WO2017217796A1 - Rhoa 억제제 및 이의 용도 - Google Patents

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    • A61K31/443—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with oxygen as a ring hetero atom

Definitions

  • the present invention relates to a RhoA inhibitor and its use, and more particularly, to a RhoA inhibitor represented by Formula 1 or Formula 2, a composition for preventing, improving or treating gastric cancer comprising the same as an active ingredient, and a method for treating cancer using the RhoA inhibitor. It is about.
  • Gastric cancer is a gastric adenocarcinoma of the gastric mucosa and gastric adenocarcinoma, muscle sarcoma, and interstitial tumor of the mucosal epithelium, but gastric cancer is a gastric adenocarcinoma.
  • Gastric adeno-carcinoma is the second leading cause of death in 700,349 people in 2000, the fourth most commonly diagnosed cancer in the world. It is considered a single heterogeneous disease with several epidemiological and histopathological features. Gastric cancer treatment is primarily based on clinical parameters such as tumor, node, metastasis staging, which determines whether the patient should be treated with surgery alone or with surgery and chemotherapy. Gastric cancer, unlike breast cancer and colon cancer, clearly varies from stage 1 to stage 4 according to the TNM staging system. In other words, the 5-year survival rate is greater than 90% in the first stage, and less than 20% in the fourth stage. Based on the staging system, gastric cancer can often be divided into early gastric cancer, locally advanced gastric cancer, locally advanced invasive gastric cancer, and metastatic gastric cancer. .
  • RhoA protein is overexpressed in early gastric cancer, using siRNA to suppress the expression of RhoA gene or , RhoA inhibitors, it was confirmed that the tumor formation can be suppressed.
  • siRNA siRNA to suppress the expression of RhoA gene or , RhoA inhibitors
  • the present invention has been made to solve the above problems, the present invention is to provide a RhoA inhibitor specifically binding to the ligand binding domain of RhoA and to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating gastric cancer comprising the same as an active ingredient. .
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of the RhoA inhibitor.
  • Another object of the present invention to provide a use of the RhoA inhibitor for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
  • the present invention includes a RhoA (Ras homolog gene family member A) inhibitor comprising at least one compound selected from the group consisting of Formula 1 and Formula 2,
  • R is an alkyl group; A benzene group unsubstituted or substituted with a hydroxy group or an alkoxy group; Or a 6-membered heterocyclic group containing at least one N atom.
  • Chemical Formula 2 may be represented by any one of the compounds represented by the following Chemical Formulas 3 to 6.
  • At least one compound selected from the group consisting of Formula 1 and Formula 2 may specifically bind to the binding domain of RhoA.
  • the RhoA inhibitor may be treated at a concentration of 2.5 to 75 ⁇ M.
  • the present invention includes a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer and a health functional food for preventing or improving cancer comprising one or more RhoA inhibitors selected from the group consisting of Formula 1 and Formula 2 as an active ingredient.
  • the present invention also includes a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of at least one RhoA inhibitor selected from the group consisting of Formula 1 and Formula 2.
  • the present invention also provides the use of the RhoA inhibitor for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
  • the RhoA inhibitor may be to specifically bind to the binding domain of the RhoA protein to inhibit the activity of the RhoA protein.
  • the cancer may be one or more selected from the group consisting of gastric cancer, colorectal cancer, breast cancer, cervical cancer, and liver cancer, and preferably gastric cancer.
  • the RhoA inhibitor may be administered at a concentration of 2.5 to 75 ⁇ M.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of gastric cancer, comprising the RhoA inhibitor as an active ingredient. Since the RhoA inhibitor of the present invention effectively inhibits gastric cancer cells, the RhoA inhibitor is effective in preventing or treating gastric cancer, and exhibits low toxicity compared to anticancer drugs, resulting in fewer side effects.
  • Figure 1a is a diagram and a table showing the results of the PATHOME (mechanism of action and transcript big data analysis algorithm) analysis of Korean gastric cancer dataset GSE36968,
  • Figure 1b is a table showing the upregulated RhoA subgenes in gastric cancer tumors.
  • FIG. 2A is a graph showing RhoA mRNA expression level according to gastric cancer
  • FIG. 2B is a graph showing RHOB mRNA expression level according to gastric cancer
  • FIG. 2C is a graph showing mRNA expression level of RhoA subgene expressed upwardly.
  • Figure 3 is a graph examining the level of RhoA expression in each stage of gastric cancer.
  • Figure 4 is a table showing the difference in RhoA expression according to the stage of gastric cancer.
  • FIG. 5a is a Western blot photograph confirming RhoA knockdown efficiency after infection of RhoA shRNA lentiviruses to SNU-484 and SNU-601
  • FIG. 5b shows infection of RhoA shRNA lentiviruses to SNU-484 and SNU-601.
  • Figure 5c is a photograph confirming this.
  • Figure 6a is a graph showing the cell proliferation rate after knocking down RhoA of gastric cancer cell line
  • Figure 6b is a graph showing a decrease in RhoA protein expression when the siRNA for the RhoA treatment in gastric cancer cell line
  • Figure 6c is SNU- Flow cytometry shows that apoptosis increases when knocking down RhoA in a 601 cell line.
  • Figure 7a is a graph showing the quantitative RT-PCR results of SNU-601 cells after knocking down RhoA with siRNA
  • Figure 7b is a schematic diagram showing the RhoA signal pathway proposed in the present invention.
  • Figure 8a shows the drug candidate selection step and the selected compounds
  • Figure 8b is a schematic diagram showing the binding-specificity
  • Figure 8c is a table showing the selected RhoA inhibitor candidates and their properties
  • 8D is a diagram showing the structures of cluster no. 4 (left) and no. 3 (right).
  • Figure 9 shows the structure and method of synthesis of RhoA small molecule inhibitor candidates.
  • 10A-10C and 11A-11B show SPR sensorgrams of RhoA small molecule inhibitor candidates.
  • 13A and 13B show five small molecule candidates (JK-121, JK-122, JK-123, JK-124 and JK-125) in seven gastric cancer cell lines SNU484, N87, MNK45, SNU601, NCC19, AGS and SNU1967. It is a graph showing the cell viability after each treatment.
  • RhoA protein is overexpressed in early gastric cancer, and using the siRNA RhoA gene It was confirmed that suppressing the expression of or treating RhoA inhibitors can suppress tumorigenesis. Based on the above facts, a novel RhoA inhibitor was devised to confirm its gastric cancer therapeutic effect and completed the present invention.
  • the present inventors have sought to solve the above problems by providing an inhibitor that specifically binds to RhoA and inhibits RhoA activity.
  • the RhoA inhibitor is remarkably compared to the known RhoA inhibitor in gastric cancer or gastric tumor cells. Since the growth can be inhibited, a pharmaceutical composition or health functional food for preventing or treating cancer containing the RhoA inhibitor can be provided.
  • the present invention includes a Raho homolog gene family member A (RhoA) inhibitor comprising at least one compound selected from the group consisting of Formula 1 and Formula 2 below,
  • RhoA Raho homolog gene family member A
  • R is an alkyl group; A benzene group unsubstituted or substituted with a hydroxy group or an alkoxy group; Or a 6 membered heterocyclic group containing one or more N atoms.
  • the alkyl group is a saturated straight-chain or branched hydrocarbon containing 1 to 6 carbon atoms, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl And it may be one or more selected from the group consisting of n-hexyl group, and most preferably may be a methyl group.
  • the 6-membered heterocyclic group containing one or more N atoms may be one selected from the group consisting of pyridyl, pyrimidyl, pyrazyl and pyridazinyl, most preferably Preferably pyrimidyl.
  • the alkoxy group may be saturated straight or branched chain containing 1 to 4 carbon atoms, preferably methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy (isopropoxy), butoxy (butoxy), isobutoxy (isobutoxy) and sec-butoxy (sec-butoxy) may be one or more selected from the group consisting of.
  • Formula 2 of the present invention may be any one of the compounds represented by the following formulas (3) to (6).
  • the RhoA inhibitor of the present invention may be a compound represented by the formula (3).
  • RhoA is an abbreviation of Ras homolog geen family, member A, and is a small GTPase protein that is known to regulate actin cytoskeleton in the formation of stress fibers.
  • RhoA proteins are encoded by the RHOA gene and mainly work on both proteins.
  • ROCK1 Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 1
  • DIAPH1 diaphanous homolog 1, Drosophila
  • RhoA is part of a family of proteins involved in the regulation of cell division. Specifically, RhoA performs functions such as skeletal dynamics, transcription, cell cycle progression, and regulation of cell transformation.
  • RhoA molecules that act on various receptors such as NgR1, LINGO1, p75 and TROY stimulate RhoA.
