WO2017155048A1 - 種子の劣化を抑制する方法 - Google Patents

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良美 大島
展隆 光田
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for suppressing the deterioration of seeds by highly accumulating cuticles in the seed coat by enhancing the expression of specific transcriptional regulatory factors in the plant, and a method for producing a plant that produces seeds with suppressed deterioration. .
  • Seeds are important as a means of plant propagation from the viewpoint of agriculture or seed preservation, and the seeds themselves are indispensable as food and feed. So far, for the purpose of crop cultivation, breeding, plant research, etc., technological development and physiological research for storing and transporting seeds with their germination ability and growth characteristics maintained without degrading seeds have been widely conducted. It was. Seed degradation refers to oxidative stress and wounds, electrolyte efflux, DNA damage, and membrane degradation due to exposure to environmental stresses such as humidity, temperature, oxygen, carbon dioxide, and UV rays, and biological stresses such as pathogens and pests. And so on.
  • the seeds are protected by seed coats, accumulate antioxidants, reduce metabolic activity, and have damage repair mechanisms, but preserved by plant species and genetic factors
  • the possible periods vary greatly.
  • Recalcitrant seeds which are common in tropical plants, are vulnerable to cooling and drying.
  • many other seeds are called orthodox seeds and can extend their life under low temperature and low humidity conditions. In general, it is said that the shelf life doubles every time the humidity drops by 1% or 5.6 ° C, and strict relative humidity and temperature control is desirable.
  • gene banks in each country are sterilized and stored in sealed containers.
  • Preserving seeds under temperature and humidity control as done at Genebank is important for extending the maximum life while maintaining activity, but on the other hand, it is necessary to store large quantities because of the equipment cost. It ’s difficult.
  • the moisture content is 12 to 13%, at room temperature, or in the summer, in a cold and hot storage, it is targeted for about one year.
  • Studies have been conducted on seed storage conditions for many plant species, and methods suitable for agriculture and long-term storage have been developed. However, there are many plants that still cannot secure a sufficient storage period by methods based on experience and knowledge so far.
  • An object of the present invention is to provide a technique for suppressing seed deterioration due to the external environment by highly accumulating cuticles on the seed surface. Development of methods for maintaining seed quality can contribute to crop production, development of new varieties through cross breeding, preservation of rare species, and maintenance of quality of beans, cereals, nuts, oil crops, etc.
  • the cuticle covers almost all of the plant's aerial parts, protecting it from drying, dirt, strong light, pathogens and pests.
  • Cuticles are composed of wax and lipid polyester cutin, aromatic compounds, etc. Wax is also used in food processing, cosmetics and industrial products. Cuticles are also formed in the outermost layer of immature seeds, and it is known that it prevents adhesion between seeds and between seeds and fruits in the process of seed development (Non-Patent Documents 5 and 6). However, its function in mature seeds is not known and has not been considered to contribute to seed preservation.
  • MYB16-VP16 and MYB106-VP16 fused with a herpesvirus-derived strong transcription activation domain are expressed throughout the plant, a group of enzymes and transporters required for cuticle formation, etc. It was possible to accumulate the types of waxes and petal-specific cuticles found on the leaf surface. From this, it was clarified that MYB16 and MYB106 transcription factors have a function of highly accumulating functional cuticles by inducing a series of gene expressions necessary for cuticle formation.
  • the MYB16 and MYB106 transcription factors belong to the R2R3MYB subgroup 9 in the MYB family, and the subgroup also includes LMI2 transcription factors (Non-patent Document 7) that control flower bud differentiation.
  • the LMI2 transcription factor was thought to have a different protein function because the clade within the subgroup was different from MYB16 and MYB106, and the structure of the protein domain was also very different from MYB16 and MYB106 (Non-patent Document 3).
  • the present inventors previously created a plant in which a dysfunction phenotype was induced by constitutive expression by fusing a strong transcription repression domain to the LMI2 gene.
  • the LMI2 gene disruption strain lmi2-2 is essential for the formation of the seed cuticle because the seed surface has adhered, the cuticle on the immature seed coat surface has become thinner, and the water permeability has increased.
  • Non-Patent Document 8 Non-Patent Document 9. From these facts, it can be said that the LMI2 transcription factor is also a transcription factor expected to have a high accumulation of functional cuticles by high expression in plants, like the MYB16 and MYB106 transcription factors.
  • the inventors of the present invention can enhance the formation of cuticle on the seed surface by expressing LMI2 transcription factor and the like in a seed-specific manner. I thought that it could prevent deterioration.
  • various types of genes are involved in the formation of cuticles in seeds, and it is unclear whether high cuticles can be accumulated even if only LMI2 gene is highly expressed, and only on the seed surface. I did not know at all whether or not high accumulation was possible. It is true that the expression of MYB16 and MYB106 transcription factors within the same R2R3MYB subgroup has succeeded in high accumulation of cuticles in the leaves and petals.
  • the present inventors have found that the CYP77A6 gene, which is an enzyme gene in the cuticular synthesis pathway, is a gene involved in cuticular synthesis in a wide range of plants, and is not seed-specific.
  • the LMI2-VP16 gene was ligated and expressed in a promoter derived from the CYP77A6 gene, paying attention to the point that the expression time was similar to that of the LMI2 gene and the point expressed only in the seed coat.
  • cuticle synthesis in a wide range of plant bodies is not so active, whereas in seeds, the seed coat only accumulates high cuticles and thickens the cuticles of the seed coats. It was possible to provide seeds that are resistant to deterioration without impairing the quality of the seeds. Based on the above findings, the present invention has been completed.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a plant production method for producing seeds that specifically accumulate cuticles in seed coats The target plant is transformed with a gene encoding at least one transcriptional regulatory factor selected from the group consisting of LMI2, MYB16, and MYB106 transcriptional regulatory factors belonging to the MYB transcriptional regulatory factor gene family and homologs thereof. And a plant production method.
  • a gene encoding a transcriptional regulatory factor is fused with a gene encoding a transcriptional activation domain.
  • the gene encoding the transcription activation domain is a herpesvirus-derived VP16 gene.
  • the gene encoding a transcriptional regulatory factor is expressed in a transformed plant under the control of the promoter of the gene itself or a promoter derived from a cuticle biosynthesis gene, ] The method in any one of.
  • the cuticle biosynthetic gene-derived promoter is a CYP77A6 promoter or a promoter of an ortholog gene thereof.
  • the transcription control factor is a transcription control factor represented by any one of (a) to (e) below: (A) a transcriptional regulatory factor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 12 or 14, (A) a transcriptional regulatory factor in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 12 or 14, and have an activity of controlling the formation of a cuticle; (C) a transcriptional regulatory factor comprising an amino acid sequence having at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 12 or 14, and having an activity of controlling the formation of a cuticle, (D) a transcriptional regulatory factor encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 or 13 or 15; (E) A transcriptional regulatory factor encoded by a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 or 13 or
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising a sequence and having an activity of increasing the accumulation of cuticles (D) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 11 are linked; (E) In the nucleic acid of the above (d), the first base sequence and / or the second base sequence are under stringent conditions with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and / or SEQ ID NO: 11.
  • a nucleic acid that encodes a polypeptide that has a base sequence that hybridizes and has an activity of increasing the accumulation of cuticles (F) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are linked; (G) In the nucleic acid according to (f), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, and A nucleic acid encoding a polypeptide having an activity to increase the amount of (H) In the nucleic acid of (f), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 and / or SEQ ID NO: 2.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising a sequence and having an activity of increasing the accumulation of cuticles (I) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 11 are linked; (J) In the nucleic acid of the above (i), the first base sequence and / or the second base sequence are stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and / or SEQ ID NO: 11
  • a nucleic acid that encodes a polypeptide that has a base sequence that hybridizes and has an activity of increasing the accumulation of cuticles (K) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are linked; (L) In the nucleic acid described in (k) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising a sequence and having an activity of increasing the accumulation of cuticles (N) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 11 are linked; (O) In the nucleic acid of (n), the first base sequence and / or the second base sequence are under stringent conditions with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and / or SEQ ID NO: 11.
  • An expression cassette for producing a plant that produces seeds that specifically accumulate cuticles in the seed coat, LMI2 belonging to the MYB transcription factor gene family under the control of a promoter that induces gene expression in the seed coat,
  • An expression cassette comprising a gene encoding at least one transcriptional regulatory factor selected from the group consisting of MYB16 and MYB106 transcriptional regulatory factors and homologs thereof.
  • the promoter according to [8] or [9], wherein the promoter that induces gene expression in the seed coat is expressed under the control of the promoter derived from the transcription factor gene or the cuticle biosynthesis gene promoter.
  • Expression cassette [11] The expression cassette according to [10], wherein the cuticle biosynthetic gene-derived promoter is a CYP77A6 promoter or a promoter of an ortholog gene thereof.
  • the expression cassette is an expression cassette in which the nucleic acid according to any one of the following (a) to (o) is operably linked under the control of a promoter that induces gene expression in the seed coat.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising a sequence and having an activity of increasing the accumulation of cuticles (D) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 6 are linked; (E) In the nucleic acid of the above (d), the first base sequence and / or the second base sequence are under stringent conditions with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and / or SEQ ID NO: 11.
  • a nucleic acid that encodes a polypeptide that has a base sequence that hybridizes and has an activity of increasing the accumulation of cuticles (F) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are linked; (G) In the nucleic acid according to (f), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, and A nucleic acid encoding a polypeptide having an activity to increase the amount of (H) In the nucleic acid of (f), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 and / or SEQ ID NO: 2.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising a sequence and having an activity of increasing the accumulation of cuticles (I) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 11 are linked; (J) In the nucleic acid of the above (i), the first base sequence and / or the second base sequence are stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and / or SEQ ID NO: 11
  • a nucleic acid that encodes a polypeptide that has a base sequence that hybridizes and has an activity of increasing the accumulation of cuticles (K) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are linked; (L) In the nucleic acid described in (k) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising a sequence and having an activity of increasing the accumulation of cuticles (N) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 11 are linked; (O) In the nucleic acid of (n), the first base sequence and / or the second base sequence are under stringent conditions with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and / or SEQ ID NO: 11.
  • a nucleic acid that encodes a polypeptide that has a base sequence that hybridizes and has an activity of increasing the amount of cuticle accumulation [13] A vector comprising the expression cassette according to any one of [8] to [12]. [14] A kit comprising the vector according to [13].
  • the cuticle is thickened and hardly deteriorated by enhancing the function of the transcriptional regulatory factor encoded by “LMI2 gene” or “MYB16 gene” or “MYB106 gene” or a homologue thereof. It becomes possible to produce a plant having seeds. Thereby, the preservation
  • Fig. 1 shows the adhesion of leaf surface of Arabidopsis wild strain (Wild-type), 35S: LMI2-SRDX strain (strain expressed in Arabidopsis thaliana by cauliflower mosaic virus 35S promoter with SRDX transcription repression domain added to LMI2 transcription factor) (A, B), adhesion inside the bud (C, D), adhesion outside the bud (E, F), epicuticular wax accumulation (G, H), toluidine blue staining (I, J) Indicates.
