WO2017131504A1 - Cepas fúngicas, cultivo y uso como saprófitos y/o simbiontes para cultivo de vegetales in vitro - Google Patents

Cepas fúngicas, cultivo y uso como saprófitos y/o simbiontes para cultivo de vegetales in vitro Download PDF

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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01NPRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01HNEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H17/00Symbiotic or parasitic combinations including one or more new plants, e.g. mycorrhiza

Definitions

  • the difficulty in establishing an in vitro culture is to keep the conditions free of any microorganism within the culture environment (container and nutrient medium).
  • saprophytic or saprophytic microorganisms have been used to induce secondary metabolism, increase the production of constitutive or inducible compounds (Barz ei al, 2007), which through saprotrophy, condition of these microorganisms, which for their nutrition digest the residues from other organisms, such as dead leaves, corpses or excrement, with extracellular and external digestion (Thomma 2003).
  • forced saprotrophs can be distinguished, that is, those who have no other way of collecting nutrients, and facultative saprotrophs, those who, for most of their lives, use another means of nutrition and are only saprotrophs during a phase by environmental conditions (Bidartondo, 2005).
  • sensu lato symbiosis is any biological interaction between species, positively or negatively among them, such as mutualism, commensalism and parasitism (Doug ⁇ as, 2010).
  • mutualism this is where the relationship between two species is beneficial to both but not indispensable; and symbiosis is strictly when it is indispensable and obligatory for survival.
  • Cladosporium which constitute common indoor and outdoor molds. These species produce mycelium with color differences between olive green, gray and black; they have dark conidia of simple or branched chain. Cladosporium bifas and spores are found in living or dead plants. Some species are pathogenic, others parasitize other fungi, and their spores are very abundant in open environments, in humid interiors their development is easy. It is worth noting a pathogen: Cladosporium fulvum, which causes leaf mold in the tomato, which has become a genetic resistance model (Schoch et al. 2006).
  • the invention is in the microbial and biotechnological field that refers to a new competition of strains of obligate saprophytic fungi (Cladosporium sp.) Under in vitro conditions, which can be used as symbionts or probiotics because it feeds on crop wastes and their It also generates a contradictory environment that is innocuous and without infection, and with availability of nutrients for the plant under these artificial conditions. Additionally, the plant can initiate the process of adaptation to conditions in vivo, due to the constitutive or inducible activity of the secondary metabolism and the adaptation and defense mechanisms, because it is not infected by the mycelium of the fungus, and can remain up to 6 months without subculture, where no damage, wilt or infection is observed.
  • Figure It represents the isolated fungal strain (CF) from a saprophyte fungus bound and capable of being used as inoculum in the in vitro culture of vegetables.
  • Figure 1 b It represents the container with the inoculum of the fungal strain (CF) without infecting the plant in vitro (V).
  • Figure ic It represents the mycelium with the hyphae (H) and spores (E) characteristic of an obligate saprophyte species.
  • Table 1 Example of results obtained in vegetables treated for 6 months with mycelium of saprophytic strains and / or symbionts in the same container.

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Abstract

Un nuevo invento biotecnológico que incluye la actividad constitutiva o inducible del micelios de hongos saprófitos obligados del genero Cladosporium sp. y/o como simbiontes de vegetales bajo condiciones in vitro; su inoculación porque no infectan los vegetales vivos bajo dichas condiciones, ya que genera y mantiene un entorno nutritivo para el vegetal sin competir. Adicionalmente el vegetal inicia el proceso de adaptación a condiciones in vivo, promoviendo el metabolismo secundario y/o las competencias constitutivas y/o inducibles para su adaptación y/o defensa, lo cual se demuestra porque no es infectado por el micelio del hongo, bajo tal proceso puede permanecer hasta 6 meses en el mismo contenedor/ambiente sin mostrar ningún tipo de daño, marchitez o infección.

