WO2017130756A1 - 小胞体ストレスを標的とする椎間板変性症に対する治療薬 - Google Patents

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intervertebral disc
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reticulum stress
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中村　雅也
守雄 松本
順之 藤田
藤井　武
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving intervertebral disc degeneration and diseases such as low back pain caused by the degeneration.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a compound targeting endoplasmic reticulum stress as an active ingredient.
  • the present invention relates to a method for screening a therapeutic agent for improving intervertebral disc degeneration and a disease caused by the degeneration.
  • the intervertebral disc that exists between the vertebrae is composed of a central nucleus pulposus and an outer annulus that surrounds the nucleus pulposus.
  • the nucleus pulposus is made of a gel-like substance containing a large amount of water.
  • a state in which the intervertebral disc has degenerated is called intervertebral disc degeneration.
  • Intervertebral disc degeneration is known to cause many degenerative spinal degeneration conditions such as low back pain, herniated disc, spinal stenosis, and spinal deformity (Non-patent Document 1). Intervertebral disc degeneration is considered to develop due to various factors such as aging, mechanical stress such as obesity and lifting heavy objects, lifestyle such as tobacco, genetics, and inflammatory cytokines.
  • Intervertebral disc degeneration is currently treated by surgical and symptomatic treatment when symptoms such as low back pain occur.
  • Symptomatic treatment is centered on drug treatment and physical therapy, and anti-pain drugs are mainly administered as drug treatment, and the basic treatment is aimed at alleviating symptoms. Further, when the stress is significant, an anxiolytic / antidepressant may be used in combination.
  • Treatment with anti-pain drugs cannot suppress the progression of intervertebral disc degeneration, and at present there is no drug therapy that can fundamentally treat low back pain or intervertebral disc degeneration itself that causes low back pain.
  • anti-pain drugs currently used, non-steroidal anti-inflammatory drugs have many side effects such as gastrointestinal disorders and kidney disorders.
  • analgesics frequently used in recent years have many side effects such as nausea, constipation, dizziness and sleepiness.
  • reducing the number of patients leading to surgical treatment is very significant from the viewpoint of medical economy, and there is a demand for a drug having an effect of preventing the progression of spinal degenerative diseases. To that end, it is important to elucidate the pathogenesis of intervertebral disc degeneration.
  • Non-Patent Document 2 when inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IL-1 ⁇ , and IL-6 are secreted from intervertebral disc cells, it promotes degradation of extracellular matrix and production of chemokines, thereby causing intervertebral disc degeneration and pain. It is supposed to be brought about. However, there are many cases that cannot be explained only by secretion of inflammatory cytokines.
  • Osteoarthritis is a painful disease that develops due to causes similar to intervertebral disc degeneration, such as aging and obesity. Recently, it has been reported that ER stress is involved in osteoarthritis (Non-patent Document 3). However, there are many differences in the pathology between osteoarthritis and intervertebral disc degeneration, and osteoarthritis is a disease of articular cartilage, and the annulus fibrosus and chondrocytes that make up the intervertebral disc are different. Their properties are also different. Therefore, the relationship between intervertebral disc degeneration and endoplasmic reticulum stress has not been analyzed so far.
  • Endoplasmic reticulum stress refers to a state in which proteins that have not been folded into a normal higher-order structure accumulate excessively in the endoplasmic reticulum and adversely affect cells. It is known that endoplasmic reticulum stress interferes with physiological functions related to cell differentiation and maturation, and that apoptosis is induced when a strong endoplasmic reticulum stress is applied. Endoplasmic reticulum stress is known to cause various diseases such as neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease, and diabetes. However, as described above, there has been no report on the relationship between endoplasmic reticulum stress and osteoarthritis.
  • An object of the present invention is to provide a drug for treating disc degeneration. It is another object of the present invention to provide a method for screening a new drug.
  • the present inventors have revealed that endoplasmic reticulum stress is involved in the development of intervertebral disc degeneration.
  • the present invention relates to a composition for treating intervertebral disc degeneration, and associated low back pain, intervertebral disc herniation, and spinal canal stenosis by removing or reducing endoplasmic reticulum stress. Further, the present invention relates to a screening method for a therapeutic agent for intervertebral disc degeneration that targets endoplasmic reticulum stress, in particular, PERK (PKR-like endoplasmic reticulum kinase) pathway, from the mechanism of onset of intervertebral disc degeneration.
  • PERK PSR-like endoplasmic reticulum kinase
  • a therapeutic agent for intervertebral disc degeneration comprising a PERK inhibitor as an active ingredient.
  • the PERK inhibitor is GSK2606414 or GSK2656157, or a pharmacologically acceptable salt or ester derivative thereof, or siRNA of CHOP, ATF4, or HERP.
  • Degenerative medicine (3) A therapeutic agent for intervertebral disc degeneration by using a candidate substance in contact with an annulus fibrosus (AF) cell in which endoplasmic reticulum stress has been induced, and using a protein and / or gene change of PERK pathway or NF- ⁇ B signal transduction system as an index. How to screen.
  • AF annulus fibrosus
  • the candidate substance selected by the screening method described in (3) is further administered to a rodent intervertebral disc degeneration model animal, and changes in the protein and / or gene of the PERK pathway or NF- ⁇ B signal transduction system are performed.
  • a method for screening a therapeutic agent for intervertebral disc degeneration comprising selecting a candidate substance as an index.
  • FIG. 2A shows mRNA expression
  • FIG. 2B shows protein expression.
  • FIG. 4A shows immunostaining of CHOP and ATF4 expression in human intervertebral disc degeneration patients.
  • FIG. 4B shows the frequency of phosphorylated PERK, ATF4, CHOP expression positive cells.
  • FIG. 12A is a graph showing an increase in phosphorylation amount of NF- ⁇ B p65 subunit by endoplasmic reticulum stress induction.
  • 12B is a graph showing changes in the expression levels of TNF- ⁇ , ADAMTS4, ADAMT5, and IL-6 by NF- ⁇ B inhibitors during endoplasmic reticulum stress induction.
  • the endoplasmic reticulum stress center senses and acts.
  • Three known endoplasmic reticulum stress sensors are the PERK pathway, the IRE1 (Inositol requiring 1) pathway, and the ATF6 (Activating transcription factor 6) pathway.
  • the PERK pathway is particularly involved in intervertebral disc degeneration. Therefore, compounds that inhibit the PERK pathway can be used as therapeutic agents for intervertebral disc degeneration.
  • a compound targeting a protein involved in PERK pathway signal transduction or a nucleic acid such as siRNA that reduces protein expression of the PERK pathway may be applied as a therapeutic agent for intervertebral disc degeneration.
  • ⁇ Endoplasmic reticulum stress reducing agents that have not yet been clinically applied can be used as agents for intervertebral disc degeneration if safety in humans can be confirmed by future research.
  • GSK2606414 and GSK2656157 are known as PERK inhibitors, but it goes without saying that not only this but also a newly developed endoplasmic reticulum stress reducing agent can be used.
  • siRNA capable of regulating PERK pathway gene expression can be used as a medicament.
  • CHOP C / EBP homologous protein
  • ATF4 activating transcription factor 4
  • HERP homotropicstein-induced mRNA expression
  • the formulation may be any form, but tablets are usually used for oral administration. Alternatively, it may be administered locally in the form of injection, patch, ointment, cream, lotion or the like.
  • the dosage for intervertebral disc degeneration may be appropriately selected according to the dosage form, age, weight, and symptoms based on the dosage of each compound.
  • Formulation can be carried out by mixing an endoplasmic reticulum stress-reducing agent with additives used for pharmaceuticals such as carriers, excipients, auxiliaries, and solvents according to a conventional method to obtain a desired dosage form.
  • Any carrier or excipient may be used, and examples thereof include lactose, corn starch or derivatives thereof, talc, stearic acid or salts thereof, and the like.
  • suitable excipients used in soft gelatin capsules include vegetable oils, waxes, fats, semi-solid or liquid polyols and the like.
  • excipients for the preparation of solutions and syrups include water, polyols, saccharose, invert sugar and glucose.
