaliação da incorporação de DNA, visando estudos subsequent-.es de transfecçâo in vitro.
[172] Esse estudo comparativo foi realizado, portanto, para avaliar a influência do tamanho inicial da partícula, índic de polidispersidade potenciai zeta canto na formação dos poiiplexos quanto em sua posterior transfecçâo. Estabelsceu-se a investigação preliminar de poiiplexos NAp- CHI/ATP formados por 36¾ de DNA, como forma de comparação.
[173] Além disso, Puscou-se investigar condições de excesso de DNA para avaliar a capacidade máxima de incorporação de DNA plas idial na formação de poiiplexos DNAp-CHI/Ά'ΤΡ . Foram investigadas as proporções de 72 e 144% de DNAp, correspondentes a concentrações superiores em duas e quatro vezes, respectivamente, à condição de 361 de DNAp. Porém, devido ao potencial zeta das nanoparticulas de R K:/;V; = 1,0 ser mais baixo, por volta de ( = 24 mV (Tabela 2), e possivelmente limitante para estudos de transfecçâo, para W
49/56 esta condição foi avaliada apenas a incorporação de 36% de DNA/CHI (m/m) , enquanto que para RCHÍ AÍJ» ~ 1,7 foram avaliadas as proporções de- 36, 72 e 1 4% de DNA ,
[174] Os polipl xos foram formados por compiexação convencional bulfc, em agitador do tipo vòrtex, entre as nanopartículas -previamente formadas em processo mícrofluídico e os plasraideos pEGFP-Nl . Mo entanto, os poliplêxos produzidos: com 72 de DNAp apresentaram formação de agregados, a qual será discutida posteriormente, e, por isso, não estão apresentados na avaliação das propriedades f1si co-químicas juntamente com os outros poliplêxos.
[175] Os perfis de distribuição de tamanho para os polipl xos DNAp-CH I /A P fo rmados com 36 e 1441 de DNAp, por intensidade e número de partículas, estão apresentados na Figura 14.
[176] Avaliando as distribuições apresentadas na Figura 14, pode- se observar que, apesar da análise por intensidade revelar flutuações para os complexos d RO».Í/A-;T - 1,7, ambos os polipl xos formados por 36% de DNA (Figura 14 a e b) resultaram em populações monodispersas pela distribuição por número de partículas. As flutuações das dist ibuições por número: de intensidade para o polrplexo formado por 144% de DNA caracteriza uma população mais polidispersa (Figura 14c) , Essas análises podem ser evidenciadas pela Tabela 3, que apresenta as propriedades físico— uímicas finais dos polipl xos formados .
Tabela 3 - Propriedades fisico-quíoiicas dos poliplêxos
DNAp-CHI/A P formados
ROUVÁ DNA Di ame t ro V lo Va lo Potenci valo
PDI+SO
Ti- P íi ϊ r-p r- ai Zeta r-p 5D/56
Figure imgf000052_0001
Em que :
(i) Porcentagem de DNAp é relacionada à massa de quitosana no sistema;
(ii) Diâmetro médio obtido por distribuição por número; :(iii) p<0,05 indica que os valores comparados .são significativamente diferentes. Formulação com 72?; DHA/CHI resuitou em formação de agregados.
[177] De acordo com a Tabela 3, pode-se observar diferentes comportamentos para as relações màssicas analisadas quanto ao tamanho dos poliplexos após a incorporação de DNAp . Isso ocorre, provavelmente, devido às distintas concentrações de quitosana e ATP nas partículas levando à ocorrência de interações diferenciadas entre quitosana e DNA.
[178] Para complexos formados por nanopaκticulas de CHI/ATP de
Figure imgf000053_0001
- 1, , foi observada a diminuição no tamanho do poliplexo para todas as concentrações de DNAp estudadas. Essa diminuição pode estar relacionada à maior concentração de quitosana e maior potenciai zeta dessas partículas, quando comparadas às de relação mas sica RCH i .- ri-- ~ 1, 0, qu conferem uma alta carga supe ficial positiva., possibilitando uma interação eletrostática mais forte entre quitos.ana e DNA. Dessa forma, o poliplexo ONA-CHI /AT.P formado: pode estar mais intrinsicamente ligado, levando à diminuição era seu tamanho.
[179] Quanto: aos poliplexos formados por CHI /A P de R;:H: Í.TÇ ~ 1,0, as condições inferiores de concentração de quitosan na partícula e de potencial zeta podem ter levado a uma interação eletrostática mais fraca entre partícula e DMA, formando poliplexos maiores e menos intrinsicamente ligados. Além disso, o ATP ei» maior concentração nessas partículas pode influenciar ern uma desestabilização das ligações entre quitosana e DNA, levando possivelmente a uma liberação mais facilitada durante a transfecção.
