WO2017221875A1 - Complex and utilization thereof - Google Patents

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WO2017221875A1
WO2017221875A1 PCT/JP2017/022494 JP2017022494W WO2017221875A1 WO 2017221875 A1 WO2017221875 A1 WO 2017221875A1 JP 2017022494 W JP2017022494 W JP 2017022494W WO 2017221875 A1 WO2017221875 A1 WO 2017221875A1
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stranded nucleic
particle
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基 大石
聡深 杉山
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国立大学法人筑波大学
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • ⁇ - ⁇ [wherein ⁇ is the same as defined in the above formula (1), and ⁇ has a base sequence complementary to the above ⁇ ′ in the above formula (1).
  • an anchorage-dependent strand exchange reaction occurs using the region of ⁇ ′ in formula (1) as a scaffold.
  • X 1 - ⁇ in formula (1) is dissociated.
  • a state in which the bond between the particle X 1 and the particle X 2 is dissociated is shown in the following formula (1-1).
  • the single-stranded nucleic acid fragments ⁇ and ⁇ ′, ⁇ and ⁇ ′, ⁇ and ⁇ ′, ⁇ and ⁇ ′ are hybridized, respectively.
  • ⁇ - ⁇ is free.
  • the abundance of the first particles is measured by irradiating excitation light and measuring the generated fluorescence with a fluorescence spectrophotometer or the like. Can do.
  • the obtained DNA (x) / PEG-gold nanoparticle solution was stored at 4 ° C. Approximately 30% of the original amount of gold nanoparticles was lost during the preparation process.

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Abstract

A complex in which a first particle is bonded to a second particle via a first nucleic acid structure, wherein the bond between the first particle and the second particle is dissociated by a scaffold dependent chain exchange reaction of the first nucleic acid structure.

Description

複合体及びその使用Complexes and uses thereof
　本発明は、複合体及びその使用に関する。より具体的には、複合体、試料中の対象核酸の検出方法及びキットに関する。本願は、２０１６年６月２２日に、日本に出願された特願２０１６－１２３９３４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。 The present invention relates to a composite and its use. More specifically, the present invention relates to a complex, a method for detecting a target nucleic acid in a sample, and a kit. This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2016-123934 filed in Japan on June 22, 2016, the contents of which are incorporated herein by reference.
　近年の分子生物学の急速な発展に伴い、疾病に関与する様々な核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の存在が明らかになりつつある。特に、タンパク質をコードしていない約２０塩基の１本鎖の非翻訳ＲＮＡであるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が、自身の配列と相補的な配列を持つｍＲＮＡの翻訳を制御していることが明らかとなっている。ｍｉＲＮＡは、癌、循環器疾患、神経系疾患を含むヒトの様々な疾患に関与していることからもその重要性が広く認識されつつある。 With the rapid development of molecular biology in recent years, the existence of various nucleic acids (DNA and RNA) involved in diseases is becoming clear. In particular, it is clear that microRNA (miRNA), which is a single-stranded untranslated RNA of about 20 bases that does not encode a protein, controls translation of mRNA having a sequence complementary to its own sequence. It has become. The importance of miRNA has been widely recognized because it is involved in various human diseases including cancer, cardiovascular diseases, and nervous system diseases.
　近年、疾患に関与するｍｉＲＮＡがエクソソーム（脂質膜で構成された大きさ３０～１００ｎｍのベシクル）に封入された状態で血中に安定に存在することが報告されている。したがって、臓器と比ベてアクセスしやすい血中からｍｉＲＮＡを高感度にその場で検出することができれば様々な疾病に対する早期診断が可能になると考えられる。 Recently, it has been reported that miRNAs involved in diseases are stably present in blood in a state of being encapsulated in exosomes (30-100 nm vesicles composed of lipid membranes). Therefore, if miRNA can be detected on the spot with high sensitivity from blood that is easier to access than organs, early diagnosis of various diseases will be possible.
　現在、血中ｍｉＲＮＡ等の対象核酸を検出する手法としては、ＲＴ－ＰＣＲ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ－Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ：逆転写－ポリメラーゼ連鎖反応）法等が用いられている（例えば非特許文献１を参照。）。 Currently, RT-PCR (ReverseTransscriptase-Polymerase Chain Reaction: reverse transcription-polymerase chain reaction) method or the like is used as a technique for detecting a target nucleic acid such as blood miRNA (see Non-patent Document 1, for example). .
　また、より簡便な対象核酸の比色検出システムとして、ＤＮＡ化金ナノ粒子を用いた手法が数多く報告されている（例えば、非特許文献２を参照。）。これらは、金ナノ粒子表面に存在するＤＮＡと対象核酸がハイブリダイゼーションすることでＤＮＡ化金ナノ粒子が凝集（架橋）し、溶液の色が赤色から紫色に変化する現象を利用したものである。また、ＤＮＡ化金ナノ粒子を用いた手法にシグナル増幅機能を付与した検出システムも報告されている（例えば、非特許文献３を参照。）。 In addition, as a simpler colorimetric detection system for target nucleic acids, a number of methods using DNA-modified gold nanoparticles have been reported (for example, see Non-Patent Document 2). These utilize the phenomenon in which DNA present on the surface of the gold nanoparticle and the target nucleic acid are hybridized to cause aggregation (crosslinking) of the DNA gold nanoparticle, and the color of the solution changes from red to purple. A detection system in which a signal amplification function is added to a technique using DNA-modified gold nanoparticles has also been reported (see, for example, Non-Patent Document 3).
　しかしながら、非特許文献１に記載の方法は、手間、時間、コストのかかる前処理（対象核酸の精製等）及び高価な装置（リアルタイムＰＣＲ装置等）が必要不可欠であり、対象核酸のその場検出には利用しにくい場合がある。また、非特許文献２に記載の方法は、検出感度が低く、対象核酸の検出限界濃度は１０ｎＭ程度である。また、非特許文献３に記載の方法は、非特許文献２に記載の方法よりも検出感度が向上し、対象核酸の検出限界濃度は０．２６ｎＭ程度であるが、検出に要する時間が極めて長く、約１２時間を要する。そこで、本発明は、対象核酸を簡便に検出する技術を提供することを目的とする。 However, the method described in Non-Patent Document 1 requires laborious, time-consuming and expensive pretreatment (such as purification of the target nucleic acid) and expensive apparatus (such as a real-time PCR apparatus), and in situ detection of the target nucleic acid. May be difficult to use. Further, the method described in Non-Patent Document 2 has low detection sensitivity, and the detection limit concentration of the target nucleic acid is about 10 nM. Further, the method described in Non-Patent Document 3 has improved detection sensitivity and the detection limit concentration of the target nucleic acid is about 0.26 nM, but the time required for detection is extremely long. , Takes about 12 hours. Then, an object of this invention is to provide the technique which detects a target nucleic acid simply.
　本発明は以下の態様を含む。
［１］第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した複合体であって、前記第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離する、複合体。
［２］前記第１の粒子が光学的に識別可能である、［１］に記載の複合体。
［３］前記第１の粒子に水溶性高分子化合物が結合している、［１］又は［２］に記載の複合体。
［４］遠心分離又は磁石を近接させることにより前記第２の粒子が凝集する、［１］～［３］のいずれかに記載の複合体。
［５］下記式（１）で表される、［１］～［４］のいずれかに記載の複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式（１）中、Ｘ１又はＸ２は一方が前記第１の粒子を表し、他方が前記第２の粒子を表し、γ及びδ’はそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、γ’は前記γと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］
［６］下記式（２）で表される、［１］～［４］のいずれかに記載の複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［式（２）中、Ｘ１、Ｘ２、γ、γ’及びδ’は前記式（１）における定義に同じであり、α及びβはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、α’及びβ’はそれぞれ前記α又は前記βと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］
［７］下記式（３）又は下記式（４）で表される、［１］～［４］のいずれかに記載の複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 ［式（３）中、Ｘ１、Ｘ２、α、α’、β、β’、γ、γ’及びδ’は前記式（２）における定義に同じであり、εはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、ε’は前記εと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ［式（４）中、Ｘ１、Ｘ２、α、α’、β、β’、γ、γ’、δ’、ε及びε’は前記式（３）における定義に同じである。］
［８］第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した複合体であって、前記第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、対象核酸が生成される、複合体。
［９］前記第１の粒子が光学的に識別可能である、［８］に記載の複合体。
［１０］前記第１の粒子に水溶性高分子化合物が結合している、［８］又は［９］に記載の複合体。
［１１］遠心分離又は磁石を近接させることにより前記第２の粒子が凝集する、［８］～［１０］のいずれかに記載の複合体。
［１２］下記式（５）で表される、［８］～［１１］のいずれかに記載の複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ［式（５）中、Ｘ１、Ｘ２、α、α’、β’、γ、γ’及びδ’は前記式（３）における定義に同じであり、δは前記δ’又と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］
［１３］下記工程（ａ）～（ｃ）を備える、試料中の対象核酸の検出方法。
　工程（ａ）：前記試料と、［１］～［７］のいずれかに記載の複合体とを含む混合液をインキュベートする工程であって、前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離する工程。
　工程（ｂ）：工程（ａ）の後に、解離した前記第２の粒子及び未反応の前記複合体を凝集させる工程であって、その結果、解離した前記第１の粒子が前記混合液中に分散する工程。
　工程（ｃ）：工程（ｂ）の後に、前記混合液中の前記第１の粒子の存在量を測定する工程であって、測定された前記存在量が前記対象核酸の存在量に対応する工程。
［１４］工程（ａ）における前記複合体が［５］～［７］のいずれかに記載の複合体であり、前記対象核酸がγ－δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片である、［１３］に記載の検出方法。
［１５］前記工程（ａ）が、前記試料と、［６］又は［７］に記載の複合体と、α－β－γ［但し、α、β、γは、前記式（３）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを含む混合液をインキュベートする工程であって、
　前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からβ－γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離する工程（ａ１）と、
　α－β－γの塩基配列を有する前記一本鎖核酸断片が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からαの塩基配列を有する一本鎖核酸及び対象核酸が解離することにより、前記第１の粒子と前記第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸が再生される工程（ａ２）とを含む、［１４］に記載の検出方法。
［１６］下記工程（ａａ）、（ｂｂ）及び（ｃｃ）を備える、試料中の対象核酸の検出方法。
　工程（ａａ）：前記試料と、［１２］に記載の複合体とを含む混合液をインキュベートする工程であって、前記混合液中で、足場依存型鎖交換反応により前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離するとともに対象核酸が増幅される工程。
　工程（ｂｂ）：工程（ａａ）の後に、解離した前記第２の粒子及び未反応の前記複合体を凝集させる工程であって、その結果、解離した前記第１の粒子が前記混合液中に分散する工程。
　工程（ｃｃ）：工程（ｂｂ）の後に、前記混合液中の前記第１の粒子の存在量を測定する工程であって、測定された前記存在量が前記対象核酸の存在量に対応する工程。
［１７］前記工程（ａａ）が、前記試料と、下記式（６）で表され、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した第１の複合体と、下記式（７）で表され、第２の核酸構造体を介して前記第１の粒子と前記第２の粒子とが結合した第２の複合体と、下記式（８）で表される第３の核酸構造体と、λ－γ－β－γ［但し、λ、β、γは、下記式（８）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを含む混合液をインキュベートする工程であって、
　前記対象核酸がγ－δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片であり、
　前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第３の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第３の核酸構造体からα－β－γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離する工程（ａａ１）と、
　α－β－γの塩基配列を有する前記一本鎖核酸断片が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からαの塩基配列を有する一本鎖核酸及びγ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離することにより、前記第１の粒子と前記第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸が生成される工程（ａａ２）と、
　λ－γ－β－γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が前記第３の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第３の核酸構造体からθ－λ－γの塩基配列を有する一本鎖核酸及び対象核酸が解離することにより、対象核酸が再生される工程（ａａ３）と、
　θ－λ－γの塩基配列を有する前記一本鎖核酸断片が前記第２の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第２の核酸構造体からθの塩基配列を有する一本鎖核酸及びγ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離することにより、前記第１の粒子と前記第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸が生成される工程（ａａ４）とを含む、［１６］に記載の検出方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 ［式（６）中、Ｘ１、Ｘ２、α、α’、β’、γ、γ’及びδ’は前記式（３）における定義に同じであり、δは前記δ’又と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 ［式（７）中、Ｘ１、Ｘ２、γ、γ’、δ及びδ’は前記式（６）における定義に同じであり、θ’及びλ’はそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、θは前記θ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 ［式（８）中、α、β、β’、γ、γ’、δ’は前記式（３）における定義に同じであり、θ及びλはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、λ’は前記λと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］
［１８］［１］～［１２］のいずれかに記載の複合体を備える、試料中の対象核酸の検出キット。
［１９］［６］又は［７］に記載の複合体と、α－β－γ［但し、α、β、γは、前記式（３）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを備え、前記対象核酸がγ－δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片である、［１８］に記載のキット。
［２０］前記式（６）で表され、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した第１の複合体と、前記式（７）で表され、第２の核酸構造体を介して前記第１の粒子と前記第２の粒子とが結合した第２の複合体と、前記式（８）で表される第３の核酸構造体と、λ－γ－β－γ［但し、λ、β、γは、前記式（８）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを備え、前記対象核酸がγ－δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片である、［１８］に記載のキット。
［２１］増感剤を更に備える、［１８］～［２０］のいずれかに記載のキット。 The present invention includes the following aspects.
[1] A complex in which a first particle and a second particle are bonded via a first nucleic acid structure, wherein the first nucleic acid structure is subjected to an anchorage-dependent strand exchange reaction, thereby A complex in which the bond between the particle and the second particle is dissociated.
[2] The composite according to [1], wherein the first particles are optically distinguishable.
[3] The complex according to [1] or [2], wherein a water-soluble polymer compound is bound to the first particles.
[4] The composite according to any one of [1] to [3], wherein the second particles are aggregated by centrifugation or bringing a magnet close to each other.
[5] The complex according to any one of [1] to [4], which is represented by the following formula (1).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 [In the formula (1), one of X 1 and X 2 represents the first particle, the other represents the second particle, and γ and δ ′ are each a single-stranded nucleic acid fragment having an arbitrary base sequence. Γ ′ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to γ. ]
[6] The complex according to any one of [1] to [4], represented by the following formula (2).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 [In the formula (2), X 1 , X 2 , γ, γ ′ and δ ′ are the same as defined in the formula (1), and α and β are single-stranded nucleic acid fragments each having an arbitrary base sequence. Α ′ and β ′ each represent a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to α or β. ]
[7] The complex according to any one of [1] to [4], which is represented by the following formula (3) or the following formula (4).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 [In Formula (3), X 1 , X 2 , α, α ′, β, β ′, γ, γ ′, and δ ′ are the same as defined in Formula (2), and ε is an arbitrary base sequence. And ε ′ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to ε. ]
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 [In the formula (4), X 1 , X 2 , α, α ′, β, β ′, γ, γ ′, δ ′, ε, and ε ′ are the same as defined in the formula (3). ]
[8] A complex in which the first particle and the second particle are bonded via the first nucleic acid structure, and the target nucleic acid is obtained by the anchorage-dependent strand exchange reaction of the first nucleic acid structure. The complex that is generated.
[9] The composite according to [8], wherein the first particles are optically distinguishable.
[10] The composite according to [8] or [9], wherein a water-soluble polymer compound is bound to the first particles.
[11] The composite according to any one of [8] to [10], wherein the second particles are aggregated by centrifugation or bringing a magnet close to each other.
[12] The complex according to any one of [8] to [11], which is represented by the following formula (5).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 [In Formula (5), X 1 , X 2 , α, α ′, β ′, γ, γ ′, and δ ′ are the same as defined in Formula (3), and δ is complementary to δ ′. Represents a single-stranded nucleic acid fragment having a simple base sequence. ]
[13] A method for detecting a target nucleic acid in a sample, comprising the following steps (a) to (c):
Step (a): Incubating a mixed solution containing the sample and the complex according to any one of [1] to [7], wherein the target nucleic acid in the sample is contained in the mixed solution. Performing a scaffold-dependent strand exchange reaction with the first nucleic acid structure, resulting in dissociation of the bond between the first particle and the second particle.
Step (b): a step of aggregating the dissociated second particles and the unreacted complex after the step (a), and as a result, the dissociated first particles are contained in the mixed solution. Step of dispersing.
Step (c): a step of measuring the abundance of the first particles in the mixed solution after the step (b), wherein the abundance measured corresponds to the abundance of the target nucleic acid. .
[14] The complex in the step (a) is the complex according to any one of [5] to [7], and the target nucleic acid is γ-δ [where γ is as defined in the formula (3). And δ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the δ ′ in the formula (3). ] The detection method according to [13], which is a single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of
[15] The step (a) includes the sample, the complex according to [6] or [7], and α-β-γ [where α, β, and γ are defined in the formula (3). Is the same. And incubating a mixed solution containing a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of
In the mixed solution, the target nucleic acid in the sample undergoes an anchorage-dependent strand exchange reaction with the first nucleic acid structure, and as a result, one nucleic acid structure having a β-γ base sequence from the first nucleic acid structure. A step (a1) of dissociating the double-stranded nucleic acid;
The single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of α-β-γ performs an anchorage-dependent strand exchange reaction with the first nucleic acid structure, and as a result, the base sequence of α is converted from the first nucleic acid structure. [14] including a step (a2) in which the bond between the first particle and the second particle is dissociated by dissociating the single-stranded nucleic acid and the target nucleic acid, and the target nucleic acid is regenerated. The detection method described.
[16] A method for detecting a target nucleic acid in a sample, comprising the following steps (aa), (bb), and (cc).
Step (aa): a step of incubating a mixed solution containing the sample and the complex described in [12], wherein the first particles and the A step in which the target nucleic acid is amplified while the bond with the second particle is dissociated.
Step (bb): a step of aggregating the dissociated second particles and the unreacted complex after step (aa), and as a result, the dissociated first particles are contained in the mixed solution. Step of dispersing.
Step (cc): a step of measuring the abundance of the first particles in the mixed solution after the step (bb), wherein the abundance measured corresponds to the abundance of the target nucleic acid. .