  • pH adjusters When used as an injection, known pH adjusters, tonicity agents, solubilizers, buffers, antioxidants, and the like can be added as additives.
  • penetration enhancers such as monoglycerides, transdermal absorption enhancers such as fatty acid esters, ointments, creams, and lotions
  • the base material normally contained in the agent can be included.
  • a candidate substance is brought into contact with an annulus fibrosus (AF) cell, and the signal induced by endoplasmic reticulum stress, fluctuating gene expression, and protein expression are reduced as compared with the control.
  • AF annulus fibrosus
  • the annulus cells primary annulus cells isolated and cultured from rodents such as mice and rats may be used.
  • human annulus fibrosus cells available as primary cultured cells may be used.
  • it can be suitably used as long as it is a cultured cell in which signals induced by endoplasmic reticulum stress, fluctuating gene expression, and protein expression exhibit the same behavior as annulus fibrosus cells.
  • any known protein or gene known as an endoplasmic reticulum stress marker may be used.
  • the expression of genes or proteins known to be involved in signal transmission of endoplasmic reticulum stress such as CHOP, ATF4, and HERP described later can be used as an index.
  • inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ (tumor necrosis factor- ⁇ )
  • genes and proteins such as MMP-3 (matrix metalloproteinase-3) whose expression is enhanced in intervertebral disc degeneration may be used as an index.
  • changes in proteins such as phosphorylation caused by gene expression, protein expression, or activation of the NF- ⁇ B signal transduction system that has been revealed to be activated by endoplasmic reticulum stress can be used as an index.
  • RNA In order to detect a change in gene expression, a known method capable of quantitatively measuring RNA such as quantitative RT-PCR and Northern blotting can be used. In particular, RT-PCR can quantify mRNA expression with high sensitivity. If protein expression is to be quantified, a known method capable of quantifying protein expression such as immunostaining or Western blotting may be used.
  • a kinase that has been confirmed to be phosphorylated by activation of the PERK pathway may be detected.
  • PERK forms oligomers and is activated by autophosphorylation.
  • Activated PERK is known to phosphorylate eIF2 ⁇ (eukaryotic initiation factor 2 ⁇ ). Therefore, immunostaining and Western blotting may be performed using an antibody that detects the phosphorylated form of PERK or eIF2 ⁇ to determine the degree of activation of the PERK pathway.
  • the activated protein can be detected with high sensitivity. Further, the activation of PERK may be quantified using a known substrate.
  • a commonly used chemical library may be used.
  • a protein involved in the endoplasmic reticulum stress sensor, particularly the PERK pathway is an existing compound, Among them, compounds known to inhibit the PERK pathway may be screened, and those effective for disc degeneration may be selected. Further, a compound that has been primarily screened with cultured cells may be applied to a model animal for intervertebral disc degeneration to examine its effect.
  • the present invention will be described in detail with reference to examples.
  • 3 Wistar rat annulus tissues each of 3 week old, 10 week old, and 42 week old females were separated from the lumbar region and the intervertebral disc of the coccyx, and RT-PCR was performed.
  • As the endoplasmic reticulum stress marker ATF4, HERP, and CHOP which are typical endoplasmic reticulum stress markers were analyzed.
  • RT-PCR was performed using SYBR Premix Ex Taq (manufactured by TakaraBio) using Thermal Cycler Dice Real-Time System (manufactured by TakaraBio). Expression was normalized by ⁇ -actin. The results were analyzed by the ddCt method.
  • FIG. * Indicates that a significant difference was observed. It was confirmed that the expression level of ATF4 significantly increased with aging. In addition, the expression of HERP was significantly increased in 10-week-old rats as compared to 3-week-old, but a decrease in expression was observed in 42-week-old rats as compared to 10-week-old. The expression of CHOP significantly increased with aging. From the above results, it was confirmed that the expression of the endoplasmic reticulum stress marker increases with aging.
  • intervertebral disc degeneration model animal An intervertebral disc degeneration model animal was prepared by puncturing the third to tenth tail intervertebral discs of 8-week-old Wistar rats with a 23G needle. In addition, a group that was developed but not punctured was defined as a control group. Two months after the puncture, the T2 intramedullary high-intensity region was measured by MRI, and it was confirmed that symptoms similar to human intervertebral disc degeneration were exhibited (not shown).
  • the intervertebral disc of the puncture group had a significantly lower signal than the control intervertebral disc, and the ratio of the high intensity area of the intervertebral disc of the puncture group was significantly lower than the control group .
  • Results from MRI indicate that the disc of the rat tail disc puncture model can be a model for disc degeneration in human patients.
  • Rat TNF- ⁇ (F) 5'-GCAGATGGGCTGTACCTTATC-3 '(SEQ ID NO: 9) (R) 5′-GGCTGACTTTCTCCTGGTATG-3 ′ (SEQ ID NO: 10)
  • Rat MMP-3 (F) 5'-GGACCAGGGATTAATGGAGATG-3 '(SEQ ID NO: 11) (R) 5′-TGAGCAGCAACCAGGAATAG-3 ′ (SEQ ID NO: 12)
  • results are shown in FIG. 2A.
  • CHOP an endoplasmic reticulum stress marker
  • TNF- ⁇ and MMP-3 which are intervertebral disc degeneration markers
  • the intervertebral disc tissue was isolated 4 weeks after puncture, and the protein was extracted using a mammalian protein extraction reagent (Pierce). Protease inhibitor cocktail (Roche), 1M NaF, 50 ⁇ M Na 3 VO 4 were added to the protein extraction solution and the washing solution.
  • Western blotting was performed by a conventional method and analyzed.
  • An anti-ATF4 antibody manufactured by SANTA CRUZ
  • an anti-CHOP antibody manufactured by NOVUS
  • an anti-actin antibody manufactured by Sigma-Aldrich
  • an HRP-labeled anti-rabbit antibody (Life Technologies) is used as the secondary antibody.
  • the product was detected using an ECL detection reagent (ECL Western Blotting Detection Reagent, manufactured by GE Healthcare). The result is shown in FIG. 2B.
  • Rat disc degeneration model isolated disc tissue 1 month after puncture. The sample was fixed with 4% paraformaldehyde / phosphate buffer, embedded in paraffin, and sliced at a thickness of 4 ⁇ m. CHOP was detected using the above-mentioned anti-CHOP antibody as the primary antibody and after reacting with HRP-labeled goat anti-rabbit IgG (manufactured by Sigma-Aldrich) as the secondary antibody. Detection was performed with diaminobenzidine (manufactured by Nakarai Tasks).
  • CHOP expression in human intervertebral disc degeneration model Since CHOP expression was confirmed in a rat intervertebral disc degeneration model, the expression of CHOP and ATF4 in human patient tissues was analyzed by immunostaining. In the same manner as described above, a sample was prepared and observed with a microscope. As the anti-ATF4 antibody, the same antibody as that used for Western blotting was used.
  • the undegenerated disc was obtained from an autopsy sample of a 17 year old male.
  • the degree of intervertebral disc degeneration was classified by Pfirermann classification from MRI images. According to the Pfirermann classification, Grade 1 is normal and Grade 5 is the most denatured state.
  • the human tissue was obtained by surgery from a patient with intervertebral disc degeneration with informed consent.
  • each positive cell rate was calculated by visually measuring the proportion of positive cells in the total number of cells observed in one field of view at a magnification of 200 times. Measurement was performed in three different visual fields for each sample, the positive cell rate was calculated, and the average value was indicated by ⁇ . Moreover, it measured by three different samples for each Grade, and the average value was shown by ⁇ (FIG. 4B).
  • Rat annulus cells were prepared as follows. The rat annulus tissue was separated from the lumbar region and the intervertebral disc of 8-week-old female Wistar rats, treated with DMEM containing 0.04% pronase E (manufactured by SERVA) at 37 ° C. for 1 hour, and subsequently 0 Isolated by treatment with 025% collagenase P (Roche Diagnostics) at 37 ° C. for 4 hours. The isolated cells were washed with Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, manufactured by Invitrogen) containing inactivated 5% fetal calf serum (manufactured by JRH Biosciences Lenexa). The isolated annulus cells were cultured in DMEM containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. Cells were used for analysis up to passage 5.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • ADAMTS4 a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4
  • Rat ADAMTS4 (F) 5′-GGAGATCGTGTTTCCAGAGAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 13) (R) 5'-CAAAGGCTGGTAATCGGTACA-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • ER stress markers such as ATF4, HERP, and CHOP was observed in a concentration-dependent manner by adding tunicamycin (TM).