  • RhoA activates ROCK (RhoA kinase), which is activated by LIM kinase, and then stimulates cofilin, effectively reconstructing the actin cytoskeleton of cells. In the case of neurons, they inhibit neural pathways and axon growth and repair.
  • Rosine has the function of inhibiting cancer proliferation and promoting neuronal regeneration, and specifically targets Rho GTPases to prevent the growth of cancer-related cells. Rosine inhibited the growth and dose-dependent growth of cancer cells in breast cancer cells, and has been shown to be effective in asthma and diabetes.
  • the present invention targets RhoA and provides more effective RhoA inhibitors than Rosine.
  • Compounds represented by the formula (1) and / or formula (2) provided in the present invention was confirmed that can bind specifically to the binding domain of RhoA, like leucine known as RhoA inhibitors, in the case of JK-122, higher binding capacity than rosin It was confirmed that it is shown.
  • RhoA inhibitors were screened based on the structure of rosine known to specifically bind to the RhoA binding domain to inhibit RhoA.
  • FIGS. 2A to 2C, 3 and 4 are diagrams showing that expression levels of RhoA are different in each stage of gastric cancer.
  • gastric cancer can be diagnosed by measuring RhoA expression level in gastric cancer stage 1, and at this time, if the RhoA expression level is high, the RhoA inhibitor of the present invention Can inhibit tumor growth.
  • JK-122 most effectively inhibited the growth of gastric cancer cell lines
  • JK-124 was 30% or more
  • JK-121, 123 and 125 showed about 30% effect.
  • the present invention also includes a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the RhoA inhibitor as an active ingredient, and includes a cancer preventing or improving health functional food comprising the RhoA inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method of treating cancer, comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of said RhoA inhibitor.
  • the present invention also provides the use of said RhoA inhibitor for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
  • the RhoA inhibitor may inhibit the proliferation of gastric tumor cells by inhibiting the activity of RhoA.
  • the RhoA inhibitor of the present invention may be one to be treated in stage 1 of gastric cancer.
  • the expression level of RhoA shows a great difference between the gastric cancer stage 1 patients and normal people. Therefore, administration of the RhoA inhibitor of the present invention in the first stage of gastric cancer can effectively inhibit gastric tumor growth.
  • the cancer may be at least one selected from the group consisting of gastric cancer, colorectal cancer, breast cancer, cervical cancer, and liver cancer, preferably gastric cancer.
  • the treatment of various gastric cancer cell lines with RhoA inhibitors to confirm whether the RhoA inhibitor selected in the present invention can be used as a prophylactic or therapeutic agent for gastric cancer confirmed that the growth of gastric cancer cell lines was inhibited or apoptosis occurred.
  • compositions can be formulated in a variety of formulations. When formulated, it may be formulated using conventional diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may comprise at least one excipient (e.g., starch, sucrose, lactose and gelatin) in the RhoA inhibitor. Can be mixed. Lubricants may also be used in addition to simple excipients.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solvents, emulsions, and syrups.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, water-insoluble solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • Glycerol and gelatin may be used as the base of the suppository.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be differently applied depending on the age, sex, condition, absorption of the active ingredient, inactivation rate and excretion rate, and the drug used in combination in the subject, but preferably the RhoA inhibitor is 2.5 to 75 ⁇ M. May be treated at a concentration. If treated at concentrations lower than 2.5 ⁇ M it may not effectively inhibit RhoA, and if treated at concentrations higher than 75 ⁇ M may cause cytotoxicity.
  • the type of the health prevention food for cancer prevention or improvement comprising the RhoA inhibitor of the present invention as an active ingredient is not particularly limited, for example, meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, Other noodles, gums, dairy products including ice creams, various soups, beverages, teas, drinks, alcoholic beverages, vitamin complexes, and the like.
  • the health food may be used with other food or food additives in addition to the RhoA inhibitor, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the cancer preventive or improvement beverage containing the RhoA inhibitor as an active ingredient, in addition to the RhoA inhibitor is included as an active ingredient, calcium, thorny oocyte concentrate, liquid fructose, purified water, and the like to be mixed and filled in the drink bottle After sterilization, the beverage may be prepared by cooling to room temperature.
  • the health supplement for preventing or improving cancer containing the RhoA inhibitor as an active ingredient is a nutritional supplement component (vitamin B1, B2, B5, B6, E and acetate ester, nicotinic acid amide), oligosaccharide, 50% ethanol, After adding and mixing purified water to form granules and drying them in a vacuum dryer, the granules are uniformly produced by passing through 12 to 14 mesh, and extruded by appropriate amounts into tablets or powders or filled into hard capsules. It can be manufactured as a product.
  • a nutritional supplement component vitamin B1, B2, B5, B6, E and acetate ester, nicotinic acid amide
  • oligosaccharide 50% ethanol
  • An effective dose of the RhoA inhibitor contained in the health food may be used according to the effective dose of the pharmaceutical composition, and the mixed amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use, such as prophylactic or therapeutic treatment. In the case of long term intake for health and hygiene purposes or health control purposes, it may be less than the above range.
  • the term "individual” may be any animal including a human having or may have a cancer, and may be a cell, tissue, organ, or the like derived from the animal.
  • the term “therapeutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease, with the effective dose level being the severity of the disease; The age, body weight, health, sex of the individual; Sensitivity to the subject's drugs; Time of administration, route of administration, and rate of excretion; Duration of treatment; It may be determined according to factors including drugs which are used in combination or coincidental with the RhoA inhibitor of the present invention and other factors well known in the medical field.
  • PATHOME Algorithm for Mechanism and Transcript Victor Analysis
  • CBioPortal and UCSC Cancer Genomics Browser were used for TCGA gastric cancer dataset analysis. According to the “TCGA, Nature 2014” data version on CBioPortal, the stomach and normal sample identifiers were obtained for both Asians and whites. “TCGA_STAD_exp_HiSeq-2015-01-28” data in the UCSC Cancer Genomics Browser was used to extract gene expression data of gastric tumor and normal samples for each race.
  • RNA-seq datasets of Asians revealed that among the top 31 important pathways (see FIG. 1A), RhoA was associated with gastric cancer in the signaling of actin cytoskeleton. I found a connection.
  • RhoA subreactors and subpaths were discovered using the PATHOME network analysis tool.
  • the upregulated subgenes were found from the GSE36968 dataset and then confirmed once again via two independent datasets (GSE13861 and GSE27342).
  • RATHOME also showed that focal adhesion is the second most involved pathway in gastric tumors.
  • other pathways such as cell migration, actin cytoskeleton signaling pathways are highly mediated by RhoA signaling (FIG. 1B).
  • chemokine signaling, focal adhesion, and cancer-related (Cluster 6, 17, 20, 26 and 31) pathways all incorporate an integrated function with RhoA. It was confirmed to include.
  • RhoA expression levels by tumor stage see FIGS. 2A-2C.
  • FIGS. 2A-2C we show RhoA expression levels by tumor stage.
  • RhoA related gene expression in cases of 77 Asians and 172 Caucasians was significantly different when compared to RhoA expression in gastric tumors of Caucasians (p-value 0.032) (FIG. 2A).
  • RhoA is up-regulated in Asian gastric tumors.
  • RHOB a gene associated with apoptosis, was significantly downregulated in Asian tumor populations (FIG. 2B).
  • RhoA pathway confirmed that upregulation of ANLN and DIAPH1d was observed in both Asian and Caucasian gastric tumors. And LIMK2 and PLD1 were up-expressed only in Asians (FIG. 2C).
  • Human gastric tumor cell lines used in the present invention were used within 6 months after harvesting. Cell lines were stored in a 5% CO 2 , 37 ° C environment. Specifically, human gastric tumor cell lines were NCI-N87, AGS (ATCC), MKN45 (RIKEN), SNU-484, SNU-601, SNU-1967 (KCLB), RPMI-1640 (HyClone) and 10% fetal bovine Cultured in serum (HyClone) conditions.
  • RNAs short hairpin RNAs Lenti virus particles
  • the cell line was incubated on a 12-well plate in medium containing RPMI-1640, 10% FBS and 0.3 mg / mL of fumomycin (Sigma-Aldrich).
  • siRNA Small interfering RNA
  • Dharmacon / GE non-target control sequences
  • Example 2-3 The cells cultured in Example 2-3 were washed twice in PBS and then lysed in a solution containing 20 mM Tris pH 7.4, 250 mM NaCl, 2 mM EDTA, and 1% Triton X-100 buffer. Suspensions were collected and total protein concentration was measured using BCA protein assay (Pierce). Anti-RhoA (ab54835, Abcam), anti- ⁇ -actin (clone 4967, Cell Signaling), and anti- ⁇ -tubulin (clone 05-829, Millipore) antibodies were used, and as anti-Rb (secondary antibodies) # 7074S, Cell Signaling) and anti-Ms (# 7076S, Cell Signaling) were used together. The experimental results were then quantified using Image Lab software (Bio-Rad).