  • the wild-type strain showed no adhesion of leaves or floral organs
  • the 35S: LMI2-SRDX strain showed adhesion of leaves or floral organs.
  • FIG. 2 shows seed adhesion of wild-type Arabidopsis thaliana (Wild-type) and lmi2-2 mutants (A, B), toluidine blue staining of immature seeds (C, D), and transmission electron microscope images of immature seed coat epidermis cell cross sections (E, F) shows the thickness (G) of the immature seed surface cuticle.
  • the wild strains formed individual seeds one by one, whereas the seeds of lmi2-2 mutants had a surface adhesion.
  • the wild type was not stained with toluidine blue because the cuticle was normal, whereas the lmi2-2 mutant was stained with toluidine blue.
  • FIG. 3 shows a wild-type Arabidopsis strain (Wild-type), an lmi2-2 mutant, and a CYP77A6pro: LMI2-VP16 strain (LMI2 transcription factor added with a VP16 transcriptional activation domain and expressed in Arabidopsis thaliana by a CYP77A6 promoter) ) Shows a reflection electron image of a cross section of a mature seed by a scanning electron microscope.
  • Fig. 4 shows seed deterioration treatment (A: relative humidity 100%, 40 ° C, 3 days) artificially performed in a short period of time between wild-type Arabidopsis (Wild-type) and CYP77A6pro: LMI2-VP16 strains or normal temperature and humidity 6
  • the germination rate after seed deterioration treatment by month (B) is shown.
  • Seeds in which cuticles are highly accumulated in the seed coat in the present invention to prevent deterioration, and plants that produce the seeds (1) Genes that highly accumulate seed coat cuticles In the present invention, seed coats are highly accumulated in plants.
  • the gene that controls the conservation of seeds is typically represented by “LMI2 gene” represented by SEQ ID NO: 10 or “MYB16 gene” represented by SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 15 derived from Arabidopsis thaliana. This is the “MYB106 gene”.
  • LMI2 transcription factor (GenBank Accession No.:NM_115989), MYB16 (GenBank Accession No.:NM_001085120), and MYB106 transcription factor (GenBank Accession No.:NM_110979) are known transcription factors belonging to R2R3MYB subgroup 9 of the MYB family. Since there are only two types of clades containing LMI2 transcription factor and clades containing MYB16 and MYB106 transcription factors, the same function can be expected for other transcription factors belonging to R2R3MYB subgroup 9. Further, in the group of plant transcription factors, it has been conventionally known that the conservation of function between plants is high, homologs with the same function exist, and functions can be shared across plant species.
  • orthologs such as Os02g0641900 gene derived from rice, AmMIXTA gene derived from snapdragon, homologs such as paralogs, and those in which a mutation is introduced into a part of the base sequence thereof are included. Then, by enhancing the function of the protein (transcriptional control factor) encoded by the “LMI2 gene” or “MYB16 gene” or “MYB106 gene” or a homologue thereof, a plant having an improved ability to produce the cuticle of the seed coat is obtained. be able to.
  • LMI2 gene “MYB16 gene” and “MYB106 gene” are not so high in identity among all amino acid sequences, but can be aligned with the transcription factor function (R2R3-MYB domain. LMI2 gene product).
  • the amino acid sequence within positions 1 to 183) shows about 65% identity at the amino acid level. Since these transcription factors have the same function with respect to cuticle formation, even among homologous genes in Arabidopsis thaliana or other plant genomes with high sequence identity of the alignable region, or among genes in which mutations are partially introduced If the storability of the alignable area is ensured, the same function can be expected.
  • LMI2 gene orthologs such as rice Os02g0641900 gene are expected to have the same function.
  • Any similar gene having at least 60%, preferably 70%, 80%, more preferably 90% identity at the amino acid level with the “LMI2 gene” or “MYB16 gene” or “MYB106 gene” can be used similarly. It is clear. Moreover, as long as the same function is hold
  • Such a gene has at least 60%, preferably 70%, 80%, more preferably 90% or more identity with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14 in amino acid sequence.
  • the plant transcriptional regulatory factor used for seed coat-specific accumulation of cuticles is “a group consisting of LMI2, MYB16 and MYB106 transcriptional regulatory factors belonging to the MYB transcriptional regulatory gene family and homologs thereof” At least one transcriptional regulatory factor selected from the above-mentioned "LMI2, MYB16, and MYB106 transcriptional regulatory factors and homologues" here, Arabidopsis or other plants in which the alignable region is conserved Along with the homologous gene in the genome, or a gene into which a mutation has been partially introduced, at least 60%, preferably 70%, 80%, more preferably at the amino acid level with “LMI2 gene” or “MYB16 gene” or “MYB106 gene” Contains 90% of similar genes with identity.
  • the method for producing seeds containing cuticle increased in the seed coat of the present invention comprises “LMI2 gene” or “MYB16 gene” or “ A plant that highly specifically expresses the function of the transcriptional regulatory factor encoded by the “MYB106 gene” in the seed coat, and that highly accumulates the cuticle in the seed coat can be obtained by this process.
  • LMI2 gene If expressed using the amino acid sequence or base sequence of the “LMI2 gene”, for example, it can be described as (a) to (e) below; (A) a transcriptional regulatory factor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (A) a transcriptional regulatory factor consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having an activity of controlling the accumulation of cuticles, (C) A transcription factor comprising an amino acid sequence having at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and having an activity of controlling cuticle accumulation.
  • the transcriptional regulatory factor encoded by the “MYB16 gene” is expressed using the amino acid sequence or base sequence of the “MYB16 gene”, it can be described as, for example, (f) to (c) below.
  • a transcriptional regulatory factor comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12
  • G a transcriptional regulatory factor consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and having an activity of controlling cuticle accumulation
  • C A transcription factor comprising an amino acid sequence having at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12, and having an activity of controlling cuticle accumulation.
  • the transcriptional regulatory factor encoded by the “MYB106 gene” is expressed using the amino acid sequence or base sequence of the “MYB106 gene”, it can be described, for example, as (sa) to (so) below. ; (Sa) a transcriptional regulatory factor consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, (B) a transcriptional regulatory factor consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, and having an activity of controlling cuticle accumulation; (S) A transcription factor comprising an amino acid sequence having at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, and having an activity of controlling cuticle accumulation.
  • “one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence” means that the amino acid in the amino acid sequence is modified without significantly affecting the structure or function of the polypeptide. Refers to what you are doing.
  • the term “several” refers to the presence of 2 to 160, 2 to 100, 2 to 50, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10 mutations.
  • “several” amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid shown in SEQ ID NO: 1, for example, 2 to 119, 2 to 89, preferably 2 to 59, more preferably It means that there are 2 to 29 mutations.
  • “several” amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid shown in SEQ ID NO: 12, for example, 2 to 130, 2 to 97, preferably 2 to 65, more preferably This refers to the presence of 2 to 32 mutations.
  • “several” amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid shown in SEQ ID NO: 14, for example, 2 to 155, 2 to 116, preferably 2 to 77, more preferably It means that there are 2 to 38 mutations.
  • “several” amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid shown in SEQ ID NO: 2, for example, 2 to 31, 2 to 15, preferably 2 to 7, more preferably The presence of 2 or 3 mutations.
  • the transcriptional regulatory factor to be functionally enhanced is at least 60% identical to the amino acid sequence of the transcriptional regulatory factor encoded by the “LMI2 gene” or “MYB16 gene” or “MYB106 gene”. And a transcriptional regulatory factor having an activity to control the formation of cuticles.
  • the identity of the transcriptional regulatory factor encoded by the “LMI2 gene” or “MYB16 gene” or “MYB106 gene” with respect to the amino acid sequence is preferably at least 60%, 70%, 80%.
  • the stringent condition refers to a condition in which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed.
  • a highly complementary nucleic acid that is, a complementary strand of DNA consisting of a nucleotide sequence having 90% or more, preferably 95% or more identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 is hybridized.
  • Examples include conditions in which complementary strands of nucleic acids with low identity do not hybridize.
  • Plants that are the subject of the present invention are generally applicable to dicotyledonous plants such as potatoes, beans and solanaceae, but from the viewpoint of seed crop preservation, soybeans, red beans Beans such as rapeseed, oil crops such as rapeseed, cottonseed and sunflower are preferred.
  • the present invention is not limited to these plants, and can also be applied to general breeding of monocotyledons such as rice, wheat and barley.
  • a plant containing the increased cuticle in the seed coat can be obtained.
  • plant progeny refers to a progeny obtained by sexual reproduction or asexual reproduction of the plant, including clones of the plant.
  • propagation materials for example, seeds, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.
  • “activity controlling cuticle formation” refers to the production of cuticles inherently provided by the transcriptional regulatory factor encoded by “LMI2 gene”, “MYB16 gene” or “MYB106 gene”. It refers to the transcriptional control activity of genes involved in synthesis.
  • the transcriptional regulatory factor or homologue or variant thereof it can be said that the body has an activity to control cuticle synthesis.
  • the transcriptional control activity inherently provided by the transcriptional regulatory factor is used synonymously with the function of the transcriptional regulatory factor.
  • the technique for enhancing the function of the transcriptional regulatory factor is merely to enhance the expression of the gene or protein of the target transcription factor in the plant body. However, it is necessary to increase the accumulation of cuticles in a seed coat-specific manner without impairing the growth function in the living body of the plant, and particularly the original function in the seed.
  • a transcriptional regulatory factor such as the LMI2 gene in the present invention, it is effective to add a gene encoding a transcriptional activation domain to a gene encoding the transcriptional regulatory factor.
  • VP16 SEQ ID NO: 5
  • GAL4 protein GAL4 protein
  • a promoter capable of highly accumulating cuticle specifically in the seed coat includes moderate expression of the LMI2 gene in the seed coat. It is important to encourage and not impede seed development.
  • the CYP77A6 promoter (SEQ ID NO: 16) used in this example is a promoter of the CYP77A6 enzyme gene in the cuticle synthesis pathway of Arabidopsis thaliana, and the CYP77A6 enzyme is mainly expressed in developing floral organs among tissues producing cuticles.
  • the LMI2 gene can be appropriately expressed in the seed coat and high accumulation in the seed coat can be achieved. Therefore, as a promoter for highly accumulating cuticle specifically in the seed coat of the present invention, in addition to the CYP77A6 promoter (SEQ ID NO: 16) or a promoter of its ortholog gene, a promoter derived from an enzyme gene in the cuticle biosynthetic pathway and LMI2 The promoter of the gene itself (SEQ ID NO: 17) or a homologous gene-derived promoter can also be used in the same manner.
  • a method for enhancing the function of a transcriptional regulatory factor encoded by the “LMI2 gene” using the method of adding a transcription activation domain will be specifically described as an example. To do.
  • the present invention is not limited to the method described below, and enhances the function of a transcriptional regulatory factor encoded by the “LMI2 gene” or “MYB16 gene” or “MYB106 gene” or a homolog thereof (including orthologs and paralogs). Any method that can be used, including those listed above, can be employed.