[ISO] Os menores valores de PDI após a complexaçáo, exceto para complexos DNA ( 1.4 %) -CHI /A P , podem apontar que a interação com o DNA resultou na formação de complexos mais homogéneos e ideais para investigação de transfecção celular. Para poliplexos preparados com 144% de DMA, o aumento no PDI pode estar relacionado ao excesso de DNAp em sua composição, que pode estar adsorvido na superfície da partícula, promovendo interações eletrostáticas entre partículas e a formação de agregados oanoparciculados, resultando em uma mistura mais heterogénea.
[181] A diminuição significativa no potencial zeta é W
decorrente da neutralização das cargas positivas das partículas apos ínteraçao com as cargas negativas dos ácidos nucieicos. Ob.serva-se que para a concentração de 361 de DNAp, ambas as partículas apresentaram dimin ição do potencial zeta, porém mantendo o políplexo resultante com carga superficial positiva. Para concentração de 144% de DNAp, no entanto, o eve-se políplexos de carga superficial negativa.
[182] Para lipossornas', carreadores catiõnicos lipídicos, a inversão do potencial zeta de acordo com a razão molar de cargas catiônícas: aniônicas (R±) é reportada no estado da técnica, em que a tendência do perfil de potencial zeta para complexos lipídicos se dá na forma de função sigraoide, para a qual existem três regiões de potencial zeta: região de potencial zeta positivo próximo ao do lipos sortia; região de isoneutralidade,: na qual ocorre a inversão do potencial zeta; e região de potencial seta negativo próximo ao do DNAp livre. Além disso, também foi reportada a ocorrência de inversão do potencial zeta para os políplexos, dependendo principalmente da relação molar entre polímero e ácido nucleico.
[183] Apresentando uma tendência semelhante, para os complexos DNAp-CHI/ATP estudados, a concentração de 144% de DNA í DNA/CHI /.m): causou a inversão de potencial zeta, provavelmente pela adsorçào de DNA excedente na superfície do políplexo, devido ao excesso de DNA em sua composição. Apesar de não obterem carga superficial positiva para interagir com a membrana negativa das células, esses complexos ainda podem ser estudados para transfecção celular, pois há indícios de que utilizarão mecanismos celulares diferenciados como os utilizados por carreadores aniônicos . [184] Como comentado anteriormente, a composição de poiiplexos preparada para CHÍ/ATR 1, 7 com 72¾ de DNA ( D A CHI m/m) não está descrita juntamente cora as outras formulações na Tabela 3 devido à formação de agregados .
[185] Todavia, os so reaadantes destes poiiplexos foram avaliados para melhor entendimento do fenómeno ocorrido. As propriedades f ísico-químicas médias obtidas foram de 156, SS ± 20, 32 nm de tamanho, índice de polidisper sidade de 0, 43 ± 0, 08 e potenciai seta de 16, 7 ± 0, 5 mV.
[186] A diminuição do tamanho do polipiexo está de acordo com o que foi observado anteriormente para as formulações com 36 e 144% de. DNA. Assim», os poiiplexos formados provavelmente resultam, de uma interaçâo eletrostática forte e estável entre CHI e DNA. Porém, observando o baixo valor de potenciai zeta das nanoparticulas remanescentes em suspensão, pode-se pressupor que a agregação dos complexas DNA (72% ) -CHI /ATP seja decorrente de uma provável instabilidade coloidal.
[187] Através do grau de atração/repnisão entre as partículas, o potencial -zeta pode ser interpretado como um indicativo de estabilidade coloidal cie uma suspensão, sendo consideradas estáveis as dispersões com potencial ze a acima de ±30 mV. A estabilidade coloidal é regida per interações fracas de van der Waals, a qual desempenha uma força de atr cão para partículas semelhantes. Devido ao movimento Brownia.no, que causa colisões frequentes entre as partículas. aquelas cora carga superficial próxima à neutralidade podem favorecer um predomínio de forças atnativas e levar à geração de agregados.
[188] Logo, esse fenómeno pode ser a causa da agregação observada para os complexos DNAp ( 72 ¾ ) -CHI/ATP, pois o baixo potencial zeta das nanoparticulas em. suspensão juntamente cora o alto índice de polidispersidacle da amostra podem ser indicativos de que a presença de partículas com carga superficial próxima à neutralidade tenha levado à atraçâo e a formação de agregados.