  • RNA pellets were dried and then dissolved in DEPC treated water.
  • cDNA was synthesized using ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover kits (Toyobo).
  • RT-PCR is a basic designed by the CFX384 system (Bio-Rad) and Primer-BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ ) or GenScript ( www.genscript.com). It was carried out using the iQTMSYBR® Green Supermix (Bio-Rad) using the guidelines. Relative expression levels were normalized to GAPDH using the 2-delta-delta CT method. All the experiments were performed three times.
  • Negative control cells cells infected with siRNA-RhoA and cells infected with non-target-siRNA were collected on days 2, 3 and 4. The collected cells were centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes and washed with 10 ml PBS. After centrifugation, PBS was removed and cells were dropped-wise with 80% cold EtOH. After removal of EtOH, cells were incubated in 1 ml of propidium iodide (PI; 50 ⁇ g / ml) containing RNase A (0.1 mg / ml) for 30 minutes at 37 ° C. and centrifuged to remove unbound PI. Separated. After resuspending in PBS, flow cytometry was performed using a FACS Calibur (BD Biosciences) flow cytometer.
  • PI propidium iodide
  • RhoA protein expression was evaluated in 25 gastric tumor cell lines. The results are consistent with our immunohistochemistry (IHC) assessment (results not shown). RhoA immunohistochemical expression grades were divided evenly (2.5-3.0 high grade, 2.0-2.5 medium grade, 2.0 or less low grade expression). According to this classification, SNU-484 and SNU-601 were classified as high expressing cell lines, AGS and NCC-1 as intermediate expressing cell lines, and NCI-N87, MKN45, and SNU-1967 as low expressing cell lines. Two RhoA high expressing cell lines, SNU-484 and SNU-601, were selected for mouse xenograft studies.
  • shRNA was used to make RhoA knockdown cell lines. 3 shows the knockdown step of distinctly distinct replicas, via Western blot. Cells showing the lowest RhoA expression were xenografted to infect nude mice.
  • RhoA knockdown cell line In the SNU-484 cell line, in the RhoA knockdown cell line, tumors did not grow in size, but only grew to a certain baseline (p-value ⁇ 0.05;). On the other hand, shRNA-RhoA tumor growth was completely inhibited in SNU-601 (FIGS. 5B and 5C). Overall, we demonstrated that RhoA contributes to gastric tumor formation and showed that when RhoA knocked down, it inhibits tumor growth.
  • RhoA function in gastric tumor cell lines we knocked down the RhoA gene with siRNA, as described in Example 2-2 above. Through this, it was confirmed that the inhibition of transcription / translation is more effective in the RhoA-expressing cell line than the low-expressing gastric tumor cell lines (see FIG. 6A).
  • FIG. 6B Western Blot, weakly knocked down gastric tumor cells (eg, NCI-N87 and SNU-1967) are strongly knocked down (eg, SNU-484, SNU-601, and NCC-19 cells) showed less tumor growth inhibition than gastric tumor cell lines.
  • RhoA guanine nucleotide exchange factors ARHGEF11 and ARHGEF12.
  • DIAPH1 the gene encoding the actin polymerization protein, was upregulated in SNU-1967.
  • ANLN was downregulated in SNU-484, SNU-601, and SNU-1967.
  • the genes encoding HOA downstream signal reactors, ROCK1, ROCK2, PFN1, LIMK2, CDC42, c-FOS, c-JUN, ANLN, and other RHO sets of small GTPase genes (RAC1) showed various expression stages.
  • FIGS. 8A-8D All procedures for virtual screening of RhoA inhibitor subjects are shown in FIGS. 8A-8D.
  • PUBCHEM library we investigated compounds that are structurally similar to the RhoA inhibitor known by the name Rhosin through the Tanimoto score. Similar backbone compounds with a 730 Tanimoto score of 0.6 were found from approximately 450,000 compounds.
  • Compound 2 was synthesized to assess the activity of the non-polar phenyl group family with the R moiety.
  • compound 1 was synthesized to assess the activity of the sulfonyl functional family at the hydrazide spacer.
  • Compounds 3 and 4 were synthesized to assess the activity and need of hydrophilic functional groups such as hydroxyl groups or nitrogen that may be involved in hydrogen bonding.
  • Compound 5 was synthesized to gain insight into the effects of aliphatic group families instead of aromatic group families. Synthetic strategies for the preparation of compounds 1 to 5 are as described in FIG. 9.
  • Compounds 1 to 5 were synthesized from piperonal by treatment with appropriate hydrazide compounds. In this example the hydrazide derivative family was synthesized as a potential inhibitor targeting RhoA and evaluated for the biological activity shown in FIG. 8B.
  • RhoA small molecule inhibitor of the present invention can be synthesized as shown in Figure 9 and the detailed procedure is as follows.
  • the general synthesis process of hydrazide is as follows. A mixture of piperonal (7 mmol) and a suitable hydrazide compound (7 mmol) dissolved in MeOH or EtOH was stirred at room temperature or heated at reflux for 2-40 hours. The reaction process was monitored by TLCdp. After completion of the reaction, the contents were cooled to room temperature with stirring and poured into ice water (35 mL). The solid was filtered, dried and purified by recrystallization with MeOH or EtOH to yield the hydrazide product in 64-95% yield.
  • RhoA Low molecular weight Inhibitor Gastric cancer cell line Cell viability inhibition effect
  • RhoA small molecule inhibitor compounds synthesized in Example 3 were treated with seven gastric cancer cell lines (SNU484, SNU601, MKN45, N87, NCC19, AGS and SNU1967) to confirm the survival rate of gastric cancer cells.
  • Gastric cancer cells used in this example were cultured three times in 6-well plates (1E5 to 2.5E5), and the synthesized small molecule inhibitor compounds were treated at 20 ⁇ M for 1 to 5 days depending on the cell line. The number of cells was then counted. Control cells did not process anything.
  • JK-122 inhibited the growth of gastric cancer cell lines most effectively, and JK-124 was 30% or more, JK- 121, 123, and 125 showed an inhibitory effect of about 30%.
  • the present invention provides a composition for the prevention or treatment of gastric cancer, comprising the RhoA inhibitor as an active ingredient. Since the RhoA inhibitor of the present invention effectively inhibits gastric cancer cells, the RhoA inhibitor is effective in preventing or treating gastric cancer, and exhibits low toxicity compared to anticancer drugs, resulting in fewer side effects.

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Abstract

본 발명은 RhoA 억제제 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 화학식 1 또는 화학식 2로 나타나는 RhoA 억제제, 이를 유효성분으로 포함하는 위암 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 및 상기 RhoA 억제제를 이용한 암 치료방법을 제공한다. 본 발명의 RhoA 억제제는 위암세포를 효과적으로 억제하기 때문에, 위암을 예방 또는 치료하기에 효과적이며, 항암제에 비해 낮은 독성을 나타내어 부작용이 적다.

Description

RHOA 억제제 및 이의 용도
본 발명은 RhoA 억제제 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 화학식 1 또는 화학식 2로 나타나는 RhoA 억제제, 이를 유효성분으로 포함하는 위암 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 및 상기 RhoA 억제제를 이용한 암 치료방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2017006281-appb-I000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2017006281-appb-I000002
위암(gastric cancer)은 위에 생기는 악성 종양에는 위 점막 상피에서 생기는 위선암과 점막하층에서 생기는 악성림프종, 근육육종, 간질성 종양 등이 있으나, 대개 위암이라 하면 위선암(gastric adenocarcinoma)에 해당한다.
위선암(Gastric adeno-carcinoma)은 2000년 700,349명의 사망에서 두 번째 원인으로, 세계에서 가장 일반적으로 진단된 네 번째 암이다. 몇 가지 역학적 및 조직병리학적 특징들을 갖는 단일 이질적 질환으로 간주하고 있다. 위암 치료는 주로 환자를 수술 만으로 또는 수술과 화학요법으로 치료하여야 하는지를 결정하는 TNM(tumor, node, metastasis) 병기결정 같은 임상적 파라미터에 근거한다. 위암은 유방암과 대장암 등과 달리 TNM 병기 시스템에 따라서 1기에서 4기까지 명확하게 차이가 난다. 즉, 1기의 경우에는 5년 생존율이 90% 이상이며, 4기의 경우에는 20% 이하로 큰 차이를 보인다. 상기 병기 시스템에 기반을 두어 위암은 흔히 조기 위암(Early Gastric Cancer), 국소진행형(Locally Advanced Gastric Cancer), 국소 침윤형(Locally Advanced Invasive Gastric Cancer) 및 전이 위암(Metastatic Gastric Cancer) 등으로 나눌 수 있다.