Description

CEPAS FÚNGICAS, CULTIVO Y USO COMO SAPROFITOS Y/O SIMBIONTES PARA CULTIVO DE VEGETALES IN VITRO.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Convencionalmente, la dificultad para establecer un cultivo in vitro es mantener las condiciones libres de cualquier microorganismo dentro del ambiente de cultivo (contenedor y medio nutritivo). No obstante, se han utilizado microorganismos saprofitos o saprótrofos para inducir el metabolismo secundario, incrementar la producción de compuestos constitutivos o inducibles (Barz ei al, 2007), que mediante la saprotroíia, condición de estos microorganismos, los cuales para su nutrición digieren los residuos procedentes de otros organismos, tales como hojas muertas, cadáveres o excrementos, con una digestión extracelular y externa (Thomma 2003). También se puede llamar al fenómeno saprobiosis y a los organismos que lo representan, saprobios (generalmente usado como adjetivo) o saprohioníes. Contribuyen a la descomposición de la materia orgánica y mantienen la fertilidad del suelo. Entre los saprótrofos pueden distinguirse los saprótrofos obligados, es decir, aquellos que no tienen otra manera de recabar nutrientes, y los saprótrofos facultativos, aquellos que durante la mayor parte de su vida emplean otro medio de nutrición y sóío son saprótrofos durante una fase por las condiciones ambientales (Bidartondo, 2005).
Por otra parte cabe señalar las características de las relaciones simbióticas, deben ser especies diferentes y viven en contacto físico, como es la unión de algas y hongos para generar un liquen; también el caso de las leguminosas y las bacterias fijadoras de nitrógeno, que son esenciales para su crecimiento; también las especies arbóreas que requieren de micorrizas, como los robles que penetran sus raíces, y se prueba cuando generan el cuerpo fructífero y se observan como setas u hongos macroscópicos. El ser humano no es la excepción por la implicación que tiene la bioflora en la digestión, inmunidad, etc.. Por lo anterior, el concepto no se aplica a un rasgo de interacción infra específica. Por ejemplo, la simbiosis sensu lato es cualquier interacción biológica entre especies, positiva o negativamente entre ellas, como el mutualismo, comensalismo y parasitismo (Dougías, 2010). sin embargo, el más aceptado por sus implicaciones ecológicas, fisiológicas y evolutivas está en la publicación de Martin y Schwab (2013): el mutualismo: es donde la relación entre dos especies es benéfica para ambas pero no es indispensable; y la simbiosis estrictamente es cuando si es indispensable y obligada para la sobrevivencia. De modo similar, se puede distinguir entre simbiosis de transmisión vertical, en la que existe una transferencia directa de la "infección" desde los organismos anfitriones a su progenie (Yamamura 1993), y simbiosis de transmisión horizontal, en la que el simbionte es adquirido del medio ambiente en cada generación (Bright y Bulgheresi, 2010).
Por lo cual cabe mencionar al género Cladosporium, el cual lo constituyen mohos comunes de interiores y exteriores. Estas especies producen micelio con diferencias de color entre verde oliva, gris y negro; tienen conidios obscuros de cadena simple o ramificada. Las bifas y esporas de Cladosporium se encuentran en plantas vivas o muertas. Algunas especies son patógenas, otras parasitan otros hongos, y sus esporas son muy abundantes en ambientes abiertos, en interiores húmedos es fácil su desarrollo. Cabe señalar un patógeno: Cladosporium fulvum, que causa en el jitomate el moho de la hoja, que se ha convertido en un modelo genético de resistencia (Schoch et al. 2006). De acuerdo a los especialistas, hay cerca de 800 especies de Cladosporium patógenos y saprotróficos (Rivas y Thomas, 2005; Dugan et ai. 2004). Se dificulta su estudio por lo fragilidad de sus esporas, donde se observa generalmente al microscopio los conidios completos (Barron 1968). Este género generalmente no infecta la humano, sin embargo puede causar infecciones en la piel, uñas, and pulmones. Las esporas afectan a los asmáticos o personas con problemas respiratorios, también se sabe que no son importantes desde el punto de vista de producción de micotoxinas, pero produce compuestos volátiles asociado a malos olores (Deshmukh y Rai, 2005).