[17] The first complex in which the step (aa) is represented by the following formula (6), and the first particles and the second particles are bonded via the first nucleic acid structure. And represented by the following formula (7), and represented by the following formula (8), a second complex in which the first particles and the second particles are bonded via a second nucleic acid structure: The third nucleic acid structure and λ-γ-β-γ [where λ, β, γ are the same as defined in the following formula (8). And incubating a mixed solution containing a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of
The target nucleic acid is γ-δ [where γ is the same as defined in the formula (3), and δ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the δ ′ in the formula (3). . A single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of
In the mixed solution, the target nucleic acid in the sample undergoes a scaffold-dependent strand exchange reaction with the third nucleic acid structure, and as a result, the base sequence of α-β-γ is converted from the third nucleic acid structure. A step (aa1) of dissociating the single-stranded nucleic acid having,
The single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of α-β-γ performs an anchorage-dependent strand exchange reaction with the first nucleic acid structure, and as a result, the base sequence of α is converted from the first nucleic acid structure. A step of dissociating a single-stranded nucleic acid fragment having a single-stranded nucleic acid fragment and a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ, whereby the bond between the first particle and the second particle is dissociated, and a target nucleic acid is further generated. (Aa2),
A single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of λ-γ-β-γ undergoes an anchorage-dependent strand exchange reaction with the third nucleic acid structure, and as a result, the third nucleic acid structure is subjected to θ-λ- a step (aa3) of regenerating the target nucleic acid by dissociating the single-stranded nucleic acid having the base sequence of γ and the target nucleic acid;
The single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of θ-λ-γ performs an anchorage-dependent strand exchange reaction with the second nucleic acid structure. As a result, the base sequence of θ is converted from the second nucleic acid structure. A step of dissociating a single-stranded nucleic acid fragment having a single-stranded nucleic acid fragment and a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ, whereby the bond between the first particle and the second particle is dissociated, and a target nucleic acid is further generated. The detection method according to [16], comprising (aa4).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 [In Formula (6), X 1 , X 2 , α, α ′, β ′, γ, γ ′, and δ ′ are the same as defined in Formula (3), and δ is complementary to δ ′. Represents a single-stranded nucleic acid fragment having a simple base sequence. ]
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 [In the formula (7), X 1 , X 2 , γ, γ ′, δ and δ ′ are the same as defined in the formula (6), and θ ′ and λ ′ each have an arbitrary base sequence. Represents a strand nucleic acid fragment, and θ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the aforementioned θ ′. ]
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 [In the formula (8), α, β, β ′, γ, γ ′, and δ ′ are the same as defined in the formula (3), and θ and λ each have an arbitrary base sequence. Λ ′ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to λ. ]
[18] A kit for detecting a nucleic acid of interest in a sample, comprising the complex according to any one of [1] to [12].
[19] The complex according to [6] or [7] and α-β-γ [where α, β, and γ are the same as defined in Formula (3). A single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ [wherein γ is the same as defined in the formula (3), and δ is the δ ′ in the formula (3) Represents a single-stranded nucleic acid fragment having a complementary base sequence. ] The kit according to [18], which is a single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of
[20] The first complex represented by the formula (6), in which the first particles and the second particles are bonded via the first nucleic acid structure, and the formula (7), A second complex in which the first particles and the second particles are bonded via a second nucleic acid structure, a third nucleic acid structure represented by the formula (8), and λ− γ-β-γ [where λ, β, γ are the same as defined in the above formula (8). A single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ [wherein γ is the same as defined in the formula (3), and δ is the δ ′ in the formula (3) Represents a single-stranded nucleic acid fragment having a complementary base sequence. ] The kit according to [18], which is a single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of
[21] The kit according to any one of [18] to [20], further comprising a sensitizer.
　本発明によれば、対象核酸を簡便に検出する技術を提供することができる。 According to the present invention, a technique for easily detecting a target nucleic acid can be provided.
複合体の一例を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows an example of a composite_body | complex. ＤＮＡの鎖交換反応の一例を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows an example of the strand exchange reaction of DNA. ＤＮＡの足場依存型鎖交換反応の一例を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows an example of the anchorage-dependent strand exchange reaction of DNA. 実験例２において、波長５２２ｎｍにおける吸光度を測定した結果を示すグラフである。In Experimental example 2, it is a graph which shows the result of having measured the light absorbency in wavelength 522nm. 実験例３において、波長５２２ｎｍにおける吸光度を測定した結果を示すグラフである。In Experimental example 3, it is a graph which shows the result of having measured the light absorbency in wavelength 522nm. 実験例４において、波長５２２ｎｍにおける吸光度を測定した結果を示すグラフである。また、挿入図は、ｍｉＲ３４ｃの濃度０～１．０ｎＭの範囲の拡大図である。In Experimental example 4, it is a graph which shows the result of having measured the light absorbency in wavelength 522nm. The inset is an enlarged view of the miR34c concentration range of 0 to 1.0 nM. 実験例５において、波長５７５ｎｍにおける吸光度を測定した結果を示すグラフである。また、挿入図は、ｍｉＲ３４ｃの濃度０～０．１ｎＭの範囲の拡大図である。In Experimental Example 5, it is a graph which shows the result of having measured the light absorbency in wavelength 575nm. The inset is an enlarged view of the miR34c concentration range of 0 to 0.1 nM. 実験例５の増幅反応の前後における反応液の写真である。6 is a photograph of a reaction solution before and after an amplification reaction in Experimental Example 5. 実験例６の増幅反応の前後における反応液の写真である。6 is a photograph of a reaction solution before and after an amplification reaction in Experimental Example 6. 実験例６の増幅反応前の波長５２２ｎｍにおける吸光度の測定結果を示すグラフである。また、挿入図は、増幅反応後の波長５７５ｎｍにおける吸光度の測定結果を示すグラフである。14 is a graph showing measurement results of absorbance at a wavelength of 522 nm before an amplification reaction in Experimental Example 6. The inset is a graph showing the measurement results of absorbance at a wavelength of 575 nm after the amplification reaction.
［複合体］
　１実施形態において、本発明は、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した複合体であって、前記第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離する、複合体を提供する。 [Complex]
In one embodiment, the present invention provides a complex in which a first particle and a second particle are bound via a first nucleic acid structure, and the anchorage-dependent strand exchange of the first nucleic acid structure. Provided is a complex in which a bond between the first particle and the second particle is dissociated by the reaction.
　図１は、本実施形態の複合体の一例を示す模式図である。図１に示すように、複合体１００は、第１の粒子１１０と、第２の粒子１２０と、第１の核酸構造体１３０とを備える。第１の核酸構造体１３０の一部は第１の粒子１１０と結合している。また、第１の核酸構造体１３０の他の一部は第２の粒子１２０と結合している。すなわち、第１の粒子１１０と第２の粒子１２０とは、第１の核酸構造体１３０を介して結合している。後述するように、第１の核酸構造体が、足場依存型鎖交換反応を行うことにより、第１の粒子１１０と第２の粒子１２０との結合が解離する。 FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the composite according to the present embodiment. As shown in FIG. 1, the complex 100 includes a first particle 110, a second particle 120, and a first nucleic acid structure 130. A part of the first nucleic acid structure 130 is bound to the first particle 110. Further, the other part of the first nucleic acid structure 130 is bound to the second particle 120. That is, the first particle 110 and the second particle 120 are bonded via the first nucleic acid structure 130. As will be described later, when the first nucleic acid structure performs an anchorage-dependent strand exchange reaction, the bond between the first particle 110 and the second particle 120 is dissociated.
（鎖交換反応）
　ここで、図２を参照しながら、鎖交換反応について説明する。図２は、ＤＮＡの鎖交換反応の一例を示す模式図である。図２では、一本鎖ＤＮＡ断片２１０と、これに相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片２２０とがハイブリダイズして、二本鎖ＤＮＡ断片２３０を形成している。二本鎖ＤＮＡ断片２３０に、一本鎖ＤＮＡ断片２２０と同じ塩基配列を有する別の一本鎖ＤＮＡ断片２２０’を混合してインキュベートすると、やがて、一本鎖ＤＮＡ断片２２０と一本鎖ＤＮＡ断片２２０’とが置換される。この、一本鎖ＤＮＡ断片２２０と一本鎖ＤＮＡ断片２２０’との置換反応を鎖交換反応という。 (Strand exchange reaction)
Here, the strand exchange reaction will be described with reference to FIG. FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of a DNA strand exchange reaction. In FIG. 2, a single-stranded DNA fragment 210 and a single-stranded DNA fragment 220 having a complementary base sequence are hybridized to form a double-stranded DNA fragment 230. When the double-stranded DNA fragment 230 is mixed with another single-stranded DNA fragment 220 ′ having the same base sequence as the single-stranded DNA fragment 220 and incubated, the single-stranded DNA fragment 220 and the single-stranded DNA fragment are eventually 220 ′ is replaced. This substitution reaction between the single-stranded DNA fragment 220 and the single-stranded DNA fragment 220 ′ is called a strand exchange reaction.
　鎖交換反応の結果、一本鎖ＤＮＡ断片２２０と一本鎖ＤＮＡ断片２２０’とが置換され、一本鎖ＤＮＡ断片２１０と一本鎖ＤＮＡ断片２２０’とがハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡ断片２３０’と、遊離した一本鎖ＤＮＡ断片２２０とが生成される。しかしながら、図２に示す鎖交換反応は反応に長時間を必要とすることが知られている。 As a result of the strand exchange reaction, the single-stranded DNA fragment 220 is replaced with the single-stranded DNA fragment 220 ′, and the single-stranded DNA fragment 210 and the single-stranded DNA fragment 220 ′ are hybridized. 'And a free single-stranded DNA fragment 220 are generated. However, it is known that the strand exchange reaction shown in FIG. 2 requires a long time for the reaction.
（足場依存型鎖交換反応）
　続いて、図３を参照しながら、足場依存型鎖交換反応について説明する。図３は、ＤＮＡの足場依存型鎖交換反応の一例を示す模式図である。図３では、一本鎖ＤＮＡ断片３１０と、これに相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片３２０とがハイブリダイズして、二本鎖ＤＮＡ断片３３０を形成している。 (Scaffold-dependent chain exchange reaction)
Subsequently, the scaffold-dependent strand exchange reaction will be described with reference to FIG. FIG. 3 is a schematic diagram showing an example of an anchorage-dependent strand exchange reaction of DNA. In FIG. 3, a single-stranded DNA fragment 310 and a single-stranded DNA fragment 320 having a complementary base sequence are hybridized to form a double-stranded DNA fragment 330.
　ここで、一本鎖ＤＮＡ断片３１０のうち、一本鎖ＤＮＡ断片３２０とハイブリダイズしていない領域３１１を足場（ｔｏｅ－ｈｏｌｄ）という。二本鎖ＤＮＡ断片３３０に、一本鎖ＤＮＡ断片３１０に相補的な塩基配列を有する別の一本鎖ＤＮＡ断片３４０を混合してインキュベートすると、やがて、一本鎖ＤＮＡ断片３１０の足場領域３１１に一本鎖ＤＮＡ断片３４０の一部がハイブリダイズする。続いて、足場領域３１１におけるハイブリダイゼーションを起点として、一本鎖ＤＮＡ断片３４０と一本鎖ＤＮＡ断片３２０とが置換される。この、足場領域３１１を介した、一本鎖ＤＮＡ断片３４０と一本鎖ＤＮＡ断片３２０との置換反応を足場依存型鎖交換反応という。 Here, of the single-stranded DNA fragment 310, the region 311 that does not hybridize with the single-stranded DNA fragment 320 is referred to as a “toe-hold”. When the double-stranded DNA fragment 330 is mixed with another single-stranded DNA fragment 340 having a base sequence complementary to the single-stranded DNA fragment 310 and incubated, the scaffold region 311 of the single-stranded DNA fragment 310 is eventually added. A part of the single-stranded DNA fragment 340 hybridizes. Subsequently, the single-stranded DNA fragment 340 and the single-stranded DNA fragment 320 are replaced starting from the hybridization in the scaffold region 311. This substitution reaction between the single-stranded DNA fragment 340 and the single-stranded DNA fragment 320 via the scaffold region 311 is called an anchorage-dependent strand exchange reaction.
　足場依存型鎖交換反応の結果、一本鎖ＤＮＡ断片３２０と一本鎖ＤＮＡ断片３４０とが置換され、一本鎖ＤＮＡ断片３１０と一本鎖ＤＮＡ断片３４０とがハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡ断片３３０’と、遊離した一本鎖ＤＮＡ断片３２０とが生成される。 As a result of the anchorage-dependent strand exchange reaction, the single-stranded DNA fragment 320 and the single-stranded DNA fragment 340 are replaced, and the single-stranded DNA fragment 310 and the single-stranded DNA fragment 340 are hybridized. 330 ′ and a free single-stranded DNA fragment 320 are generated.
　二本鎖ＤＮＡ断片３３０’において、一本鎖ＤＮＡ断片３１０のうち、一本鎖ＤＮＡ断片３４０とハイブリダイズしていない領域３１２は、再び足場として機能する。その結果、今度は一本鎖ＤＮＡ断片３２０と一本鎖ＤＮＡ断片３４０とが置換される逆反応が進む。 In the double-stranded DNA fragment 330 ′, the region 312 not hybridized with the single-stranded DNA fragment 340 of the single-stranded DNA fragment 310 functions again as a scaffold. As a result, the reverse reaction in which the single-stranded DNA fragment 320 and the single-stranded DNA fragment 340 are replaced this time advances.
　足場依存型鎖交換反応は、上述した足場を介しない鎖交換反応と比較して、速度定数ｋ（Ｍ－１ｓ－１）が１０５～１０７倍増加することが知られている。また、足場の長さは４～６塩基で十分であることが知られている。 The anchorage-dependent chain exchange reaction is known to increase the rate constant k (M −1 s −1 ) by 10 5 to 10 7 times as compared with the above-described chain exchange reaction not via a scaffold. Also, it is known that 4-6 bases are sufficient for the length of the scaffold.
　後述するように、本実施形態の複合体では、第１の粒子と第２の粒子とを結合する、第１の核酸構造体上で行われる足場依存型鎖交換反応によって、前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離する。そして、解離した第１の粒子を検出することにより、対象核酸を検出することができる。 As will be described later, in the complex of the present embodiment, the first particle is bonded to the first particle by a scaffold-dependent strand exchange reaction performed on the first nucleic acid structure, which binds the first particle and the second particle. And the second particle dissociate. Then, the target nucleic acid can be detected by detecting the dissociated first particles.
　実施例において後述するように、本実施形態の複合体を利用することにより、対象核酸を簡便に検出する技術を提供することができる。また、実施例において後述するように、本実施形態の複合体を利用した対象核酸の検出では、対象核酸を精製することなく、細胞抽出液等の生体試料中の対象核酸を直接検出することもできる。したがって、例えば、血中からｍｉＲＮＡを高感度にその場で検出すること等が可能となる。 As will be described later in Examples, by using the complex of this embodiment, it is possible to provide a technique for easily detecting a target nucleic acid. Further, as will be described later in the Examples, in the detection of the target nucleic acid using the complex of the present embodiment, the target nucleic acid in a biological sample such as a cell extract can be directly detected without purifying the target nucleic acid. it can. Therefore, for example, miRNA can be detected from blood in situ with high sensitivity.
　本実施形態の複合体において、第１の粒子１１０は光学的に識別可能であってもよい。ここで、光学的に識別可能とは、例えば、可視光の吸収、蛍光、酵素反応により発色、蛍光又は化学発光を生じること等により、第１の粒子１１０の存在を検出可能であることを意味する。 In the composite of this embodiment, the first particles 110 may be optically distinguishable. Here, optically distinguishable means that the presence of the first particle 110 can be detected by, for example, generating visible color, fluorescence, or chemiluminescence by absorption of visible light, fluorescence, or enzymatic reaction. To do.
　例えば、第１の粒子１１０はナノオーダーの直径を有する金粒子（金ナノ粒子）であってもよい。金ナノ粒子は、そのサイズ、形状、表面の修飾、凝集状態等に依存して吸光特性が変化することが知られている。あるいは、第１の粒子１１０は、量子ドットであってもよく、色素、蛍光物質、酵素（アルカリフォスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等）等で修飾した樹脂粒子等であってもよい。 For example, the first particles 110 may be gold particles (gold nanoparticles) having a nano-order diameter. It is known that the gold nanoparticles change in light absorption characteristics depending on the size, shape, surface modification, aggregation state, and the like. Alternatively, the first particles 110 may be quantum dots, resin particles modified with a dye, a fluorescent substance, an enzyme (such as alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, or luciferase).
　また、第１の粒子１１０には、水溶性高分子化合物が結合していてもよい。水溶性高分子化合物としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、デキストラン等が挙げられる。水溶性高分子化合物は、非イオン性であってもよく、イオン性であってもよい。水溶性高分子化合物が非イオン性であると、第１の粒子１１０の表面の電荷を減らす効果が高い傾向にあり、好ましい。 Further, a water-soluble polymer compound may be bound to the first particles 110. Examples of the water-soluble polymer compound include polyethylene glycol (PEG), polyacrylamide, and dextran. The water-soluble polymer compound may be nonionic or ionic. It is preferable that the water-soluble polymer compound is nonionic because the effect of reducing the charge on the surface of the first particles 110 tends to be high.
　第１の粒子１１０の表面に水溶性高分子化合物を結合させることにより、第１の粒子１１０の表面への生体物質の非特異的吸着を抑制することができる。また、水溶性高分子化合物を結合させることにより、第１の粒子１１０の表面の電荷を減らすことができる。この結果、水溶性高分子化合物を有しない第１の粒子１１０における鎖交換反応よりも、水溶性高分子化合物が結合した第１の粒子１１０における鎖交換反応の方が、反応速度が向上する傾向にある。 By binding a water-soluble polymer compound to the surface of the first particle 110, nonspecific adsorption of the biological substance to the surface of the first particle 110 can be suppressed. In addition, the charge on the surface of the first particle 110 can be reduced by binding the water-soluble polymer compound. As a result, the reaction rate tends to be improved in the chain exchange reaction in the first particle 110 to which the water-soluble polymer compound is bonded than in the chain exchange reaction in the first particle 110 that does not have the water-soluble polymer compound. It is in.
　水溶性高分子化合物の分子量は、第１の粒子１１０の表面の第１の核酸構造体を水溶性高分子化合物の分子量が覆ってしまわない（第１の核酸構造体が露出する）程度の分子量であることが好ましい。水溶性高分子化合物の分子量としては、例えば２００～１５０００程度が挙げられる。 The molecular weight of the water-soluble polymer compound is such that the molecular weight of the water-soluble polymer compound does not cover the first nucleic acid structure on the surface of the first particle 110 (the first nucleic acid structure is exposed). It is preferable that Examples of the molecular weight of the water-soluble polymer compound include about 200 to 15000.