위암 특이적 치료제를 개발하기 위한 활발한 연구가 수행되었으나, 위암의 유전적 돌연변이 성질 때문에 개발이 쉽지 않았다. 주로 수술적 방법이 위암 치료의 첫번째 치료 순서가 되며, 초기 위암환자에서 60 - 70%의 생존율을 보인다. 아울러, 위암의 항체 치료제도 활발하게 개발되고 있다. 최근 VEGFR2(vascular endothelial growth factor receptor 2)를 타겟으로 하는 트라스투주맙이 개발되어 FDA의 승인을 받았다. 하지만 이러한 특정 종양에 대한 표적치료제는 이질적인 종양에 대해서는 효과적이지 않다는 단점이 있다.
본 발명의 발명자들은 선행 연구를 통해(Hae Ryung Chang et al., Gut., 0:1, 2014), 초기위암에서 RhoA 단백질이 과발현되는 것을 확인하였으며, siRNA를 이용하여 RhoA 유전자의 발현을 억제하거나, RhoA 억제제를 처리하면, 종양형성을 억제할 수 있는 것을 확인하였다. 상기 사실을 바탕으로, 신규한 RhoA 억제제를 고안하여 이의 위암 치료 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명은 RhoA의 리간드 바인딩 도메인에 특이적으로 결합하는 RhoA 억제제 및 이를 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 RhoA 억제제의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 RhoA 억제제의 용도를 제공하는데 있다.
상술한 본 발명의 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 하기 화학식 1 및 화학식 2로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 RhoA(Ras homolog gene family member A) 억제제를 포함하며,
[화학식 1]
Figure PCTKR2017006281-appb-I000003
[화학식 2]
Figure PCTKR2017006281-appb-I000004
상기 R은 알킬기; 히드록시기 또는 알콕시기로 치환되거나 치환되지 않은 벤젠기; 또는 하나 이상의 N 원자를 포함하는 6원자 헤테로 고리기이다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 2는 하기 화학식 3 내지 화학식 6으로 표시되는 화합물 중 어느 하나로 표시될 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2017006281-appb-I000005
[화학식 4]
Figure PCTKR2017006281-appb-I000006
[화학식 5]
Figure PCTKR2017006281-appb-I000007
[화학식 6]
Figure PCTKR2017006281-appb-I000008
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 화학식 1 및 화학식 2로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물은 RhoA의 바인딩 도메인에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명에서 RhoA 억제제는 2.5 내지 75 μM의 농도로 처리되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1 및 화학식 2로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 RhoA 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암 예방 또는 개선용 건강기능식품을 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 화학식 1 및 화학식 2로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 RhoA 억제제의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료방법을 포함한다.
본 발명은 또한, 암 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 RhoA 억제제의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 RhoA 억제제는 RhoA 단백질의 바인딩 도메인에 특이적으로 결합하여 RhoA 단백질의 활성을 억제하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에 따르면 상기 암은 위암, 대장암, 유방암, 자궁경부암 및 간암으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있고, 바람직하게는 위암일 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 RhoA 억제제는 2.5 내지 75 μM의 농도로 투여되는 것일 수 있다.
따라서 본 발명은 RhoA 억제제를 유효성분으로 포함하는 위암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 RhoA 억제제는 위암세포를 효과적으로 억제하기 때문에, 위암을 예방 또는 치료하기에 효과적이며, 항암제에 비해 낮은 독성을 나타내어 부작용이 적다.
도 1a는 한국인 위암 데이터세트 GSE36968의 PATHOME(작용기전 및 전사체 빅테이터 분석 알고리즘) 분석 결과를 나타낸 그림과 표이며, 도 1b는 위암 종양에서 상향 조절된 RhoA 하위 유전자를 나타낸 표이다.
도 2a는 위암 단계별 RhoA mRNA 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 2b는 위암 단계별 RHOB mRNA 발현량을 나타낸 그래프이며, 도 2c는 상향 발현된 RhoA 하위유전자의 mRNA 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 위암 단계별로 RhoA 발현 수준을 조사한 그래프이다.
도 4는 위암 단계에 따른 RhoA 발현량의 차이를 나타낸 표이다.
도 5a는 각각 SNU-484와 SNU-601에 RhoA shRNA 렌티바이러스를 감염시킨 후, RhoA 넉다운 효율을 확인한 웨스턴 블롯 사진이고, 도 5b는 SNU-484와 SNU-601에 RhoA shRNA 렌티바이러스를 감염시킨 후, 종양의 부피를 측정한 그래프이며, 도 5c는 이를 확인한 사진이다.
도 6a는 위암세포주의 RhoA를 넉다운시킨 후, 세포 증식율을 나타낸 그래프이고, 도 6b는 위암세포주에 RhoA에 대한 siRNA를 처리하였을 때, RhoA 단백질 발현이 감소함을 나타낸 그래프이며, 도 6c는 SNU-601 세포주의 RhoA를 넉다운 할 경우, 세포사멸이 증가됨을 유세포분석으로 나타낸 그래프이다.
도 7a는 RhoA를 siRNA로 넉다운 후, SNU-601 세포의 정량적 RT-PCR 결과를 나타낸 그래프이고, 도 7b는 본 발명에서 제안된 RhoA 신호 경로를 나타낸 모식도이다.
도 8a는 신약후보 물질 선별 단계와 선별된 화합물을 나타내고, 도 8b는 결합-특이성을 나타낸 모식도이며, 도 8c는 선택된 RhoA 억제제 후보 물질과 그 특성을 나타낸 표이다. 또한, 도 8d는 클러스터 no.4(왼쪽) 및 no.3(오른쪽)의 구조를 나타낸 그림이다.
도 9는 RhoA 저분자 억제제 후보물질의 구조 및 합성방법을 나타낸 것이다.
도 10a 내지 10c 및 11a 내지 11b는 RhoA 저분자 억제제 후보물질의 SPR 센서그램을 나타낸 것이다.
도 12는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 RhoA-저분자 억제제 후보물질간의 약동학 데이터를 나타낸 표이다.
도 13a 및 13b는 7가지 위암 세포주 SNU484, N87, MNK45, SNU601, NCC19, AGS 및 SNU1967에 5개의 저분자 후보물질(JK-121, JK-122, JK-123, JK-124 및 JK-125)을 각각 처리한 후 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 선행 연구를 통해(Hae Ryung Chang et al., Gut., 0:1, 2014), 초기위암에서 RhoA 단백질이 과발현되는 것을 확인하였으며, siRNA를 이용하여 RhoA 유전자의 발현을 억제하거나, RhoA 억제제를 처리하면, 종양형성을 억제할 수 있는 것을 확인하였다. 상기 사실을 바탕으로, 신규한 RhoA 억제제를 고안하여 이의 위암 치료 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명자들은 RhoA에 특이적으로 결합하여 RhoA의 활성을 억제시키는 억제제를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였으며, 이를 통해 RhoA 억제제는 기존에 알려진 RhoA 억제제에 비해 현저하게 위암 또는 위종양세포의 성장을 억제할 수 있으므로, 상기 RhoA 억제제를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능식품을 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 1 및 화학식 2로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 RhoA(Ras homolog gene family member A) 억제제 포함하며,
[화학식 1]
Figure PCTKR2017006281-appb-I000009
[화학식 2]
Figure PCTKR2017006281-appb-I000010
상기 R은 알킬기; 히드록시기 또는 알콕시기로 치환되거나 치환되지 않은 벤젠기; 또는 하나 이상의 N 원자를 포함하는 6원자 헤테로 고리기일 수 있다.
상기 알킬기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 포화된 직쇄 또는 분지 탄화수소로서, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸 및 n-헥실기로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 메틸기 일 수 있다. 상기 하나 이상의 N 원자를 포함하는 6원자 헤테로 고리기는 피리딜(pyridyl), 피리미딜(pyrimidyl), 피라질(pyrazyl) 및 피리다지닐(pyridazinyl)로 구성된 군에서 선택되는 1종일 수 있으며, 가장 바람직하게는 피리미딜일 수 있다. 상기 알콕시기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함하는 포화된 직쇄 또는 분지쇄(branched chain)일 수 있고, 바람직하게는 메톡시(methoxy), 에톡시(ethoxy), 프로폭시(propoxy), 이소프로폭시(isopropoxy), 부톡시(butoxy), 이소부톡시(isobutoxy) 및 sec-부톡시(sec-butoxy)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 화학식 2는 하기 화학식 3 내지 6으로 표시되는 화합물 중 어느 하나일 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2017006281-appb-I000011
[화학식 4]
Figure PCTKR2017006281-appb-I000012
[화학식 5]
Figure PCTKR2017006281-appb-I000013
[화학식 6]
Figure PCTKR2017006281-appb-I000014
가장 바람직하게 본 발명의 RhoA 억제제는 화학식 3으로 나타나는 화합물일 수 있다.