Eficí ê cia de Ineorporação de DNAp
1189} Para investigar melhor a capacidade das nanoparticulas de CHI/ATP de realizarem, a incorpo ação DNAp em sua estrutura, reali-zou-se o ensaio d eietroforese em gel de agaro.se. Esse teste se baseia na separação do DNAp que não foi incorporado pelas partículas, que permeia através do gel de agarose em direção ao polo positive e pode ser visualizado através do corante Brometo de Etidio, Assim, o conteúdo de DNAp que interagir com as nanoparticulas, se mantém retido no poço inicial .
[190] Os complexos analisados neste ensaio, em duplicata, foram os formados por nanoparticulas de relação m ssica CHI.ATP Βα;:/;..τ;' ~ 1,1 coro 36 e 144% de DNAp (DNA/CHI m/m.) e de Ro ,:;-;? - 1,0 com 36.1 de DNAp . Foram utilizados como controle positivo. DNAp livre e como controle -negativo- a nanopartícula CHI/ATP de Jfaaf - 1,"- A Figura 15 apresenta o resultado do ensaio de eietroforese em gel de agarose, com legenda superior identificando as amostras analisadas.
[191] Analisando a Figura 15, verifica-se que para todas as condições ocorreu uma elevada eficiência de incorporação de DNA nas nanoparticulas de CHI./ATP, dado que não foi possível observar bandas de DNA permeado entre o gel de agarose para as duas condições. As bandas foram quantificadas através do software IraageJ, resultando em eficiências de incorporação de 99, 39% ± 0,25 e 99, 70% ± 0,23 (R HI/ rt- = 1,7 6 1,0 respectivamente) para os poiiplexos compostos por 36% de DNAp.
[192] Pode-se observar pela Figura 15 a presenç de bandas sutis de DNAp no gel para a condição de 144%
Figure imgf000057_0001
~ 1,7>, correspondentes á permeação de DNA não incorporado através do gel de agarose. Este ensaio, portanto, corroborou a condição de excesso de DNAp para essa formulação o que também pode estar relacionado aos resultados obtidos de elevado índice de polidispersidadé e potencial seta negativo dos poiiplexos formados. Porém, apesar da excedente concentração de DNA em sua formulação, a complexacão com as nanopartieulas também resultou em uma elevada eficiência de incorporação de DNA nas nanopa ticulas de CHI /ATP. de 94,891 ± 0,85 para os poiiplexos DNAp ( 144% ) --CKI/ATP.
[193] Portanto, a partir dos resultados de complexação de DNA, evidencia-se que as nanopa ticulas de CHI/ATP apresentam grande potencial para utilização era transfecçào In vxtro e para posteriores aplicações em liberação génica (gene dei£ver ) , mais especificamente na área de terapia e vaci n çâo génxc ·
[194] O desenvolvimento do sistema de Focalização com Corrente Aquosa Central (PCAC). da presente invenção possibilitou a síntese controlada de nanopar icuias de CHI/ATP era microcanais cora potencial aplicação como vetores não virais de ácidos nucleicos,
[195] Foi possível realizar a produção de nanopartieulas de CHI /ATP era sistemas microfluidicos, empregando a configuração de processo FCAC e o Dispositivo de Focalização Hidrodinâmica Simples (DFHSj . Ensaios investigando a: influência da corrente aquosa central evidenciaram que o caminho difusivo desempenhado pelo fluxo central de água permitiu o controle sobre a mistura entre CHI e ATP e o estabelecimento de um processo continuo e homogéneo de produção de nanopartícuias de CHI ATP.
[196] Além disso, os ensaios de incorporação demonstraram que os poiiplexos formados por nanoparticul as de CHI/ATP apresentaram elevada eficiência de incorporação de DNAp , possibilitando sua utilização em transfecção in vit ro.
[197] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas .modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.

Claims

1/4 REIVINDICAÇÕES
1. Sistema raicrofluídico de focalização hidrodinâmica para produção de nanopartícuias de quitosana caracterizado por compreender um dispositivo que emprega, uma corrente central de água e duas correntes laterais, sendo que uma è composta por quitosana e a outra por um agente de reticulaçâo .
2. Sistema, de acordo cora a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a corrente central de água compreende água ultrapura acidificada, em que o pH da mesma é entre 4 e 6, p eferencialmente 4.
3. Sistema, de acordo com qualquer u a das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o agente de reticulaçâo compreende tripoli osfato de sódio (TPP; ou adenosina tri.fosfa.to (ATP) , preferencialmente ATP.
4. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado peio fato da concentração inicial da corrente lateral de quitosana, estar entre 0,1 e 5,0 mg/mL, ρi:e ferencia1mente e rit re 0,5 e 2 , 5 rag/m L -
5. Sistema de acordo com qualquer urna das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato da corrente central d água ter fluxo (QK;;OÍ entre 20 e 90 uL/min, preferencialmente 40 pL/min e ter largura (w.r) entre 30 e 70 um, p ef rencialmente 55 um.
6. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato da concentração da corrente finai de quitosana, estar entre 0,1 e 0,75 mg/mL, pre ferenciaI en e 0 , 1 mg/ L .
7. Sistema de acorda com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato da concentração da corrente 2/4 lateral de ATP ou TPP, estar entre 0,1 e 5,0 mg/m,L, preferencialmente 1,0 mg/mL.
8. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de. 1 a 7, caracterizado pelo fato do fluxo (Qcn;:) da corrente lateral de quitosana, estar entre 15 e 80 L/min, preferencialmente 25 pL/min,
9. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, carac srizado pelo fato do fluxo (QATF) dá corrente lateral de ATP ou TPP, estar entre 15 e 80 yL./min, preferencialmente 25 L/min.
10. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindic ções de 1 a 9, caracterizado pelo fato da vazão total ÍQr) estar entre 20 e 2.00. uL/rnin.
11. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato do dispositi o ser configurado para receber uma corrente central e duas: correntes laterais e não permitir a formação do precipitado.
12. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o dispositi o pode s r um Dispositivo de Foca 1 ização Hidrodinâmica Simples (DFHS) .
13. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 caracterizado pelo fato de que o dispositivo compreende canais que não interagem quimicamente com quitosana ou agente reticulante.
14. Sistema, de acordo com a reivindicação 13, earacterizado pelo fato de que o dispositivo compreende canais construídos de materiais dentre os seguintes: poiidimetilsiloxano (PDM5) /vidro ou PDMS/PDMS.
15. Sistema, de acordo co qualquer uma das 3/4 reivindicações de 1 a 12, caracterizado peio fato de que a vazão da corrente aquosa central (Q;Í;: ) é estabelecida para corresponder entre 12,5 a 5.0% da vazão total (.Q?). do sistema, preferenciaImen e 51.
16, Sistema/ de acordo coa qualque uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato cie que a razão entre taxas de fluxo <■ FRR) do sistema mícrofluí dico é renor ou igual a 8, preferivelmente de 1,3.
17, sisteroa, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a relação raássica de CHI /agente reticuiante (RCHT ATS* OU R HI 'TP?) varia de 0,25 a 6,0 /m.
18. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17, caracterizado pelo fato de que a relação raássica de CHI/agente reticuiante (RCHI/ATÍ- ou
Figure imgf000061_0001
para o agente reticuiante ATP varia p eferencialmente entre 0,5 a 2 , 0 m/m:.
19. Sistema, de acordo com as reivindicações 5, 15, 16, 17 e 18 caracterizado pelo fato de que os microdispositivos de PDMS/vidro utilizados possuem preferencialmente canais de dimensões de 140 pm de largura e 50 pra de altura.
2G, Processo microfluidico para produção de nanoparticulas: de quitosana caracterizado pelo fato da produção das nanopart ícuias de quitosana ser através de ge.iificação ionotrópica utilizando o sistema conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19,
21. Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a etapa de produção de nanoparticulas de quitosana/ATP (CKI/ΆΤ?) compreende a gelificação ionot ópica, em que as nanoparticulas são 4/4 produzidas por reticulação iônica com agente .reticulante ATP ou TPF, preferencialmente A P, no referido dispositivo microfluídicc .
22. Nanoparticuia de quitosana earacteriz da pelo fato de ser produzida pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.
23. Nanoparticuia de quitosana, de acordo com a rei indicação 22, caracterizada pelo fato de que possui diâmetro hidrodinamico de 40 a 300 rira, preferencialmente 100 nm, índice de polidispersidade de 0,05 a 0,4, preferencialmente abaixo de 0,2, e potencial zeta de 10 a 60 mV. prefe encialmente acima de 30 mV.
24. Uso da nanoparticuia de quitosana conforme definida em qualquer uma das reivindicações 22 ou 23, caract@r.zada por ser na produção de vetores não virais para liberação cénica íqene delivery) , mais especificamente para terapia gênica, e por ser para veiculação e liberação de fármacos.
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