　本実施形態の複合体において、第２の粒子１２０は、遠心分離又は磁石を近接させることにより凝集するものであることが好ましい。第２の粒子１２０が、遠心分離又は磁石を近接させることにより凝集するものであると、上述した足場依存型鎖交換反応で第１の粒子１１０と第２の粒子１２０との結合が解離した後、遊離の第１の粒子１１０とそれ以外の粒子（第２の粒子１２０、第１の粒子１１０と第２の粒子１２０との結合が維持されている未反応の複合体等）を容易に分離することができる。その結果、遊離の第１の粒子１１０の量を測定することが容易になる。 In the composite of this embodiment, the second particles 120 are preferably aggregated by centrifugation or bringing magnets close to each other. If the second particles 120 are aggregated by centrifugation or bringing magnets close to each other, after the bond between the first particles 110 and the second particles 120 is dissociated by the above-described anchorage-dependent chain exchange reaction. Easily separate the free first particles 110 and the other particles (second particles 120, unreacted complexes in which the binding between the first particles 110 and the second particles 120 is maintained). can do. As a result, it becomes easy to measure the amount of the free first particles 110.
　遠心分離の条件としては、遊離の第１の粒子１１０とそれ以外の粒子を簡便且つ確実に分離することができれば特に制限されず、例えば１５，０００×ｇ以下で５分間以内の条件等が挙げられる。 The conditions for the centrifugation are not particularly limited as long as the free first particles 110 and the other particles can be easily and reliably separated, and examples include conditions of 15,000 × g or less and within 5 minutes. It is done.
　あるいは、第２の粒子１２０は、磁気粒子であってもよい。第２の粒子１２０が磁気粒子であると、磁気スタンド等により磁場を適用することにより、反応チューブの壁面等に第２の粒子１２０を容易に凝集させることができる。これにより、遊離の第１の粒子１１０とそれ以外の粒子を簡便且つ確実に分離することができる。 Alternatively, the second particles 120 may be magnetic particles. When the second particles 120 are magnetic particles, the second particles 120 can be easily aggregated on the wall surface of the reaction tube or the like by applying a magnetic field using a magnetic stand or the like. Thereby, the free first particles 110 and the other particles can be easily and reliably separated.
（複合体：第１実施形態）
　１実施形態において、上述した複合体は下記式（１）で表されるものであってもよい。 (Composite: First Embodiment)
In one embodiment, the complex described above may be represented by the following formula (1).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　式（１）中、Ｘ１又はＸ２は一方が前記第１の粒子を表し、他方が前記第２の粒子を表し、γ及びδ’はそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、γ’は前記γと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。 In formula (1), one of X 1 and X 2 represents the first particle, the other represents the second particle, and γ and δ ′ represent single-stranded nucleic acid fragments each having an arbitrary base sequence. Γ ′ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to γ.
　式（１）において、粒子Ｘ１は一本鎖核酸断片γと結合している。また、一本鎖核酸断片γ’及びδ’は連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、粒子Ｘ２は一本鎖核酸断片δ’と結合している。また、一本鎖核酸断片γとγ’とはハイブリダイズしている。その結果、一本鎖核酸断片γ、γ’及びδ’は第１の核酸構造体を形成しており、第１の核酸構造体を介して粒子Ｘ１と粒子Ｘ２とが結合し、複合体を形成している。 In the formula (1), the particles X 1 is bound to the single-stranded nucleic acid fragments gamma. In addition, single-stranded nucleic acid fragments γ ′ and δ ′ are linked to form a single-stranded nucleic acid fragment. The particle X 2 is bound to single-stranded nucleic acid fragments [delta] '. Further, the single-stranded nucleic acid fragments γ and γ ′ are hybridized. As a result, the single-stranded nucleic acid fragments γ, γ ′, and δ ′ form the first nucleic acid structure, and the particle X 1 and the particle X 2 are combined through the first nucleic acid structure to form a composite. Forming the body.
　ここで、粒子Ｘ１又はＸ２と核酸断片とは直接結合していてもよいし、スペーサーを介して結合していてもよい。スペーサーとしては任意の２価の基が挙げられ、例えば炭素数１～２０のアルキレン基、炭素数２～２０のポリオキシエチレン基、オリゴヌクレオチド鎖、ペプチド鎖等が挙げられる。 Here, the particle X 1 or X 2 and the nucleic acid fragment may be directly bonded or may be bonded via a spacer. Examples of the spacer include any divalent group, and examples thereof include an alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, a polyoxyethylene group having 2 to 20 carbon atoms, an oligonucleotide chain, and a peptide chain.
　式（１）で表される複合体にγ－δ［但し、γは上記式（１）における定義に同じであり、δは上記式（１）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させると、式（１）におけるδ’の領域を足場として足場依存型鎖交換反応が生じる。その結果、式（１）におけるＸ１－γが解離する。その結果、粒子Ｘ１と粒子Ｘ２との結合が解離する。粒子Ｘ１と粒子Ｘ２との結合が解離した状態を下記式（１－１）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 Γ-δ [wherein γ is the same as defined in the above formula (1), and δ has a base sequence complementary to the above δ ′ in the above formula (1). Represents a single stranded nucleic acid fragment. When a single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence is contacted, an anchorage-dependent strand exchange reaction occurs using the region of δ ′ in formula (1) as a scaffold. As a result, X 1 -γ in formula (1) is dissociated. As a result, the dissociation of binding to the particle X 1 and particles X 2. A state in which the bond between the particle X 1 and the particle X 2 is dissociated is shown in the following formula (1-1).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　式（１－１）において、一本鎖核酸断片γ及びγ’、δ及びδ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、Ｘ１－γは遊離している。 In the formula (1-1), the single-stranded nucleic acid fragments γ and γ ′, δ and δ ′ are hybridized, respectively. X 1 -γ is free.
（複合体：第２実施形態）
　１実施形態において、上述した複合体は下記式（２）で表されるものであってもよい。 (Composite: Second Embodiment)
In one embodiment, the complex described above may be represented by the following formula (2).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　式（２）中、Ｘ１、Ｘ２、γ、γ’及びδ’は上記式（１）における定義に同じであり、α及びβはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、α’及びβ’はそれぞれ前記α又は前記βと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。 In formula (2), X 1 , X 2 , γ, γ ′ and δ ′ are the same as defined in formula (1) above, and α and β each represent a single-stranded nucleic acid fragment having an arbitrary base sequence. , Α ′ and β ′ each represent a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to α or β.
　式（２）で表される複合体において、粒子Ｘ１は一本鎖核酸断片αと結合している。また、一本鎖核酸断片β及びγは連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、一本鎖核酸断片α’、β’、γ’及びδ’は連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、粒子Ｘ２は一本鎖核酸断片δ’と結合している。また、一本鎖核酸断片α及びα’、β及びβ’、γ及びγ’は、それぞれハイブリダイズしているが、αとβとは結合していない。その結果、一本鎖核酸断片α、α’、β、β’、γ、γ’及びδ’は第１の核酸構造体を形成しており、第１の核酸構造体を介して粒子Ｘ１と粒子Ｘ２とが結合し、複合体を形成している。 In the complex of Formula (2), the particles X 1 is bound to the single-stranded nucleic acid fragments alpha. In addition, single-stranded nucleic acid fragments β and γ are linked to form a single-stranded nucleic acid fragment. Single-stranded nucleic acid fragments α ′, β ′, γ ′ and δ ′ are linked to form a single-stranded nucleic acid fragment. The particle X 2 is bound to single-stranded nucleic acid fragments [delta] '. Single-stranded nucleic acid fragments α and α ′, β and β ′, γ and γ ′ are hybridized, but α and β are not bound. As a result, the single-stranded nucleic acid fragments α, α ′, β, β ′, γ, γ ′, and δ ′ form the first nucleic acid structure, and the particle X 1 passes through the first nucleic acid structure. and the particles X 2 attached to form a complex with.
　式（１）で表される複合体と同様に、式（２）で表される複合体において、粒子Ｘ１又はＸ２と核酸断片とは直接結合していてもよいし、スペーサーを介して結合していてもよい。スペーサーとしては上述したものと同様のものが挙げられる。 Similar to the complex represented by the formula (1), in the complex represented by the formula (2), the particle X 1 or X 2 and the nucleic acid fragment may be directly bonded, or via a spacer. It may be bonded. Examples of the spacer include the same ones as described above.
　ここで、式（２）で表される複合体にγ－δ［但し、γは上記式（１）における定義に同じであり、δは上記式（１）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させた場合の反応について説明する。γ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片は、例えば、対象核酸（検出対象である一本鎖核酸断片）である。 Here, in the complex represented by the formula (2), γ-δ [where γ is the same as defined in the formula (1), and δ is a base complementary to the δ ′ in the formula (1). Represents a single stranded nucleic acid fragment having a sequence. The reaction when contacting a single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of The single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ is, for example, a target nucleic acid (single-stranded nucleic acid fragment to be detected).
　式（２）で表される複合体にγ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させると、式（２）におけるδ’の領域を足場として足場依存型鎖交換反応が生じる。その結果、式（２）におけるβ－γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離する。β－γが解離した状態を下記式（２－１）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 When a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ is brought into contact with the complex represented by formula (2), an anchorage-dependent strand exchange reaction occurs with the region of δ ′ in formula (2) as a scaffold. As a result, the single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of β-γ in formula (2) is dissociated. The state where β-γ is dissociated is shown in the following formula (2-1).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　式（２－１）において、一本鎖核酸断片α及びα’、γ及びγ’、δ及びδ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、β－γは遊離している。 In the formula (2-1), the single-stranded nucleic acid fragments α and α ′, γ and γ ′, δ and δ ′ are hybridized, respectively. Β-γ is free.
　続いて、式（２－１）で表される複合体にα－β－γ［但し、α、β、γは、上記式（２）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させると、式（２－１）におけるβ’の領域を足場として足場依存型鎖交換反応が生じる。その結果、式（２－１）におけるγ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片、及びＸ１－αが解離する。その結果、粒子Ｘ１と粒子Ｘ２との結合が解離するとともに、γ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が再生される。ここで、再生されるとは、一度足場依存型鎖交換反応に関与した、γ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が、再び新たな足場依存型鎖交換反応に関与できる状態になることを意味する。 Subsequently, α-β-γ [where α, β, γ are the same as defined in the above formula (2) in the complex represented by the formula (2-1). ] Is contacted with a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of [2], a scaffold-dependent strand exchange reaction occurs using the β ′ region in formula (2-1) as a scaffold. As a result, the single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of γ-δ in formula (2-1) and X 1 -α are dissociated. As a result, the dissociation of binding to the particle X 1 and particles X 2, single-stranded nucleic acid fragments having the nucleotide sequence of the gamma-[delta] is reproduced. Here, the term “regenerated” means that the single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of γ-δ once involved in the anchorage-dependent strand exchange reaction can again participate in the new anchorage-dependent strand exchange reaction. Means that.
　γ－δが再生され、粒子Ｘ１と粒子Ｘ２との結合が解離した状態を下記式（２－２）に示す。 A state where γ-δ is regenerated and the bond between the particle X 1 and the particle X 2 is dissociated is shown in the following formula (2-2).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　式（２－２）において、一本鎖核酸断片α及びα’、β及びβ’、γ及びγ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、β－γ、Ｘ１－α、及びγ－δはそれぞれ遊離している。このように、第２実施形態の複合体は、γ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片を再生することができる。 In the formula (2-2), the single-stranded nucleic acid fragments α and α ′, β and β ′, γ and γ ′ are hybridized, respectively. Β-γ, X 1 -α, and γ-δ are each free. Thus, the complex of the second embodiment can regenerate a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ.
　１実施形態において、上述した複合体は下記式（３）又は下記式（４）で表されるものであってもよい。 In one embodiment, the complex described above may be represented by the following formula (3) or the following formula (4).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　式（３）中、Ｘ１、Ｘ２、α、α’、β、β’、γ、γ’及びδ’は上記式（２）における定義に同じであり、εはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、ε’は前記εと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。式（３）で表される複合体は、後述する実施例で使用した複合体に相当するものである。 In formula (3), X 1 , X 2 , α, α ′, β, β ′, γ, γ ′, and δ ′ are the same as defined in the above formula (2), and ε represents an arbitrary base sequence. And ε ′ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to ε. The complex represented by the formula (3) corresponds to the complex used in Examples described later.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　式（４）中、Ｘ１、Ｘ２、α、α’、β、β’、γ、γ’、δ’、ε及びε’は上記式（３）における定義に同じである。 In the formula (4), X 1 , X 2 , α, α ′, β, β ′, γ, γ ′, δ ′, ε, and ε ′ are the same as defined in the above formula (3).
　式（３）で表される複合体は、上述した式（２）で表される複合体と類似した構成を有しており、一本鎖核酸断片ε及びε’が存在する点において、式（２）で表される複合体と相違している。 The complex represented by the formula (3) has a configuration similar to that of the complex represented by the formula (2) described above, and the single-stranded nucleic acid fragments ε and ε ′ are present. It is different from the complex represented by (2).
　式（３）で表される複合体において、粒子Ｘ１は一本鎖核酸断片αと結合している。また、一本鎖核酸断片β及びγは連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、一本鎖核酸断片α’、β’、γ’、δ’及びε’は連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、粒子Ｘ２は一本鎖核酸断片εと結合している。また、一本鎖核酸断片α及びα’、β及びβ’、γ及びγ’、ε及びε’は、それぞれハイブリダイズしているが、αとβとは結合していない。また、γとεとは結合していない。その結果、一本鎖核酸断片α、α’、β、β’、γ、γ’、δ’、ε及びε’は第１の核酸構造体を形成しており、第１の核酸構造体を介して粒子Ｘ１と粒子Ｘ２とが結合し、複合体を形成している。 In the complex of Formula (3), the particles X 1 is bound to the single-stranded nucleic acid fragments alpha. In addition, single-stranded nucleic acid fragments β and γ are linked to form a single-stranded nucleic acid fragment. Single-stranded nucleic acid fragments α ′, β ′, γ ′, δ ′, and ε ′ are linked to form a single-stranded nucleic acid fragment. The particle X 2 is bound to single-stranded nucleic acid fragments epsilon. Single-stranded nucleic acid fragments α and α ′, β and β ′, γ and γ ′, ε and ε ′ are hybridized, but α and β are not bound. Also, γ and ε are not bonded. As a result, the single-stranded nucleic acid fragments α, α ′, β, β ′, γ, γ ′, δ ′, ε, and ε ′ form the first nucleic acid structure, and the first nucleic acid structure bonded with the particles X 1 and particles X 2 through, to form a complex.
　式（１）で表される複合体と同様に、式（３）で表される複合体において、粒子Ｘ１又はＸ２と核酸断片とは直接結合していてもよいし、スペーサーを介して結合していてもよい。スペーサーとしては上述したものと同様のものが挙げられる。 Similar to the complex represented by the formula (1), in the complex represented by the formula (3), the particle X 1 or X 2 and the nucleic acid fragment may be directly bonded or via a spacer. It may be bonded. Examples of the spacer include the same ones as described above.
　式（４）で表される複合体は、式（３）で表される複合体と類似した構成を有しており、粒子Ｘ２が結合している一本鎖核酸断片がεではなくε’である点において相違している。式（４）で表される複合体も、式（３）で表される複合体と同様に機能することができる。 Complex of formula (4) has a configuration similar to the complex of the formula (3), rather than the single-stranded nucleic acid fragments having a particle X 2 are bonded epsilon epsilon 'Is different in that it is. The complex represented by formula (4) can also function in the same manner as the complex represented by formula (3).
　ここで、式（３）で表される複合体にγ－δ［但し、γは上記式（１）における定義に同じであり、δは上記式（１）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させた場合の反応について説明する。γ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片は、例えば、対象核酸（検出対象である一本鎖核酸断片）である。 Here, in the complex represented by the formula (3), γ-δ [where γ is the same as defined in the formula (1), and δ is a base complementary to the δ ′ in the formula (1). Represents a single stranded nucleic acid fragment having a sequence. The reaction when contacting a single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of The single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ is, for example, a target nucleic acid (single-stranded nucleic acid fragment to be detected).
　式（３）で表される複合体にγ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させると、式（３）におけるδ’の領域を足場として足場依存型鎖交換反応が生じる。その結果、式（３）におけるβ－γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離する。β－γが解離した状態を下記式（３－１）に示す。 When a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ is brought into contact with the complex represented by Formula (3), an anchorage-dependent strand exchange reaction occurs using the region of δ ′ in Formula (3) as a scaffold. As a result, the single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of β-γ in formula (3) is dissociated. The state where β-γ is dissociated is shown in the following formula (3-1).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　式（３－１）において、一本鎖核酸断片α及びα’、γ及びγ’、δ及びδ’、ε及びε’は、それぞれハイブリダイズしている。また、β－γは遊離している。 In the formula (3-1), the single-stranded nucleic acid fragments α and α ′, γ and γ ′, δ and δ ′, ε and ε ′ are hybridized, respectively. Β-γ is free.
　続いて、式（３－１）で表される複合体にα－β－γ［但し、α、β、γは、上記式（２）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を反応させると、式（３－１）におけるβ’の領域を足場として足場依存型鎖交換反応が生じる。その結果、式（３－１）におけるγ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片、及びＸ１－αが解離する。その結果、粒子Ｘ１と粒子Ｘ２との結合が解離するとともに、γ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が再生される。ここで、再生されるとは、一度足場依存型鎖交換反応に関与した、γ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が、再び新たな足場依存型鎖交換反応に関与できる状態になることを意味する。 Subsequently, α-β-γ [where α, β, and γ are the same as defined in the above formula (2) in the complex represented by the formula (3-1). When a single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence is reacted, an anchorage-dependent strand exchange reaction occurs using the β ′ region in formula (3-1) as a scaffold. As a result, the single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of γ-δ in formula (3-1) and X 1 -α are dissociated. As a result, the dissociation of binding to the particle X 1 and particles X 2, single-stranded nucleic acid fragments having the nucleotide sequence of the gamma-[delta] is reproduced. Here, the term “regenerated” means that the single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of γ-δ once involved in the anchorage-dependent strand exchange reaction can again participate in the new anchorage-dependent strand exchange reaction. Means that.
　γ－δが再生され、粒子Ｘ１と粒子Ｘ２との結合が解離した状態を下記式（３－２）に示す。 A state where γ-δ is regenerated and the bond between the particle X 1 and the particle X 2 is dissociated is shown in the following formula (3-2).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　式（３－２）において、一本鎖核酸断片α及びα’、β及びβ’、γ及びγ’、ε及びε’は、それぞれハイブリダイズしている。また、β－γ、Ｘ１－α、及びγ－δはそれぞれ遊離している。このように、第２実施形態の複合体は、γ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片を再生することができる。 In the formula (3-2), the single-stranded nucleic acid fragments α and α ′, β and β ′, γ and γ ′, ε and ε ′ are hybridized, respectively. Β-γ, X 1 -α, and γ-δ are each free. Thus, the complex of the second embodiment can regenerate a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ.