  • a transcriptional regulatory domain encoded by an “LMI2 gene” derived from Arabidopsis thaliana has a “transcription activation domain”.
  • Nucleic acids encoding the added polypeptide can be used.
  • VP16 (SEQ ID NO: 5) is preferably used as the polypeptide used as the transcription activation domain.
  • a nucleic acid (transgene) introduced to express a cuticle-enhancing trait is, for example, Can be expressed as: (A) a nucleic acid encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are linked; (B) In the nucleic acid described in (a) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, and a cuticle A nucleic acid encoding a polypeptide having an activity to increase the amount of (C) In the nucleic acid of (a), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and / or SEQ ID NO: 5.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising a sequence and having an activity of increasing the accumulation of cuticles (D) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 11 are linked; (E) In the nucleic acid of the above (d), the first base sequence and / or the second base sequence are under stringent conditions with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and / or SEQ ID NO: 11.
  • a nucleic acid (transgene) introduced to express a cuticle-enhancing trait is for example, it can be expressed as: (F) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are linked; (G) In the nucleic acid according to (f), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, and A nucleic acid encoding a polypeptide having an activity to increase the amount of (H) In the nucleic acid of (f), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 and / or SEQ ID NO: 2.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising a sequence and having an activity of increasing the accumulation of cuticles (I) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 11 are linked; (J) In the nucleic acid of the above (i), the first base sequence and / or the second base sequence are stringent with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and / or SEQ ID NO: 11
  • a nucleic acid (transgene) introduced to express a cuticle-enhancing trait is for example, it can be expressed as: (K) a nucleic acid encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 and the second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 are linked; (L) In the nucleic acid described in (k) above, the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids, and a cuticle A nucleic acid encoding a polypeptide having an activity to increase the amount of (M) In the nucleic acid of (k), the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has at least 60% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 and / or SEQ ID NO: 2.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide comprising a sequence and having an activity of increasing the accumulation of cuticles (N) a nucleic acid comprising a base sequence in which the first base sequence shown in SEQ ID NO: 15 and the second base sequence shown in SEQ ID NO: 11 are linked; (O) In the nucleic acid of (n), the first base sequence and / or the second base sequence are under stringent conditions with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 and / or SEQ ID NO: 11.
  • the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1” or “the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12” or “the first amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14” means “LMI2 gene” ”Or“ MYB16 gene ”or“ MYB106 gene ”, which is an amino acid sequence of a transcriptional regulatory factor, which lacks a part on the C-terminal side in order to be linked in-frame with the second amino acid sequence. Good amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of the transcriptional regulatory factor encoded by “LMI2 gene” or “MYB16 gene” or “MYB106 gene” used in the present invention is the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 14.
  • polypeptide having any of the following (i) or (ii) and a function of a transcriptional regulatory factor encoded by “LMI2 gene” or “MYB16 gene” or “MYB106 gene” Peptides are also included; (i) one or several amino acids deleted, substituted or added in the amino acid sequence, or (ii) the amino acid sequence, at least 60%, more preferably 70% 80%, more preferably 90% or more amino acid sequences having identity.
  • the function of a transcriptional regulatory factor encoded by “LMI2 gene” or “MYB16 gene” or “MYB106 gene” is preferably a polypeptide having the DNA binding ability of the transcription control factor. That is, if the polypeptide includes the DNA binding region of the transcriptional regulatory factor, the amino acid sequence of the transcriptional regulatory factor fragment is also the amino acid sequence of the transcriptional regulatory factor encoded by the “LMI2 gene” used in the present invention. included.
  • the “second amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2” is a “transcription activation domain” added to enhance the function of the transcription control factor encoded by the “LMI2 gene”.
  • the “transcription activation domain” used in the present invention in addition to the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, either of the following (i) or (ii), and the first Also included are polypeptides that can enhance the function of the transcription factor encoded by the amino acid sequence; (i) a deletion, substitution, or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence, or (ii) the An amino acid sequence having an identity of at least 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95%.
  • the above (c) includes the following one form: (C-1)
  • the first amino acid sequence is at least 60% (more preferably 70% or more, 80% or more, more preferably 90%) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. % Or more) identity
  • the second amino acid sequence has at least 80% (more preferably 90% or more, more preferably 95% or more) identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Consisting of an amino acid sequence having And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of accumulated cuticle.
  • the above (h) includes the following one form: (H-1) In the nucleic acid of (f), the first amino acid sequence is at least 60% (more preferably, 70% or more, 80% or more, more preferably 90%) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12. % Or more) identity, (H-2) In the nucleic acid of (f), the second amino acid sequence has at least 80% (more preferably 90% or more, more preferably 95% or more) identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Consisting of an amino acid sequence having And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of accumulated cuticle.
  • the above (m) includes the following one form: (M-1) In the nucleic acid of (k), the first amino acid sequence is at least 60% (more preferably 70% or more, 80% or more, more preferably 90%) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14. % Or more) identity, (M-2) In the nucleic acid of (k), the second amino acid sequence has at least 80% (more preferably 90% or more, more preferably 95% or more) identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. Consisting of an amino acid sequence having And a nucleic acid encoding a polypeptide having an activity of increasing the amount of accumulated cuticle.
  • the first amino acid sequence and / or the second amino acid sequence has a deletion, substitution or addition of one or several amino acids
  • the first amino acid sequence and the second amino acid sequence are In the linked amino acid sequence, (1) when a part of the first amino acid sequence has deletion, substitution or addition of one or several amino acids, (2) one or several parts of the second amino acid sequence And (3) deletion, substitution or addition of one or several amino acids in the entire amino acid sequence in which the first amino acid sequence and the second amino acid sequence are linked. Including.
  • the first base sequence and / or the second base sequence is a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and / or SEQ ID NO: 11”.
  • a portion of the first base sequence is a stringent condition with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10
  • the second base sequence portion is a base sequence that hybridizes with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 under stringent conditions
  • the entire base sequence linked to the first base sequence and the second base sequence is linked to the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 and the base sequence shown in SEQ ID NO: 11.
  • the nucleotide sequence hybridizes to a nucleotide sequence, including. "The first base sequence and / or the second base sequence is a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and / or SEQ ID NO: 11.” And “the first base sequence and / or the second base sequence is a base sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 and / or SEQ ID NO: 11. Similarly, the case of “Yes” includes the cases (4) to (6) above.
  • first amino acid sequence and the “second amino acid sequence”, or the “first base sequence” and the “second base sequence” are respectively passed through the “polypeptide linker” or the “polynucleotide linker”. May be connected.
  • the use of the linker is not essential, and can be appropriately designed and used as necessary.
  • the amino acid sequence or base sequence of the linker is not particularly limited as long as a polypeptide capable of enhancing the function of the transcription control factor can be produced.
  • the polypeptide linker consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 A polynucleotide linker consisting of the base sequence shown in the above can be preferably used.
  • the linker can also contain a sequence generated as a result of gateway cloning of the transcriptional regulatory factor into the vector.
  • a sequence generated as a result of gateway cloning of the transcriptional regulatory factor into the vector For example, an attB sequence generated by the gateway LR reaction can be included. Accordingly, the linker is not limited to the above-described sequence, and those skilled in the art can appropriately design a preferable linker depending on the type of vector used.
  • first amino acid sequence or base sequence and the second amino acid sequence or base sequence may be arranged on the N-terminal side or 5 'side.
  • first amino acid sequence or base sequence (2) polypeptide linker or polynucleotide linker, and (3) second amino acid sequence or base sequence from the N-terminal side or 5 'side.
  • second amino acid sequence or base sequence from the N-terminal side or 5 'side.
  • the “expression cassette” refers to one expression system unit capable of expressing a nucleic acid (mainly a gene or a fragment thereof) contained in the cassette.
  • the expression cassette has an expression regulatory region necessary for gene expression in addition to the region containing the nucleic acid.
  • Such expression regulatory regions include, for example, promoters and terminators.
  • an enhancer, a poly A addition signal, a 5'-UTR (untranslated region), a label or selection marker gene, a multicloning site, a replication origin, and the like can be included.
  • the expression cassette was artificially constructed by combining a single expression system unit necessary for expressing a specific gene, etc., as it was from the genome, or by combining expression control regions derived from various organisms. Things exist. Any expression cassette can be used in the present invention.
  • a configuration known in the art can be appropriately selected as long as it is not described in the present specification.
  • the “expression cassette” provides an effect of enhancing the activity of a transcriptional regulatory factor encoded by the “LMI2 gene” in the target plant, and has a function of increasing the accumulation of cuticle in the plant. .
  • the promoter for expressing the transgene used in the present invention is a “promoter that induces LMI2 gene expression in the seed coat”.
  • the “promoter capable of highly accumulating cuticle specific to the seed coat” is the promoter of CYP77A6 promoter or its ortholog gene (hereinafter simply referred to as “CYP77A6 promoter”).
  • a construct (recombinant vector) in which the transgene is arranged downstream of the “CYP77A6 promoter” is constructed according to a conventional method, and is transformed into a wild-type strain.
  • the “vector” includes the expression cassette, and is a vector introduced into Escherichia coli or the like used for the propagation of a nucleic acid comprising the base sequence contained in the expression cassette, or a plant transformation. Contains vectors to do.
  • a vector known in the art can be used, and it may be appropriately selected according to the plant to be introduced and the technique and purpose of the vector.
  • R4pGWB5_VP16_HSP used in the following examples can be used, but the present invention is not limited thereto.
  • pDEST_VP16_HSP_GWB5 can be used.
  • the present invention provides, as one embodiment, a kit for producing a plant containing increased cuticles.
  • the kit include a vector used for enhancing the function of a transcriptional regulatory factor encoded by “LMI2 gene”, “MYB16 gene”, or “MYB106 gene”.
  • a kit containing such a vector a vector comprising an expression cassette in which the nucleic acid according to any one of the above (a) to (c) is operably linked downstream of a promoter that induces gene expression in the seed coat. It is sufficient if it contains at least, and it is more preferable if it contains a reagent group for introducing the vector into plant cells. Examples of the reagent group include enzymes, buffers and the like corresponding to the type of transformation. In addition, an experimental material such as a microcentrifuge tube may be attached as necessary.
  • the Agrobacterium method is typical, but the PEG-calcium phosphate method, electroporation method, liposome method, particle gun method, microinjection method, etc. The method can be applied.
  • the cuticle accumulation amount in the seed coat increases as shown in the following Examples.
  • the thickness of the lipid layer existing on the surface can be evaluated by observing the seed coat cross section using a scanning electron microscope. When a scanning electron microscope detects reflected electrons, a contrast is obtained due to a difference in composition. Since lipids appear bright, they can be distinguished from other cell structures, and the thickness of the cuticle can be examined.
  • the plant with increased cuticular accumulation obtained by the present invention contains an increased cuticle when compared to the wild strain in a preferred embodiment.