  • TNF- ⁇ and ADAMTS4 were also found to increase significantly in a concentration-dependent manner by the addition of tunicamycin.
  • GSK2606414 (manufactured by LKT Laboratories) was added to rat annulus cells at different concentrations from 20 to 1000 nM together with 2.0 mM DTT, and 24 hours later, the cells were collected and mRNA was purified.
  • Human annulus cells were prepared as follows. Human annulus fibrosus tissue was separated from degenerated intervertebral discs of Pfilmann class Grade 4 collected at the time of surgery, treated with DMEM containing 0.04% pronase E (manufactured by SERVA) at 37 ° C. for 1 hour, and subsequently 0.025% It was isolated by treatment with collagenase P (Roche Diagnostics) at 37 ° C. for 4 hours. The isolated cells were washed with Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, manufactured by Invitrogen) containing inactivated 5% fetal calf serum (manufactured by JRH Biosciences Lenexa). The isolated annulus cells were cultured in DMEM containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. Cells were used for analysis up to the third passage.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • GSK2606414 was added to human annulus fibrosus cells at a concentration of 0, 4, and 20 nM. After 24 hours, the cells were collected, RNA was purified as described above, and TNF- ⁇ , ADAMTS4, ADAMTS5, and IL-6 were purified by RT-PCR. Expression was analyzed. Expression was normalized by ⁇ -actin.
  • the primers used are as follows.
  • PERK EIF2AK3
  • TRCN0020026374 SHC002V, Sigma-Aldrich
  • PERK EIF2AK3
  • TRCN0020026374 SHC002V, Sigma-Aldrich
  • PERK TNF- ⁇
  • ADAMTS4 ADAMTS5
  • IL-6 IL-6
  • Transfection was performed by the recommended method using Hexadimethine Bromide when human degenerative disc cells were 40-50% confluent, RNA was extracted 72 hours after transfection, and analyzed by RT-PCR (Fig. 10).
  • the PERK primer used the following.
  • Human EIF2AK3 F) 5′-CTTATGCCAGACACACAGGACAA-3 ′ (SEQ ID NO: 25)
  • R 5′-TCCATCTGAGTGCTGAATGGATAC-3 ′
  • SEQ ID NO: 26 Human EIF2AK3
  • PERK expression is significantly inhibited by introducing PERK shRNA with a lentivirus (upper part of FIG. 10). Furthermore, the expression of IL-6 was significantly suppressed. Regarding TNF- ⁇ and ADAMTS4, although not significant, there was a tendency for the expression to decrease. A knockdown system with shRNA also showed that the PERK pathway is involved in intervertebral disc degeneration.
  • ATF4 located downstream of PERK was similarly knocked down in a system using shRNA, and the expression of a molecule whose expression was increased with disc degeneration was analyzed.
  • ATF4 TRCN00000013573, Sigma-Aldrich
  • control shRNA were transfected into human degenerated intervertebral disc cells using lentivirus, and the expression of ATF4, TNF- ⁇ , ADAMTS4, ADAMTS5, and IL-6 was changed to RT. Analysis was performed by PCR (FIG. 11). The following sequences were used for the ATF4 primer.
  • Human ATF4 F) 5′-GGAGATAGGAAGCCAGACTACA-3 ′ (SEQ ID NO: 27)
  • R 5'- GGCTCATACAGATGCCACTATC-3 '(SEQ ID NO: 28)
  • ATF4 shRNA By introducing ATF4 shRNA with a lentivirus, ATF4 expression is significantly inhibited (upper part of FIG. 11). Along with this, molecular expression of all of TNF- ⁇ , ADAMTS4, ADAMTS5, and IL-6 was significantly suppressed.
  • the shRNA knockdown system has shown that the PERK-ATF4 pathway is involved in intervertebral disc degeneration.
  • the endoplasmic reticulum stress inducer tunicamycin was added to rat annulus fibrosus cells at a concentration of 2 ⁇ g / ml, and the activation of NF- ⁇ B was analyzed by detecting the phosphate of the p65 subunit by Western blotting.
  • the antibody which detects a phosphorylated p65 subunit used the Cell Signaling Technology company.
  • the NF- ⁇ B inhibitor DHMEQ dehydroxymethyloxyquinomicin
  • DHMEQ dehydroxymethyloxyquinomicin
  • Tunicamycin was added to human annulus fibrosus cells at a concentration of 2 ⁇ g / ml to induce endoplasmic reticulum stress. Changes in the expression of TNF- ⁇ , ADAMTS4, ADAMTS5, and IL-6 with and without 10.0 ⁇ g / ml DHMEQ were analyzed by RT-PCR. RNA was cultured and extracted for 24 hours after adding tunicamycin and DHMEQ (FIG. 12B).
  • TNF- ⁇ and IL-6 were significantly suppressed by the addition of DHMEQ. Moreover, it was recognized that the expression of ADAMTS4 is suppressed although it is not significant. Therefore, it was confirmed that the NF- ⁇ B signaling pathway is also involved as a mechanism involving endoplasmic reticulum stress.
  • FIG. 13 schematically shows an endoplasmic reticulum stress signal transduction system involved in intervertebral disc degeneration.
  • the PERK pathway is involved in intervertebral disc degeneration.
  • the NF- ⁇ B signal transduction system located downstream of the PERK pathway is also activated, it has become clear that it is involved in intervertebral disc degeneration. Therefore, PERK and ATF4 located in the PERK pathway are important as therapeutic targets for intervertebral disc degeneration.
  • PERK inhibitors can be used to treat disc degeneration.
  • the PERK inhibitor is considered to be effective as a therapeutic agent for diseases such as low back pain and intervertebral disc herniation caused by disc degeneration.
  • a new screening method can be provided.