　式（４）で表される複合体に、上述したγ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片、及びα－β－γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させた場合においても、粒子Ｘ２がεでなくε’と結合している点以外は、式（３）で表される複合体と同様の反応が生じる。 When the single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of γ-δ and the single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of α-β-γ are contacted with the complex represented by the formula (4) also, except that bound to the epsilon not particle X 2 epsilon ', the same reaction and the complex represented by the formula (3) occurs.
（複合体：第３実施形態）
　１実施形態において、本発明は、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した複合体であって、前記第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、対象核酸が生成される、複合体を提供する。 (Composite: Third Embodiment)
In one embodiment, the present invention provides a complex in which a first particle and a second particle are bound via a first nucleic acid structure, and the anchorage-dependent strand exchange of the first nucleic acid structure. A complex is provided in which the nucleic acid of interest is produced by the reaction.
　本明細書において、対象核酸とは、検出対象である核酸を意味する。本実施形態の複合体によれば、第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、対象核酸が生成され、試料中の対象核酸を増幅することができる。このため、本実施形態の複合体を使用することにより、対象核酸の検出感度を飛躍的に向上することができる。 In this specification, the target nucleic acid means a nucleic acid to be detected. According to the complex of this embodiment, the target nucleic acid is generated by the anchorage-dependent strand exchange reaction of the first nucleic acid structure, and the target nucleic acid in the sample can be amplified. For this reason, the detection sensitivity of the target nucleic acid can be dramatically improved by using the complex of the present embodiment.
　本実施形態の複合体は、第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、対象核酸が生成されるとともに、第１の粒子と第２の粒子との結合が解離するものであってもよい。 In the complex of the present embodiment, the target nucleic acid is generated by the anchorage-dependent strand exchange reaction of the first nucleic acid structure, and the bond between the first particle and the second particle is dissociated. Also good.
　また、本実施形態の複合体においても、上述した第１実施形態の複合体と同様に、第１の粒子が光学的に識別可能であってもよい。光学的に識別可能な第１の粒子としては、上述したものと同様のものが挙げられる。 Also in the composite of this embodiment, the first particles may be optically distinguishable as in the composite of the first embodiment described above. Examples of the first optically distinguishable particles include the same particles as described above.
　また、本実施形態の複合体においても、上述した第１実施形態の複合体と同様に、第１の粒子に水溶性高分子化合物が結合していてもよい。これにより、第１の粒子の表面への生体物質の非特異的吸着を抑制することができる。また、水溶性高分子化合物を結合させることにより、第１の粒子の表面の電荷を減らすことができ、反応速度を向上させることができる傾向にある。水溶性高分子化合物の種類及び分子量は上述したものと同様のものが挙げられる。 Also in the composite of this embodiment, a water-soluble polymer compound may be bound to the first particles as in the composite of the first embodiment described above. Thereby, nonspecific adsorption | suction of the biological material to the surface of 1st particle | grains can be suppressed. Further, by binding the water-soluble polymer compound, the charge on the surface of the first particles can be reduced, and the reaction rate tends to be improved. The kind and molecular weight of the water-soluble polymer compound are the same as those described above.
　また、本実施形態の複合体においても、上述した第１実施形態の複合体と同様に、遠心分離又は磁石を近接させることにより第２の粒子が凝集するものであることが好ましい。第２の粒子としては、上述したものと同様のものが挙げられる。 Also in the composite according to the present embodiment, it is preferable that the second particles are aggregated by centrifuging or bringing magnets close to each other as in the composite according to the first embodiment described above. Examples of the second particles include the same particles as described above.
　本実施形態の複合体は、例えば、下記式（５）で表されるものであってもよい。 The complex of the present embodiment may be represented by the following formula (5), for example.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　式（５）中、Ｘ１、Ｘ２、α、α’、β’、γ、γ’及びδ’は上記式（３）における定義に同じであり、δは前記δ’又と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。 In the formula (5), X 1 , X 2 , α, α ′, β ′, γ, γ ′ and δ ′ are the same as defined in the above formula (3), and δ is complementary to the δ ′ or This represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence.
　式（１）で表される複合体と同様に、式（５）で表される複合体において、粒子Ｘ１又はＸ２と核酸断片とは直接結合していてもよいし、スペーサーを介して結合していてもよい。スペーサーとしては上述したものと同様のものが挙げられる。 Similar to the complex represented by the formula (1), in the complex represented by the formula (5), the particle X 1 or X 2 and the nucleic acid fragment may be directly bonded, or via a spacer. It may be bonded. Examples of the spacer include the same ones as described above.
　ここで、式（５）で表される複合体にα－β－γ［但し、α、β、γは、上記式（２）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させた場合の反応について説明する。 Here, α-β-γ in the complex represented by the formula (5) [where α, β, γ are the same as defined in the above formula (2). The reaction when contacting a single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of
　式（５）で表される複合体にα－β－γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片を接触させると、式（５）におけるβ’の領域を足場として足場依存型鎖交換反応が生じる。その結果、式（５）におけるγ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片、及びＸ１－αが解離する。その結果、粒子Ｘ１と粒子Ｘ２との結合が解離するとともに、γ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が生成される。ここで、γ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片は、対象核酸である（対象核酸と同一の塩基配列を有している。）。 When a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of α-β-γ is brought into contact with the complex represented by the formula (5), an anchorage-dependent strand exchange reaction is performed using the β ′ region in the formula (5) as a scaffold. Arise. As a result, the single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of γ-δ in formula (5) and X 1 -α are dissociated. As a result, the dissociation of binding to the particle X 1 and particles X 2, single-stranded nucleic acid fragments having the nucleotide sequence of the gamma-[delta] is generated. Here, the single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of γ-δ is the target nucleic acid (having the same base sequence as the target nucleic acid).
　γ－δが生成され、粒子Ｘ１と粒子Ｘ２との結合が解離した状態を下記式（５－１）に示す。 A state where γ-δ is generated and the bond between the particle X 1 and the particle X 2 is dissociated is shown in the following formula (5-1).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　式（５－１）において、一本鎖核酸断片α及びα’、β及びβ’、γ及びγ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、Ｘ１－α及びγ－δはそれぞれ遊離している。このように、第３実施形態の複合体は、γ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片を新たに生成することができる。 In the formula (5-1), the single-stranded nucleic acid fragments α and α ′, β and β ′, γ and γ ′ are hybridized, respectively. X 1 -α and γ-δ are free. Thus, the complex of the third embodiment can newly generate a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ.
［試料中の対象核酸の検出方法］
　１実施形態において、本発明は、下記工程（ａ）～（ｃ）を備える、試料中の対象核酸の検出方法を提供する。
　工程（ａ）：前記試料と、上述した第１実施形態又は第２実施形態の複合体とを含む混合液をインキュベートする工程であって、前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離する工程。
　工程（ｂ）：工程（ａ）の後に、解離した前記第２の粒子及び未反応の前記複合体を凝集させる工程であって、その結果、解離した前記第１の粒子が前記混合液中に分散する工程。
　工程（ｃ）：工程（ｂ）の後に、前記混合液中の前記第１の粒子の存在量を測定する工程であって、測定された前記存在量が前記対象核酸の存在量に対応する工程。 [Method for detecting target nucleic acid in sample]
In one embodiment, the present invention provides a method for detecting a nucleic acid of interest in a sample, comprising the following steps (a) to (c).
Step (a): a step of incubating a mixed solution containing the sample and the complex of the first embodiment or the second embodiment described above, wherein the target nucleic acid in the sample is the mixture in the mixed solution. Performing a scaffold-dependent strand exchange reaction with the first nucleic acid structure, and as a result, the bond between the first particle and the second particle is dissociated.
Step (b): a step of aggregating the dissociated second particles and the unreacted complex after the step (a), and as a result, the dissociated first particles are contained in the mixed solution. Step of dispersing.
Step (c): a step of measuring the abundance of the first particles in the mixed solution after the step (b), wherein the abundance measured corresponds to the abundance of the target nucleic acid. .
　本実施形態の検出方法により試料中の対象核酸を簡便に検出することができる。以下各工程について説明する。 The target nucleic acid in the sample can be easily detected by the detection method of the present embodiment. Each step will be described below.
《工程（ａ）》
　対象核酸としては、一本鎖の核酸が好適である。核酸はＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、核酸アナログであってもよい。より具体的な対象核酸としては、ｍｉＲＮＡ、アプタマー等が挙げられる。アプタマーとしては、例えば、標的分子に結合することにより核酸断片をリリースする、構造スイッチングアプタマー等が挙げられる。この場合においては、リリースされた核酸断片を対象核酸としてもよい。 << Step (a) >>
As the target nucleic acid, a single-stranded nucleic acid is suitable. The nucleic acid may be DNA, RNA, or a nucleic acid analog. More specific target nucleic acids include miRNA, aptamer and the like. Examples of aptamers include structure-switching aptamers that release nucleic acid fragments by binding to target molecules. In this case, the released nucleic acid fragment may be the target nucleic acid.
　対象核酸の長さは、例えば１０～１００塩基であってもよく、１０～５０塩基であってもよく、１０～３０塩基であってもよい。 The length of the target nucleic acid may be, for example, 10 to 100 bases, 10 to 50 bases, or 10 to 30 bases.
　また、対象核酸を含有する試料としては特に制限されず、例えば、血液、血清、血漿等の生体試料が挙げられるがこれに限定されない。 Further, the sample containing the target nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include biological samples such as blood, serum, and plasma, but are not limited thereto.
　混合液のインキュベート温度は、検出対象である対象核酸が足場依存型鎖交換反応を行うことができる温度であればよく、例えば１０～５０℃の任意の温度であってもよく、例えば室温（約２５℃）であってもよい。また、均一に反応を進行させる観点から、インキュベート中に撹拌することが好ましい。 The incubation temperature of the mixed solution may be any temperature as long as the target nucleic acid to be detected can perform the anchorage-dependent strand exchange reaction, and may be any temperature of 10 to 50 ° C., for example, room temperature (about 25 ° C.). Moreover, it is preferable to stir during incubation from a viewpoint of making reaction progress uniformly.
　本実施形態の検出方法は、従来法よりも短時間で対象核酸を検出することができる。したがって、インキュベート時間は例えば１０分間～１０時間であってもよく、１０分間～５時間であってもよく、１０分間～３時間であってもよい。 The detection method of this embodiment can detect the target nucleic acid in a shorter time than the conventional method. Therefore, the incubation time may be, for example, 10 minutes to 10 hours, 10 minutes to 5 hours, or 10 minutes to 3 hours.
《工程（ｂ）》
　続いて、本工程において、解離した第１の粒子をその他の粒子と分離する。その他の粒子とは、解離した第２の粒子、及び、未反応の複合体（第１の粒子と第２の粒子とが結合した複合体）である。 << Step (b) >>
Subsequently, in this step, the dissociated first particles are separated from other particles. The other particles are dissociated second particles and unreacted complexes (complexes in which the first particles and the second particles are combined).
　例えば、第２の粒子が磁性粒子である場合、磁気スタンド等により磁場を適用することにより、解離した第２の粒子及び未反応の複合体を凝集させることができる。あるいは、例えば、第２の粒子が容易に遠心可能な粒子である場合、遠心分離することにより、解離した第２の粒子及び未反応の複合体を凝集させることができる。その結果、解離した第１の粒子を混合液中に分散することができる。 For example, when the second particles are magnetic particles, the dissociated second particles and the unreacted complex can be aggregated by applying a magnetic field with a magnetic stand or the like. Alternatively, for example, when the second particles are particles that can be easily centrifuged, the dissociated second particles and the unreacted complex can be aggregated by centrifugation. As a result, the dissociated first particles can be dispersed in the mixed liquid.
《工程（ｃ）》
　続いて、本工程において、混合液中に分散した第１の粒子の存在量を測定する。第１の粒子の存在量は、試料中の対象核酸の存在量に対応する。例えば、第１の粒子が特定の波長の光を吸収するものである場合には、分光光度計等により第１の粒子の存在量を測定することができる。 << Step (c) >>
Subsequently, in this step, the abundance of the first particles dispersed in the mixed solution is measured. The abundance of the first particles corresponds to the abundance of the target nucleic acid in the sample. For example, when the first particles absorb light of a specific wavelength, the abundance of the first particles can be measured with a spectrophotometer or the like.
　また、第１の粒子が蛍光を発するものである場合には、励起光を照射して、発生する蛍光を蛍光分光光度計等により測定することにより、第１の粒子の存在量を測定することができる。 Further, when the first particles emit fluorescence, the abundance of the first particles is measured by irradiating excitation light and measuring the generated fluorescence with a fluorescence spectrophotometer or the like. Can do.
　また、第１の粒子が酵素で標識されている場合、第１の粒子に適切な基質を反応させることにより生じる、発色、発光、蛍光等を測定することにより、第１の粒子の存在量を測定することができる。 In addition, when the first particles are labeled with an enzyme, the amount of the first particles present can be determined by measuring color development, luminescence, fluorescence, etc. generated by reacting the first particles with an appropriate substrate. Can be measured.
（検出方法：第１実施形態）
　上述した第１実施形態の複合体を用いて本実施形態の検出方法を実施する場合について説明する。一例として、上記式（１）で表される複合体を使用して試料中の対象核酸を検出する場合について説明する。ここで、対象核酸はγ－δ［但し、γは上記式（１）における定義に同じであり、δは上記式（１）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片（例えば、ｍｉＲＮＡ）であるものとする。 (Detection method: first embodiment)
The case where the detection method of this embodiment is implemented using the composite_body | complex of 1st Embodiment mentioned above is demonstrated. As an example, a case where a target nucleic acid in a sample is detected using the complex represented by the above formula (1) will be described. Here, the target nucleic acid is γ-δ [where γ is the same as defined in the above formula (1), and δ is a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the above δ ′ in the above formula (1). Represents. ] Is a single-stranded nucleic acid fragment (for example, miRNA) having the base sequence.
《工程（ａ）》
　本工程において、試料と、式（１）で表される複合体とを混合して混合液を調製し、インキュベートする。その結果、混合液中で、試料中の対象核酸が、式（１）で表される複合体を構成する第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、第１の粒子と第２の粒子との結合が解離する。この足場依存型鎖交換反応、及び第１の粒子と第２粒子との結合の解離については、第１実施形態の複合体の説明において上述したものと同様である。 << Step (a) >>
In this step, the sample and the complex represented by the formula (1) are mixed to prepare a mixed solution and incubated. As a result, the target nucleic acid in the sample undergoes a scaffold-dependent strand exchange reaction with the first nucleic acid structure constituting the complex represented by the formula (1) in the mixed solution. As a result, the bond between the first particle and the second particle is dissociated. The scaffold-dependent chain exchange reaction and the dissociation of the bond between the first particle and the second particle are the same as those described above in the description of the complex of the first embodiment.
《工程（ｂ）及び工程（ｃ）》
　工程（ｂ）及び工程（ｃ）については、上述したものと同様である。本実施形態の検出方法により、対象核酸を簡便に検出することができる。 << Step (b) and Step (c) >>
Step (b) and step (c) are the same as described above. The target nucleic acid can be easily detected by the detection method of the present embodiment.
（検出方法：第２実施形態）
　続いて、第２実施形態の検出方法について説明する。本実施形態の検出方法は、上述した第１実施形態の検出方法と、工程（ａ）が異なっている。本実施形態の検出方法の工程（ａ）は、下記工程（ａ１）及び（ａ２）を備える。
　工程（ａ１）：試料と、上述した第２実施形態の複合体と、α－β－γ［但し、α、β、γは、前記式（３）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを含む混合液をインキュベートする工程であって、前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からβ－γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離する工程。
　工程（ａ２）：α－β－γの塩基配列を有する前記一本鎖核酸断片が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からαの塩基配列を有する一本鎖核酸及び対象核酸が解離することにより、前記第１の粒子と前記第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸が再生される工程。 (Detection method: second embodiment)
Subsequently, the detection method of the second embodiment will be described. The detection method of this embodiment differs from the detection method of the first embodiment described above in step (a). Step (a) of the detection method of the present embodiment includes the following steps (a1) and (a2).
Step (a1): the sample, the complex of the second embodiment described above, and α-β-γ [wherein α, β, and γ are the same as defined in Formula (3). ] A step of incubating a mixed solution containing a single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of the above, wherein the target nucleic acid in the sample is exchanged with the first nucleic acid structure in a mixed solution. Performing a reaction, and as a result, dissociating a single-stranded nucleic acid having a base sequence of β-γ from the first nucleic acid structure.
Step (a2): The single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of α-β-γ performs an anchorage-dependent strand exchange reaction with the first nucleic acid structure, and as a result, the first nucleic acid structure a step of dissociating a single-stranded nucleic acid having a base sequence of α and a target nucleic acid to dissociate a bond between the first particle and the second particle, thereby further regenerating the target nucleic acid.
　第２実施形態の検出方法では、試料中の対象核酸は、複合体中の第１の粒子及び第２の粒子を解離させた後、再生される。そして、再生された対象核酸は、更に別の複合体と反応し、第１の粒子と第２の粒子を解離させる。このため、本実施形態の検出方法では、対象核酸の検出速度又は検出感度が向上している。 In the detection method of the second embodiment, the target nucleic acid in the sample is regenerated after dissociating the first particle and the second particle in the complex. The regenerated target nucleic acid then reacts with another complex to dissociate the first particles and the second particles. For this reason, in the detection method of this embodiment, the detection speed or detection sensitivity of the target nucleic acid is improved.
　ここで、検出速度が向上しているとは、所定のレベルのシグナルを生成するのに要する時間が短縮することを意味する。また、検出感度が向上しているとは、工程（ａ）を所定の時間実施した場合に得られるシグナルが高くなることを意味する。 Here, the improvement in the detection speed means that the time required to generate a predetermined level of signal is shortened. Moreover, that the detection sensitivity is improving means that the signal obtained when the step (a) is carried out for a predetermined time is increased.
　ここで、一例として、上記式（２）で表される複合体を使用して試料中の対象核酸を検出する場合についてより詳細に説明する。ここで、対象核酸はγ－δ［但し、γは上記式（１）における定義に同じであり、δは上記式（１）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片（例えば、ｍｉＲＮＡ）であるものとする。 Here, as an example, the case where the target nucleic acid in a sample is detected using the complex represented by the above formula (2) will be described in more detail. Here, the target nucleic acid is γ-δ [where γ is the same as defined in the above formula (1), and δ is a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the above δ ′ in the above formula (1). Represents. ] Is a single-stranded nucleic acid fragment (for example, miRNA) having the base sequence.