  • LMI2-VP16 Arabidopsis and wild seeds are harvested and stored in a low-temperature room (relative humidity 6-12%, 7-10 ° C) for more than a week after harvesting to stabilize the water content, then relative humidity 100%, 40 Aged for 3 days at °C. Subsequently, after drying for 3 days at room temperature with a relative humidity of 10-30%, it was placed in a cold room for 2 days or more. Control seeds that were not degraded were stored in a cold room. The seeds subjected to the above treatment were sterilized with PPM and simultaneously water-absorbed at 4 ° C. for 4 days and then sown on an agar medium.
  • Example 1 Preparation of Arabidopsis plant transformed with ProCYP77A6: LMI2-VP16 (1-1) Construction of transformation vector ProCYP77A6: LMI2-VP16 A transformation vector was constructed as follows. The LMI2 protein coding region derived from Arabidopsis thaliana excluding the stop codon was amplified by PCR using the following oligonucleotide pair as a primer, and cloned into the gateway donor vector pDONR207 vector (Invitrogen) by BP clonase.
  • a CYP77A6 promoter derived from Arabidopsis thaliana was amplified by PCR using the following oligonucleotide pair as a primer, and cloned into the gateway donor vector pDONRG_P4P1R described in Non-Patent Document 10 using BP clonase.
  • the vector used for transformation was constructed by ligating the CYP77A6 promoter and the protein coding region of the LMI2 gene simultaneously with LR clonase into the R4pGWB5_VP16_HSP vector (SEQ ID NO: 9).
  • the protein coding region of the LMI2 gene and the base sequence encoding the VP16 transcriptional activation domain are arranged downstream of the CYP77A6 promoter via a polynucleotide linker.
  • the cells were collected from the culture and suspended in 500 ml of an infiltration medium (see Patent Document 1).
  • Arabidopsis thaliana Columbia-0 was grown for 45-60 days to bloom, and after cutting the main stem, it was grown for another 10 days and used for transformation.
  • the Arabidopsis thaliana was infected for 2 minutes in an infiltration medium in which bacterial cells were suspended, and grown as usual, and T1 seeds were harvested. After that, T1 seeds were sterilized with 50% bleach and 0.02% Triton X-100 solution for 7 minutes, rinsed three times with sterilized water, and sown in MS selective medium containing 30 mg / l hygromycin (Hg).
  • Transformed plants (ProCYP77A6: LMI2-VP16, T1) that grow on the above hygromycin plate are selected, planted in soil, grown, seeds collected and sown to obtain the next generation (T2) Arabidopsis plants It was. Subsequently, a transformant (ProCYP77A6: LMI2-VP16, T2) that grows on the hygromycin plate is selected, replanted in soil, grown, seeded and sown, and the next generation (T3) Arabidopsis plant Got.
  • ProCYP77A6 Cross-sectional observation of seed of LMI2-VP16 Arabidopsis plant
  • ProCYP77A6 LMI2-VP16 Arabidopsis T2 seed obtained in Example (1-2) was cut with a razor at right angles to the seed coat and scanned Observed with a scanning electron microscope.
  • the ProCYP77A6 LMI2-VP16 strain, cuticles accumulated thicker in the seed coat surface than in the wild strain (FIG. 3).
  • ProCYP77A6 LMI2-VP16 Arabidopsis plant seed degradation test (3-1) Artificial degradation ProCYP77A6: LMI2-VP16 Arabidopsis T3 seed obtained in Example (1-2) above harvested after harvest After one week or more, the samples were placed in a low temperature room (relative humidity 6-12%, 7-10 ° C) to stabilize the water content, and then subjected to deterioration treatment at 100% relative humidity and 40 ° C for 3 days. After drying for 3 days at room temperature with a relative humidity of 10-30%, it was placed in a cold room for 2 days or more. Control seeds that were not degraded were stored in a cold room.
  • a low temperature room relative humidity 6-12%, 7-10 ° C
  • the seeds treated as described above were sterilized by immersing in 1/50 diluted PPM, 0.005% Triton X-100 solution, and at the same time absorbed water at 4 ° C. for 4 days, and then sown on MS agar medium.
  • LMI2-VP16 Arabidopsis thaliana was germinated faster than the wild strain, and the germination rate was increased (FIG. 4A). From these results, it was considered that ProCYP77A6: LMI2-VP16 Arabidopsis thaliana had less seed degradation than the wild type and was advantageous for long-term storage of seeds.

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Abstract

本発明の課題は、植物の表面を保護するクチクラを種子の表面に高蓄積させることによる保存性の高い種子の提供、及び種子の保存能力を高めた植物を提供することにある。　対象とする植物において、シロイヌナズナ由来の「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」によりコードされる転写制御因子、又はそのホモログを、CYP77A6遺伝子由来プロモータの制御下で発現させることにより種皮へのクチクラの蓄積を増加させる方法を提供する。

Description

種子の劣化を抑制する方法
　本発明は、植物において特定の転写制御因子の発現を強化させることにより、種皮にクチクラを高蓄積させて種子の劣化を抑制する方法、及び劣化が抑制された種子を産生する植物の生産方法に関する。
　種子は植物の繁殖手段として農業上または種の保存の観点から重要であり、さらに種子そのものが食糧や飼料として欠かすことができない。これまでに、作物の栽培、育種、植物研究などを目的として、種子を劣化させずに発芽能力と生育特性を保った状態で保存、運搬するための技術開発や生理学的研究が広く行われてきた。種子の劣化とは、湿度、温度、酸素、二酸化炭素、紫外線等の環境ストレスや病原菌、害虫などの生物ストレスにさらされたことにより、酸化ストレスや傷、電解質流出、DNAの損傷、膜の分解等が起こることである。種子の劣化を防ぐため、種子は種皮によって保護され、抗酸化物質を蓄積したり、代謝活性を低下させたりするほか、損傷の修復機構が備わっているが、植物種や遺伝的な要因により保存可能期間は大きく異なる。熱帯性の植物に多いレカルシトラント種子は冷却や乾燥に弱い。それに対して、その他の多くの種子はオーソドックス種子と呼ばれ、低温・低湿条件下で寿命を延ばすことができる。一般的には湿度が1％下がる、または5.6℃下がるごとに保存性は2倍に上昇すると言われており、厳密な相対湿度と温度の管理が望ましい。また、高酸素圧やカビ等の発生は寿命を縮める原因となるため、各国のジーンバンクでは殺菌処理及び密閉容器による保存が行われている。ジーンバンクで行われるような温度、湿度管理のもと、種子を保存することは活性を保ったまま最大限寿命を延ばすためには重要であるが、一方で設備コストがかかるため多量に保管することは難しい。農業上の保存は、例えば穀類の場合、水分含量12～13％、常温で、もしくは夏場は冷温庫で一年程度の保存が目標とされている。多くの植物種に対して種子の保存条件の検討が行われ、農業上や長期保存に適した手法が開発されてきた。しかし、これまでの経験や知見に基づいた方法では未だ十分な保存期間を確保できない植物も数多く存在する。
ＷＯ２００７／１０２３４６
Plant Physiology,2000 122,403-413 The Plant Cell, 2007 19,351-368 Yoshimi Oshima, Masahito Shikata, Tomotsugu Koyama, Norihiro Ohtsubo, Nobutaka Mitsuda, Masaru Ohme-Takagi, The Plant Cell, 2013, 25,1609-1624 Yoshimi Oshima, Nobutaka Mitsuda, Plant Sinnaling & Behavior,2013, 8,e26826 Plant Physiology, 2009 151,1773-1789 Molecular plant, 2010 3,563-575 Development, 2011 138,3189-3198 大島良美、鳴海貴子、高木優、光田展隆、花芽発生を制御する転写因子LMI2の未熟種子クチクラ形成における機能、第55回日本植物生理学会年会、2014, 3月 大島良美、鳴海貴子、金子康子、石川寿樹、川合真紀、高木優、光田展隆、花芽発生を制御する転写因子LATE MERISTEM IDENTITY 2のクチクラ形成における機能、第56回日本植物生理学会年会、2015, 3月 Yoshimi Oshima, Nobutaka Mitsuda, Masaru Nakata, Tsuyoshi Nakagawa, Shingo Nagaya, Ko Kato, Masaru Ohme-Takagi, Plant Biotechnology, 2011, 28,201-210
　植物の種皮は抗酸化物質（色素）、脂質性ポリエステル層、二次細胞壁を含んでいることにより水分、酸素、二酸化炭素、紫外線などの透過を制限し、内部の胚を守っていることが知られている。その中でも主要な役割を果たすと考えられているのは色素とスベリンであり、色素の合成が出来なくなる変異体や外側の細胞層の分化（脂質性ポリエステル層スベリンと二次細胞壁を含む）が異常になる変異体種子は野生型と比べて容易に劣化する（非特許文献１）。スベリンの合成酵素の変異体では、種子の水分透過性が上昇する（非特許文献２）。しかし、色素やスベリンの合成酵素遺伝子を導入し、これらの構造を増強して種子劣化を防いだという報告はなく、色素やスベリンなどの生合成には複数の遺伝子が関わることから単一遺伝子を高発現させても期待した効果が得られなかった可能性が高い。劣化防止に利用する為には、適切な組成でそれぞれの単量体を蓄積、重合させる必要があると考えられ、容易ではない。
　このように、種子の保護組織を改変するのは容易ではなく、保存方法も限られている。
　本発明においては、種子表面にクチクラを高蓄積させることにより、外部環境による種子の劣化を抑える技術を提供することを目的とする。種子の品質を維持する方法の開発により作物の生産や交配育種による新品種の開発、希少種の保存、豆類、穀類、ナッツ、油糧作物等の品質維持に貢献できる。
　クチクラは植物の地上部のほとんどすべてを覆っている構造で、植物を乾燥、汚れ、強光、病原菌や害虫から守っている。クチクラはワックスと脂質性ポリエステルのクチン、芳香族化合物などから構成されており、ワックスは食品加工、化粧品、工業品にも使われる。未熟種子の最外層にもクチクラが形成され、種子の発達過程で種子同士や種子と果実内部の癒着を防ぐ働きが知られている（非特許文献５、非特許文献６）。しかし、成熟種子での機能は知られておらず、種子の保存性に寄与するとは考えられてこなかった。
　本発明者らはシロイヌナズナの転写因子遺伝子について広く検討する中で、MYB転写制御因子遺伝子ファミリーに属するMYB16とMYB106転写因子がクチクラの形成を制御することを発見した（非特許文献３、非特許文献４）。これらの転写因子にヘルペスウイルス由来の強力な転写活性化ドメインを融合した活性強化タイプのMYB16-VP16やMYB106-VP16を植物全身で発現させると、クチクラ形成に必要な一群の酵素群及びトランスポーターなどの発現を介して葉の表面に葉に見られるタイプのワックスや花弁特有のクチクラを蓄積させることができた。このことから、MYB16及びMYB106転写因子には、クチクラ形成に必要な一連の遺伝子発現を誘導することで機能的なクチクラを高蓄積させる機能があることを解明した。
　MYB16、MYB106転写因子は、MYBファミリーのうちでもR2R3MYBサブグループ９に属するが、当該サブグループには、花芽の分化を制御するLMI2転写因子（非特許文献７）も含まれる。LMI2転写因子は、サブグループ内のクレードがMYB16、MYB106とは異なっており、タンパク質ドメインの構造もMYB16及びMYB106とは大きく異なる為、タンパク質機能も異なると考えられていた（非特許文献３）。