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Abstract

小胞体ストレスが椎間板変性症と相関があることを明らかにしたことから、小胞体ストレス低減剤、特にＰＥＲＫ阻害剤が椎間板変性症、これに起因する腰痛その他の疾患を改善し得ることを示した。また、ＰＥＲＫ経路、又はＮＦ-κＢシグナル伝達系の分子の変化を指標とする椎間板変性症の治療薬のスクリーニング方法を提供する。

Description

小胞体ストレスを標的とする椎間板変性症に対する治療薬
　本発明は椎間板変性症、及びこれを誘因とする腰痛等の疾患を改善するための組成物に関する。特に、小胞体ストレスを標的とする化合物を有効成分として含む医薬組成物に関する。さらに、椎間板変性症、及びこれを誘因とする疾患を改善するための治療薬をスクリーニングする方法に関する。
　椎骨の間に存在する椎間板は、中央の髄核と、髄核を取り囲むように存在する外側の線維輪から構成されている。髄核は水分を多く含むゲル状の物質からなっているが、加齢により髄核の水分が減少して弾力性が失われ変性が生じる。椎間板が変性した状態を椎間板変性症という。老化現象によって、椎間板の支持性が失われ、クッションとしての機能が低下すると、周囲の神経を刺激したり、靭帯、関節、筋肉などの周囲の組織に負担がかかり痛みの原因となることがある。
　椎間板変性症は、腰痛、椎間板ヘルニア、脊柱管狭窄症、脊柱変形といった多くの脊髄変性症状（degenerative spinal condition）の要因となることが知られている（非特許文献１）。椎間板変性症は、加齢、肥満や重量物を持ち上げるなどの機械的ストレス、タバコなどの生活習慣、遺伝、炎症性サイトカインなど様々な因子が関与して発症するものと考えられている。
　椎間板変性症の治療は現在のところ腰痛などの症状が出た場合に、手術療法と対症療法によって処置される。対症療法は薬物治療と物理療法が中心であり、薬物治療としては抗疼痛薬が主として投与され、症状の緩和を目指すことが基本の治療法となっている。さらに、ストレスが著しい場合には抗不安薬／抗うつ薬などが併用される場合もある。
　抗疼痛薬による治療は、椎間板変性症の進行を抑止できるものではなく、現在のところ腰痛や、腰痛の原因となっている椎間板変性症それ自体を根本的に治療する薬物療法はない。また、現在使用されている抗疼痛薬の中でも非ステロイド性抗炎症薬は胃腸障害、腎障害などの副作用が多い。また、近年多用される鎮痛薬には吐き気、便秘、めまい、眠気などの副作用も多い。また、手術療法に至る患者数を減らすことは、医療経済の観点からも大変有意義であり、脊椎変性疾患の進行予防効果を持つ薬剤が求められている。そのためには、椎間板変性症の発症機序の解明が重要である。
　椎間板変性症の発症の過程には、炎症性サイトカインが関与していることが明らかになってきた。非特許文献２によれば、椎間板細胞からＴＮＦ－α、ＩＬ-１β、ＩＬ－６などの炎症性サイトカインが分泌されると細胞外基質の分解やケモカインの産生を促し、それにより椎間板変性や疼痛がもたらされるとされている。しかしながら、炎症性サイトカインの分泌だけでは説明のできないことも多い。
　加齢や肥満など、椎間板変性症と類似した原因により発症する疼痛を伴う疾患に変形性関節症（ＯＡ）がある。最近、変形性関節症には、小胞体ストレスが関与することが報告されてきている（非特許文献３）。しかしながら、変形性関節症と椎間板変性症とでは、その病態には異なる点も多く、また、変形性関節症は関節軟骨の疾患であり、椎間板を構成している線維輪細胞と軟骨細胞とではその性質も異なっている。そのため、これまで椎間板変性症と小胞体ストレスの関係は解析されてこなかった。
　小胞体ストレスとは、正常な高次構造に折りたたまれなかったタンパク質が小胞体に過剰に蓄積し、細胞に対して悪影響を与える状態をいう。小胞体ストレスは細胞の分化、成熟にかかわる生理機能を妨げ、さらに、強い小胞体ストレスが与えられた場合には、アポトーシスが誘導されることが知られている。また、小胞体ストレスは、アルツハイマー病、パーキンソン病をはじめとする神経変性疾患や、糖尿病など種々の疾患の原因となることが知られている。しかしながら、上述のように小胞体ストレスと変形性関節症との関係は今までに報告がない。
UrbanJ.P., Roberts S. 2003, Arthritis Res. Ther. Vol.5, p.120-130. Risbud,M.V., Shapiro, I.M., 2014, Nat.Rev. Rhumatol., Vol.10(1), p.44-56. Uehara,Y., Hirose, J., et al., 2014, Osteoarthritis Cartilage, Vol. 22(7), 1007-17.
　本発明は椎間板変性症を治療する薬剤を提供することを課題とする。また、新しい薬剤をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、椎間板変性症の発症に、小胞体ストレスが関与することを明らかにした。本発明は、小胞体ストレスを除去、または軽減することによって、椎間板変性症、また、これに伴う腰痛、椎間板ヘルニア、脊柱管狭窄症を治療する組成物に関する。また、新たに見出した椎間板変性症の発症の機序から、小胞体ストレス、特にＰＥＲＫ（ＰＫＲ－ｌｉｋｅ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｋｉｎａｓｅ）経路を標的とする椎間板変性症治療薬のスクリーニング方法に関する。
（１）ＰＥＲＫ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする椎間板変性症治療薬。
（２）前記ＰＥＲＫ阻害剤が、ＧＳＫ２６０６４１４、若しくはＧＳＫ２６５６１５７、又はこの薬理学的に許容される塩、若しくはエステル誘導体、又はＣＨＯＰ、ＡＴＦ４、若しくはＨＥＲＰのｓｉＲＮＡであることを特徴とする（１）の椎間板変性症治療薬。
（３）小胞体ストレスを誘導した線維輪（ＡＦ）細胞に、候補物質を接触させ、ＰＥＲＫ経路、又はＮＦ-κＢのシグナル伝達系のタンパク質及び／又は遺伝子の変化を指標として椎間板変性症治療薬をスクリーニングする方法。
（４）（３）記載のスクリーニング方法によって選択された候補物質をさらに、げっ歯類椎間板変性モデル動物に投与し、ＰＥＲＫ経路、又はＮＦ-κＢのシグナル伝達系のタンパク質及び／又は遺伝子の変化を指標として候補物質を選択することを特徴とする椎間板変性症治療薬をスクリーニングする方法。
　今まで根本的な薬物治療を行うことのできなかった椎間板変性症に対して、進行予防効果を持つ薬剤を提供することができる。また、新規の標的分子に対する新たな治療薬の開発を行うことが期待できる。
週齢によるラット線維輪細胞の小胞体ストレスマーカー発現量の推移を示す図。 ラット椎間板変性モデルにおける小胞体ストレスマーカーの発現量を示す図。図２Ａは、ｍＲＮＡ発現を、図２Ｂはタンパク質発現を示す。 ラット椎間板変性モデルにおけるＣＨＯＰ発現の免疫染色を示す図。 ヒト椎間板変性症の進行度とマーカー発現を示す図。図４Ａはヒト椎間板変性症患者におけるＣＨＯＰ、ＡＴＦ４発現の免疫染色を示す。図４Ｂは、リン酸化ＰＥＲＫ、ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ発現陽性細胞の頻度を示す。 小胞体ストレス誘導剤、ツニカマイシン（ＴＭ）添加による小胞体ストレスマーカー発現量の変化を示す図。 小胞体ストレス誘導剤、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）添加による小胞体ストレスマーカー発現量の変化を示す図。 ＤＴＴ及びＰＥＲＫ阻害剤（Ｇｓｋ）添加による炎症性マーカー発現量の変化を示す図。 ヒト線維輪細胞におけるＰＥＲＫ阻害剤添加時のＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴ５，ＩＬ－６の発現量の変化を示す図。 ＰＥＲＫ阻害剤によるアポトーシスの抑制を示す図。 ｓｈＲＮＡを用いたＰＥＲＫノックダウンによるＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴ５、ＩＬ－６の発現量の変化を示す図。 ｓｈＲＮＡを用いたＡＴＦ４ノックダウンによるＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴ５，ＩＬ－６の発現量の変化を示す図。 椎間板変性にＮＦ-κＢシグナル伝達経路が関与することを示す図。図１２Ａは、小胞体ストレス誘導によるＮＦ-κＢ　ｐ６５サブユニットのリン酸化量の増加を示す図。図１２Ｂは、小胞体ストレス誘導時のＮＦ-κＢ阻害剤によるＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴ５、ＩＬ－６の発現量の変化を示す図。 椎間板変性における小胞体ストレスが関与する経路を示す図。