《工程（ａ１）》
　本工程において、試料と、式（２）で表される複合体と、α－β－γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを混合して混合液を調製し、インキュベートする。その結果、混合液中で、試料中の対象核酸が式（２）で表される複合体を構成する第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、第１の核酸構造体からβ－γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離する。この足場依存型鎖交換反応、及びβ－γの塩基配列を有する一本鎖核酸の解離については、第２実施形態の複合体の説明において上述したものと同様である。 << Step (a1) >>
In this step, a sample, a complex represented by the formula (2), and a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of α-β-γ are mixed to prepare a mixed solution and incubated. As a result, the target nucleic acid in the sample undergoes a scaffold-dependent strand exchange reaction with the first nucleic acid structure constituting the complex represented by the formula (2) in the mixed solution. As a result, a single-stranded nucleic acid having a β-γ base sequence is dissociated from the first nucleic acid structure. The anchorage-dependent strand exchange reaction and the dissociation of the single-stranded nucleic acid having the base sequence of β-γ are the same as those described above in the description of the complex of the second embodiment.
《工程（ａ２）》
　続いて、本工程において、α－β－γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が、β－γが解離した第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、第１の核酸構造体から、αの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離し、対象核酸が再生する。そして、第１の粒子と第２の粒子の結合が解離する。この足場依存型鎖交換反応、第１の粒子と第２粒子との結合の解離、及び対象核酸の再生については、第２実施形態の複合体の説明において上述したものと同様である。再生した対象核酸は、更に別の複合体と反応し、第１の粒子と第２の粒子を解離させる。このため、本実施形態の検出方法では、対象核酸の検出速度又は検出感度が向上している。 << Step (a2) >>
Subsequently, in this step, a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of α-β-γ performs an anchorage-dependent strand exchange reaction with the first nucleic acid structure from which β-γ is dissociated. As a result, the single-stranded nucleic acid having the base sequence α is dissociated from the first nucleic acid structure, and the target nucleic acid is regenerated. Then, the bond between the first particle and the second particle is dissociated. The scaffold-dependent strand exchange reaction, the dissociation of the bond between the first particle and the second particle, and the regeneration of the target nucleic acid are the same as those described above in the description of the complex of the second embodiment. The regenerated target nucleic acid further reacts with another complex to dissociate the first particles and the second particles. For this reason, in the detection method of this embodiment, the detection speed or detection sensitivity of the target nucleic acid is improved.
《工程（ｂ）及び工程（ｃ）》
　工程（ｂ）及び工程（ｃ）については、上述したものと同様である。 << Step (b) and Step (c) >>
Step (b) and step (c) are the same as described above.
（検出方法：第３実施形態）
　続いて、第３実施形態の検出方法について説明する。本実施形態の検出方法は、下記工程（ａａ）、（ｂｂ）及び（ｃｃ）を備えている。
　工程（ａａ）：試料と、上述した第３実施形態の複合体とを含む混合液をインキュベートする工程であって、前記混合液中で、足場依存型鎖交換反応により前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離するとともに対象核酸が増幅される工程。
　工程（ｂｂ）：工程（ａａ）の後に、解離した前記第２の粒子及び未反応の前記複合体を凝集させる工程であって、その結果、解離した前記第１の粒子が前記混合液中に分散する工程。
　工程（ｃｃ）：工程（ｂｂ）の後に、前記混合液中の前記第１の粒子の存在量を測定する工程であって、測定された前記存在量が前記対象核酸の存在量に対応する工程。 (Detection method: third embodiment)
Subsequently, the detection method of the third embodiment will be described. The detection method of this embodiment includes the following steps (aa), (bb), and (cc).
Step (aa): a step of incubating a mixed solution containing a sample and the complex of the third embodiment described above, wherein the first particles and the above-described mixture are mixed in the mixed solution by an anchorage-dependent strand exchange reaction. A step in which the target nucleic acid is amplified while the bond with the second particle is dissociated.
Step (bb): a step of aggregating the dissociated second particles and the unreacted complex after step (aa), and as a result, the dissociated first particles are contained in the mixed solution. Step of dispersing.
Step (cc): a step of measuring the abundance of the first particles in the mixed solution after the step (bb), wherein the abundance measured corresponds to the abundance of the target nucleic acid. .
　ここで、対象核酸が増幅されるとは、対象核酸が新たに生成され、対象核酸の分子数が増加することを意味する。 Here, amplification of the target nucleic acid means that the target nucleic acid is newly generated and the number of molecules of the target nucleic acid increases.
　第３実施形態の検出方法では、試料中の対象核酸は、複合体中の第１の粒子及び第２の粒子を解離させた後再生され、更に新たに生成（増幅）される。そして、再生された対象核酸、及び新たに生成された対象核酸は、更に別の複合体と反応し、第１の粒子と第２の粒子を解離させ、更に対象核酸を増幅させる。このため、本実施形態の検出方法では、対象核酸の検出速度又は検出感度が格段に向上している。 In the detection method of the third embodiment, the target nucleic acid in the sample is regenerated after dissociating the first particle and the second particle in the complex, and further generated (amplified). Then, the regenerated target nucleic acid and the newly generated target nucleic acid react with another complex, dissociate the first particle and the second particle, and further amplify the target nucleic acid. For this reason, in the detection method of this embodiment, the detection speed or detection sensitivity of the target nucleic acid is significantly improved.
　第３実施形態の複合体としては、上述した式（５）で表される複合体を利用することができる。第３実施形態の複合体は、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。 As the complex of the third embodiment, the complex represented by the above formula (5) can be used. The composite of 3rd Embodiment may be used individually by 1 type, and may be used in combination of 2 or more type.
　ここで、一例として、第３実施形態の複合体を２種類用いる検出方法について、より詳細に説明する。ここで、対象核酸はγ－δ［但し、γは上記式（１）における定義に同じであり、δは上記式（１）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片（例えば、ｍｉＲＮＡ）であるものとする。 Here, as an example, a detection method using two types of the complex of the third embodiment will be described in more detail. Here, the target nucleic acid is γ-δ [where γ is the same as defined in the above formula (1), and δ is a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the above δ ′ in the above formula (1). Represents. ] Is a single-stranded nucleic acid fragment (for example, miRNA) having the base sequence.
　本例においては、上述した工程（ａａ）は、後述する工程（ａａ１）、工程（ａａ２）、工程（ａａ３）及び工程（ａａ４）を備えている。また、対象核酸はγ－δ［但し、γは上記式（３）における定義に同じであり、δは上記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片（例えば、ｍｉＲＮＡ）であるものとする。 In this example, the process (aa) described above includes a process (aa1), a process (aa2), a process (aa3), and a process (aa4) described later. The target nucleic acid is γ-δ [where γ is the same as defined in the above formula (3), and δ is a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the above δ ′ in the above formula (3). To express. ] Is a single-stranded nucleic acid fragment (for example, miRNA) having the base sequence.
《工程（ａａ１）》
　本工程において、試料と、下記式（６）で表され、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した第１の複合体と、下記式（７）で表され、第２の核酸構造体を介して前記第１の粒子と前記第２の粒子とが結合した第２の複合体と、下記式（８）で表される第３の核酸構造体と、λ－γ－β－γ［但し、λ、β、γは、下記式（８）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを混合して混合液を調製し、インキュベートする。 << Step (aa1) >>
In this step, the sample, the first complex represented by the following formula (6), in which the first particles and the second particles are bonded via the first nucleic acid structure, and the following formula (7) A second complex in which the first particle and the second particle are bound via a second nucleic acid structure, and a third nucleic acid structure represented by the following formula (8): And λ-γ-β-γ [where λ, β, and γ are the same as defined in the following formula (8). ] Is mixed with a single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
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　式（６）中、Ｘ１、Ｘ２、α、α’、β’、γ、γ’及びδ’は上記式（３）における定義に同じであり、δは前記δ’又と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。 In the formula (6), X 1 , X 2 , α, α ′, β ′, γ, γ ′ and δ ′ are the same as defined in the above formula (3), and δ is complementary to the δ ′ or This represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence.
　式（６）で表される第１の複合体において、粒子Ｘ１は一本鎖核酸断片αと結合している。また、一本鎖核酸断片γ及びδは連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、一本鎖核酸断片α’、β’、γ’及びδ’は連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、粒子Ｘ２は一本鎖核酸断片δ’と結合している。また、一本鎖核酸断片α及びα’、γ及びγ’、δ及びδ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、αとγとは結合していない。その結果、一本鎖核酸断片α、α’、β’、γ、γ’、δ及びδ’は第１の核酸構造体を形成しており、第１の核酸構造体を介して粒子Ｘ１と粒子Ｘ２とが結合し、複合体を形成している。 In the first complex of the formula (6), the particles X 1 is bound to the single-stranded nucleic acid fragments alpha. In addition, single-stranded nucleic acid fragments γ and δ are linked to form a single-stranded nucleic acid fragment. Single-stranded nucleic acid fragments α ′, β ′, γ ′ and δ ′ are linked to form a single-stranded nucleic acid fragment. The particle X 2 is bound to single-stranded nucleic acid fragments [delta] '. Single-stranded nucleic acid fragments α and α ′, γ and γ ′, δ and δ ′ are hybridized, respectively. Α and γ are not bonded. As a result, the single-stranded nucleic acid fragments α, α ′, β ′, γ, γ ′, δ, and δ ′ form the first nucleic acid structure, and the particle X 1 passes through the first nucleic acid structure. and the particles X 2 attached to form a complex with.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
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　式（７）中、Ｘ１、Ｘ２、γ、γ’、δ及びδ’は上記式（６）における定義に同じであり、θ’及びλ’はそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、θは前記θ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。 In the formula (7), X 1 , X 2 , γ, γ ′, δ and δ ′ are the same as defined in the above formula (6), and θ ′ and λ ′ are single strands each having an arbitrary base sequence. Represents a nucleic acid fragment, and θ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to θ ′.
　式（７）で表される第２の複合体において、粒子Ｘ１は式（６）で表される複合体における粒子Ｘ１と同じものであり、一本鎖核酸断片θと結合している。また、一本鎖核酸断片γ及びδは連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、一本鎖核酸断片θ’、λ’、γ’及びδ’は連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、粒子Ｘ２は式（６）で表される複合体における粒子Ｘ２と同じものであり、一本鎖核酸断片δ’と結合している。また、一本鎖核酸断片θ及びθ’、γ及びγ’、δ及びδ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、θとγとは結合していない。その結果、一本鎖核酸断片θ、θ’、λ’、γ、γ’、δ及びδ’は第２の核酸構造体を形成しており、第２の核酸構造体を介して粒子Ｘ１と粒子Ｘ２とが結合し、複合体を形成している。 In the second complex of the formula (7), particles X 1 is identical to the particle X 1 in the complex represented by the formula (6), is bonded to the single-stranded nucleic acid fragments θ . In addition, single-stranded nucleic acid fragments γ and δ are linked to form a single-stranded nucleic acid fragment. The single-stranded nucleic acid fragments θ ′, λ ′, γ ′ and δ ′ are linked to form a single-stranded nucleic acid fragment. The particle X 2 is identical to the particle X 2 in the complex represented by the formula (6), is bonded to the single-stranded nucleic acid fragments [delta] '. Moreover, the single-stranded nucleic acid fragments θ and θ ′, γ and γ ′, δ and δ ′ are hybridized, respectively. Also, θ and γ are not coupled. As a result, the single-stranded nucleic acid fragments θ, θ ′, λ ′, γ, γ ′, δ, and δ ′ form the second nucleic acid structure, and the particle X 1 passes through the second nucleic acid structure. and the particles X 2 attached to form a complex with.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
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　式（８）中、α、β、β’、γ、γ’、δ’は前記式（３）における定義に同じであり、θ及びλはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、λ’は前記λと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。 In Formula (8), α, β, β ′, γ, γ ′, and δ ′ are the same as defined in Formula (3), and θ and λ are single-stranded nucleic acid fragments each having an arbitrary base sequence. Λ ′ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to λ.
　式（８）で表される第３の核酸構造体において、一本鎖核酸断片θ、λ及びγは連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、一本鎖核酸断片α、β及びγは連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、一本鎖核酸断片λ’、γ’、β’、γ’及びδ’は連結して一本鎖の核酸断片を形成している。また、一本鎖核酸断片λ及びλ’、２組存在するγ及びγ’、β及びβ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、γとβとは結合していない。 In the third nucleic acid structure represented by the formula (8), the single-stranded nucleic acid fragments θ, λ, and γ are linked to form a single-stranded nucleic acid fragment. Single-stranded nucleic acid fragments α, β, and γ are linked to form a single-stranded nucleic acid fragment. The single-stranded nucleic acid fragments λ ′, γ ′, β ′, γ ′ and δ ′ are linked to form a single-stranded nucleic acid fragment. In addition, single-stranded nucleic acid fragments λ and λ ′, and two pairs of γ and γ ′, β and β ′ are hybridized, respectively. Also, γ and β are not bonded.
　ここで、上述した式（７）で表される複合体を構成する第２の核酸構造体、及び式（８）で表される第３の核酸構造体において、θ＝αであってもよい。すなわち、θ及びαは同じ塩基配列を有する一本鎖核酸断片であってもよい。これにより、式（６）で表される第１の複合体におけるＸ１－αと式（７）で表される第２の複合体におけるＸ１－θを共通化することができる。 Here, in the second nucleic acid structure constituting the complex represented by the formula (7) and the third nucleic acid structure represented by the formula (8), θ = α may be satisfied. . That is, θ and α may be single-stranded nucleic acid fragments having the same base sequence. Thereby, X 1 -α in the first complex represented by the formula (6) and X 1 -θ in the second complex represented by the formula (7) can be shared.
　第１の複合体と、第２の複合体と、第３の核酸構造体と、λ－γ－β－γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを含む混合液をインキュベートした結果、混合液中で、試料中の対象核酸γ－δが式（８）で表される第３の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、第３の核酸構造体からα－β－γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離する。 As a result of incubating a mixed solution containing the first complex, the second complex, the third nucleic acid structure, and the single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of λ-γ-β-γ, In the liquid, the target nucleic acid γ-δ in the sample undergoes a scaffold-dependent strand exchange reaction with the third nucleic acid structure represented by the formula (8). As a result, the single-stranded nucleic acid having the base sequence of α-β-γ is dissociated from the third nucleic acid structure.
　対象核酸γ－δが第３の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、第３の核酸構造体からα－β－γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離した状態を下記式（８－１）に示す。 The target nucleic acid γ-δ undergoes a scaffold-dependent strand exchange reaction with the third nucleic acid structure, and the state where the single-stranded nucleic acid having the base sequence of α-β-γ is dissociated from the third nucleic acid structure is represented by the following formula: This is shown in (8-1).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　式（８－１）において、一本鎖核酸断片λ及びλ’、２組存在するγ及びγ’、δ及びδ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、α－β－γは遊離している。 In the formula (8-1), single-stranded nucleic acid fragments λ and λ ′ and two pairs of γ and γ ′, δ and δ ′ are hybridized, respectively. Α-β-γ is free.
《工程（ａａ２）》
　続いて、本工程において、工程（ａａ１）で遊離したα－β－γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が、上述した式（６）で表される複合体を構成する第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、第１の核酸構造体からαの塩基配列を有する一本鎖核酸及びγ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離する。そして、第１の粒子と第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸γ－δが生成される。 << Step (aa2) >>
Subsequently, in this step, the first nucleic acid constituting the complex represented by the above formula (6), wherein the single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of α-β-γ released in step (aa1) is used. Perform scaffold-dependent chain exchange reaction with the structure. As a result, a single-stranded nucleic acid having an α base sequence and a single-stranded nucleic acid fragment having a γ-δ base sequence are dissociated from the first nucleic acid structure. Then, the bond between the first particle and the second particle is dissociated, and the target nucleic acid γ-δ is further generated.
　α－β－γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が、式（６）で表される複合体を構成する第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行った結果、粒子Ｘ１と粒子Ｘ２との結合が解離し、対象核酸γ－δが生成された状態を下記式（６－１）に示す。 As a result of a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of α-β-γ undergoing an anchorage-dependent strand exchange reaction with the first nucleic acid structure constituting the complex represented by formula (6), particle X The state where the bond between 1 and the particle X 2 is dissociated and the target nucleic acid γ-δ is generated is shown in the following formula (6-1).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　式（６－１）において、一本鎖核酸断片α及びα’、β及びβ’、γ及びγ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、Ｘ１－α及びγ－δはそれぞれ遊離している。この反応により、第１の粒子と第２の粒子の結合が解離するとともに、試料中のγ－δの分子数が増幅する。 In the formula (6-1), the single-stranded nucleic acid fragments α and α ′, β and β ′, γ and γ ′ are hybridized, respectively. X 1 -α and γ-δ are free. By this reaction, the bond between the first particle and the second particle is dissociated, and the number of γ-δ molecules in the sample is amplified.
《工程（ａａ３）》
　一方、工程（ａａ１）でインキュベートした混合液中のλ－γ－β－γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片は、上記式（８－１）で表される前記第３の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、式（８－１）で表される第３の核酸構造体からθ－λ－γの塩基配列を有する一本鎖核酸及び対象核酸γ－δが解離する。すなわち、一度足場依存型鎖交換反応を行った、試料中の対象核酸γ－δが再生され、再び反応に関与できる状態になる。 << Step (aa3) >>
On the other hand, the single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of λ-γ-β-γ in the mixed solution incubated in step (aa1) is the third nucleic acid structure represented by the above formula (8-1). And perform a scaffold-dependent strand exchange reaction. As a result, the single-stranded nucleic acid having the base sequence of θ-λ-γ and the target nucleic acid γ-δ are dissociated from the third nucleic acid structure represented by the formula (8-1). That is, once the scaffold-dependent strand exchange reaction is performed, the target nucleic acid γ-δ in the sample is regenerated and can be involved in the reaction again.
　式（８－１）で表される第３の核酸構造体からθ－λ－γの塩基配列を有する一本鎖核酸及び対象核酸γ－δが解離した状態を下記式（８－２）に示す。 A state where the single-stranded nucleic acid having the base sequence of θ-λ-γ and the target nucleic acid γ-δ are dissociated from the third nucleic acid structure represented by the formula (8-1) is expressed by the following formula (8-2). Show.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　式（８－２）において、一本鎖核酸断片λ及びλ’、２組存在するγ及びγ’、β及びβ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、θ－λ－γ及びγ－δはそれぞれ遊離している。 In the formula (8-2), single-stranded nucleic acid fragments λ and λ ′, and two pairs of γ and γ ′, β and β ′ are hybridized, respectively. Also, θ-λ-γ and γ-δ are free.