본 발명에서 RhoA란 Ras homolog geen family, member A의 줄임말로, 스트레스 섬유의 형성에서 액틴 세포 골격을 조절하는 것으로 일려져 있는 small GTPase 단백질이다. RhoA 단백질은 RHOA 유전자에 의해 코딩되며, 주로 두 단백질에 작용한다. 하나는 ROCK1 (Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 1) 이며, 또다른 하나는 DIAPH1(diaphanous homolog 1, Drosophila) 이다. RhoA는 세포 분열의 조절에 관여하는 단백질 family의 일부이며, 구체적으로 RhoA는 골격 역학, 전사, 세포주기 진행 및 세포 변형의 조절과 같은 기능을 수행한다.
RhoA의 경로에 관해서, NgR1, LINGO1, p75 및 TROY와 같은 다양한 리셉터에 작용하는 분자들은 RhoA를 자극한다. RhoA 는 LIM kinase에 의해 활성화 된 ROCK(RhoA kinase)를 활성화 시키며, 그 후 cofilin을 자극, 세포의 액틴 세포 골격을 효과적으로 재구성한다. 신경 세포의 경우, 신경 경로와 축삭 성장 및 복구를 억제한다.
2012년 5월 '로신(Rhosin)'이라는 이름의 신약 후보는 신시내티 어린이 병원의 연구원으로부터 합성되었다. 로신은 암의 증식을 억제하고 신경 세포 재생을 촉진하는 기능을 가지며, 특히 암 관련 세포의 성장을 방지하기 위해 Rho GTPases를 특이적으로 타겟팅한다. 유방암 세포에서 로신은 성장 및 투여량 의존적으로 암세포의 성장을 억제하였으며, 천식과 당뇨병에도 효과가 있음이 입증되었다.
본 발명은 RhoA를 타겟으로 하여, 로신보다 더욱 효과적인RhoA 억제제를 제공한다. 본 발명에서 제공하는 화학식 1 및/또는 화학식 2로 표시되는 화합물은 RhoA 억제제로 알려진 로신과 마찬가지로 RhoA의 바인딩 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 확인하였으며, JK-122의 경우, 로신보다 높은 결합능을 보인다는 것을 확인하였다.
본 발명의 일양태에서, RhoA 바인딩 도메인에 특이적으로 결합하여 RhoA를 억제하는 것으로 알려진 로신의 구조를 기본으로 타겟으로 하여, RhoA 억제제를 스크리닝 하였다.
도 1a 및 1b는 한국인 위암 데이터세트로부터 도출된 PATHOME 분석 결과를 나타내는 그림과 표이고, 도 2a 내지 2c, 도 3 및 도 4는 위암 단계별로 RhoA의 발현 수치가 상이함을 나타내는 그림이다. 본 발명의 도 2a 내지 2c, 도 3 및 도 4 결과를 통해, 위암 1단계에서 RhoA 발현량 측정을 통해, 위암을 진단할 수 있으며, 이 때, RhoA 발현량이 높게 확인되면 본 발명의 RhoA 억제제를 통해 종양의 성장을 억제시킬 수 있다.
도 5a 내지 도 5c에 나타난 바와 같이, RhoA 억제제인 shRNA를 종양 세포주에 처리하였을 때, 위 종양이 효과적으로 억제된다는 것을 확인하였다. 이를 토대로 RhoA에 특이적으로 결합하는 저분자 스크리닝을 실시하였으며, 그 결과 도 12에 기재된 저분자 후보물질을 선별하였다.
도 13a 및 13b에 나타난 바와 같이, 5개의 저분자 후보물질을 7개의 위암 세포주에 처리하였을 때, JK-122가 가장 효과적으로 위암 세포주의 성장을 억제하였고, JK-124는 30% 이상, JK-121, 123 및 125는 30% 정도의 효과를 나타냈다.
본 발명은 또한, 상기 RhoA 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함하며, 상기 RhoA 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품을 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 RhoA 억제제의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 암 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 RhoA 억제제의 용도를 제공한다.
상기 RhoA 억제제는 RhoA의 활성을 억제하여 위종양 세포의 증식을 억제시킬 수 있다. 바람직하게 본 발명의 RhoA 억제제는 위암 1단계에서 처리되는 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 RhoA의 발현량이 위암 1단계 환자와 정상인 사이에서 큰 차이를 보인다는 것을 나타낸다. 따라서, 위암 1단계에 본 발명의 RhoA 억제제를 투여하면 효과적으로 위종양 성장을 억제시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 위암, 대장암, 유방암, 자궁경부암 및 간암으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 위암이다.
본 발명의 일양태에서, 본 발명에서 선별한 RhoA 억제제가 위암 예방 또는 치료제로 사용가능한지 확인하기 위해 다양한 위암 세포주에 RhoA 억제제를 처리한 결과, 위암세포주의 성장이 억제되거나 세포사멸이 일어나는 것을 확인하였다.
약학적 조성물은 여러 가지 제형으로 제제화할 수 있다. 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 RhoA 억제제에 적어도 하나 이상의 부형제(예를 들면, 전분, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴) 등이 섞여 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 들 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함될 수 있다. 비수용성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 대상의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 병용되는 약물에 따라 달리 적용될 수 있지만, 바람직하게 RhoA 억제제는 2.5 내지 75 μM의 농도로 처리되는 것일 수 있다. 만약 2.5 μM보다 낮은 농도로 처리될 경우, RhoA를 효과적으로 억제하지 못할 수 있으며, 75 μM보다 높은 농도로 처리될 경우, 세포독성을 야기할 수 있다.
또한, 본 발명의 RhoA 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등일 수 있다.
상기 건강식품은 상기 RhoA 억제제 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 RhoA 억제제를 유효 성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 음료는 RhoA 억제제가 유효성분으로 포함되는 것 이외에 칼슘, 가시오가피 농축액, 액상과당, 정제수 등을 첨가 혼합하여 드링크용 병에 충진하여 살균한 후 실온으로 냉각하여 음료를 제조할 수 있다. 또한, 상기 RhoA 억제제를 유효 성분으로 함유하는 암 예방 또는 개선용 건강보조제는 RhoA 억제제에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드), 올리고당, 50% 에탄올, 정제수를 첨가 혼합하여 과립상으로 성형하여 진공건조기에서 건조시킨 후, 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하여 적당량씩 압출 성형하여 정제 또는 분말로 하거나 경질캡슐에 충전하여 경질캡슐제품으로 제조할 수 있다.
상기 건강식품에 함유된 상기 RhoA 억제제의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 예방 또는 치료적 처치 등의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명에서, 용어 “개체”란 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 본 발명에서, 용어 “치료학적 유효량”이란 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도; 개체의 연령, 체중, 건강, 성별; 개체의 약물에 대한 민감도; 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율; 치료 기간; 사용된 본 발명의 RhoA 억제제와 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1]
1-1) 시스템 생물학 분석
한국 GC RNA-Seq 데이터세트를 기반으로 PATHOME(작용기전 및 전사체 빅테이터 분석 알고리즘)을 수행하였다. 이를 통해, 위 종양과 정상 조직 사이에서 통계적으로 차이를 보이는 경로 네트워크 데이터베이스의 신호를 추출 및 식별하였다(p<0.05). 본 발명에서 사용된 데이터세트는 6개의 정상 위 조직과 24개의 위 종양으로 구성되었다. 네트워크는 559개의 교점들과 2031개의 모서리들로 구성되며, 이 네트워크에 따라, 2개의 독립적인 위암 환자 데이터세트에서 지속적으로 높게 발현되는 단백질을 찾기 위하여 알려져 있는 RhoA 하위 유전들을 확인하였다.
1-2) 아시아인들과 백인들에 대한 TCGA 위암 데이터세트 확보
TCGA 위암 데이트세트 분석을 위하여 CBioPortal과 UCSC 암 제노믹스 브라우저(CGB)가 사용되었다. CBioPortal에 있는 “TCGA, Nature 2014” 데이터 버전에 따라, 아시아인들과 백인들 모두에게 위 종양 샘플와 정상 샘플 식별자들을 얻었다. UCSC 암 제노믹스 브라우저에 있는 “TCGA_STAD_exp_HiSeq-2015-01-28” 데이터는 각각의 인종들에 대한 위 종양 샘플와 정상 샘플들의 유전자 발현 데이터를 추출하기 위하여 사용되었다.
1-3) 위암 신호전달 네트워크 분석 결과
본 발명에서는 트랜스크립톰의 분석[GEO accession: GSE 13861(65 GC, 19 normal samples), GSE15081 (56 GC samples)]을 통해 위암과 연관된 경로들을 발견하였다. 아시아인들의 RNA-seq 데이터세트[GEO accession: GSE36968 (24 GC, 6 normal samples)] 분석 결과, 상위 31개의 중요한 경로들(도 1a 참조) 중, 액틴 세포 골격의 신호전달에 관한 RhoA가 위암과 연관이 있다는 사실을 발견하였다.