　本発明者らは、以前、LMI2転写因子の機能解明のため、LMI2遺伝子に強力な転写抑制ドメインを融合して恒常的に発現させることにより機能欠損の表現型を誘導した植物を作成したところ、予想に反して葉やつぼみ表面の癒着や水分透過性の上昇、エピクチクラワックスの減少などクチクラ減少の表現型を示すことを見出した。さらに、LMI2の遺伝子破壊株lmi2-2は種子の表面が癒着し、未熟種皮表面のクチクラが薄くなり、水分透過性が上昇したことから、LMI2遺伝子は種子のクチクラの形成に不可欠な遺伝子であることも見出した（非特許文献８、非特許文献９）。
　これらのことから、LMI2転写因子もMYB16、MYB106転写因子と同様に、植物内で高発現させることにより機能的なクチクラを高蓄積させる可能性があることが期待される転写因子であるといえる。
　本発明者らは、前記課題を解決するために、LMI2転写因子などを種子特異的に発現させることで、種子表面のクチクラ形成を増強することができれば、クチクラによる種子表面の保護作用により種子の劣化を防げるのではないかと発想した。
　しかしながら、種子でのクチクラ形成には種々の一連の遺伝子が関わっており、LMI2遺伝子のみを高発現させたからといって、果たしてクチクラを高蓄積できるのかすら不明な状況であり、しかも種子表面のみでの高蓄積が可能か否かは全くわからなかった。確かに、同じR2R3MYBサブグループ内のMYB16、MYB106転写因子の発現によって、葉や花弁内でクチクラの高蓄積に成功していたといっても、種子の場合は、単なる植物小器官の葉や花弁とは事情が大きく異なり、次の世代の完全な植物体を形成するための全機能と共に発芽のためのホルモン形成や栄養分の貯蔵機能が凝縮されて詰まっている。そのような種子内で特定の経路の遺伝子を高発現させることにより、望みの機能のみが発現できる確実性は乏しかった。すなわち、仮に種子表面にクチクラが高蓄積するとしても、カーボンリソースがそれに奪われることなどにより、種子本来の重要な機能が損なわれる可能性もあった。
　実際、本発明者らはまず、種子特異的にLMI2遺伝子に強力な転写活性化ドメインのVP16を融合したキメラアクティベーター遺伝子を発現させるために、種子全体を含めた植物全身で働くカリフラワーモザイクウイルス由来の35Sプロモータと種皮の発達段階で長く働くABCG12プロモータを試してみたが、種子本来の機能を損なう結果となり、種子数の低下や発芽率の低下を引き起こした。
　そこで、本発明者らは、クチクラ合成経路中の酵素遺伝子であるCYP77A6遺伝子が、植物体内の広範な部位でのクチクラ合成に関わる遺伝子であって、種子特異的とはいえないが、種子内では種皮のみで発現している点とLMI2遺伝子と発現時期が似ている点に注目し、CYP77A6遺伝子由来のプロモータにLMI2-VP16遺伝子を繋ぎ発現させた。
　その結果、予想に反し、植物体内の広範な部位でのクチクラ合成はそれほど活発ではないのに対し、種子においては種皮のみでクチクラの高蓄積が起こって種皮のクチクラが厚くなり、種子本来の機能を損なうことなく劣化に強い種子を提供することができた。
　以上の知見から、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
〔１〕　種皮で特異的にクチクラを蓄積する種子を産生する植物の生産方法であって、
対象植物を、MYB転写制御因子遺伝子ファミリーに属するLMI2、MYB16、及びMYB106転写制御因子並びにそのホモログからなる群より選択される少なくとも一つの転写制御因子をコードする遺伝子を用いて形質転換することを特徴とする、植物の生産方法。
〔２〕　転写制御因子をコードする遺伝子が、転写活性化ドメインをコードする遺伝子と融合されていることを特徴とする前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕　転写活性化ドメインをコードする遺伝子がヘルペスウイルス由来VP16遺伝子である、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕　転写制御因子をコードする遺伝子が、形質転換された植物において、当該遺伝子自身のプロモータ又はクチクラ生合成遺伝子由来プロモータの制御下で発現することを特徴とする、前記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕　クチクラ生合成遺伝子由来プロモータが、CYP77A6プロモータ又はそのオルソログ遺伝子のプロモータである前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕　転写制御因子が、下記(ア)～(オ)のいずれかに示される転写制御因子である、前記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の方法；
(ア)配列番号１又は１２又は１４に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
(イ)配列番号１又は１２又は１４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、クチクラの形成を制御する活性を有する転写制御因子、
(ウ)配列番号１又は１２又は１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写制御因子であって、かつ、クチクラの形成を制御する活性を有する転写制御因子、
(エ)配列番号１０又は１３又は１５に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
(オ)配列番号１０又は１３又は１５に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、クチクラの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
〔７〕　対象植物の形質転換方法が、種皮で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)～(ｏ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを用いることを特徴とする、前記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法；
（ａ）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号１０に示される第一の塩基配列と配列番号１１に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１０及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｆ）配列番号１２に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ）前記(ｆ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｈ）前記(ｆ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１２及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ）配列番号１３に示される第一の塩基配列と配列番号１１に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｊ）前記(ｉ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１３及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ）配列番号１４に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｌ）前記(ｋ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｍ）前記(ｋ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１４及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｎ）配列番号１３に示される第一の塩基配列と配列番号１１に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｏ）前記(ｎ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１３及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
〔８〕　種皮で特異的にクチクラを蓄積する種子を産生する植物を生産するための発現カセットであって、種皮で遺伝子発現を誘導するプロモータの制御下にMYB転写制御因子遺伝子ファミリーに属するLMI2、MYB16、及びMYB106転写制御因子並びにそのホモログからなる群より選択される少なくとも一つの転写制御因子をコードする遺伝子を含む、発現カセット。
〔９〕　転写制御因子をコードする遺伝子が、転写活性化ドメインをコードする遺伝子と融合されていることを特徴とする前記〔８〕に記載の発現カセット。
〔１０〕　種皮で遺伝子発現を誘導するプロモータが、前記転写制御因子遺伝子由来のプロモータ又はクチクラ生合成遺伝子由来プロモータの制御下で発現することを特徴とする、前記〔８〕又は〔９〕に記載の発現カセット。
〔１１〕　クチクラ生合成遺伝子由来プロモータが、CYP77A6プロモータ又はそのオルソログ遺伝子のプロモータである前記〔１０〕に記載の発現カセット。
〔１２〕　発現カセットが、種皮で遺伝子発現を誘導するプロモータの制御下に、以下の(ａ)～(ｏ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットである、前記〔８〕～〔１１〕のいずれかに記載の発現カセット；
（ａ）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号２に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１０及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｆ）配列番号１２に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ）前記(ｆ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｈ）前記(ｆ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１２及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ）配列番号１３に示される第一の塩基配列と配列番号１１に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｊ）前記(ｉ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１３及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ）配列番号１４に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｌ）前記(ｋ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｍ）前記(ｋ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１４及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｎ）配列番号１３に示される第一の塩基配列と配列番号１１に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｏ）前記(ｎ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１３及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
〔１３〕　前記〔８〕～〔１２〕のいずれかに記載の発現カセットを含むベクター。
〔１４〕　前記〔１３〕に記載のベクターを含むキット。
　本発明の植物の生産方法によれば、「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」によりコードされる転写制御因子又はそのホモログの機能を強化することでクチクラを厚くし、劣化しにくい種子を有する植物を生産することが可能となる。これにより、種子の保存期間の延長や冷蔵庫などを使用しない保存方法を採用することができる。
図１はシロイヌナズナ野生株（Wild-type）、35S:LMI2-SRDX株 (LMI2転写因子にSRDX転写抑制ドメインを付加してカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモータによりシロイヌナズナにおいて発現させた株)の葉の表面の癒着（A,B）、つぼみ内部の癒着（C,D）、つぼみ外部の癒着(E,F)、エピクチクラワックスの蓄積（G,H）、トルイジンブルー染色（I,J）を、観察した画像を示す。野生株は葉や花器官の癒着が見られないのに対し、35S:LMI2-SRDX株では葉や花器官の癒着が見られた。茎表面の走査型電子顕微鏡観察を行うと、野生株ではエピクチクラワックスの白い結晶が多く見られたのに対し、35S:LMI2-SRDX株では減少していた。機能的なクチクラを有する野生株は水溶性の染色液であるトルイジンブルーを組織内部に吸収しない為、染色されないのに対し、35S:LMI2-SRDX株はトルイジンブルーにより青く染色された。すなわち、35S:LMI2-SRDX株のクチクラの機能的な欠損とクチクラワックスの減少は、LMI2が正常なクチクラ形成を制御する機能を持つことを示している。 図２はシロイヌナナズナ野生株（Wild-type）、lmi2-2変異株の種子の癒着（A,B）、未熟種子のトルイジンブルー染色（C,D）、未熟種皮表皮細胞断面の透過型電子顕微鏡画像（E,F）、未熟種子表面クチクラの厚さ(G)を示す。野生株は一つ一つ独立した種子を形成するのに対し、lmi2-2変異株の種子は表面が癒着した。野生型はクチクラが正常である為トルイジンブルーに染色されないのに対し、lmi2-2変異株はトルイジンブルーに染色された。オスミウム染色により黒い層として観察されるクチクラは野生株と比較してlmi2-2では薄い。すなわち、LMI2遺伝子は種子のクチクラ形成に機能する。 図３は、シロイヌナズナの野生株（Wild-type）、lmi2-2変異体及びCYP77A6pro:LMI2-VP16株（LMI2転写因子にVP16転写活性化ドメインを付加してシロイヌナズナCYP77A6プロモータによりシロイヌナズナにおいて発現させた株）の成熟種子断面の走査型電子顕微鏡による反射電子画像を示す。反射電子像では脂質層が白く見え、表面に存在する白い層がクチクラを示す。野生株に対してlmi2-2変異株ではクチクラが薄くなり、CYP77A6pro:LMI2-VP16株(LMI2-VP16#1,LMI2-VP16#21)ではクチクラが厚くなっていた。 図４は、シロイヌナズナの野生株(Wild-type)とCYP77A6pro:LMI2-VP16株の人工的に短期間で行う種子劣化処理（A：相対湿度100%、40℃、3日間）または常温常湿6か月（B）による種子劣化処理後の発芽率を示す。人工的な劣化処理を行わない場合（Control）、野生株、CYP77A6pro:LMI2-VP16株ともに発芽率の低下は見られないが、人工的な劣化処理後、野生株は発芽率が60％程度に低下するのに対し、CYP77A6pro:LMI2-VP16株は90%の発芽率を保っていた。収穫後すぐの発芽率に対する常温常湿6か月保存後の発芽率は野生株に比較してCYP77A6pro:LMI2-VP16株の方が高かった。
　以下、本発明をさらに詳細に説明する。
１．本発明における種皮にクチクラを高蓄積させて劣化を防止した種子、及び当該種子を産生する植物について
（１）種皮のクチクラを高蓄積させる遺伝子について
　本発明において植物に対して種皮のクチクラを高蓄積させて種子の保存性を制御する遺伝子は、典型的には、シロイヌナズナ由来の配列番号１０で表される「LMI2遺伝子」又は配列番号１３で表される「MYB16遺伝子」又は配列番号１５で表される「MYB106遺伝子」である。