《工程（ａａ４）》
　本工程において、工程（ａａ３）で遊離したθ－λ－γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が、上述した式（７）で表される複合体を構成する第２の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、第２の核酸構造体からθの塩基配列を有する一本鎖核酸及びγ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離する。そして、第１の粒子と第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸γ－δが生成される。 << Process (aa4) >>
In this step, the single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of θ-λ-γ released in step (aa3) is a second nucleic acid structure constituting the complex represented by the formula (7) described above. An anchorage-dependent strand exchange reaction is performed. As a result, the single-stranded nucleic acid having a base sequence of θ and the single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ are dissociated from the second nucleic acid structure. Then, the bond between the first particle and the second particle is dissociated, and the target nucleic acid γ-δ is further generated.
　θ－λ－γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が、式（７）で表される複合体を構成する第２の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行った結果、粒子Ｘ１と粒子Ｘ２との結合が解離し、対象核酸γ－δが生成された状態を下記式（７－１）に示す。 As a result of a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of θ-λ-γ undergoing an anchorage-dependent strand exchange reaction with the second nucleic acid structure constituting the complex represented by the formula (7), 1 and bonded dissociation of the particles X 2, showing a state in which the target nucleic acid gamma-[delta] is generated by the following equation (7-1).
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　式（７－１）において、一本鎖核酸断片θ及びθ’、λ及びλ’、γ及びγ’は、それぞれハイブリダイズしている。また、Ｘ１－θ及びγ－δはそれぞれ遊離している。この反応により、第１の粒子と第２の粒子の結合が解離するとともに、試料中のγ－δの分子数が増幅する。 In the formula (7-1), the single-stranded nucleic acid fragments θ and θ ′, λ and λ ′, γ and γ ′ are hybridized, respectively. X 1 -θ and γ-δ are free. By this reaction, the bond between the first particle and the second particle is dissociated, and the number of γ-δ molecules in the sample is amplified.
　以上説明した工程（ａａ１）～（ａａ４）は、混合液をインキュベートしている間、繰り返し進行する。そして、工程（ａａ２）、工程（ａａ４）で新たに生成された対象核酸γ－δ、及び、工程（ａａ３）で再生された対象核酸γ－δは、更に、未反応の第３の核酸構造体と反応し、第１の粒子Ｘ１を解離させる。そして、遊離の粒子Ｘ１の量は、工程（ｂｂ）及び工程（ｃｃ）を経て、試料中の対象核酸の量に対応するシグナルとして検出される。 The steps (aa1) to (aa4) described above proceed repeatedly while the mixed solution is incubated. The target nucleic acid γ-δ newly generated in step (aa2) and step (aa4) and the target nucleic acid γ-δ regenerated in step (aa3) are further converted into an unreacted third nucleic acid structure. react with the body, it is dissociated first particles X 1. The amount of particles X 1 free undergoes a step (bb) and step (cc), is detected as a signal corresponding to the amount of target nucleic acid in the sample.
《工程（ｂｂ）及び工程（ｃｃ）》
　工程（ｂｂ）は上述した工程（ｂ）と同様である。また、工程（ｃｃ）は上述した工程（ｃ）と同様である。 << Step (bb) and Step (cc) >>
Step (bb) is the same as step (b) described above. Step (cc) is the same as step (c) described above.
《シグナル及び対象核酸の増幅》
　本例の反応においては、工程（ａａ１）～（ａａ４）が１回ずつ実行された場合を１サイクルとし、反応がｎサイクル実行されると、混合液中の対象核酸の存在量が３ｎ倍に増幅する。また、遊離の粒子Ｘ１の量は２×３ｎ－１倍ずつ増幅する。このように、第３実施形態の検出方法によれば、対象核酸の検出速度又は検出感度が格段に向上している。 << Amplification of signal and target nucleic acid >>
In the reaction of this example, the case where the steps (aa1) to (aa4) are executed once is regarded as one cycle, and when the reaction is executed n times, the abundance of the target nucleic acid in the mixed solution is 3 n times. Amplify to. The amount of free particles X 1 amplifies by a factor 2 × 3 n-1. Thus, according to the detection method of the third embodiment, the detection speed or detection sensitivity of the target nucleic acid is remarkably improved.
［試料中の対象核酸の検出キット］
　１実施形態において、本発明は、上述したいずれかの複合体を備える、試料中の対象核酸の検出キットを提供する。実施例において後述するように、本実施形態のキットによれば、試料中の対象核酸を簡便に検出することができる。 [Detection kit for target nucleic acid in sample]
In one embodiment, the present invention provides a detection kit for a nucleic acid of interest in a sample, comprising any of the complexes described above. As will be described later in the Examples, according to the kit of this embodiment, the target nucleic acid in the sample can be easily detected.
（検出キット：第２実施形態）
　１実施形態において、検出キットは、対象核酸がγ－δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片であり、上述した第２実施形態の複合体と、α－β－γ［但し、α、β、γは、前記式（３）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを備えるものであってもよい。 (Detection kit: second embodiment)
In one embodiment, in the detection kit, the target nucleic acid is γ-δ [where γ is the same as defined in the formula (3), and δ is a base sequence complementary to the δ ′ in the formula (3). It represents a single-stranded nucleic acid fragment. ] The single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of the above-mentioned complex of the second embodiment and α-β-γ [where α, β, γ are the same as defined in the above formula (3). is there. And a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of
　本実施形態の検出キットは、上述した、第２実施形態の検出方法に使用することができる。本実施形態のキットによれば、対象核酸を再生することができるため、対象核酸の検出速度又は検出感度が向上している。 The detection kit of this embodiment can be used for the detection method of the second embodiment described above. According to the kit of this embodiment, since the target nucleic acid can be regenerated, the detection speed or detection sensitivity of the target nucleic acid is improved.
（検出キット：第３実施形態）
　１実施形態において、検出キットは、対象核酸がγ－δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片であり、上述した第３実施形態の複合体と、上記式（８）で表される核酸構造体と、λ－γ－β－γ［但し、λ、β、γは、前記式（８）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを備えるものであってもよい。 (Detection kit: third embodiment)
In one embodiment, in the detection kit, the target nucleic acid is γ-δ [where γ is the same as defined in the formula (3), and δ is a base sequence complementary to the δ ′ in the formula (3). It represents a single-stranded nucleic acid fragment. ] A single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of the above-mentioned, the complex of the third embodiment described above, the nucleic acid structure represented by the above formula (8), and λ-γ-β-γ [where λ , Β, and γ are the same as defined in the equation (8). And a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of
　第３実施形態の検出キットが備える複合体は、１種であってもよく、２種以上の組み合わせであってもよい。複合体が２種の組み合わせである場合、例えば、上記式（６）で表される第１の複合体と、上記式（７）で表される第２の複合体との組み合わせであってもよい。複合体を２種以上組み合わせることにより、対象核酸及びシグナルの増幅量を更に増大することができる。 The complex provided in the detection kit of the third embodiment may be one type or a combination of two or more types. When the complex is a combination of two kinds, for example, even if the first complex represented by the above formula (6) and the second complex represented by the above formula (7) are combined. Good. By combining two or more complexes, the amount of amplification of the target nucleic acid and signal can be further increased.
　本実施形態の検出キットは、上述した、第３実施形態の検出方法に使用することができる。本実施形態のキットによれば、対象核酸を再生させるだけでなく、対象核酸を新たに生成（増幅）させることができるため、対象核酸の検出速度又は検出感度を格段に向上させることができる。 The detection kit of this embodiment can be used for the detection method of the third embodiment described above. According to the kit of this embodiment, not only the target nucleic acid can be regenerated, but also the target nucleic acid can be newly generated (amplified), so that the detection speed or detection sensitivity of the target nucleic acid can be significantly improved.
（増感剤）
　上述した検出キットは、更に増感剤を備えていてもよい。増感剤としては、複合体から解離した第１の粒子に由来するシグナルを増幅するものであれば特に制限されない。例えば、第１の粒子が金ナノ粒子である場合、テトラクロリド金（ＩＩＩ）酸と塩酸ヒドロキシルアミンの組み合わせ等が挙げられる。 (Sensitizer)
The detection kit described above may further include a sensitizer. The sensitizer is not particularly limited as long as it amplifies a signal derived from the first particles dissociated from the complex. For example, when the first particles are gold nanoparticles, a combination of tetrachloride gold (III) acid and hydroxylamine hydrochloride can be used.
　次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to experimental examples, but the present invention is not limited to the following experimental examples.
＜実験例１＞
［複合体の調製］
　下記式（３）で表される複合体を調製した。より具体的には、下記式（３）において、Ｘ１が金ナノ粒子であり、Ｘ２が磁気粒子であり、α、α’、β、β’、γ、γ’、δ’、ε及びε’が下記表１に示す塩基配列の一本鎖ＤＮＡである複合体を調製した。本実験例で調製した複合体は、ｍｉＲＮＡの１種であるｍｉＲ３４ｃ（配列番号１６）を対象核酸として検出できるものである。 <Experimental example 1>
[Preparation of complex]
A complex represented by the following formula (3) was prepared. More specifically, in the following formula (3), X 1 is a gold nanoparticle, X 2 is a magnetic particle, α, α ′, β, β ′, γ, γ ′, δ ′, ε, and A complex in which ε ′ is a single-stranded DNA having the base sequence shown in Table 1 below was prepared. The complex prepared in this experimental example can detect miR34c (SEQ ID NO: 16), which is a kind of miRNA, as a target nucleic acid.
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
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Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
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　下記表２に、使用したＤＮＡ断片及びＲＮＡ断片の塩基配列の配列番号を示す。 Table 2 below shows the sequence numbers of the base sequences of the DNA fragments and RNA fragments used.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
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（ＤＮＡ／ＰＥＧ－金ナノ粒子の調製）
　表面にＤＮＡ及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合した金ナノ粒子（以下、「ＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ－金ナノ粒子」といい、ここで、ｘは金ナノ粒子１個あたりのＤＮＡ鎖の平均数を表す。）を調製した。 (Preparation of DNA / PEG-gold nanoparticles)
Gold nanoparticles having DNA and polyethylene glycol (PEG) bound to the surface (hereinafter referred to as “DNA (x) / PEG-gold nanoparticles”, where x is the average number of DNA strands per gold nanoparticle Was prepared).
　クエン酸で安定化した直径１５ｎｍの金ナノ粒子の溶液（２．３ｎＭ、１．４×１０１２個／ｍＬ）１０００μＬに、１．０（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０水溶液１０μＬ、及び２０μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｓ－２」）の水溶液（ｘ＝２２では３０μＬ、ｘ＝３３では３５μＬ、ｘ＝４２では４０μＬ、ｘ＝５５では５０μＬ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。 1000 μL of a solution of 15 nm diameter gold nanoparticles stabilized with citric acid (2.3 nM, 1.4 × 10 12 particles / mL), 10 μL of 1.0 (v / v)% Tween 20 aqueous solution, and 20 μM DNA ( An aqueous solution of “s-2” in Table 2 above (30 μL at x = 22, 35 μL at x = 33, 40 μL at x = 42, 50 μL at x = 55) was incubated at room temperature for 1 hour.
　続いて２０μＭのＰＥＧ（重量平均分子量６０００）の水溶液を３０μＬ添加した。１分間インキュベートした後、１０×リン酸バッファー（ＰＢＳ）を添加した。続いて、溶液を更に室温で１時間インキュベートした。 Subsequently, 30 μL of an aqueous solution of 20 μM PEG (weight average molecular weight 6000) was added. After 1 minute incubation, 10 × phosphate buffer (PBS) was added. Subsequently, the solution was further incubated at room temperature for 1 hour.
　続いて、溶液を２０，０００×ｇで２０分遠心し、遊離のＤＮＡ及びＰＥＧを除去することを３回繰り返した。上清を除去し、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５０μＬをＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ－金ナノ粒子の赤い油状の沈殿に添加して懸濁した。 Subsequently, the solution was centrifuged at 20,000 × g for 20 minutes to remove free DNA and PEG three times. The supernatant was removed and 250 μL of 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4) was added to the red oily precipitate of DNA (x) / PEG-gold nanoparticles and suspended.
　得られたＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ－金ナノ粒子の溶液は４℃で保存した。調製の過程で元の量の約３０％の金ナノ粒子が失われた。 The obtained DNA (x) / PEG-gold nanoparticle solution was stored at 4 ° C. Approximately 30% of the original amount of gold nanoparticles was lost during the preparation process.
（ｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ－金ナノ粒子の調製）
　ＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ－金ナノ粒子の０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液２５０μＬ（金ナノ粒子の濃度６ｎＭ、ｘ＝２２、３３、４２、５５）に、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２０μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｓ－１」）１４μＬ、及び０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２０μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｓ－３」）１２μＬを添加し、室温で６時間インキュベートした。 (Preparation of dsDNA (x) / PEG-gold nanoparticles)
To 250 μL of DNA (x) / PEG-gold nanoparticles in 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4) solution (gold nanoparticle concentration 6 nM, x = 22, 33, 42, 55), 14 μL of 20 μM DNA (“s-1” in Table 2 above) in 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4), and 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7) 4) of 12 μL of 20 μM DNA (“s-3” in Table 2 above) was added and incubated at room temperature for 6 hours.
　続いて、溶液を２０，０００×ｇで２０分遠心し、遊離のＤＮＡを除去することを３回繰り返した。上清を除去し、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２００μＬをｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ－金ナノ粒子の赤い油状の沈殿に添加して懸濁した。 Subsequently, the solution was centrifuged at 20,000 × g for 20 minutes to remove free DNA three times. The supernatant was removed, and 200 μL of 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4) was added to the red oily precipitate of dsDNA (x) / PEG-gold nanoparticles and suspended.
　続いて、各溶液の紫外光／可視光スペクトルを測定し、適切な量の０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して、金ナノ粒子の濃度を４ｎＭに調整した。得られたｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ－金ナノ粒子の溶液は４℃で保存した。 Subsequently, the ultraviolet light / visible light spectrum of each solution was measured, and an appropriate amount of 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4) was added to bring the gold nanoparticle concentration to 4 nM. It was adjusted. The resulting dsDNA (x) / PEG-gold nanoparticle solution was stored at 4 ° C.
（複合体の調製）
　ストレプトアビジン修飾された磁気粒子（２０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、６×１０８個／ｍＬ）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）２０μＬで３回洗浄した。続いて、磁気粒子に２０μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｃａｐｔｕｒｅ－ＤＮＡ」）７．５μＬを添加して２５℃で３０分間穏やかに撹拌した。 (Preparation of complex)
Streptavidin-modified magnetic particles (20 μL, 10 mg / mL, 6 × 10 8 particles / mL) were washed three times with 20 μL of PBS (pH 7.4). Subsequently, 7.5 μL of 20 μM DNA (“capture-DNA” in Table 2 above) was added to the magnetic particles and gently stirred at 25 ° C. for 30 minutes.
　磁気スタンドを用いてＤＮＡ－磁気粒子を反応チューブの壁面に集め、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２０μＬで３回洗浄した。得られたＤＮＡ－磁気粒子に、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ－金ナノ粒子（２０μＬ、金ナノ粒子の濃度＝４ｎＭ）を添加し、２５℃で３０分間穏やかに撹拌して、複合体を形成させた。磁気スタンドを用いて形成された複合体を反応チューブの壁面に集め、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２０μＬで３回洗浄した。 DNA-magnetic particles were collected on the wall of the reaction tube using a magnetic stand, and washed 3 times with 20 μL of 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4). To the resulting DNA-magnetic particles, dsDNA (x) / PEG-gold nanoparticles (20 μL, gold nanoparticle concentration = 4 nM) in 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4). Added and gently stirred at 25 ° C. for 30 minutes to form a complex. The complex formed using a magnetic stand was collected on the wall of the reaction tube and washed three times with 20 μL of 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4).
　続いて、上清の波長５２２ｎｍにおける吸光度（Ａ５２２）を測定することにより複合体の収率を決定した。なお、金ナノ粒子は波長５２２ｎｍに吸光のピークを有している。続いて、複合体を０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３０μＬに懸濁した。金ナノ粒子の終濃度は２．６７ｎＭであった。 Subsequently, the yield of the complex was determined by measuring the absorbance (A 522 ) of the supernatant at a wavelength of 522 nm. Gold nanoparticles have a light absorption peak at a wavelength of 522 nm. Subsequently, the complex was suspended in 30 μL of 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4). The final concentration of gold nanoparticles was 2.67 nM.
＜実験例２＞
［金ナノ粒子１個あたりのＤＮＡ鎖の平均数の最適化］
　実験例１と同様にして調製した、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３０μＬ中の各複合体（金ナノ粒子の終濃度＝２．６７ｎＭ、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）の濃度＝５８．６７～１４６．８５ｎＭ、ｘ＝２２、３３、４２、５５）を９６ウェルプレートのウェルに添加した。 <Experimental example 2>
[Optimization of the average number of DNA strands per gold nanoparticle]
Each complex (final concentration of gold nanoparticles = 2.67 nM, dsDNA (double stranded) in 30 μL of 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4), prepared as in Experimental Example 1. DNA) concentration = 58.67 to 146.85 nM, x = 22, 33, 42, 55) was added to the wells of a 96-well plate.
　続いて、各複合体の溶液に、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－１２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１．０μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｆｕｅｌ－ＤＮＡ」）５μＬ、及び０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１．０μＭの対象核酸（上記表２の「ｍｉＲ３４ｃ」）５μＬを添加し、５０μＬの溶液を調製した。 Subsequently, 5 μL of 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4), 0.01 (v / v)% Tween20-125 mM MgCl 2 -PBS (pH 7.4) was added to each complex solution. 5 μL, 0.01 (v / v)% Tween20—5 μL of 1.0 μM DNA (“fuel-DNA” in Table 2 above) in PBS (pH 7.4), and 0.01 (v / v)% Tween20 -5 μL of 1.0 μM nucleic acid of interest (“miR34c” in Table 2 above) in PBS (pH 7.4) was added to prepare a 50 μL solution.
　溶液中のＭｇ２＋、金ナノ粒子、ｄｓＤＮＡ、ｆｕｅｌ－ＤＮＡ及びｍｉＲ３４ｃの終濃度は、それぞれ１２．５ｍＭ、１．６ｎＭ、３５～８８ｎＭ、１００ｎＭ及び１００ｎＭであった。 The final concentrations of Mg 2+ , gold nanoparticles, dsDNA, fuel-DNA and miR34c in solution were 12.5 mM, 1.6 nM, 35-88 nM, 100 nM and 100 nM, respectively.