PATHOME 네트워크 분석 도구를 사용하여 RhoA 하위 반응기와 하위경로들을 발견하였다. 상향조정된 하위 유전자들은 GSE36968 데이터세트로부터 발견되었고, 그리고 나서 두 개의 독립적인 데이터세트들(GSE13861 및 GSE27342)을 통해 다시 한번 확인하였다.
RATHOME은 또한 초점접착역(focal adhesion)이 위 종양에서 두번째로 많이 연관된 경로라는 것을 보여주었다. 아울러, 다른 경로들 예를들어 세포 이동, 액틴 세포골격 신호전달 경로는 RhoA 신호전달에 크게 중재된다는 것을 확인하였다(도 1b).
또한, 본 발명자들은 여기에 케모카인 신호전달, 초점접착역(focal adhesion), 그리고 암 관련 (Cluster 6, 17, 20, 26 and 31) 경로들 (도 1a, 우측 패널) 모두 RhoA와 통합된 기능을 포함한다는 것을 확인하였다. 동일한 데이터세트를 사용하여, 우리는 종양 단계(도 2a 내지 2c 참조)에 의하여 RhoA 발현 수준을 보여준다. 통계상으로 정상적인 위와 비교할 때, RhoA의 발현량은 1단계의 위 종양과 관련이 있음을 확인하였다(p-value 0.0409, 도 2a 내지 2c, 도 3 및 도 4 참조).
TCGA 위 종양 데이터세트를 사용하여, 우리는 77명의 아시아인과 172명의 백인을 대조하는 경우에서 RhoA 관련 유전자 발현을 비교하였다(도 2a 내지 도 2c). 아시아인의 위 종양내 RhoA 발현은 백인의 위 종양내 RhoA 발현과 비교할 때, 큰 차이점을 가지고 있었다(p-value 0.032) (도 2a). 아시아인들과 백인들을 대조한 데이터세트를 통해, 본 발명자는 아시아인의 위 종양에서 RhoA가 상향조정된다는 사실을 알아내었다. 흥미롭게도, 본 발명자는 또한 세포소멸과 관련된 유전자인 RHOB가 아시아인 종양 집단에서 상당히 하향조정된다는 것을 확인할 수 있었다(도 2b).
아울러, RhoA 경로의 하위 유전자 평가를 통해, 아시아인과 백인의 위 종양 모두에게서 ANLN 과 DIAPH1d의 상향조정이 나타남을 확인하였다. 그리고 LIMK2 와 PLD1는 오직 아시아인들의 것에서만 상향 발현되었다(도 2c).
[ 실시예 2]
2-1) 세포 배양
본 발명에서 사용된 인간 위 종양 세포주는 수득 후, 6개월 안에 사용되었다. 세포주는 5%의 CO2, 37℃ 환경에서 보관되었다. 구체적으로 인간 위 종양 세포주는 NCI-N87, AGS (ATCC), MKN45 (RIKEN), SNU-484, SNU-601, SNU-1967 (KCLB)가 사용되었으며, RPMI-1640 (HyClone)와 10% 소태아혈청(HyClone)의 조건에서 배양되었다.
2-2) 이종이식 RhoA-넉다운 생쥐모델 제작
MISSION® short hairpin RNAs(shRNAs) 렌티 바이러스 입자(Sigma-Aldrich)는 SNU-484과 SNU-601 세포주를 감염시키기 위해 사용되었다. 상기 세포주는 RPMI-1640, 10% FBS 그리고 0.3mg/mL의 퓨모마이신(Sigma-Aldrich)을 포함하는 배지로 12-웰 플레이트상에서 배양되었다.
웨스텐블롯 분석은 줄어든 RhoA 발현량을 확인하고, RhoA가 넉다운되었는지 확인하기 위하여 수행되었다. 약 5 내지 7 x 106개의 증식기 세포들을 0.1 ml의 인산염 완충 식염수(PBS)에서 현탁시켰다. 그리고 이를 중증 복합 면역결핍(scid) 생쥐(Orient Bio)의 옆구리에 피하주사로 투여시켰다. 동물들의 무게는 주 1회 측정하였고 종양의 직경을 주 2회 전자식 캘리퍼스로 V = [(dlong)x(dshort)x(dlong)/2] 공식에 따라 정확한 각(dshort 와 dlong)에서 측정하였다. 종양이 150 내지 300mm3 사이의 용량에 도달했을 때, 생쥐들을 무작위로 8마리씩 두 그룹으로 분류하였다.
2-3) Small siRNA의 형질감염
Small interfering RNA(siRNA) SMARTpools와 비표적 제어 염기서열(Dharmacon/GE) 정보가 세포 감염을 위하여 사용되었다. 실험군으로 상기 실시예에서 준비된 위 종양 세포주에 40nM siRNA-RhoA를 처리하여 형질감염 시켰으며, 대조군으로는 DharmaFECT1(Dharmacon/GE)를 이용하여 scrambled siRNA 컨트롤로 세포주를 감염시켰다. 형질감염 배지는 24시간 후에 다시 채워주었으며, 세포들은 37℃, CO2 5%에서 배양하였다.
2-4) 웨스턴블롯
상기 실시예 2-3에서 배양된 세포를 PBS에서 두 번 세척한 후, 20mM Tris pH 7.4, 250mM NaCl, 2mM EDTA, 및 1% Triton X-100완충액을 포함하는 용액에 용해시켰다. 부유물을 수집하고, BCA 단백질 분석(Pierce)을 사용하여 총 단백질 농도를 측정하였다. 항-RhoA(ab54835, Abcam), 항-β-액틴(clone 4967, Cell Signaling), 그리고 항-α-튜불린(clone 05-829, Millipore) 항체들이 사용되었으며, 각각 이차항체로서 항-Rb(#7074S, Cell Signaling)와 항-Ms(#7076S, Cell Signaling)가 함께 사용되었다. 그리고 나서 Image Lab 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 실험 결과를 정량하였다.
2-5) 실시간 중합효소연쇄반응(real time-PCR)
모든 RNA는 Isol-RNA Lysis Reagent(5Prime)를 사용하여 세포 용해물로부터 수득하였다. 세포의 용해 후, 0.2 ml의 클로로포름을 첨가하고, 그리고 나서 혼합된 샘플들은 4°C에서 15분동안 13x1000 rpm으로 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층부는 새로운 튜브에 담았고, 0.5ml의 이소프로판올이 첨가되었다. 샘플을 천천히 혼합한 후, 실온에서 10분간 배양되었다. 그리고 다시 4°C에서 10분 간 13x1000 rpm으로 원심분리하였다. 표면에 뜨는 것은 제거시키고 4 ℃에서 5 분 동안 7500 rpm에서 원심 분리 한 후 70% 농도의 EtOH 1ml가 첨가하였다. RNA 펠렛(pellets)을 건조시킨 후, DEPC 처리 된 물에 용해시켰다. cDNA는 ReverTra Ace®qPCR RT Master Mix with gDNA Remover kits(Toyobo)를 사용하여 합성되었다. RT-PCR은 CFX384 시스템 (Bio-Rad)과 Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 또는 GenScript (www.genscript.com)에 의해 설계된 기본 지침서를 이용한 iQTMSYBR® Green Supermix(Bio-Rad)를 사용하여 실시되었다. 상대적인 발현 수준은 the 2-delta-delta CT 방법을 사용하여 GAPDH로 표준화 시켰다. 상기 모든 실험은 3번씩 실시되었다.
2-6) 유세포 분석에 의한 세포주기 분석
음성 대조군 세포, siRNA-RhoA로 감염된 세포 및 비-타겟-siRNA로 감염된 세포는 2, 3 및 4일에 수집되었다. 수집된 세포들은 10분간 1200 rpm으로 원심분리하였고, 10ml PBS로 세척되었다. 원심분리 후에, PBS를 제거하고 80%농도의 차가운 EtOH로 세포를 분리하였다(drop-wise). EtOH를 제거한 후, 세포를 37°C에서 30분 동안 RNase A (0.1 mg/ml)가 포함된 1ml의 propidium iodide (PI; 50 μg/ml)에서 배양되었고, 결합되지 않은 PI를 제거하기 위해서 원심 분리하였다. 그리고 이를 PBS에 재현탁시킨 후, FACS Calibur (BD Biosciences) 유세포분석기를 사용하였다 유세포 분석을 실시하였다.