　LMI2転写因子（GenBank Accession No.:NM_115989）並びにMYB16（GenBank Accession No.:NM_001085120）、MYB106転写因子（GenBank Accession No.:NM_110979）は、MYBファミリーのR2R3MYBサブグループ９に属する既知の転写因子であり、当該サブグループにはLMI2転写因子が含まれるクレード及びMYB16、MYB106転写因子が含まれるクレードの2種類しか存在しないので、他のR2R3MYBサブグループ９に属する転写因子についても同様の機能が期待できる。また、植物の転写因子群においては、従来から植物間での機能の保存性が高く、同一機能のホモログが存在し、かつ植物種を越えて機能が共有できることが知られており、本発明においても、例えばイネ由来のOs02ｇ0641900遺伝子や、キンギョソウ由来のAmMIXTA遺伝子などのオルソログ、パラログなどのホモログやその塩基配列の一部に変異が導入されたものも含まれる。そして、当該「LMI2遺伝子」若しくは「MYB16遺伝子」若しくは「MYB106遺伝子」又はそのホモログによりコードされるタンパク質(転写制御因子)の機能を強化することで、種皮のクチクラの生産能が向上した植物を得ることができる。
　「LMI2遺伝子」と「MYB16遺伝子」及び「MYB106遺伝子」は、全アミノ酸配列同士の同一性はそれほど高くないが、転写因子機能に関わるとされるアライン可能領域（R2R3-MYBドメイン。LMI2遺伝子産物のアミノ酸配列1番目～183番目の位置。）内のアミノ酸レベルで約65％の同一性が認められる。これら転写因子はクチクラ形成に関して同じ機能を持っていることから、当該アライン可能領域の配列同一性の高いシロイヌナズナ又は他の植物ゲノム中の相同遺伝子、又は一部に変異が導入された遺伝子のうちでも当該アライン可能領域の保存性が確保されていれば、同様の機能が期待できる。例えば、イネのOs02g0641900遺伝子などのLMI2遺伝子オルソログなどは同一機能を有すると期待される。
　「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」とアミノ酸レベルで少なくとも60％、好ましくは70％、80％、より好ましくは90％、の同一性を有する類似遺伝子であれば同様に用いられることが明らかである。また同一機能を保持している限り、そのフラグメントでもよい。そのような遺伝子は、アミノ酸配列では配列番号１又は配列番号１２又は配列番号１４と少なくとも60％、好ましくは70％、80％、より好ましくは90％以上の同一性を有する。
　以上のことから、本発明において、種皮特異的にクチクラを蓄積させるために用いる植物転写制御因子は、「MYB転写制御因子遺伝子ファミリーに属するLMI2、MYB16、及びMYB106転写制御因子並びにそのホモログからなる群より選択される少なくとも一つの転写制御因子」と表現することができ、ここでいう「LMI2、MYB16、及びMYB106転写制御因子並びにホモログ」には、前記アライン可能領域が保存されたシロイヌナズナ又は他の植物ゲノム中の相同遺伝子、又は一部に変異が導入された遺伝子と共に、「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」とアミノ酸レベルで少なくとも60％、好ましくは70％、80％、より好ましくは90％、の同一性を有する類似遺伝子が含まれる。
（２）本発明における種皮にクチクラを高蓄積させて劣化を抑えた種子の作成方法
　本発明の種皮に増加したクチクラを含有する種子の生産方法は、「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を種皮で特異的に高発現させる工程を含み、当該工程によりクチクラを種皮で高蓄積する植物を得ることができる。
　本発明の種皮で増加したクチクラを含有する種子の生産方法において、機能強化の対象である「LMI2遺伝子」によりコードされる転写制御因子というとき、「LMI2遺伝子」の全長は必要でなく、アライン可能領域が保存されていれば良く、また、上述のように他の植物由来のホモログ遺伝子であっても良い。「LMI2遺伝子」のアミノ酸配列又は塩基配列を用いて表現すれば、例えば、下記(ア)～(オ)のように記載することができる；
（ア）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（イ)配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（ウ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、クチクラの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（エ）配列番号１０に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（オ）配列番号１０に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、クチクラの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
　同様に、「MYB16遺伝子」によりコードされる転写制御因子を「MYB16遺伝子」のアミノ酸配列又は塩基配列を用いて表現すれば、例えば、下記(カ)～(コ)のように記載することができる；
（カ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（キ)配列番号１２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（ク）配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、クチクラの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（ケ）配列番号１３に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（コ）配列番号１３に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、クチクラの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
　同様に、「MYB106遺伝子」によりコードされる転写制御因子を「MYB106遺伝子」のアミノ酸配列又は塩基配列を用いて表現すれば、例えば、下記(サ)～(ソ)のように記載することができる；
（サ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（シ)配列番号１４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（ス）配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、クチクラの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（セ）配列番号１５に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ソ）配列番号１５に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、クチクラの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
　ここで、「アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加」しているとは、当該アミノ酸配列中のアミノ酸が、そのポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく改変していることを指す。また、「数個」とは、2～160個,2～100個,2～50個，好ましくは2～20個、より好ましくは2～10個の変異が存在することを指す。また、配列番号１に示されるアミノ酸において「数個」のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたというとき、例えば、2～119個、2～89個、好ましくは2～59個、より好ましくは2～29個の変異が存在することをいう。また、配列番号１２に示されるアミノ酸において「数個」のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたというとき、例えば、2～130個、2～97個、好ましくは2～65個、より好ましくは2～32個の変異が存在することをいう。また、配列番号１４に示されるアミノ酸において「数個」のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたというとき、例えば、2～155個、2～116個、好ましくは2～77個、より好ましくは2～38個の変異が存在することをいう。また、配列番号２に示されるアミノ酸において「数個」のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたというとき、例えば、2～31個、2～15個、好ましくは2～7個、より好ましくは2または3個の変異が存在することをいう。
　また、上述のように、機能強化の対象となる転写制御因子としては、「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有し、かつ、クチクラの形成を制御する活性を有する転写制御因子も含まれる。また、同一の機能を保持している限り、「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有する転写制御因子は、そのフラグメントであってもよい。「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列に対する同一性は、少なくとも60％、70％、80％であることが好ましい。
　また、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い核酸、すなわち配列番号２又は配列番号４に示す塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNAの相補鎖がハイブリダイズし、それより同一性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。このようなストリンジェントな条件については、T.Maniatisら編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratoryなどに記載の通常のハイブリダイゼーション操作におけるTm値を高めた条件として当業者には自明である。例えば、0.5％SDS、5×デンハルツ［Denhardt’s,0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400］及び100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)中で、50℃で4時間～一晩保温を行う条件などである。
（３）本発明の対象となる植物
　本発明の対象となる植物としては、イモ類、豆類、ナス科類などの双子葉植物一般に適用できるが、特に種子作物保存の観点からは、大豆、小豆などの豆類、菜種、綿実、ヒマワリなどの油糧作物、が好ましい。ただし、本発明は、これらの植物に限定されるものではなく、イネ、小麦、大麦などの単子葉穀類の育種一般にも適用できる。
　本発明によれば、例えば、上記に列挙するような植物について、増加したクチクラを種皮に含有する植物を得ることができる。また、本明細書において、「植物の子孫」というとき、当該植物の有性生殖又は無性生殖により得られる子孫をいい、当該植物のクローンを含む。例えば、当該植物体やその子孫から繁殖材料(例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等)を得て、それらを基に当該植物の子孫を作出することが可能である。また、本明細書において、「植物若しくはその子孫、又はそれらの一部」というときは、特別な場合を除き、当該植物又はその子孫の植物における、種子(発芽種子、未熟種子を含む)、器官又はその部分(葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片を含む)、植物培養細胞、カルス、プロトプラストを含む。
　また、本明細書において、「クチクラの形成を制御する活性」とは、「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」によりコードされる転写制御因子が本来的に備えているクチクラの生合成に関係する遺伝子の転写制御活性をいう。本明細書においては、とりわけ、当該転写制御因子又はそのホモログや変異体において、その機能を強化した際に、植物体内においてクチクラの合成が増す場合、当該転写制御因子若しくはそのホモログ、又はそれらの変異体は、クチクラの合成を制御する活性を有しているということができる。また、当該転写制御因子が本来的に備えている転写の制御活性は、当該転写制御因子の機能と同義で使用される。
（４）本発明の転写制御因子の機能を強化する方法
　本発明では、転写制御因子の機能を強化する手法といっても、単に植物体内における目的の転写因子の遺伝子又はタンパク質の発現を増強すればよいわけではなく、植物生体内の生育機能、又特に種子内の本来の機能を損なわずに種皮特異的にクチクラの蓄積を増大させる必要がある。
　本発明におけるLMI2遺伝子などの転写制御因子の機能を強化する手法の１つとして、当該転写制御因子をコードする遺伝子に対し、転写活性化ドメインをコードする遺伝子を付加することが有効である。本実施例ではヘルペスウイルス由来の「転写活性化ドメイン」である「VP16（配列番号５）」を利用したが、これに限定されない。他に、酵母由来のGAL4タンパク質の転写活性化ドメインなどが同様に用いられる。
（５）種皮特異的にクチクラを高蓄積できるプロモータの利用
　本発明において、LMI2遺伝子などの発現を促し、かつ種皮特異的にクチクラを高蓄積できるプロモータとしては、種皮におけるLMI2遺伝子の適度な発現を促して、種子の発達を妨げないことが重要である。
　本実施例で用いたCYP77A6プロモータ（配列番号１６）は、シロイヌナズナのクチクラ合成経路中のCYP77A6酵素遺伝子のプロモータであり、CYP77A6酵素はクチクラを産生する組織のうち主に発達中の花器官で発現するが、種子内では種皮のみで発現しており、また発現時期がLMI2遺伝子と似ていることから、種皮におけるLMI2遺伝子の適度な発現が可能となり、種皮への高蓄積が達成できたと考えられる。
　このことから、本発明の種皮特異的にクチクラを高蓄積させるためのプロモータとしては、CYP77A6プロモータ（配列番号１６）もしくはそのオルソログ遺伝子のプロモータの他、クチクラ生合成経路中の酵素遺伝子由来プロモータ及びLMI2遺伝子自身のプロモータ（配列番号１７）又はそのホモログ遺伝子由来プロモータも同様に用いることができる。
　なお、以下では、本発明の一実施の形態である転写活性化ドメインを付加する手法を用いた「LMI2遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化する方法を、一例として具体的に説明する。しかしながら、本発明は、下記で説明する手法に限られず、「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」又はそのホモログ(オルソログ及びパラログを含む)によりコードされる転写制御因子の機能を強化できる方法であれば上記に挙げたものを含めて採用することができる。
　本発明の一実施の形態である転写活性化ドメインを付加する手法を用いた形質転換植物の作出方法では、シロイヌナズナ由来の「LMI2遺伝子」によりコードされる転写制御因子に「転写活性化ドメイン」が付加されたポリペプチドをコードする核酸を使用することができる。転写活性化ドメインとして用いられるポリペプチドとしてはVP16(配列番号５)が好ましく用いられている。