　続いて、各溶液を２５℃で２時間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。この過程において、まず、ｍｉＲＮＡ３４ｃが複合体のｄｓＤＮＡと足場依存型鎖交換反応を行う。続いて、ｆｕｅｌ－ＤＮＡが複合体のｄｓＤＮＡと足場依存型鎖交換反応を行う。その結果、金ナノ粒子と磁気粒子との結合が解離する。インキュベーションの過程で、Ａ５２２を適切な時間間隔で測定した。Ａ５２２の測定は、磁場の適用下でマイクロプレート分光光度計により行った。 Subsequently, each solution was incubated at 25 ° C. for 2 hours with gentle agitation. In this process, miRNA34c first performs a scaffold-dependent strand exchange reaction with the complex dsDNA. Subsequently, the fuel-DNA performs an anchorage-dependent strand exchange reaction with the complex dsDNA. As a result, the bond between the gold nanoparticle and the magnetic particle is dissociated. During the course of incubation, A 522 was measured at appropriate time intervals. A 522 was measured with a microplate spectrophotometer under application of a magnetic field.
　図４は、Ａ５２２の測定結果を示すグラフである。その結果、金ナノ粒子１個あたりのＤＮＡ鎖の平均数ｘが２２である複合体において、Ａ５２２の変化が最も大きく最も速かった。この結果から、ｘ＝２２が最適であることが明らかとなった。そこで、後の実験においては、ｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ－金ナノ粒子（ｘ＝２２）を使用した。 FIG. 4 is a graph showing the measurement result of A522 . As a result, the average number x of DNA strands per gold nanoparticles in a complex is 22, the change in A 522 was the largest fastest. From this result, it was found that x = 22 is optimal. Therefore, dsDNA (x) / PEG-gold nanoparticles (x = 22) were used in later experiments.
＜実験例３＞
［ｆｕｅｌ－ＤＮＡ濃度の最適化］
　ｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ－金ナノ粒子（ｘ＝２２）を用いて調製した複合体を用いて、ｆｕｅｌ－ＤＮＡの最適な濃度を検討した。具体的には、ｍｉＲ３４ｃの終濃度を０又は１００ｎＭとし、ｆｕｅｌ－ＤＮＡの終濃度を５０、１００、１２０、１５０又は２００ｎＭとした点以外は、実験例２と同様の反応を行い、Ａ５２２を適切な時間間隔で測定した。 <Experimental example 3>
[Optimization of fuel-DNA concentration]
The optimal concentration of fuel-DNA was examined using a complex prepared using dsDNA (x) / PEG-gold nanoparticles (x = 22). Specifically, the same reaction as in Experimental Example 2 was performed except that the final concentration of miR34c was 0 or 100 nM and the final concentration of fuel-DNA was 50, 100, 120, 150, or 200 nM, and A 522 Measurements were taken at appropriate time intervals.
　図５は、Ａ５２２の測定結果を示すグラフである。その結果、ｍｉＲ３４ｃの濃度（図中、［ｍｉＲ３４ｃ］と表す。）が０ｎＭの試料と１００ｎＭの試料との間でＡ５２２の変化に明確な差が認められた。この結果は、本実験系によりｍｉＲ３４ｃを特異的に検出できることを示す。 FIG. 5 is a graph showing the measurement result of A522 . As a result, a clear difference was observed in the change in A 522 between a sample with a miR34c concentration (indicated by [miR34c] in the figure) of 0 nM and a sample with 100 nM. This result shows that miR34c can be specifically detected by this experimental system.
　また、ｆｕｅｌ－ＤＮＡの終濃度（図中、［ｆｕｅｌ］と表す。）が１５０ｎＭである試料において、最も高いシグナル／ノイズ比が得られることが明らかとなった。この結果から、ｆｕｅｌ－ＤＮＡの終濃度は１５０ｎＭが最適であることが明らかとなった。 Further, it was revealed that the highest signal / noise ratio was obtained in the sample having a final concentration of fuel-DNA (denoted as [fuel] in the figure) of 150 nM. From this result, it was revealed that the final concentration of fuel-DNA is optimally 150 nM.
＜実験例４＞
［緩衝液中のｍｉＲ３４ｃの検出］
　ｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ－金ナノ粒子（ｘ＝２２）を用いて調製した複合体を用いて、緩衝液中でｍｉＲ３４ｃの検出を行った。具体的には、実験例１と同様にして調製した、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３０μＬ中の複合体（金ナノ粒子の終濃度＝２．６７ｎＭ、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）の濃度＝５８．６７ｎＭ、ｘ＝２２）を９６ウェルプレートのウェルに添加した。 <Experimental example 4>
[Detection of miR34c in buffer]
Detection of miR34c was performed in a buffer using a complex prepared using dsDNA (x) / PEG-gold nanoparticles (x = 22). Specifically, a complex (final concentration of gold nanoparticles = 2.67 nM, dsDNA) prepared in the same manner as in Experimental Example 1 in 30 μL of 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4) (Double-stranded DNA) concentration = 58.67 nM, x = 22) was added to the wells of a 96-well plate.
　続いて、複合体の溶液に、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－１２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１．５μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｆｕｅｌ－ＤＮＡ」）５μＬ、及び０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の様々な濃度の対象核酸（上記表２の「ｍｉＲ３４ｃ」）５μＬを添加し、５０μＬの溶液を調製した。 Subsequently, 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4) 5 μL, 0.01 (v / v)% Tween20-125 mM MgCl 2 -PBS (pH 7.4) 5 μL were added to the complex solution. , 0.01 (v / v)% Tween20—5 μL of 1.5 μM DNA (“fuel-DNA” in Table 2 above) in PBS (pH 7.4), and 0.01 (v / v)% Tween20— 5 μL of nucleic acid of interest (“miR34c” in Table 2 above) at various concentrations in PBS (pH 7.4) was added to prepare a 50 μL solution.
　溶液中のＭｇ２＋、金ナノ粒子、ｄｓＤＮＡ、ｆｕｅｌ－ＤＮＡ及びｍｉＲ３４ｃの終濃度は、それぞれ１２．５ｍＭ、１．６ｎＭ、３５ｎＭ、１５０ｎＭ及び０～１０ｎＭであった。 The final concentrations of Mg 2+ , gold nanoparticles, dsDNA, fuel-DNA and miR34c in solution were 12.5 mM, 1.6 nM, 35 nM, 150 nM and 0-10 nM, respectively.
　続いて、各溶液を２５℃で２時間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。インキュベーションの過程で、Ａ５２２を適切な時間間隔で測定した。Ａ５２２の測定は、磁場の適用下でマイクロプレート分光光度計により行った。 Subsequently, each solution was incubated at 25 ° C. for 2 hours with gentle agitation. During the course of incubation, A 522 was measured at appropriate time intervals. A 522 was measured with a microplate spectrophotometer under application of a magnetic field.
　図６は、Ａ５２２の測定結果を示すグラフである。図中、ｍｉＲ３４ｃの濃度を［ｍｉＲ３４ｃ］と表す。また、図６における挿入図は、ｍｉＲ３４ｃの濃度０～１．０ｎＭの範囲の拡大図である。その結果、反応時間２時間での検出限界濃度が０．０５ｎＭであることが明らかとなった。 FIG. 6 is a graph showing the measurement result of A522 . In the figure, the concentration of miR34c is represented as [miR34c]. The inset in FIG. 6 is an enlarged view of the miR34c concentration range of 0 to 1.0 nM. As a result, it was revealed that the detection limit concentration at a reaction time of 2 hours was 0.05 nM.
＜実験例５＞
［増幅反応の検討］
　実験例４の反応後、金ナノ粒子の増幅反応を行い、検出感度の向上について検討した。具体的には、実験例４の反応後、磁気スタンドを用いて磁気粒子を壁面に集め、解離したＤＮＡ／ＰＥＧ－金ナノ粒子を含む上清を回収して新しい９６ウェルプレートに入れた。 <Experimental example 5>
[Examination of amplification reaction]
After the reaction in Experimental Example 4, an amplification reaction of gold nanoparticles was performed, and improvement in detection sensitivity was examined. Specifically, after the reaction in Experimental Example 4, magnetic particles were collected on the wall surface using a magnetic stand, and the supernatant containing dissociated DNA / PEG-gold nanoparticles was collected and placed in a new 96-well plate.
　続いて、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１０μＬ、２．５ｍＭ　ＨＡｕＣｌ４（テトラクロリド金（ＩＩＩ）酸）水溶液５μＬ、及び１００ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン５μＬを添加して混合し、混合液の波長５７５ｎｍにおける吸光度（Ａ５７５）を１分以内に測定した。この反応により、溶液中の金ナノ粒子を核として金ナノ粒子が成長し、検出感度が向上した。 Subsequently, 10 μL of 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4), 5 μL of 2.5 mM HAuCl 4 (tetrachloride gold (III) acid) aqueous solution, and 5 μL of 100 mM hydroxylamine hydrochloride were added and mixed. and, the absorbance at a wavelength of 575nm of mixture (a 575) was measured within 1 minute. By this reaction, gold nanoparticles grew from the gold nanoparticles in the solution as a nucleus, and the detection sensitivity was improved.
　図７は、Ａ５７５の測定結果を示すグラフである。図中、ｍｉＲ３４ｃの濃度を［ｍｉＲ３４ｃ］と表す。また、図７における挿入図は、ｍｉＲ３４ｃの濃度０～０．１ｎＭの範囲の拡大図である。また、図８は、増幅反応の前後における反応液の写真である。その結果、反応時間２時間後の増幅反応（１分間）により、検出限界濃度が０．００５ｎＭに向上し、目視でも検出できることが明らかとなった。 FIG. 7 is a graph showing the measurement result of A575 . In the figure, the concentration of miR34c is represented as [miR34c]. The inset in FIG. 7 is an enlarged view of the miR34c concentration range of 0 to 0.1 nM. FIG. 8 is a photograph of the reaction solution before and after the amplification reaction. As a result, the detection limit concentration was improved to 0.005 nM by the amplification reaction (1 minute) after 2 hours of reaction time, and it was revealed that it could be detected visually.
＜実験例６＞
［対象核酸の特異性の検討］
　ｄｓＤＮＡ（ｘ）／ＰＥＧ－金ナノ粒子（ｘ＝２２）を用いて調製した複合体を用いて、実験例４と同様にして、ｍｉＲ３４ｃ、ｍｉＲ３４ａ及びｍｉＲ３４ｂ＊の検出を行った。なお、使用した複合体は、ｍｉＲ３４ｃ検出用の塩基配列を有していた。ｍｉＲ３４ｃ、ｍｉＲ３４ａ及びｍｉＲ３４ｂ＊の塩基配列を下記表３に示す。表３中、ｍｉＲ３４ａ及びｍｉＲ３４ｂ＊の塩基配列のうち、ｍｉＲ３４ｃの塩基配列と相違する部分に下線を付す。 <Experimental example 6>
[Examination of specificity of target nucleic acid]
Using the complex prepared using dsDNA (x) / PEG-gold nanoparticles (x = 22), miR34c, miR34a and miR34b * were detected in the same manner as in Experimental Example 4. The complex used had a base sequence for miR34c detection. The base sequences of miR34c, miR34a and miR34b * are shown in Table 3 below. In Table 3, a portion of the base sequence of miR34a and miR34b * that is different from the base sequence of miR34c is underlined.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
　具体的には、実験例１と同様にして調製した、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）３０μＬ中の複合体（金ナノ粒子の終濃度＝２．６７ｎＭ、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）の濃度＝５８．６７ｎＭ、ｘ＝２２）を９６ウェルプレートのウェルに添加した。 Specifically, a complex (final concentration of gold nanoparticles = 2.67 nM, dsDNA) in 30 μL of 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4) prepared in the same manner as in Experimental Example 1. (Double-stranded DNA) concentration = 58.67 nM, x = 22) was added to the wells of a 96-well plate.
　続いて、複合体の溶液に、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－１２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１．５μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｆｕｅｌ－ＤＮＡ」）５μＬ、及び０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１ｎＭ又は５０ｎＭの各ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ３４ｃ、ｍｉＲ３４ａ及びｍｉＲ３４ｂ＊）５μＬを添加し、５０μＬの溶液を調製した。 Subsequently, 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4) 5 μL, 0.01 (v / v)% Tween20-125 mM MgCl 2 -PBS (pH 7.4) 5 μL were added to the complex solution. , 0.01 (v / v)% Tween20—5 μL of 1.5 μM DNA (“fuel-DNA” in Table 2 above) in PBS (pH 7.4), and 0.01 (v / v)% Tween20— 5 μL of 1 nM or 50 nM of each miRNA (miR34c, miR34a and miR34b * ) in PBS (pH 7.4) was added to prepare a 50 μL solution.
　溶液中のＭｇ２＋、金ナノ粒子、ｄｓＤＮＡ及びｆｕｅｌ－ＤＮＡの終濃度は、それぞれ１２．５ｍＭ、１．６ｎＭ、３５ｎＭ及び１５０ｎＭであった。また、溶液中のｍｉＲＮＡの終濃度は１００ｐＭ又は５ｎＭであった。 The final concentrations of Mg 2+ , gold nanoparticles, dsDNA and fuel-DNA in the solution were 12.5 mM, 1.6 nM, 35 nM and 150 nM, respectively. The final concentration of miRNA in the solution was 100 pM or 5 nM.
　続いて、各溶液を２５℃で２時間穏やかに撹拌しながらインキュベートした後Ａ５２２を測定した。Ａ５２２の測定は、磁場の適用下でマイクロプレート分光光度計により行った。また、実験例５と同様の増幅反応を行い、Ａ５７５を１分以内に測定した。 Subsequently, A 522 was measured after each solution was incubated at 25 ° C. for 2 hours with gentle agitation. A 522 was measured with a microplate spectrophotometer under application of a magnetic field. Moreover, amplification reaction similar to Experimental Example 5 was performed, and A575 was measured within 1 minute.
　図９は、増幅反応の前後における反応液の写真である。図中、ｍｉＲＮＡの濃度を［ｍｉＲＮＡ］と表す。また、図１０は、増幅反応前のＡ５２２の測定結果を示すグラフである。また、図１０における挿入図は、増幅反応後のＡ５７５の測定結果を示すグラフである。 FIG. 9 is a photograph of the reaction solution before and after the amplification reaction. In the figure, the miRNA concentration is represented as [miRNA]. FIG. 10 is a graph showing the measurement result of A 522 before the amplification reaction. Further, the inset in FIG. 10 is a graph showing the measurement result of A575 after the amplification reaction.
　その結果、対象核酸としてｍｉＲ３４ｃを反応させた試料において、ｍｉＲ３４ａ、ｍｉＲ３４ｂ＊を反応させた試料よりも顕著に高い吸光が観察された。この結果は、本実験例の方法により、わずかな塩基配列の違いを識別することができ、ｍｉＲ３４ｃを特異的に検出できることを示す。 As a result, a significantly higher absorbance was observed in the sample reacted with miR34c as the target nucleic acid than in the sample reacted with miR34a and miR34b * . This result shows that a slight difference in base sequence can be identified by the method of this experimental example, and miR34c can be specifically detected.
＜実験例７＞
［細胞抽出液中のｍｉＲ３４ｃの検出］
　健康なドナーから採取した口腔粘膜由来の細胞からヒト細胞抽出液を調製した。口腔粘膜由来の細胞は、口を１ｍＬの生理的食塩水で激しくリンスすることにより回収した。回収した細胞懸濁液を２，０００×ｇで９０秒間遠心し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。 <Experimental example 7>
[Detection of miR34c in cell extract]
A human cell extract was prepared from cells derived from the oral mucosa collected from a healthy donor. Oral mucosa-derived cells were collected by rinsing the mouth vigorously with 1 mL of physiological saline. The collected cell suspension was centrifuged at 2,000 × g for 90 seconds and washed three times with PBS (pH 7.4).
　続いて、細胞の沈殿をＲＮＡ　ｌａｔｅｒ（商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィク社）５００μＬに懸濁し、内在性ＲＮＡの酵素的分解を抑制した。細胞数を測定した後、ＲＮＡ　ｌａｔｅｒ（商標）７５μＬを更に追加し、細胞密度を１×１０６個／ｍＬに調整した。細胞懸濁液は使用するまで－２０℃で保存した。 Subsequently, the cell pellet was suspended in 500 μL of RNA later ™ (Thermo Fisher Scientific) to suppress enzymatic degradation of endogenous RNA. After the number of cells was measured, 75 μL of RNA later ™ was further added to adjust the cell density to 1 × 10 6 cells / mL. The cell suspension was stored at −20 ° C. until use.
　続いて、細胞懸濁液１００μＬ（１×１０５個の細胞に相当）を２，０００×ｇで９０秒間遠心し、ＲＮＡ　ｌａｔｅｒ（商標）を除去した。この細胞の沈殿に０．５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）２５μＬを添加し、２５℃で３０分間穏やかに撹拌しながらインキュベートして細胞を破砕し、細胞抽出液を得た。 Subsequently, 100 μL of cell suspension (corresponding to 1 × 10 5 cells) was centrifuged at 2,000 × g for 90 seconds to remove RNA later ™. 25 μL of 0.5 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4) is added to the cell pellet, and the cells are disrupted by gentle stirring at 25 ° C. for 30 minutes to obtain a cell extract. It was.
　続いて細胞抽出液を２，０００×ｇで９０秒間遠心し、細胞の破片を除去した。細胞抽出液（上清２５μＬ）（１×１０５個の細胞に相当）を新しい反応チューブに移し、使用するまで－２０℃で保存した。 Subsequently, the cell extract was centrifuged at 2,000 × g for 90 seconds to remove cell debris. Cell extract (25 μL of supernatant) (corresponding to 1 × 10 5 cells) was transferred to a new reaction tube and stored at −20 ° C. until use.
　続いて、複合体を用いてヒト細胞抽出液中のｍｉＲ３４ｃを検出した。具体的には、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の５０ｎＭ又は１ｎＭのｍｉＲ３４ｃ溶液５μＬを、上述したヒト細胞抽出液５μＬ（２×１０４個の細胞に相当）にそれぞれ添加した。 Subsequently, miR34c in the human cell extract was detected using the complex. Specifically, 5 μL of 50 nM or 1 nM miR34c solution in 0.01 (v / v)% Tween20-PBS (pH 7.4) is equivalent to 5 μL of the above human cell extract (2 × 10 4 cells). ) Respectively.