　高次構造の異常なタンパク質や正常な修飾を受けていないタンパク質が小胞体に蓄積すると小胞体ストレスセンターが感知して作用する。小胞体ストレスセンサーとしては、ＰＥＲＫ経路、ＩＲＥ１（Ｉｎｏｓｉｔｏｌ　ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ　１）経路、ＡＴＦ６（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　６）経路の３つが知られている。後述するように本発明者らは、小胞体ストレスセンサーの経路のうち、特にＰＥＲＫ経路が椎間板変性症に関与することを明らかにした。したがって、椎間板変性症治療薬としては、ＰＥＲＫ経路を阻害する化合物等を用いることができる。すなわち、ＰＥＲＫ経路のシグナル伝達に関わるタンパク質を標的とする化合物や、ＰＥＲＫ経路のタンパク質発現を低減させるｓｉＲＮＡなどの核酸を椎間板変性症治療薬として適用できる可能性がある。
　現在のところ臨床応用に至っていない小胞体ストレス低減剤も今後の研究によってヒトへの安全性が確認できれば、椎間板変性症の薬剤として使用することができる。現在のところ、ＰＥＲＫ阻害剤として、ＧＳＫ２６０６４１４、ＧＳＫ２６５６１５７が知られているが、これに限らず、新たに開発される小胞体ストレス低減剤も使用することができることは言うまでもない。
　また、ＰＥＲＫ経路の遺伝子発現を調節することができるｓｉＲＮＡも医薬として使用できる。具体的には、本発明で椎間板変性と相関が見られたＣＨＯＰ（Ｃ/ＥＢＰ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＡＴＦ４（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　４）、ＨＥＲＰ（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を低下させるｓｉＲＮＡを使用することができる。
　小胞体ストレス低減剤やｓｉＲＮＡが単独で製剤化されているとき、その製剤形態はどのような形態でもよいが、経口投与の場合は通常は錠剤が使用される。また、注射、貼付剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤等の形態で局所に投与してもよい。椎間板変性症に対しての投与量は、各化合物の投与量に基づいて投与形態、年齢、体重、症状に応じて適宜選択すればよい。製剤化は小胞体ストレス低減剤を担体、賦形剤、助剤、溶剤等、医薬用に使用される添加剤とともに定法にしたがって混合し、所望の剤型とすることができる。
　担体や賦形剤は、どのようなものを使用してもよいが、例えば、乳糖、トウモロコシデンプン若しくはその誘導体、タルク又はステアリン酸若しくはその塩などが挙げられる。軟ゼラチンカプセル剤に使用される適切な賦形剤の例には、植物油、ロウ、脂肪、半固体又は液体ポリオール等が挙げられる。液剤及びシロップ剤の調製のための賦形剤の例には、水、ポリオール、サッカロース、転化糖及びグルコースなどが挙げられる。
　注射剤として用いる場合には、公知のｐＨ調節剤、等張化剤、溶解補助剤、緩衝剤、抗酸化剤などを添加剤として加えることができる。貼付剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤等の形態で経皮から吸収させる場合には、モノグリセリドなどの浸透促進剤や、脂肪酸エステルなどの経皮吸収促進剤や、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤に通常含まれる基剤原料を含むことができる。
　本発明のスクリーニング方法は、線維輪（ａｎｎｕｌｕｓ　ｆｉｂｒｏｓｕｓ；ＡＦ）細胞に、候補物質を接触させ、小胞体ストレスにより誘導されるシグナルや変動する遺伝子発現、タンパク質発現がコントロールと比較して低減しているか解析すればよい。線維輪細胞としては、マウス、ラット等げっ歯類から単離培養した初代線維輪細胞を用いれば良い。また、初代培養細胞として入手可能なヒト線維輪細胞等を用いても良い。さらに、小胞体ストレスにより誘導されるシグナルや変動する遺伝子発現、タンパク質発現が、線維輪細胞と同様の挙動を示す培養細胞であれば好適に用いることができる。
　スクリーニングの際に指標とする遺伝子、タンパク質発現としては、小胞体ストレスマーカーとして知られている公知のタンパク質や遺伝子であれば、どのようなものを用いてもよい。例えば、後述するＣＨＯＰ、ＡＴＦ４、ＨＥＲＰのような小胞体ストレスのシグナル伝達に関与することが知られている遺伝子やタンパク質発現を指標とすることができる。また、ＴＮＦ‐α（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ-α）などの炎症性サイトカインや、椎間板変性症において発現増強が見られるＭＭＰ‐３（ｍａｔｒｉｘ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ‐３）などの遺伝子やタンパク質発現を指標としてもよい。さらに、小胞体ストレスによって活性化することが明らかとなったＮＦ-κＢシグナル伝達系の遺伝子発現、タンパク質発現、あるいは活性化に伴って起こるリン酸化などのタンパク質の変化を指標とすることができる。
　遺伝子発現の変化を検出するには、定量的ＲＴ-ＰＣＲ、ノーザンブロッティング等、ＲＮＡを定量的に測定することができる公知の方法を用いることができる。特に、ＲＴ-ＰＣＲは感度良くｍＲＮＡ発現を定量することができる。また、タンパク質発現を定量するのであれば、免疫染色、ウェスタンブロッティング等、タンパク質発現を定量できる公知の方法を用いればよい。
　また、ＰＥＲＫ経路の活性化によってリン酸化することが確認されたキナーゼを検出してもよい。小胞体ストレスを感知すると、ＰＥＲＫはオリゴマーを形成し、自己リン酸化により活性化する。活性化したＰＥＲＫは、ｅＩＦ２α（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　２α）をリン酸化することが知られている。したがって、ＰＥＲＫ経路の活性化の程度をＰＥＲＫやｅＩＦ２αのリン酸化型を検出する抗体を用いて、免疫染色、ウェスタンブロッティングを行えばよい。リン酸化されたタンパク質を検出することによって、活性化されたタンパク質を感度良く検出することができる。また、ＰＥＲＫの活性化を公知の基質を用いて定量してもよい。
　スクリーニングを行う化合物としては一般的に使用されているケミカルライブラリーを用いてもよいが、小胞体ストレスセンサー、特にＰＥＲＫ経路に関与するタンパク質が標的であることが明らかであることから、既存の化合物の中からＰＥＲＫ経路を阻害することが知られている化合物をスクリーニングし、椎間板変性症に効果のあるものを選択してもよい。さらに培養細胞で一次スクリーニングした化合物を椎間板変性症のモデル動物に適用し、その効果を検討してもよい。以下、実施例を示しながら本発明を詳細に説明する。
[週齢別のラット線維輪細胞における小胞体ストレスマーカー発現量の推移]
　最初に、小胞体ストレスが椎間板変性症に関与するか解析を行った。椎間板変性症は加齢が原因の一つであることから、加齢に伴って小胞体ストレスマーカーが増加するかＲＴ-ＰＣＲで解析した。
　３週齢、１０週齢、４２週齢のメス各３匹のウィスターラット線維輪組織を、腰部、及び尾骨の椎間板から分離し、ＲＴ-ＰＣＲを行った。小胞体ストレスマーカーとしては、代表的な小胞体ストレスマーカーであるＡＴＦ４、ＨＥＲＰ、ＣＨＯＰについて解析を行った。
　全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、又はＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて調整した。ｃＤＮＡはＰｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（ＴａｋａｒａＢｉｏ社製）を用いて合成した。
　ＲＴ‐ＰＣＲは、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｒｅａｌ‐Ｔｉｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＴａｋａｒａＢｉｏ社製）を用い、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（ＴａｋａｒａＢｉｏ社製）によって増幅を行った。発現は、β－アクチンによって正規化した。また、結果はｄｄＣｔ法によって解析を行った。
　用いたプライマーは以下のとおりである。