　本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「LMI2遺伝子」の機能を強化する場合、クチクラ増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ａ）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号１０に示される第一の塩基配列と配列番号１１に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１０及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　なお、本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「MYB16遺伝子」の機能を強化する場合、クチクラ増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ｆ）配列番号１２に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ）前記(ｆ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｈ）前記(ｆ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１２及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ）配列番号１３に示される第一の塩基配列と配列番号１１に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｊ）前記(ｉ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１３及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　なお、本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「MYB106遺伝子」の機能を強化する場合、クチクラ増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ｋ）配列番号１４に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｌ）前記(ｋ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｍ）前記(ｋ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１４及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｎ）配列番号１５に示される第一の塩基配列と配列番号１１に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｏ）前記(ｎ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１５及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　ここで、「配列番号１に示される第一のアミノ酸配列」又は「配列番号１２に示される第一のアミノ酸配列」又は「配列番号１４に示される第一のアミノ酸配列」とは、「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列であって、第二のアミノ酸配列とインフレームに連結するためにそのＣ末端側の一部を欠いていてもよいアミノ酸配列である。本発明に使用される「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列」としては、配列番号１又は配列番号１２又は配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド以外に、下記(ｉ)又は(ｉｉ)のいずれかであって、かつ、「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を有するポリペプチドも含まれる；（ｉ）当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したもの、又は、（ｉｉ）当該アミノ酸配列であって、少なくとも60％、より好ましくは、70％、80％、さらに好ましくは、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列。本発明の一実施の形態である転写活性化ドメインを付加する手法を用いた植物の作出方法において、「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を有するポリペプチドという場合、好ましくは、当該転写制御因子のDNA結合能を有するポリペプチドである。すなわち、当該転写制御因子のDNA結合領域を含むポリペプチドであれば、当該転写制御因子の断片のアミノ酸配列も、本発明に使用される「LMI2遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列に含まれる。
　また、「配列番号２に示される第二のアミノ酸配列」とは、「LMI2遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化するために付加される「転写活性化ドメイン」である。本発明に使用される「転写活性化ドメイン」としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド以外に、下記(ｉ)又は(ｉｉ)のいずれかであって、かつ、第一のアミノ酸配列によりコードされる転写制御因子の機能を強化可能なポリペプチドも含まれる；（ｉ）当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したもの、又は、（ｉｉ）当該アミノ酸配列であって、少なくとも80％以上、より好ましくは、90％以上、さらに好ましくは95％の同一性を有するアミノ酸配列。
　すなわち、上記(ｃ)には、下記の一形態が含まれる：
（ｃ－１）前記(ａ)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ｃ－２）前記(ａ)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
　かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　また、上記(ｈ)には、下記の一形態が含まれる：
（ｈ－１）前記(ｆ)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ｈ―２）前記(ｆ)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
　かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　また、上記(ｍ)には、下記の一形態が含まれる：
（ｍ－１）前記(ｋ)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ｍ―２）前記(ｋ)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
　かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
　また、「第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する」というとき、第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列において、（１）第一のアミノ酸配列の部分が１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する場合、（２）第二のアミノ酸配列の部分が１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する場合、及び、（３）第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列全体において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する場合、を含む。
　また、「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１０及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というとき、第一の塩基配列及び第二の塩基配列とが連結した塩基配列において、（４）第一の塩基配列の部分が、配列番号１０に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である場合、（５）第二の塩基配列の部分が、配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である場合、及び、（６）第一の塩基配列及び第二の塩基配列とが連結した塩基配列全体が、配列番号１０に示される塩基配列と配列番号１１に示される塩基配列とが連結した塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である場合、を含む。なお、「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１３及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というとき、及び「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１５及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というときも同様に上記(４)～(６)の場合を含む。
　また、「第一のアミノ酸配列」と「第二のアミノ酸配列」、又は「第一の塩基配列」と「第二の塩基配列」は、それぞれ、「ポリペプチドリンカー」又は「ポリヌクレオチドリンカー」を介して連結されていてもよい。なお、当該リンカーの使用は必須ではなく、必要に応じて適宜設計・使用することができる。当該リンカーのアミノ酸配列又は塩基配列は、当該転写制御因子の機能を強化可能なポリペプチドを産生できる限りにおいて特に限定されず、例えば、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドリンカー又は配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドリンカーを好適に使用することができる。また、リンカーには、ベクターへの当該転写制御因子のゲートウェイクローニングの結果によって生じた配列を含ませることもできる。例えば、ゲートウェイLR反応によって生じたattＢ配列などを含ませることができる。従って、リンカーは上記の配列に限定されず、使用するベクターの種類等により、当業者であれば適宜好ましいリンカーを設計可能である。
　なお、第一のアミノ酸配列又は塩基配列と、第二のアミノ酸配列又は塩基配列との配置の順序は、どちらがＮ末側又は５’側に配置されてもよい。好ましくは、Ｎ末側又は５’側より、（１）第一のアミノ酸配列又は塩基配列、（２）ポリペプチドリンカー又はポリヌクレオチドリンカー、（３）第二のアミノ酸配列又は塩基配列の順である。なお、(１)と(３)の位置を入れ替える際には、１つのポリペプチドとして翻訳されるように、適宜開始コドンや終止コドンの設計を行う。
　また、本明細書において、「発現カセット」とは、そのカセットに内包された核酸(主に、遺伝子又はその断片)を発現することのできる一つの発現系単位をいう。発現カセットは、前記核酸を含む領域の他に、遺伝子発現に必要な発現調節領域を有する。そのような発現調節領域には、例えば、プロモータ及びターミネータが含まれる。また、その他の構成として、エンハンサ、ポリＡ付加シグナル、5’-UTR(非翻訳領域)、標識若しくは選抜マーカー遺伝子、マルチクローニング部位、複製開始点等を含むことができる。発現カセットには、特定の遺伝子等を発現させる上で必要な一つの発現系単位をゲノム上からそのまま取り出したものや、様々な生物由来の発現調節領域等を組み合わせる等して人工的に構築したものが存在する。本発明においては、いずれの発現カセットも利用することが可能である。また、上述する発現調節領域の構成については、本明細書中に記載のない限り、当該分野において公知の構成を適宜選択することが可能である。
　本明細書において「発現カセット」は、目的とする植物内の「LMI2遺伝子」によりコードされる転写制御因子の活性を強化する効果を提供し、その植物においてクチクラの蓄積量を増加させる機能を有する。
（２－２）クチクラの蓄積が種皮で増強された植物の作出方法
　上述のように、本発明で用いられる導入遺伝子を発現させるためのプロモータは、「種皮においてLMI2遺伝子発現を誘導するプロモータ」であり、「種皮特異的にクチクラを高蓄積できるプロモータ」は、CYP77A6プロモータもしくはそのオルソログ遺伝子のプロモータである（以下、単に「CYP77A6プロモータ」という。）。
　導入遺伝子を「CYP77A6プロモータ」の下流に配置したコンストラクト(組換えベクター)を常法に従って構築し、野生株に形質転換して作製する。
　本明細書において「ベクター」とは上記発現カセットを含むものであって、上記発現カセットに含まれる塩基配列からなる核酸の増殖に使用される大腸菌等へ導入されるベクターや、植物の形質転換を行うためのベクターを含む。本発明に使用されるベクターとしては、当該分野において公知のベクターを使用でき、導入する植物やベクターの使用する手法・目的に応じて適宜選択すればよい。ベクターとしては、例えば、下記実施例にて使用されるR4pGWB5_VP16_HSPなどを使用することができるが、これに限定されない。他に、pDEST_VP16_HSP_GWB5を用いることができる。
　本発明は、一つの態様として、増加したクチクラを含有する植物を生産するためのキットを提供する。当該キットの具体例としては、「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化するために使用されるベクターを挙げることができる。このようなベクターを含むキットとしては、種皮で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、上記(ａ)～(ｃ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを少なくとも含んでいればよく、当該ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。当該試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材が添付されていてもよい。
　遺伝子又は組換えベクターを植物中に導入する方法としては、アグロバクテリウム法が典型的であるが、PEG-リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等、従来周知の方法が適用できる。
（３）「LMI2遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能が強化された植物の形質的特徴の評価
（３－１）クチクラ蓄積量の評価
　「LMI2遺伝子」又は「MYB16遺伝子」又は「MYB106遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能が強化された植物においては、下記の実施例で示すように、種皮のクチクラ蓄積量が増加する。増加したクチクラを評価するには、例えば、走査型電子顕微鏡を用いて種皮断面を観察することにより表面に存在する脂質層の厚さで評価することができる。
　走査型電子顕微鏡は、反射電子を検出する場合、組成の違いでコントラストがつく。脂質は明るく写るため、他の細胞構造と区別することができ、これによりクチクラの厚さを調べることができる。
　下記の実施例により得られたLMI2-VP16シロイヌナズナの種子をカミソリで切断し断面を走査型電子顕微鏡で観察すると、種皮の表面に野生株より厚い脂質層が観察された（図３）。
　このように、本発明により得られる、クチクラの蓄積量が増加した植物は、好ましい実施形態において、野生株と比較した際に、増加したクチクラを含有する。
（３－２）種子保存性向上の評価
　「LMI2遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能が強化された植物においては、クチクラが高蓄積する。クチクラの高蓄積に伴い種子の保存性が向上しているかどうかは劣化処理後の発芽率を調べることで推定することができる。劣化処理の方法は人為的に劣化を促進させる方法と自然に劣化を待つ方法がある。人為的に劣化を促進させる方法では、高温高湿条件を用いることにより種子を長期保存した際の劣化を再現することができる。
　LMI2-VP16シロイヌナズナと野生株の種子を収穫後収穫後一週間以上低温室（相対湿度6～12%、7～10℃）に保管して水分含量を安定させた後、相対湿度100％、40℃で3日間劣化処理を行った。続いて、相対湿度10～30％、室温で3日間乾燥後、低温室に2日以上置いた。劣化させないコントロール種子は低温室で保管した。以上の処理を行った種子をPPMで殺菌すると同時に4℃で4日間吸水後、寒天培地に播種した。継時的に発芽率を調べたところ、LMI2-VP16シロイヌナズナは野生株と比較して発芽が早く、発芽率が上昇していた（図４）。
　室温、常湿で6ヶ月間保存したLMI2-VP16シロイヌナズナと野生株の種子の発芽率を調べ、収穫後すぐに播種した場合の発芽率と比較した。収穫後すぐの発芽率を100%とした場合、6ヶ月経過後の野生株の発芽率は70％程度に低下したのに対し、LMI2-VP16シロイヌナズナ種子の発芽率はほとんど低下しなかった (図４)。
　このことから、本発明により得られる、クチクラの蓄積量が増加した植物では種子の劣化が抑えられていたことがわかった。
２．その他
　本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning： A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., DNA Cloning, 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995)などに記載の方法により、又はそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種タンパク質やペプチド、あるいはそれらをコードするDNAについては、既存のデータベース(URL：http：//www.arabidopsis.org/又はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed等)から入手することができる。
　なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
　以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）ProCYP77A6：LMI2-VP16で形質転換したシロイヌナズナ植物体の作成
（１－１）形質転換ベクターProCYP77A6：LMI2-VP16の構築
　以下のように形質転換ベクターを構築した。
　終止コドンを除いたシロイヌナズナ由来のLMI2タンパク質コード領域を下記のオリゴヌクレオチドペアをプライマーとしたPCRで増幅し、ゲートウェイドナーベクターpDONR207ベクター(インビトロジェン社)に、BPクロナーゼによってクローニングした。
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGGGAAGAACACCTTGTTGTGACAAGAT-3’(LMI2、配列番号５)
5’- ggggaccactttgtacaagaaagctgggttGAATTTGGAAACCATGGAAACAAGACCAAT -3’(LMI2、配列番号６)
　シロイヌナズナ由来のCYP77A6プロモータを下記のオリゴヌクレオチドペアをプライマーとしたPCRで増幅し、非特許文献１０に記載のゲートウェイドナーベクターpDONRG_P4P1RにBPクロナーゼによりクローニングした。
5’- GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTTATCTTCCCGGAATTAGTGAAGACCC - 3’(LMI2、配列番号７)
5’- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGGCATTTTTAGCTTCTTGTTTTTCTTCTT - 3’ (LMI2、配列番号８) 
つぎにR4pGWB5_VP16_HSPベクター(配列番号９)にLRクロナーゼによって上記CYP77A6プロモータとLMI2遺伝子のタンパク質コード領域を連結すると同時に移し変えることによって、形質転換に使用したベクターを構築した。
　なお、R4pGWB5_VP16_HSPベクターには、CYP77A6プロモータの下流に、LMI2遺伝子のタンパク質コード領域とVP16転写活性化ドメインをコードする塩基配列とがポリヌクレオチドリンカーを介して連結された状態で配置されている。これにより、当該ベクターを用いて形質転換された植物の種皮では、配列番号８(LMI2-VP16)に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが発現される。
（１－２）フローラルディップ法を用いたProCYP77A6：LMI2-VP16によるシロイヌナズナの形質転換
　上記実施例(１－１)で得られたプラスミドを、土壌細菌(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1 Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Schell 1986))株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を200mlの抗生物質(スぺクチノマイシン(Spe)50mg/L、ゲンタマイシン(Gm)25mg/L及びリファンピシリン(Rif)50mg/L)を含むLB培地で2日間培養した。
　次いで、培養液から菌体を回収し、500mlの浸潤培地(Infiltration medium；特許文献１を参照)に懸濁した。形質転換させる植物体として、シロイヌナズナColumbia-0を45日間～60日間育てて花を咲かせ、主茎を切った後にさらに10日間育て形質転換に用いた。形質転換は、当該シロイヌナズナを菌体を懸濁させた浸潤培地に2分間浸して感染させ、通常通り育成しT1種子を収穫した。そののち、T1種子を50％ブリーチ、0.02％Triton X-100溶液で7分間滅菌した後、滅菌水で3回リンスし、30mg/lのハイグロマイシン(Hg)を含むMS選択培地に播種した。
　上記ハイグロマイシンプレートで生育する形質転換植物体(ProCYP77A6：LMI2-VP16, T1)を選抜し、土壌に植え換えて生育し、種子を採取して播種し、次世代(T2)のシロイヌナズナ植物を得た。続いて、上記ハイグロマイシンプレートで生育する形質転換体(ProCYP77A6：LMI2-VP16, T2)を選抜し、土壌に植え換えて生育し、種子を採取して播種し、次世代(T3)のシロイヌナズナ植物を得た。
（実施例２）ProCYP77A6：LMI2-VP16シロイヌナズナ植物の種子の断面観察
　上記実施例(１－２)で得られたProCYP77A6：LMI2-VP16シロイヌナズナT2種子をカミソリで種皮に対して直角に切断し、走査型電子顕微鏡で観察した。その結果、ProCYP77A6:LMI2-VP16株では野生株と比較して種皮表層にクチクラが厚く蓄積していた（図３）。
（実施例３）ProCYP77A6：LMI2-VP16シロイヌナズナ植物の種子の劣化試験
（３－１）人為的な劣化
　上記実施例(１－２)で得られたProCYP77A6：LMI2-VP16シロイヌナズナT3種子を収穫後収穫後一週間以上低温室（相対湿度6～12%、7～10℃）に置いて水分含量を安定させた後、相対湿度100％、40℃で3日間劣化処理を行った。相対湿度10～30％、室温で3日間乾燥後、低温室に2日以上置いた。劣化させないコントロール種子は低温室で保管した。以上の処理を行った種子を1/50希釈PPM, 0.005％ Triton X-100溶液に浸漬して殺菌すると同時に4℃で4日間吸水後、MS寒天培地に播種した。継時的に発芽率を調べたところ、LMI2-VP16シロイヌナズナは野生株と比較して発芽が早く、発芽率が上昇していた（図４Ａ）。この結果からProCYP77A6:LMI2-VP16シロイヌナズナは野生株に比べて種子の劣化が抑えられており、種子の長期保存に有利であると考えられた。
（３－２）自然な劣化
　　上記実施例(１－２)で得られたProCYP77A6：LMI2-VP16シロイヌナズナT2種子を室温、常湿で6ヶ月間保存し、T3種子を収穫後すぐに用いた。これらの種子を1/50希釈PPM, 0.005％ Triton X-100溶液に浸漬して殺菌すると同時に4℃で4日間吸水後、MS寒天培地に播種した。継時的に発芽率を調べたところ、収穫後すぐの発芽率を100%とした場合、6ヶ月経過後の野生株の発芽率は低下したのに対し、LMI2-VP16シロイヌナズナ種子の発芽率はほとんど低下しなかった （図４Ｂ）。
　この結果からProCYP77A6:LMI2-VP16シロイヌナズナは野生株に比べて常温常湿下での種子の劣化が抑えられており、簡易な環境条件での種子の保存に有利であると考えられた。

Claims (14)

  1. 　種皮で特異的にクチクラを蓄積する種子を産生する植物の生産方法であって、
    対象植物を、MYB転写制御因子遺伝子ファミリーに属するLMI2、MYB16、及びMYB106転写制御因子並びにそのホモログからなる群より選択される少なくとも一つの転写制御因子をコードする遺伝子を用いて形質転換することを特徴とする、植物の生産方法。
  2. 　転写制御因子をコードする遺伝子が、転写活性化ドメインをコードする遺伝子と融合されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 　転写活性化ドメインをコードする遺伝子がヘルペスウイルス由来VP16遺伝子である、請求項２に記載の方法。
  4. 　転写制御因子をコードする遺伝子が、形質転換された植物において、当該遺伝子自身のプロモータ又はクチクラ生合成遺伝子由来プロモータの制御下で発現することを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　クチクラ生合成遺伝子由来プロモータが、CYP77A6プロモータ又はそのオルソログ遺伝子のプロモータである請求項４に記載の方法。
  6. 　転写制御因子が、下記(ア)～(オ)のいずれかに示される転写制御因子である、請求項１～５のいずれかに記載の方法；
    (ア)配列番号１又は１２又は１４に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
    (イ)配列番号１又は１２又は１４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、クチクラの形成を制御する活性を有する転写制御因子、
    (ウ)配列番号１又は１２又は１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写制御因子であって、かつ、クチクラの形成を制御する活性を有する転写制御因子
    (エ)配列番号１０又は１３又は１５に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
    (オ)配列番号１０又は１３又は１５に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、クチクラの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
  7. 　対象植物の形質転換方法が、種皮で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)～(ｏ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを用いることを特徴とする、請求項１～６のいずれかに記載の方法；
    （ａ）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
    （ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｃ）前記(ａ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｄ）配列番号１０に示される第一の塩基配列と配列番号１１に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
    （ｅ）前記(ｄ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１０及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｆ）配列番号１２に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
    （ｇ）前記(ｆ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｈ）前記(ｆ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１２及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｉ）配列番号１３に示される第一の塩基配列と配列番号１１に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
    （ｊ）前記(ｉ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１３及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｋ）配列番号１４に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
    （ｌ）前記(ｋ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｍ）前記(ｋ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１４及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｎ）配列番号１３に示される第一の塩基配列と配列番号１１に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
    （ｏ）前記(ｎ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１３及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
  8. 　種皮で特異的にクチクラを蓄積する種子を産生する植物を生産するための発現カセットであって、種皮で遺伝子発現を誘導するプロモータの制御下にMYB転写制御因子遺伝子ファミリーに属するLMI2、MYB16、及びMYB106転写制御因子並びにそのホモログからなる群より選択される少なくとも一つの転写制御因子をコードする遺伝子を含む、発現カセット。
  9. 　転写制御因子をコードする遺伝子が、転写活性化ドメインをコードする遺伝子と融合されていることを特徴とする請求項８に記載の発現カセット。
  10. 　種皮で遺伝子発現を誘導するプロモータが、前記転写制御因子遺伝子由来のプロモータ又はクチクラ生合成遺伝子由来プロモータの制御下で発現することを特徴とする、請求項８又は９に記載の発現カセット。
  11. 　クチクラ生合成遺伝子由来プロモータが、CYP77A6プロモータ又はそのオルソログ遺伝子のプロモータである請求項１０に記載の発現カセット。
  12. 　発現カセットが、種皮で遺伝子発現を誘導するプロモータの制御下に、以下の(ａ)～(ｏ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットである、請求項８～１１のいずれかに記載の発現カセット；
    （ａ）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
    （ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｃ）前記(ａ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｄ）配列番号２に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
    （ｅ）前記(ｄ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１０及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｆ）配列番号１２に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
    （ｇ）前記(ｆ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｈ）前記(ｆ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１２及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｉ）配列番号１３に示される第一の塩基配列と配列番号１１に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
    （ｊ）前記(ｉ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１３及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｋ）配列番号１４に示される第一のアミノ酸配列と配列番号２に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
    （ｌ）前記(ｋ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｍ）前記(ｋ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１４及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
    （ｎ）配列番号１３に示される第一の塩基配列と配列番号１１に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
    （ｏ）前記(ｎ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号１３及び／又は配列番号１１に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、クチクラの蓄積量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
  13. 　請求項８～１２のいずれかに記載の発現カセットを含むベクター。
  14. 　請求項１３に記載のベクターを含むキット。

     
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