　続いて、９６ウェルプレート中の複合体の溶液３０μＬに、ｍｉＲ３４ｃを含むヒト細胞抽出液１０μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－１２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）５μＬ、０．０１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１．５μＭのＤＮＡ（上記表２の「ｆｕｅｌ－ＤＮＡ」）５μＬを添加し、５０μＬの溶液を調製した。ｍｉＲ３４ｃの終濃度は１００ｐＭ又は５ｎＭであった。また、比較のために、細胞抽出液を含まない緩衝液中のｍｉＲ３４ｃの検出も行った。 Subsequently, 30 μL of the complex solution in a 96-well plate was added to 10 μL of human cell extract containing miR34c, 0.01 (v / v)% Tween 20-125 mM MgCl 2 -PBS (pH 7.4) 5 μL, 0.01 (V / v) 5 μL of 1.5 μM DNA (“fuel-DNA” in Table 2 above) in% Tween20-PBS (pH 7.4) was added to prepare a 50 μL solution. The final concentration of miR34c was 100 pM or 5 nM. For comparison, miR34c was also detected in a buffer containing no cell extract.
　続いて、各溶液を２５℃で２時間穏やかに撹拌しながらインキュベートした後Ａ５２２を測定した。Ａ５２２の測定は、磁場の適用下でマイクロプレート分光光度計により行った。 Subsequently, A 522 was measured after each solution was incubated at 25 ° C. for 2 hours with gentle agitation. A 522 was measured with a microplate spectrophotometer under application of a magnetic field.
　下記表４に、細胞抽出液中のｍｉＲ３４ｃを検出した結果を示す。細胞抽出液を含まない緩衝液中のｍｉＲ３４ｃの検出結果も示す。表４中、ＲＳＤは相対標準偏差を表す。 Table 4 below shows the results of detecting miR34c in the cell extract. The detection result of miR34c in the buffer solution not containing the cell extract is also shown. In Table 4, RSD represents relative standard deviation.
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
　その結果、緩衝液中での測定値及び細胞抽出液中での測定値の間の誤差は８％以内であり、いずれも同じような値が測定された。この結果は、本実験例の方法による対象核酸の検出が、様々な生体物質に阻害されることがないことを示す。したがって、本実験例の方法により、細胞抽出液等の生体試料中の対象核酸を直接検出することができる。 As a result, the error between the measured value in the buffer solution and the measured value in the cell extract was within 8%, and the same value was measured in both cases. This result shows that detection of the target nucleic acid by the method of this experimental example is not inhibited by various biological substances. Therefore, the target nucleic acid in a biological sample such as a cell extract can be directly detected by the method of this experimental example.
　本発明によれば、対象核酸を簡便に検出する技術を提供することができる。 According to the present invention, a technique for easily detecting a target nucleic acid can be provided.

Claims (21)

  1. 　第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した複合体であって、前記第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離する、複合体。 A complex in which a first particle and a second particle are bonded via a first nucleic acid structure, and the first particle and the first particle are bonded by a scaffold-dependent strand exchange reaction of the first nucleic acid structure. A complex in which a bond with the second particle is dissociated.
  2. 　前記第１の粒子が光学的に識別可能である、請求項１に記載の複合体。 The composite according to claim 1, wherein the first particles are optically distinguishable.
  3. 　前記第１の粒子に水溶性高分子化合物が結合している、請求項１又は２に記載の複合体。 The composite according to claim 1 or 2, wherein a water-soluble polymer compound is bound to the first particles.
  4. 　遠心分離又は磁石を近接させることにより前記第２の粒子が凝集する、請求項１～３のいずれか一項に記載の複合体。 The composite according to any one of claims 1 to 3, wherein the second particles are aggregated by centrifugation or bringing a magnet close to each other.
  5. 　下記式（１）で表される、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（１）中、Ｘ１又はＸ２は一方が前記第１の粒子を表し、他方が前記第２の粒子を表し、γ及びδ’はそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、γ’は前記γと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］     The complex according to any one of claims 1 to 4, which is represented by the following formula (1).
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     [In the formula (1), one of X 1 and X 2 represents the first particle, the other represents the second particle, and γ and δ ′ are each a single-stranded nucleic acid fragment having an arbitrary base sequence. Γ ′ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to γ. ]
  6. 　下記式（２）で表される、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式（２）中、Ｘ１、Ｘ２、γ、γ’及びδ’は前記式（１）における定義に同じであり、α及びβはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、α’及びβ’はそれぞれ前記α又は前記βと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］     The complex according to any one of claims 1 to 4, which is represented by the following formula (2).
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     [In the formula (2), X 1 , X 2 , γ, γ ′ and δ ′ are the same as defined in the formula (1), and α and β are single-stranded nucleic acid fragments each having an arbitrary base sequence. Α ′ and β ′ each represent a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to α or β. ]
  7. 　下記式（３）又は下記式（４）で表される、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式（３）中、Ｘ１、Ｘ２、α、α’、β、β’、γ、γ’及びδ’は前記式（２）における定義に同じであり、εはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、ε’は前記εと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式（４）中、Ｘ１、Ｘ２、α、α’、β、β’、γ、γ’、δ’、ε及びε’は前記式（３）における定義に同じである。］     The complex according to any one of claims 1 to 4, which is represented by the following formula (3) or the following formula (4).
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     [In Formula (3), X 1 , X 2 , α, α ′, β, β ′, γ, γ ′, and δ ′ are the same as defined in Formula (2), and ε is an arbitrary base sequence. And ε ′ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to ε. ]
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     [In the formula (4), X 1 , X 2 , α, α ′, β, β ′, γ, γ ′, δ ′, ε, and ε ′ are the same as defined in the formula (3). ]
  8. 　第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した複合体であって、前記第１の核酸構造体の足場依存型鎖交換反応によって、対象核酸が生成される、複合体。 A complex in which a first particle and a second particle are bonded via a first nucleic acid structure, and a target nucleic acid is generated by an anchorage-dependent strand exchange reaction of the first nucleic acid structure , Complex.
  9. 　前記第１の粒子が光学的に識別可能である、請求項８に記載の複合体。 The composite according to claim 8, wherein the first particles are optically distinguishable.
  10. 　前記第１の粒子に水溶性高分子化合物が結合している、請求項８又は９に記載の複合体。 The composite according to claim 8 or 9, wherein a water-soluble polymer compound is bound to the first particles.
  11. 　遠心分離又は磁石を近接させることにより前記第２の粒子が凝集する、請求項８～１０のいずれか一項に記載の複合体。 The composite according to any one of claims 8 to 10, wherein the second particles are aggregated by centrifugation or bringing a magnet close to each other.
  12. 　下記式（５）で表される、請求項８～１１のいずれか一項に記載の複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［式（５）中、Ｘ１、Ｘ２、α、α’、β’、γ、γ’及びδ’は前記式（３）における定義に同じであり、δは前記δ’又と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］     The complex according to any one of claims 8 to 11, which is represented by the following formula (5).
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     [In Formula (5), X 1 , X 2 , α, α ′, β ′, γ, γ ′, and δ ′ are the same as defined in Formula (3), and δ is complementary to δ ′. Represents a single-stranded nucleic acid fragment having a simple base sequence. ]
  13. 　下記工程（ａ）～（ｃ）を備える、試料中の対象核酸の検出方法。
    　工程（ａ）：前記試料と、請求項１～７のいずれか一項に記載の複合体とを含む混合液をインキュベートする工程であって、前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離する工程。
    　工程（ｂ）：工程（ａ）の後に、解離した前記第２の粒子及び未反応の前記複合体を凝集させる工程であって、その結果、解離した前記第１の粒子が前記混合液中に分散する工程。
    　工程（ｃ）：工程（ｂ）の後に、前記混合液中の前記第１の粒子の存在量を測定する工程であって、測定された前記存在量が前記対象核酸の存在量に対応する工程。     A method for detecting a target nucleic acid in a sample, comprising the following steps (a) to (c):
    Step (a): a step of incubating a mixed solution containing the sample and the complex according to any one of claims 1 to 7, wherein the target nucleic acid in the sample is contained in the mixed solution. Performing a scaffold-dependent strand exchange reaction with the first nucleic acid structure, resulting in dissociation of the bond between the first particle and the second particle.
    Step (b): a step of aggregating the dissociated second particles and the unreacted complex after the step (a), and as a result, the dissociated first particles are contained in the mixed solution. Step of dispersing.
    Step (c): a step of measuring the abundance of the first particles in the mixed solution after the step (b), wherein the abundance measured corresponds to the abundance of the target nucleic acid. .
  14. 　工程（ａ）における前記複合体が請求項５～７のいずれか一項に記載の複合体であり、前記対象核酸がγ－δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片である、請求項１３に記載の検出方法。 The complex in step (a) is the complex according to any one of claims 5 to 7, wherein the target nucleic acid is γ-δ [where γ is the same as defined in the formula (3). , Δ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to δ ′ in the formula (3). ] The detection method of Claim 13 which is a single-stranded nucleic acid fragment which has a base sequence of].
  15. 　前記工程（ａ）が、前記試料と、請求項６又は７に記載の複合体と、α－β－γ［但し、α、β、γは、前記式（３）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを含む混合液をインキュベートする工程であって、
    　前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からβ－γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離する工程（ａ１）と、
    　α－β－γの塩基配列を有する前記一本鎖核酸断片が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からαの塩基配列を有する一本鎖核酸及び対象核酸が解離することにより、前記第１の粒子と前記第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸が再生される工程（ａ２）とを含む、請求項１４に記載の検出方法。     The step (a) includes the sample, the complex according to claim 6 or 7, and α-β-γ [wherein α, β, and γ are the same as defined in the formula (3). And incubating a mixed solution containing a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of
    In the mixed solution, the target nucleic acid in the sample undergoes an anchorage-dependent strand exchange reaction with the first nucleic acid structure, and as a result, one nucleic acid structure having a β-γ base sequence from the first nucleic acid structure. A step (a1) of dissociating the double-stranded nucleic acid;
    The single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of α-β-γ performs an anchorage-dependent strand exchange reaction with the first nucleic acid structure, and as a result, the base sequence of α is converted from the first nucleic acid structure. The step (a2) includes a step (a2) in which a bond between the first particle and the second particle is dissociated by dissociating the single-stranded nucleic acid and the target nucleic acid, and the target nucleic acid is regenerated. The detection method described.
  16. 　下記工程（ａａ）、（ｂｂ）及び（ｃｃ）を備える、試料中の対象核酸の検出方法。
    　工程（ａａ）：前記試料と、請求項１２に記載の複合体とを含む混合液をインキュベートする工程であって、前記混合液中で、足場依存型鎖交換反応により前記第１の粒子と前記第２の粒子との結合が解離するとともに対象核酸が増幅される工程。
    　工程（ｂｂ）：工程（ａａ）の後に、解離した前記第２の粒子及び未反応の前記複合体を凝集させる工程であって、その結果、解離した前記第１の粒子が前記混合液中に分散する工程。
    　工程（ｃｃ）：工程（ｂｂ）の後に、前記混合液中の前記第１の粒子の存在量を測定する工程であって、測定された前記存在量が前記対象核酸の存在量に対応する工程。     A method for detecting a target nucleic acid in a sample, comprising the following steps (aa), (bb) and (cc).
    Step (aa): a step of incubating a mixed solution containing the sample and the complex according to claim 12, wherein the first particle and the mixture are mixed with each other by an anchorage-dependent strand exchange reaction in the mixed solution. A step in which the target nucleic acid is amplified while the bond with the second particle is dissociated.
    Step (bb): a step of aggregating the dissociated second particles and the unreacted complex after step (aa), and as a result, the dissociated first particles are contained in the mixed solution. Step of dispersing.
    Step (cc): a step of measuring the abundance of the first particles in the mixed solution after the step (bb), wherein the abundance measured corresponds to the abundance of the target nucleic acid. .
  17. 　前記工程（ａａ）が、前記試料と、下記式（６）で表され、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した第１の複合体と、下記式（７）で表され、第２の核酸構造体を介して前記第１の粒子と前記第２の粒子とが結合した第２の複合体と、下記式（８）で表される第３の核酸構造体と、λ－γ－β－γ［但し、λ、β、γは、下記式（８）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを含む混合液をインキュベートする工程であって、
    　前記対象核酸がγ－δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片であり、
    　前記混合液中で、前記試料中の対象核酸が前記第３の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第３の核酸構造体からα－β－γの塩基配列を有する一本鎖核酸が解離する工程（ａａ１）と、
    　α－β－γの塩基配列を有する前記一本鎖核酸断片が前記第１の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第１の核酸構造体からαの塩基配列を有する一本鎖核酸及びγ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離することにより、前記第１の粒子と前記第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸が生成される工程（ａａ２）と、
    　λ－γ－β－γの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が前記第３の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第３の核酸構造体からθ－λ－γの塩基配列を有する一本鎖核酸及び対象核酸が解離することにより、対象核酸が再生される工程（ａａ３）と、
    　θ－λ－γの塩基配列を有する前記一本鎖核酸断片が前記第２の核酸構造体と足場依存型鎖交換反応を行い、その結果、前記第２の核酸構造体からθの塩基配列を有する一本鎖核酸及びγ－δの塩基配列を有する一本鎖核酸断片が解離することにより、前記第１の粒子と前記第２の粒子の結合が解離し、更に対象核酸が生成される工程（ａａ４）とを含む、請求項１６に記載の検出方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     ［式（６）中、Ｘ１、Ｘ２、α、α’、β’、γ、γ’及びδ’は前記式（３）における定義に同じであり、δは前記δ’又と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     ［式（７）中、Ｘ１、Ｘ２、γ、γ’、δ及びδ’は前記式（６）における定義に同じであり、θ’及びλ’はそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、θは前記θ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     ［式（８）中、α、β、β’、γ、γ’、δ’は前記式（３）における定義に同じであり、θ及びλはそれぞれ任意の塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表し、λ’は前記λと相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］     The step (aa) is expressed by the following formula (6), the first complex in which the first particles and the second particles are bonded via the first nucleic acid structure, and the following: A second complex represented by formula (7), wherein the first particle and the second particle are bonded via a second nucleic acid structure, and a third complex represented by the following formula (8): And λ-γ-β-γ [where λ, β, γ are the same as defined in the following formula (8). And incubating a mixed solution containing a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of
    The target nucleic acid is γ-δ [where γ is the same as defined in the formula (3), and δ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the δ ′ in the formula (3). . A single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of
    In the mixed solution, the target nucleic acid in the sample undergoes a scaffold-dependent strand exchange reaction with the third nucleic acid structure, and as a result, the base sequence of α-β-γ is converted from the third nucleic acid structure. A step (aa1) of dissociating the single-stranded nucleic acid having,
    The single-stranded nucleic acid fragment having the base sequence of α-β-γ performs an anchorage-dependent strand exchange reaction with the first nucleic acid structure, and as a result, the base sequence of α is converted from the first nucleic acid structure. A step of dissociating a single-stranded nucleic acid fragment having a single-stranded nucleic acid fragment and a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ, whereby the bond between the first particle and the second particle is dissociated, and a target nucleic acid is further generated. (Aa2),
    A single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of λ-γ-β-γ undergoes an anchorage-dependent strand exchange reaction with the third nucleic acid structure, and as a result, the third nucleic acid structure is subjected to θ-λ- a step (aa3) of regenerating the target nucleic acid by dissociating the single-stranded nucleic acid having the base sequence of γ and the target nucleic acid;
    The single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of θ-λ-γ performs an anchorage-dependent strand exchange reaction with the second nucleic acid structure. As a result, the base sequence of θ is converted from the second nucleic acid structure. A step of dissociating a single-stranded nucleic acid fragment having a single-stranded nucleic acid fragment and a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ, whereby the bond between the first particle and the second particle is dissociated, and a target nucleic acid is generated The detection method of Claim 16 containing (aa4).
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     [In Formula (6), X 1 , X 2 , α, α ′, β ′, γ, γ ′, and δ ′ are the same as defined in Formula (3), and δ is complementary to δ ′. Represents a single-stranded nucleic acid fragment having a simple base sequence. ]
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     [In the formula (7), X 1 , X 2 , γ, γ ′, δ and δ ′ are the same as defined in the formula (6), and θ ′ and λ ′ each have an arbitrary base sequence. Represents a strand nucleic acid fragment, and θ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the aforementioned θ ′. ]
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     [In the formula (8), α, β, β ′, γ, γ ′, and δ ′ are the same as defined in the formula (3), and θ and λ each have an arbitrary base sequence. Λ ′ represents a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence complementary to λ. ]
  18. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載の複合体を備える、試料中の対象核酸の検出キット。 A kit for detecting a target nucleic acid in a sample, comprising the complex according to any one of claims 1 to 12.
  19. 　請求項６又は７に記載の複合体と、α－β－γ［但し、α、β、γは、前記式（３）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを備え、前記対象核酸がγ－δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片である、請求項１８に記載のキット。 The complex according to claim 6 or 7, and α-β-γ [where α, β, γ are the same as defined in the formula (3). A single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ [wherein γ is the same as defined in the formula (3), and δ is the δ ′ in the formula (3) Represents a single-stranded nucleic acid fragment having a complementary base sequence. The kit according to claim 18, which is a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of
  20. 　前記式（６）で表され、第１の核酸構造体を介して第１の粒子と第２の粒子とが結合した第１の複合体と、前記式（７）で表され、第２の核酸構造体を介して前記第１の粒子と前記第２の粒子とが結合した第２の複合体と、前記式（８）で表される第３の核酸構造体と、λ－γ－β－γ［但し、λ、β、γは、前記式（８）における定義に同じである。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片とを備え、前記対象核酸がγ－δ［但し、γは前記式（３）における定義に同じであり、δは前記式（３）における前記δ’と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸断片を表す。］の塩基配列を有する一本鎖核酸断片である、請求項１８に記載のキット。 A first complex represented by the formula (6), in which the first particles and the second particles are bonded via the first nucleic acid structure, and represented by the formula (7), A second complex in which the first particles and the second particles are bonded via a nucleic acid structure, a third nucleic acid structure represented by the formula (8), and λ-γ-β. -Γ [where λ, β, and γ are the same as defined in Equation (8). A single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of γ-δ [wherein γ is the same as defined in the formula (3), and δ is the δ ′ in the formula (3) Represents a single-stranded nucleic acid fragment having a complementary base sequence. The kit according to claim 18, which is a single-stranded nucleic acid fragment having a base sequence of
  21. 　増感剤を更に備える、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のキット。 The kit according to any one of claims 18 to 20, further comprising a sensitizer.
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