ラットＡＴＦ４　　（Ｆ）5′-GCCATCTCCCAGAAAGTGTAATA-3′（配列番号１）
　　　　　　　　　（Ｒ）5′-CCTCACTTCCCAGCTCTAAAC-3′　（配列番号２）
ラットＨＥＲＰ　　（Ｆ）5′-GGTTGGATTGGACCTACTCAGCA-3′（配列番号３）
　　　　　　　　　（Ｒ）5′-GCCTCTGTCTGAATGGAAACCAC-3′（配列番号４）
ラットＣＨＯＰ　　（Ｆ）5′-TGGAAGCCTGGTATGAGGATCTG-3′（配列番号５）
　　　　　　　　　（Ｒ）5′-GAGGTGCTTGTGACCTCTGCTG-3′（配列番号６）
ラットβ－アクチン（Ｆ）5′-TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′（配列番号７）
　　　　　　　　　（Ｒ）5′-AAGAAGGAAGGCTGGAAAAGAG-3′（配列番号８）
　結果を図１に示す。図中*印は有意差が認められたことを示す。ＡＴＦ４は加齢にともなって有意に発現量が増加することが確認された。また、ＨＥＲＰは、１０週齢のラットでは３週齢に比べて有意にその発現が増加していたが、４２週齢のラットでは１０週齢に比べて発現の低下が観察された。ＣＨＯＰは、加齢に伴って有意に発現が増加していた。以上の結果から、加齢に伴って小胞体ストレスマーカーの発現が増強することが認められた。
[ラット椎間板変性モデルにおけるＴＮＦ‐α、ＭＭＰ‐３、ＣＨＯＰ、ＡＴＦ４発現量]
　本発明者らは、ＭＲＩ等の解析結果より、ラット尾椎椎間板を穿刺することにより作成した椎間板変性モデル動物は、ヒト椎間板変性症と同様の性質を備えていることをすでに検証している。そこで、ラット椎間板変性モデルを用いて、椎間板変性による小胞体ストレスマーカーの発現量の解析を行った。
１．椎間板変性モデル動物の作成
　８週齢のウィスターラットの３～１０番目の尾椎椎間板を２３Ｇ針で穿刺することで椎間板変性モデル動物を作製した。また、展開のみで穿刺を行っていない群をコントロール群とした。穿刺２ヶ月後にＭＲＩでＴ２髄内高輝度領域を測定し、ヒト椎間板変性症と同等の症状を呈していることを確認した（図示せず。）。すなわち、Ｔ２強調ＭＲＩの結果、穿刺群の椎間板は、コントロールの椎間板に比べ、有意にシグナルが低く、穿刺群の椎間板の高輝度領域の比は、コントロール群に対して有意に低い値であった。ＭＲＩによる結果は、ラット尾椎椎間板穿刺モデルの椎間板がヒト患者の椎間板変性症のモデルとなり得ることを示している。
２．椎間板変性モデル動物による、遺伝子発現の検討
　ラット椎間板変性症モデル（Ｐｕｎｃｔｕｒｅ群）、及びコントロール群から、穿刺１週後に椎間板組織を単離し、上記と同様にしてＲＮＡを抽出し、ＲＴ‐ＰＣＲにより、小胞体ストレスマーカーであるＣＨＯＰ、ＡＴＦ４の他に、椎間板変性症によって発現が増加することが知られているＴＮＦ‐α、ＭＭＰ‐３の遺伝子発現をＲＴ‐ＰＣＲにより解析した。
　ＴＮＦ‐α、ＭＭＰ‐３のプライマーは以下の配列を用いた。
ラットＴＮＦ‐α（Ｆ）5′-GCAGATGGGCTGTACCTTATC-3′　（配列番号９）
　　　　　　　　（Ｒ）5′-GGCTGACTTTCTCCTGGTATG-3′　（配列番号１０）
ラットＭＭＰ‐３（Ｆ）5′-GGACCAGGGATTAATGGAGATG-3′（配列番号１１）
　　　　　　　　（Ｒ）5′-TGAGCAGCAACCAGGAATAG-3′　（配列番号１２）
　結果を図２Ａに示す。小胞体ストレスマーカーであるＣＨＯＰの発現は、椎間板変性モデルにおいて有意に増加していることが示された。また、椎間板変性マーカーであるＴＮＦ‐α、ＭＭＰ‐３が椎間板変性モデルにおいて有意に増加していることが確認された。
３．椎間板変性モデル動物による、タンパク質発現の検討
　小胞体ストレスマーカーのｍＲＮＡ発現の増加が認められたので、次に、タンパク質レベルでこれらマーカーの発現を解析した。椎間板変性モデルとしては、穿刺後４週のラットを用いた。
　ラット椎間板変性モデルは、穿刺４週後に、椎間板組織を単離し、タンパク質をｍａｍｍａｌｉａｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて抽出した。タンパク質抽出溶液、洗浄液には、タンパク質分解酵素阻害剤カクテル（ロシュ社製）、１Ｍ　ＮａＦ、５０μＭ　Ｎａ３ＶＯ４添加して用いた。定法によりウェスタンブロッティングを行い解析した。一次抗体として、抗ＡＴＦ４抗体（ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ社製）、抗ＣＨＯＰ抗体（ＮＯＶＵＳ社製）、抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を使用し、二次抗体としてＨＲＰ標識抗ｒａｂｂｉｔ抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用し、ＥＣＬ検出試薬（ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて検出を行った。結果を図２Ｂに示す。
　ＣＨＯＰ、ＡＴＦ４ともに、椎間板変性モデルでは発現の増加が確認された。ＡＴＦ４はｍＲＮＡレベルでは発現に差が認められなかったが、タンパク質レベルでは発現が増加していることが確認された。
[ラット椎間板変性モデルにおけるＣＨＯＰ発現]
　ラット椎間板変性モデルで、小胞体ストレスマーカーの遺伝子発現、タンパク質発現の増加が確認されたことから、組織染色を行い、組織内での発現を解析した。ラット椎間板変性モデルは穿刺１ヶ月後に椎間板組織を単離した。サンプルは４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で固定し、パラフィン包埋の後、４μｍの厚さで薄切した。ＣＨＯＰの検出は、一次抗体として上述の抗ＣＨＯＰ抗体を用い、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と反応させた後に検出を行った。検出はジアミノベンジジン（ナカライタスク社製）により行った。
　図３に示すようにコントロールでは、髄核にＣＨＯＰの発現が見られるが（図中矢印で示す。）線維輪細胞には発現が認められなかった。一方、椎間板変性モデルでは、線維輪細胞にＣＨＯＰを発現している細胞（図中矢印で示す。）が認められた。免疫組織染色によっても、椎間板変性モデルにおいてＣＨＯＰ発現が亢進していることが確認された。
[ヒト椎間板変性モデルにおけるＣＨＯＰ発現]
　ラット椎間板変性モデルにおいてＣＨＯＰ発現が確認されたことから、ヒト患者組織でＣＨＯＰ、ＡＴＦ４の発現を免疫染色法により解析した。上記と同様にして、試料を作製し顕微鏡観察を行った。抗ＡＴＦ４抗体は、ウェスタンブロッティングに用いた抗体と同じ抗体を使用した。
　変性していない椎間板は１７歳男性の剖検試料から得た。椎間板変性の程度は、ＭＲＩ画像からＰｆｉｒｒｍａｎｎ分類によって分類した。Ｐｆｉｒｒｍａｎｎ分類によれば、Ｇｒａｄｅ　１が正常であり、Ｇｒａｄｅ　５が最も変性が進んだ状態である。なお、ヒト組織はインフォームドコンセントが得られた椎間板変性症の患者から外科手術によって得たものである。
　結果を図４Ａに示す。ＣＨＯＰ、ＡＴＦ４ともに、コントロールとして用いた１７歳男性の試料では発現が認められない。一方、患者組織では、Ｐｆｉｒｒｍａｎｎ分類のＧｒａｄｅが高くなるにしたがって、ＣＨＯＰ、ＡＴＦ４ともに発現細胞数が増加するだけではなく、強く染色される像が観察された。ラット椎間板変性モデルだけではなく、ヒト患者においても椎間板変性症に伴って、小胞体ストレスマーカーの発現増強が観察された。
　さらに、リン酸化ＰＥＲＫ、ＡＴＦ４、ＣＨＯＰ陽性細胞の頻度を進行度の異なる患者組織を用いて解析した。抗リン酸化ＰＥＲＫ抗体は、Ｎｏｖｕｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製のものを使用した。それぞれの陽性細胞率は、２００倍の拡大率における１視野で認められる全細胞数の中の陽性細胞の割合を目視で計測することで算出した。１サンプルにつき異なる３視野で測定を行い陽性細胞率を算出し、その平均値を○で示した。また、それぞれのＧｒａｄｅごとに異なる３サンプルで計測し、その平均値を●で示した（図４Ｂ）。
　リン酸化ＰＥＲＫ、ＡＴＦ４、ＣＨＯＰいずれも、Ｇｒａｄｅ５では有意に陽性細胞率が増加していることが認められた。特に、ＣＨＯＰはＧｒａｄｅ３でもＧｒａｄｅ１に対して有意な差が認められた。ヒト臨床サンプルでも小胞体ストレスマーカーの有意な発現増強が確認された。
[小胞体ストレス誘導剤添加による小胞体ストレスマーカー発現量の変化]