Por lo tanto, las interacciones entre organismos son parte de la evolución, por lo tanto es un proceso en el que los simbiontes deben mejorar su interacción. Lo cual depende de las características de la simbiosis y de los simbiontes que la integran, esta relación podría alcanzar su máximo grado de integración: la simbiogénesis. Por esta razón esta innovación de cultivo de vegetales bajo condiciones in vitro con un saprofito obligado, esta relación no es mutual! sta, a los dos beneficia desde el punto de vista ecológico, fisiológico y evolutivo; la adaptación a nuevas condiciones sin competencia en un espacio mínimo. Este proceso generará deshechos con facilidad de uso para compostas, sin embargo las condiciones de bioseguridad deberán mantenerse debido a las condiciones obvias donde se puede dar la contaminación por cepas o especies patógenas o parásitas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención es en el campo microbiano y biotecnológico que refiere una nueva competencia de cepas del hongos saprofitos obligados (Cladosporium sp.) bajo condiciones in vitro, las cuales se pueden usar como simbiontes o probióticos porque se alimenta de los deshechos de los cultivos y a su vez genera un ambiente contradictoriamente inocuo y sin infección, y con disponibilidad de nutrientes para el vegetal bajo estas condiciones artificiales. Adicionalmente, el vegetal puede iniciar el proceso de adaptación a condiciones in vivo, debido a la actividad constitutiva o inducible del metabolismo secundario y de los mecanismos de adaptación y defensa, porque no es infectado por el micelio del hongo, y puede permanecer hasta 6 meses sin subcultivo, donde no se observa ningún tipo de daño, marchitez o infección.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura la. Representa la cepa fúngica (CF) aislada proveniente de un hongo saprofito obligado y susceptible de usarse como inoculo en el cultivo in vitro de vegetales.
Figura 1 b. Representa el contenedor con el inoculo de la cepa fúngica (CF) sin infectar el vegetal in vitro (V).
Figura íc. Representa el micelio con las hifas (H) y esporas (E) características de una especies saprofita obligada.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La interacción entre ios organismos es un tema cada vez mas estudiado debido a la implicación que tiene a todos los niveles en la naturaleza, y por lo tanto en el ser humano como parte de la misma. Esta invención facilita la interacción entre dos especies que normalmente no están conviviendo en un microambieníe, y menos aitiflcial. De acuerdo a su habitat, los hongos microscópicos y los vegetales conviven desde hace millones de años, y gracias al saber hacer de la biotecnológico, se pudo generar una nueva competencia de cepas del hongos saprofitos obligados {Cladosporium sp.) bajo condiciones in vitro, las cuales se pueden usar como saprobiontes, simbiontes o probióticos porque se alimenta de los deshechos producidos por el metabolismo de los vegetales de cualquier clase (Angiospermas o Gimnospermas) presentes en el contenedor, tales como semillas previamente germinadas, brotes enraizados o plantas en endurecimiento para adaptarlas a condiciones in vivo; donde ei hongo mantiene un ambiente contradictoriamente inocuo para el vegeta! y sin infección, y con disponibilidad de nutrientes. De sabe que ia interacción natural activa el metabolismo secundario como mecanismo de adaptación y defensa, lo cual se pudo observar porque las condiciones fueron las de incubación convencional in vitro, fotoperiodo de 16 horas, temperatura entre 20-14° C; un medio de cultivo con los macroelementos, microelementos base de medios como MS, DCR: una solución de vitaminas de niacina, piridoxina, y tiamina; fuentes de carbono como sacarosa o fructosa; suplementado con fitohormoas exógenas como citocininas (BA, ΚΪΝ, 2ip) y/o auxinas (ANA, AI A). Este proceso prepara a! vegetal para su adaptación a condiciones in vivo, debido a la actividad constitutiva o inducible del metabolismo secundario y de los mecanismos de adaptación y defensa, porque no es infectado por el micelio del hongo (Cuadro 1), y puede permanecer hasta 6 meses o mas sin subcultivo, donde no se observó ningún tipo de daño, marchitez o infección, y el micelio mantuvo una tonalidad de color entre gris obscuro y negro durante todo el tiempo que se mantuvo ia interacción vegetal- hongo.
Cuadro 1. Ejemplo de resultados obtenidos en vegetales tratados durante 6 meses con micelios de las cepas saprofitas y/o simbiontes en el mismo contenedor.
! Tiempo Color de la cepa Resultado
1 mes gris obscuro Adaptación y crecimiento