2-7) RhoA 넉다운 모델에서의 종양성장 억제 확인
RhoA 단백질 발현은 25개의 위 종양 세포주에서 평가되었다. 그 결과들은 우리의 면역조직화학(IHC) 평가와 일치한다(결과 미도시). RhoA 면역조직화학 발현 등급은 다음과 같이 균등하게 나눠졌다(2.5-3.0는 높은 등급, 2.0-2.5는 중간 등급, 2.0 이하는 낮은 등급의 발현). 이 분류에 따라, SNU-484 과SNU-601는 높은 발현 세포주로, AGS와 NCC-1는 중간 발현 세포주로, NCI-N87, MKN45, 그리고 SNU-1967은 낮은 발현 세포주로 분류되었다. 2개의 RhoA 높은 발현 세포주인 SNU-484와 SNU-601는 생쥐 이종이식 연구로 선택되었다.
shRNA는 RhoA 넉다운 세포주를 만드는데 사용되었다. 도 3은 웨스턴 블롯을 통해, 뚜렷이 구별되는 복제물들의 넉다운 단계를 보여준다. 가장 낮은 RhoA 발현을 보이는 세포를 이종이식하여 누드마우스에 감염시켰다.
SNU-484 세포주에서는 RhoA 넉다운 세포주의 경우, 종양은 크기가 커지지는 않고, 단지 일정 기준치 정도로만 자랐다(p-value < 0.05;). 한편, SNU-601에서는 shRNA-RhoA 종양 성장이 완벽하게 억제되었다(도 5b 및 5c). 종합적으로 우리는 RhoA가 위 종양 형성에 기여한다는 것을 입증하였으며, RhoA 넉다운되었을 때, 종양의 성장을 억제한다는 것을 보여주었다.
2-8) RNAi 넉다운 여부에 따른 RhoA관련 유전자들의 발현 확인
위종양 세포주에서 RhoA 기능을 더 연구하기 위해서, 본 발명자는 상기 실시예 2-2에 기재한 바와 같이, siRNA로 RhoA 유전자를 넉다운 시켰다. 이를 통해, RhoA가 낮게 발현되는 위종양 세포주들보다 RhoA가 높게 발현되는 세포주에서 전사/번역의 억제가 더욱 효과적이라는 것을 확인하였다(도 6a 참조). 예를 들면, 도 6b 웨스턴블롯에서 보이는 바와 같이, 약하게 넉다운된 위종양 세포(예를 들면, NCI-N87과 SNU-1967)는 강하게 넉다운된 (예를 들면, SNU-484, SNU-601, 그리고 NCC-19 cells) 위 종양 세포주보다 더 적은 종양증식 억제효과를 보였다.
유세포분석으로 siRNA-RhoA의 세포 주기를 분석하여, RhoA 넉다운된 대부분의 세포주에서 다수의 종양세포가 사멸됨을 확인하였다(결과 미도시).
SNU-484, SNU-601, 그리고 SNU-1967에서, RhoA의 넉다운은 ARHGEF11과 ARHGEF12라는 RhoA 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자의 다양한 상향 조절을 야기했다. 액틴 중합 단백질을 코드화한 유전자인 DIAPH1는 SNU-1967에서 상향 조절되었다. 2일과 3일자에 SNU-484, SNU-601, 그리고 SNU-1967에서 ANLN는 하향 조절되었다. HOA 하류 신호 반응기들, ROCK1, ROCK2, PFN1, LIMK2, CDC42, c-FOS, c-JUN, ANLN, 그리고 다른 RHO 집합의 작은 GTPase 유전자들 (RAC1)을 코드화한 유전자들은 다양한 발현 단계들을 보여 주었다.
[ 실시예 3]
3-1) RhoA에 특이적으로 결합하는 저분자 억제제의 가상 스크리닝
RhoA 억제제 대상의 가상 검색을 위한 모든 절차는 도 8a 내지 8d에 나타난 바와 같다. PUBCHEM 라이브러리를 활용하여, 우리는 유사도 측정(Tanimoto score)을 통하여 로신(Rhosin)이라는 이름으로 알려진 RhoA 억제제와 구조적으로 유사한 화합물들에 대하여 조사했다. 대략적으로 45만개의 화합물로부터 0.6의 730개의 타니모토 점수를 가진 비슷한 백본(backbone) 화합물들을 찾았다. 우리는 RhoA 결정 구조에서 지도화된 결합영역과 도킹이 가능한 모든 화합물들을 더 선택했다. 도킹 소프웨어인 오토도크 비나(AutoDock Vina)를 사용하였고 CHARMM을 사용하여 질량 중심(COM)을 계산하였다. 도킹이 가능한 화합물들에게 “클러스터”라고 정의내렸으며, 잠재적 결합 가능성이 있는 저분자를 도 6a에 있는 우측 패널에 나타내었다. 마지막으로 우리는 더 나은 스크리닝을 위하여 결합 특이성뿐만 아니라 약물 등의 물리 화학적 특성을 고려하였다.
결과적으로, PUBCHEM 라이브러리에 있는 4500만 화합물에서, 첫 번째와 두 번 째 화합물의 결합 에너지 사이에서의 에너지 차이에 근거하여(도 8b 참조) 높은 RhoA-결합 특이성(즉, Lipinski's rule)을 가진 41개의 화합물을 찾았다. 복수 영역에 결합가능한(비특이성을 보이는) 몇몇 화합물은 제외하고, RhoA에 특이적으로 결합할 수 있는 화합물을 선택했다. 그 결과, 41개 화합물에서, 7개의 대표 화합물들이 선택되었고 표로 작성되었다(도 8c 참조).
3-2) RhoA 저분자 억제제의 합성
상기 가상 스크리닝을 통해 선택된 7가지의 화합물 구조를 토대로 하여, 신약으로 개발가능한 RhoA 저분자 억제제를 하기와 같이 고안하였다.
RhoA를 타겟으로하는 잠재적 억제제의 합성
RhoA를 타겟으로하는 약물 유사성(drug-likeness)의 설명을 위한 전략의 필요성을 고려하여, 하이드라지드의 몇몇 동족체의 고안 및 합성에 중점을 두었다. 도 8c에 도시된 가상(In silico) 스크리닝의 결과를 바탕으로, 하이드라지드 작용기를 도 9에 기재된 R 부분(moiety)의 구조적 변화 및 스페이서 골격(spacer skeleton)으로 고안하였다. 구조적 다양성을 위해, 구조적으로 유사한 화합물들이 유사한 생물학적 활성을 나타낼 것이라는 근거를 고려하였다. 피페로닐기와 하이드라지드 스페이서 부분은 화합물 구조에 고정되었다. 구조적 변형를 위해 R 부분에 변화를 주고, R 부분의 적용범위(coverage)에 따른 다른 생물학적 활성을 예상하였다. 적절한 화학적 스페이스를 통한 다양화 방법 탐색의 목적을 위해, 다른 화학적 특성을 나타내는 5개 카테고리의 화합물이 고안 및 합성되었다. 화합물 2는 R 부분으로 비-극성 페닐기 계열의 활성을 평가하기 위해 합성되었다. 화합물 2와 비교하여, 화합물 1은 하이드라지드 스페이서에서 설포닐 작용기 계열의 활성을 평가하기 위해 합성되었다. 화합물 3 및 4는 수소결합에 관여할 수 있는 히드록실기 또는 질소와 같은 친수성 작용기 계열의 활성 및 필요성을 평가하기 위해 합성되었다. 화합물 5는 방향족 그룹 계열 대신 지방족 그룹 계열의 효과를 통찰하기 위해 합성하였다. 화합물 1 내지 5의 준비를 위한 합성 전략은 도 9에 기재된 바와 같다. 화합물 1 내지 5는 적절한 하이드라지드 화합물로 처리함으로써 피페로날(piperonal) 로부터 합성되었다. 본 실시예에서 하이드라지드 유도체 계열은 RhoA를 타겟팅하는 잠재적 억제제로서 합성되었고 도 8b에 나타난 생물학적 활성에 대해 평가되었다.
본 발명의 RhoA 저분자 억제제는 도 9에 나타난 바와 같이 합성될 수 있으며 상세한 과정은 다음과 같다.