　次に、小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ、ＴＭ）及びジチオスレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、ＤＴＴ）を線維輪細胞に添加して、小胞体ストレスマーカーの発現を解析した。
１．ラット線維輪細胞の調製
　ラット線維輪細胞は以下のようにして調整した。ラット線維輪組織は、８週齢のメスのウィスターラットの腰部、及び尾骨の椎間板から分離し、０．０４％プロナーゼＥ（ＳＥＲＶＡ社製）を含むＤＭＥＭで３７℃、１時間処理し、引き続き０．０２５％コラゲナーゼＰ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）で３７℃、４時間処理し単離した。単離した細胞は、非働化処理した５％ウシ胎児血清（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｎｅｃｅｓ　Ｌｅｎｅｘａ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、インビトロジェン社製）で洗浄した。単離した線維輪細胞は、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン‐ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。細胞は第５継代までを解析に用いた。
２．ツニカマイシン添加による小胞体ストレスマーカーの変化
　ラット線維輪細胞に、０、０．４、２．０、１０．０μｇ／ｍｌ濃度でツニカマイシンを添加し、２４時間後に細胞を集め、上記と同様にＲＮＡを調整し、ＲＴ-ＰＣＲにより小胞体ストレスマーカーＡＴＦ４、ＨＥＲＰ、ＣＨＯＰ、及び椎間板変性症に伴って増加することが知られているＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４（ａ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ　ｍｏｔｉｆｓ　４）の発現を解析した。ＡＤＡＭＴＳ４のＰＣＲプライマーは以下の配列を用いた。
ラットＡＤＡＭＴＳ４(Ｆ)5′-GGAGATCGTGTTTCCAGAGAAG-3′(配列番号１３)
　　　　　　　　（Ｒ）5′-CAAAGGCTGGTAATCGGTACA-3′（配列番号１４）
　図５に示すように、ＡＴＦ４、ＨＥＲＰ、ＣＨＯＰいずれの小胞体ストレスマーカーも、ツニカマイシン（ＴＭ）添加により濃度依存的に有意な発現の増加が認められた。また、ＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４も同様にツイニカマイシン添加により濃度依存的に有意な発現の増加が認められた。
３．ＤＴＴ添加による小胞体ストレスマーカーの変化
　次に、小胞体ストレスマーカーとして知られているＤＴＴを用いた解析結果を示す。ラット線維輪細胞に、０、０．５、１．０、２．０ｍＭ濃度でＤＴＴを添加し、２４時間後に細胞を集め、上記と同様にＲＮＡを調整し、ＲＴ-ＰＣＲにより小胞体ストレスマーカーＡＴＦ４、ＨＥＲＰ、ＣＨＯＰ、及び椎間板変性症に伴って増加することが知られているＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４、ＭＭＰ-３の発現を解析した。
　図６に示すように、ＡＴＦ４、ＨＥＲＰ、ＣＨＯＰいずれの小胞体ストレスマーカーも、ＤＴＴ添加により濃度依存的に有意な発現の増加が認められた。また、ＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４、ＭＭＰ-３もＤＴＴ添加により濃度依存的に有意な発現の増加が認められた。
[ＰＥＲＫ阻害剤添加による炎症性マーカー発現量の変化]
　上記示してきたように、椎間板変性とともに小胞体ストレスセンサーのうちＰＥＲＫ経路に属する遺伝子やタンパク質の発現の増加が認められた。そこで、２．０ｍＭ　ＤＴＴによって小胞体ストレスを誘導し、ＰＥＲＫ阻害剤の効果があるか解析した。ＰＥＲＫ阻害剤としては、ＧＳＫ２６０６４１４を用いた。
　ラット線維輪細胞に、２．０ｍＭ　ＤＴＴとともにＧＳＫ２６０６４１４（ＬＫＴ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を２０から１０００ｎＭまで濃度を変えて添加し、２４時間後に細胞を集めｍＲＮＡを精製した。ＲＴ-ＰＣＲにより、炎症性マーカーであるＴＮＦ-α、ＭＭＰ-３の発現を解析した。結果を図７に示す。
　ＤＴＴで誘導されたＴＮＦ-α、ＭＭＰ-３の発現が、ＰＥＲＫ阻害剤ＧＳＫ２６０６４１４添加（Ｇｓｋ）により濃度依存的に、有意に減少することが認められた。また、ここでは示さないが、ＣＨＯＰの発現が有意に減少することも確認している。
[ヒト線維輪細胞におけるＰＥＲＫ阻害剤添加による椎間板変性症マーカーの発現量の推移]
　ＰＥＲＫ阻害剤が、ラット線維輪細胞においてＤＴＴで誘導した小胞体ストレスの低減に効果があったことから、次に、ヒト患者から採取したヒト線維輪培養細胞を用いてＰＥＲＫ阻害剤の効果を解析した。
　ヒト線維輪細胞は以下のようにして調整した。ヒト線維輪組織は、手術時に採取されたＰｆｉｒｒｍａｎｎ分類Ｇｒａｄｅ　4の変性椎間板から分離し、０．０４％プロナーゼＥ（ＳＥＲＶＡ社製）を含むＤＭＥＭで３７℃、１時間処理し、引き続き０．０２５％コラゲナーゼＰ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）で３７℃、４時間処理し単離した。単離した細胞は、非働化処理した５％ウシ胎児血清（ＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｎｅｃｅｓ　Ｌｅｎｅｘａ社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、インビトロジェン社製）で洗浄した。単離した線維輪細胞は、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン‐ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。細胞は第３継代までを解析に用いた。
　ヒト線維輪培養細胞にＧＳＫ２６０６４１４を０、４、２０ｎＭ濃度で添加し、２４時間後に細胞を集め、上記と同様にＲＮＡを精製し、ＲＴ-ＰＣＲによりＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＩＬ-６の発現を解析した。なお、発現は、β-アクチンによって正規化した。用いたプライマーは以下のとおりである。
ヒトＴＮＦ－α　（Ｆ）5′-CAGAGGGCTGATTAGAGAGAGGT-3′（配列番号１５）
　　　　　　　　（Ｒ）5′-TGCTTGTTCCTCAGCCTCTT-3′（配列番号１６）
ヒトＡＤＡＭＴＳ４（Ｆ）5′-GACACGCTGGGTATGGCTGA-3′（配列番号１７）
　　　　　　　　（Ｒ）5′-ACTGATGCATGGCTTGGAGTTG-3′（配列番号１８）
ヒトβ－アクチン　（Ｆ）5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′（配列番号１９）
　　　　　　（Ｒ）5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′（配列番号２０）
ヒトＡＤＡＭＴＳ５(Ｆ)5′-TTTCGTGACCGACTGTCAAATG-3′(配列番号２１)
　　　　　　　（Ｒ）5′-TTTGAGTATCAAGTTGTGCCCTACC-3′（配列番号２２）
ヒトＩＬ－６（Ｆ）5′-AAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTA-3′（配列番号２３）
　　　　　　（Ｒ）5′-TGTCCTGCAGCCACTGGTTC-3′（配列番号２４）
　結果を図８に示す。ＰＥＲＫ阻害剤を添加すると、濃度依存的にＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴ４、ＩＬ-６の発現が有意に減少することが明らかとなった。ヒト患者組織から単離された線維輪細胞において、ＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４、ＩＬ-６の発現が、ＰＥＲＫ阻害剤によって減少することは、小胞体ストレスが椎間板変性症の原因となっていること、小胞体ストレスを低減することによって、椎間板変性症の治療が可能であることを示している。
 [ヒト線維輪細胞におけるＰＥＲＫ阻害剤添加によるアポトーシスの回避]
　小胞体にＵＰＲ（ｕｎｆｏｌｄｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を超えるような過度のストレスが加えられた場合には、アポトーシスシグナルが生じることが知られている。そこで、ＰＥＲＫ阻害剤を添加することによってアポトーシスが抑制されるか解析を行った。