3 meses gris obscuro Mantenimiento (vegetal vivo)
6 meses gris obscuro Mantenimiento (vegetal vivo) De acuerdo a esta descripción se pueden mantener dos organismos en condiciones no convencionales in vitro; sin infección por ser el hongo un saprofito obligado y el vegetal por mantener la actividad del metabolismo secundario constitutivo o inducido por las condiciones descritas.
Asimismo, esto proceso puede ser utilizado como una opción para no generar substancias contaminantes, tomando en consideración las medidas de bioseguridad convenientes y adecuadas. REFERENCIAS
Barran GL.1968. The genera of Hyphomycetes from soil. Baltimore, MD: Williams & Wilkins, Baltimore. Pp: 1 -364 ISBN 9780882750040
Barz W, Daniel S, Hinderer W, Jaques U, Kessman H, Koster J, Otto C y K. Tiemann.2007. Elicitation and Metabolism of Phytoalexins in Plant Cell Culture. Pharmaceutical & Medicinal Chemistry. Ciba Fundation Symposium 137. Appications of Plant Cell Culture: 178-198.
Bidartondo MI.2005. The Evolutionary Ecology of Myco-heterotrophy. New Phytologist.
167: 335-352.
Brighí M, y S Buigheresi.2010. A complex journey: transmission of microbiai symbionts. Nature Microhiology Reviews 8: 218-230.
Deshmukh SK. y MK Raí.2005. Biodiversity of fungi : their role in human Ufe. Enfíeld, NH: Science Publishers. p. 460. ISBN 1578083680. Dougias AE.2010. The symhiotic habit. New Jersey: Princeton University Press. ISBN 978- 0-691 -1 1341-8.
Dugan, FM, Schubert K, y U Braun-2004. Check-list of Cladosporium ñames. Schlechtendalia 11: 1-1 39.
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Rivas S. y CM Thomas.2005. Molecular interactions between tomato and the leaf mold pathogen: Cladosporium fulvum. Ann. Rev. Phytopathology 43: 395-436.
Schoch CL, Shoemaker RA, Seifert KA, Hambleton S, Spatafora JW, Crous PW.2006. "A multigene phylogeny of the Dothideomycetes using four nuclear loci". Mycologia 98 (6): S 041-1052.
Thomraa, BPHJ. 2003. Alternaria spp.; groni general saprohpyte lo specifíc parasite. Mol. Plant Pathol. 4; 225-236.
Yamamura N.1993. Vertical transmission and evolution of mutualism from parasitism. Theor. Pop. Bioí. 44: 95- 109.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un proceso de cultivo de vegetales in vitro con inoculo de capas fúngicas de especies saprofitas obligadas, saprobiontes o simbiontes para promover la actividad constitutiva o inducible del metabolismo secundario y/o de los mecanismos de adaptación y defensa.
2. Un proceso de cultivo de vegetales in vitro con inoculo de cepas fúngicas de acuerdo a la reivindicación 1 , donde los vegetales pueden ser especies de las clases Angiospermas y Gimnospermas, en estadios de plántula germinada, brote en proceso de enraizamiento y de plántula en endurecimiento para su adaptación in vivo.
3. Un proceso de cultivo de vegetales in vitro con inoculo de cepas fúngicas de especies saprofitas obligadas, saprobiontes o simbiontes de acuerdo a la reivindicación 1, donde las cepas fúngicas provienen de especies del género Cladosporium y/o de otras taxa con la misma actividad y/o competencia bajo condiciones in vitro, sin infectar el tejido vegetal vivo y así promover la actividad consitutiva o inducible del metabolismo secundario y/o de los mecanismos de adaptación y defensa, donde las bifas o micelio mantienen una tonalidad que varía entre el gris obscuro y el negro.
4. El uso de las cepas fúngicas de especies saprofitas obligadas en el cultivo in vitro de vegetales como saprofitos, saprobiontes y/o simbiontes sin infectar el tejido vegetal vivo para promover la actividad consitutiva o inducible del metabolismo secundario y/o de los mecanismos de adaptación y defensa, que puede variar desde 1 día hasta 365 días en el mismo contenedor, y el micelio del hongo permanece con una tonalidad que varía entre el gris obscuro y el negro.
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LEE, S. ET AL.: "Age matters: the effeets of volatile organic compounds emitted by Trichoderma atroviride on plant growth", ARCH MICROBIOL, vol. 197, no. 5, June 2015 (2015-06-01), pages 723 - 727, XP055402158 *
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ZTOCH, M. ET AL.: "Analysis of microbiologically stimulated biomass of Salix viminalis L. in the presence of Cd 2+ under in vitro conditions - implications for phytoremediation", ACTA BIOLÓGICA CRACOVIENSIA, SERIES BOTÁNICA, vol. 57, no. 2, 2015, pages 67 - 78, XP055402152 *

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