저분자 합성
공기 또는 수분에 민감한 모든 반응은 질소 환경하에서 수행되었다. 시약은 Sigma-Aldrich와 Tokyo Chemical Industry에서 구입하였다. 별도의 설명이 없는 한, 모든 무수 용매(anhydrous solvent)는 반응 전에 CaH2, P2O5, 또는 Na/벤조페논에 대해 증류되었다. 분석적 TLC (thin-layer chromatography)는 상업용 피복(precoated) TLC 플레이트를 이용하여 수행하였다(Silicagel 60, F-254, Merck). 스팟은 에탄올에 용해된 인몰리브덴산(PMA) 또는 과망간산칼륨 수용액 중 어느 하나에 담근 후 자외선 하에서 보거나(여기, 254 nm), 또는 탄화로 착색하여 탐지된다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(Flash column chromatography)는 실리카 겔 60 (0.040~0.063 mm, 230-400 mesh, Merck)에서 수행되었다. 적외선 스펙트럼은 Agilent Cary670을 사용하여 기록되었다. 1H NMR 스펙트럼(CDCl3, CD3OD, D2O or DMSO-d 6)은 Agilent 400-MR (400 MHz)에 기록되었다. 화학적 이동(chemical shifts)은 용매 피크에 대하여 ppm (δ) 단위로 기록되었다. 1H NMR 데이터는 피크 다중도(peak multiplicities)로 보고 되었다: s는 단일선(singlet); d는 이중선(doublet); dd는 이중선들 중 이중선(doublet of doublets); ddd는 이중선들의 이중선의 이중선(doublet of doublet of doublets); t는 삼중선(triplet); 모조(pseudo) t는 모조 삼중선; brs는 넓은 단일선(broad singlet)이고; m은 다중선(multiplet)을 나타낸다. 결합상수(coupling constants)는 헤르츠(Hertz)로 보고되었다. 13C NMR 스펙트럼(CDCl3, CD3OD, D2O or DMSO-d 6)은 Agilent 400-MR (100 MHz) 장치를 사용하여 유사하게 기록되었다. 화학적 이동은 용매 피크에 대하여 ppm (δ)으로 보고되었다. 질량 스펙트럼은 염화메틸렌 또는 메탄올에서 ESI+ source 상에 기록되었다.
하이드라지드의 일반적인 합성과정은 다음과 같다. MeOH 또는 EtOH에 용해된 피페로날(7 mmol) 및 적합한 하이드라지드 화합물(7 mmol)의 혼합물은 실온에서 교반되거나 환류에서 2-40시간 동안 가열되었다. 반응 과정은 TLCdp 의해 모니터링되었다. 반응 완료 후, 내용물을 교반하면서 실온까지 냉각시키고 얼음물(35 mL)에 부었다. 고형물은 여과되고, 건조된 후, MeOH 또는 EtOH을 이용하여 재결정화에 의해 정제되어 64-95%의 수율로 하이드라지드 산물을 생성하였다.
저분자량 화합물 합성 개요 :
(E)-N'-( 벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일메틸렌 ) 벤젠설포노하이드라지드 ( JK -121)　: 노란색 고체; IR (ATR) cm-1 1624, 1594; 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 11.37 (s, 1H), 7.87 (d, J = 6.8㎐, 2H), 7.81 (s, 1H), 7.62 (m, 3H), 7.09 (d, J =1.4㎐, 1H), 7.02 (dd, J = 1.4, 8㎐, 1H), 6.92 (d, J = 8㎐, 1H), 6.05 (s, 2H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 149.06, 147.87, 147.04, 138.96, 133.01, 129.01, 127.99, 127.20, 123.02, 108.39, 104.86, 101.53; HRMS calcd for C14H12N2O4S [M+H]+ 305.0596; found 305.0596.
(E)-N'-( 벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일메틸렌 ) 밴조하이드라지드 ( JK -122): 백색 고체; IR (ATR) cm-1 1654, 1627, 1593; 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 11.75 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.89 (d, J = 7.3㎐, 2H), 7.54 (m, 3H), 7.31 (s, 1H), 7.17 (d, J= 7.8, 1H), 7.00 (d, J = 7.9㎐, 1H), 6.06 (s, 2H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 162.97, 149.10, 147.99, 147.58, 133.51, 131.66, 128.74, 128.45, 127.56, 123.34, 108.49, 105.10, 101.58; HRMS calcd for C15H12N2O3 [M+H]+ 269.0926; found 269.0927.
(E)-N'-( 벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일메틸렌 ) 이소니코티노하이드라지드 ( JK -123): 백색 고체; IR (ATR) cm-1 1785, 1675, 1626; 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 11.97 (s, 1H), 8.78 (dd, J = 1.4, 4.5㎐, 2H), 8.37 (s, 1H), 7.82 (dd, J = 1.4, 4.5㎐, 2H), 7.31 (s, 1H), 7.20 (dd, J = 1.4, 8㎐, 1H), 7.01 (d, J = 8㎐, 1H), 6.11(s, 2H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 161.43, 150.30, 149.36, 148.78, 148.03, 140.57, 128.41, 123.67, 121.50, 108.53, 105.20, 101.63; HRMS calcd for C14H11N3O3 [M+H]+ 270.0879; found 270.0896.
(E)-N'-( 벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일메틸렌 )-4- 하이드록시벤조하이드라지드 (JK-124): 백색 고체; IR (ATR) cm-1 1783, 1648, 1595; 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 11.54 (s, 1H), 10.09 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 7.78 (d, J = 8.6㎐, 2H), 7.28 (s, 1H), 7.14 (d, J = 8.0㎐, 1H), 6.98 (d, J = 8.0㎐, 1H), 6.84 (d, J = 8.6 ㎐, 2H), 6.09 (s, 2H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 162.60, 160.64, 148.90, 147.96, 146.61, 129.58, 128.95, 123.90, 123.07, 114.98, 108.46, 105.01, 101.51; HRMS calcd for C15H12N2O4 [M+H]+ 285.0875; found 285.0877.
(E)-N'-( 벤조[d][1,3]디옥솔 -5- 일메틸렌 ) 아세토하이드라지드 ( JK -125): 백색 고체; IR (ATR) cm-1 1757, 1677, 1597; 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 11.13 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.24 (d, J = 1.4, 1H), 7.07 (dd, J = 1.4, 8㎐, 1H), 6.94 (d, J = 8㎐, 1H), 6.07(s, 2H), 2.17 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 171.79, 148.67, 147.92, 142.19, 128.75, 122.66, 108.41, 104.85, 101.45, 20.26; HRMS calcd for C10H10N2O3 [M+H]+ 207.0770; found 207.0766.
[ 실시예 4]
RhoA 저분자 억제제의 위암세포주 세포생존율 억제 효과
상기 실시예 3에서 합성된 5개의 RhoA 저분자 억제제 화합물을 7개의 위암 세포주(SNU484, SNU601, MKN45, N87, NCC19, AGS 및 SNU1967)에 각각 처리하여 위암세포의 생존율을 확인하였다.
본 실시예에 사용된 위암세포는 6웰 플레이트에 3회 배양되었고 (1E5 ~ 2.5E5), 합성된 저분자 억제제 화합물은 세포주에 따라 1 내지 5일 동안 20μM로 처리되었다. 이후 세포의 수를 계수하였다. 대조군 세포는 아무것도 처리하지 않았다.
그 결과, 도 13a 및 13b에 나타난 바와 같이 5개의 저분자 후보물질을 7개의 위암 세포주에 처리하였을 때, JK-122가 가장 효과적으로 위암 세포주의 성장을 억제하였고, JK-124는 30% 이상, JK-121, 123 및 125는 30% 정도의 억제 효과를 나타냈다.
따라서 본 발명은 RhoA 억제제를 유효성분으로 포함하는 위암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 RhoA 억제제는 위암세포를 효과적으로 억제하기 때문에, 위암을 예방 또는 치료하기에 효과적이며, 항암제에 비해 낮은 독성을 나타내어 부작용이 적다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1 및 화학식 2로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 RhoA(Ras homolog gene family member A) 억제제:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017006281-appb-I000015
    ; 및
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2017006281-appb-I000016
    ;
    상기 R은 알킬기; 히드록시기 또는 알콕시기로 치환되거나 치환되지 않은 벤젠기; 또는 하나 이상의 N 원자를 포함하는 6원자 헤테로 고리기이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 2는 하기 화학식 3 내지 화학식 6으로 표시되는 화합물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 RhoA 억제제:
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2017006281-appb-I000017
    ;
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2017006281-appb-I000018
    ;
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2017006281-appb-I000019
    ; 및
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2017006281-appb-I000020
    .
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1 및 화학식 2로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 RhoA 단백질의 바인딩 도메인에 특이적으로 결합하여 RhoA 단백질의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 RhoA 억제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1 및 화학식 2로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 RhoA 억제제는 2.5 내지 75 μM의 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는 RhoA 억제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RhoA 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 RhoA 억제제는 RhoA 단백질의 바인딩 도메인에 특이적으로 결합하여 RhoA 단백질의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 암은 위암, 대장암, 유방암, 자궁경부암 및 간암으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 RhoA 억제제는 2.5 내지 75 μM의 농도로 투여되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RhoA 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항 이상의 RhoA 억제제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 RhoA 억제제는 RhoA 단백질의 바인딩 도메인에 특이적으로 결합하여 RhoA 단백질의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 암의 치료방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 암은 위암, 대장암, 유방암, 자궁경부암 및 간암으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암의 치료방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 RhoA 억제제는 2.5 내지 75 μM의 농도로 투여되는 것을 특징으로 하는 암의 치료방법.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 RhoA 억제제의 암 치료용 약제를 제조하기 위한 용도.
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