　ＧＳＫ２６０６４１４を０、４、２０ｎＭの濃度で添加した無血清培地で、ヒト線維輪細胞を２４時間培養し、タンパク質を抽出し、抗Ｃｌｅａｖｅｄ　ｃａｓｐａｓｅ３抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いてカスパーセ３の切断をウェスタンブロッティングにより解析した（図９）。
　ＰＥＲＫ阻害剤ＧＳＫ２６０６４１４を添加することにより、濃度依存的にカスパーセ３の切断が抑制されていることが観察された。したがって、ヒト線維輪細胞において、ＰＥＲＫ阻害剤によって、アポトーシスが抑制されることが示された。椎間板変性症において、過度の小胞体ストレスがアポトーシスを誘導し、疾患の増悪に関与するとすれば、ＰＥＲＫ阻害剤によって症状の進行を抑制することが可能である。
［ｓｈＲＮＡによるノックダウンシステムを用いた解析］
　小胞体ストレスが椎間板変性症の原因となっていることが示されたことから、ＰＥＲＫ経路の分子をｓｈＲＮＡによってノックダウンし、椎間板変性症に伴って増加が認められるＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＩＬ-６の発現をＲＴ-ＰＣＲにより解析した。
　ヒト変性椎間板細胞にレンチウイルス用いてＰＥＲＫ（ＥＩＦ２ＡＫ３）、コントロールｓｈＲＮＡ（ＴＲＣＮ００００２６２３７４、ＳＨＣ００２Ｖ、シグマ-アルドリッチ社製）をトランスフェクションし、ＰＥＲＫ、ＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＩＬ-６の発現をＲＴ－ＰＣＲにより解析を行った。トランスフェクションは、ヒト変性椎間板細胞が４０－５０％コンフルエントになった時にＨｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ　Ｂｒｏｍｉｄｅを用いて推奨された方法で行い、トランスフェクション７２時間後にＲＮＡを抽出し、ＲＴ-ＰＣＲによる解析を行った（図１０）。ＰＥＲＫプライマーは以下のものを用いた。
ヒトＥＩＦ２ＡＫ３(Ｆ)5′-CTTATGCCAGACACACAGGACAA-3′(配列番号２５)
　　　　　　　（Ｒ）5′-TCCATCTGAGTGCTGAATGGATAC-3′（配列番号２６）
　ＰＥＲＫ　ｓｈＲＮＡをレンチウイルスによって導入することにより、有意にＰＥＲＫ発現が阻害されている（図１０上段）。さらに、ＩＬ-６の発現が有意に抑制されていた。ＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４に関しては、有意ではないものの発現が減少する傾向が見られた。ｓｈＲＮＡによるノックダウン系によっても、ＰＥＲＫ経路が椎間板変性症に関与することが示された。
　次に、ＰＥＲＫの下流に位置するＡＴＦ４の発現を同様にしてｓｈＲＮＡを用いた系でノックダウンし、椎間板変性症に伴って発現増加が認められる分子の発現を解析した。上記と同様にして、ヒト変性椎間板細胞にレンチウイルス用いてＡＴＦ４（ＴＲＣＮ０００００１３５７３、シグマ-アルドリッチ社製）、コントロールｓｈＲＮＡをトランスフェクションし、ＡＴＦ４、ＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＩＬ-６の発現をＲＴ－ＰＣＲにより解析を行った（図１１）。ＡＴＦ４プライマーは以下の配列を用いた。
ヒトＡＴＦ４（Ｆ）5′- GGAGATAGGAAGCCAGACTACA-3′（配列番号２７）
　　　　　　（Ｒ）5′- GGCTCATACAGATGCCACTATC-3′（配列番号２８）
　ＡＴＦ４　ｓｈＲＮＡをレンチウイルスによって導入することにより、有意にＡＴＦ４発現が阻害されている（図１１上段）。それに伴って、ＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＩＬ-６すべての分子発現が有意に抑制されていた。ｓｈＲＮＡによるノックダウン系によって、ＰＥＲＫ-ＡＴＦ４経路が椎間板変性症に関与することが示された。
［ＮＦ－κＢ阻害剤の効果］
　小胞体ストレスによるＰＥＲＫ経路の活性化によって、ｅＩＦ２α（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　２　α）が活性化し、さらにＮＦ－κＢが活性化する経路の存在が知られている。そこで、小胞体ストレスを誘導し、ＮＦ－κＢの活性化が起こるか解析した。
　ラット線維輪細胞に小胞体ストレス誘導剤ツニカマイシンを２μｇ／ｍｌの濃度で添加し、ＮＦ－κＢの活性化は、ｐ６５サブユニットのリン酸をウェスタンブロット法によって検出することによって解析した。なお、リン酸化ｐ６５サブユニットを検出する抗体はＣｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のものを用いた。
　ツニカマイシンによって小胞体ストレスを誘導すると、ＮＦ－κＢ　ｐ６５サブユニットのリン酸化量の増加が認められることから、小胞体ストレスが椎間板変性に関与するメカニズムとしてＮＦ－κＢ経路が関与することが示唆された（図１２Ａ）。
　そこで、ＮＦ－κＢ阻害剤ＤＨＭＥＱ（ｄｅｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｐｏｘｙｑｕｉｎｏｍｉｃｉｎ）によって、ＮＦ－κＢ経路が関与するか解析を行った。ヒト線維輪細胞にツニカマイシンで小胞体ストレスを誘導し、椎間板変性症に伴って発現増加が認められるＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＩＬ-６の発現がＤＨＭＥＱによって変化するか解析した。
　ヒト線維輪細胞に、２μｇ／ｍｌの濃度でツニカマイシンを添加し、小胞体ストレスを誘導した。１０．０μｇ／ｍｌ　ＤＨＭＥＱの有無によるＴＮＦ-α、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＩＬ-６の発現が変化をＲＴ-ＰＣＲにより解析した。ＲＮＡはツニカマイシン、ＤＨＭＥＱ添加後、２４時間培養し抽出している（図１２Ｂ）。
　ＴＮＦ-α、ＩＬ-６の発現はＤＨＭＥＱの添加によって有意に抑制されることが認められた。また、ＡＤＡＭＴＳ４の発現は有意ではないものの抑制されることが認められた。したがって、小胞体ストレスが関与する機構としてＮＦ－κＢシグナル伝達経路も関与することが確認された。
　椎間板変性症に関与する小胞体ストレスのシグナル伝達系について、図１３に模式的に示す。小胞体ストレスのＰＥＲＫ、ＡＴＦ６、ＩＲＥ１の３つの経路のうち、ＰＥＲＫ経路が椎間板変性症に関与している。さらに、ＰＥＲＫ経路の下流に位置するＮＦ－κＢシグナル伝達系も活性化していることから、椎間板変性症に関与していることが明らかとなった。したがって、ＰＥＲＫ経路に位置するＰＥＲＫ、ＡＴＦ４は椎間板変性症の治療標的として重要である。
　小胞体ストレス、特にＰＥＲＫ経路が椎間板変性症の発症に関与することが明らかとなった。したがって、ＰＥＲＫ阻害剤を椎間板変性症の治療に使用できる。ＰＥＲＫ阻害剤は、椎間板変性症が要因である、腰痛、椎間板ヘルニア等の疾患の治療薬としても有効であると考えられる。また、ＰＥＲＫ経路が椎間板変性の原因となることを明らかにしたことから、新たなスクリーニング方法を提供することができる。

Claims (4)

  1. 　ＰＥＲＫ（ＰＫＲ－ｌｉｋｅ　ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　ｋｉｎａｓｅ）阻害剤を有効成分とすることを特徴とする椎間板変性症治療薬。
  2. 　前記ＰＥＲＫ阻害剤が、
    　ＧＳＫ２６０６４１４、若しくはＧＳＫ２６５６１５７、又はこの薬理学的に許容される塩、若しくはエステル誘導体、又はＣＨＯＰ、ＡＴＦ４、若しくはＨＥＲＰのｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１の椎間板変性症治療薬。
  3. 　小胞体ストレスを誘導した線維輪（ＡＦ）細胞に候補物質を接触させ、
    　ＰＥＲＫ経路、又はＮＦ-κＢのシグナル伝達系のタンパク質及び／又は遺伝子の変化を指標として椎間板変性症治療薬をスクリーニングする方法。
  4. 　請求項３記載のスクリーニング方法によって選択された候補物質を
    　さらに、げっ歯類椎間板変性モデル動物に投与し、
    　ＰＥＲＫ経路、又はＮＦ-κＢのシグナル伝達系のタンパク質及び／又は遺伝子の変化を指標として候補物質を選択することを特徴とする椎間板変性症治療薬をスクリーニングする方法。
     
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